DE69230670T2

DE69230670T2 - Zusammensetzungen, die eine blutgerinnselpolymermatrix zur verabreichung von osteogenen proteinen enthalten

Info

Publication number: DE69230670T2
Application number: DE69230670T
Authority: DE
Inventors: Eyal Ron; George Schaub; Joseph Turek
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2012-10-10
Also published as: ES2145013T3; WO1993006872A1; JPH07500038A; JP3336010B2; AU669133B2; AU2788592A; EP0608313B1; KR0181984B1; US5171579A; ATE189611T1; DE69230670D1; EP0608313A1; DK0608313T3; GR3033204T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Der vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet osteogener Proteine und pharmazeutische Formulierungen davon. Im besonderen beinhaltet die vorliegende Erfindung pharmazeutische Formulierungen, welche entwickelt wurden, um osteogene Proteine in situ für eine Zeit zu sequestrieren, die ausreichend ist, um zu gewährleisten, daß das Protein Knorpel- und/oder Knochenbildung induzieren kann.
Osteogene Proteine sind diejenigen Proteine, die in der Lage sind, die Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung zu induzieren oder bei deren Induktion mitzuhelfen. Viele solcher osteogenen Proteine sind in den letzten Jahren isoliert und charakterisiert worden und einige sind durch rekombinante Verfahren hergestellt worden. Die sogenannten Knochenmorphogenetischen Proteine (bone morphogenetic proteins, BMP) sind aus demineralisiertem Knochengewebe isoliert worden (siehe z. B. Urist US 4.455.256); einige dieser BMP-Proteine sind durch rekombinante Verfahren hergestellt worden (siehe z. B. Wang et al. US 4.877.864 und Wang et al. US 5.013.549); eine Familie von transformierenden Wachstumsfaktoren (transforming growth factors, TGF-α und TGF-β) ist als potentiell zweckmäßig für die Behandlung von Knochenerkrankungen identifiziert worden (siehe z. B. Derynck et al., EP 154.434); von einem als Vgr-1 bezeichneten Protein fand man, daß es in großen Mengen in osteogenen Zellen exprimiert wird (siehe Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4554-4558); und von Proteinen, welche mit OP-1, COP-5 und COP-7 bezeichnet wurden, ist angeblich gezeigt worden, daß sie induktive Aktivität besitzen (siehe Oppermann et al. U. S. 5.001.691).
Verschiedene Versuche sind gemacht worden, um Formulierungen zu entwickeln, die so gestaltet sind, daß sie osteogene Proteine an einem Ort bereitstellen, an welchem die Induktion von Knochenbildung erwünscht ist. Bestimmte Polymermatrices, wie das Acrylesterpolymer (Urist, US 4.526.909) und das Milchsäurepolymer (Urist, US 4.563.489) z. B. sind verwendet worden, doch diese Formulierungen sequestrieren das osteogene Protein für eine Zeit, die nicht ausreichend ist, um die Knochenbildung optimal zu induzieren und darüber hinaus ist gefunden worden, daß sie für eine optimale Knochenbildung zu langsam freigesetzt werden.
Eine biodegradierbare Matrix poröser Teilchen zur Bereitstellung eines osteogenen Proteins, welches als OP bezeichnet wird, ist in Kuberasampath, U. S. 5.108.753 offenbart. Während die Anmeldung US 5.108.753 offenbart, daß ein erfolgreicher Träger für OP das Protein binden muß, als Bereitstellungssystem durch langsame Freisetzung wirken muß, sich an jeden Schritt der zellulären Antwort während der Knochenentwicklung anpassen muß und das Protein vor unspezifischer Proteolyse schützen muß, werden dagegen keine Formulierungen vorgeschlagen, die Komponenten enthalten, die das OP spezifisch an der Stelle sequestrieren, an der die Knochenbildung gewünscht wird.
Okada et al. US 4.652.441, US 4.771.782, US 4.917.893 und US 5.061.492 und Yamamoto et al., US 4.954.298 offenbaren eine Mikrokapsel zur verlängerten Freisetzung, welche einen Polypeptid-Wirkstoff und eine Medikament-zurückhaltende Substanz umfaßt, die in einer inneren wäßrigen Schicht eingekapselt ist und von einer Polymerwandsubstanz in einer äußeren Ölschicht umgeben ist. Obwohl das Knochenmorphogenetische Protein zu den Polypeptiden gezählt wird, die die Fähigkeit zu einer solchen Bildung haben, verhindert die Mikro-Einkapselung osteogener Proteine eine für optimale Knochenbildung ausreichende kontrollierte Freisetzung eines solchen Proteins.
