KR20050009731A - 활성제를 전달하기 위한 비중합성 조혈 세포 응괴 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 성분을 전달하기 위한 방법 및 장치를 포함한다. 성분의 전달은 대상에게 성분이 혼입된 비중합성 조혈 세포 응괴를 투여하는 것을 포함한다. 비중합성 조혈 세포 응괴는 성분의 전달 비히클로서 기능한다.
Description
연골, 뼈, 척추 디스크 및 연조직 병변을 생물학적 인자 및 세포로 치료하는 것운 결함 회복을 증진시키기 위한 새로운 접근법이다. 조직 재성장을 촉진하기 위해 재조합 단백질 및 단백질 성장 인자를 투여한 결과는, 치료적 농도를 유지하기 위해서는 매우 높은 부하 용량 또는 반복적인 투여가 필요하기 때문에 치료 효율은 감소하는 반면, 비용, 복잡성, 및 비표적 장기가 노출됨으로 인한 원치않는 부작용 발생 위험은 증가하기 때문에 실망스러웠다.
재조합 단백질의 조직 회복에의 적용을 촉진시키기 위해 설계된 하나의 접근법은, 재조합 단백질을 결함 조직 내에 이식하기 위한 생체적합성 매트릭스 또는 완속 방출 기구에 혼입하여, 단백질을 손상 부위에 국소화시키고 유출 세포가 콜로니화되도록 3차원 구조를 제공하는 것이다. 근골격 조직의 회복에 대해 평가되었던 매트릭스는 다양한 합성 및 천연 중합체를 포함한다. 이러한 시스템은 또한, 매트릭스에 부하된 단백질이 그 양에 있어서 생산에 너무 많은 비용을 들 수도 있고 좀처럼 장기적이면서 균일하게 방출되지 않는 반면, 새로 형성되는 회복 조직이 이식된 이물질의 존재에 의해 악영향을 받을 수 있는 한계점이 있다. 유전자 전달은 손상된 조직에 단백질을 전달하는데 있어서의 다수의 한계점들을 극복할 수 있는 접근법을 제공한다. (Bonadio et al., 1999; Evans and Robbins, 1995; Evans et al., 1995; Kang et al., 1997; Smith et al., 2000)
본 발명은 활성제 전달, 더욱 특히 활성제의 전달을 돕기 위한 비중합성 조혈 세포 응괴에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 활성 성분, 예를 들어 손상된 조직을 치유하기 위한 유전자 전달 비히클, 세포 및 가용성 단백질을 적용하기 위한 신규 시스템에 관한 것이다. 비중합성 조혈 세포 응괴 (clot)를 사용하면 성분을 대상자에게 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 비중합성 조혈 세포 응괴는 성분을 대상자에게 전달하는 전달 비히클로서 기능한다.
한 면에 따르면, 본 발명은 성분을 대상자에게 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴를 대상자에게 투여하여 성분을 대상자에게 전달하는 것을 포함한다.
다른 면에 따르면, 본 발명은 비중합성 조혈 세포 응괴 성분 전달 시스템의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 성분을 조혈 세포 표본에 첨가하고, 성분을 포함하는 조혈 세포 표본이 비중합성 조혈 세포 응괴를 형성하도록 하는 것을 포함한다.
또 다른 면에 따르면, 본 발명은 성분이 혼입된 비중합성 조혈 세포 응괴를포함하는 성분 전달 시스템에 관한 것이다.
비중합성 조혈 세포 응괴는 골수 세포, 혈액 세포, 또는 응괴를 형성할 수 있는 기타 임의 형태의 세포를 포함할 수 있다. 성분은 유전자 전달 비히클, 추가의 세포, 예를 들어 유전공학적으로 처리된 세포 또는 천연 세포, 단백질, 예를 들어 재조합 또는 가용성 단백질, 생활성 분자, 또는 대상자에게 영향을 미칠 수 있는 기타 임의 형태의 성분을 포함할 수 있다.
비중합성 조혈 세포 응괴는 아마 임의 형태의 조직으로 전달될 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 조직은 뼈, 연조직, 연골, 인대, 힘줄, 반월 및 추간판 (invertebral disks), 또는 신체의 기타 임의 부위이다.
