JP7426484B2 - 高分子水溶液凍結体の製造方法及び高分子多孔質体の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、高分子水溶液凍結体の製造方法に関し、特に異方性の低い凍結物を高得率で製造する方法に関する。
コラーゲンやゼラチン等の生体親和性高分子からなる多孔質体は、細胞足場、移植用部材、組織修復材等の材料として有用であり、特許文献１には、リコンビナントゼラチン多孔質体の製造方法が記載されている。具体的には、円筒カップ状容器に流し込んだリコンビナントゼラチン水溶液を凍結乾燥して、リコンビナントゼラチン多孔質体を製造する方法が開示されている。
ところで、製品として一定品質の高分子多孔質体を提供する等の観点からは、高分子多孔質体における孔（ポア）の大きさのバラつきが小さいこと、即ち、多孔質体の構造的均一性が高いことが望ましい。ここで、高分子水溶液から高分子多孔質体を得るための凍結乾燥工程は、平易に言えば、（１）高分子水溶液を凍結して高分子水溶液凍結体を得る工程、（２）高分子水溶液凍結体から水分を昇華させる工程からなる。
上記（１）の工程で得られる高分子水溶液凍結体は、高分子多孔質体の中間体と言え、この高分子水溶液凍結体の製造工程を制御することで、高分子多孔質体の構造的均一性を向上できる可能性がある。例えば、特許文献２には、高分子多孔質体の製造方法の一部として、凍結時における高分子水溶液内の温度差を一定以下の値とする高分子水溶液凍結体の製造方法が記載されており、そうして得られた高分子多孔質体の構造的均一性が高いことも開示されている。こうした方法に代わるか、こうした方法と組み合わせて使用可能な、新たな高分子水溶液凍結体の製造方法が求められている。
本発明の目的は、構造的均一性が高い（異方性が低い）高分子水溶液凍結体を高い得率で得る製造方法、及び上記高分子水溶液凍結体を用いた高分子多孔質体の製造方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、凍結時に用いる液体容器について、溶液に接する面をテトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）とすることで、異方性が低い高分子水溶液凍結体が得られる確率（得率）が高くなることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記を提供する。
［１］
高分子水溶液を、溶液に接する面がＦＥＰである液体容器中で凍結する工程を含む、含高分子水溶液凍結体の製造方法
［２］
液体容器の主たる部材の線膨張係数が１０×１０-5／Ｋ未満である、［１］に記載の製造方法
［３］
液体容器の主たる部材の内面のコート部材がＦＥＰである、［１］に記載の製造方法
［４］
高分子水溶液の高分子濃度が０．１ｗｔ％以上である、［１］に記載の製造方法
［５］
高分子水溶液が組換えゼラチンの水溶液である、［１］に記載の製造方法
［６］
高分子中の親水性繰り返し単位比率が５０％以下である、［１］に記載の製造方法
［７］
高分子水溶液中の不溶物及び気泡が、０．５個/μL以下である、［１］に記載の製造方法。
［８］
含高分子水溶液凍結体の製造に供するまで、高分子水溶液を凍結乾燥しない、［１］に記載の製造方法。
［９］
［１］～［８］のいずれか一に記載の製造法で得られた高分子水溶液凍結体から、さらに水分を除去する工程を含む、高分子多孔質体の製造方法
［１］
高分子水溶液を、溶液に接する面がＦＥＰである液体容器中で凍結する工程を含む、含高分子水溶液凍結体の製造方法
［２］
液体容器の主たる部材の線膨張係数が１０×１０-5／Ｋ未満である、［１］に記載の製造方法
［３］
液体容器の主たる部材の内面のコート部材がＦＥＰである、［１］に記載の製造方法
［４］
高分子水溶液の高分子濃度が０．１ｗｔ％以上である、［１］に記載の製造方法
［５］
高分子水溶液が組換えゼラチンの水溶液である、［１］に記載の製造方法
［６］
高分子中の親水性繰り返し単位比率が５０％以下である、［１］に記載の製造方法
［７］
高分子水溶液中の不溶物及び気泡が、０．５個/μL以下である、［１］に記載の製造方法。
［８］
含高分子水溶液凍結体の製造に供するまで、高分子水溶液を凍結乾燥しない、［１］に記載の製造方法。
［９］
［１］～［８］のいずれか一に記載の製造法で得られた高分子水溶液凍結体から、さらに水分を除去する工程を含む、高分子多孔質体の製造方法
本発明によれば、異方性が低い高分子水溶液凍結体を高い得率で得るための製造方法が提供される。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の効果が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列を、当業界で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。本発明において、対比される２種のポリペプチドのアミノ酸配列に関する「同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。
なお、複数のポリペプチドの対比（アライメント）は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
同一性（％）＝[（同一となるアミノ酸残基の数）／（アラインメント長）｝×１００
なお、複数のポリペプチドの対比（アライメント）は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
同一性（％）＝[（同一となるアミノ酸残基の数）／（アラインメント長）｝×１００
以下、本発明について説明する。
［高分子］
本発明において高分子とは、分子量が大きい分子で、分子量が小さい分子から実質的又は概念的に得られる単位の多数回の繰り返しで構成した構造を有する分子を言う。例えば、ポリアミン、セルロース、アミロース、デンプン、キチン、ポリペプチド、タンパク質、DNA及びRNA等が挙げられる。高分子は水溶性であることが好ましく、ポリペプチド及びタンパク質がさらに好ましい。ポリペプチド及びタンパク質の中では、コラーゲン及びゼラチンが特に好ましい。
本発明において高分子とは、分子量が大きい分子で、分子量が小さい分子から実質的又は概念的に得られる単位の多数回の繰り返しで構成した構造を有する分子を言う。例えば、ポリアミン、セルロース、アミロース、デンプン、キチン、ポリペプチド、タンパク質、DNA及びRNA等が挙げられる。高分子は水溶性であることが好ましく、ポリペプチド及びタンパク質がさらに好ましい。ポリペプチド及びタンパク質の中では、コラーゲン及びゼラチンが特に好ましい。
高分子中の親水性繰り返し単位比率は、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましい。これよりも親水性単位比率が高いと、高分子周囲の自由水が減少し凍結が阻害される。ここで、親水性繰り返し単位比率とは、高分子中に占めるイオン性基、及び／又は水酸基を有する繰り返し単位の比率をいう。
上記ゼラチンは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列を連続して６以上含むポリペプチドを意味し、ポリペプチド中にＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列以外に他のアミノ酸残基を１以上有していてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列に相当する配列であり、この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。
複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。また、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ配列中Ｘ及びＹは繰返し単位ごとに独立であり、同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、上記ゼラチン全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。上記ゼラチン中のＧｌｙ－Ｘ－Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
上記ゼラチンとしては、天然型であっても、天然型とは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる変異型であってもよい。天然型のゼラチンとは、天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチン、又は天然で生じたコラーゲンを原料とするゼラチンと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。特に断らない限り、本明細書では変異型又は組換え体のゼラチンを総称して、組換えゼラチンと称する。天然型のゼラチン又はその組換えゼラチンは、例えば、魚類、哺乳類等の動物に由来するものが挙げられるが、 哺乳類の動物の天然型ゼラチン又はその組換えゼラチンであることが好ましい。哺乳類の動物としては、例えば、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等が挙げられ、ヒト又はブタであることがより好ましい。天然型ゼラチンとしてはブタ又はヒトに由来するものであることが好ましく、組換えゼラチンとしてはヒト由来組換えゼラチンであることが好ましい。