Kollagenmatrices sind ebenfalls als Freisetzungs-Vehikel für osteogene Proteine verwendet worden (siehe z. B. Jeffries, US 4.394.370), Kollagen verursacht jedoch gelegentlich unerwünschte antigene Reaktionen in den Patienten. Deshalb bleibt ein Bedarf nach einer pharmazeutischen Formulierung, die fähig ist, osteogene Proteine an einem Ort, an welchem die Induktion von Knochenbildung gewünscht ist, für eine Zeit, die ausreichend ist, eine sichere und wirkungsvolle Induktion solcher Knochenbildung zu gewährleisten, zu sequestrieren.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die Anmelder haben überraschenderweise entdeckt, daß osteogene Proteine an dem Ort, an welchem Knocheninduzierende Aktivität gewünscht ist, sequestriert werden können, wenn sie ein Blutgerinnsel in Abwesenheit eines antifibrinolytischen Wirkstoffes verwenden, vorausgesetzt, daß eine poröse, aus Partikeln bestehende Polymermatrix in der Formulierung enthalten ist. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung im besonderen eine Zusammensetzung bereit, die ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus einem osteogenen Protein, einer porösen, aus Partikeln bestehende Polymermatrix und einer osteogenes Protein sequestrierenden Menge von autologen Blutgerinnseln umfaßt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die osteogenen Proteine, welche für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung zweckmäßig sind, sind dem Fachmann gut bekannt und beinhalten diejenigen, welche vorstehend besprochen wurden. Die bevorzugten osteogenen Proteine zur Anwendung hierin sind die der BMP-Klasse, welche in US 4.877.864; US 5.013.649; WO 90/11366, veröffentlich am 4. Oktober 1990, und WO 91/18098, veröffentlicht am 28. November 1991, als BMP-1 bis BMP-8 identifiziert wurden. Das am meisten bevorzugte ist BMP-2, die vollständige cDNA-Sequenz und die endgültige reife Proteinsequenz, die in Einzelheiten in dem '649-Patent beschrieben wurde. Selbstverständlich können Kombinationen von zwei oder mehr solcher osteogener Proteine wie auch Fragmente solcher Proteine, die ebenso osteogene Aktivität zeigen, verwendet werden. Es ist bekannt, daß solche osteogenen Proteine homodimerer Art sind, sie aber auch als gemischte Heterodimere Wirkung zeigen. Heterodimere Formen osteogener Proteine können ebenfalls für die Durchführung des erfindungsgemäßen Gegenstandes verwendet werden. Rekombinante Proteine werden gegenüber natürlich auftretenden isolierten Proteinen bevorzugt. Die Menge an osteogenem Protein, welche hierin zweckmäßig ist, ist diejenige Menge, die für Stimulation erhöhter osteogener Aktivität infiltrierender Vorläuferzellen wirksam ist und hängt von der Größe und der Natur des zu behandelnden Schadens ab, wie es nachfolgend im Detail dargestellt wird, wobei solche Mengen um Größenordnungen niedriger sind als die Mengen an eingesetzter Polymermatrix, im allgemeinen zwischen 1-50 ug Protein pro eingesetzten 10 mg Polymermatrix und bevorzugter von 0,5-10 ug Protein pro jedem mg eingesetzter Polymermatrix (0,2 g pro/cc Dichte annehmend).
Die osteogenen Proteine können in Form einer pharmazeutisch verträglichen Lösung verwendet werden (einschließlich Wiederherstellung aus einer lyophilisierten Form). Es ist optimal, das osteogene Protein in Konzentrationen von mindestens etwa 1 mg pro ml, vorzugsweise etwa 2 mg pro ml zu solubilisieren, so daß eine pharmazeutisch wirkungsvolle Menge an Protein bereitgestellt werden kann, ohne daß übermäßige Volumina eines Trägers notwendig sind. In dieser Hinsicht sind Aminosäuren zweckmäßig, welche eine positive Nettoladung (z. B. Netto +1-Arten, wie Arginin, Histidin, Lysin und die Ethylester von Glycin und β-Alanin), vorzugsweise eine Nettoladung von +2 (z. B. die Ethylester von Histidin, die Methylester von Lysin und Arginin, und Agmatin). Aminosäuren, welche eine Nettoladung von 0 haben sind in dieser Hinsicht dann zweckmäßig, wenn die positive Ladung der Verbindung in ausreichender Entfernung (mindestens im Abstand von 2-3 CH&sub2;- Einheiten) von der neutralisierenden negativen Ladung lokalisiert ist (z. B. Arten mit neutraler Nettoladung, wie