WO2023188492A1 - 組織修復材及び組織修復材の製造方法 - Google Patents

組織修復材及び組織修復材の製造方法 Download PDF

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WO2023188492A1
WO2023188492A1 PCT/JP2022/039789 JP2022039789W WO2023188492A1 WO 2023188492 A1 WO2023188492 A1 WO 2023188492A1 JP 2022039789 W JP2022039789 W JP 2022039789W WO 2023188492 A1 WO2023188492 A1 WO 2023188492A1
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tissue repair
gelatin
repair material
kda
amino acid
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PCT/JP2022/039789
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沙耶美 伊藤
愛 岡村
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富士フイルム株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present disclosure relates to a tissue repair material and a method of manufacturing the tissue repair material.
  • Regenerative medicine is a new medical treatment that uses three factors: cells, scaffolds, and growth factors to recreate the form and function of the original tissue in living tissues that cannot be recovered using only the body's natural healing ability. It's technology.
  • bone regeneration in the field of orthopedics or dentistry is an area that is attracting much attention in the field of regenerative medicine. If the bone disease occurs in the legs or lower back, the bone loss caused by the disease will make it impossible to walk, and if the bone disease is in the periodontal tissues, it will be difficult to eat, so the bone disease is significant. It causes a decline in QOL (Quality of Life).
  • WO 2013/137268 discloses a tissue repair material containing crosslinked gelatin.
  • tissue repair materials are required to have excellent tissue repair ability, and for example, after applying the tissue repair material to a defective or damaged area, the tissue repair rate is high after about 4 weeks have elapsed. (hereinafter also referred to as tissue repair properties) is required.
  • a problem to be solved by an embodiment of the present disclosure is to provide a tissue repair material with excellent tissue repair properties and a method for manufacturing the tissue repair material.
  • the present disclosure includes the following aspects. ⁇ 1> In the elution curve of the cross-linked gelatin containing cross-linked gelatin and obtained by gel permeation chromatography under the following conditions, an absorption peak with an absorbance of 0.025 or more is present in a molecular weight range of 14 kDa or more and 51 kDa or less. At least one tissue repair material is present.
  • tissue repair material according to ⁇ 1> above which has an absorption peak in a molecular weight range of 14 kDa or more and less than 28 kDa, and a molecular weight range of 28 kDa or more and less than 43 kDa.
  • ⁇ 4> According to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, wherein the residual rate of the crosslinked gelatin is 60% or less after a 3-hour decomposition treatment using 1 mol/L (liter) of hydrochloric acid. tissue repair material.
  • the gelatin is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 with one or several amino acids deleted, substituted, or added, and A peptide that has biocompatibility; and an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • the tissue repair material according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> above, which is one or more selected from the group consisting of peptides having affinity.
  • the ratio of the area where the molecular weight is 14 kDa or more and 43 kDa or less to the area where the molecular weight is more than 43 kDa and 51 kDa or less is 2.5 or more, The tissue repair material according to any one of the above.
  • a method for producing a tissue repair material comprising: ⁇ 8> The method for producing a tissue repair material according to ⁇ 7> above, wherein the radiation is a gamma ray or an electron beam.
  • the molecular weight is The tissue repair according to ⁇ 7> or ⁇ 8> above, which has an absorption peak in a range of 14 kDa or more and 51 kDa or less, a molecular weight range of 14 kDa or more and less than 28 kDa, and a molecular weight range of 28 kDa or more and less than 43 kDa.
  • Method of manufacturing wood is The tissue repair according to ⁇ 7> or ⁇ 8> above, which has an absorption peak in a range of 14 kDa or more and 51 kDa or less, a molecular weight range of 14 kDa or more and less than 28 kDa, and a molecular weight range of 28 kDa or more and less than 43 kDa.
  • the gelatin is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 with one or several amino acids deleted, substituted, or added, and A peptide that has biocompatibility; and an amino acid sequence that has 80% or more sequence identity with the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • the method for producing a tissue repair material according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 12> above, which is one or more selected from the group consisting of: peptides having affinity;
  • tissue repair material with excellent tissue repair properties and a method for manufacturing the tissue repair material.
  • FIG. 1 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Example 1.
  • FIG. 2 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Example 2.
  • FIG. 3 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Example 3.
  • FIG. 4 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Example 4.
  • FIG. 5 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Example 5.
  • FIG. 6 shows the elution curve obtained from the tissue repair material of Comparative Example 1.
  • a numerical range indicated using “ ⁇ ” indicates a range that includes the numerical value written before “ ⁇ ” as the lower limit value and the numerical value written before “ ⁇ ” as the upper limit value.
  • the upper limit or lower limit described in a certain numerical range may be replaced with the upper limit or lower limit of another numerical range described step by step.
  • the upper limit or lower limit described in a certain numerical range may be replaced with the value shown in the Examples.
  • amino acid sequences constituting gelatin are expressed using the one-letter notation (for example, "G” for a glycine residue) or the three-letter notation (for example, "Gly” for a glycine residue) well known in the art.
  • G for a glycine residue
  • Gly for a glycine residue
  • Gly-XY Gly represents a glycine residue
  • X and Y represent any amino acid residue other than the glycine residue.
  • crosslinked gelatin means gelatin that is crosslinked with each other.
  • the amount of each component in the composition refers to the total amount of the corresponding multiple substances present in the composition. means.
  • step includes not only independent steps but also steps that cannot be clearly distinguished from other steps if the intended purpose is achieved.
  • the absorption peak of crosslinked gelatin is confirmed as follows. First, a tube with a capacity of 15 mL is filled with 5 mg of tissue repair material, 5 mL of water for injection is added, and then incubated at 37° C. for 24 hours. Next, after mixing by inversion, 1 mL of the supernatant is collected using a low adsorption tube. The fractionated solution is filtered using a 0.22 ⁇ m pore size filter and used as a measurement sample. Gel permeation chromatography is performed on 5 ⁇ L of the measurement sample under the following conditions to obtain an elution curve with absorbance on the vertical axis and elution time on the horizontal axis.
  • a substance with a known molecular weight such as a polystyrene standard substance, is measured at the same or different timing than the measurement sample, and the relationship between elution time and molecular weight in the elution curve is determined. The presence or absence of an absorption peak is confirmed from the elution curve obtained as described above. Note that in the present disclosure, the absorption peak includes not only a waveform at which the absorbance is maximum, but also a waveform having a shoulder portion indicated by the symbol X in FIG. 1 . As the column, ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column, 200 ⁇ , 1.7 ⁇ m, 4.6 mm x 150 mm, or a column with equivalent performance can be used.
  • the heating temperature of gelatin refers to the set temperature of the device used for heating, and is not the temperature of gelatin to be heated.
  • the water absorption rate of the tissue repair material is measured as follows. First, a filter cup whose mass (w0) has been measured is set in a microtube (hereinafter referred to as tube). Next, 500 ⁇ L of water is added to the filter cup and stirred on a rotator for 2 hours. After stirring, the tube is centrifuged at 25° C. and 6000 ⁇ g for 1 minute to confirm that water has moved from the filter cup into the tube. The mass (w1) of the filter cup is measured again, and the amount of remaining water is calculated using the following formula.
  • the acid decomposition residual rate of the tissue repair material is measured as follows.
  • a microtube (hereinafter referred to as tube) is prepared and its mass (A) is measured.
  • 1.7 mL of 1 mol/L hydrochloric acid is added to the tube containing the tissue repair material, and heated for 3 hours using a heat block set at 37°C. After heating, the tube is placed on ice to stop the acid decomposition reaction, and centrifuged at 10,000 xg for 1 minute using a centrifuge preset at 4°C.
  • the molecular weight of crosslinked gelatin is a molecular weight calculated using polystyrene as a standard substance, and is measured by the gel permeation chromatography under the above conditions.
  • the radiation dose is measured by the following method. Multiple vials filled with cross-linked gelatin are placed in a cardboard box, and a polymethyl methacrylate dosimeter is attached to the side of the cardboard box. After irradiation with radiation in this state, the dose of radiation measured by the dosimeter is taken as the dose of radiation irradiated to the crosslinked gelatin.
  • tissue repair material contains crosslinked gelatin, and in the elution curve of the crosslinked gelatin obtained by gel permeation chromatography under the following conditions, the molecular weight is in the range of 14 kDa or more and 51 kDa or less, and the absorbance is 0.025. At least one of the above absorption peaks exists.
  • the tissue repair material is sometimes required to have a high tissue repair rate (hereinafter also referred to as tissue repair rate) after approximately two weeks have passed after being applied to a defective or damaged site.
  • tissue repair rate tissue repair rate
  • the presence of at least one absorption peak with an absorbance of 0.025 or more in a molecular weight range of 14 kDa or more and 51 kDa or less tends to improve the tissue repair speed of the tissue repair material.
  • the absorbance of the absorption peak is preferably 0.025 or more, more preferably 0.03 or more, and even more preferably 0.035 or more.
  • the upper limit of the absorbance of the absorption peak is not particularly limited, and can be 0.06 or less.
  • the absorption peaks preferably exist in a range where the molecular weight is 14 kDa or more and less than 28 kDa, and a range where the molecular weight is 28 kDa or more and less than 43 kDa, and when the molecular weight is 43 kDa or more. , 51 kDa or less, a molecular weight of 28 kDa or more and less than 43 kDa, and a molecular weight of 14 kDa or more and less than 28 kDa.
  • the ratio of the area where the molecular weight is 14 kDa or more and 43 kDa or less to the area where the molecular weight is more than 43 kDa and 51 kDa or less is preferably 2.5 or more. , more preferably 3.0 or more, and still more preferably 7.0 or more.
  • the upper limit of the above area ratio is not particularly limited and can be 30.00 or less.
  • the area where the molecular weight is more than 43 kDa and 51 kDa or less, and the area where the molecular weight is 14 kDa or more and 43 kDa or less are determined from the elution curve obtained as described above. Specifically, this is performed by determining the area of the region surrounded by the elution curve and the baseline in a range where the molecular weight is greater than 43 kDa and less than 51 kDa, or in a range where the molecular weight is greater than or equal to 14 kDa and less than 43 kDa.
  • the baseline refers to a straight line where the absorbance becomes 0.
  • the water absorption rate of the tissue repair material of the present disclosure is preferably 450% or more, more preferably 500% or more, and even more preferably 600% or more.
  • the upper limit of the water absorption rate of the tissue repair material is not particularly limited, but is preferably 9900% or less, more preferably 5000% or less, still more preferably 3000% or less.
  • the water absorption rate of the tissue repair material can be adjusted by the components contained in the tissue repair material, the type of crosslinked gelatin, and the form of the crosslinked gelatin.
  • the water absorption rate can be adjusted by adjusting the freezing step, the temperature of the crosslinking step, the crosslinking treatment time of the crosslinking step, etc. in the method for producing the tissue repair material.
  • water absorption tends to increase when the temperature of the freezing step is raised, the temperature of the crosslinking step is lowered, or the crosslinking treatment time of the crosslinking step is shortened.
