JPH07500038A - 骨形成性蛋白の送達のための血餅−ポリマー・マトリックスの処方 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨形成性蛋白の送達のための血餅−ポリマー・マトリックスの処方発明の背景 本発明は、骨形成性蛋白およびその医薬処方の分野に関する。さらに詳しくは、 本発明は、骨形成性細胞臼が軟骨および／または骨の形成を誘導するのに十分な 時間、当該蛋白をその場所に（ｉｎ−ｓｉｔｕ）隔離するように設計した医薬処 方を含む。

骨形成性蛋白は、軟骨および／または骨の形成を誘導できるか、あるいは誘導を 助けることができる蛋白である。近年、多くのかかる骨形成性蛋白が単離されて 特徴付けられており、いくつかは組換え法によって生産されてきた。例えば、い わゆる骨形成性蛋白（ＢＭＰ）が無機質脱落骨組織から単離されており（例えば 、ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）の米国特許第４．４５５．２５６号参照）、多数のか かるＢＭＰ蛋白が組換え技術によって生産されており（例えば、ウアング（ｆａ ｎｇ）らの米国特許第４．８７７．８６４号およびウアング（ｆａｎｇ）らの米 国特許第５，０１３．５４９号参照）、一群の形質転換成長因子（ＴＧＦ−αお よびＴＧＦ−β）が骨疾患の治療で有用でありうるとして同定されており（例え ば、プリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら、欧州特許第１５４．４３４号参照）；Ｖｇ ｒ−１と表される蛋白が骨形成性細胞で高レベルで発現されることが見い出され ており（リオンズ（Ｌｙｏｎｓ）ら、（１９８９）、プロシーディングズ・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ旦旦、４５５４−４５５８）；および０Ｐ−１、Ｃ０ Ｐ−５およびＣ０Ｐ−７と表される蛋白は骨誘導活性を示シティる（オノペルマ ン（Ｏｐｐｅｒｍａｎ）らの米国特許第５．ＯＯｌ、６９１号参照）。

骨形成性蛋白を、骨形成の誘導が望まれる部位へ送達するように設計された処方 を開発しようとする種々の試みがなされてきた。例えば、アクリル酸エステルポ リマー（ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）の米国特許第４．５２６．９０９号）および乳 酸ポリマー（ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）の米国特許第４．５６３．４８９号）のご ときある種のポリマー材料が利用されてきたが、これらの処方は、最適に骨形成 を誘導するのに十分な時間、骨形成性蛋白を隔離せず、さらに、最適な骨形成に は侵食するのが遅すぎることが判明している。

ＯＰと表される骨形成性蛋白の送達のための多孔性粒子の生分解性マトリックス がクーペラスアンバス（Ｋｕｐｅｒａｓａｍｐａｔｈ）の米国特許第５，１０８ ，７５３号に開示されている。米国特許第５．１０８．７５３号は、ＯＰ用の成 功した担体が当該蛋白に結合し、徐放送達系として働き、骨発育の間の細胞の応 答の各段階を収容し、かつ当該蛋白を非特異的蛋白分解から保護するにちがいな いと開示しているが、骨形成が望まれる部位においてＯＰを特異的に隔離する成 分を含有する処方は示唆されていない。

オカダ（Ｏｋａｄａ）らの米国特許第４．６５２．４４１号、米国特許第４．７ １１．７８２号、米国特許第４．９１７．８９３号およびヤマモト（Ｙａｍａｗ ｏｔｏ）らの米国特許第４．９５４．２９８号は、外部の油層中のポリマー壁物 賀によって囲まれた内部の水性層にカプセル化されたポリペプチド薬物および薬 物保持物質からなる徐放性マイクロカプセルを開示している。骨形態形成性蛋白 は、かかる形成が可能なポリペプチドとしてリストされているが、骨形成性蛋白 のマイクロカプセル化は、最適な骨形成のために十分なかかる蛋白の制御放出を 妨げる。

また、コラーゲンマドノックスも骨形成性蛋白用の送達ビヒクルとして使用さレ テキタ（例えば、シェフリーズ（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ）の米国特許第４．３９４． ３７０号）が、コラーゲンは、しばしば、蛋白において望まない抗原反応を引き 起こす。従って、かかる骨形成の安全で、効果的な誘導を可能とするのに十分な 時間、骨形成の誘導が望まれる部位に骨形成性蛋白を隔離できる医薬処方に対す る要求が依然存在する。

