JP5808631B2 - 血管新生用足場、及び再生医療用の血管の製造方法 - Google Patents
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Description
再生医療という組織再生の成否において、最も重要な要因となるのが血管導入、障害部位への血管誘導の成否であることがよく知られている。組織再生には栄養分の送達が重要であり、生体内で栄養を送達する手段である血管が新生されるかどうかが重要と考えられている。
生体内では、通常、細胞外マトリックス(「ECM」)と呼ばれる細胞を取り囲む構造的に安定な物質が存在し、足場を提供している。主要な細胞外マトリックスとして知られているI型コラーゲン、フィブロネクチンは、組織修復、胚発生、血液凝固、及び血管内皮細胞の接着に関与する。血管新生においてもこれらECMが足場として用いられている(例えば、非特許文献2、参照)。
また、特許文献2には、血管再生に応用可能な化合物として、所定のピリミジン化合物等の幹細胞及び/又は内皮前駆細胞の分化促進剤が開示されており、この化合物を血管内皮細胞に暴露することにより血管内皮細胞の遊走が促進されると記載されている。
また、ある素材の血管新生の評価としては、血管内皮細胞が接着しやすいこと、血管内皮細胞の遊走が促進すること、血管内皮細胞による管腔形成が生じやすいこと、という評価基準があり、このうち、血管を組織へ導引する足場材という観点では、特に(1)血管内皮細胞が良好に接着し、かつ(2)血管内皮細胞の遊走を促進させる足場材であることが強く求められている。上記ECMをこの基準に照らしてみると、血管新生の足場材として用いられるI型コラーゲン、フィブロネクチンでは(1)の細胞接着性は良好であるものの、(2)の遊走能が不十分であることが知られている。また、RGDやIGDのような個々のペプチドとして血管内皮細胞の遊走に寄与する配列が見出されたとしても、血管内皮細胞を効果的に遊走するには充分とは言えず、実際の足場材として用いることは容易ではない。このように、確実に血管を組織に導引するために高い遊走能を示す足場用材料が依然として求められている。
[1] 下記(A)及び(C)の少なくともいずれかの遺伝子組換えゼラチンを主として含有する三次元の多孔質体と、前記三次元の多孔質体に浸潤させた塩基性線維芽細胞増殖因子とを含む血管新生用足場。
(A) 配列番号1で示されるポリペプチド、
(C) 前記(A)のアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
[2] 前記遺伝子組換えゼラチンが前記(A)である[1]に記載の血管新生用足場。
[3] 前記三次元の多孔質体が前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である[1]又は[2]に記載の血管新生用足場。
[4] 生体から単離した血管内皮細胞を、[1]〜[3]のいずれかに記載の血管新生用足場に接触させること、前記血管新生用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む再生医療用の血管の製造方法。
本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場とすることにより、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走させることができる。
即ち、本発明の血管内皮細胞遊走用足場に含まれる前記遺伝子組換えゼラチンには、血管内皮細胞の遊走を著しく促進する作用が見出された。この結果、本発明の血管内皮細胞遊走用足場を用いることにより、所定の部位に確実に血管内皮細胞を遊走し、血管を新生することが可能となった。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
前記遺伝子組換えゼラチンは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンを用いることができ、例えば、EP1014176A2、US6992172、WO2004/85473及びWO2008/103041等に開示されているものを用いることができる。また、前記遺伝子組換えゼラチンは、2kDa以上100kDa以下の分子量であることが好ましく、5kDa以上90kDa以下であることがより好ましく、10kDa以上90kDa以下であることがより好ましい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンにおけるアミノ酸の総数に対するRGD配列の割合は、少なくとも0.4%であることが好ましく、遺伝子組換えゼラチンが350以上のアミノ酸を含む場合、350アミノ酸の各ストレッチが少なくとも1つのRGD配列を含むことが好ましい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、式:Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly(式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、3個の(Gly−X−Y)63はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される。
前記遺伝子組換えゼラチンの等電点は、好ましくは5〜10であり、より好ましくは6〜10であり、更に好ましくは7〜9.5とすることができる。