  • the tissue repair material of the present disclosure has a residual rate (acid decomposition residual rate) after a 3-hour decomposition treatment using 1 mol/L (liter) of hydrochloric acid on a mass basis. It is preferably 60% or less, more preferably 55% or less, even more preferably 50% or less.
  • the acid-decomposed residual rate of the tissue repair material is preferably 5% by mass or more, more preferably 20% by mass or more, from the viewpoint of maintaining the volume at the defect site and replacing it with tissue to be regenerated.
  • the content is preferably 40% by mass or more, and more preferably 40% by mass or more.
  • the acid-decomposed residual rate of the tissue repair material can be adjusted by the components contained in the tissue repair material, the type of crosslinked gelatin, and the form of the crosslinked gelatin. Further, the acid decomposition residual rate can be adjusted by the freezing step, the temperature of the crosslinking step, the crosslinking treatment time of the crosslinking step, etc. in the method for producing a tissue repair material. Generally, when the temperature of the freezing step is raised, the temperature of the crosslinking step is lowered, or the crosslinking treatment time of the crosslinking step is shortened, the acid decomposition residual rate tends to decrease.
  • the tissue repair material of the present disclosure contains crosslinked gelatin obtained by subjecting gelatin to heat treatment, crosslinking agent treatment, and the like.
  • cross-linked gelatin is preferably obtained by heat-treating gelatin, and in the present disclosure, heat-treated cross-linked gelatin is also referred to as dehydrated cross-linked gelatin.
  • Dehydrated crosslinked gelatin is preferable from the viewpoint of biosafety because it does not require the use of a crosslinking agent or only uses a small amount of crosslinking agent, and is less likely to cause cytotoxicity, inflammation, etc.
  • the gelatin used to produce crosslinked gelatin may be a natural gelatin, or may be a mutant or recombinant gelatin that differs from the natural gelatin in at least one amino acid residue.
  • natural gelatin refers to gelatin made from naturally occurring collagen or a polypeptide having the same amino acid sequence as gelatin made from naturally occurring collagen. Unless otherwise specified, mutant or recombinant gelatins are collectively referred to as recombinant gelatin in this disclosure.
  • natural gelatin or recombinant gelatin examples include those derived from animals such as fish and mammals, but natural gelatin or recombinant gelatin derived from mammals is preferred. Examples of mammals include humans, horses, pigs, mice, rats, etc., and humans or pigs are more preferable.
  • the natural gelatin is preferably a pig-derived or human-derived natural gelatin, and the recombinant gelatin is preferably a human-derived recombinant gelatin.
  • gelatin refers to a polypeptide containing six or more consecutive amino acid sequences represented by Gly-XY, and includes other amino acid residues in the polypeptide in addition to the amino acid sequence represented by Gly-XY. It may have one or more groups.
  • Gly-XY Gly represents a glycine residue
  • X and Y represent any amino acid residue other than the glycine residue.
  • the amino acid sequence represented by Gly-XY is a sequence corresponding to an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen, and the repetition of this sequence means a sequence characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XYs in one molecule of gelatin may be the same or different. Further, in the Gly-XY sequence, X and Y are independent for each repeating unit and may be the same or different.
  • X and Y contain a large amount of imino acid residues (specifically, proline residues or oxyproline residues).
  • the content of such imino acid residues is preferably 10% by mass to 45% by mass in one molecule of gelatin.
  • the content of Gly-XY in one molecule of gelatin is preferably 80% by mass or more, more preferably 95% by mass or more, and most preferably 99% by mass or more.
  • Gelatin is made by changing one or more bases or amino acid residues to the base sequence or amino acid sequence of a gene encoding collagen that has six or more consecutive amino acid sequences represented by Gly-XY.
  • the gelatin is a recombinant gelatin obtained by introducing and expressing a gene having a base sequence or an amino acid sequence into a suitable host by a conventional method.
  • Examples of recombinant gelatin include EP1014176A2, US6992172B1, WO2004/85473A2, WO2008/103041A1, Special Table of Contents No. 2010-519293, Special Publication No. 2010-519252, Special Publication No. 2010-518833, and Special Publication No. 2010- Publication No. 519251, Those disclosed in WO2010/128672A1, WO2010/147109A1, etc. can be particularly preferably used.
  • the molecular weight of gelatin is preferably 2 kDa to 100 kDa, more preferably 5 kDa to 90 kDa, and even more preferably 10 kDa to 90 kDa.
  • gelatin preferably further contains a cell adhesion signal, and more preferably has two or more cell adhesion signals in one molecule.
  • cell adhesion signals include RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence, LGTIPG sequence, RNIAEIIKDI sequence, IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence.
  • RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence or HAV sequence and more preferably RGD sequence.
  • the ERGD sequence is more preferred.
  • the number of amino acid residues between RGD sequences is preferably 0 to 100, more preferably 25 to 60. Further, the RGD sequence is preferably arranged non-uniformly within the above range of the number of amino acid residues.
  • the ratio of RGD sequences to the total number of amino acid residues in gelatin is preferably at least 1.2%, and the recombinant gelatin contains 250 or more amino acid residues. of amino acid residues, each stretch of 250 amino acid residues preferably contains at least one RGD sequence. More preferably, the gelatin contains at least two RGD sequences per 250 amino acid residues, more preferably at least three RGD sequences, and even more preferably at least four RGD sequences.
  • the gelatin sequence preferably satisfies at least one of the following aspects, but is not limited thereto.
  • Gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the gelatin has the amino acid sequence A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • A represents one or more arbitrary amino acid residues
  • B represents one or more arbitrary amino acid residues
  • Gly represents a glycine residue
  • n Xs represent a glycine residue.
  • the n Y's each independently represent an arbitrary amino acid residue.
  • m represents an integer of 2 to 10, preferably an integer of 3 to 5.
  • n represents an integer of 3 to 100, preferably an integer of 15 to 70, more preferably an integer of 50 to 65.
  • the m Gly-XYs may be all the same, partially the same, or different from each other.
  • the recombinant gelatin has the amino acid sequence Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly.
  • the 63 X's each independently represent any amino acid residue
  • the 63 Y's each independently represent any amino acid residue. All of the 63 Gly-XYs may be the same, some of them may be the same, or they may be different from each other. It is preferable that the repeating unit of gelatin is formed by forming a part of the amino acid sequence of naturally occurring collagen into one unit and bonding a plurality of such units.
  • the naturally occurring collagen mentioned here preferably includes type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, and type V collagen, and type I collagen, type II collagen, or type III collagen is more preferable.
  • the collagen is preferably human, horse, pig, mouse, or rat-derived collagen, and more preferably human-derived collagen.
  • the isoelectric point of gelatin is preferably from 5 to 10, more preferably from 6 to 10, even more preferably from 7 to 9.5. Note that the isoelectric point of gelatin is calculated based on the amino acid composition of gelatin.
  • Gelatin preferably satisfies at least one of the following aspects, but is not limited thereto.
  • gelatin is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 below (hereinafter also referred to as specific peptide A); A peptide consisting of an amino acid sequence (hereinafter also referred to as specific amino acid sequence B) in which five amino acids are deleted, substituted, or added and has biocompatibility (hereinafter also referred to as specific peptide B); and SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence (hereinafter also referred to as specific amino acid sequence C) that has 80% or more sequence identity with the partial amino acid sequence consisting of the 4th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence described in It is preferable that the peptide is one or more selected from the group consisting of peptides having affinity (hereinafter also referred to as specific peptide C).
  • GAP GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAA GLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 G (SEQ ID NO: 1)
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted or added may be one or several, and can be from 2 to 15, preferably from 2 to 5. .
  • the sequence identity of specific peptide C is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the partial amino acid sequence is a partial amino acid sequence corresponding to a repeating unit of the sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the specific peptide C may contain two or more specific amino acid sequences C.
  • the ratio of the number of amino acid residues included in the specific amino acid sequence C to the total number of amino acid residues included in the specific peptide C is preferably 80% or more.
  • Recombinant gelatin can be produced by genetic recombination techniques known to those skilled in the art. For example, it can be manufactured according to the method described in EP1014176A2, US6992172B1, WO2004/85473A2, WO2008/103041A1, etc.
  • the number of amino acid residues contained in gelatin can be 151 to 2260, and from the viewpoint of degradability after crosslinking, it is preferably 193 or more, and from the viewpoint of stability, it is 944 or less.
  • the number is preferably 380 to 756, and more preferably 380 to 756.
  • crosslinked gelatin is not particularly limited, and examples include forms such as sponge, film, nonwoven fabric, particles, and mesh. Among these, from the viewpoints of cell invasion, tissue repair speed, and tissue repair properties, the crosslinked gelatin is preferably in the form of particles (hereinafter, particulate crosslinked gelatin is also referred to as crosslinked gelatin particles).
  • the crosslinked gelatin particles are preferably particles that pass through a 4 mm sieve, more preferably particles that pass through a 1400 ⁇ m sieve, and 1000 ⁇ m sieves. It is more preferable that the particles pass through a sieve, and it is particularly preferable that the particles pass through a sieve having an opening of 710 ⁇ m. From the viewpoint of the elasticity of the layer formed by arranging the tissue repair material of the present disclosure in a predetermined space (hereinafter also referred to as a formulation layer), it is important that the crosslinked gelatin particles remain on a sieve with an opening of 75 ⁇ m. is preferable, and more preferably remains on a sieve with an opening of 300 ⁇ m.
  • a test sieve according to ISO3310 standard is used to sieve the crosslinked gelatin particles, and the sieving method is in accordance with the sieving method described in Method 2 of Section 3.04 of the 16th edition of the Japanese Pharmacopoeia. That is, shaking for 5 minutes was performed multiple times intermittently, and after shaking, the mass of the particles remaining on the sieve was 5% or less of the mass of the particles on the sieve before shaking. When it ends.
  • the term “pass through” means that the particles remaining on the sieve at the end point are no more than 10% by weight of the total mass before the sieve.
  • the term “remains” means that the particles remaining on the sieve at the end point are 95% by weight or more of the total mass before sieving.
  • crosslinked gelatin is preferably a porous material.
  • the porosity of crosslinked gelatin is preferably 80% to 99.99%, more preferably 95.01% to 99.9%. preferable.
  • the porosity of crosslinked gelatin is determined using the bulk density ( ⁇ ) of crosslinked gelatin, the true density ( ⁇ c) of crosslinked gelatin, and the following formula.
  • the bulk density ( ⁇ ) is calculated from the dry mass and volume of the crosslinked gelatin, and the true density ( ⁇ c) of the crosslinked gelatin is determined by the pycnometer method using a Gay-Lussac type pycnometer.
  • Porosity P (%) (1- ⁇ / ⁇ c) ⁇ 100
  • the tap density ( ⁇ t) is determined by the method described below.
  • the true density ( ⁇ c) is determined by the pycnometer method using a Hubbard pycnometer.
