CN1674923A - 用于转移活性剂的非聚合造血细胞凝块 - Google Patents

用于转移活性剂的非聚合造血细胞凝块 Download PDF

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Abstract

本发明包括转移物质的方法和装置。物质的转移包括向受试体服用有物质结合在其中的非聚合造血细胞凝块。该非聚合造血细胞凝块起到物质的转移载体的作用。

Description

用于转移活性剂的非聚合造血细胞凝块
本发明的领域
本发明涉及活性剂转移，更具体地涉及在非聚合造血细胞凝块帮助下的活性剂的转移。
本发明的背景
用生物学因子和细胞来治疗软骨、骨组织、脊椎盘、以及软组织的损伤对于增强缺损的修复来说是一种新兴的方法。重组蛋白和蛋白生长因子的给药促进了组织的生长，导致了如治疗浓度的维持要求非常高的负荷剂量或者重复给药等令人失望的结果，由此在增加了成本、复杂性，以及由于非目标器官的暴露而产生的不必要的副作用的风险的同时，降低了修复的功效。
一种打算用于促进重组蛋白应用于组织修复的方法，已经打算将它们结合到不会引起排斥反应的基质或者是缓慢释放的装置中，用于植入到组织缺损，由此使该蛋白质局部化于损害部位并且可能提供用于迁移细胞生殖的三维空间结构。已经被评定用于修补肌肉与骨骼组织的基质包括多种合成的或天然的聚合物。这些方法也有局限性，那就是在数量上载入到基质中的蛋白质的生产可能格外的昂贵，很少有延长和均衡的释放，而且新成形的修复组织可以受到外来的植入材料不利地影响。基因转移提供了一种方法，可能克服蛋白质输送到被损害的组织的许多局限性。(BONADIO et al.，1999；Evans和Robbins，1995；Evans et al.，1995；Kang et al.，1997；Smith et al.，2000)
本发明的概要
本发明提供了一种新颖的用活性物质，如，基因转移载体，细胞和可溶性蛋白质，治疗受损害组织的方法。已经发现的非聚合造血细胞凝块的用途可以用于将物质输送到受试体。非聚合造血细胞凝块行使作为转移载体的职责，用于转移物质到受试体。
首先，本发明提供的是一种用于转移物质到受试体的方法。该方法包括向受试体服用包括物质的非聚合造血细胞凝块，以转移该物质到受试体。
其次，本发明提供的是一种制备非聚合造血细胞凝块物质转移系统的方法。该方法包括向非聚合造血细胞的样品添加物质，并且包括物质的造血细胞形成非聚合造血细胞凝块。
再次，本发明提供一种物质转移系统，包括：有物质结合在其中的非聚合造血细胞凝块。
该非聚合造血细胞凝块可包括：骨髓细胞，血细胞或将会形成凝块的任何一种其它细胞。该物质可包括：基因转移载体；其他细胞，如基因工程细胞或原初细胞；蛋白质，如重组或可溶性蛋白；生物活性分子或能够影响受试体的任何其他类型的物质。
非聚合造血细胞凝块可能被输送到任何形式的组织中。例如，在某些具体实施方案中，该组织是骨，软组织，软骨，韧带，腱，半月板，以及无脊椎动物盘或身体的任何其它部位。
在某些实施方案中，非聚合造血细胞凝块的形状和大小可以由容器来决定。非聚合造血细胞凝块可均匀分布着物质。在其他具体实施方案中，非聚合造血细胞凝块可以是遗传上修饰过的，以表达至少一个生长因子和其他促进组织修复的基因产品。
在其他具体实施方案中，非聚合造血细胞凝块的量可以由将被修复的组织所的大小所决定。
在还有一些其他的具体实施方案中，非聚合造血细胞凝块可以从受试体上采集得到。在另一个具体实施方案中，骨质细胞可以从髂骨嵴获得，从暴露在骨髓之下骨软骨的缺损获得，或者是从受试体的任何其他可以获得骨髓细胞的区域获得。
物质可以任意地以溶液的形式存在。
包含物质非聚合造血细胞凝块可以用滴定方法测定。该滴定可以使用吸液管完成。
在一些具体实施方案中，该非聚合造血细胞凝块与至少是一种原初细胞和基因修饰过的细胞的悬浊液混合，形成细胞悬浊液。细胞悬浊液可包括另外的基因载体或无其他基因载体。
在其他的具体实施方案中，该转移过程可以缓慢的，局部化的从非聚合造血细胞凝块中释放出该物质。该非聚合造血细胞凝块可以以允许有效地转移该物质的方式成型。物质转移系统可以导致在物质释放的区域的组织的再生。
在一些具体实施方案中，非聚合造血细胞凝块通过在室温下或在被置于容器中的时候的凝结15-30分钟的造血细胞的样品中制备。非聚合造血细胞凝块这时可从该容器中获得。
非聚合造血细胞凝块也可以通过在磷酸盐缓冲盐水中清洗过的造血细胞的样品中制备。任何没有结合的物质都可以该非聚合造血细胞凝块上除去。
依照其他具体实施方案，非聚合造血细胞凝块可以植入到受试体中。物质可以被转移到该受试体。转移过程可以是缓慢的从非聚合造血细胞凝块局部释放物质。非聚合造血细胞凝块转移系统也可以随意地用于再生组织。
造血细胞的样品可以从受试体上采集，或者从造血细胞的另外的来源获得。该受试体可以是相同的或不同的随后会被植入凝块的受试体。
图形的详细描述
本发明的不同的具体实施方案将在下面通过实例和参考附随的图形而被描述，其中
如图1所示是已经用于基因治疗的基因的范例表；
如图2所示是人类的血凝块和胶原质粘多糖基质负荷能力的曲线图；
如图3所示是含预先感染的兔子骨髓细胞的人血凝块和在凝结24小时以后的图片；
如图4所示是2毫米厚度，30毫米直径的人类的血凝块(在组织培养皿中形成的)；
如图5所示是GFP阳性细胞在第1天(图5a)和第21天(图5b)的凝结状况图；
如图6所示是包括有被Ad TGF-β感染的兔骨髓细胞的兔血凝块的TGF-β产量的曲线图；
如图7所示是TGF-β相对于周围媒介的表达的曲线图，其中“BL”代表血“BM”，骨髓；
如图8所示是TGF-β在分解兔骨髓和血凝块中的表达的示图；
如图9所示是腺病毒在凝块中稳定性的示图；
如图10所示是在第三天的活的兔子的有机体内的基因表达示图；
如图11所示是使用Gomori三色试剂盒着色的兔骨髓凝块在生物体外6周后的图片；
如图12所示是使用Gomori三色试剂盒着色的含Ad TGF-β的兔骨髓凝块在生物体外6周后的图片。
本发明的详细描述
本发明在此公开，物质可以通过向受试体服用包括有该物质的非聚合造血细胞凝块而被转移到受试体。在现有技术中用于转移物质到受试体的技术方法，有许多局限性。例如其中一些是昂贵的，复杂的，并且极少能够有所需要的持续和均衡的释放。
在此所使用的“造血细胞凝块”是包括可以在不同的条件下形成凝块的任何类型的造血细胞的凝块。实例包括血凝块和骨髓凝块。骨髓或血的抽吸物可以通过最低限度的侵入手术轻易地从受试体获得。与之相比较，制造人造基质更加的耗时，昂贵，并且劳动强度大。为了形成血凝块，由缺损的大小确定的一定量的血细胞，可以通过抽血从受试体采集得到。同样，为了形成骨髓细胞凝块，适当数量的骨髓抽吸物可以从富含骨髓的来源获得，例如从骼骨嵴，从暴露在骨髓之下骨软骨的缺损获得，或者是从其他适当的位置。骨髓抽吸物和血液通常都有相同的密度并且有相似的凝结特性。
