JP5548983B2 - 組換えゼラチン - Google Patents
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Description
用語’コラーゲン’、’コラーゲン関連’、’コラーゲン由来’なども当技術分野でしばしば用いられるが、本明細書の他の箇所全体において用語’ゼラチン’または’ゼラチン様’タンパク質を用いる。天然ゼラチンは5,000から400,000ダルトンより大きい範囲にわたるMWをもつ個々のポリマーの混合物である。
用語”RGD配列”と”RGDモチーフ”も互換性をもって用いられる。
さらに、不定冠詞”a”または”an”による要素の表記は、その状況から1つ、かつ1つだけの要素があることが明らかに要求されない限り、1より多い要素が存在する可能性を除外するものではない。したがって、不定冠詞”a”または”an”は通常は”少なくとも1つ”を意味する。
本発明を限定するわけではないが、これらのポリペプチドの特性を判定する際にRGDモチーフの分布および量が重要なだけではないと考えられる。たとえば、細胞付着特性のほかに、ポリペプチドの安定性および/または三次元フォールディングがこれらのポリペプチドの有用性を決定する重要な要因である。これに関して、RGDモチーフの数およびそれらの分布だけでなく、介在アミノ酸配列も改良された特性に寄与する可能性があることが見いだされた。本発明によるモノマーCBEポリペプチドは、たとえばUS2006/0241032のSEQ ID NO:2に対して若干の配列類似体をもち、同様に4つのRGDモノマーを含むが、その配列とはそれでもなお実質的に異なる。アラインメントした場合、これら2つのポリペプチドは72.8%の配列同一性をもつにすぎず、かつアラインメントにおいて多数のギャップも含まれる(54のギャップ、すなわち54の不適合アミノ酸)。特に、各RGD配列の隣のアミノ酸のうちの1つは、本発明によるポリペプチドにおいてEであり(すなわちERGD)、一方、前記の米国特許出願に記載されたポリペプチドにおいてはDである(DRGD)。また、本発明によるモノマー(およびマルチマー)の場合はRGDモチーフ間の間隔がより短く、RGD間にあるアミノ酸は最大で54個であり(第1と第2、第2と第3、および第3と第4のRGD間に、それぞれ33、39および54個のアミノ酸)、一方、先行技術の配列はRGD間に60個のアミノ酸を含む。これらの特徴が本発明のポリペプチドの改良された特性に寄与すると考えられる。
したがって1態様においては、SEQ ID NO:1に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも76%、78%、80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、組換えゼラチン様タンパク質が提供される。好ましくは、本発明の配列は少なくとも4つのRGDモチーフ、特に少なくとも1、2、3または4つのERGDモチーフを含む。好ましくは、RGDおよび/またはERGDモチーフは配列内に比較的均一に分布し、2つのRGDおよび/またはERGDモチーフ間に少なくとも約30、35、40、45または50個のアミノ酸を含み、ただし、好ましくは約100個より多くないアミノ酸、より好ましくは60個未満、より好ましくは55個より多くないアミノ酸が存在する。1態様において、組換えゼラチン様タンパク質は少なくとも3つのRGDおよび/またはERGDモチーフを含み、その際、続く第1と第2のRGDおよび/またはERGDモチーフ間のアミノ酸の数は第2と続く第3のRGDおよび/またはERGDモチーフ間のアミノ酸の数とは異なる。1態様において、ポリペプチドは好ましくは、100、150、200または212個のアミノ酸につき少なくとも4つのRGDおよび/またはERGDモチーフを含む。場合によっては、より多数、たとえば5、6または7つのRGDおよび/またはERGDモチーフが存在してもよい。
さらに他の態様においては、前記モノマーのマルチマーが提供される。したがって、そのようなマルチマーはモノマー配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10の反復配列を含むか、またはそれからなる。したがって、さらに他の態様においては、前記のモノマー配列のマルチマーを含むか、またはそれからなる、組換えゼラチンポリペプチドが提供される。好ましくは、モノマー反復配列は同じモノマー単位(同一アミノ酸配列をもつもの)の反復配列であるが、場合により異なるモノマー単位(それぞれ前記の基準に含まれる異なるアミノ酸配列をもつもの)の組合わせも使用できる。
マルチマーは既知の標準的な分子生物学的方法を用いて作製できる。一例はWerten et al., Protein Engineering vol 14, pp 447-454, 2001に見ることができる。この方法を用いると、マルチマーの構築のために制限酵素部位を用いることにより、マルチマータンパク質の前後に数個の余分なアミノ酸がある可能性がある。
本発明による組換えゼラチンは細胞培養支持体をコートするのにきわめて適切であり、これをバイオテクノロジー法または医療用途に使用できることが見いだされた。ゼラチン中のRGD配列は、細胞壁上のインテグリンと呼ばれる特異的受容体に接着できる。これらのインテグリンは、細胞結合アミノ酸配列の認識に際してのそれらの特異性が異なる。
細胞培養支持体として、またはそれと組み合わせて使用する場合、本発明によるゼラチン様ポリペプチドは細胞結合ポリペプチドとして機能する。それは、その上で増殖する細胞がそれを代謝することもできるという、他のポリペプチドを上回る利点をもつ。さらに他の利点は、それは容易に酵素消化できるので細胞をほぼ100%の収率で採取できることである。
1)細胞培養支持体、たとえばコアビーズ(たとえばマイクロキャリヤービーズ)もしくはペトリ皿またはこれらに類するものを、1種類以上の本発明によるゼラチン様ポリペプチドでコートしたもの;
2)インプラントまたは移植装具(たとえば股関節−、歯−、または他のインプラント、ステントなど)を、1種類以上の本発明による組換えゼラチンでコートしたもの;
3)組織工学のための骨格またはマトリックス、たとえば人工皮膚マトリックス材料を、1種類以上の組換えゼラチン様ポリペプチドでコートしたもの;