  • the crosslinked gelatin particles may have communicating pores. Because the crosslinked gelatin particles have communicating pores, voids are continuous from the outside to the inside of the tissue repair material, allowing cells that have come into contact with the outside of the tissue repair material to disperse or diffuse into the inside of the tissue repair material. .
  • the diameter of the communicating hole is preferably 10 ⁇ m to 2500 ⁇ m, more preferably 50 ⁇ m to 2500 ⁇ m, and even more preferably 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m, in order to exhibit the above function.
  • the tap density of the crosslinked gelatin particles is preferably 10 mg/cm 3 to 500 mg/cm 3 , more preferably 30 mg/cm 3 to 450 mg/cm 3 . It is more preferably 50 mg/cm 3 to 420 mg/cm 3 , particularly preferably 140 mg/cm 3 to 280 mg/cm 3 .
  • tap density is a value that represents how many particles can be densely packed into a certain volume, and the smaller the value, the more complex the structure of the formulation layer tends to be, and the smaller the value, the more complex the structure of the formulation layer, and the smaller the value tends to be wide, and the particles tend to be coarsely packed.
  • the tap density measurement method is performed as follows. First, a cylindrical (volume: 0.616 cm 2 ) container (hereinafter referred to as a cap) with a diameter of 6 mm and a length of 21.8 mm is prepared, and the mass of only the cap is measured (wt). Next, the cap and the funnel are connected, and the crosslinked gelatin particles are poured through the funnel so that they accumulate in the cap. After pouring in a sufficient amount of crosslinked gelatin particles, tap the cap 200 times on a hard surface such as a desk, remove the funnel, and scrape off the crosslinked gelatin particles that have risen beyond the edge of the cap with a spatula. The mass of the crosslinked gelatin particles completely filled in the cap is measured (wg).
  • the content of crosslinked gelatin with respect to the total mass of the tissue repair material of the present disclosure is preferably 70% by mass or more, more preferably 80% by mass or more, and 90% by mass or more. It is more preferably at least 95% by mass, particularly preferably at least 95% by mass.
  • the upper limit of the content of crosslinked gelatin is not particularly limited, and may be 100% by mass.
  • the tissue repair material of the present disclosure may contain components other than crosslinked gelatin, including components related to bone regeneration or new bone formation, such as osteoinductive agents.
  • osteoinductive drugs include bone morphogenetic protein (BMP), basic fibroblast growth factor (bFGF), and the like.
  • the method for producing a tissue repair material of the present disclosure includes a step of heating gelatin at 100° C. to 170° C. for 2 hours to 24 hours to obtain crosslinked gelatin (hereinafter referred to as a crosslinking step); A step of irradiating radiation at a dose of 5 kGy to 50 kGy (hereinafter referred to as a radiation irradiation step).
  • the method for producing a tissue repair material of the present disclosure includes, before the step of obtaining crosslinked gelatin, a step of preparing a gelatin solution containing gelatin dissolved in an aqueous medium (hereinafter referred to as a gelatin solution preparation step), and a step of freeze-drying the gelatin solution.
  • a gelatin solution preparation step a step of preparing a gelatin solution containing gelatin dissolved in an aqueous medium
  • a step of freeze-drying the gelatin solution may include a step of obtaining a freeze-dried product (hereinafter referred to as a freeze-drying step) and a step of pulverizing the freeze-dried product to obtain a pulverized product (hereinafter referred to as a crushing step).
  • the gelatin solution in order to obtain crosslinked gelatin, which is a porous body, the gelatin solution is cooled to below the ice crystal formation temperature (hereinafter referred to as ice crystal formation temperature) before the freeze drying step. ) is preferable.
  • the method for producing a tissue repair material of the present disclosure includes the step of heating gelatin at 100° C. to 170° C. for 2 hours to 24 hours to obtain crosslinked gelatin. Since the type of gelatin to be crosslinked has been described above, the description thereof will be omitted here. Further, the gelatin to be crosslinked may be a pulverized freeze-dried product of a gelatin solution, which will be described later.
  • the heating temperature is preferably 120°C to 170°C, more preferably 120°C to 150°C, and even more preferably 130°C to 140°C.
  • the heating time is preferably 2 hours to 20 hours, more preferably 4 hours to 12 hours, and even more preferably 4.5 hours to 8 hours. preferable.
  • Heating of gelatin is preferably carried out under reduced pressure, vacuum or an inert gas atmosphere, more preferably carried out under vacuum or an inert gas atmosphere, and preferably carried out under an inert gas atmosphere to prevent oxidation. is even more preferable.
  • the environment is preferably 4 hPa or less. Nitrogen is preferred as the inert gas.
  • a conventionally known heating device can be used to heat the gelatin, for example, DP-43 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd. can be used.
  • the radiation used in the radiation irradiation process includes alpha rays, beta rays, gamma rays, neutron beams, electron beams, and X-rays. Among these, from the viewpoint of tissue repair speed and tissue repairability, gamma rays or Electron beams are preferred, and gamma rays are more preferred.
  • the radiation dose is preferably 10 kGy to 48 kGy, more preferably 12 kGy to 45 kGy, even more preferably 12 kGy to 30 kGy.
  • the preferable numerical range of the irradiation dose and irradiation time is the preferable numerical range when crosslinked gelatin is irradiated with radiation from one direction, and when irradiating from two or more directions, it is not limited to the above and may be adjusted as appropriate. Adjustment is preferred.
  • a gelatin solution may be prepared by dissolving gelatin in an aqueous medium, or a prepared gelatin solution may be prepared.
  • the aqueous medium that can be used is not particularly limited as long as it can dissolve gelatin and can be used for living tissues, and examples include water, physiological saline, phosphate buffer, and the like.
  • the content of gelatin with respect to the total mass of the gelatin solution is not particularly limited, and is preferably 0.5% to 20% by mass, more preferably 2% to 16% by mass, and 4% to 4% by mass. More preferably, it is 12% by mass.
  • the strength of the tissue repair material tends to increase, and when the gelatin content is 20% by mass or less, the tissue repair material has a highly uniform mesh. It becomes easier to form a structure, and tissue repair speed and tissue repairability tend to be improved.
  • the temperature of the aqueous medium when preparing the gelatin solution can be 0°C to 60°C, preferably 3°C to 30°C.
  • the gelatin solution may contain components other than gelatin, such as a crosslinking agent.
  • the gelatin solution is freeze-dried to obtain a freeze-dried product.
  • the method for producing a tissue repair material of the present disclosure includes an ice crystal formation step, the cooled gelatin solution is freeze-dried.
  • the freezing conditions conditions normally used for protein freeze-drying may be used as they are. Freeze-drying time can be, for example, 0.5 to 300 hours. There are no particular restrictions on the freeze dryer that can be used.
  • the lyophilized gelatin is pulverized to obtain a pulverized product.
  • the pulverization can be carried out using a pulverizer such as a hammer mill or a screen mill. It is preferable to use a screen mill from the viewpoint that the pulverized material pulverized to a certain size can be recovered at any time and the variation in particle size is small.
  • a screen mill a Cormill manufactured by Quadro, etc. can be used.
  • Examples of the pulverization method include a crushing method and a cutting method.
  • the pulverization step may include pulverizing the freeze-dried gelatin to obtain a pulverized product, and then classifying the pulverized product. Thereby, a pulverized product having a uniform particle size can be obtained.
  • classification it is preferable to use, for example, a sieve with an opening of 300 ⁇ m to 1400 ⁇ m.
  • the method for producing a tissue repair material of the present disclosure can include an ice crystal formation step before the freeze-drying step. Thereby, a gelatin-containing intermediate having ice crystals inside can be obtained.
  • the formed ice crystals cause the peptide chains of gelatin to become coarser and the gelatin-containing intermediate solidifies, so that after the ice crystals disappear, a gelatin-containing intermediate having voids inside is formed.
  • the disappearance of ice crystals can be achieved by drying in the freeze-drying process.
  • the pore size of the voids in the gelatin-containing intermediate can be adjusted by adjusting the ice crystal temperature, cooling time, etc.
  • the shape of the void there is no particular restriction on the shape of the void, and it may be a two-dimensional structure or a three-dimensional structure.
  • the cross-sectional shape of the mesh is not particularly limited, and examples include polygons, circles, and ellipses.
  • Examples of the three-dimensional structure of the void include columnar, spherical, and the like. From the viewpoint of tissue repair speed and tissue repairability, the shape of the void is preferably spherical.
  • the gelatin-containing intermediate may have communicating pores in which voids are continuously formed. Since the communicating holes have been described above, their description will be omitted here.
  • the pore diameter of the voids is preferably 10 ⁇ m or more, more preferably 50 ⁇ m or more, and even more preferably 100 ⁇ m or more, from the viewpoint of tissue repair speed and tissue repair properties.
  • the pore diameter of the void is the average diameter in the major axis direction (major axis), and is measured as follows.
  • a test piece obtained by cutting the dried intermediate obtained after drying the gelatin-containing intermediate in the horizontal direction and a test piece cut in the vertical direction are prepared.
  • the horizontal direction of the dry intermediate means a direction that is horizontal to a flat surface when the dry intermediate is left standing. Note that the dry intermediate is left standing so that the area in contact with a flat surface is maximized.
  • the cross section of each test piece is stained by bringing it into close contact with a stamp stand, and a 2.0 mm x 2.0 mm area is observed using an optical microscope.
  • the circumscribed rectangle in which the distance between two opposing sides of the rectangle is the largest is selected.
  • the length of the long side of the circumscribed rectangle where the distance between the two opposing sides is maximum is 50 within the observation area of each of the cross section of the test piece cut in the horizontal direction and the cross section of the test piece cut in the vertical direction.
  • the measurement is performed one by one, and the average value is taken as the average value of the long diameter of the voids in the gelatin-containing intermediate.
  • the aspect ratio of the void is between 1 and 3, it is defined as “spherical", and when it is outside this range, it is defined as “columnar”.
  • the aspect ratio is preferably 4 or 5 from the viewpoint of tissue repair speed and tissue repairability.
  • the porosity of the gelatin-containing intermediate is preferably 80% to 99.99%, more preferably 95.01% to 99.9%.
  • the porosity of the gelatin-containing intermediate is determined using the bulk density ( ⁇ 1) of the gelatin-containing intermediate, the true density ( ⁇ c1) of crosslinked gelatin, and the following formula.
  • the bulk density ( ⁇ 1) is calculated from the dry mass and volume of the gelatin-containing intermediate, and the true density ( ⁇ c1) of the gelatin-containing intermediate is determined by the pycnometer method using a Gay-Lussac type pycnometer.
  • Porosity P1 (%) (1- ⁇ 1/ ⁇ c1) x 100
  • Ice crystal formation temperature means the temperature at which at least a portion of the gelatin solution freezes.
  • the ice crystal formation temperature varies depending on the solid content concentration of the gelatin solution, but can generally be set to -10°C or lower.
  • the cooling temperature of the gelatin solution is preferably -100°C to -10°C, more preferably -80°C to -20°C, even more preferably -40°C to -60°C.