骨髓或血凝块在组织修复中的使用提供了有利的条件，血凝块的形成和骨髓细胞的转移都是在骨软骨缺损，骨，腱，半月板，或者椎间盘的缺损产生之后的自愈反应的一部分。另外，骨髓凝块富含干细胞，而干细胞保留了形成身体的不同组织的能力；由此，凝块扮演着用于修复反应的天生的小环境。如果与适当的生物剂结合，该造血凝块有促进个别组织类型修复的潜能。
造血细胞可以从凝块将被递送的相同的受试体，从另外一个物质将不会被递送的受试体，从一个生长在生物体外的实验室样品，或从其他任何造血细胞的来源分离出来。很明显，不同的情形和物质将会促成造血细胞凝块的不同的来源。例如，如果该造血细胞凝块是从物质将被转移进去的相同的受试体获得，那么凝块完全是天生的并且对受试体来说是自体的。因此，造血细胞较小可能干涉物质的转移，抑制物质想得到的效果或产生免疫反应。
该造血细胞凝块可以是任何尺寸和形状的。例如，该造血细胞凝块可以以其在凝结过程期间自然形成的任何形状使用。作为选择的，也可以使造血细胞凝块形成特殊的形状和尺寸。具有特殊的尺寸或形状的造血细胞凝块在修复特殊的组织缺损时可能是有用的。在那样的情况下，制造尺寸小于被矫正和治疗的特殊的缺损的凝块可能是很值得的。
一种使用成型容器用于制备特殊尺寸和形状的造血细胞凝块的方法。例如，该造血细胞凝块可以在容器中形成，因而，造血细胞的样品和物质的混合物将在容器中凝结。以这样的方式，该凝块的尺寸和形状将由容器的尺寸和形状所确定。造血细胞凝块也可以以允许有效地转移像药这样的物质的方式成形，也就是，甚至是在没有组织缺损的情况下。造血细胞凝块的固体状态允许凝块可以被轻易地操纵和植入到受损害的位置。
所前所述，造血细胞凝块可以用于修复缺损的组织。凝块可以放置到组织内以帮助康复过程。优选的，对修复过程中同样有益的物质被结合到凝块中。在一些情况下，凝块在修复过程期间可以单独使用，仅仅提供用于细胞向内生长的基质，但是优选的，如细胞，药或基因载体的物质，被结合到其中。有缺损的组织可以是任何需要修补的组织。例如，该组织可以是骨和不同的软组织，包括却不仅仅限于软骨，韧带，腱，半月板和椎间盘。另外，造血细胞凝块可以用来作为生物体外系统用于为随后的植入过程制造或修复组织。对于生物体内组织的形成，造血细胞凝块可以用该细胞播种，并且在适当的培养基中培养。
该造血细胞凝块也可以在没有任何组织需要修复的情况下用于转移药或细胞到受试体。例如，凝块可以用来作为任何其他的持续释放装置，用于转移化合物的到受试体。该特殊的用途取决于被转移到受试体的药，细胞或基因载体的类型。
在此所使用的“受试体”是脊椎动物，如人，非人类的灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫，或啮齿类动物。
造血细胞凝块的形成，可以发生在不同的状态下，如在室温下。例如，兔或人的血液和骨髓抽吸物的凝结物将会在大约15-30分钟内出现。如果有必要的话，凝块可以因此通过在内部操作而产生和植入。
一旦造血细胞凝块已经形成，任何没有结合的物质都可以从凝块除去。例如，让造血细胞凝块在如磷酸盐缓冲液的溶液中清洗。更详细的用于制备凝块的实例在通过描述下面的实验之后被阐述明了。那些本领域内的普通技术人员都能够由此联想到其他的用于制备造血细胞凝块的方法。
在此所使用的“非聚合造血细胞凝块”是如前所详述过的造血细胞凝块，其中聚合体基质没有被结合到凝块中，或者用来作为凝块的构造物。大多数用于组织修复的药物转移装置使用聚合物基质作为构造物用于转移药物。聚合物基质由聚合物形成，如改良的或天然的多糖，如脱乙酰壳多糖，壳多糖，hyaluronan，粘多糖，硫酸软骨素，硫酸角质素，硫酸皮肤素，肝素，或硫酸肝素。聚合物可以是天然的，重组的或合成的蛋白质，例如可溶性胶原质或可溶性凝胶，或者是多聚氨基酸，如聚赖氨酸。聚合物也可以是聚乳酸，聚乙醇酸，合成的均聚和嵌段共聚物，包括：羧基的，氨基的，磺酸基的，磷的，有或没有附加官能团的次磷官能团，没有限制地，如羟基，硫醇，allcoxy，芳氧基，酰氧基，和芳酰基。另外，聚合物可包括orthoesters，酐，丙烯共延胡索酸酯，[propylene-co-fumarates]或有一个或更多α-羟基羧酸单体的聚合物，(如，α-羟基乙酸(羟基乙酸)和/或羟基丙酸(乳酸))。
聚合物可以最初溶解或悬浮于包括无机盐，如氯化钠，钾，钙，磷酸镁，硫酸盐，和羧酸盐的缓冲液中。聚合物也可以溶于或悬浮于包括有机盐，如甘油磷酸盐，果糖磷酸盐，葡萄糖磷酸盐，L-丝氨酸磷酸盐，腺苷磷酸盐，[glycerol-phosphate，fructosephosphate，glucose phosphate，L-Serine phosphate，adenosinephosphate]葡糖胺，氨基半乳糖，HEPES，PIPES和MES的缓冲液中。
优选的，物质被结合到非聚合造血细胞凝块中。在此所使用的“物质”是任何将对受试体有影响的组合物，包括诊断的影响。物质可以是，例如，细胞或任何其他活性剂，如，药或有能力表达肽的基因载体，小分子，等。物质是外源性的物质。也就是说，它是被加入造血细胞样品的，并且是在它取自它以前的环境(如，受试体，生物体外的环境，等)之前细胞样品中所没有的。物质的样品包括：基因传递载体(病毒的和非病毒的)，其他细胞，遗传工程的或天然的、重组的、可溶的或任何其他类型的蛋白质或者其他生物活性分子，如生长因子。
在此所使用的活性剂，是对生物学有机体有诊断的，预防疾病的，或治疗上效果的任何化合物。活性剂包括化合物，如蛋白质，缩氨酸，抗体，多聚糖，核酸(如，RNA，DNA，PNA，它们的复合体(如，三重的))，糖类，糖蛋白类，氨基酸，病毒，不同种类大分子的混合物(如，天然产品的提取物)和大分子混合体(如，蛋白质/核酸混合体，清蛋白缀合蛋白，含无机分子接头的药，有机分子，或它们的组合物)。