γ- Aminobuttersäure, β-Aminopropionsäure und Glycin-Glycin- Dipeptid). Andere solubilisierende Wirkstoffe, welche hierin zweckmäßig sind, beinhalten Poly(sorbat)dextransulfat, Guanidin, Heparin und Natriumchlorid. Die bevorzugten Solubilisierungswirkstoffe zum Zwecke der Solubilisierung von BMP-2 sind Arginin und Histidin (einschließlich deren Ester). Arginin wird in Konzentrationen von 50-600 mM, vorzugsweise 300-500 mlvi, verwendet. Histidin kann zur Solubilisierung von BMP-2 in Konzentrationen von etwa 1-100 mM, vorzugsweise 10-50 mM zu Arginin hinzugefügt werden. Wenn Histidin alleine als Solubilisierungswirkstoff verwendet wird, wird es in Konzentrationen von etwa 50-600 mM, vorzugsweise 300-500 mM, eingesetzt. Verschiedene gut bekannte Verfahren können verwendet werden, um das osteogene Protein und den solubilisierenden Wirkstoff für die Verwendung hierin zu verbinden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Ultrafiltration, Dialyse, Gelfiltration und hydrophobe Interaktions-Chromatographie.
Die Polymermatrix-Komponente, welche für die Durchführung der vorliegenden Erfindung zweckmäßig ist, ist ein Polymermaterial, das wie nachfolgend beschrieben in poröse Partikel geformt werden kann, wobei ein in situ-Gerüst für das osteogene Protein bereitgestellt wird, während es biodegradierbare Eigenschaften besitzt, was den Austausch durch neues Knochenwachstum gewährt. Beispiele sind Polymere aus Aminosäuren, Orthoester, Anhydride, Propylen-co-fumarate oder ein Polymer aus einem oder mehreren α- Hydroxycarbonsäuremonomeren (z. B. α-Hydroxyessigsäure [Glycolsäure) und/oder α-Hydroxypropionsäure (Milchsäure)]. Letztere kann in ihrer d- oder l-Form eingesetzt werden, oder als ein racemisches Gemisch, wobei das racemische Gemisch bevorzugt wird. Wenn ein Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure eingesetzt wird (PLGA), kann das molare Verhältnis der Monomere von 1 : 99 bis 99 : 1 variieren, was von der gewünschten Bioerosions-Lebensdauer abhängt, die ihrerseits wiederum von der zu erzielenden klinischen Indikation abhängt, da mehr als 50% von jedem Monomer eine längere Bioerosions-Lebensdauer (langsamere Biodegradation) bereitstellt. Das Molekulargewicht des Polymers kann von etwa 1.000-100.000 (in Bezug auf Polystyrol in CHCl&sub3;) variieren, wobei 30.000-50.000 bevorzugt werden, wenn ein 50 : 50-Copolymer eingesetzt wird. Je höher das Molekulargewicht ist, um so niedriger ist die Biodegradation. Die Polymermatrix-Komponente des erfindungsgemäßen Gegenstandes wird in Form stark poröser bis Hohlräume enthaltender (mit Oberflächenporösität) Partikel, hierin nachfolgend gemeinsam als "poröse Partikel" bezeichnet, benutzt. Diese porösen Partikel sind im allgemeinen sphärisch und haben einen Durchmesser von 150-850 Mikron (um), vorzugsweise 150 bis 500 um, am meisten bevorzugt 150-300 um. Diese Partikelgröße läßt ausreichenden Raum zwischen den Partikeln, um die Infiltration von Säuger- Knochenvorläuferzellen zu gewähren und durch das osteogene Protein positiv beeinflußt zu werden (gezeigt durch einen Anstieg an osteogener Aktivität/Knochenwachstumsrate).
Während im allgemeinen gefordert wurde, daß Partikel die als Matrices zur Bereitstellung von osteogenen Proteinen geeignet sind, porös sein sollten, ist der Grad an Porösität, welcher notwendig ist, um die Knochenbildung optimal zu induzieren, bisher nicht untersucht worden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß der durchschnittliche Oberflächenbereich pro porösem Partikel für die Optimierung der Knochenbildung kritisch ist. Insbesondere sollten poröse Partikel, die für die Knochenbildung gemäß der vorliegenden Erfindung zweckmäßig sind, einen durchschnittlichen Oberflächenbereich von etwa 0,02 bis 4 m²/g haben. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben weiterhin entdeckt, daß es möglich ist, poröse Partikel zu produzieren, die den gewünschten Oberflächenbereich haben, indem sie ein "Porosigen" (Zusammensetzung, die fähig ist, Porösität zu verleihen, indem sie den Oberflächenbereich der Partikel erhöht) in die Lösung zu geben, die verwendet wird, um die porösen Partikel herzustellen. Es ist auch möglich, die Bioerosionsrate zu kontrollieren, indem man die porösen Partikel sterilisierenden Dosen γ-Bestrahlung unterzieht. Je höher die Dosis an γ-Bestrahlung, um so schneller ist die Bioerosion.