  • the cooling time is preferably 1 to 6 hours from the viewpoint of uniform ice crystal formation.
  • tissue repair material of the present disclosure includes applying the tissue repair material to a defective or damaged site in a target tissue.
  • the target tissue is preferably a hard tissue such as a tooth or bone, and the tissue repair material is preferably used for bone regeneration.
  • Use of the tissue repair material of the present disclosure includes applying at least one of transplanted cells and an osteoinductive agent to the site to which the tissue repair material is applied, as necessary, before or after application of the tissue repair material. You can stay there.
  • the use of tissue repair materials includes treatment methods or restorative methods such as periodontal defects in the maxillofacial region, implant defects, etc.; GBR method as a preliminary treatment for implant placement, gingival augmentation, etc. It can be preferably applied to ridge augmentation method, sinus lift method, socket reservation method, etc.
  • CBE3 described in WO2008/103041A1 was prepared as a recombinant gelatin.
  • the details of CBE3 are as follows. ⁇ Molecular weight: 51.6kDa ⁇ Number of amino acid residues: 571 ⁇ Number of RGD sequences: 12 ⁇ Amino acid sequence: SEQ ID NO: 1 GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPA
  • An aqueous solution containing 7.5% by mass of CBE3 was prepared.
  • the aqueous solution was poured into a cylindrical container and then placed in a freeze dryer.
  • the aqueous solution was frozen at ⁇ 60° C. for 1 hour or more, and primary drying was performed at ⁇ 15° C. for 38 hours under vacuum and secondary drying was performed at 23° C. for 2 hours to obtain sponge-like gelatin.
  • Sponge-like gelatin was pulverized using a screen pulverizer (Cormil U10, manufactured by Quadro) using a 0.079-inch screen and then a 0.040-inch screen to obtain a pulverized product.
  • a test sieve of ISO3310 standard the pulverized material was sieved in accordance with the method described in Method 2 of Section 3.04 of the 16th revised Japanese Pharmacopoeia. Specifically, the fraction that passed through a sieve with an opening of 1400 ⁇ m and remained on a sieve with an opening of 300 ⁇ m was collected, and about 0.09 g was placed in a 10 mL glass vial ( ⁇ 24.3 mm, height 46.5 mm). Filled.
  • the crushed product filled in a glass vial was placed in a clean oven (NCO-500A600L-WS, manufactured by Nitto Rika Kogyo Co., Ltd.), and heated at a heating temperature of 135°C to 140°C for 4.75 hours in a nitrogen atmosphere.
  • the pulverized material was heated to obtain particulate crosslinked gelatin.
  • the glass vial was capped with a rubber stopper (rubber stopper 2A) and sealed with an aluminum cap.
  • the glass vial filled with the crosslinked gelatin was placed in a cardboard box, a polymethyl methacrylate dosimeter was attached to the side of the cardboard box, and a dose of 18 kGy was irradiated to obtain a tissue repair material.
  • Example 2 A tissue repair material was obtained in the same manner as in Example 1, except that the dose of irradiated gamma rays was changed to 28 kGy.
  • Example 3 A tissue repair material was obtained in the same manner as in Example 1, except that the dose of irradiated gamma rays was changed to 13 kGy and the heating time of the crushed material was changed to 6.25 hours.
  • Example 4 A tissue repair material was obtained in the same manner as in Example 1, except that the dose of irradiated gamma rays was changed to 28 kGy and the heating time of the crushed material was changed to 6.25 hours.
  • Example 5 A tissue repair material was obtained in the same manner as in Example 1, except that the dose of irradiated gamma rays was changed to 28 kGy and the heating time of the crushed material was changed to 8.00 hours.
  • Example 1 A tissue repair material was obtained in the same manner as in Example 1 except that ⁇ -ray irradiation was not performed.
  • the elution curves obtained from the tissue repair materials of Examples 1 to 7 have molecular weights in the range of 43 kDa or more and 51 kDa or less, molecular weights in the range of 28 kDa or more and less than 43 kDa, and molecular weights in the range of 14 kDa or more and less than 28 kDa. At least two absorption peaks with an absorbance of 0.025 or more (described as absorption peak number in Table 1) were observed.
  • the elution curves obtained from the tissue repair materials of Comparative Examples 1 and 2 have molecular weights in the range of 43 kDa or more and 51 kDa or less, molecular weights in the range of 28 kDa or more and less than 43 kDa, and molecular weights in the range of 14 kDa or more and less than 28 kDa. No absorption peak with an absorbance of 0.025 or more was observed in any range.
  • a microtube (hereinafter referred to as tube) was prepared, and its mass (A) was measured. 15.0 ( ⁇ 0.2) mg of the tissue repair material produced in the Examples and Comparative Examples was weighed (mass: B) and filled into a tube. 1.7 mL of 1 mol/L hydrochloric acid was added to the tube containing the tissue repair material, and heated for 3 hours using a heat block set at 37°C. After heating, the tube was placed on ice to stop the acid decomposition reaction, and centrifuged at 10,000 xg for 1 minute using a centrifuge preset at 4°C.
  • the supernatant was sucked out, 1 mL of ultrapure water previously chilled on ice was added, and the tube was centrifuged again under the same conditions as above. After centrifugation, the supernatant was sucked out, ultrapure water was added again, and centrifugation was performed again under the same conditions as above. After centrifugation, the supernatant is sucked out, and the tube filled with the tissue repair agent is placed in a -80°C freezer (Ultra-low temperature freezer CLN-31UW, manufactured by Nippon Freezer Co., Ltd.) for at least 1 hour to obtain the frozen tissue repair agent. I got it.
  • a -80°C freezer Ultra-low temperature freezer CLN-31UW, manufactured by Nippon Freezer Co., Ltd.
  • tissue repair materials obtained in the Examples have excellent tissue repair properties compared to the tissue repair materials obtained in the Comparative Examples. Moreover, from Table 1, it can be seen that the tissue repair materials obtained in the examples have excellent tissue repair speed.

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Abstract

架橋ゼラチンを含有し、且つ一定条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、上記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークが少なくとも１つ存在する、組織修復材及び組織修復材の製造方法。

Description

組織修復材及び組織修復材の製造方法
　本開示は、組織修復材及び組織修復材の製造方法に関する。
　現在、機能障害や機能不全に陥った、生体組織又は臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
　このうち、整形外科領域又は歯科領域の骨再生は、再生医療領域において非常に注目を集めている領域である。骨疾患が足又は腰において生じている場合は、疾患に起因して発生した骨欠損により、歩行不能となり、骨疾患が歯周組織の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）の低下を引き起こす。
　再生医療の分野では、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンが用いられている。例えば、国際公開第２０１３／１３７２６８号においては、架橋ゼラチンを含有する組織修復材が開示される。
　ところで、組織修復材には、優れた組織修復能を有することが求められており、例えば、組織修復材を欠損又は損傷した部位に適用した後、４週間程度経過後の組織修復率が高いこと（以下、組織修復性ともいう。）が求められる。