生物活性剂是对生物有机体具有预防疾病或治疗效果的任何化合物。在有些实施方案中，该生物活性剂可以是下面的任何物质：肾上腺素能药；肾上腺皮质类固醇；肾上腺皮质抑制剂；认知治疗剂，抗血小板，醛固酮拮抗剂；氨基酸；合成代谢的；复素药；止痛剂；麻醉剂；厌食剂；抗痤疮剂；抗肾上腺素能药；抗变应性剂；抗-Alzheimer′s，抗阿米巴药；补血药；抗心绞痛药；抗关节炎药；止喘药；抗动脉粥样硬化药；抗菌药；抗胆碱能药；抗凝血剂；抗痉挛药；抗抑郁剂；抗糖尿病药剂；抗利尿剂；止吐剂；抗癫痫药剂；抗溶解纤维蛋白的药物；抗真菌素；止血药；抗组胺剂；抗高血脂药；抗高血压药；抗低血压药；抗传染药；抗炎药；抗菌剂；抗偏头痛药；抗有丝分裂药；抗霉菌药，止恶心药，抗瘤剂，抗中性白细胞减少症，抗寄生虫药；抗增生药剂；安定药；治疗风湿药剂；康皮脂溢剂；抑制分泌药剂；止痉挛的药；抗血栓形成药；抗溃疡药；抗病毒药；抗焦虑药，抑制食欲药；血糖调节剂；骨吸收抑制剂；支气管扩张药；心血管疾病治疗剂；类乙酰胆碱药；COX1抑制剂，COX2抑制剂，直接凝血酶抑制剂，镇静剂；诊断辅助药剂；利尿剂；多巴胺能药；雌激素受体增效剂；溶解纤维蛋白药剂；荧光剂；游离氧基清除剂；肠胃蠕动效应剂；肾上腺皮质激素；GPIIbIIIa拮抗剂，毛发生长促进剂；止血剂；组胺H2受体增效剂；荷尔蒙；人类生长激素，胆固醇过少药；低血糖症药剂；促使血清脂质减少药剂；催眠药，降血压药；显像药剂；免疫学的药剂，如：免疫剂，免疫调节剂，免疫控制剂，免疫促进剂，免疫抑制剂；角质分离剂剂；LHRH增效剂；情绪调节剂；黏液溶解剂；散瞳剂；鼻解充血药；神经肌肉阻断剂；神经元保护剂；NMDA拮抗剂；荷尔蒙固醇衍生物；纤维蛋白酶原激活剂；血小板活性因子拮抗剂；血小板聚合抑制剂；质子泵抑制剂，神经药物；放射性药物；灭疥癣药；致硬化剂；镇静剂；镇静催眠剂；选择性腺苷A1拮抗剂；5-羟色胺拮抗剂；5-羟色胺抑制剂；5-羟色胺受体拮抗剂；抑制素，类固醇；甲状腺激素；甲状腺抑制剂；抑甲状腺腺药；镇定剂；肌萎缩性侧索硬化症药；脑缺血药剂；Paget′s症剂；不稳定心绞痛剂；血管缩小剂；血管扩张剂；伤口治疗剂；黄嘌呤氧化酶抑制剂。
一个优选的非聚合造血细胞凝块的用途是修复骨和组织的缺损。最可能连接软骨、骨和软组织修复的蛋白质，是β转移生长因子(TGF-β)超家族的组成部分包括TGF-βS1-3，各种各样的骨成型素蛋白(BMPs)，纤维原细胞生长因子，生长激素，和胰岛素类生长因子(IGFs)。
在体内服用重组蛋白以增强软骨的形成和软骨的修复以及骨和软组织的形成和修复，已经在不同的缺损模式下和实验动物中进行了研究。(Hunziker，2001；Nixon et al.，1999；Sellers etal.，1997)尽管得到有希望的结果，但是重组蛋白在临床上的应用还是受到这些分子较短的生物半寿期以及缺乏有效地维持和目标转移方式而受到阻碍。直接注射蛋白生长因子进入到组织损伤的位置，由于因子受到体内液体的稀释很快地产生代谢变化或是散布到其它组织中，已经导致令人失望的结果。这样，维持治疗的浓度要求非常高的负荷剂量或重复给药。这样就减小了修复的功效，同时增加了成本，复杂性和非目标器官受影响产生不必要的副作用的风险。在此所描述的非聚合造血细胞凝块克服了许多这些方面的问题，正如在下面的实验中所证实的。
凝块通常也被用于转移基因到受试体，或是到受试体的特殊的组织。在此所使用的“基因”，是长度大于三十个核苷酸的离体的核酸分子，更有代表性的是一百个核苷酸或更多。它一般会在适当的启动因子的控制之下，启动因子可以是诱导型的，阻遏型的，或组成型的。在置换或补充所期望的功能，或达到所需要的效果，如抑制瘤的生长，等方面有用的任何基因，都能够使用在此所述的凝块引导。启动因子可以是普通的启动因子，在多种哺乳动物细胞中表达，或细胞特异性的，或是细胞质相对的核特异性的。这些对于本领域内的那些普通技术人员来说都是众所周知的，并且能够运用通常的分子生物学实验方案来创设。
依照本发明的方法的任何类型的基因都是有用的。用于特殊情况下的特殊基因将取决于被治疗的情况和/或所希望的治疗结果。已经用于基因治疗的有代表性的基因范例表如表1所示。在本发明的一些实施方案中，列于表1中的任何一个基因或基因的组合到可以被结合到本发明的转移装置中。
基因转移提供了可以克服将蛋白质转移到受损组织的许多方法的局限性。本发明在此公开了一种通过应用基因转移载体，细胞和可溶性蛋白来医治受损组织的新颖的方法。通过将编码具有修复或治疗潜能蛋白质的cDNAs转移到受损或疾病部位的特异细胞，遗传修饰的细胞成为药物产生的局部因子，允许持续地合成特殊蛋白。
适合于这样的基因的合适的启动因子、强化因子、载体等，都已经公布在文献中。一般，有用的基因替换或补充功能，包括：基因编码缺乏酶，如腺苷脱氨酶(ADA)，已经用于治疗ADA缺乏和辅助因子如胰岛素的以及凝结因子VIII的临床试验中。影响调节的基因也能够单独或与基因补充或替换特殊功能相结合来给药。例如，编码抑制特殊的蛋白编码基因表达的蛋白的基因可以通过本发明所述的凝块给药。基因可以取自或源于不同的来源，包括文献参考，Genbank，或商业上的供应者。如果相对较小，它们可以使用固相合成法来合成，从保藏样品获得，如美国类型培养基American Type solid phase ROCKVILLE，MD保藏物，或者使用公开的序列信息重新分离制备。
除了基因之外，物质也可以是通过它们的长度和功能从基因中辨别出来的短的寡核苷酸如反义的，以及核糖核酸构成酶。和这些短的寡核苷酸不同的是，基因编码蛋白也因此优选的是最低长度大于100个碱基对，更优选的是数百个碱基对。
在此所使用的载体，是不被降解的转移基因到细胞中的媒介物，并且包括在其将被输送进入的细胞中产生基因表达的启动因子。
基因表达载体中的基因可以转染进入宿主细胞和细胞系，如在生物体外的原核的基因(如，E.coli)，或真核状态的基因(如，树突状细胞，B cells，CHO cells，COS cells，酵母基因表达系统和在昆虫细胞中的重组杆状病毒的基因表达)，这一点也已经经过验证。这些细胞因而可以被结合到凝块中。尤其有益的是哺乳动物细胞中，如人，鼠，仓鼠，猪，山羊，灵长类动物，等。它们可以是广泛的多样性的组织，并且包括初生细胞和细胞系。特殊样品包括角化细胞，外周血白细胞，骨髓干细胞和胚胎干细胞。基因表达载体要求相关的基因序列可操作的连接到受试体。
在一些实施方案中，用于转移基因的病毒载体选自包括腺病毒，腺病毒相关病毒，痘病毒包括牛痘病毒和弱化的痘病毒，泽姆利基森林病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，逆转录酶病毒，仙台病毒，和Ty-病毒样颗粒的组群。已经用于转移外源性核酸的病毒和病毒样颗粒的样品包括：复制缺陷型病毒(如，Xiang et al.，滤过性微生物学219：220-227，1996；Eloit et al.，J.VirolL.7：5375-5381，1997；Chengalvala et al.，疫苗15：335-339，1997)，改良的逆转录酶病毒(Townsend et al.，J.VirolL.71：3365-3374，1997)，非复制逆转录酶病毒(Irwin et AL.