また、上記ゼラチンとしては、上記Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列を連続して６以上有する上記コラーゲンをコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列に対して、１つ以上の塩基又はアミノ酸残基の変更を加えた塩基配列又はアミノ酸配列を、常法により、適当な宿主に導入し発現させて得られた組換えゼラチンであることが好ましい。このような組換えゼラチンを用いることにより、（骨）組織修復能を高めると共に、天然のゼラチンを用いる場合と比較して種々の特性を発現させることができ、例えば、生体による拒絶反応などの不都合な影響を回避することができるなどの利点を有する。
上記組換えゼラチンとしては、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１、特表２０１０－５１９２９３、特表２０１０－５１９２５２、特表２０１０－５１８８３３、特表２０１０－５１９２５１、ＷＯ２０１０／１２８６７２及びＷＯ２０１０／１４７１０９等に開示されているものを特に好ましく用いることができる。 また、上記組換えゼラチンは、２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましい。
上記組換えゼラチンは、生体親和性の点で、細胞接着シグナルを更に含むものであることが好ましく、上記組換えゼラチン中に存在する細胞接着シグナルが一分子中に２つ以上有することものであることが、より好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列であることが特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。
上記組換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸残基数が０～１００であることが好ましく、２５～６０であることが更に好ましい。また、ＲＧＤ配列は、このようなアミノ酸残基数の範囲内で不均一に配置されていることが好ましい。
また、上記組換えゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するＲＧＤ配列の割合は、少なくとも０．４％であることが好ましく、組換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸残基を含む場合、３５０アミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
また、上記組換えゼラチンにおけるアミノ酸残基の総数に対するＲＧＤ配列の割合は、少なくとも０．４％であることが好ましく、組換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸残基を含む場合、３５０アミノ酸残基の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
上記組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸残基あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことが好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。ただし、上記組換えゼラチンの配列は、以下の態様であることが好ましい：（１）セリン残基及びスレオニン残基を含まない、（２）セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、及びシステイン残基を含まない、（３）Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。上記組換えゼラチンは、この好ましい配列の態様（１）～（３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。また、上記組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
上記組換えゼラチンは、Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍは、２～１０を表し、３～５を表すことが好ましい。Ａ及びＢは、任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を表す。ｎは３～１００を表し、１５～７０を表すことが好ましく、５０～６０を表すことがより好ましい。
好ましくは、組換えゼラチンは、式：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸残基の何れかを示す。なお、３個の（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
上記組換えゼラチンの繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。より好ましくは、Ｉ型、II型又はIII型とすることができる。コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラットを挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
上記組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、更に好ましくは７～９．５とすることができる。
上記組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、更に好ましくは７～９．５とすることができる。
上記組換えゼラチンの好ましい態様としては以下のものを挙げることができる：（１）カルバモイル基が加水分解されていない、（２）プロコラーゲンを有さない、（３）テロペプタイドを有さない、（４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。上記組換えゼラチンは、この好ましい態様（１）～（４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
上記組換えゼラチンは、（骨）組織修復能の高さから、好ましくは、以下（Ａ）～（Ｃ）のいずれかとすることができる。
（Ａ） 下記配列番号１で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
（Ｂ） 上記（Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有すると共に、（骨）組織修復能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 上記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、（骨）組織修復能を有するポリペプチド。
（Ａ） 下記配列番号１で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
（Ｂ） 上記（Ａ）のアミノ酸配列中、第４番目～第１９２番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を有すると共に、（骨）組織修復能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 上記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、（骨）組織修復能を有するポリペプチド。
上記（Ｂ）における配列同一性としては、組換えゼラチンの（骨）組織修復能の観点から、より好ましくは９０％以上とすることができ、更に好ましくは９５％以上とすることができる。
上記（Ｂ）の配列における上記部分アミノ酸配列は、配列番号１で示される配列の繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列である。上記（Ｂ）のポリペプチドに上記繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列が複数存在する場合には、配列同一性が８０％以上となる繰り返し単位を１つ、好ましくは２つ以上含むポリペプチドとすることができる。
また、上記（Ｂ）で規定されるポリペプチドは、上記繰り返し単位に相当する部分アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する部分配列を、合計のアミノ酸残基数として、全アミノ酸残基数の８０％以上含むことが好ましい。
上記（Ｂ）で規定されるポリペプチドの長さとしては、１５１個～２２６０個のアミノ酸残基数とすることができ、架橋後の分解性の観点から、１９３個以上、安定性の観点から、９４４個以下のアミノ酸残基数であることが好ましく、３８０個～７５６個のアミノ酸残基数であることがより好ましい。
また、上記（Ｃ）で規定されるポリペプチドは、上記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、組織修復能を有するポリペプチドであってもよい。
上記（Ｃ）で規定されるポリペプチドにおいて欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、組換えゼラチンの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個～１５個、好ましくは２個～５個とすることができる。