4)創傷修復製品を、1種類以上の組換えゼラチン様ポリペプチドでコートしたもの;
5)1種類以上の組換えゼラチン様ポリペプチドを含むか、またはそれからなる、組織接着剤;
6)皮膚充填剤。
−請求項1〜4に記載のポリペプチドをコードする核酸配列が適切なプロモーターに作動可能な状態で連結したものを含む発現ベクターを調製し、
−前記の核酸配列をメチロトローフ酵母(methylotrophic yeast)において発現させ、
−前記の核酸配列を発現させるのに適切な発酵条件下でその酵母を培養し、
−場合により前記ポリペプチドを培養物から精製する。
SEQ ID NO 1:CBEモノマー(CBE1)
SEQ ID NO 2:CBE2
SEQ ID NO 3:CBE3
SEQ ID NO 4:CBE4
SEQ ID NO 5:CBE5
SEQ ID NO 6:CBE6
SEQ ID NO 7:CBE7
SEQ ID NO 8:CBE8
SEQ ID NO 9:CBE9
SEQ ID NO 10:CBE10
SEQ ID NO 11:CBE。
ヒトCOL1A1−1のゼラチンアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列に基づき、この核酸配列を修飾して、RGD富化ゼラチンを製造した。EP−A−0926543、EP−A−1014176およびWO 01/34646に開示された方法を用いた。このRGD富化ゼラチンをCBEと命名し、本発明によるこのRGD富化ゼラチンをSEQ ID NO:11に示す。
CBEモノマーのアミノ酸配列(SEQ ID NO:1):
以下の実施例に用いたアミノ酸配列CBEトリマー;これはCBE3(SEQ ID NO:3)を基本とし、前にGAPを含み、かつグリシン(G)で延長されている:
マイクロキャリヤービーズの調製
平均直径100マイクロメートルのポリスチレンビーズを用いる。ヘテロ二官能性架橋剤BBA−EAC−NOSを用いて、ゼラチンをポリスチレンビーズ上に共有結合により固定化する。BBA−EAC−NOSをポリスチレンビーズに添加し、吸着させる。次いでゼラチンを添加し、このNOS合成ポリマーと反応させて、このスペーサーへの共有結合を生じさせる。次いでビーズを(320nmで)光活性化して、スペーサー(および共有結合したゼラチン)をポリスチレンビーズに共有結合により固定化する。最後に、リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.2)中の緩和な界面活性剤トTween 20で一夜洗浄することにより、ゆるく付着したゼラチンを除去する。
ミドリザル(Green monkey)腎(Vero)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、正常ラット腎線維芽(NRK−49F)細胞、およびMadin Darbyイヌ腎(MDCK)細胞を、ATCCから購入した。4種類すべての細胞タイプを75cm2のフラスコ内で37℃において5% CO2の環境で継代および維持した。VeroおよびNRK−49F細胞はダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中で培養され、CHO細胞はハム(Ham)のF−12栄養素混合物中で培養され、MDCK細胞はアールの塩類(Earle’s salts)を含む最少必須培地(MEM)中で培養された。
細胞付着アッセイのために、20mg/mlのコートしたポリスチレンビーズを用い、細胞濃度はそれぞれの細胞タイプにつき1.5×105細胞/mlであった。
細胞付着の動態を上清細胞濃度の低下としてアッセイした。試料を取り出すために撹拌を短時間(約30秒間)停止し、この時点でマイクロキャリヤーは沈降し、下記に従って細胞を定量するために上清試料を取り出した。
Claims (10)
- 組換えゼラチンであって、SEQ ID NO:1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなり、そして細胞付着特性を有し、ここで該配列中の4つのRGDモチーフが保存されている、前記組換えゼラチン。
- SEQ ID NO:1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の組換えゼラチン。
- 請求項1に記載する配列のマルチマーを含むか、またはそれからなる、請求項1または2に記載の組換えゼラチン。
- マルチマーが、それぞれSEQ ID NO:1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも3つの配列を含むか、またはそれからなる、請求項3に記載の組換えゼラチン。
- ゼラチンがSEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9または10を含むか、またはそれからなる、請求項3または4に記載の組換えゼラチン。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えゼラチンを含む、細胞支持体。
- 細胞支持体が、組換えゼラチンでコートしたインプラントまたは移植材料、組換えゼラチンでコートした組織工学用骨格、歯科製品(の一部)、創傷修復製品(の一部)、人工皮膚マトリックス材料(の一部)、および組織接着剤(の一部)よりなる群から選択される、請求項6に記載の細胞支持体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えゼラチンを含む、制御放出組成物。
- 組換えゼラチンが架橋している、請求項8に記載の制御放出組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えゼラチンを製造するための方法であって、下記:
a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えゼラチンをコードする核酸配列が適切なプロモーターに作動可能な状態で連結したものを含む発現ベクターを調製し;
b)前記の核酸配列をメチロトローフ酵母において発現させ;
c)前記の核酸配列を発現させるのに適切な発酵条件下でその酵母を培養し;そして
d)場合により前記組換えゼラチンを培養物から精製する。
を含む、前記方法。
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