，J.VirolL.68：5036-5044，1994)，复制缺陷型泽姆利基森林病毒(Zhao etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3009-3013，1995)，金丝雀痘病毒和极度弱化的牛痘病毒的衍生物(Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11349-11353，1996)，非复制牛痘病毒(Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11341-11348，1996)，复制牛痘病毒(Moss，Dev.Biol.Stand，82：55-63，1994)，委内瑞拉马脑炎病毒(Davis et AL.，J.Virol.70：3781-3787，1996)，仙台病毒(Pugachev et al.，滤过性微生物学212：587-594，1995)和Ty-病毒样颗粒(Allsopp et al.，Eur.J.Immumol 26：1951-1959，1996)。在优选的实施方案中，该病毒载体是腺病毒或α-病毒。
另一个优选的用于确定的应用的病毒是腺病毒相关病毒，双链DNA病毒。腺病毒相关病毒能够感染广泛范围的细胞类型和物种，并且可以被改变为复制缺乏型。它还有进一步的优势，如耐热性和脂溶稳定性，在包括造血细胞的不同的细胞谱系中的高转导作用频率，以及缺乏重复感染抑制从而允许多重系列的转导作用。腺病毒相关病毒可以以部位特异性方式结合到人类细胞的DNA中，由此最小化插入突变作用的可能性以及插入基因表达的可变性。另外，野生型腺病毒相关病毒感染已经在缺乏选择压力的情况下在组织培养中观察超过100代，这意味着腺病毒相关病毒基因组整合作用是相对稳定的事件。腺病毒相关病毒也可以以染色体外的形式发挥作用。
一般而言，其他优选的滤过性毒菌都基于非致细胞病的真核病毒，其中非必需基因已经被有价值的基因所替代。非致细胞病的病毒包括逆转录酶病毒，它的生命周期包括逆向转录基因组的滤过性毒菌的RNA以随附的前病毒的整合作用进入到宿主细胞的DNA中的方式进入到DNA中。腺病毒和逆转录酶病毒已经被认可用于人类基因治疗的试验。一般而言，逆转录酶病毒都是复制缺乏型的(如，能够直接合成所需要的蛋白质，但是不能制造感染性颗粒)。这样在遗传学上改变反转录的基因表达载体对于在活的有机生物体内的高效率的基因转导作用有综合的效用。用于生产复制缺乏型的逆转录酶病毒的标准的试验设计(包括的步骤有：外源性的遗传物质结合进入质粒，用质粒转染包装的细胞系，通过包装细胞系制造重组的逆转录酶病毒，从组织培养培养基采集滤过性毒菌颗粒，然后用滤过性毒菌颗粒感染靶细胞)在Kriegler.M的《基因转移和基因表达，实验室手册》，W.H.Freeman公司，纽约(1990)，和Murry，E.J.Ed.的《分子生物学方法》第7卷Humana出版有限公司，克利夫顿，新泽西(1991)。
优选的前述核酸转移载体：(1)包括在哺乳动物的细胞中可以转录和翻译的外源性的基因物质，以及(2)可任选的包括在表面上的选择性地结合到如哺乳动物细胞的靶细胞的表面上的受体的配合体，并由此获得进入靶细胞的入口。
不同的技术可被用于引导本发明的核酸进入细胞，依靠的不管是核酸在生物体外被引导，还是在宿主的活的生物体内被引导。这样的技术包括核酸CaPO4沉淀物的转染，DEAE关联性核酸的转染，用前述的包括所关注的核酸的病毒来转染或感染，脂质体作为引起媒介的转染，等等。对于确定的用途，可以优选地将核酸靶中具体细胞，尤其是如果在凝块被植入或给药到离靶细胞较远的位置。在这样的实例中，用来转移本发明的核酸进入到细胞中(如，逆转录酶病毒，或其他病毒；脂质体)的载体在从凝块释放以后，可以将靶分子附于细胞上。例如，分子，如在靶细胞或用来作为在靶细胞上的受体配合体上的，与表面膜蛋白相区别的抗体，可以约束或结合到核酸转移载体内。在脂质体用于转移基因的情况中，与细胞内吞作用有关的表面膜蛋白的结合的蛋白质可掺入到脂质体的组成中，用于定向和/或促进摄取。这样的蛋白质包括衣壳蛋白或其向性的于特殊的细胞类型的碎片，用于在循环中经历细胞内化作用的蛋白的抗体，导向细胞内局部化作用以及增强细胞内半寿期的蛋白质，等等。该物质可以以任何状态存在，如溶液，固体，载体，气体或任何其他能够使该物质与造血细胞混合以形成凝块的状态。
对于直接的基因转移，采集到的血液或骨髓可被加入到包括基因转移载体(病毒的，或非病毒)或蛋白质的溶液中，该溶液存在于适当的成型尺寸和成型形状的器皿或者任何其他能够允许细胞样品与物质混合的器皿中。该混合物可以用吸液管滴定或者任何其他能够将该物质与细胞样品混合的装置或方法得到。
对于在活的有机体外的基因转移方法，造血细胞，如，血液或骨髓抽吸物可以与含有或不含有附加的载体的天然的或遗传修饰的细胞的悬浮液混合。该细胞然后被结合到凝块中接着又被送回到生物体内。
本发明也包括产品。该产品是物质转移系统。在此所使用的“物质转移系统”是包括物质的非聚合造血细胞凝块，这样，非聚合造血细胞凝块可转移物质到受试体。
在给药的时候，该组合物(包括物质的非聚合造血细胞凝块)可以以制药上可接受的制剂的形式给药。这样的制剂可以常规地包括制药上可接受的盐的浓缩物，缓冲剂，防腐剂，适合的载体和任意其他非结合性治疗剂。
组合物可以通过任何常规的途径给药，包括注射或多次逐步地输注。给药方式可以是，如，直接注射或植入的，口服的，静脉的，腹膜内的，肌肉的，腔内的，肺内的，黏膜的(如，直肠的，阴道的，眼睛的，皮肤的，鼻内的，等)，皮下的，气雾剂，或经皮的。给药可以是全身的或局部的。
本发明的组合物以有效量给药。“有效量”是指单独，或更多的剂量一起，引起所期望的反应的组合物的量。所期望的反应，当然取决于被治疗的特殊状况以及细胞或在凝块内被给药的活性剂的类型。这些因素对于本领域内的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以仅仅通过常规的实验来处理。通常优选的是，在此使用单独的成分或其化合物的最大的剂量，也就是，依照可靠的医学判断的最大的安全剂量。本领域内的普通技术人员将会明白，无论如何，患者可能因为医学上的原因、心理上的原因、或实际上任何其他原因，而坚持较低的剂量或者的可以容忍的剂量。在前述的方法中使用的该组合物优选的是无菌的，并且包括用于在重量和体积适当的单元内通过给药到患者以产生所期望的反应的有效量的物质。
在给药时，本发明的制药上的制剂以制药上可接受的量和制药上可接受的组合物的形式应用。术语“制药上可接受的”的意思是指无毒性，不会干扰活性成分的生物学行为的效力。这样的制剂可以常规地包括：盐，缓冲剂，防腐剂，适合的载体，以及任意其它治疗剂。在药中使用的时候，该盐应该是制药上可接受的，但是非制药上可接受的盐也可以方便地用于制备其制药上可接受的盐，并且不会被排斥在本发明的范围之外。这样的药学上或制药上可接受的盐包括，但是不仅仅限于，通过下面的酸所制备的盐：氯化氢的，溴化氢的，含硫的，含氮的，含磷的，马来酸的，乙酸的，水扬酸的，柠檬酸的，甲酸的，丙二酸的，丁二酸的，等等。同样，制药上可接受的盐也可以制备成碱金属的或碱土盐，如钠，钾或钙盐。