上記組換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の組換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、組換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された組換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる組換えゼラチンを調製することができる。
［高分子水溶液］
本発明において高分子水溶液とは、一種以上の高分子が含まれる水溶液である。高分子水溶における高分子濃度は、０．１ｗｔ％以上であることが好ましく、１ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、５ｗｔ％以上であることが特に好ましい。０．１ｗｔ％よりも濃度が低いと、水分を除去したのちに高分子多孔質体の構造を維持することが困難である。高分子水溶液は、凍結温度以上でゲル化することが好ましい。高分子水溶液における高分子濃度の上限は、高分子が溶解できる限り特に限定されないが、一般的には４０ｗｔ％以下であり、３０ｗｔ％以下、又は２０ｗｔ％以下でもよい。
本発明において高分子水溶液とは、一種以上の高分子が含まれる水溶液である。高分子水溶における高分子濃度は、０．１ｗｔ％以上であることが好ましく、１ｗｔ％以上であることがさらに好ましく、５ｗｔ％以上であることが特に好ましい。０．１ｗｔ％よりも濃度が低いと、水分を除去したのちに高分子多孔質体の構造を維持することが困難である。高分子水溶液は、凍結温度以上でゲル化することが好ましい。高分子水溶液における高分子濃度の上限は、高分子が溶解できる限り特に限定されないが、一般的には４０ｗｔ％以下であり、３０ｗｔ％以下、又は２０ｗｔ％以下でもよい。
高分子水溶液は、高分子を含む溶液を精製及び濃縮すること、又は乾燥状態の高分子を水性媒体に溶解することにより調製する。(1)用事調整してもよいし、(2)予め調整済みのものを準備して用いてもよい。(3)精製及び濃縮により得られた高分子水溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥体に水性媒体を加えて再溶解することで高分子水溶液を調整してもよい。または、(4)精製及び濃縮により得られた高分子水溶液を凍結し、得られた凍結体を解凍することで高分子水溶液を調整してもよい。凍結体の解凍は、気泡や不溶物（凍結体の溶け残り）の発生を低減する観点から、３０～４０℃で１５～２０時間かけて解凍することが好ましい。用事調整の手間削減、輸送や保管の便宜、高分子水溶液中の気泡や不溶物を低減する観点から、上記(4)の方法が好ましい。
高分子水溶液中に分散した気泡や不溶物は、濾過、遠心、減圧、脱泡等の操作により、凍結工程前に除去することが好ましい。これにより、異方性が低い高分子水溶液凍結体の得率が向上する。気泡や不溶物が除かれていることは、濁度測定により評価できる。又は、光学顕微鏡による目視検査によっても評価できる。例えば、光学顕微鏡の視野に映る気泡及び不要物の個数を計算し、高分子水溶液１μL中の気泡及び不溶物の個数で評価できる。高分子水溶液中の気泡や不溶物は、０．５個/μL以下であることが好ましく、０．３個/μL以下であることがより好ましく、０．１個/μL以下であることがさらに好ましく、０個/μLであることが特に好ましい。
高分子水溶液には、所定の特性を付加する目的で、高分子以外の成分を添加してよい。
このような他の成分としては、例えば、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。他に例えば、ポリペプチド又はタンパク質の架橋剤を挙げることができる。
このような他の成分としては、例えば、骨誘導薬剤等の骨再生又は骨新生に関する成分を挙げることができる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。他に例えば、ポリペプチド又はタンパク質の架橋剤を挙げることができる。
高分子水溶液の水性媒体としては、高分子を溶解可能であり、生体組織に対して使用可能なものであれば特に制限はなく、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等、当分野で通常使用可能なものを挙げることができる。
高分子としてゼラチンを用いる場合、ゼラチン溶液におけるゼラチン濃度については、ゼラチンが溶解可能な濃度であればよく、特に制限はない。ゼラチン溶液中のゼラチン濃度は、例えば、０．５質量％～２０質量％とすることが好ましく、２質量％～１６質量％であることがより好ましく 、４質量％～１２質量％であることが更に好ましい。また、ゼラチン溶液は、凍結工程の前に脱泡処理してもよい。これにより、氷晶形成を均一に生じやすくさせることができる。脱泡方法については特に制限はないが、例えば、２～１０ｋPaの圧力で真空遠心脱泡することができる。
ゼラチン溶液は、溶解していない粒子を除くためにろ過をしてもよい。ろ過方法は特に制限されないが、例えば、孔径０．２２～０．４５μｍのフィルターを用いて加圧ろ過する。フィルターの材質についても特に制限はなく、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、セルロースアセテート、ポリビニリデンフルオライドなどを用いることができるが、ゼラチンの吸着性が低く溶出物が少ないという観点から、セルロースアセテートが好ましい。ゼラチン溶液を調製する際の温度については、特に制限はなく、通常用いられる温度、 例えば、０℃～６０℃、好ましくは、３℃～４０℃程度であればよい。
［液体容器］
本発明において液体容器とは、高分子水溶液を入れて、冷却・凍結するための容器を言う。容器の形状は例えば、皿状、円筒カップ状、略直方体状が挙げられる。円筒カップ状または略直方体状が好ましい。略直方体状の容器とは、平面形状が略矩形の底面を１つと、平面形状が略矩形の側面を、前後一対、左右一対の合計４つ有する形状の容器である。略直方体状の容器は、一体的に形成されていてもよく、側面と底面、側面同士を繋ぐ角部分が面取りされていてもよい。
容器内部は高い曲率を持たないことが好ましい。具体的にはＲ１ｍｍ以上であることが好ましく、Ｒ２ｍｍ以上であることがさらに好ましい（Ｒは曲率半径を意味する）。容器の大きさは特に限定されないが、円筒カップ状容器の場合、内径２００ｍｍ以下であることが好ましく、１５０ｍｍ以下であることがさらに好ましい。略直方体状の容器の場合、内寸が２００ｍｍ（縦）×２００ｍｍ（横）×６０ｍｍ（深さ）以下であることが好ましく、１５０ｍｍ（縦）×１５０ｍｍ（横）×４５ｍｍ（深さ）以下であることがさらに好ましい。
本発明において液体容器とは、高分子水溶液を入れて、冷却・凍結するための容器を言う。容器の形状は例えば、皿状、円筒カップ状、略直方体状が挙げられる。円筒カップ状または略直方体状が好ましい。略直方体状の容器とは、平面形状が略矩形の底面を１つと、平面形状が略矩形の側面を、前後一対、左右一対の合計４つ有する形状の容器である。略直方体状の容器は、一体的に形成されていてもよく、側面と底面、側面同士を繋ぐ角部分が面取りされていてもよい。
容器内部は高い曲率を持たないことが好ましい。具体的にはＲ１ｍｍ以上であることが好ましく、Ｒ２ｍｍ以上であることがさらに好ましい（Ｒは曲率半径を意味する）。容器の大きさは特に限定されないが、円筒カップ状容器の場合、内径２００ｍｍ以下であることが好ましく、１５０ｍｍ以下であることがさらに好ましい。略直方体状の容器の場合、内寸が２００ｍｍ（縦）×２００ｍｍ（横）×６０ｍｍ（深さ）以下であることが好ましく、１５０ｍｍ（縦）×１５０ｍｍ（横）×４５ｍｍ（深さ）以下であることがさらに好ましい。
液体容器は、伝熱体を含むことができる。伝熱体とは、容器底面または内側面に容器と一体で設けられる物体であり、容器底面に垂直で設けられることが好ましい。伝熱体の形状は例えば、板状、棒状が挙げられ、板状が好ましい。伝熱体の材質は、０℃における熱伝導率が５Ｗ／ｍ・Ｋ以上である限りは特に限定されず、例えば、アルミニウム、金、銀、銅、鉄、これらの合金（例えば、アルミニウム合金（例えば、Ａ５０５２）ステンレス等）が挙げられ、アルミニウム又はその合金であることが好ましい。伝熱体を設けることで、高分子水溶液の単位体積当たりの容器本体又は伝熱体への接触面積を増加させることができる。
液体容器は、液体容器を構成する部材と同一又は別の部材（コート部材）で、液体容器の内面をコートしてもよい。また、液体容器を構成する部材と同一又は別の部材からなるカバー部材を液体容器の内面に敷き詰めたり、円筒状のカバー部材を設置したりしてもよい。コート部材やカバー部材と区別して、液体容器を構成する部材を液体容器の主たる部材とも称する。液体容器が伝熱体を含む場合、伝熱体も液体容器の主たる部材である。液体容器の主たる部材、コート部材、カバー部材の組み合わせは問わない。即ち、液体容器は、（１）液体容器の主たる部材のみ、（２）液体容器の主たる部材及びコート部材、（３）液体容器の主たる部材及びカバー部材、（４）液体容器の主たる部材、コート部材及びカバー部材、のいずれの組み合わせでもよい。
液体容器の内面、即ち、高分子水溶液を液体容器に入れた時に高分子水溶液の接する面は、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（パーフルオロエチレンプロペンコポリマーとも言う）（ＦＥＰ）である。例えば、上記（１）～（４）に即して言えば、（１）液体容器の主たる部材がＦＥＰ、（２）少なくとも、コート部材がＦＥＰ、（３）少なくとも、カバー部材がＦＥＰ、（４）少なくとも、カバー部材がＦＥＰ、である。