일부 실시태양에서 비중합성 조혈 세포 응괴의 형상 및 크기는 용기에 의해 결정될 수 있다. 비중합성 조혈 세포 응괴는 성분과 균질화될 수 있다. 기타 실시태양에서, 비중합성 조혈 세포 응괴는 하나 이상의 성장 인자 및 조직 회복을 촉진하는 기타 유전자 생성물을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
기타 실시태양에서, 비중합성 조혈 세포 응괴는 회복될 조직의 크기에 의해 결정되는 부피를 가질 수 있다.
또 다른 기타 실시태양에서, 비중합성 조혈 세포 응괴는 대상자로부터 수집될 수 있다. 뼈 괴세포 (mass cell)는 기타 실시태양에서는 장골릉, 하부 골수를 노출시키는 골연골 결함 부위, 또는 골수 세포가 수집될 수 있는 대상자의 기타 임의 영역으로부터 수집될 수 있다.
기질은 임의로 용액 형태일 수 있다.
성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴는 역가측정 (titration)될 수 있다. 역가측정은 피펫을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시태양에서, 비중합성 조혈 세포 응괴는 하나 이상의 천연 및 유전적으로 변형된 세포의 현탁액과 혼합되어 세포 현탁액을 형성한다. 세포 현탁액은 추가의 유전자 벡터를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
기타 실시태양에서, 전달은 비중합성 조혈 세포 응괴로부터 성분이 천천히, 국소적으로 방출되어 이루어질 수 있다. 비중합성 조혈 세포 응괴는 성분을 효과적으로 전달하는 방식으로 형상화될 수 있다. 성분 전달 시스템은 성분 전달 영역 내의 조직을 재생시킬 수 있다.
일부 실시태양에서 비중합성 조혈 세포 응괴는, 실온에서 또는 용기에 넣었을 때 15-30분 동안 응고되는 조혈 세포 표본으로부터 제조될 수 있다. 그 후, 비중합성 조혈 세포 응괴는 용기로부터 수확될 수 있다.
비중합성 조혈 세포 응괴는 또한, 인산염 완충 식염수 중에서 세척된 조혈 세포 표본으로부터 제조될 수 있다. 임의의 미결합 성분은 비중합성 조혈 세포 응괴로부터 제거될 수 있다.
기타 실시태양에 따르면, 비중합성 조혈 세포 응괴는 대상자에게 이식될 수 있다. 성분은 대상자에게 전달될 수 있다. 전달은 비중합성 조혈 세포 응괴로부터 성분이 천천히, 국소적으로 방출되어 이루어질 수 있다. 임의로, 비중합성 조혈 세포 응괴 전달 시스템은 조직을 재생하는데 사용될 수 있다.
조혈 세포의 표본은 대상자로부터 수집되거나, 다른 조혈 세포원으로부터 수득할 수 있다. 대상자는 이후에 응괴를 이식할 대상자와 동일하거나 다를 수 있다.
도면의 간단한 설명
이제 참조 도면과 관련하여 본 발명의 다양한 실시태양을 기술할 것이며, 여기서
도 1은 유전자 치료에 사용되어 온 유전자의 예시적인 목록이고;
도 2는 인간 혈액 응괴 및 콜라겐-글리코스아미노글리칸-매트릭스의 부하능 (loading capacity)의 그래프이고;
도 3은 사전 감염된 토끼 골수 세포와의 응고 24시간 후 인간 혈액 응괴의 사진이고;
도 4는 두께 2 mm, 직경 30 mm의 인간 혈액 응괴 (조직 배양 웰에서 형성됨)의 사진이고;
도 5는 1일째 (도 5a) 및 21일째 (도 5b)에 응괴 내의 GFP 양성 세포의 사진이고;
도 6은 Ad TGF-β 감염된 토끼 골수 세포를 포함하는 토끼 혈액 응괴에 의한 TGF-β의 생산 그래프이고;
도 7은 주위 배지로의 TGF-β 발현 그래프 (여기서, "BL"은 혈액을 나타내고 "BM"은 골수를 나타냄)이고;
도 8은 탈응집된 토끼 골수 및 혈액 응괴에서 TGF-β의 발현 그래프이고;
도 9는 응괴에서 아데노바이러스의 안정성 그래프이고;
도 10은 3일째에 토끼에서의 생체내 유전자 발현 그래프이고;
도 11은 시험관내에서 6주 후 고모리의 삼색단 키트 염색 (Gomori's Trichrome Kit staining)을 사용한 토끼 골수 응괴의 사진이고;
도 12는 시험관내에서 6주 후 고모리의 삼색단 키트 염색을 사용한 Ad TGF-β를 갖는 토끼 골수 응괴의 사진이다.