实例
在生物体外：
实例1：血或骨髓凝块的负荷能力
为了确定可以被加入到人血中而不会破坏凝结过程的液体的最大的量，200μl的血和渐增量的PBS混合。在加入的PBS的量差不多有血量的两倍的时候，凝结状态仍然存在。如表2所示的是，这一发现与有相同数量的能够被胶原质粘多糖基质(胶原质gag基质)吸收的液体量的比较。在吸收液体方面，凝块和胶原质gag基质之间液体的吸收没有重大的区别。
为了确定人类的血凝块是否能够并入细胞，培养兔骨髓细胞的单细胞层，然后用携带着编码有绿色荧光蛋白(GFP)的基因的腺病毒载体感染。在24小时以后，大约600,000个荧光细胞被胰蛋白酶化并且通过离心过滤作用分离出来。细胞颗粒状物各自重悬浮于450μl的人类血液中。这些血和细胞的构成物随后在微离心管中凝结。1小时以后采集凝块，浸入1ml的PBS中并且在HAM的F12培养基中培养24小时，每样都在12个井盘中。
人血凝块在凝结24小时以后，显现了的高密度的绿色荧光兔骨髓细胞，正如图3所表示的。分析凝结以后在Eppendorf管中的残存液显示没有残留的绿色细胞，说明所有的转导兔骨髓细胞都已经被保留在人血凝块中。
实例2：凝块的形成
实验室使用不同的器皿来完成凝结，确定了凝块可以成形为广泛的多样性的形状和大小。凝块因而可以足够稳定的产生保留，以被植入任何大小和形状的缺损中，其实例如图4所示。
实例3：带有遗传改良细胞的血凝块和骨髓凝块的播种(以模拟 生物体外基因转移途径)
为了模拟生物体外的基因转移途径，4组兔血凝块进行了生物体外实验：
1.仅450μl的兔血
2.450μl的兔血与含400,000个兔骨髓细胞的悬浊液混合
3.450μl的兔血与含400,000个用表达GFP的重组腺病毒基因修饰过的兔骨髓细胞的悬浊液混合
4.450μl的兔血与含400,000个用表达TGF-β的重组腺病毒基因修饰过的兔骨髓细胞的悬浊液混合
每一组实验重复4次。凝块通过荧光微显微镜法在第1，3，7，14，和21天进行检测。通过运用酶联免疫吸附测定来测量培养基中TGF-β的量来确定凝块中TGF-β的表达，凝块和转导以表达TGF-β的细胞一起种的。
凝块内的荧光细胞在生物体外接受至少21天的观测。图5a显示细胞在第1天的状况，图5b显示的是细胞在21天后的状况。同样TGF-β基因表达也至少观测21天，其在第7天达到最大，结果如图6所示。
实例4：在血凝块和骨髓凝块中的细胞直接转导作用(以模拟直 接的基因转移方法)
为了确定血凝块或骨髓凝块中的细胞是否可以支持转基因表达，将血和骨髓与腺病毒的载体、Ad TGF-β以及Ad GFP混合。
1.仅450μl的兔血
2.450μl的兔血和10μl的Ad GFP
3.450μl的兔血和10μl的Ad TGF-β
4.仅450μl的兔骨髓抽吸物
5.450μl的兔骨髓抽吸物和10μl的Ad GFP
6.450μl的兔骨髓抽吸物和10μl的Ad TGF-β
每一组实验重复4次。凝块以如前所述的方法形成并且用微显微镜法在第1，3，7，14，和21天进行检测。在相同的时间点完成对经过调节的培养基的酶联免疫吸附测定，以检测TGF-β基因表达。
观测在血凝块和骨髓凝块中的GFP基因表达直到第14天，其结果如图7所示。
观测骨髓凝块中的TGF-β产物直到第7天连，其在第3天达到最大，然后在第14天减小到背景水平。
相反，在被Ad TGF-β感染的血凝块中没有可检测到水平的TGF-β基因表达。在培养基中没有分泌的TGF-β可能是由于生长因子在凝块中被捕捉，或者是由于其他的载体的差异。
量化在血凝块中采集到的这些转基因产物残留在的进一步的实验，通过相同的程序来完成，其结果如图8所示。
1.兔血(450μl)
2.兔骨髓(450μl)
3.兔血(450μl)和Ad TGF-β(10μl)
4.兔骨髓(450μl)和TGF-β(10μl)
在培养的第2天，采集凝块，在PBS中冲洗，用机械的方式分解，然后在HAM的F12培养基中培养。在第3，7，14，21天化验TGF-β的水平。
血和骨髓凝块中TGF-β的水平在基因转移后的第3天达到高值，但是在第7天下落到非常低的水平。然而，骨髓凝块与血凝块相比较，表达出六倍高的TGF-β全部的基因表达，很可能是由于其更高的细胞结构。同样，与血相比较，骨髓的使用对于在直接基因转移之后的转基因产物的基因表达似乎更有效。
实例5：在血凝块和骨髓凝块中的腺病毒的稳定性
执行进一步的研究，以确定有传染性的病毒载体是否能够被保留在凝块中并维持转导作用，其结果如图9所示。
血凝块和骨髓凝块被Ad GFP感染并培养，正如前面所述的。凝块在不同的时间点被机械地分解并且经历离心作用以除去细胞残片。采集上层清液并用于感染293细胞的单分子层培养物。在24小时候分析细胞的荧光性。
荧光细胞确实出现在被上层清液感染的培养液中，该上层清液取自被破碎的凝块的第1，3，和7天的样品。
这一结果表明了从凝块中采集到的病毒载体，Ad GFP，能够在培养液中保留其传染性至少7天。
在活的生物体内：
实例6：使用自体的血凝块和骨髓凝块直接转移基因到兔膝部的 受损软骨
为了达到这样的目的，腺病毒基因转移载体与由新西兰白兔获得的血或骨髓抽吸物混合并凝结，该腺病毒基因转移载体上的基因用荧光素酶、GFP、和/或Lac Z编码过。在凝结(大约30分钟)之后，血或骨髓载体结构被植入到在同一兔子的股骨踝通过外科手术形成的骨软骨缺损处。植入后，缝合关节囊并使动物苏醒。在第3天后，杀死兔子并且从受损部位采集凝块。通过定量的分析，测定在凝块中的荧光酶的活性。通过定性的分析，在显微镜下对荧光细胞进行观察。对邻近的滑膜同样进行转基因表达的检测。
如图10所示，在采集到的被混合了AD荧光酶的血凝块和骨髓凝块中观测到高水平的荧光酶转基因表达。同样，在采集到的被Ad GFP感染的凝块中观测到大量的荧光细胞。在直接靠近缺损部位的滑液的内层也观测到了少量绿色细胞。然而，在滑膜的其他区域未发现基因表达。这些结果与直接基因转移包括Ad GFP的胶原质GAG基质到骨软骨缺损之后观测到的较高的绿色荧光滑液内层形成了对照。这样，血和骨髓凝块在植入到活的生物体内时，提供更多的包括局部化的转基因表达。
实例7：使用兔血凝块和骨髓凝块对于软骨生成或骨生成的潜能
本试验研究在血和骨髓凝块中的内源性前体细胞对于改变表型以及在血凝块和骨髓凝块中进行成软骨或成骨分化的能力。为了达到这一目的，从新西兰白兔采集用于总共6组试验的血和骨髓：