発明の概要 出願人は、驚（べきことに、抗フィブリン溶解剤の不存在下で血餅を用いて、骨 誘導活性が望まれる部位に骨形成性蛋白が隔離できることを見い出した（但し、 多孔性粒子ポリマーマトリックスが処方に取り込まれている）。従って、さらに 詳しくは、本発明は、骨形成性蛋白：多孔性ポリマーマトリックスおよび骨形成 性蛋白隔離量の血餅の医薬上許容される混合物からなる組成物を提供する。

発明の詳細な記載 本発明の実施で有用な骨形成性蛋白は当業者によく知られており、前記したもの を包含する。ここで用いる好ましい骨形成性蛋白は、米国特許第７．８７７、８ ６４号；米国特許第５．０１３．６４９号：　１９９０年１０月４日に公開され たＷＯ９０／１１３６６号および１９９１Ｊ１１月２８８＋：、公開されたＷｏ 　９１／１８０９８号においてＢＭＰ−１ないしＢＭＰ−８と表されているＢＭ Ｐクラスのものである。最も好ましいものはＢＭＰ−２であり、全長ｃＤＮＡ配 列および最終的な成熟蛋白の配列が６４９号の特許に詳細に記載されている。も ちろん、骨形成性活性を示すかかる蛋白の断片が用いることができるように、か かる骨形成性蛋白の２またはそれ以上の組合せも使用できる。かかる骨形成性蛋 白はホモダイマ一種であることが知られているが、混合したヘテロダイマーとし ても活性を示す。骨形成性蛋白のへテロダイマー形もまた本発明の実施で用いる ことができる。組換え蛋白は天然に存在する単離された蛋白よりも好ましい。こ こで有用な骨形成性蛋白の量は、侵潤性祖先細胞の骨形成活性の増大を刺激する 量であり、それは、後記にて詳細に説明するごとく、治療されるべき欠陥のサイ ズおよび性質に依存し、かかる量は使用するポリマーマトリックスの量よりも小 さいオーダーであり、一般に、使用するポリマーマトリックスＩＱｍｇにつき蛋 白１−５０μｇ、より好ましくは、使用するポリマーマトリックス１μｇにつき ０．５−１０μｇの範囲である（推定０．２ｇ／ｃｃ密度）。

骨形成性蛋白は（凍結乾燥形からの復元を含めた）医薬上許容される溶液の形態 で使用できる。医薬上効果的な量の蛋白が必要な担体の不適切な容量なくして医 薬上効果的な量の蛋白が送達できるように、骨形成性蛋白を少なくとも約１ｍｇ ／ｍＬ好ましくは約２ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化させるのが最適である。

正味の正の電荷を有する（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジンならびにグ リシンおよびベーターアラニンのエチルエステルのごとき正味で１＋の種）を有 するアミノ酸、好ましくは正味で２＋の電荷（例えば、ヒスチジンのエチルエス テル、リジンおよびアルギニンのメチルエステル、ならびにアグマチン）を有す るアミノ酸がこの点で有用である。正味でゼロの電荷を有するアミノ酸はこの点 で有用であるが、当該化合物の正の電荷は中和する負の電荷から十分距離がある ものとする（少なくとも２−３個のＣＨ，単位離れる）（例えば、ガンマ−アミ ノ酪酸、ベーターアミノプロピオン酸、およびグリシン−グリジンジペプチドの ごとき正味中性種）。ここで有用な他の可溶化剤は、ポリ（ツルベート）、デキ ストランサルフェート、グアニジン、ヘパリンおよび塩化ナトリウムを包含する 。

ＢＭＰ−２の可溶化で使用するには、好ましい可溶化剤はアルギニンおよびヒス チジンであり（そのエステルを含む）。アルギニンは５０−６００ｍＭ、好まし くは３００−５００ｍＭの濃度で用いる。ヒスチジンは、約１１００ｍＭ、好ま しくは１０−５０ｍＭの濃度でアルギニンに加えてＢＭＰ−２を可溶化する。

ヒスチジンを単独で可溶化剤として使用する場合、約５０−６００ｍＭ、好まし くは３００−５００ｍＭの濃度で用いる。骨形成性蛋白および可溶化剤を配合す るには種々のよく知られた公知の方法を用いることができ、限外濾過、透析、ゲ ル濾過および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されるも のではない。