(A) 下記配列番号1で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G(配列番号1)
(B) 前記(A)のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
(C) 前記(A)のアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
前記(C)において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸数としては、1個又は数個であればよく、遺伝子組換えゼラチンの総アミノ酸数によって異なるが、例えば、2〜15個、好ましくは2〜5個とすることができる。
足場表面における前記遺伝子組換えゼラチンの割合としては、当該足場表面に血管内皮細胞をより効率的に遊走させるために、30μg/cm2以上であることが好ましく、100μg/cm2以上であることが好ましい。好ましい遺伝子組換えゼラチンとして前述した(A)〜(C)の遺伝子組換えゼラチンとした場合も同様である。一方、遺伝子組換えゼラチンを効率よく活用するとの観点から、3000μg/cm2以下の割合とすることができる。
前記足場の幅及び長さについては適宜設定が可能であり、適切な大きさの血管を形成するなどの観点から、特に制限されないが、例えば、円盤状では、直径10cmとしてもよく、直径8mmであることが好ましい。
ここで「主として」とは、単数又は複数の材料で構成された前記三次元多孔質体の全質量に対して最大の質量比を占めることを意味する。前記足場における前記遺伝子組換えゼラチンの質量比は、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上、最も好ましくは100%、即ち遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持することができる。
なお、「遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持」とは、前記足場を構成する遺伝子組換えゼラチンの他に、形状の維持に関与しない他の成分、例えば、各種増殖因子などの液性因子を前記足場に含めてもよいことを意味する。
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素(株)製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業(株)製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子(Factor XIIIa、Haematologic Technologies, Inc.社)などが挙げられる。
前記遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤の反応過程では、温度を上昇させることができる。前記混合することにより得られた均一溶液における反応温度としては、架橋が進行する限りは特に限定はないが、高分子材料の変性や分解を考慮すると実質的には−100℃〜200℃であり、より好ましくは0℃〜60℃であり、より好ましくは0℃〜40℃であり、より好ましくは3℃〜25℃であり、より好ましくは3℃から15℃であり、さらに好ましくは3℃〜10℃であり、特に好ましくは3℃〜7℃である。
また、足場の気孔率は、細胞が足場内部に所定の密度で存在可能であれば特に制限されないが、好ましくは81%以上99.99%以下であり、さらに好ましくは95.01%以上99.9%以下である。なお、足場の気孔率は、嵩密度(ρ)と真密度(ρc)より、気孔率(P=(1−ρ/ρc)×100(%))として求めることができる。
なお、本発明において、「三次元多孔質体」とは、複数の気孔を有する三次元構造を有する足場を意味する。
前記足場において前記遺伝子組換えゼラチンと併用可能な液性因子としては、特に制限はなく、血管新生因子、神経成長因子(NGF)やアディポカイン、インターフェロン等を挙げることができる。なかでも、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板由来成長因子(PDGF)などの血管新生因子であることが、血管内皮細胞の遊走促進および血管新生の点で好ましく、中でも、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)が好ましい。
前記bFGFの形態は特に限定されず、天然由来のbFGFでもよいし、遺伝子組み換えbFGFでもよい。遺伝子組み換えbFGFとしては、例えばトラフェルミン(フィブラスト)(科研製薬株式会社)として市販されているものを使用してもよい。
本血管新生用足場に適用される遺伝子組換えゼラチン及びbFGFについては、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。また、本血管新生用足場における三次元であること及び多孔質であることに関する事項は、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。
また本発明は、血管新生方法も包含する。当該血管新生方法は、前記血管内皮細胞遊走用足場又は血管新生用足場を、血管新生を必要とする部位に配置することを含む。
これらの治療方法及び血管新生方法において、前記足場を目的部位に配置する方法には特に制限はなく、前記血管内皮細胞遊走用足場及び血管新生用足場の治療効果又は血管新生効果を妨げない公知の方法により行うことができる。