1.兔血(450μl)(1个凝块)
2.兔血(450μl)和Ad GFP(10μl)(3个凝块)
3.兔血(450μl)和Ad TGF-β(10μl)(4个凝块)
4.兔骨髓(450μl)(1个凝块)
5.兔骨髓(450μl)和Ad GFP(10μl)(5个凝块)
6.兔骨髓(450μl)和Ad TGF-β(10μl)(3个凝块)
凝块在HAM的F12培养基中培养6周。采集后混合，装填石蜡，切片并检查组织结构。切片用苏木精曙红和Gomori三色试剂盒(蓝色胶原质着色)染色。切片通过三个不同的个体以未知的方式被检查。
在未被生长因子基因修饰过的骨髓凝块中(仅仅是骨髓并且是与Ad GFP混合的骨髓)，内源性细胞的多能性是显而易见的。肌肉类、脂肪类和纤维组织区域在6周后发现了所有这些凝块，如图11所示。富含Ad TGF-β的骨髓凝块说明了更多的同质分化，没有观察到肌肉类组织。代之以，更多的纤维组织被观察到，如图12所示。
在血凝块中的细胞分化并不明显。然而，载体的不同的浓缩物和化合物可能导致分化。这些结果暗示在骨髓凝块中的细胞是多潜能的，具有区分许多组织类型的能力。
因为腺病毒载体是研究基因产物过度表达影响的强有力的工具，所以它们成为在此所描述的实验的载体的选择。然而，据预测，其它的基因转移载体，如，腺病毒相关型病毒(AAV)和逆转录酶的载体可能比源自腺病毒的载体有更加广阔的临床应用前景。
实例8：Ad TGF-β改良的用于修补的软骨组织的骨髓凝块的用 途
本试验研究在修补的软骨组织中的骨髓凝块的用途。在兔膝关节钻一个3毫米宽和8毫米深的孔，穿过软骨并且进入到骨和骨髓，由此造成骨软骨缺损。对照缺损或者维持未治疗状态(未使用的缺损)或者接受未被改良过的骨髓凝块。将预先已经用包括转移生长因子beta-1(TGF-β)基因的腺病毒感染的骨髓凝块植入到保留的骨软骨缺损中。
在手术六周后取样品作载玻片并且用苏木精曙红(H&E)和甲苯胺蓝染色。H&E是普通的酸碱组织染料；甲苯胺蓝作为粘多糖(GAGs)指示剂。
在维持未治疗状态的对照缺损中，形成了与傍侧软骨不相似的纤维性修复。通过植入改良的骨髓凝块而被处理过的其他的对照缺损仅仅显示在骨的表面，并且没有GAGs。
用预先感染的包括TGF-β的骨髓凝块处理过的缺损，有成软骨的出现，显示了强壮的细胞外基质。在多数修复中，修复基质用深蓝色染色，标示GAGs的存在。在修复基质之内的细胞在形态学上类似软骨细胞，但是却成群地出现。在软骨修复组织下面是粗壮的骨形成物。同样，软骨层和旁侧组织大约位于相同的深度。这些结果显示，虽然该修复组织不是完美的，利用这种方法基因转移，在凝结的骨髓抽吸物内的细胞生物朝着积极的方式被改变。

Claims (104)

1.一种用于转移物质到受试体的方法，该方法包括：
给受试体服用包含物质的非聚合造血细胞凝块以转移所述物质到该受试体。
2.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块包括骨髓细胞。
3.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块包括血细胞。
4.依照权利要求1的方法，其中，物质包括基因转移载体。
5.依照权利要求1的方法，其中，物质包括其他细胞。
6.依照权利要求5的方法，其中，其他细胞包括基因工程细胞。
7.依照权利要求5的方法，其中，其他细胞包括原初细胞。
8.依照权利要求1的方法，其中，物质包括蛋白质。
9.依照权利要求1的方法，其中，物质包括重组蛋白。
10.依照权利要求1的方法，其中，物质包括可溶性蛋白。
11.依照权利要求1的方法，其中，物质包括生物活性分子。
12.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移进入骨中。
13.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移到软组织中。
14.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移到至少是软骨、韧带、腱、半月板和无脊椎动物盘之一中。
15.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块的形状和尺寸通过模子来确定。
16.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块上均匀分布着物质。
17.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是基因修饰的以表达至少一种生长因子以及其它促进组织修复的基因产物。
18.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块的体积由将被修复的组织的大小确定。
19.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是从受试体采集的。
20.依照权利要求2的方法，其中，骨髓细胞是从髂骨嵴获得的。
21.依照权利要求2的方法，其中，骨髓细胞是从暴露在骨髓下层的骨软骨缺陷处获得。
22.依照权利要求1的方法，其中，物质以溶液的形式存在。
23.依照权利要求1的方法，其中，包含物质的非聚合造血细胞凝块是通过滴定法测定的。
24.依照权利要求23的方法，其中，滴定是使用吸液管来完成的。
25.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块与至少是原初细胞和基因修饰细胞之一的悬浮液混合后，形成细胞悬浮液。
26.依照权利要求25的方法，其中，细胞悬浮液包含至少一种基因载体。
27.依照权利要求25的方法，其中，细胞悬浮液中不包含其他的基因载体。
28.依照权利要求1的方法，其中，转移过程是缓慢，局部的从非聚合造血细胞凝块释放物质。
29.依照权利要求1的方法，其中，该非聚合造血细胞凝块以一种允许有效地转移物质的方式成形。
30.依照权利要求1的方法，进一步包括在物质转移区域的再生组织。
31.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块由凝结15-30分钟的造血细胞样品产生的。
32.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是由可以在室温下凝结的造血细胞样品产生的。
33.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是由放置在容器中凝结的造血细胞样品产生的。