상세한 설명
본 발명에 따라, 성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴를 대상자에게 투여하면 성분을 대상자에게 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 대상자에게 성분을 전달하기 위한 선행 기술상의 방법들은 많은 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 이들 중 일부는 고가이고 복잡하며, 거의 지속이면서 균일하게 (바람직한) 방출하지 않는다.
본원에 사용된 "조혈 세포 응괴"는 여러 가지 조건하에서 응괴를 형성할 수 있는 임의 형태의 조혈 세포를 포함하는 응괴를 나타낸다. 예를 들면, 혈액 응괴 및 골수 응괴이다. 골수 또는 혈액 흡인물 (aspirate)은 최소한도의 침습성 시술로 대상자로부터 용이하게 수득할 수 있다. 이는 인공 매트릭스의 제조가 훨씬 많은 시간과 비용이 소모되고 노동 집약적인 것과는 대조적이다. 혈액 응괴를 제조하기 위해, 결함의 크기에 의해 결정되는 일정 부피의 혈액 세포를 대상자로부터 채혈로 수집할 수 있다. 이와 유사하게, 골수 응괴를 제조하기 위해서는 적당한 부피의 골수 흡인물을 골수가 풍부한 근원, 예를 들어 장골릉, 하부 골수를 노출시키는 골연골 결함 부위, 또는 기타 적절한 부위로부터 수집할 수 있다. 골수 흡인물 및 혈액은 통상적으로 동일한 밀도이고 유사한 응고 특성을 갖는다.
조직 회복에 있어서 골수 또는 혈액 응괴를 사용하면, 혈액 응괴의 형성 및 골수 세포의 이동이 골연골 결함, 뼈, 힘줄, 반월 또는 추간판 결함 발생 이후의 자연 회복 반응의 일부가 되는 장점을 제공한다. 또한, 골수 응괴는 신체의 각기 다른 조직을 형성할 수 있는 능력을 지닌 줄기 세포가 풍부하고, 나아가 응괴는 회복 반응을 위한 천연의 미세 환경을 나타낸다. 만일 적절한 생물학적 약제와 결합된다면, 조혈 응괴는 다수 조직 형태의 회복을 촉진시킬 잠재력을 가지게 된다.
조혈 세포는 응괴가 전달될 대상자와 동일한 대상자, 상기 성분이 전달되지 않을 다른 대상자, 시험관내에서 성장시킨 실험실 표본, 또는 기타 임의의 조혈 세포원으로부터 단리될 수 있다. 확실히, 조혈 세포 응괴가 채취되는 원천이 다르면 각각 다른 조건 및 성분이 바람직할 것이다. 예를 들어, 조혈 세포 응괴가 성분이 전달될 대상자와 동일한 대상자로부터 수득된다면, 응괴는 대상자에게 완전히 선천적이며 자가 조직이다. 따라서, 조혈 세포가 성분 전달을 방해하고 성분의 바람직한 효과를 억제하거나 면역 반응을 일으킬 가능성이 보다 낮아지게 된다.