本発明の実施で用いるポリマーマトリックス成分は、後記するごとく多孔性粒子 に形成でき、それにより、新しい骨成長によって置換される生分解特性を有しつ つ、骨形成製蛋白の１ｎ−ｓｉｔｕ足場を提供できるボッマーマトリックスであ る。

その例は、アミノ酸、オルトエステル、無水物、ブロビレンーコーフマレートの ポリマー、あるいはα−ヒドロキシカルボン酸モノマー（例えば、α−ヒドロキ シ酢酸（グリコール酸）および／またはα−ヒドロキシピロピオン酸（乳酸）） の１種またはそれ以上のポリマーである。後者は、そのｄ−またはｌ−形で、あ るいはラセミ混合物として使用でき、ラセミ混合物が好ましい。乳酸とグリコー ル酸のコポリマーを使用する場合（ＰＬＧＡ）　、モノマーのモル比は、目的と する臨床症状に依存する所望の生分解半減期に応じて１：９９ないし９９：１の 範囲であり、いずれかのモノマーが５０％を超えると、長い生分解半減期を与え る（より遅い生分解）。ポリマーの分子量は（ＣＨＣＩｓ中のポリスチレンに対 して）約１０００ないし１０００００の範囲であり、５０　：　５０のコポリマ ーを使用する場合、３００００ないし５００００が好ましい。分子量が高くなれ ば、それだけ生分解は遅くなる。

本発明のポリマーマトリックス成分は粒子を空洞とするために（表面多孔性）、 高度に多孔性の形態で使用するが、以後集合的に「多孔性粒子」という。これら の多孔性粒子は、一般に、１５０ないし８５０ミクロンの直径、好ましくは１５ ０−５００ミクロン、最も好ましくは１５０−３００ミクロンの直径を有する球 形である。この粒子サイズは粒子間に十分なスペースを生じて、哺乳動物骨祖先 細胞が侵潤し、（骨形成活性／骨成長速度の増加によって証明されるごとく）骨 形成性蛋白によって良好な影響を受けることを可能とする。

一般に、骨形成性蛋白の送達用のマトリックスとして適する粒子は多孔性である べきとされているが、最適に骨形成を誘導するのに必要な多孔度は従前には研究 されていない。本発明者らは、多孔性粒子当たりの平均表面積が骨形成を最適化 するのに臨界的であることを発見した。具体的には、本発明において骨形成で有 用な多孔性粒子は約０．０２ないし４ｍ”７ｇの平均表面積を有するべきである 。

本発明者らは、さらに、「孔形成剤（ポロンゲン（ｐｏｒｏｓｉｇｅｎ））　Ｊ 　（粒子表面積を増加させることによって多孔性を付与できる組成物）を多孔性 粒子を生産するための溶液に導入することにより、所望の表面積を有する多孔性 粒子を生産できることを見い出した。また、該多孔性粒子を滅菌用量のγ線に付 すことによって生分解速度を制御することも可能である。γ線の用量が高くなる と、生分解は速くなる。

ここに有用な粒子は、当該粒子の表面積が、匹敵するサイズの非多孔性粒子の表 面積の約２−２５０倍に増大した多孔性を有する。

本発明の多孔性粒子の生産の好ましい方法は、一般的に言えば、ポリマーを、例 えば、（ＣＨ，ＣＩ　、中に）溶解し、固体および／または液体形態のＮａＣ１ 、マンニトールまたはスクロースのごときポロシゲンを添加することよりなる溶 媒蒸発プロセスである。ボロンゲンを固体形態で添加する場合、マトリックスー ポロンゲン溶液は懸濁液の形態を採る。本発明の多孔性粒子のもう１つの好まし い生産方法は溶媒抽出方法であり、そこでは、ポロシゲンを同時ホモゲナイゼー ンヨンにて液体形態で添加する。ポロンゲンをホモゲナイゼーションにて液体形 態で添加する場合、マトリックスーポロンゲン溶液はエマルジョンの形態を採る 。いずれかの方法で、マトリックスーポロシゲンエマルジョンを、撹拌および温 度を制御しつつ、ポリ（ビニルアルコール）のごとき界面活性剤を含有する過剰 の水性溶液に添加する。得られた多孔性粒子を、抽出しまたは残存する溶媒を蒸 発させることによって固化させ、乾燥する。ポロシゲンとして５０％　ＮａＣ１ を利用する本発明で有用なＰＬＧＡ粒子は約０．２および０．６ｍ”７ｇの間の 表面積を有し：ポロンゲンとしてスクロースを用いる粒子は約０．０４および０ ．０９ｍ２／ｇの間の表面積を有する。ホモゲナイゼーションにて液体ポロシゲ ンを用いる本発明のＰＬＧＡ粒子は約１０２および４ｍ”７ｇの間の表面積を有 する。