Partikel, welche hierfür zweckmäßig sind, haben eine solche Porösität, daß der Oberflächenbereich der Partikel gegenüber dem Oberflächenbereich nicht-poröser Partikel vergleichbarer Größe etwa 2-250fach erhöht ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen porösen Partikel ist allgemein ein Lösungsmittel-Verdampfungsverfahren, welches das Lösen des Polymers (in z. B. CH&sub2;Cl&sub2;) und die Zugabe eines Porosigens wie NaCl, Mannitol oder Saccharose in fester und/oder flüssiger Form umfaßt. Wenn das Porosigen in fester Form zugegeben wird, hat die Matrix-Porosigen-Lösung die Form einer Suspension. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen porösen Partikel ist ein Lösungsmittel- Extraktionsverfahren, wobei das Porosigen in flüssiger Form während einer Homgenisation zugegeben wird. Wenn das Porosigen in flüssiger Form unter Homogenisation zugegeben wird, hat die Matrix-Porosigen-Lösung die Form einer Emulsion. Bei beiden Verfahren wird die Matrix-Porosigen-Emulsion unter kontrolliertem Rühren und kontrollierter Temperatur einer überschüssigen wässerigen Lösung, die ein grenzflächenaktives Mittel wie Poly(vinylalkohol) enthält, zugegeben. Die resultierenden porösen Partikel werden durch Extraktion oder Eindampfung des rückständigen Lösungsmittel gehärtet und getrocknet. PLGA-Partikel, welche für die vorliegende Erfindung zweckmäßig sind und welche unter Verwendung von 50% NaCl als Porosigen hergestellt wurden, haben einen Oberflächenbereich von zwischen etwa 0.2 und 0,6 m²/g; und Partikel, welche unter Verwendung von Saccharose als Porosigen hergestellt wurden, haben einen Oberflächenbereich von zwischen etwa 0,04 und 0.09 m²/g. Erfindungsgemäße PLGA- Partikel, welche unter Verwendung von flüssigem Porosigen unter Homogenisation hergestellt wurden, haben einen Oberflächenbereich von zwischen etwa 0.02 und 4 m²/g.
Die poröse Natur der erfindungsgemäßen Partikel schafft einen ausreichenden Oberflächenbereich für die Protein-Adsorption und erhöht die Biodegradation, wobei das gewünschte Ausmaß von beidem von der zu erzielenden klinischen Indikation abhängt. Der Oberflächenbereich kann durch jedes herkömmliche Verfahren gemessen werden. Z. B. kann eine BET-Oberflächenbereich-Analyse unter Verwendung eines Mikromeritics ASAP 2000-Systems durchgeführt werden, welches den Oberflächenbereich basierend auf der Adsorption und Desorption von Kryptongas an der Oberfläche und innerhalb der Poren der festen Probe mißt. Die Einheit berechnet den Oberflächenbereich und druckt ihn aus:
V = Volumen, welches beim Druck P absorbiert wird,
P/P&sub0; = relativer Druck
C = Konstante
Vm = Einzelschicht-Kapazität
P&sub0; = Sättigungsdruck
P = Druck
A = Gas-Querschnittsfläche
Indem man 1/VA[(P&sub0;/P)-1]
gegen P/P&sub0; aufträgt, wobei die Steigung C-1/VmC
ist und der Achsenabschnitt 1/VmC
ist, ist der Oberflächenbereich St = VmNA/V
wobei N die Avogadrosche Zahl und V das molare Volumen ist. Die Menge poröser Partikel, die verwendet wird, um einen bestimmten Schaden zu behandeln, wird natürlich von der Größe des zu behandelnden Schadens und von der effektiven Menge, die benötigt wird, um das osteogene Protein zu adsorbieren, abhängen.
Das zu verwendende Protein-sequestrierende Material der vorliegenden Erfindung ist pharmazeutisch verträgliches menschliches autologes Blut. Wenn man sie einem osteogenes Protein/poröse Partikel-Gemisch zufügt, bilden die Blutgerinnsel ein verformbares Gemisch, worin das adsorbierte Protein innerhalb der Matrix für eine Zeit sequestriert wird, welche ausreichend ist, die ansonsten natürliche Rate osteogener Aktivität der infiltrierenden Säuger- Vorläuferzellen zu erhöhen. In Abwesenheit solcher Blutgerinnsel wird das osteogene Protein von den PLGA- Partikeln in situ mit einer Rate desorbiert, so daß die osteoinduzierende Wirkung des Proteins klinisch nicht signifikant ist. Das Verhältnis von Blut zu porösen Partikeln, welches hier zweckmäßig ist, beträgt 1 : 0,5 bis 1 : 10 (v : v), vorzugsweise 1 : 5 (v : v) und noch