34.依照权利要求33的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是从该容器中获得的。
35.依照权利要求1的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是由在磷酸盐缓冲液中清洗过的造血细胞样品产生的。
36.依照权利要求1的方法，其中，将任何没有结合的物质从非聚合造血细胞凝块除去。
37.一种制备非聚合造血细胞凝块物质转移系统的方法，该方法包括：
向造血细胞样品中添加物质，以及
使造包含物质的血细胞样品形成非聚合造血细胞凝块。
38.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被植入受试体中。
39.依照权利要求37的方法，其中，物质被转移到该受试体。
40.依照权利要求39的方法，其中，该转移过程是缓慢，局部的从非聚合造血细胞凝块释放该物质。
41.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块以一种允许有效地转移该物质的方式成形。
42.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块转移系统被用于使组织再生。
43.依照权利要求37的方法，其中，该造血细胞样品是从受试体上采集的。
44.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是在容器中形成的。
45.依照权利要求44的方法，进一步包括从容器中获取非聚合造血细胞凝块。
46.依照权利要求37的方法，进一步包括冲洗该非聚合造血细胞凝块。
47.依照权利要求46的方法，其中，任何没有结合的物质通过清洗而除去。
48.依照权利要求46的方法，其中，非聚合造血细胞凝块是在磷酸盐缓冲液中被冲洗的。
49.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块凝结15-30分钟。
50.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块在室温下凝结。
51.依照权利要求37的方法，其中，造血细胞包括骨髓细胞。
52.依照权利要求37的方法，其中，造血细胞包括血细胞。
53.依照权利要求37的方法，其中，物质包括基因转移载体。
54.依照权利要求37的方法，其中，物质包括其他细胞。
55.依照权利要求54的方法，其中，其他细胞包括基因工程细胞。
56.依照权利要求54的方法，其中，其他细胞包括原初细胞。
57.依照权利要求37的方法，其中，物质包括蛋白质。
58.依照权利要求37的方法，其中，物质包括重组蛋白。
59.依照权利要求37的方法，其中，物质包括可溶性蛋白。
60.依照权利要求37的方法，其中，物质包括生物活性分子。
61.依照权利要求38的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移到骨中。
62.依照权利要求38的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移到软组织中。
63.依照权利要求38的方法，其中，非聚合造血细胞凝块被转移到至少是软骨、韧带、腱、半月板和无脊椎动物盘之一中。
64.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块的形状和尺寸通过模子来确定。
65.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块上均匀分布着物质。
66.依照权利要求37的方法，其中，造血细胞经过基因修饰以表达生长因子和其它利于组织修复的基因产物中至少一项。
67.依照权利要求37的方法，其中，非聚合造血细胞凝块的体积由将被修复的组织的大小确定。
68.依照权利要求51的方法，其中，骨髓细胞由髂骨嵴获得。
69.依照权利要求51的方法，其中，骨髓细胞由暴露在骨髓下层的骨软骨缺陷获得。
70.依照权利要求37的方法，其中，物质以溶液的形式存在。
71.依照权利要求37的方法，其中，包含物质的非聚合造血细胞凝块是经滴定测定的。
72.依照权利要求71的方法，其中，滴定是使用吸液管来完成的。
73.依照权利要求37的方法，其中，造血细胞和至少是原初细胞和基因修饰细胞之一的悬浮液混合后，形成细胞悬浮液。
74.依照权利要求73的方法，其中，细胞悬浮液包括至少一种基因载体。
75.依照权利要求73的方法，其中，细胞悬浮液中不包括其他的基因载体。
76.一种物质转移系统，包括：
有物质结合在其中的非聚合造血细胞凝块。
77.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块以允许有效地转移该物质的方式成形。
78.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块包括骨髓细胞。
79.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块包括血细胞。
80.依照权利要求76的物质转移系统，其中，物质包括基因转移载体。
81.依照权利要求76的物质转移系统，其中，物质包括其他细胞。
82.依照权利要求81的物质转移系统，其中，其他细胞包括基因工程细胞。
83.依照权利要求81的物质转移系统，其中，其他细胞包括原初细胞。
84.依照权利要求81的物质转移系统，其中，物质包括蛋白质。
85.依照权利要求81的物质转移系统，其中，物质包括重组蛋白。
86.依照权利要求76的物质转移系统，其中，物质包括可溶性蛋白。
87.依照权利要求76的物质转移系统，其中，物质包括生物活性分子。
88.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块被配制以转移到骨中。
89.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块被配制以转移到软组织中。
90.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块被配制以转移到至少是软骨、韧带、腱、半月板和无脊椎动物盘之一中。
91.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块的形状和尺寸通过模子来确定。
92.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块上均匀分布着物质。