本発明の粒子の多孔性は、蛋白の吸着用の十分な表面積を生成させ、生分解を増 大させ、両者の望ましい程度は目的とする臨床的症状に依存する。表面積は通常 の技術によって測定できる。例えば、ＢＥＴ表面積分析は、ミクロメリティクＸ 　（ｌｉ（ｒ□ｍｅｒｉｔｉｃｓ）のＡＳＡＰ２０００システムを用いて使用で き、固体試料内の表面および孔内におけるクリプトンガスの吸着および脱着に基 いて表面積を測定する。単位は表面積を計算し、それを指摘する：■＝圧力Ｐに おける吸着容量　Ｐ、ｌ＝飽和圧力Ｐ／Ｐ、＝相対圧力　Ｐ＝圧力 Ｃ＝定数　Ａ＝ガス断面積 ■、＝単層キャパシティー １／　［ＶＡ　［（Ｐｏ／Ｐ）−１１１を（Ｐ／Ｐａ）に対してプロットするこ とによって、傾きは（Ｃ−１）／Ｖ、Ｃであって切片は１／Ｖ、Ｃであり、表面 積Ｓ、＝Ｖ、ＮＡ／Ｖであり、ここにＮ＝アボガドロ数であってＶ＝モル容量で ある。

個々の欠陥を処理するのに用いる多孔性粒子の量は、もちろん、処理すべき欠陥 のサイズ、および骨形成性蛋白を吸着するのに要する有効量に依存する。

本発明の実施で有用な蛋白−隔離材料は医薬上許容されるヒト血液、好ましくは 自己由来の血液である。骨形成性蛋白／多孔性粒子混合物に添加すると、血液は 凝固して展性複合体を形成し、吸着された蛋白は、当該蛋白が哺乳動物祖先細胞 を浸潤させる骨形成活性の天然の速度を増大させるのに十分な時間、マトリック ス内に隔離される。かかる血餅の不存在下では、骨形成性蛋白は、蛋白の骨誘導 効果が臨床的に有意でない速度にて、１ｎ−ｓｉｔｕでＰＬＧＡ粒子から脱着す る。

ここに有用な多孔性粒子に対する血液の比は１・０．５ないし１：１０（Ｖ：Ｖ ）、好ましくは１：５（ｖ：ｖ）、より好ましくは１・２　（ｖ　：　２）であ り、この比はポリマーマトリックスからの脱着を防ぐのに必要な量を表すが、祖 先細胞はマトリックスに浸潤するのが妨げられず、それにより、蛋白が祖先細胞 の骨形成活性を助力する機会を与える。従って、１ｍｌの欠陥につき、必要な血 液量は、一般に、約０．５−１．０ｍｌである。大用量の骨形成性蛋白を使用す る場合、トロンビンのごとき凝固容易化剤を使用して骨形成性蛋白の希釈効果を 補うこともできる。多孔性粒子の添加の前に、血液成分を骨形成性蛋白の溶液と 混合するのが好ましい。

本発明の実施で有用なさらなる任意の成分は、例えば、（凍結乾燥中の分解を防 ぐための）マンニトール、スクロース、ラクトース、グルコース、またはグリッ ジのごとき低温保護剤、メチルおよびプロピルパラベンならびにベンジルアルコ ールのごとき抗菌性防腐剤、ＥＤＴＡ、ントレート、およびＢＨＴ　（ブチル化 ヒドロキシトルエン）のごとき抗酸化剤、およびポリ（ツルベート）およびポリ （オキシエチレン）等のごとき界面活性剤を包含する。もちろん、医薬上許容さ れる形態（すなわち、パイロジエン−フリー、適当なｐＨおよび等張性、滅菌性 等）における処方の伝統的製剤は当業者の技量内のものであり、本発明の処方に 適用できる。処方の骨形成性蛋白および多孔性粒子は、溶液または凍結乾燥形態 としての、単一のバイアルとしてのクリニックに提供できるか、あるいは該処方 は、例えば、骨形成性蛋白が１のバイアル中に供され、多孔性粒子が別のバイア ル中に供される多成分キットとして供することができる。凝固時間におけるよく 知られた患者−慰者間の変動を考慮して、該処方で用いる血液は、凝固が可能と なる十分な使用前、一般に、使用の３０ないし１８０分前に混合する。