조혈 세포 응괴는 임의의 크기 및 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 조혈 세포 응괴는 그것이 응고 과정 동안 천연적으로 어떠한 형태이든 간에 사용될 수 있다. 별도로, 조혈 세포 응괴를 특정 크기 또는 형상으로 형성시키는 단계를 거칠 수 있다. 특정 크기 또는 형상의 조혈 세포 응괴는, 특정 조직 결함의 회복에 유용할 수 있다. 이 경우, 교정되거나 치료되는 특정 결함과 유사한 크기를 갖는 응괴를 제조하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 크기 또는 형상의 조혈 세포 응괴를 제조하기 위한 하나의 방법은 성형 용기를 사용하는 것이다. 예를 들어, 조혈 세포 응괴는 용기 내에서 형성될 수 있기 때문에, 조혈 세포 표본과 성분의 혼합물은 용기 내에서 고체화될 것이다. 이러한 방식의 경우, 응괴는 용기의 크기 및 형상에 의해 결정된 크기 및 형상을 가질 것이다. 조혈 세포 응괴는 또한, 약물과 같은 성분이 효과적으로 전달되도록 하는 방식으로, 즉, 심지어 조직 결함이 없는 경우에도 형성될 수 있다. 조혈 세포 응괴의 고체상은 응괴가 용이하게 취급되어 손상 부위에 이식되도록 한다.
상기와 같이, 조혈 세포 응괴는 손상 조직의 회복에 유용할 수 있다. 응괴는 치유 과정을 돕기 위해 조직에 위치시킬 수 있다. 바람직하게는, 회복 과정에도 도움이 되는 성분이 응괴 내에 혼입된다. 일부 경우 회복 과정 동안 세포의 내부 성장을 위해 단순히 매트릭스를 제공하는데 응괴를 단독으로 사용할 수도 있지만, 바람직하게는 성분, 예를 들어 세포, 약물 또는 유전자 벡터를 거기에 혼입시킬 수 있다. 결함 조직은 회복이 필요한 임의의 조직일 수 있다. 예를 들어, 조직은 뼈, 및 연골, 인대, 힘줄, 반월 및 추간판을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 연조직일 수 있다. 아니면, 조혈 세포 응괴는 후속적인 이식을 위해 조직을 처리하거나 회복시키기 위한 시험관내 시스템으로서 사용될 수 있다. 시험관내 조직 형성을 위해 조혈 세포 응괴는 세포와 시딩 (seeding)될 수 있고, 적절한 배지 내에서 배양될 수 있다.
조혈 세포 응괴는 또한, 회복될 임의의 조직이 없는 경우에도 약물 또는 세포를 대상자에게 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 응괴는 화합물을 대상자에게 전달하기 위한 기타 임의의 지속 방출 기구로서 사용될 수 있다. 특정 용도는 대상자에게 전달되는 약물, 세포 또는 유전자 벡터의 형태에 따라 좌우될 것이다.
본원에 사용된 "대상자"란 인간, 비인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류와 같은 척추 동물이다.
조혈 세포 응괴의 형성은 실온과 같은 다양한 조건하에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 토끼 또는 인간의 혈액 및 골수 흡인물의 응고는 약 15-30분 내에 일어날 것이다. 따라서, 이러한 응괴는 필요하다면 수술중에 생성되어 이식될 수 있다.
일단 조혈 세포 응괴가 형성되면, 임의의 미결합 성분은 응괴로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 조혈 세포 응괴는 인산염 완충 식염수와 같은 용액 중에서 세척할 수 있다. 응괴를 제조하기 위한 보다 상세한 방법은, 이하 제시하는 실험의 설명에 예시되어 있다. 당업자들은 조혈 세포로 응괴를 제조하는 기타 방법을 알고 있을 것이다.
본원에 사용된 "비중합성 조혈 세포 응괴"란 상기 정의한 바와 같은 조혈 세포 응괴이고, 여기서 중합체 매트릭스는 응괴 내에 혼입되지 않거나 응괴를 위한 구조체로서 사용된다. 조직 회복을 위한 대부분의 약물-전달 기구들은, 약물을 전달하기 위한 구조체로서 중합체 매트릭스를 사용한다. 중합체 매트릭스는 중합체, 예를 들어 개질된 또는 천연의 다당류, 예를 들어 키토산, 키틴, 히알유로난, 글리코스아미노글리칸, 콘드로이틴 술페이트, 케라탄 술페이트, 더마탄 술페이트, 헤파린 또는 헤파린 술페이트로부터 형성된다. 중합체는 천연, 재조합 또는 합성 단백질, 예를 들어 가용성 콜라겐 또는 가용성 젤라틴, 또는 폴리아미노산, 예를 들어 폴리리신일 수 있다. 중합체는 또한 폴리락트산, 폴리글리콜산, 또는 카르복실, 아미노, 술폰, 포스폰, 포스펜 관능기를 포함하고 추가의 관능기, 예를 들어 히드록실, 티올, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시 및 아로일옥시 (이에 한정되지는 않음)가 있거나 없는 합성 단독 및 블록 공중합체일 수 있다. 또한, 중합체는 오르토에스테르, 무수물, 프로필렌-코-푸마레이트, 또는 하나 이상의 알파-히드록시 카르복실산 단량체 (예를 들어, 알파-히드록시 아세트산 (글리콜산) 및(또는) 알파-히드록시 프로피온산 (락트산))의 중합체를 포함할 수 있다.