液体容器の主たる部材の材質に特に制限はなく、例えば、アルミニウム又はその合金が挙げられる。
液体容器の主たる部材が高分子水溶液と接する場合、液体容器の主たる部材はＦＥＰである。液体容器の主たる部材の材質は、線膨張係数（熱膨張係数とも言う）が１０×１０-5／Ｋ以下であることが好ましく、５０×１０-6／Ｋ以下であることがさらに好ましく、２５×１０-6／Ｋ以下であることが特に好ましい。
液体容器の主たる部材が高分子水溶液と接する場合、液体容器の主たる部材はＦＥＰである。液体容器の主たる部材の材質は、線膨張係数（熱膨張係数とも言う）が１０×１０-5／Ｋ以下であることが好ましく、５０×１０-6／Ｋ以下であることがさらに好ましく、２５×１０-6／Ｋ以下であることが特に好ましい。
カバー部材は、容器内面に一様に敷き詰められていればよく、カバー部材の形状、厚さに制限はない。カバー部材が高分子水溶液と接する場合、カバー部材はＦＥＰである。コート部材は、容器内面に一様にコートしていればよく、塗膜の厚さに制限はない。塗膜は２０μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがさらに好ましい。コート部材が高分子水溶液と接する場合、コート部材はＦＥＰである。
［凍結工程］
本発明において凍結工程とは、液体容器に入れた高分子水溶液を凍結する工程を言う。
凍結手段に特に制限はなく、例えば、冷凍機、凍結乾燥機等の装置で凍結すればよい。凍結乾燥機で凍結する場合、同一の装置で連続的に、高分子水溶液凍結体からの水分除去（凍結乾燥）が可能である。
本発明において凍結工程とは、液体容器に入れた高分子水溶液を凍結する工程を言う。
凍結手段に特に制限はなく、例えば、冷凍機、凍結乾燥機等の装置で凍結すればよい。凍結乾燥機で凍結する場合、同一の装置で連続的に、高分子水溶液凍結体からの水分除去（凍結乾燥）が可能である。
凍結工程の温度は、高分子の種類、高分子水溶液の濃度によって異なるが、凝固熱発生直前の溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であることが好ましい。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前～１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。また、溶液内で最も液温の低い部分の温度は－８℃以下であることが好ましく、さらに好ましくは－１０℃以下であり、なかでも－１５℃以上であることが好ましい。
［高分子水溶液凍結体］
本発明において高分子水溶液凍結体とは、高分子水溶液を凍結することで得られる凍結体を意味する。本発明の製造方法で高分子水溶液凍結体を製造することで、異方性が低い高分子水溶液凍結体が得られる確率を向上させることができる。
本発明において高分子水溶液凍結体とは、高分子水溶液を凍結することで得られる凍結体を意味する。本発明の製造方法で高分子水溶液凍結体を製造することで、異方性が低い高分子水溶液凍結体が得られる確率を向上させることができる。
本発明における高分子水溶液凍結体の「異方性」とは、以下のようにして測定される物理的特性を意味する。高分子水溶液凍結体を凍結乾燥後、凍結乾燥体（高分子多孔質体）の中央付近を水平及び鉛直方向に切断する。次いで各断面を染色し、一定（２．０ｍｍ×２．０ｍｍや２．５ｍｍ×２．５ｍｍ）の領域を光学顕微鏡で観察する。観察領域内における、染色された材料で囲まれた領域に外接する長方形のうち、長方形の対向する二辺の距離が最大となる外接長方形を選択する。この対向する二辺の距離が最大となる外接長方形の長辺の長さを、水平方向の断面及び鉛直方向の断面のそれぞれにおける観察領域内において、５０個ずつ計測し、その平均を当該凍結体の網目の長径の平均値とする。
このときの個々の網目について、水平方向の断面の長径（平均値）と鉛直方向の断面の長径（平均値）のうち小さい方をｄ１、他方をｄ２として得られた比率ｄ２／ｄ１を「異方性」と定義する。この異方性が３以下のものを「異方性が低い」と定義する。
このときの個々の網目について、水平方向の断面の長径（平均値）と鉛直方向の断面の長径（平均値）のうち小さい方をｄ１、他方をｄ２として得られた比率ｄ２／ｄ１を「異方性」と定義する。この異方性が３以下のものを「異方性が低い」と定義する。
異方性が低い高分子水溶液凍結体の得率は、製造効率の観点から、９０％以上となることが好ましい。
［水分除去工程］
本発明において水分除去工程とは、高分子水溶液凍結体から水分を除去する工程を言う。水分を除去する手段に特に制限はなく、高分子水溶液凍結体中の氷を融解させる方法、昇華させる方法（凍結乾燥）等があり、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の期間としては、例えば、０．５時間～３００時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥器について特に制限はない。
本発明において水分除去工程とは、高分子水溶液凍結体から水分を除去する工程を言う。水分を除去する手段に特に制限はなく、高分子水溶液凍結体中の氷を融解させる方法、昇華させる方法（凍結乾燥）等があり、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の期間としては、例えば、０．５時間～３００時間とすることができる。使用可能な凍結乾燥器について特に制限はない。
［高分子多孔質体］
本発明において高分子多孔質体とは、高分子からなる多孔質ブロックを言う。高分子水溶液凍結体から水分を除去することで、高分子多孔質体が得られる。高分子多孔質体は、さらに粉砕、架橋等の処理をすることで、種々の大きさの顆粒に加工し、細胞足場、移植用部材、組織修復材等として用いることができる。本発明の製造方法で製造した高分子水溶液凍結体から得られた高分子多孔質体は構造的均一性が高く、細胞足場、移植用部材、組織修復材等の材料として好適である。
本発明において高分子多孔質体とは、高分子からなる多孔質ブロックを言う。高分子水溶液凍結体から水分を除去することで、高分子多孔質体が得られる。高分子多孔質体は、さらに粉砕、架橋等の処理をすることで、種々の大きさの顆粒に加工し、細胞足場、移植用部材、組織修復材等として用いることができる。本発明の製造方法で製造した高分子水溶液凍結体から得られた高分子多孔質体は構造的均一性が高く、細胞足場、移植用部材、組織修復材等の材料として好適である。
［粉砕工程］
粉砕工程では、高分子多孔質体を粉砕して粉砕物を得る。粉砕は、ハンマーミルやスクリーンミル等の粉砕機を適用可能であり、一定の大きさに粉砕されたものから随時回収されるため試験ごとの粒径分布のばらつきが小さいという観点から、スクリーンミル（例えばクアドロ社製コーミル）が好ましい。粉砕の条件としては、粉砕物表面の構造を維持するため、破砕する方式より切断する方式のほうが好ましい。また、顆粒内部の構造を維持するため、粉砕中に強い圧縮がかからない方式とすることが好ましい。高分子多孔質体を粉砕して得られた粉砕物は、高分子顆粒として組織修復材に含有されうる。
粉砕工程では、高分子多孔質体を粉砕して粉砕物を得る。粉砕は、ハンマーミルやスクリーンミル等の粉砕機を適用可能であり、一定の大きさに粉砕されたものから随時回収されるため試験ごとの粒径分布のばらつきが小さいという観点から、スクリーンミル（例えばクアドロ社製コーミル）が好ましい。粉砕の条件としては、粉砕物表面の構造を維持するため、破砕する方式より切断する方式のほうが好ましい。また、顆粒内部の構造を維持するため、粉砕中に強い圧縮がかからない方式とすることが好ましい。高分子多孔質体を粉砕して得られた粉砕物は、高分子顆粒として組織修復材に含有されうる。
［分級工程］
粉砕工程の後には、整粒を目的として分級工程を含むことができる。これにより、均一な粒子径を有する高分子粉砕物を得ることができる。例えば、ゼラチン粉砕物の分級には、目開き３００μｍ～１４００μｍのふるいを用いることが好ましい。
粉砕工程の後には、整粒を目的として分級工程を含むことができる。これにより、均一な粒子径を有する高分子粉砕物を得ることができる。例えば、ゼラチン粉砕物の分級には、目開き３００μｍ～１４００μｍのふるいを用いることが好ましい。
［充填工程］
粉砕工程の後には、粉砕物をバイアルに充填する工程を含むことができる。例えば、ゼラチン粉砕物の充填方法は特に制限されないが、質量フィードバック方式のテーブルフィーダーを用いることができる。ゼラチン粉砕物を充填するバイアルについても特に制限されないが、例えば、内面をシリコーン加工されたガラスバイアルを用いることができる。
粉砕工程の後には、粉砕物をバイアルに充填する工程を含むことができる。例えば、ゼラチン粉砕物の充填方法は特に制限されないが、質量フィードバック方式のテーブルフィーダーを用いることができる。ゼラチン粉砕物を充填するバイアルについても特に制限されないが、例えば、内面をシリコーン加工されたガラスバイアルを用いることができる。
［架橋工程］
粉砕工程の後には、得られた粉砕物中の高分子を架橋する架橋工程を含むことが好ましい。架橋の方法としては、例えば、熱架橋、酵素による架橋、各種の化学架橋剤を用いた架橋、ＵＶ架橋など公知の方法を用いることができる。架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋又は熱架橋であることが好ましい。架橋（共有結合）のほかに、疎水性相互作用、水素結合、及びイオン性相互作用の少なくともいずれかにより、更に高次構造化されているものも好ましい。