本発明の処方は、骨誘導性蛋白の治療上有効量が軟骨および／または骨の形成が 望まれる負傷部位に送達されるのを可能とする展性インブラントを提供する。

かかるインブラントは、整形分野において一頭蓋／顎顔面復元において；補綴組 み込みのための、特に、ヒドロキシアパタイト被覆補綴のごとき補綴インブラン トの固定を改良するための表面コーティングとして；骨再生のための骨髄炎にお いて、および歯槽隆線および歯周疾患の侵食のための歯科分野において、新しい 偽関節の骨折、を髄固定、および骨欠損修復での自己由来骨移植の代替物として 使用できる。骨髄炎を治療するのに使用する場合、骨形成性蛋白は多孔性粒子お よび抗生物賀と組み合わせ、自己由来の血液を隔離剤として添加して使用できる 。

低粘性処方もまた、閉鎖骨折の治癒を加速するために経皮注射として使用できる 。

これらの使用のうちある場合は、本発明の組成物は、ポリ（プロピレン−共重合 −フマレート）のごとき侵食性骨セメントを含めた種々の骨セメントと組み合わ せて使用できる。また、これらの使用のあるものは、侵食性プレート、ネジ等の ごとき生侵食性ハードウェアを利用できる。前記したごと（、用量は目的とする 臨床徴候によって、ならびに種々の患者の変数（例えば、体重、年令、性別）お よび臨床的表示（負傷の程度、負傷の部位等）によって決定される。

実施例■ インブラントの調製 乳酸およびグリコール酸（５０：　５０）のランダムコポリマー（ＰＬＧＡ）（ 平均分子量３０〜４０ｋＤ、ポリスチレン標準物質に対するゲル透過クロマトグ ラフィーによる平均分子量約２０ｋＤ、固有粘度０．３５〜０．４５ｄＬ／ｇ） をＣＨｚＣＨｔ　（１５％　ｗ　／　ｖ　）に溶解し、この溶液中にＬｏｇの孔 形成剤（７，５％　Ｗ／Ｖ）を懸濁させた。得られた溶液を、過剰のポリ（ビニ ルアルコール）水溶液（０，１％　Ｗ／Ｖ）に添加した。減圧下（２４インチＨ ｇ）で数時間撹拌した後、粒子を過剰の冷エタノール（９５％）中で固化させた 。得られた粒子を注射用水で洗浄し、真空乾燥して浮遊物のない製品を得た。前 記したミクロメトリファ、　（Ｉｌｉｃｒｏｍｅｔｒｉｃｓ）　Ａ　Ｓ　Ａ　Ｐ 　２０００システムを用いてＢＥＴ表面積測定を行ったところ、粒子は約０．２ ないし１．０ｍ”／Ｈの表面積を有していた。スクロースを孔形成剤として用い て調製した粒子は、約１０４ないし０．０９の間の表面積を有していた。該多孔 性粒子を使用前にγ線照射により滅菌する。ヒトに使用するための各インブラン ト（１０ｍｌの多孔性粒子）を滅菌カップ中に置く。

凍結乾燥したヒト・ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）（２ｍｇ）を、１ｍｌの注射 用滅菌水（ＷＦＩ）で復元する。ｒｈＢＭＰ−２（１ｍｇ）溶液０．５ｍｌを３ ｍｌシリンジ中に吸い込み、ついでその針を雌型ルエル・ロク・　（Ｌｕｅｒ　 Ｌｏｋ）コネクターに置き換える。