　本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、組織修復性に優れる組織修復材及び組織修復材の製造方法を提供することである。
　本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞　架橋ゼラチンを含有し、且つ
　以下条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、上記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークが少なくとも１つ存在する、組織修復材。
（条件）
カラム長さ：１５０ｍｍ
カラム内径：４．６ｍｍ
充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
充填剤のポアサイズ：２００Å
カラム温度：３０℃
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
流速：０．１ｍＬ／分
検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
測定波長：２１５ｎｍ
測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
測定試料の量：５μＬ
＜２＞　分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに吸収ピークを有する、上記＜１＞に記載の組織修復材。
＜３＞　上記架橋ゼラチンの吸水率が４５０％以上である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の組織修復材。
＜４＞　１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による、上記架橋ゼラチンの残存率が６０％以下である、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の組織修復材。
＜５＞　上記ゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；及び配列番号１に記載のアミノ酸配列における第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；からなる群より選択される１種以上である、上記＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の組織修復材。
＜６＞　上記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下における面積に対する、分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下における面積の比が２．５以上である、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の組織修復材。
＜７＞　ゼラチンを１００℃～１７０℃、２時間～２４時間の条件で加熱し、架橋ゼラチンを得る工程と、
　上記架橋ゼラチンに対し、線量５ｋＧｙ～５０ｋＧｙの放射線を照射する工程と、
を有する、組織修復材の製造方法。
＜８＞　上記放射線が、γ線又は電子線である、上記＜７＞に記載の組織修復材の製造方法。
＜９＞　上記＜７＞又は＜８＞に記載の組織修復材の製造方法により製造される組織修復材の、以下条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、上記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに吸収ピークを有する、上記＜７＞又は＜８＞に記載の組織修復材の製造方法。
（条件）
カラム長さ：１５０ｍｍ
カラム内径：４．６ｍｍ
充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
充填剤のポアサイズ：２００Å
カラム温度：３０℃
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
流速：０．１ｍＬ／分
検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
測定波長：２１５ｎｍ
測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
測定試料の量：５μＬ
＜１０＞　放射線照射後の上記架橋ゼラチンの吸水率が４５０％以上である、上記＜７＞～＜９＞のいずれか１つに記載の組織修復材の製造方法。
＜１１＞　放射線照射後の上記架橋ゼラチンの酸分解残存率が６０％以下である、上記＜７＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組織修復材の製造方法。
＜１２＞　放射線照射後の上記架橋ゼラチンが多孔質体であり、且つ
　放射線照射後の上記架橋ゼラチンの空隙率が、８０．００％～９９．９９％である、上記＜７＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の組織修復材の製造方法。
＜１３＞　上記ゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；及び配列番号１に記載のアミノ酸配列における第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；からなる群より選択される１種以上である、上記＜７＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の組織修復材の製造方法。
　本開示の一実施形態によれば、組織修復性に優れる組織修復材及び組織修復材の製造方法を提供することができる。
図１は、実施例１の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。 図２は、実施例２の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。 図３は、実施例３の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。 図４は、実施例４の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。 図５は、実施例５の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。 図６は、比較例１の組織修復材から得られた溶出曲線を示す。
　以下、本開示の実施形態について詳細に説明する。本開示は、以下の実施形態に何ら制限されない。以下の実施形態は、本開示の目的の範囲内において適宜変更されてもよい。
　本開示において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前に記載される数値を下限値として、「～」の前に記載される数値を上限値として含む範囲を示す。本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において、ゼラチンを構成するアミノ酸配列を、当業界で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
　本開示において、「ゼラチン」とは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示されるアミノ酸配列を連続して６以上含むポリペプチドを意味する。
　なお、Ｇｌｙ－Ｘ－ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。
　本開示において、「架橋ゼラチン」とは、ゼラチン同士が架橋したものを意味する。
　本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する該当する複数の物質の合計量を意味する。
　本開示において、「工程」との用語は、独立した工程だけでなく、所期の目的が達成される場合には他の工程と明確に区別できない工程も包含する。
　本開示において、架橋ゼラチンの吸収ピークは以下のようにして確認する。
　まず、容量１５ｍＬのチューブに、組織修復材を５ｍｇ充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。
　次いで、転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取する。分取した溶液を、孔径０．２２μｍフィルターによりろ過を行い、測定試料とする。
　測定試料５μＬに対し、下記条件のゲル浸透クロマトグラフィーを実施し、縦軸を吸光度、横軸を溶出時間とする溶出曲線を得る。
　測定試料と同一又は異なるタイミングで、ポリスチレン標準物質などの分子量既知の物質を測定し、溶出曲線における溶出時間と分子量の関係を把握する。
　上記のようにして得られた溶出曲線から吸収ピークの有無を確認する。
　なお、本開示において、吸収ピークとは、吸光度が極大点となる波形のみならず、図１において符号Ｘで示す肩部を有する波形も包含する。
　カラムとしては、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＥＨ　ＳＥＣ　Ｃｏｌｕｍｎ、２００Å,　１．７μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ又はこれと同程度の性能のものを使用することができる。
（条件）
カラム長さ：１５０ｍｍ
カラム内径：４．６ｍｍ
充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
充填剤のポアサイズ：２００Å
カラム温度：３０℃
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
流速：０．１ｍＬ／分
検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
測定波長：２１５ｎｍ
測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
測定試料の量：５μＬ
　本開示において、ゼラチンの加熱温度とは、加熱に使用する装置の設定温度を指し、加熱されるゼラチンの温度ではない。
　本開示において、組織修復材の吸水率は、以下のようにして測定する。
　まず、マイクロチューブ（以下、チューブという。）に、質量（ｗ０）を測定したフィルターカップをセットする。
　次いで、５００μＬの水をフィルターカップに加え、ローテータにて２時間撹拌させる。
　攪拌後、チューブを２５℃、６０００×ｇの条件で１分間遠心を行い、水がフィルターカップから、チューブ内へ移動したことを確認する。フィルターカップの質量（ｗ１）を再度測定し、以下の式を用いて残水量を算出する。
　　残水量（ｍｇ）：ｗ１－ｗ０
　次いで、チューブに、質量（ｗ２）を測定した別のフィルターカップをセットし、組織修復材をフィルターカップへ１０ｍｇ（質量：ｗ３）充填する。
　次いで、５００μＬの水をフィルターカップへ加え、ローテータにて２時間撹拌させる。
　攪拌後、チューブを２５℃、６０００×ｇの条件で１分間遠心を行い、水がフィルターカップから、チューブ内へ移動したことを確認する。
　フィルターカップに残存した組織修復材の質量及びフィルターカップの質量の和（ｗ４）を測定し、下記式（１）を用いて吸水率を算出する。
　　吸水率（％）＝（ｗ４－ｗ２－(ｗ１－ｗ０)）／ｗ３×１００・・・・（１）
　本開示において、組織修復材の酸分解残存率は、以下のようにして測定する。
　マイクロチューブ（以下、チューブという。）を用意し、その質量（Ａ）を測定する。
　組織修復材を１５．０（±０．２）ｍｇをｍｇ秤量し（質量：Ｂ）、チューブへ充填する。
　組織修復材入りのチューブに、１モル／Ｌの塩酸を１．７ｍＬ添加し、３７℃に設定したヒートブロックを用いて、３時間加熱する。
　加熱後、チューブを氷上に立て、酸分解反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心器を用いて、１０，０００×ｇの条件で１分間遠心する。
　チューブ内において、組織修復材が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を１ｍＬ添加して、上記と同一の条件で再度、遠心する。
　遠心後、上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心する。
　遠心後、上清を吸い取り、凍結乾燥する。
　凍結乾燥後、凍結乾燥機から取り出し、空気中の水分を組織修復材が吸い取るのを防ぐため、すばやくチューブのキャップを閉める。
　チューブの質量（Ｃ）を測定し、下記式（２）を用いて酸分解残存率を算出する。
残存率（％）＝（Ｃ－Ａ）／Ｂ×１００・・・・（２）
　本開示において、架橋ゼラチンの分子量は、標準物質としてポリスチレンを用いて換算した分子量であり、上記ゲル浸透クロマトグラフィーにより上記条件にて測定する。
　本開示において、放射線の線量は、下記方法により測定する。
　架橋ゼラチンを充填した複数のバイアルをダンボール箱に入れ、ダンボール箱側面にポリメチルメタクリレート線量計を貼り付ける。この状態で放射線を照射後、線量計によって測定された放射線の線量を、架橋ゼラチンに照射した放射線の線量とする。
［組織修復材］
　本開示の組織修復材は、架橋ゼラチンを含有し、且つ以下条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、前記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークが少なくとも１つ存在する。
（条件）
カラム長さ：１５０ｍｍ
カラム内径：４．６ｍｍ
充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
充填剤のポアサイズ：２００Å
カラム温度：３０℃
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
流速：０．１ｍＬ／分
検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
測定波長：２１５ｎｍ
測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
測定試料の量：５μＬ
　また、組織修復材には、欠損又は損傷した部位に適用した後、２週間程度経過後の組織修復率が高いこと（以下、組織修復速度ともいう。）が求められることがある。溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークが少なくとも１つ存在することにより、組織修復材の組織修復速度を向上することができる傾向にある。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、上記吸収ピークの吸光度は、０．０２５以上であることが好ましく、０．０３以上であることがより好ましく、０．０３５以上であることが更に好ましい。
　上記吸収ピークの吸光度の上限は、特に限定されず、０．０６以下とすることができる。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、上記吸収ピークを２つ以上有することが好ましく、３つ以上存在することがより好ましい。
　上記吸収ピークが２つ又は３つ存在する場合、吸収ピークは、分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに存在することが好ましく、分子量が４３ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲、分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに存在することが好ましい。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下における面積に対する、分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下における面積の比が２．５以上であることが好ましく、３．０以上であることがより好ましく、７．０以上であることが更に好ましい。