粉砕工程の後には、得られた粉砕物中の高分子を架橋する架橋工程を含むことが好ましい。架橋の方法としては、例えば、熱架橋、酵素による架橋、各種の化学架橋剤を用いた架橋、ＵＶ架橋など公知の方法を用いることができる。架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋又は熱架橋であることが好ましい。架橋（共有結合）のほかに、疎水性相互作用、水素結合、及びイオン性相互作用の少なくともいずれかにより、更に高次構造化されているものも好ましい。
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、生分解性材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。
本発明において、粉砕物がゼラチン粉砕物の場合、アルデヒド類又は縮合剤などの架橋剤で処理する際のゼラチンとの混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは０℃～３０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃～１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
架橋剤を混合して攪拌した後は、温度を上昇させることができる。例えば、粉砕物がゼラチン粉砕物の場合、反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、ゼラチンの変性や分解を考慮すると実質的には０℃～６０℃であり、より好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃～１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
化学架橋剤を用いた架橋法の場合には、グルタルアルデヒドを化学架橋剤として用いた架橋であることがより好ましい。化学架橋剤を用いた架橋法を採用する場合には、化学架橋剤は、高分子水溶液に添加して、乾燥工程の前に架橋を行ってもよい。
熱架橋法に適用される架橋温度は、１００℃～２００℃であることが好ましく、１２０℃～１７０℃であることがより好ましく、１３０℃～１６０℃であることがさらに好ましい。熱架橋法を採用することにより、架橋剤の使用を回避することができる。熱架橋の処理時間としては、架橋温度、高分子の種類やどの程度の分解性を保持させるかによって異なる。
例えば、ヒト由来組換えゼラチンとして後述する実施例で使用のＣＢＥ３を用いた場合の熱架橋条件は、次のとおりである。実温約１３５℃のとき、２時間 ～２０時間であることが好ましく、３時間～１８時間であることがより好ましく、４時間 ～８時間であることが更に好ましい。熱架橋の処理は、酸化防止の点で減圧又は真空下又は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。例えば、１３０℃～１５０℃で窒素雰囲気下３時間～７時間の熱架橋を行うことが好ましい。減圧度としては、４ｈＰａ以下とすることが好ましい。不活性ガスとして窒素又はアルゴンが好ましく、均一な加熱の観点より真空下より不活性ガス雰囲気下での架橋が好ましい。加熱手段としては特に制限はなく、例えばヤマト科学製ＤＰ－４３のような真空オーブン等を挙げることができる。
熱架橋後の粉砕物は、容器に保存してもよい。例えば、ゼラチンからなる粉砕物の場合、容器については特に制限されないが、例えば、ガラスバイアルにゴム栓とアルミキャップで密封したものを用いることができる。ガラスバイアルのサイズは特に制限されない。
ガラスバイアルにはジメチルポリシロキサンなどを用いたシリコーン樹脂コーティングや、フッ素樹脂コーティング、シリカコーティング、脱アルカリ処理などを施しても良い。
これら各種コーティング又は脱アルカリ処理により、帯電防止、付着防止、撥水などの効果を与えることができる。また、上記の容器を更に包装してもよい。包装についても特に制限はないが、例えば、アルミパウチを用いることができる。
ガラスバイアルにはジメチルポリシロキサンなどを用いたシリコーン樹脂コーティングや、フッ素樹脂コーティング、シリカコーティング、脱アルカリ処理などを施しても良い。
これら各種コーティング又は脱アルカリ処理により、帯電防止、付着防止、撥水などの効果を与えることができる。また、上記の容器を更に包装してもよい。包装についても特に制限はないが、例えば、アルミパウチを用いることができる。
［組織修復材］
本発明において組織修復材とは、高分子顆粒を含む組成物である。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材とすることにより、良好な組織修復能を示す組織修復材となる。組織修復材を適用する組織は特に限定されないが、例えば骨組織が挙げられる。これを更に説明すれば、以下のように考えることができる。即ち、（骨）組織修復材は、一定の生体親和性、生分解性を有することで、所望の期間、強度が担保され欠損部の容積を保持しつつ、再生した（骨）組織との置換場所となりうる。この結果、欠損部に（骨）組織修復材を配置することにより骨等の組織の再生が良好に進行すると推定される。ただし、本発明はこの理論に拘束されない。
本発明において組織修復材とは、高分子顆粒を含む組成物である。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材とすることにより、良好な組織修復能を示す組織修復材となる。組織修復材を適用する組織は特に限定されないが、例えば骨組織が挙げられる。これを更に説明すれば、以下のように考えることができる。即ち、（骨）組織修復材は、一定の生体親和性、生分解性を有することで、所望の期間、強度が担保され欠損部の容積を保持しつつ、再生した（骨）組織との置換場所となりうる。この結果、欠損部に（骨）組織修復材を配置することにより骨等の組織の再生が良好に進行すると推定される。ただし、本発明はこの理論に拘束されない。
本発明は、組織再生能が良好な組織修復材を提供することができるので、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本発明に包含される。具体的には、本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含む。
本発明の組織修復材により修復可能な組織としては、歯、骨等の硬組織であることが好ましい。特に、組織修復材は、骨再生用基材として好適である。本発明の組織修復材は単独で骨再生用の治療剤として用いることができる。本治療剤が適用される疾患としては、骨再生又は骨新生が必要な治療となる疾患である限り、特に限定されるものではない。
本発明における損傷組織の治療方法又は修復方法は、欠損又は損傷した対象組織の部位に、組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程、を含む。他の工程としては、例えば、移植細胞及び／又は骨誘導剤を組織修復材の適用の前後、又は同時に組織修復材を適用する部位へ適用することが挙げられる。組織修復材を適用する際は、スパチュラ、シリンジ、又はダッペンディッシュなどを使用することができる。治療方法又は修復方法は、顎顔面領域における歯周組織欠損（periodontal defect）、インプラント欠損（implant defect）等；インプラント埋入時の予備的処置としてのＧＢＲ法（Guided Bone Regeneration：骨誘導再生法）、歯肉増大術（Ｒｉｄｇｅ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法、サイナスリフト法、又はソケットリザベーション法；などに好ましく適用することができる。
［組織修復材の吸水率］
組織修復材は、一定以上の吸水率を備えることが好ましい。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の場合、質量基準で３００％以上の吸水率を示すことが好ましい。吸水率が３００％未満では、 良好な（骨）組織再生能が得られない。（骨）組織修復材の吸水率は、（骨）組織修復時の血餅保持の観点で４００％以上であることが好ましく、５００％以上であることがより好ましい。（骨）組織修復材の吸水率の上限値は、特に制限はないが、好ましくは４０００％以下、より好ましく３０００％以下、更に好ましくは２０００％以下である。（骨）組織修復材の吸水率は、（骨）組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の吸水率とする。
組織修復材は、一定以上の吸水率を備えることが好ましい。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の場合、質量基準で３００％以上の吸水率を示すことが好ましい。吸水率が３００％未満では、 良好な（骨）組織再生能が得られない。（骨）組織修復材の吸水率は、（骨）組織修復時の血餅保持の観点で４００％以上であることが好ましく、５００％以上であることがより好ましい。（骨）組織修復材の吸水率の上限値は、特に制限はないが、好ましくは４０００％以下、より好ましく３０００％以下、更に好ましくは２０００％以下である。（骨）組織修復材の吸水率は、（骨）組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の吸水率とする。