중합체는 먼저 무기염, 예를 들어 염화나트륨, 인산, 황산 및 카르복실산 칼륨, 칼슘, 마그네슘을 포함하는 완충액 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 중합체는 또한 유기염, 예를 들어 글리세롤-포스페이트, 프룩토스 포스페이트, 글루코스 포스페이트, L-세린 포스페이트, 아데노신 포스페이트, 글루코스아민, 갈락토스아민, HEPES, PIPES 및 MES를 포함하는 완충액 중에 용해되거나 현탁될 수 있다.
바람직하게는, 성분은 비중합성 조혈 세포 응괴 내에 혼입된다. 본원에 사용된 "성분"은 대상자에 대해 효과를 갖는 (진단 효과를 포함) 임의의 조성물이다. 성분은 예를 들어, 세포 또는 기타 임의의 활성제, 예를 들어 약물, 또는 펩티드, 소분자 등을 발현할 수 있는 유전자 벡터일 수 있다. 성분은 외인성 성분이다. 즉, 조혈 세포 표본에 첨가되는 성분이며 그 이전의 환경 (즉, 대상자, 시험관내 환경 등)으로부터 채취하기 전에는 세포 표본에 존재하지 않는다. 성분은 예를 들어, 유전자 전달 비히클 (바이러스 및 비바이러스), 추가의 세포, 유전공학적으로 처리되거나 천연의 재조합, 가용성 또는 기타 임의 형태의 단백질 또는 기타 생활성 분자, 예를 들어 성장 인자이다.
본원에 사용된 활성제는 생물학적 유기체에서 진단, 예방 또는 치료적 효과를 갖는 임의의 화합물이다. 활성제는 화합물, 예를 들어 단백질, 펩티드, 항체, 다당류, 핵산 (예를 들어 RNA, DNA, PNA, 이들의 복합체 (예를 들어, 트리플렉스), 당류, 당단백질, 아미노산, 바이러스, 거대 분자의 불균일 혼합물 (예를 들어, 천연 산물 추출물) 및 하이브리드 거대 분자 (예를 들어, 단백질/핵산 하이브리드, 알부민 컨쥬게이트된 단백질, 링커 무기 분자를 갖는 약물, 무기 분자, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
생활성제는 생물학적 유기체에서 예방 또는 치료적 효과를 갖는 임의의 화합물이다. 일부 실시태양에서, 생활성제는 다음의 약제 중 임의의 것이다: 아드레날린성 약제; 부신피질 스테로이드; 부신피질 억제제; 인지를 치료하기 위한 약제, 항혈소판제, 알도스테론 길항제; 아미노산; 동화제; 흥분제; 진통제; 마취제; 식욕 감퇴제; 항여드름제; 항아드레날린제; 항알레르기제; 항알츠하이머제, 항아메바제; 항빈혈제; 항협심증제; 항관절염제; 항천식제; 항죽상경화증제; 항박테리아제; 항콜린제; 항응고제; 항경련제; 항우울제; 항당뇨제; 지사제; 항이뇨제; 항구토제; 항간질제; 항섬유소용해제; 항진균제 (antifungal); 항출혈제; 항히스타민제; 항고지혈증제; 항고혈압제; 항저혈압제; 항감염제; 항염증제; 항균제; 항편두통제; 항분열제; 항진균제 (antimycotic), 항멀미제, 항신생물제, 항호중구감소제, 구충제;항증식제; 항정신병제; 항류마티스제; 항지루제; 항분비제; 진경제; 항혈전제; 항궤양제; 항바이러스제; 항불안제, 식욕 억제제; 혈액 글루코스 조절자; 뼈 