　上記面積比の上限は、特に限定されず、３０．００以下とすることができる。
　本開示において、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下における面積、及び分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下における面積は、上記のようにして得られた溶出曲線から求める。
　具体的には、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下の範囲、又は分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下の範囲において、溶出曲線とベースラインとにより囲まれる領域の面積を求めることにより行う。
　なお、ベースラインとは、吸光度が０となる直線を指す。
　本開示の組織修復材の吸水率は、４５０％以上であることが好ましく、５００％以上であることがより好ましく、６００％以上であることが更に好ましい。
　組織修復材の吸水率が４５０％以上であることにより、組織修復時における血餅保持性を向上することができ、組織修復速度及び組織修復性を向上することができる。
　組織修復材の吸水率の上限値は、特に制限はないが、好ましくは９９００％以下、より好ましく５０００％以下、更に好ましくは３０００％以下である。
　組織修復材の吸水率は、組織修復材に含まれる成分、架橋ゼラチンの種類、架橋ゼラチンの形態により調整することができる。また、吸水率は、組織修復材の製造方法における凍結工程、架橋工程の温度、架橋工程の架橋処理時間等によって調整することができる。
　一般に、凍結工程の温度を高くする、架橋工程の温度を低くする、又は架橋工程の架橋処理時間を短くすると、吸水率が高まる傾向がある。
　本開示の組織修復材は、組織修復速度及び組織修復性の観点から、１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による残存率（酸分解残存率）が、質量基準で６０％以下であることが好ましく、５５％以下であることがより好ましく、５０％以下であることが更に好ましい。
　また、組織修復材の酸分解残存率は、欠損部位での体積の維持、及び再生する組織との置換の観点から、５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、４０質量％以上であることが更に好ましい。
　組織修復材の酸分解残存率は、組織修復材に含まれる成分、架橋ゼラチンの種類、架橋ゼラチンの形態により調整することができる。また、酸分解残存率は、組織修復材の製造方法における凍結工程、架橋工程の温度、架橋工程の架橋処理時間等によって調整することができる。
　一般に、凍結工程の温度を高くする、架橋工程の温度を低くする、又は架橋工程の架橋処理時間を短くすると、酸分解残存率が低くなる傾向がある。
＜架橋ゼラチン＞
　本開示の組織修復材は、ゼラチンに対して、加熱処理、架橋剤処理等を施すことにより得られる架橋ゼラチンを含有する。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、架橋ゼラチンはゼラチンに対し加熱処理を施すことにより得られるものであることが好ましく、本開示においては、加熱処理が施された架橋ゼラチンを脱水架橋ゼラチンともいう。脱水架橋ゼラチンは、その架橋において、架橋剤を使用する必要がない、又は使用する量が少なく、細胞毒性、炎症等の原因となる可能性が低く、生体安全性の観点から好ましい。
　架橋ゼラチンを製造するために使用するゼラチンは、天然型のゼラチンであっても、天然型とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる変異型又は組換え体であってもよい。
　なお、本開示において、天然型のゼラチンとは、天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチン、又は天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
　特に断らない限り、本開示では、変異型又は組換え体のゼラチンを総称して、組換えゼラチンと称する。
　天然型のゼラチン又はその組換えゼラチンとしては、魚類、哺乳類等の動物に由来するものが挙げられるが、哺乳類由来の天然型ゼラチン又はその組換えゼラチンであることが好ましい。
　哺乳類としては、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等が挙げられ、ヒト又はブタであることがより好ましい。
　天然型ゼラチンとしてはブタ由来又はヒト由来天然ゼラチンであることが好ましく、組換えゼラチンとしてはヒト由来組換えゼラチンであることが好ましい。
　本開示において、ゼラチンは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示されるアミノ酸配列を連続して６以上含むポリペプチドを意味し、ポリペプチド中にＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示されるアミノ酸配列以外に他のアミノ酸残基を１以上有していてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。
　Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示されるアミノ酸配列は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列に相当する配列であり、この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。
　ゼラチン１分子中の複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。また、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ配列中Ｘ及びＹは繰返し単位ごとに独立であり、同一でも異なっていてもよい。
　Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基（具体的には、プロリン残基又はオキシプロリン残基）が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、ゼラチン１分子中の１０質量％～４５質量％を占めることが好ましい。ゼラチン１分子中のＧｌｙ－Ｘ－Ｙの含有率としては、全体の８０質量％以上であることが好ましく、９５質量％以上であることが更に好ましく、９９質量％以上であることが最も好ましい。
　ゼラチンとしては、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示されるアミノ酸配列を連続して６以上有するコラーゲンをコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に対して、１つ以上の塩基又はアミノ酸残基の変更を加えた塩基配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子を、常法により、適当な宿主に導入し発現させて得られた組換えゼラチンであることが好ましい。
　このような組換えゼラチンを用いることにより、組織修復速度及び組織修復性を高め、且つ、天然のゼラチンを用いる場合と比較して種々の特性を発現させることができる。例えば、生体における拒絶反応等の不都合な影響を回避することができる。
　組換えゼラチンとしては、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２Ｂ１、ＷＯ２００４／８５４７３Ａ２、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１、特表２０１０－５１９２９３号公報、特表２０１０－５１９２５２号公報、特表２０１０－５１８８３３号公報、特表２０１０－５１９２５１号公報、ＷＯ２０１０／１２８６７２Ａ１、ＷＯ２０１０／１４７１０９Ａ１等に開示されているものを特に好ましく用いることができる。
　ゼラチンの分子量は、２ｋＤａ～１００ｋＤａであることが好ましく、５ｋＤａ～９０ｋＤａであることがより好ましく、１０ｋＤａ～９０ｋＤａ以下であることが更に好ましい。
　ゼラチンは、生体親和性の点で、細胞接着シグナルを更に含むものであることが好ましく、一分子中に細胞接着シグナルを２つ以上有するものであることがより好ましい。
　細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列又はＨＡＶ配列であることが好ましく、ＲＧＤ配列であることがより好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。
　ゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ配列間のアミノ酸残基数が０個～１００個であることが好ましく、２５個～６０個であることがより好ましい。また、ＲＧＤ配列は、上記アミノ酸残基数の範囲内で、不均一に配置されていることが好ましい。
　ゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するＲＧＤ配列の割合（ＲＧＤ配列の合計アミノ酸残基数／アミノ酸残基の総数×１００）は、少なくとも１．２％であることが好ましく、組換えゼラチンが２５０個以上のアミノ酸残基を含む場合、２５０個のアミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
　ゼラチンは、２５０個のアミノ酸残基あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。
　ゼラチンの配列は、以下の態様の少なくとも１つを満たすことが好ましいが、これに限定されるものではない。
（１Ａ）セリン残基及びスレオニン残基を含まない配列、
（２Ａ）セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基を含まない配列、
（３Ａ）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐで示されるアミノ酸配列を含まない配列。
　ゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　ゼラチンは、Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂのアミノ酸配列を有することが好ましい。ここで、Ａは１個又は２個以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１個又は２個以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。
　ｍは、２～１０の整数を表し、３～５の整数を表すことが好ましい。ｎは３～１００の整数を表し、１５～７０の整数を表すことが好ましく、５０～６５の整数を表すことがより好ましい。ｍ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
　より好ましくは、組換えゼラチンは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙのアミノ酸配列を有する。
　ここで、６３個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、６３個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、全て同一であってもよく、一部が同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
　ゼラチンの繰り返し単位は、天然に存在するコラーゲンのアミノ酸配列の一部を一単位とし、この一単位を複数結合して形成されていることが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びＶ型コラーゲンが挙げられ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン又はＩＩＩ型コラーゲンがより好ましい。
　コラーゲンは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス又はラット由来のコラーゲンであることが好ましく、ヒト由来のコラーゲンであることがより好ましい。
　ゼラチンの等電点は、５～１０であることが好ましく、６～１０であることがより好ましく、７～９．５であることがさらに好ましい。
　なお、ゼラチンの等電点は、ゼラチンのアミノ酸組成に基づいて算出する。
　ゼラチンは、以下の態様の少なくとも１つを満たすことが好ましいが、これに限定されるものではない。
（１Ｂ）カルバモイル基が加水分解されていない、
（２Ｂ）プロコラーゲンを有しない、
（３Ｂ）テロペプタイドを有しない、
（４Ｂ）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、ゼラチンは、下記配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、特定ペプチドＡともいう。）；配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列（以下、特定アミノ酸配列Ｂともいう。）からなり、且つ生体親和性を有するペプチド（以下、特定ペプチドＢともいう。）；及び配列番号１に記載のアミノ酸配列における第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（以下、特定アミノ酸配列Ｃともいう。）からなり、且つ生体親和性を有するペプチド（以下、特定ペプチドＣともいう。）；からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAA
GLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
　特定ペプチドＢにおいて、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数は、１個又は数個であればよく、２個～１５個とすることができ、２個～５個であることが好ましい。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、特定ペプチドＣの配列同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
　部分アミノ酸配列は、配列番号１で示される配列の繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列である。
　特定ペプチドＣは、特定アミノ酸配列Ｃを２つ以上含んでいてもよい。
　特定ペプチドＣに含まれる全アミノ酸残基数に対する、特定アミノ酸配列Ｃに含まれるアミノ酸残基数の割合は８０％以上であることが好ましい。
　組換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができる。
　例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２Ｂ１、ＷＯ２００４／８５４７３Ａ２又はＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１等に記載の方法に準じて製造することができる。
　ゼラチンに含まれるアミノ酸残基数は、１５１個～２２６０個とすることができ、架橋後の分解性の観点から、１９３個以上であることが好ましく、安定性の観点から、９４４個以下であることが好ましく、３８０個～７５６個であることがより好ましい。
　架橋ゼラチンの形態は、特に限定されず、スポンジ、フィルム、不織布、粒子、メッシュ等の形態が挙げられる。
　これらの中でも、細胞侵入性、組織修復速度及び組織修復性の観点から、架橋ゼラチンの形態は粒子であることが好ましい（以下、粒子状の架橋ゼラチンを架橋ゼラチン粒子ともいう。）。
　細胞侵入性の観点から、架橋ゼラチン粒子は、４ｍｍの目開きのふるいを通過する粒子であることが好ましく、１４００μｍの目開きのふるいを通過する粒子であることがより好ましく、１０００μｍの目開きのふるいを通過する粒子であることが更に好ましく、７１０μｍの目開きのふるいを通過する粒子群であることが特に好ましい。