本発明における（骨）組織修復材の「吸水率」とは、以下のようにして測定される物理的特性を意味する。風袋質量を予め測定した３本のフィルターカップ(底面に孔径０．２２μｍのフィルターを備えた容積５００μLのもの。以下、容器という)に、それぞれ被験物質１０．０±０．２ｍｇを採取する(ｎ＝３)。これに十分な量の水を加え、被験物質による吸水が飽和するまで混和する (ローテート、２時間、環境温度)。次に遠心(６０００×ｇ、１分、２５℃)して余剰の水を除き、吸水後の被験物質を含む容器の質量を量る(吸水後の総質量)。別に、空試験を３回実施し、被験物質を含まない場合の吸水後の総質量から風袋質量を差し引いた値を残水量とする。３回の残水量の平均値を空試験の残水量とし、吸水率を補正する。吸水後の被験物質の質量を吸水前の被験物質の質量で除して吸水率(％)とする。
（骨）組織修復材の吸水率は、（骨）組織修復材に含まれる成分、特に高分子顆粒の種類や個々の高分子顆粒の形態によって異なるが、例えば、凍結工程、又は架橋工程の温度、処理時間等によって調整することができる。一般に、凍結工程の温度を高くする、又は架橋工程の温度を低くする、又は架橋時間を短くすると、吸水率が高まる傾向がある。
［組織修復材の酸残存率］
組織修復材は、一定以下の酸残存率を示すことが好ましい。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の場合、１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６６％以下の残存率を示すことが好ましい。１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準での残存率が６６％より高い場合は、（骨）組織再生能が充分とは言えない。（骨）組織修復材の酸残存率は、欠損部位での製剤層の体積の維持、再生する組織との置換の観点から、５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、３４質量％以上であることが更に好ましい。（骨）組織修復材の酸残存率は、（骨）組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の酸残存率とする。
組織修復材は、一定以下の酸残存率を示すことが好ましい。例えば、ゼラチン顆粒を含む組織修復材の場合、１モル／Ｌ（リットル）の塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準で６６％以下の残存率を示すことが好ましい。１モル／Ｌの塩酸を用いた３時間の分解処理による質量基準での残存率が６６％より高い場合は、（骨）組織再生能が充分とは言えない。（骨）組織修復材の酸残存率は、欠損部位での製剤層の体積の維持、再生する組織との置換の観点から、５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、３４質量％以上であることが更に好ましい。（骨）組織修復材の酸残存率は、（骨）組織修復材がゼラチン顆粒のみを含む場合、ゼラチン顆粒の酸残存率とする。
本発明における（骨）組織修復材の「酸残存率」とは、以下のようにして測定される物理的特性値のことを称する。測定用のマイクロチューブ（商品名ミニスーパーチューブ、アイビス社製、容量２ｍｌ、以下チューブと称する）の質量を測定する（Ａ）。顆粒状の修復材 については組織欠損部に配置させる形態のまま加工せず１５．０（±０．２）ｍｇを秤量（ｎ＝３）、 ブロック状の修復材については、直径６ｍｍ×厚み約１ｍｍの円柱の検体を作製し、質量を測定し（Ｂ）、測定用チューブに充填する。組織修復材入りのチューブに、１モル／ＬのＨＣｌを１．7ｍｌ添加し、３７±０．５℃にて、３時間恒温静置させる。規定時間後、チューブを氷上に立て反応を止め、あらかじめ４℃に設定した遠心器で１０，０００×ｇ、１分間遠心する。組織修復材が沈殿していることを確認し、上清を吸い取り、あらかじめ氷上で冷やしておいた超純水を添加して、上記と同一の条件で再度、遠心する。上清を吸い取り、再度超純水を加え、上記と同一の条件で再度遠心することを、あと２回繰り返す。上清を吸い取ったのち、凍結乾燥する。凍結乾燥機から取り出した後、空気中の水分を組織修復材が吸い取るのを防ぐためすばやくチューブのキャップを閉める。チューブごと質量を測定し（Ｃ）、下記計算式（３）を用いて酸残存率を算出する。
酸残存率＝（Ｃ－Ａ）／Ｂ×１００（％）・・・・（３）
酸残存率＝（Ｃ－Ａ）／Ｂ×１００（％）・・・・（３）
組織修復材の酸残存率は、組織修復材に含まれる成分、特に高分子顆粒の種類や形態によって異なるが、例えば、架橋工程の温度、処理時間等によって調整することができる。
一般に、架橋工程の処理時間を短くすると、酸残存率が低くなる傾向がある。
一般に、架橋工程の処理時間を短くすると、酸残存率が低くなる傾向がある。
以下の実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
［実施例１］
組換えゼラチンとしてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、実施例１にかかる骨再生用基材を製造した。ＣＢＥ３としては、以下記載のものを用いた（ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載）。
ＣＢＥ３分子量：５１．６ｋＤ構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４高分子中の親水性繰り返し単位比率は２６．１％である。
アミノ酸配列（配列番号１）
組換えゼラチンとしてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、実施例１にかかる骨再生用基材を製造した。ＣＢＥ３としては、以下記載のものを用いた（ＷＯ２００８／１０３０４１Ａ１に記載）。
ＣＢＥ３分子量：５１．６ｋＤ構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、チロシン残基及びシステイン残基は含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４高分子中の親水性繰り返し単位比率は２６．１％である。
アミノ酸配列（配列番号１）
上記組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮した。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加えて３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。このゼラチン水溶液を、０．２２μｍのセルロースアセテート膜フィルターでろ過し、真空脱泡機（倉敷紡績、KK－V３００SS-I）を用いて４．０kPaにおいて１８０秒間真空遠心脱泡した。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、気泡は０．４２個/μL、不溶物は０個/μLだった。このゼラチン水溶液を、内径１０４ｍｍ、底厚５ｍｍ、底面内周をＲ２ｍｍで面取りし、内面がＦＥＰ（日本フッ素、ＮＦ－００４Ａ）でコートされたアルミ合金（A５０５６）製円筒カップ状容器に約２０ｇ流し込んだ後、約－３５℃に予冷した３５０×６３４×２０ｍｍアルミ板上に１ｍｍ厚のガラス板を介して１４個設置し、蓋をして１時間静置することによって凍結したゼラチン凍結体を得た。なお、用いた円筒カップ状容器の主たる部材の材質（アルミ合金（A５０５６））の線膨張係数は２４．３×１０-6／Ｋである。このゼラチン凍結体を、凍結乾燥機（アルバック、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）を用いて凍結乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成し異方性を評価したところ１３個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝９３％）。異方性評価のための標本作成は以下の通り行った。まず凍結乾燥体を１ｃｍ×１ｃｍの大きさに切り出し、窒素雰囲気下１３５℃で５時間処理することにより、熱架橋した。次に、得られた架橋体を生理食塩水に１２時間浸漬した後、凍結組織切片作製用包埋剤に包埋し、－２０℃で凍結した。得られた凍結ブロックを、クリオスタットにより約５μｍ厚に薄切することで、切片を得た。切片をスライドグラスに貼付し、５分間ドライヤーの冷風で風乾させた後、エオジン染色液に1分間浸漬し、染色した。水洗の後、エタノール浸漬による脱水、キシレン浸漬による透徹の上、マリノールとカバーグラスにより封入し、２時間室温で乾燥させることで標本を得た。２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図１に示す。
［実施例２］
実施例１に記載の凍結乾燥体（高分子多孔質体）のうち異方性の低いものをスクリーン粉砕機（クワドロ、コーミルＵ１０）により、０．０７９ｉｎｃｈ、ついで０．０４０ｉｎｃｈのスクリーンを用いて粉砕した(１inchは約２．４５ｃｍ）。目開き１４００μｍのふるい下、且つ、目開き３００μｍのふるい上の画分を回収し、充填機（アイシンナノテクノロジーズ、ＴＦ－７０ＡＤ）を用いて１０ｍＬのガラスバイアルに約０．０９ｇ充填した。同バイアルをクリーンオーブン（日東理科工業、ＮＣＯ－５００Ａ６００Ｌ－ＷＳ）に設置し、窒素雰囲気下１３５℃で５時間処理し、組織修復材として試料１を得た。試料１は、無菌アイソレータ（エアレックス）内でバイアルにゴム栓を打栓して、アルミキャップで巻締し、アルミパウチに入れてヒートシールしたものを保管し、吸水率、酸残存率を評価したところ、それぞれ５８０％、４６％であった。