本発明は、例えば、再生医療用の血管を作製する方法を包含する。当該再生医療用の血管製造方法は、生体から単離した血管内皮細胞を前記足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む。
これにより、生体由来材料に基づく血管を生体外で作製することが可能となる。また、得られた再生医療用の血管は、当該血管を必要とする対象に移植することが可能である。特に、前記血管を作製する際に使用する血管内皮細胞を、当該血管を必要とする対象から採取した場合には、同一対象の血管内皮細胞による血管を作製するため、作製された血管を当該対象へ移植(即ち、自家移植)しても拒絶反応が起きる可能性が著しく低くなり、特に好ましい。
培養期間としては、所望される血管の大きさや長さ、使用される血管内皮細胞の細胞数又は状態等によって適宜調整すればよい。
培養に使用可能な培地としては、血管内皮細胞の培養に通常用いられる培地を使用することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)や、RPMI1640などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。移植後の拒絶反応の発生を低減させるなどの観点から、他の動物由来成分を含まない培地を用いることが好ましい。
in vitro血管内皮細胞遊走能評価
リコンビナントペプチドCBE3がヒト血管内皮細胞の遊走を促進する能力を、本評価試験を行うことで評価した。遊走は血管新生に特徴的な過程であり、細胞遊走の促進は血管新生を促進する。本試験では、足場として基材を用いた場合と、培地に基材を添加した場合の2種の遊走試験を行った。
(1)基材
本発明に係る遺伝子組み換えゼラチンとして、以下記載のCBE3を用意した(WO2008−103041に記載)。
CBE3
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。
CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
アミノ酸配列(配列番号1)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
被検物質は、CBE3と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン(高研 コラーゲン酸性溶液I−PC 5mg/mL)、ヒトフィブロネクチン(BD フィブロネクチン(ヒト))、ブタゼラチン(ニッピ ハイグレードゼラチン APAT)を使用した。各被検物質は注射用水(大塚蒸留水 大塚製薬)を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート(BD Falcon フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、8μmフィルターメンブレン付き24ウェルプレート)を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。プレートにインサートをセットし、被検物質の溶液をフィルターメンブレンに滴下し、16時間風乾したものを評価に使用した。
被検物質の溶液は、CBE3とブタゼラチンについては5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、5000μg/ml、50000μg/mlの濃度のものを、コラーゲンは5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、5000μg/mlの濃度のものを、フィブロネクチンは5μg/ml、50μg/ml、500μg/mlの濃度のものを使用した。各溶液は、それぞれ50μLでフィルターメンブレンに滴下した。なお、各試料とも、50000μg/mlは8333μg/cm2、5000μg/mlは833μg/cm2、500μg/mlは83.3μg/cm2、50μg/mlは、8.33μg/cm2、5μg/mlは0.83μg/cm2の被覆量に相当する。
上記と同様の方法で基材を被覆したフィルターメンブレンを、検量線作成用とした。また、同一のフィルターメンブレンを、PBS(pH7.2)(Gibco)で37℃で6時間擬似培養し、培養後のフィルターメンブレンを定量用に用いた。擬似培養は、24ウェルプレートのウェルに800μLのPBSを加え、セルカルチャーインサートをセットし、インサート上部に200μLのPBSを加え、37℃、5%CO2の条件にて培養した。
遊走能評価試験で用いたものと同じセルカルチャーインサートプレートに、0.4Mのホウ酸(試薬特級、和光純薬)バッファー(pH10)を376μLと、1N水酸化ナトリウム水溶液(容量分析用、和光純薬)を376μL加えた。その後、セルカルチャーインサートをプレートにセットした。滅菌済みアルミプレートシール(アズワン)をウェル上に貼り、プレートのふたをかぶせ、80℃、湿度90%で16時間反応させた。反応後に常温まで戻し、シールをはがしてセルカルチャーインサート上にある反応液をウェルに移し、セルカルチャーインサートを取り除いた。反応液を移したウェルに、更に、0.4Mホウ酸バッファー(pH10)を441μL加えた。