　本開示の組織修復材を所定の空間に配置させることにより形成された層（以下、製剤層ともいう。）の弾性の観点からは、架橋ゼラチン粒子は、７５μｍの目開きのふるいに残留することが好ましく、３００μｍの目開きのふるいに残留することがより好ましい。
　架橋ゼラチン粒子のふるい分けには、ＩＳＯ３３１０規格の試験ふるいを使用し、ふるい分けの方法は、第１６改正日本薬局方３．０４節の第２法に記載のふるい分け法に準じる。
　すなわち、５分間の振とうを断続的に複数回行い、振とう後、ふるい上に残った粒子群の質量が、振とう前のふるい上の粒子群の質量に対して５％以下となったとき、終了する。
　本開示において「通過する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の１０質量％以下であることを意味する。また、本開示において、「残留する」との語は、上記終点時にふるい上に残る粒子がふるい前の全質量の９５質量％以上であることを意味する。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、架橋ゼラチンは多孔質体であることが好ましい。
　細胞侵入性、組織修復速度及び組織修復性の観点からは、架橋ゼラチンの空隙率は、８０％～９９．９９％であることが好ましく、９５．０１％～９９．９％であることがより好ましい。
　なお、本開示において、架橋ゼラチンの空隙率は、架橋ゼラチンの嵩密度（ρ）及び架橋ゼラチンの真密度（ρc）と、下記式を利用して求める。
　なお、嵩密度（ρ）は、架橋ゼラチンの乾燥質量及び体積から算出し、架橋ゼラチンの真密度（ρc）は、ゲイリュサック型比重瓶の比重瓶法により求める。
空隙率Ｐ（％）＝（１－ρ／ρｃ）×１００
　細胞侵入性の観点から、本開示の組織修復材を所定の空間に配置させることにより形成された製剤層の空隙率は、７０％～９６．５％であることが好ましく、８０％～９０％であることがより好ましい。
　本開示において、製剤層の空隙率は、架橋ゼラチン粒子のタップ密度（ρｔ）と架橋ゼラチン粒子の真密度（ρc）とにより、下記式から求める。
　製剤層の空隙率Ｐ（％）＝（１－ρｔ／ρｃ）×１００
　タップ密度（ρt）は、後述する方法により求める。真密度（ρc）は、ハバード型比重瓶の比重瓶法により求める。
　架橋ゼラチン粒子は、連通孔を有するものであってもよい。架橋ゼラチン粒子が連通孔を有することによって、組織修復材の外部から内部にまで空隙が連なることとなり、組織修復材の外部に接触した細胞の、組織修復材の内部への分散又は拡散可能となる。
　連通孔の孔径は、上記機能を発揮するため、１０μｍ～２５００μｍであることが好ましく、５０μｍ～２５００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～１０００μｍであることが更に好ましい。
　製剤層の弾性及び細胞侵入性の観点から、架橋ゼラチン粒子のタップ密度は、１０ｍｇ／ｃｍ３～５００ｍｇ／ｃｍ３であることが好ましく、３０ｍｇ／ｃｍ３～４５０ｍｇ／ｃｍ３であることがより好ましく５０ｍｇ／ｃｍ３～４２０ｍｇ／ｃｍ３であることが更に好ましく、１４０ｍｇ／ｃｍ３～２８０ｍｇ／ｃｍ３であることが特に好ましい。
　本開示において、タップ密度は、ある体積にどれくらいの粒子を密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、製剤層の構造がより複雑になる傾向があり、また、粒子のサイズ分布が広くなる傾向があり、且つ、粒子が粗に充填される傾向にある。
　本開示において、タップ密度の測定方法は、以下のようにして行う。
　まず、直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状（体積０．６１６ｃｍ２）の容器（以下、キャップと記載する）を用意し、キャップのみの質量を測定する（ｗｔ）。
　次いで、キャップとロートとを連結し、架橋ゼラチン粒子がキャップに溜まるように、ロートから流し込む。
　十分量の架橋ゼラチン粒子を流し込んだ後、机などの硬いところに、キャップ部分を２００回たたきつけ、ロートをはずし、キャップの縁を超えて盛り上がっている架橋ゼラチン粒子をスパチュラですりきる。
　キャップにすりきり一杯入った状態の架橋ゼラチン粒子の質量を測定する（ｗｇ）。
　上記のようにして測定した質量ｗｔ及び質量ｗｇとの差から架橋ゼラチン粒子のみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求める。
タップ密度ρｔ＝（ｗｇ－ｗｔ）／０．６１６
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、本開示の組織修復材の総質量に対する架橋ゼラチンの含有率は、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることが更に好ましく、９５質量％以上であることが得に好ましい。
　架橋ゼラチンの含有率の上限は、特に限定されず、１００質量％であってもよい。
＜架橋ゼラチン以外の成分＞
　本開示の組織修復材は、架橋ゼラチン以外の成分を含有してもよく、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、骨形成因子（ＢＭＰ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等が挙げられる。
［組織修復材の製造方法］
　本開示の組織修復材の製造方法は、ゼラチンを１００℃～１７０℃、２時間～２４時間の条件で加熱し、架橋ゼラチンを得る工程（以下、架橋工程という。）と、架橋ゼラチンに対し、線量５ｋＧｙ～５０ｋＧｙの放射線を照射する工程（以下、放射線照射工程という。）と、を有する。
　本開示の組織修復材の製造方法は、架橋ゼラチンを得る工程の前に、水性媒体に溶解したゼラチンを含むゼラチン溶液を準備する工程（以下、ゼラチン溶液準備工程という。）、ゼラチン溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥体を得る工程（以下、凍結乾燥工程という。）、凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得る工程（以下、粉砕工程という。）を有していてもよい。
　また、本開示の組織修復材の製造方法は、多孔質体である架橋ゼラチンを得るために、凍結乾燥工程の前に、ゼラチン溶液を氷晶形成温度以下に冷却する工程（以下、氷晶形成工程という。）を有することが好ましい。
＜架橋工程＞
　本開示の組織修復材の製造方法は、ゼラチンを１００℃～１７０℃、２時間～２４時間の条件で加熱し、架橋ゼラチンを得る工程を有する。
　架橋するゼラチンの種類等については、上記したためここでは記載を省略する。また、架橋するゼラチンは、後述するゼラチン溶液の凍結乾燥体粉砕物であってもよい。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、加熱温度は、１２０℃～１７０℃であることが好ましく、１２０℃～１５０℃であることがより好ましく、１３０℃～１４０℃であることがより好ましい。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、加熱時間は、２時間～２０時間であることが好ましく、４時間～１２時間であることがより好ましく、４．５時間～８時間であることが更に好ましい。
　ゼラチンの加熱は、酸化防止のため、減圧下、真空下又は不活性ガス雰囲気下において行うことが好ましく、真空下又は不活性ガス雰囲気下において行うことがより好ましく、不活性ガス雰囲気下において行うことが更に好ましい。
　減圧下において、ゼラチンの加熱を行う場合、４ｈＰａ以下の環境とすることが好ましい。
　不活性ガスとしては、窒素が好ましい。
　ゼラチンの加熱には従来公知の加熱装置を使用することができ、例えば、ヤマト科学株式会社製のＤＰ－４３を使用することができる。
＜放射線照射工程＞
　放射線照射工程において使用される放射線としては、α線、β線、γ線、中性子線、電子線又はＸ線が挙げられ、これらの中でも、組織修復速度及び組織修復性の観点から、γ線又は電子線が好ましく、γ線がより好ましい。
　組織修復速度及び組織修復性の観点から、放射線の照射線量は、１０ｋＧｙ～４８ｋＧｙであることが好ましく、１２ｋＧｙ～４５ｋＧｙであることがより好ましく、１２ｋＧｙ～３０ｋＧｙであることが更に好ましい。
　なお、照射線量及び照射時間の好ましい数値範囲は、一方向から、架橋ゼラチンに対して放射を照射した場合における好ましい数値範囲であり、２方向以上から照射する場合は、上記の限りではなく、適宜調整することが好ましい。
＜ゼラチン溶液準備工程＞
　ゼラチン溶液準備工程では、ゼラチンを水性媒体に溶解させることによりゼラチン溶液を調製してもよく、調製されたゼラチン溶液を準備してもよい。
　使用できる水性媒体としては、ゼラチンを溶解可能であり、生体組織に対して使用可能なものであれば特に制限はなく、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等を挙げることができる。
　ゼラチン溶液の総質量に対するゼラチンの含有率は、特に制限はなく、０．５質量％～２０質量％であることが好ましく、２質量％～１６質量％であることがより好ましく、４質量％～１２質量％であることが更に好ましい。
　ゼラチンの含有率が０．５質量％以上であることにより、組織修復材の強度が高まる傾向があり、ゼラチンの含有率が２０質量％以下であることにより、組織修復材が均一性の高い網目構造を形成しやすくなり、組織修復速度及び組織修復性が良好になる傾向がある。
　ゼラチン溶液を調製する際の水性媒体の温度は、０℃～６０℃とすることができ、３℃～３０℃であることが好ましい。
　ゼラチン溶液には、架橋剤等のゼラチン以外の成分が含有されていてもよい。
＜凍結乾燥工程＞
　凍結乾燥工程では、ゼラチン溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥体を得る。本開示の組織修復材の製造方法が氷晶形成工程を含む場合、冷却後のゼラチン溶液を凍結乾燥する。
　凍結条件としては、タンパク質の凍結乾燥に通常用いられる条件をそのまま採用すればよい。凍結乾燥時間は、例えば、０．５時間～３００時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥機についても特に制限はない。
＜粉砕工程＞
　粉砕工程では、ゼラチンの凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得る。粉砕は、ハンマーミル、スクリーンミル等の粉砕機を使用することにより行うことができる。
　一定の大きさに粉砕された粉砕物を随時回収することができ、粒径のばらつきが小さいという観点から、スクリーンミルを使用することが好ましい。スクリーンミルとしては、クアドロ社製のコーミル等を使用することができる。
　粉砕の方式としては、破砕方式、切断方式等が挙げられる。
　粉砕工程は、ゼラチンの凍結乾燥体を粉砕して粉砕物を得た後に、粉砕物を分級することを含んでいてもよい。これにより、均一な粒子径を有する粉砕物を得ることができる。
　分級には、例えば、目開き３００μｍ～１４００μｍのふるいを用いることが好ましい。
＜氷晶形成工程＞
　本開示の組織修復材の製造方法は、凍結乾燥工程の前に、氷晶形成工程を有することができる。これにより、内部に氷晶を有するゼラチン含有中間体を得ることができる。
　形成された氷晶により、ゼラチンのペプチド鎖の粗密化が生じてゼラチン含有中間体が固体化するため、氷晶が消失した後には、内部に空隙を有するゼラチン含有中間体が形成される。氷晶の消失は、凍結乾燥工程における乾燥により行うことができる。
　ゼラチン含有中間体の空隙の孔径は、氷晶温度、冷却時間等により調整することができる。
　空隙の形状については、特に制限はなく、二次元的な構造でもよく、三次元的な構造でもよい。網目の断面形状は、特に限定されず、多角形、円、楕円等が挙げられる。空隙の三次元的な構造としては、柱状、球状等が挙げられる。組織修復速度及び組織修復性の観点からは、空隙の形状は球状であることが好ましい。
　ゼラチン含有中間体は、空隙が連続して形成される連通孔を有していてもよい。連通孔については上記したため、ここでは記載を省略する。
　空隙の孔径は、組織修復速度及び組織修復性の観点から、１０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。孔径の上限については特に制限はないが、物質強度安定及び生体親和性の観点から、２５００μｍ以下であることが好ましく、１０００μｍ以下であることがより好ましい。
　空隙の孔径は、長軸方向の径（長径）の平均であり、以下のようにして測定する。
　まず、ゼラチン含有中間体を乾燥した後に得られる乾燥中間体を、水平方向に切断した試験片、及び垂直方向に切断した試験片を用意する。
　なお、乾燥中間体の水平方向とは、乾燥中間体を平坦な面に静置させたときの面に対し水平となる方向を意味する。なお、乾燥中間体は、平坦な面に対して接する面積が最大となるように静置する。
　次いで、各試験片の断面をスタンプ台に密着させることにより染色し、２．０ｍｍ×２．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察する。
　観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域（１個の空隙）に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択する。
　この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向に切断した試験片の断面、及び垂直方向に切断した試験片の断面のそれぞれにおける観察領域内において、５０個ずつ計測し、その平均を当該ゼラチン含有中間体の空隙の長径の平均値とする。
　上記方法により求められる水平方向に切断した試験片の断面の長径の平均値と、垂直方向に切断した試験片の断面の長径の平均値とのうち小さい方をｄ１、他方をｄ２としたとき、この比率ｄ２／ｄ１をアスペクト比と呼ぶ。
　本開示においては、空隙のアスペクト比が１～３の場合を「球状」とし、この範囲外の場合を「柱状」とする。
　空隙の形状が柱状である場合、アスペクト比は、組織修復速度及び組織修復性の観点から、４又は５であることが好ましい。
　ゼラチン含有中間体の空隙率は、８０％～９９．９９％であることが好ましく、９５．０１％～９９．９％であることがより好ましい。
　なお、本開示において、ゼラチン含有中間体の空隙率は、ゼラチン含有中間体の嵩密度（ρ１）及び架橋ゼラチンの真密度（ρc１）と、下記式を利用して求める。
　なお、嵩密度（ρ１）は、ゼラチン含有中間体の乾燥質量及び体積から算出し、ゼラチン含有中間体の真密度（ρc１）は、ゲイリュサック型比重瓶の比重瓶法により求める。
空隙率Ｐ１（％）＝（１－ρ１／ρｃ１）×１００
　氷晶形成温度は、ゼラチン溶液の少なくとも一部が凍結する温度を意味する。
　氷晶形成温度は、ゼラチン溶液の固形分濃度によって異なるが、一般に－１０℃以下とすることができる。
　ゼラチン溶液の冷却温度は、－１００℃～－１０℃であることが好ましく、－８０℃～－２０℃であることがより好ましく、－４０℃～－６０℃であることが更に好ましい。
　ゼラチン溶液の冷却温度を－１００℃以上とすることにより、空隙が十分な大きさになり、組織修復材の組織修復速度及び組織修復性が向上する傾向にある。
　冷却温度を－１０℃以下とすることにより、空隙の孔径の均一性が高く、組織修復速度及び組織修復性が向上する傾向にある。
　冷却時間は、氷晶形成が均一に生じやすいという観点から、１時間～６時間であることが好ましい。
［組織修復材の使用］
　本開示の組織修復材の使用は、対象組織中の欠損又は損傷した部位に、上記組織修復材を適用することを含む。
　対象組織としては、歯、骨等の硬組織であることが好ましく、上記組織修復材は、骨再生のための使用が好適である。
　本開示の組織修復材の使用は、必要に応じて、組織修復材の適用前又は適用後に、移植細胞及び骨誘導剤の少なくとも一方を、組織修復材を適用する部位へ適用することを含んでいてもよい。