実施例１に記載の凍結乾燥体（高分子多孔質体）のうち異方性の低いものをスクリーン粉砕機（クワドロ、コーミルＵ１０）により、０．０７９ｉｎｃｈ、ついで０．０４０ｉｎｃｈのスクリーンを用いて粉砕した(１inchは約２．４５ｃｍ）。目開き１４００μｍのふるい下、且つ、目開き３００μｍのふるい上の画分を回収し、充填機（アイシンナノテクノロジーズ、ＴＦ－７０ＡＤ）を用いて１０ｍＬのガラスバイアルに約０．０９ｇ充填した。同バイアルをクリーンオーブン（日東理科工業、ＮＣＯ－５００Ａ６００Ｌ－ＷＳ）に設置し、窒素雰囲気下１３５℃で５時間処理し、組織修復材として試料１を得た。試料１は、無菌アイソレータ（エアレックス）内でバイアルにゴム栓を打栓して、アルミキャップで巻締し、アルミパウチに入れてヒートシールしたものを保管し、吸水率、酸残存率を評価したところ、それぞれ５８０％、４６％であった。
［実施例３］
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて７．５質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結した後、凍結体を３７℃で１８時間かけて解凍し７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た（実施例１と異なり、「凍結乾燥→再溶解」ではなく、「凍結→解凍」した）。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、気泡、不溶物ともに０個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は９８％だった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は、容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図２に示す。
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて７．５質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結した後、凍結体を３７℃で１８時間かけて解凍し７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た（実施例１と異なり、「凍結乾燥→再溶解」ではなく、「凍結→解凍」した）。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、気泡、不溶物ともに０個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は９８％だった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は、容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図２に示す。
［比較例１］
実施例１のアルミ合金製円筒カップ状容器の内壁に接するように肉厚３ｍｍのＰＴＦＥ製円筒状部材を設置し、約１７．８ｇのゼラチン水溶液を用いたほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ１１個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝７９％）。
実施例１のアルミ合金製円筒カップ状容器の内壁に接するように肉厚３ｍｍのＰＴＦＥ製円筒状部材を設置し、約１７．８ｇのゼラチン水溶液を用いたほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ１１個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝７９％）。
［比較例２］
実施例１のアルミ合金製円筒カップ状容器の内面をコートしないほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ５個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝３６％）。
実施例１のアルミ合金製円筒カップ状容器の内面をコートしないほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ５個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝３６％）。
［比較例３］
実施例１の円筒カップ状容器の材質としてPTFEを用い、内面をコートしないほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ１０個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝７１％）。
実施例１の円筒カップ状容器の材質としてPTFEを用い、内面をコートしないほかは実施例１と同様にして凍結乾燥体を作成し、異方性を評価したところ１０個が異方性の低い凍結乾燥体であった（得率＝７１％）。
［比較例４］
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加え３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、ゼラチン水溶液中の気泡は１１．０５個/μL、不溶物は０．９２個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は４０％だった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体には、容器底面側に不均一なポアが存在した。気泡による不均質核生成が原因であると推測した。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図３に示す。
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加え３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、ゼラチン水溶液中の気泡は１１．０５個/μL、不溶物は０．９２個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は４０％だった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体には、容器底面側に不均一なポアが存在した。気泡による不均質核生成が原因であると推測した。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図３に示す。
［比較例５］
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加え３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。このゼラチン水溶液を、０．２２μｍのセルロースアセテート膜フィルターでろ過した。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、気泡は、０．６９個/μL、不溶物は０個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は６７％だった。
なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体には、容器底面側に不均一なポアが存在した。気泡による不均質核生成が原因であると推測した。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図４に示す。
実施例１と同様の組換えゼラチンを含む溶液を精製後、３０℃にて４．０質量％まで限外ろ過により濃縮し、ゼラチン水溶液を得た。得られたゼラチン水溶液を凍結乾燥した後、凍結乾燥体に注射用水を加え３０分かけて３７℃まで昇温して再溶解し、７．５質量％のゼラチン水溶液を改めて得た。このゼラチン水溶液を、０．２２μｍのセルロースアセテート膜フィルターでろ過した。ゼラチン水溶液を、液厚２．５ｍｍとなるようポリスチレン製透明容器にサンプリングし、光学顕微鏡を用いて２．５ｍｍ×２．５ｍｍの視野で、液下面から液上面まで１００μｍ刻みで観察した。１０視野観察し、平均の気泡および不溶物の個数を算出したところ、気泡は、０．６９個/μL、不溶物は０個/μLだった。このゼラチン水溶液を用いて、実施例１と同様の方法により凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作成した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体の得率は６７％だった。
なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体には、容器底面側に不均一なポアが存在した。気泡による不均質核生成が原因であると推測した。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図４に示す。
実施例１、実施例３、比較例１～５の結果をまとめたものを表１に示す。９０％以上の得率の場合、得率の判定を「良好」とした。気泡及び不溶物が少ないゼラチン水溶液を、内面をＦＥＰでコートした容器を用いて凍結乾燥することで、異方性の低い凍結乾燥体を高い得率で作成可能なことが分かる。なお、気泡及び不溶物を少なくするには、ろ過処理と脱泡処理を共に行うか（実施例１）、凍結体の製造に供するまでゼラチン水溶液を一度も凍結乾燥しないこと（実施例３）が有効である。
［実施例４］