재흡수 억제제; 기관지 확장제; 심혈관제; 콜린제; COX1 억제제, COX2 억제제, 직접 트롬빈 억제제, 저하제 (depressant); 진단 보조제; 이뇨제; 도파민성 약제; 에스트로겐 수용체 작용제; 섬유소 용해제; 형광성 약제; 유리 산소 라디칼 스캐빈져; 위장관 운동성 효과기 (effector); 글루코코르티코이드; GPIIbIIIa 길항제, 모발 성장 촉진제; 지혈제; 히스타민 H2 수용체 길항제; 호르몬; 인간 성장 호르몬, 저콜레스테롤혈증제; 저혈당제; 저지혈증제; 수면제, 저혈압제; 영상화제; 면역학적 약제, 예를 들어 면역화제, 면역조정자, 면역조절자, 면역촉진제 및 면역억제제; 각질용해제; LHRH 작용제; 기분 조절자; 점액 용해제; 산동제; 비충혈 제거제; 신경근 차단제; 신경보호제; NMDA 길항제; 비호르몬성 스테롤 유도체; 플라스미노겐 활성화제; 혈소판 활성화 인자 길항제; 혈소판 응집 억제제; 양성자 펌프 억제제, 향정신성 약제; 방사성 약제; 살개선제 (scabicide); 경화제; 진정제; 진정-수면제; 선택적 아데노신 A1 길항제; 세로토닌 길항제; 세로토닌 억제제; 세로토닌 수용체 길항제; 스타틴, 스테로이드; 갑상선 호르몬; 갑상선 억제제; 갑상선 유사제; 정신 안정제; 근위축성 측삭 경화증 약제; 대뇌 허혈 약제; 파제트병 (Paget's disease) 약제; 불안정형 협심증 약제; 혈관 수축제; 혈관 이완제; 상처 치유제; 크산틴 옥시다제 억제제.
비중합성 조혈 세포 응괴의 하나의 바람직한 용도는, 뼈 및 조직 결함을 회복시키는 것이다. 연골, 뼈 및 연조직의 회복과 가장 연관이 있을 것 같은 단백질은 TGF-βS 1-3을 포함하는 전환 성장 인자-β (TGF-β) 상과 (superfamily), 다양한 뼈 형태형성 단백질 (BMPs), 섬유모세포 성장 인자, 성장 호르몬 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGFs)의 구성원이다.
연골 형성 및 연골 회복, 뿐만 아니라 뼈 및 연조직의 형성 및 회복을 증강시키기 위한 재조합 단백질의 생체내 투여는, 다양한 다양한 결함 모델 및 실험 동물에서 연구되어 왔다 (Hunziker, 2001; Nixon et al., 1999; Sellers et al., 1997). 기대되는 결과에도 불구하고, 재조합 단백질 분자들은 생물학적 반감기가 짧고 지속적인 표적 전달을 위한 효과적인 방법이 없다는 점이 임상 적용에 장애가 되어 왔다. 단백질 성장 인자를 조직 손상 부위에 직접 주사한 결과는 인자가 체액에 의해 희석되고, 신속하게 대사되거나 다른 조직으로 퍼져나가기 때문에 실망스러웠다. 따라서, 치료적 농도를 유지하려면 높은 부하 용량 또는 반복적인 투여가 필요하다. 이는 회복 효율은 감소시키는 반면, 비용, 복잡성, 및 비표적 장기가 노출됨으로 인한 원치않는 부작용 발생 위험은 증가시킨다. 본원에 기술된 비중합성 조혈 세포 응괴는 이하 서술하는 실시예에서 입증된 바와 같이, 이러한 다수 문제점들을 극복하고 있다.