患者の静脈血５．５ｍｌを１０ｍ１ンリンジに吸い込み（ヘパリン処理したライ ンを通さずに）、その針を取り出し、直ちにｒｈＢＭＰ−２溶液が入っている３ ｍｌシリンジについたルエル・ロク・コネクターの他方側に装着する。ｒｈＢＭ Ｐ−２７ｓ液を血液の入ったフリンジ中に徐々に移行させ、得られた混合物を、 シリンジ間を４回緩やかに移行させて均一に混合し、１０ｍ１シリンジ中で混合 を終える。空になった３ｍｌシリンジとルエル・ロク・コネクターを取り外し、 ついで血液／ｒｈＢＭＰ−２混合物を、多孔性粒子の入ったカップ中に移す。必 要ならば、混合物全体を、ステンレス鋼製薬さしでゆるやかに撹拌して均一粘度 にする。カップに覆いをし、室温で約１時間放置する。そのインブラント混合物 は、その後２時間のうちに使用すべきである。

所望の粘度の展性インブラントが得られた時点で、損傷部位における骨欠損部を 外科的切開により露出させる。外科医により、該インブラントが多孔性粒子／ｒ ｈＢＭＰ−２／血餅からなる展性コンポジットを形成して、治療すべき骨欠損部 位を埋めるように適用される。ついで切開部を慣用的方法を用いて閉じる。欠損 部位をＸ線分析することにより治癒をモニターする。

実施例ＩＩ イヌ・頭１冠欠損インブラントの分析 ２匹のオスおよび２匹のメスのイヌを通常の麻酔下に置き、アクラーカットＤＧ ＩＩ−クラニアル・ドリル（＾ｃｒａ−ｃｕｔ　ＤＧ　ＩＩ　ｃｒａｎｉａｌ　 ｄｒｉｌｌ）を用いて、下に示すように約１２ｍｍ径の４つのトレフィン穴をそ れぞれ頭蓋骨にあけた。

ｒｈＢＭＰ−２、ＰＬＧＡ多孔性粒子、および凝固させて展性インブラントを形 成した自己由来の血液からなるインブラントですべての穴を満たした。ｒ’ｈＢ ＭＰ−２用量は、各インブラント巾約２００μｇ／ｍＩであった。外科手術４週 間後、１匹のオスと１匹のメスを屠殺し、残りの動物を外科手術８週間後に屠殺 した。

屠殺後、各動物の右の口側および左の尾側の頭蓋冠部位を組織病理学試験に用い た。身体力学的試験により、４週目および８週目に屠殺した動物において同様の 圧迫抵抗性（無処理の対照のイヌと統計的に有為な差異はない）が示された。

ｍｍ学的試験により、外科手術４週間後よび８週間後両方において、おそら（頭 蓋欠損部を架橋すると思われるインブラント中への骨の内方成長が起こったこと が示された。小柱が厚くなるにつれ、４ないし８週の間に再形成が起こったと思 われた。多孔性粒子マトリックス物賀は試験期間中消失し続１九８週間後には僅 かに残りたたけてありな。

実施例ＩＩＩ ラット・大腿骨インブラントの分析 前置て穴を明けたポリエチレン板を大腿骨前部に取り付け、カーバイドの歯科用 ドリルで骨の一部を切除することにより、５６日齢のオスのロング・エバンズ（ Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ）の交配適齢期経過後のラット（４５０〜５５０グラム） それぞれの左大腿骨の骨幹中央部に臨界的な欠損（５ｍｍ）を外科的に作成した 。ｒｈＢＭＰ−２（種々の量）　、ＰＬＧＡ多孔性粒子およびラット・静脈血を 混合することにより生分解性インブラントを調製し、血液を凝固させて成形可能 なインブラントを作った。各７匹からなる８群に以下のごとく移植を行った：０ μｇ　ｒｈＢＭＰ−２；０．９３μｇ　ｒｈＢＭＰ−２；３．１μｇ　ｒｈＢＭ Ｐ−２；９．３μｇ　ｒｈＢＭＰ−２；Ｏμｇ　ｒｈＢＭＰ−２＋２Ｍ　ｅ−ア ミノカプロン酸：Ｑ、９３μｇ　ｒｈＢＭＰ−２＋２Ｍ　ε−アミノカプロン酸 ；３．１μｇ　ｒｈＢＭＰ−２＋２Ｍ　ｅ−アミノカプロン酸：および９．３μ ｇ　ｒｈＢＭＰ−２＋ε−アミノカプロン酸（ε−アミノカプロン酸は恒常性維 持剤である）。この研究に用いたＰＬＧＡ多孔性粒子は、０．２１７ｍ”／ｇの 表面積を有していた。