〈凍結乾燥用容器〉
外寸が１００ｍｍ（縦）×１０６ｍｍ（横）×３１ｍｍ（高さ）のアルミニウム合金（Ａ５０５２）を用いて、内寸が９０ｍｍ（縦）×９６ｍｍ（横）×２８ｍｍ（深さ）の容器本体（壁厚：５ｍｍ、底厚：３ｍｍ）と、容器本体の底面に垂直な４つの板状の伝熱体（９０ｍｍ（縦）×３ｍｍ（厚さ）×２３ｍｍ（高さ））とを含む、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個作製した。容器本体の壁及び伝熱体は、横方向に等間隔（１６．８ｍｍ）に配置されており、凍結乾燥用容器には、互いに連通していない５つの収容部が設けられており、更に、容器本体は伝熱体と一体であった。容器の接液面は日本フッ素社で「NF-004A」によりFEPを80μm厚みでコーティングした。
〈凍結乾燥用容器〉
外寸が１００ｍｍ（縦）×１０６ｍｍ（横）×３１ｍｍ（高さ）のアルミニウム合金（Ａ５０５２）を用いて、内寸が９０ｍｍ（縦）×９６ｍｍ（横）×２８ｍｍ（深さ）の容器本体（壁厚：５ｍｍ、底厚：３ｍｍ）と、容器本体の底面に垂直な４つの板状の伝熱体（９０ｍｍ（縦）×３ｍｍ（厚さ）×２３ｍｍ（高さ））とを含む、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個作製した。容器本体の壁及び伝熱体は、横方向に等間隔（１６．８ｍｍ）に配置されており、凍結乾燥用容器には、互いに連通していない５つの収容部が設けられており、更に、容器本体は伝熱体と一体であった。容器の接液面は日本フッ素社で「NF-004A」によりFEPを80μm厚みでコーティングした。
〈被凍結乾燥液体〉
被凍結乾燥液体として、実施例１と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
被凍結乾燥液体として、実施例１と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
〈凍結乾燥工程〉
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は２８個得られ、得率は９３％であった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×１０．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図５示す。なお、得られた凍結乾燥体は凍結乾燥容器から凍結乾燥容器を逆さにするだけで容易に剥離した。
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は２８個得られ、得率は９３％であった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×１０．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図５示す。なお、得られた凍結乾燥体は凍結乾燥容器から凍結乾燥容器を逆さにするだけで容易に剥離した。
［実施例５］
〈凍結乾燥用容器〉
実施例４と同じ、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個用意した。
〈凍結乾燥用容器〉
実施例４と同じ、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個用意した。
〈被凍結乾燥液体〉
被凍結乾燥液体として、実施例３と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
被凍結乾燥液体として、実施例３と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
〈凍結乾燥工程〉
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は２９個得られ、得率は９７％であった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×１０．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図６に示す。なお、得られた凍結乾燥体は凍結乾燥容器から凍結乾燥容器を逆さにするだけで容易に剥離した。
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は２９個得られ、得率は９７％であった。なお、得られた異方性の低い凍結乾燥体は容器底面側まで均一な構造だった。異方性評価のため、実施例１と同様に標本を作製し、２．５ｍｍ×１０．０ｍｍの領域を光学顕微鏡で観察した時の写真を図６に示す。なお、得られた凍結乾燥体は凍結乾燥容器から凍結乾燥容器を逆さにするだけで容易に剥離した。
［比較例６］
〈凍結乾燥用容器〉
外寸が１００ｍｍ（縦）×１０６ｍｍ（横）×３１ｍｍ（高さ）のアルミニウム合金（Ａ５０５２）を用いて、内寸が９０ｍｍ（縦）×９６ｍｍ（横）×２８ｍｍ（深さ）の容器本体（壁厚：５ｍｍ、底厚：３ｍｍ）と、容器本体の底面に垂直な４つの板状の伝熱体（９０ｍｍ（縦）×３ｍｍ（厚さ）×２３ｍｍ（高さ））とを含む、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個作製した。容器本体の壁及び伝熱体は、横方向に等間隔（１６．８ｍｍ）に配置されており、凍結乾燥用容器には、互いに連通していない５つの収容部が設けられており、更に、容器本体は伝熱体と一体であった。
〈凍結乾燥用容器〉
外寸が１００ｍｍ（縦）×１０６ｍｍ（横）×３１ｍｍ（高さ）のアルミニウム合金（Ａ５０５２）を用いて、内寸が９０ｍｍ（縦）×９６ｍｍ（横）×２８ｍｍ（深さ）の容器本体（壁厚：５ｍｍ、底厚：３ｍｍ）と、容器本体の底面に垂直な４つの板状の伝熱体（９０ｍｍ（縦）×３ｍｍ（厚さ）×２３ｍｍ（高さ））とを含む、略直方体状の凍結乾燥用容器を６個作製した。容器本体の壁及び伝熱体は、横方向に等間隔（１６．８ｍｍ）に配置されており、凍結乾燥用容器には、互いに連通していない５つの収容部が設けられており、更に、容器本体は伝熱体と一体であった。
〈被凍結乾燥液体〉
被凍結乾燥液体として、実施例３と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
被凍結乾燥液体として、実施例３と同様に、ゼラチン水溶液を準備した。
〈凍結乾燥工程〉
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は１０個得られ、得率は３３％であった。また得られた凍結乾燥体は容器から剥離せず、ナイフで切り出した。
凍結乾燥用容器６個のそれぞれ５つの収容部にそれぞれ、１１．５ｇのゼラチン水溶液を流し込んだ。２３℃における１１．５ｇのゼラチン水溶液の体積は、１１．３ｍＬであり、メスシリンダー中にゼラチン水溶液を収容し、質量と体積とを比較することにより測定した。凍結乾燥用容器６個を凍結乾燥機（アルバック社製、ＤＦＲ－５Ｎ－Ｂ）内に入れ、７℃で２時間静置後、－１０℃まで冷却し、その後－３０℃で１４時間、次いで－１０℃で４４時間、次いで２０℃で２時間真空乾燥して水分を除去することにより、凍結乾燥体（高分子多孔質体）を作製した。異方性を評価したところ、異方性の低い凍結乾燥体は１０個得られ、得率は３３％であった。また得られた凍結乾燥体は容器から剥離せず、ナイフで切り出した。
実施例４、実施例５、比較例６の結果をまとめたものを表２に示す。９０％以上の得率の場合、得率の判定を「良好」とした。ＦＥＰでコートした、伝熱体を含むアルミ製の凍結乾燥容器を用いても、ＦＥＰでコートしたアルミ製カップを用いた時と同様に、異方性の低い凍結乾燥体を高い得率で作成可能なことが分かる。また、ＦＥＰでコートすることで、凍結乾燥体が容器から容易に剥離することが分かる。
Claims (7)
- 高分子水溶液を、溶液に接する面がテトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体である液体容器中で凍結する工程を含み、高分子水溶液の高分子濃度が０．１ｗｔ％以上であり、高分子水溶液中の不溶物及び気泡が、０．５個/μL以下である、含高分子水溶液凍結体の製造方法。
- 液体容器の主たる部材の線膨張係数が１０×１０－５／Ｋ未満である、請求項１に記載の製造方法。
- 液体容器の主たる部材の内面のコート部材がテトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体である、請求項１に記載の製造方法。
- 高分子水溶液が組換えゼラチンの水溶液である、請求項１に記載の製造方法。
- 高分子中の親水性繰り返し単位比率が５０％以下である、請求項１に記載の製造方法。
- 含高分子水溶液凍結体の製造に供するまで、高分子水溶液を凍結乾燥しない、請求項１に記載の製造方法。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載の製造法で得られた高分子水溶液凍結体から、さらに水分を除去する工程を含む、高分子多孔質体の製造方法。
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-
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Savillex, フッ素樹脂特性 [online]，東栄株式会社，2011年，<URL: https://savillex.jp/savillex/cat02-03.html>，[検索日 2021.08.10] |
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