mehr bevorzugt 1 : 2 (v : v), wobei das Verhältnis die Menge repräsentiert, die notwendig ist, um die Desorption von der Polymermatrix zu verhindern, jedoch nicht so hoch, daß die Vorläuferzellen daran gehindert werden, die Matrix zu infiltrieren, wobei dem Protein die Gelegenheit gegeben wird, die osteogene Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen. Für jeden 1 ml-Schaden beträgt die erforderliche Menge an Blut deshalb im allgemeinen etwa 0,5 bis 1,0 ml. In Fällen, in denen große Dosen osteogenes Protein eingesetzt werden, können gerinnungserleichternde Wirkstoffe wie Thrombin eingesetzt werden, um den Verdünnungseffekt des osteogenen Proteins auszugleichen. Es wird bevorzugt, die Blutkomponente vor der Zugabe der porösen Partikel mit der Lösung von osteogenem Protein zu mischen.
Zusätzliche fakultative Komponenten, welche für die Durchführung des Gegenstands der Anmeldung zweckmäßig sind beinhalten z. B. kryogene Protektoren wie Mannitol, Saccharose, Lactose, Glucose oder Glycin (um vor Degradation während der Lyophilisation zu schützen), antimikrobielle Konservierungsmittel, wie Methyl- und Propylparabene und Benzylalkohol, Antioxidantien wie EDTA, Citrat und butyliertes Hydroxytoluol (BHT; butylated hydroxytoluene), und grenzflächenaktive Mittel wie Poly(sorbate) und Poly(oxyethylene) usw. Selbstverständlich ist die überlieferte Herstellung der Formulierungen in pharmazeutisch verträglicher Form (z. B. pyrogenfrei, angemessener pH und Isotonizität, Sterilität, usw.) dem Fachmann gut bekannt und für die Formulierungen der vorliegenden Erfindung anwendbar. Das osteogene Protein und poröse Partikel der Formulierungen können für den Kliniker als eine Einzelgefäßformulierung bereitgestellt werden, entweder als eine Lösung oder in lyophylisierter Form, oder die Formulierung kann als ein Multikomponentenkit bereitgestellt werden, worin z. B. das osteogene Protein in einem Gefäß bereitgestellt wird und die porösen Partikel in einem separaten Gefäß bereitgestellt werden. Das zu verwendende Blut in der Formulierung wird zu einem Zeitpunkt vor der Anwendung dazugemischt, welcher ausreichend ist, die Gerinnung zu gewähren, im allgemeinen 30- 180 Minuten vor der Anwendung, wobei die gut bekannte von Patient zu Patient-Variabilität der Gerinnungszeit bedacht werden muß.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung stellen verformbare Implantate bereit, welche die Freisetzung therapeutisch wirksamer Mengen von osteoinduktivem Protein an einem Verletzungsort, an dem Knorpel und/oder Knochenbildung gewünscht ist, erlaubt. Solch ein Implantat kann als Ersatz für ein autologes Knochentransplantat bei frischen und nichtheilenden Frakturen, bei operativen Wirbelsäulenversteifungen und Knochenschadenersatz auf dem orthopädischen Gebiet verwendet werden; bei Rekonstruktionen von Schädel, Kiefer- und Gesichtsknochen; für die Integration von Prothesen, insbesondere als eine Oberflächenbeschichtung, um die Fixierung des prothetischen Implantates zu sichern, wie Hydroxylapatit-beschichtete Prothesen; für die Knochenregeneration bei Osteomyelitis; zahnheilkundlich für die Erosion der Alveolarleiste und die Periodontalerkrankung. Wenn es zur Behandlung von Osteomyelitis verwendet wird, kann das osteogene Protein in Kombination mit porösen Partikeln und Antibiotika unter Zusatz von autologem Blut als Sequestrierungswirkstoff eingesetzt werden. Die Formulierungen mit niedriger Viskosität können auch als percutane Injektion verwendet werden, um den Heilungsprozeß geschlossener Frakturen zu beschleunigen. In einigen dieser Anwendungen können die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit verschiedenen Knochenzementen verwendet werden, einschließend erodierbarer Knochenzemente, wie Poly(propylen- co-fumarat). Bestimmte dieser Anwendungen werden auch bioerodierbare Materialien verwenden, wie erodierbare Platten, Schrauben, usw. Wie vorstehend erwähnt, wird die Dosierung durch die zu erzielende klinische Indikation bestimmt werden, wie auch durch verschiedene Variablen des Patienten (z. B. Gewicht, Alter, Geschlecht) und die klinische Präsentation (z. B. Ausmaß der Verletzung, Ort der Verletzung usw.).