動物のＸ線撮影を、０８目と３．６および９週目に行った。９週目の動物を層殺 し、ポリエチレン板のまわりの組織を組織学的試験用に取り出し、移植を受けた 大腿骨および移植を受けていない反対側の大腿骨を取り出した。各群の２本の大 腿骨を組織学的に試験し、残りの大腿骨を身体力学的試験に用いた。

０μｇのｒｈＢＭＰ−２を与えられた動物には、骨の癒合が見られず、それらの 群においては新たな骨の形成も認められなかった。１９３μｇ用量群のうち５０ （ε−アミノカプロン酸を与えられた動物）ないし８０（ε−アミノカプロン酸 を与えられなかった動物）パーセントにおいて骨の癒合が起こった。３．１μｇ 用量群のすべての動物には、９週目に癒合が起こった。９．３μｇ用量群の動物 １３匹のうち１２匹においては、９週目には癒合完了したままであった（９．３ μｇの動物のうち１匹において、６週目に板が破損した）。

ε−アミノカプロン酸は、治癒応答に変化をもたらさないと思われた。インブラ ントのまわりのいかなる軟組織においても骨の形成は見られなかった。いくらか の軟骨形成が、すべての移植群（０μｇのｒｈＢＭＰ−２群を含む）のポリエチ レン板のまわりの繊維組織において見られた。

９週目において、用量依存性の治癒応答が大腿骨に見られた。ｒｈＢＭＰ−２不 含インブラントは、欠損部位において繊維組織を成長させた。ｒｈＢＭＰ−２用 量０９３μｇの群は、近位および遠位の骨と欠損部位とがほとんど配列していな い部分のほかに欠損部位にもいくらかの繊維組織を有していた。３．１μｇおよ び９．３μｇのｒｈＢＭＰ−２インブラントの群は、繊維組織がほとんどないか またはなく、近位および遠位の部分がうま（配列し、い（らかのカルス形成が見 られた。カルス形成は９．３μｇ群においてより大きかった。すべてのｒｈＢＭ Ｐ−２投与群において骨髄は正常と思われた。

ｒｈＢＭＰ−２インブラントの群すべてにおいてＰＬＧＡ多孔性粒子は見られな かった。ｒｈＢＭＰ−２用量３．１および９３μｇ／インブラントで最も好まし い骨の成長が見られた。

国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　ｌｏｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８／１６ ４７／３０　Ｂ　７４３３−４Ｃ ８３１４−４Ｃ （７２）発明者　トウレック、トマス・ヨセフアメリカ合衆国マサチューセッツ 州０２１２４、ボストン、ベアーズ・アベニュー６５番Ｉ Ａ６１Ｋ　３７／１４

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）骨形成性蛋白； （ｉｉ）多孔性粒子ポリマーマトリックス：および（ｉｉｉ）骨形成性蛋白隔離 量の自己由来の血餅の医薬上許容される混合物からなる組成物。
2. ２．該骨形成蛋白が、ＢＭＰ一族のメンバーからなる群より選択される請求項１ 記載の組成物。
3. ３．該骨形成蛋白がＢＭＰ−２である請求項２記載の組成物。
4. ４．該混合物が抗フィブリン溶解剤不含である請求項１、２または３記載の組成 物。
5. ５．該ポリマーマトリックスの成分が、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、 および乳酸とグリコール酸のコポリマーからなる群より選択される請求項１、２ または３記載の組成物。
6. ６．該ポリマーマトリックスの成分がＰＬＧＡである請求項１、２、３、４また は５記載の組成物。
7. ７．該ポリマーマトリックスの成分が、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物お よびポリ（プロピレンーコーフマレート）ポリマーから選択される請求項１、２ 、３または４記載の組成物。
8. ８．（ｉ）ＢＭＰ−２； （ｉｉ）約１５０ないし８５０ミクロンの間の直径で、粒子表面積が約０．０１ ないし４．０ｍ２／ｇであるような多孔度を有するポリマー粒子であって、該ポ リマーが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、および乳酸とグリコール酸の コポリマーよりなる群より選択されるポリマー粒子からなるポリマーマトリック ス成分：および （ｉｉｉ）蛋白隔離量の自己由来の血餅の医薬上許容される混合物からなる組成 物。
9. ９．（ｉ）骨形成性蛋白：および （ｉｉ）多孔性粒子ポリマーマトリックスからなる軟骨および／または骨損傷修 複用キット。