응괴는 또한, 유전자를 통상적으로 대상자, 또는 대상자의 특정 조직에 전달하는데 유용하다. 본원에 사용된 "유전자"는 길이가 30 뉴클레오티드를 초과하거나, 보다 통상적으로는 100 뉴클레오티드 이상인 단리된 핵산 분자이다. 유전자는 통상적으로 적절한 프로모터의 조절하에 있을 것이고, 유도성, 억제성 또는 항시발현성일 수 있다. 목적하는 기능을 대체 또는 보충하거나 목적하는 효과, 예를 들어 종양 성장의 억제를 달성하는데 유용한 임의의 유전자는, 본원에 기술된 응괴를 사용하여 도입할 수 있다. 프로모터는 여러 가지의 포유류 세포에서, 또는 세포 특이적이거나 심지어 핵 대 세포질 특이적으로 발현하는 통상적인 프로모터일 수 있다. 이들은 당업자에게 공지되어 있고 표준 분자생물학 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 임의 형태의 유전자가 유용하다. 특정 상황에서 사용되는 특정 유전자는 치료되는 증상 및(또는) 목적하는 치료 결과에 따라 좌우될 것이다. 유전자 치료에 사용되어 온 유전자의 목록은 예를 들어, 도 1에 나타냈다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 도 1에 열거된 유전자 중 임의의 하나 또는 그들의 조합을 본 발명의 전달 기구에 혼입할 수 있다.
유전자 전달은 손상된 조직에 단백질을 전달하는데에 있어서의 다수의 한계점들을 극복할 수 있는 접근법을 제공한다. 본원에 기술된 본 발명은 손상 조직을 치유하기 위해 유전자 전달 비히클, 세포 및 가용성 단백질을 적용하는 신규 시스템을 제시한다. 회복 또는 치료적 잠재성이 있는 단백질을 코딩하는 cDNAs를 손상 또는 질병 부위의 특정 세포에 전달함으로써, 유전적으로-변형된 세포는 약물을 생산하는 국소적인 인자가 되어 특정 단백질이 지속적으로 합성되도록 한다.
이러한 유전자에 대한 적합한 프로모터, 인핸서, 벡터 등은 문헌에 공개되어 있다. 통상적으로, 유용한 유전자는 아데노신 디아미나제 (ADA) 결핍을 치료하기 위해 임상 실험에 사용된 ADA와 같은 결손 효소를 코딩하는 유전자, 및 인슐린 및 응고 인자 VIII과 같은 보조 인자를 포함하여, 기능을 대체하거나 보충해준다. 조절에 영향을 미치는 유전자는 또한 단독으로, 또는 특정 기능을 보충하거나 대체하는 유전자와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 단백질-코딩 유전자의 발현을 억제하는 단백질을 코딩하는 유전자가 본 발명의 응괴에 의해 투여될 수 있다. 유전자는 참조 문헌, 진뱅크 (Genbank) 또는 상업적 공급자를 포함하는 여러 가지의 공급원으로부터 수득하거나 얻을 수 있다. 이들은 만일 상대적으로 작다면 고상 합성으로 합성될 수 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 메릴랜드주 록빌)에 기탁된 것과 같은 기탁 표본으로부터 수득할 수 있거나, 공개된 서열 정보를 사용하여 새로이 단리할 수 있다.
유전자 이외에, 성분은 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 길이 및 기능에 의해 상기 유전자와 구별되는 안티센스 및 리보자임일 수 있다. 상기 짧은 올리고뉴클레오티드와 달리 유전자는 단백질을 코딩하고, 따라서 통상적으로 최소한 100 염기쌍을 초과하는 길이, 보다 통상적으로는 수백 염기쌍의 길이일 것이다.
본원에 사용된 벡터는 유전자를 분해시키지 않으면서 세포 내로 운반하고 전달될 세포 내에서 유전자가 발현되도록 프로모터를 포함하는 약제이다.
또한, 발현 벡터 내의 유전자는 숙주 세포 및 세포주, 예를 들어 시험관내 원핵 세포 (예를 들어,E. coli) 또는 진핵 세포 (예를 들어 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, 효모 발현 시스템, 및 곤충 세포 내의 재조합 배큘로바이러스 발현)에 트랜스펙션될 수 있음을 인식할 것이다. 그 후, 이 세포들은 응괴에 혼입될 수 있다. 특히 유용한 것은 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류 등과 같은 포유류 세포이다. 이들은 다양하게 선택할 수 있는 조직 형태일 수 있고, 주로 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 구체적인 예는 각질 세포, 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함한다. 발현 벡터는 해당 유전자 서열이 프로모터에 조작 가능하게 연결될 것을 필요로 한다.