Beispiel 1:

Herstellung des Implantates.

Ein 50 : 50 zufälliges Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure (PLGA), welches ein durchschnittliches Molekulargewicht von 30 bis 40 kD hat, ein Molekulargewichtzahlenmittel von etwa 20 kD (durch Gelpermeationschromatographie bestimmt, bezogen auf Polystyrol-Standards) und einer intrinsischen Viskosität von 0,35 bis 0,45 dL/g wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (15% w/v) gelöst und 10 g Porosigen (7,5% w/v) wurden in dieser Lösung suspendiert. Die resultierende Lösung wurde zu einem Überschuß wässriger Lösung (0,1% w/v) von Poly(vinylakohol) zugegeben. Nach wenigen Stunden Rühren unter partiellem Vakuum [81,0768 kPa (24 Zoll Quecksilbersäule)], wurden die Partikel in einem Überschuß an kaltem Ethanol (95%) gehärtet. Die resultierenden Partikel wurden mit Wasser zur Injektion gewaschen und vakuumgetrocknet, wobei ein frei-fließendes Produkt erhalten wurde. Eine BET Oberflächenbereich-Analyse wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines Mikrometrics ASAP 2000- Systems durchgeführt und die Partikel hatten einen Oberflächenbereich zwischen etwa 0.2 und 1,0 m²/g: Partikel, welche unter Verwendung von Saccharose als Porosigen hergestellt wurden, hatten einen Oberflächenbereich zwischen etwa 0,04 und 0,09 m²/g. Die porösen Partikel wurden vor der Verwendung durch γ-Bestrahlung sterilisiert. Für jedes Implantat, für das eine Verwendung in Menschen beabsichtigt ist, wurden 10 ml poröse Partikel in ein steriles Röhrchen gefüllt.
Lyophylisiertes rekombinantes menschliches BMP-2 (rhBMP-2) (2 mg) wird mit 1 ml sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert (water for injection; WFI). 0,5 ml der rhBMP-2-Lösung (1 mg) werden in eine 3 ml Spritze gezogen, deren Nadel dann mit einem "double female"-Luer-Locktor-Verbindungsstück ersetzt wird. 5,5 ml venöses Blut des Patienten werden in eine 10 ml Spritze gezogen (nicht heparinisiert), deren Nadel entfernt und sofort mit der anderen Seite des Luer-LockTM- Verbindungsstück an der 3 ml Spritze, welche die rhBMP-2- Lösung enthält, verbunden. Die rhBMP-2-Lösung wird vorsichtig in die Spritze, welche das Blut enthält, übertragen und das resultierende Gemisch wird vorsichtig viermal zwischen den Spritzen transferiert, um eine einheitliche Mischung zu sichern, wobei das Gemisch am Ende in der 10 ml Spritze ist. Die leere 3 ml-Spritze und das Luer-LockTM-Verbindungsstück werden entfernt und das Blut/rhBMP-2-Gemisch wird in das Röhrchen übertragen, welches die porösen Partikel enthält. Falls nötig wird das ganze Gemisch mit einem rostfreien Stahlspatel vorsichtig gerührt, um eine einheitliche Konsistenz zu erhalten. Das Röhrchen wird verschlossen und für etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Implantatgemisch sollte innerhalb der folgenden 2 Stunden verwendet werden.
Wenn die gewünschte Konsistenz des verformbaren Implantates erreicht ist, wird der Knochenschaden an der Stelle der Verletzung durch einen operativen Schnitt freigelegt. Das Implantat wird durch den Operateur eingebracht, indem die verformbare Zusammensetzung aus porösen Partikeln/rhBMP- 2/Blutgerinnsel derart verformt wird, daß sie den zu behandelnden Knochenschaden ausfüllt. Der Einschnitt wird dann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren verschlossen. Die Heilung wird durch Röntgenaufnahmen der geschädigten Stelle verfolgt.