図1に示されるように、各試料において最も高い促進速度については、CBE3は17887/h、コラーゲンは12214/h、フィブロネクチン9224/hであった。8333μg/cm2のCBE3の際は8.33μg/cm2コラーゲンの1.5倍、833μg/cm2フィブロネクチンの1.9倍であった。また、CBE3では、残存量に依存して遊走促進能が上昇しているが、コラーゲン、フィブロネクチン、ブタゼラチンでは、残存量に依存しないことが確認できる。このことから、基材の残存量を増やしても、CBE3以外の基材の遊走促進能は大きくならないため、CBE3が最も高い遊走促進能を有していることが窺える。
被検物質は、CBE3と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン(高研 コラーゲン酸性溶液I−PC 5mg/mL)、ヒトフィブロネクチン(BD フィブロネクチン(ヒト))、ブタゼラチン(ニッピ ハイグレードゼラチン APAT)を使用した。また、RGD配列の遊走促進効果について検証するため、サイクリックRGD(以下cRGDと記載)(Cyclo−RGDfK ANASPEC)も、被検物質として用いた。各被検物質は注射用水(大塚蒸留水 大塚製薬)を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート(BD Falcon フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、8μmフィルターメンブレン付き24ウェルプレート)を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。
5000μgのCBE3を使用した場合に、最も高い遊走能促進効果を示した。コラーゲンでは500μg、フィブロネクチンでは50μgの含有量の場合に、高い遊走能促進効果が見られた。5000μgのCBE3の際は、500μgのコラーゲンの1.6倍、50μgのフィブロネクチンの1.7倍であった。また、5000μgのCBE3と等量のRGD配列を含む700μgのcRGDの場合には、5000μgのCBE3ほどの遊走促進効果は得られなかった。遊走促進効果は、cRGDの含有量に依存しないことも窺える。このことから、CBE3による遊走促進効果は、RGD配列の効果では説明ができない要因によることが示された。
in vivo血管形成能評価
CBE3が生体内で血管を形成する足場と成り得るかを調べるために、本試験を行った。CBE3スポンジをマウス皮下に移植し、CBE3スポンジ中での血管形成を評価した。
CBE3スポンジは以下の方法で作製した。
以下の組成で試料溶液を調製し、グルタルアルデヒドを添加後、4℃にてホモジナイザー(AM−11、NIHONSEIKI製)で17,000rpmで4分間攪拌し、そのまま−80℃で3時間急冷した。
試料溶液
組成:5%スポンジ10mL分(CBE3:500mg、超純水:9424μL、
1N HCl:76μL、3%グルタルアルデヒド:500μL)
平均気孔サイズは、内部断面構造を走査型電子顕微鏡で観察することで求めたところ、100μmであった。
気孔率は、嵩密度(ρ)と真密度(ρc)より、気孔率(P=(1−ρ/ρc)×100(%))を求めた。嵩密度(ρ)を乾燥重量と体積から算出し、真密度(ρc)をハバード型の比重瓶法により求めたところ、気孔率Pは95%以上であった。
また、CBE3スポンジに対する比較例として、動物ゼラチンスポンジ(アステラス製薬(製)、スポンゼル)を用いた。
移植方法は以下の手順で行った。まず、マウスをイソフルラン吸引麻酔下で、背部の首の位置に、はさみで約2cmの切れ込みを入れた。その切れ込みから、はさみを入れ、尾部から約2cm〜3cmの位置まで、筋肉に付着している皮膚をはがした。インキュベートしたスポンジをピンセットでつまみ、ピンセットを首の切れ込み部から皮膚を這うようにして、尾部から約2cm〜3cmの位置にスポンジを置いた。首の切れ込み部はサージカルホッチキス(夏目製作所)で止め、傷口をイソジン(明治製菓)で拭いた。移植後のマウスは、2週間飼育した。
まず、HE染色切片のスポンジ側部の上方部分、中央部分、下方部分の3箇所をそれぞれランダムに選び、顕微鏡(オリンパスIX71IX81)で画像を撮影した。その画像中における、血管数および血管部分の面積を定量した。血管数は画像中の血管の数をカウントし、血管の面積はImageJを用いて算出した。結果を表3に示す。血管数は括弧内に示した。
従って、本発明によれば、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することができる。
Claims (4)
- 下記(A)及び(C)の少なくともいずれかの遺伝子組換えゼラチンを主として含有する三次元の多孔質体と、
前記三次元の多孔質体に浸潤させた塩基性線維芽細胞増殖因子と
を含む血管新生用足場。
(A) 配列番号1で示されるポリペプチド、
(C) 前記(A)のアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。 - 前記遺伝子組換えゼラチンが前記(A)である請求項1記載の血管新生用足場。
- 前記三次元の多孔質体が前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である請求項1又は請求項2記載の血管新生用足場。
- 生体から単離した血管内皮細胞を、請求項1〜請求項3のいずれか一項記載の血管新生用足場に接触させること、
前記血管新生用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養すること
を含む再生医療用の血管の製造方法。
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