93.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是经过基因修饰以表达至少是生长因子和其它利于组织修复的基因产物之一。
94.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块的体积由将被修复的组织的大小确定。
95.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是在分离的造血细胞样品中制备。
96.依照权利要求78的物质转移系统，其中，骨髓细胞是从髂骨嵴的骨髓细胞中分离出来的。
97.依照权利要求78的物质转移系统，其中，骨髓细胞是从暴露在骨髓下层的骨软骨缺陷分离出来的。
98.依照权利要求76的物质转移系统，其中，物质至少是原初细胞和基因修饰细胞之一。
99.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是通过造血细胞样品凝结15-30分钟的方法来制备的。
100.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是通过造血细胞样品在室温下凝结的方法来制备的。
101.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是通过造血细胞样品在一个容器中凝结的方法来制备的。
102.依照权利要求101的物质转移系统，进一步包括从该容器中获取非聚合造血细胞凝块。
103.依照权利要求76的物质转移系统，其中，非聚合造血细胞凝块是通过在磷酸盐缓冲液中清洗非聚合造血细胞凝块的方法来制备的。
104.依照权利要求76的物质转移系统，其中，该非聚合造血细胞凝块是通过从该非聚合造血细胞凝块中除去任何没有结合的物质的方法来制备的。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
DE102005040429A1 (de) * 2005-08-25 2007-03-01 Heraeus Kulzer Gmbh Wirkstofffreisetzungssystem und seine Verwendung
US8576846B2 (en) 2005-10-05 2013-11-05 Qualcomm Incorporated Peer-to-peer communication in ad hoc wireless network
US8708944B2 (en) * 2009-02-26 2014-04-29 Javin C. Pierce System for harvesting and dispensing a fibrin clot
US20100228175A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-09 Pierce Javin C System for harvesting and dispensing blood clot
US8679076B2 (en) * 2009-02-26 2014-03-25 Javin C. Pierce Method and apparatus for harvesting and dispensing a fibrin clot
US8177738B2 (en) * 2009-07-28 2012-05-15 Arthrex, Inc. Bone void filling tube and shear mechanism

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4902288A (en) * 1985-12-03 1990-02-20 Marylou Ingram Implantable immunotherapy system using stimulated cells
US6311690B1 (en) * 1986-03-27 2001-11-06 Gensci Orthobiologics, Inc. Bone repair material and delayed drug delivery system
US6048729A (en) * 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US5487897A (en) * 1989-07-24 1996-01-30 Atrix Laboratories, Inc. Biodegradable implant precursor
US5171579A (en) * 1991-10-11 1992-12-15 Genetics Institute, Inc. Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins
US5763416A (en) * 1994-02-18 1998-06-09 The Regent Of The University Of Michigan Gene transfer into bone cells and tissues
DE69739540D1 (de) * 1996-04-19 2009-10-01 Osiris Therapeutics Inc Die wiederherstellung und verstärkung von knochen mittels mesenchymalen stammzellen
US5945457A (en) * 1997-10-01 1999-08-31 A.V. Topchiev Institute Of Petrochemical Synthesis, Russian Academy Of Science Process for preparing biologically compatible polymers and their use in medical devices
US6723131B2 (en) * 2001-02-28 2004-04-20 The Cleveland Clinic Foundation Composite bone marrow graft material with method and kit
US6552172B2 (en) * 2001-08-30 2003-04-22 Habto Biotech, Inc. Fibrin nanoparticles and uses thereof

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