Beispiel 2

Implantat-Analyse an einem Schädeldeckendefekt von Hunden.

Zwei männliche und zwei weibliche Hunde wurden einer allgemeinen Anästhesie unterzogen und 4 trepanierte Löcher von jeweils etwa 12 mm wurden unter Verwendung eines Acra-cut DGII-Schädelbohrers wie nachfolgend gezeigt gemacht. Draufsicht Schädeldecke
Alle Löcher wurden mit einem Implantat, bestehend aus rhBMP-2, PLGA-porösen Partikeln und autologem Blut, welchem erlaubt wurde zu gerinnen, um ein verformbares Implantat zu bilden, ausgefüllt. Die Dosis an rhBMP-2 war für jedes Implantat etwa 200 mg/ml. Ein männliches und ein weibliches Tier wurden nach 4 Wochen getötet und die verbleibenden Tiere wurden 8 Wochen nach der Operation getötet.
Nach der Tötung wurden die linke rostrale und die rechte caudale Schädeldecke jedes Tieres für biomechanische Tests verwendet und die rechte rostrale und linke caudale Schädeldecke wurden für die Histopathologie verwendet. Der biomechanische Test ergab eine ähnliche Streßresistenz in den Tieren, die nach 4 und 8 Wochen getötet wurden, welche statistisch nicht signifikant verschieden von den unbehandelten Kontrollhunden war. Sowohl 4 wie 8 Wochen nach der Operation ergab die histologische Untersuchung, daß in den implantierten Stellen ein knochiges Einwachsen auftrat, welches wahrscheinlich die Defekte in der Schädeldecke überbrückte.
Die Wiederherstellung schien zwischen 4 und 8 Wochen aufzutreten, wobei die Trabekel dicker wurden. Das poröse, aus Partikeln bestehende Matrixmaterial verschwand während des Verlaufs der Studie, wobei nach 8 Wochen wenig davon übrig blieb.

Beispiel 3

Implantatanalyse bei Femurdefekten der Ratte.