　組織修復材の使用は、治療方法又は修復方法は、顎顔面領域における歯周組織欠損（periodontal defect）、インプラント欠損（implant defect）等；インプラント埋入時の予備的処置としてのＧＢＲ法、歯肉増大術（Ｒｉｄｇｅ　Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法、サイナスリフト法、ソケットリザベーション法等；などに好ましく適用することができる。
　以下、実施例により本開示を詳細に説明する。ただし、本開示は、以下の実施例に制限されるものではない。
（実施例１）
　組み換えゼラチンとして、ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載されるＣＢＥ３を用意した。
　なお、ＣＢＥ３の詳細は以下の通りである。
・分子量：５１．６ｋＤａ
・アミノ酸残基数：５７１個
・ＲＧＤ配列数：１２個
・アミノ酸配列：配列番号１
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
　ＣＢＥ３を７．５質量％含有する水溶液を用意した。
　上記水溶液を、円筒形状の容器に流し込んだ後、凍結乾燥機に入れた。
　水溶液を－６０℃で１時間以上凍結させ、真空下において－１５℃３８時間の一次乾燥、２３℃２時間の二次乾燥を行い、スポンジ状のゼラチンを得た。
　スポンジ状のゼラチンをスクリーン粉砕機（クワドロ社製、コーミルＵ１０）により、０．０７９ｉｎｃｈ、ついで０．０４０ｉｎｃｈのスクリーンを用いて粉砕し、粉砕物を得た。
　ＩＳＯ３３１０規格の試験ふるいを使用し、第１６改正日本薬局方３．０４節の第２法に記載の方法に順じて、粉砕物のふるい分けを行った。
　具体的には、目開き１４００μｍのふるいを通過し、且つ、目開き３００μｍのふるいに残留した画分を回収し、１０ｍＬガラスバイアル瓶（φ２４．３ｍｍ、高さ４６．５ｍｍ）に約０．０９ｇ充填した。
　ガラスバイアル瓶に充填した粉砕物をクリーンオーブン（日東理科工業株式会社製、ＮＣＯ－５００Ａ６００Ｌ－ＷＳ）に設置し、窒素雰囲気下において、１３５℃～１４０℃の加熱温度、４．７５時間の加熱時間により、粉砕物の加熱を行い、粒子状の架橋ゼラチンを得た。続いて、ガラスバイアル瓶にゴム栓（ゴム栓２Ａ）を打栓して、アルミキャップで巻締した。
　上記架橋ゼラチンが充填されたガラスバイアル瓶を段ボール箱に入れ、段ボール箱側面にポリメチルメタクリレート線量計を貼り付け、線量１８ｋＧｙを照射し、組織修復材を得た。
（実施例２）
　照射したγ線の線量を２８ｋＧｙに変更した以外は、実施例１と同様にして、組織修復材を得た。
（実施例３）
　照射したγ線の線量を１３ｋＧｙ、粉砕物の加熱時間を６．２５時間に変更した以外は、実施例１と同様にして、組織修復材を得た。
（実施例４）
　照射したγ線の線量を２８ｋＧｙ、粉砕物の加熱時間を６．２５時間に変更した以外は、実施例１と同様にして、組織修復材を得た。
（実施例５）
　照射したγ線の線量を２８ｋＧｙ、粉砕物の加熱時間を８．００時間に変更した以外は、実施例１と同様にして、組織修復材を得た。
（比較例１）
　γ線の照射を行わなかった以外は、実施例１と同様にして、組織修復材を得た。
＜＜ゲル浸透クロマトグラフィーによる溶出曲線の取得＞＞
　容量１５ｍＬのチューブに、実施例及び比較例において製造した組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションした。
　次いで、転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取した。分取した溶液は、０．２２μｍフィルターによりろ過を行い、測定試料とした。
　測定試料５μＬに対し、下記条件のゲル浸透クロマトグラフィーを実施し、縦軸を吸光度、横軸を溶出時間とする溶出曲線を得た。
　分子量既知の物質（ＣＢＥ３：５１．６ｋＤａ、ＧＰＣ標準品：４３ｋＤａ、デオキシリボヌクレアーゼ：２８ｋＤａ、リゾチーム：１４ｋＤａ）についても同様の条件でゲル浸透クロマトグラフィーを実施し、溶出時間と分子量の関係を把握した。
　実施例１～実施例５の組織修復材から得られた溶出曲線を、図１～図５に、比較例１の組織修復材から得られた溶出曲線を、図６に示す。
（条件）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＥＨ　ＳＥＣ　Ｃｏｌｕｍｎ、２００Å,　１．７μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
カラム長さ：１５０ｍｍ
カラム内径：４．６ｍｍ
充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
充填剤のポアサイズ：２００Å
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
流速：０．１ｍＬ／分
検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
測定波長：２１５ｎｍ
測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
測定試料の量：５μＬ
　実施例１～実施例７の組織修復材から得られた溶出曲線の、分子量が４３ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲、分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲の少なくとも２つにおいて、吸光度が０．０２５以上の吸収ピーク（表１においては、吸収ピーク数と記載する。）が観察された。
　比較例１～比較例２の組織修復材から得られた溶出曲線の、分子量が４３ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲、分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲のいずれの範囲においても、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークは観察されなかった。
　上記のようにして得られた実施例及び比較例の組織修復材の溶出曲線から、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下における面積に対する、分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下における面積の比を求め、表１にまとめた（表１においては、面積比と記載する）。
＜＜組織修復材の吸水率の測定＞＞
　まず、マイクロチューブ（以下、チューブという。）に、質量（ｗ０）を測定したフィルターカップをセットした。
　次いで、５００μＬの水をフィルターカップに加え、ローテータにて２時間撹拌させた。
　攪拌後、チューブを２５℃、６０００×ｇの条件で１分間遠心を行い、水がフィルターカップから、チューブ内へ移動したことを確認した。フィルターカップの質量（ｗ１）を再度測定し、以下の式を用いて残水量を算出した。
　　残水量（ｍｇ）：ｗ１－ｗ０
　次いで、チューブに、質量（ｗ２）を測定した別のフィルターカップをセットし、組織修復材をフィルターカップへ１０ｍｇ（質量：ｗ３）充填した。
　次いで、５００μＬの水をフィルターカップへ加え、ローテータにて２時間撹拌させた。
　攪拌後、チューブを２５℃、６０００×ｇの条件で１分間遠心を行い、水がフィルターカップから、チューブ内へ移動したことを確認した。
　フィルターカップに残存した組織修復材の質量及びフィルターカップの質量の和（ｗ４）を測定し、下記式（１）を用いて吸水率を算出した。結果を表１にまとめた。
　　吸水率（％）＝（ｗ４－ｗ２－(ｗ１－ｗ０)）／ｗ３×１００・・・・（１）
＜＜組織修復材の酸分解残存率の測定＞＞
　マイクロチューブ（以下、チューブという。）を用意し、その質量（Ａ）を測定した。
　実施例及び比較例において製造した組織修復材を１５．０（±０．２）ｍｇを秤量し（質量：Ｂ）、チューブへ充填した。
　組織修復材入りのチューブに、１モル／Ｌの塩酸を１．７ｍＬ添加し、３７℃に設定したヒートブロックを用いて、３時間加熱した。
　加熱後、チューブを氷上に立て、酸分解反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心器を用いて、１０，０００×ｇの条件で１分間遠心した。
　チューブ内において、組織修復材が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を１ｍＬ添加して、上記と同一の条件で再度、遠心した。
　遠心後、上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心した。
　遠心後、上清を吸い取り、組織修復剤が充填されたチューブを－８０℃の冷凍庫（日本フリーザー株式会社製、超低温フリーザーＣＬＮ－３１ＵＷ）に１時間以上静置することによって、凍結した組織修復剤を得た。この組織修復剤を真空凍結乾燥機（東京理科器械株式会社製、ＦＤＵ－１１１０に移し、真空度１０Ｐａ程度まで下がった状態で、１６時間～２４時間、真空凍結乾燥した。
　凍結乾燥後、凍結乾燥機から取り出し、空気中の水分を組織修復材が吸い取るのを防ぐため、すばやくチューブのキャップを閉めた。
　チューブの質量（Ｃ）を測定し、下記式（２）を用いて酸分解残存率を算出した。結果を表１にまとめた。
酸分解残存率（％）＝（Ｃ－Ａ）／Ｂ×１００・・・・（２）
＜＜組織修復能の評価＞＞
　ＳＤラットの頭頂骨に、直径５ｍｍの円形の骨欠損部を作製し、実施例及び比較例において製造した組織修復材を３．０±０．２ｍｇ充填した後、骨膜と共に縫合した。
　手術後２週目経過後、及び４週目経過後において。ラット頭頂骨の骨量をマイクロＣＴにて計測し、欠損部体積に対する欠損部内部の骨体積の比率を求めた。結果を表１にまとめた。
　表１から、実施例において得られた組織修復材は、比較例において得られた組織修復材に比べ、組織修復性に優れることが分かる。また、表１から、実施例において得られた組織修復材は、組織修復速度にも優れることが分かる。
　２０２２年３月３０日に出願された日本国特許出願２０２２－０５７３７４号の開示、及び２０２２年４月１日に出願された日本国特許出願２０２２－０６２０５８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記載された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (13)

  1. 　架橋ゼラチンを含有し、且つ
    　以下条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、前記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、吸光度が０．０２５以上の吸収ピークが少なくとも１つ存在する、組織修復材。
    （条件）
    カラム長さ：１５０ｍｍ
    カラム内径：４．６ｍｍ
    充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
    充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
    充填剤のポアサイズ：２００Å
    カラム温度：３０℃
    移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
    流速：０．１ｍＬ／分
    検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
    測定波長：２１５ｎｍ
    測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
    測定試料の量：５μＬ
  2. 　分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに吸収ピークを有する、請求項１に記載の組織修復材。
  3. 　前記架橋ゼラチンの吸水率が４５０％以上である、請求項１に記載の組織修復材。
  4. 　１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による、前記架橋ゼラチンの残存率が６０％以下である、請求項１に記載の組織修復材。
  5. 　前記ゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；及び配列番号１に記載のアミノ酸配列における第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の組織修復材。
  6. 　前記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が４３ｋＤａ超、５１ｋＤａ以下における面積に対する、分子量が１４ｋＤａ以上、４３ｋＤａ以下における面積の比が２．５以上である、請求項１に記載の組織修復材。
  7. 　ゼラチンを１００℃～１７０℃、２時間～２４時間の条件で加熱し、架橋ゼラチンを得る工程と、
    　前記架橋ゼラチンに対し、線量５ｋＧｙ～５０ｋＧｙの放射線を照射する工程と、
    を有する、組織修復材の製造方法。
  8. 　前記放射線が、γ線又は電子線である、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
  9. 　請求項７に記載の組織修復材の製造方法により製造される組織修復材の、以下条件のゲル浸透クロマトグラフィーにより得られる、前記架橋ゼラチンの溶出曲線において、分子量が１４ｋＤａ以上、５１ｋＤａ以下の範囲に、分子量が１４ｋＤａ以上、２８ｋＤａ未満の範囲、及び分子量が２８ｋＤａ以上、４３ｋＤａ未満の範囲のそれぞれに吸収ピークを有する、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
    （条件）
    カラム長さ：１５０ｍｍ
    カラム内径：４．６ｍｍ
    充填剤：エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子
    充填剤の粒子サイズ：１．７μｍ
    充填剤のポアサイズ：２００Å
    カラム温度：３０℃
    移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、１質量％ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ５．３
    流速：０．１ｍＬ／分
    検出器：波長可変ＵＶ検出器（ＴＵＶ）
    測定波長：２１５ｎｍ
    測定試料の調整：容量１５ｍＬのチューブに組織修復材を充填し、５ｍＬの注射用水を加えた後、３７℃で２４時間インキュベーションする。転倒混和を行った後、上澄み１ｍＬを低吸着性チューブにより分取し、０．２２μｍフィルターによりろ過を行う。
    測定試料の量：５μＬ
  10. 　放射線照射後の前記架橋ゼラチンの吸水率が４５０％以上である、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
  11. 　放射線照射後の前記架橋ゼラチンの酸分解残存率が６０％以下である、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
  12. 　放射線照射後の前記架橋ゼラチンが多孔質体であり、且つ
    　放射線照射後の前記架橋ゼラチンの空隙率が、８０．００％～９９．９９％である、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
  13. 　前記ゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；及び配列番号１に記載のアミノ酸配列における第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ生体親和性を有するペプチド；からなる群より選択される１種以上である、請求項７に記載の組織修復材の製造方法。
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