Ein Schaden von kritischer Größe (5 mm) wurde an der mittleren Diaphyse des linken Oberschenkelknochens von jeder der 56 männlichen nicht mehr zur Zucht verwendeten Long Evans-Ratten (450-550 g) operativ gesetzt, indem eine vorgebohrte Polyethylenplatte an den vorderen Teil des Oberschenkelknochens befestigt wurde und mit einem Karbid- Dentalbohrer ein Stück Knochen ausgeschnitten wurde. Durch Mischen von rhBMP-2 (in unterschiedlichen Mengen), PLGA- poröser Partikel und venösem Rattenblut, wobei dem Blut erlaubt wurde zu gerinnen, um ein verformbares Implantat auszubilden, wurde ein bioerodierbares Implantat hergestellt. 8 Gruppen von jeweils 7 Tieren wurden wie folgt implantiert: 0 ug rhBMP-2; 0,93 ug rhBMP-2; 3,1 ug rhBMP-2; 9,3 ug rhBMP-2; 0 ug rhBMP-2 + 2 M &epsi;-Aminocapronsäure; 0,93 ug rhBMP-2 + 2 M &epsi;- Aminocapronsäure; 3,1 ug rhBMP-2 +2 M &epsi;-Aminocapronsäure; und 9,3 u rhBMP-2 + 2 M &epsi;-Aminocapronsäure. (&epsi;-Aminocapronsäure ist ein hämostatischer Wirkstoff). Die PLGA-porösen Partikel, welche in dieser Studie verwendet wurden, hatten einen Oberflächenbereich von 0,217 m²/g.
Die Tiere wurden am Tag 0 und nach 3, 6 und 9 Wochen radiographiert. Die Tiere wurden nach 9 Wochen getötet, die Gewebe, welche die Polyethylenplatten umgeben haben, wurden für histologische Untersuchungen entfernt und die implantierten und auf der Gegenseite nicht implantierten Oberschenkelknochen wurden entnommen. Zwei Oberschenkelknochen in jeder Gruppe wurden histologisch untersucht und die verbleibenden Oberschenkelknochen wurden für biomechanische Tests verwendet.
Tiere welche 0 ug rhBMP-2 erhielten, waren nach 9 Wochen nicht geheilt und es zeigte sich in diesen Gruppen keine neue Knochenbildung. 50 (Tiere welche &epsi;-Aminocapronsäure erhielten) bis 80 (Tiere welche keine &epsi;-Aminocapronsäure erhielten) % der 0,93 ug Dosisgruppe erreichte eine Heilung nach 9 Wochen. Alle Tiere in der 3,1 ug Dosisgruppe erreichten eine Heilung nach 9 Wochen. 12 der 13 verbleibenden 9,3 ug Dosis-Gruppen-Tiere erreichten eine Heilung nach 9 Wochen (ein 9,3 ug Tier hatte einen Plattendefekt nach 6 Wochen).
&epsi;-Aminocapronsäure schien den Heilungsprozeß nicht zu modifizieren. In keinem der Weichteile, welche die Implantate umgaben, wurde Knochenbildung gefunden. In allen Implantatgruppen (einschließlich der 0 ug rhBMP-2-Gruppen) wurde in den fibrösen Geweben, welche die Polyethylen-Platte umgaben, etwas Knorpelbildung nachgewiesen.
Die Oberschenkelknochen zeigten nach 9 Wochen eine dosisabhängige Heilungsantwort. Implantate ohne rh-BMP-2 entwickelten fibröses Gewebe in der Schadensregion. Die 0,93 ug rhBMP-2-Dosis-Gruppe hatte zusätzlich zu Bereichen von geringer Ausrichtung der Schadensstelle mit proximalem und distalem Knochen etwas fibröses Gewebe in der Schadensregion. 3,1 und 9,3 ug rhBMP-2-Implantate hatten kein bis wenig fibröses Gewebe, eine gute Ausrichtung proximaler und distaler Segmente und etwas Kallusbildung. Die Kallusbildung war in der 9,3 ug Gruppe größer. In allen rhBMP-2-Dosis-Gruppen erschien das Knochenmark normal.
In keiner der rhBMP-2-Implantatgruppen wurden PLGA-poröse Partikel gefunden. RhBMP-2-Dosen von 3,1 und 9,3 ug pro Implantat ergaben das am meisten akzeptable Knochenwachstum.

Claims

1. Zusammensetzung, die in der Lage ist, Knorpel- und/oder Knochenbildung in einem Patienten zu induzieren, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus

(i) einem osteogenen Protein;

(ii) einer porösen, aus Partikeln bestehenden Polymermatrix; und

(iii) einer osteogenes Protein sequestrierenden Menge von autologen Blutgerinnseln.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteogene Protein ein Mitglied der BMP-Familie ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das osteogene Protein BMP-2 ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gemisch frei von antifibrinolytischen Stoffen ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Polymermatrix-Komponente Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) oder ein Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Polymermatrix-Komponente PLGA ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Polymermatrix-Komponente ein Poly(orthoester), Polyanhydrid oder ein Poly(propylenco-fumarat)-Polymer ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Polymermatrix-Komponente Polymerpartikel umfaßt, die einen Durchmesser von etwa 150 bis 850 um und eine Porösität besitzen, bei der die Oberfläche der Partikel zwischen 0,01 und 4,0 m²/g ist, wobei das Polymer Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) oder ein Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure ist.

9. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend das Kombinieren

(i) eines osteogenen Proteins;

(ii) einer porösen aus Partikeln bestehenden Polymermatrix; und

(iii) einer osteogenes Protein sequestrierenden Menge von autologen Blutgerinnseln

zu einem pharmazeutisch verträglichen Gemisch.