일부 실시태양에서, 유전자를 전달하기 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 독성약화 폭스바이러스를 포함하는 폭스바이러스, 셈리키 포레스트 (Semliki Forest) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 레트로바이러스, 신드비스 바이러스 및 Ty 바이러스-유사 입자로 구성된 군으로부터 선택된다. 외인성 핵산을 전달하는데 사용된 바이러스 및 바이러스-유사 입자는 예를 들어, 복제-결함 아데노바이러스 (예를 들어, Xiang et al.,Virology219:220-227, 1996; Eloit et al.,J. Virol.7:5375-5381, 1997; Chengalvala et al.,Vaccine15:335-339, 1997), 변형 레트로바이러스 (Townsend et al.,J. Virol.71:3365-3374, 1997), 비복제 레트로바이러스 (Irwin et al.,J. Virol.68:5036-5044, 1994), 복제 결함 셈리키 포레스트 바이러스 (Zhao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:3009-3013, 1995), 카나리아폭스 바이러스 및 고독성약화 백시니아 바이러스 유도체 (Paoletti,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11349-11353, 1996), 비복제 백시니아 바이러스 (Moss,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11341-11348, 1996), 복제 백시니아 바이러스 (Moss,Dev. Biol. Stand.82:55-63, 1994), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (Davis et al.,J. Virol.70:3781-3787, 1996), 신드비스 바이러스 (Pugachev et al.,Virology212:587-594, 1995) 및 Ty 바이러스-유사 입자 (Allsopp et al.,Eur. J. Immunol26:1951-1959, 1996)를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 알파바이러스이다.
특정 용도를 위한 다른 바람직한 바이러스는 아데노-관련 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 아데노-관련 바이러스는 다양한 범위의 세포 형태 및 종을 감염시킬 수 있으며, 복제-결핍으로 조작될 수 있다. 또한, 열 및 지질 용매 안정성, 조혈 세포를 포함하는 다양한 계통의 세포에서의 높은 트랜스덕션 빈도, 및 중복 감염 억제가 없는 것과 같은 장점을 가지고 있기 때문에, 다수의 연속적인 트랜스덕션이 가능하다. 아데노-관련 바이러스는 인간 세포 DNA에 위치 특이적인 방식으로 통합될 수 있으므로, 삽입에 의한 돌연변이 유발 및 삽입된 유전자 발현의 변화 가능성을 최소화한다. 또한, 야생형 아데노-관련 바이러스 감염은 조직 배양 후 선택 압력 없이도 100계대 이상 계속되는데, 이는 아데노-관련 바이러스의 게놈 통합이 상대적으로 안정적인 현상임을 의미한다. 아데노-관련 바이러스는 염색체외 방식으로 기능할 수도 있다.
통상적으로, 기타 바람직한 바이러스 벡터는 비본질적인 유전자가 관심대상인 유전자로 대체된 비세포변성 (non-cytopathic) 진핵 세포 바이러스에 기초한다. 비세포변성 바이러스는 레트로바이러스를 포함하고, 레트로바이러스의 생활사는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사와 숙주 세포 DNA로의 후속적인 프로바이러스의 통합을 포함한다. 아데노바이러스 및 레트로바이러스는 인간 유전자 치료 실험에 대해 사용 승인을 받았다. 통상적으로, 레트로바이러스는 복제-결핍 (즉, 목적 단백질을 합성시킬 수는 있지만, 감염성 입자를 만들 수는 없음)이다. 이렇게 유전적으로 변형된 레트로바이러스 발현 벡터는 통상적으로, 유전자의 생체내 고효율 트랜스덕션에 사용된다. 복제-결핍 레트로바이러스를 제조하는 표준 프로토콜 (외인성 유전 물질을 플라스미드에 혼입하고, 팩키징 세포주를 플라스미드로 트랜스펙션하며, 팩키징 세포주가 재조합 레트로바이러스를 제조하고, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자를 수집하며, 표적 세포를 바이러스 입자로 감염시키는 단계를 포함)은, 문헌 [Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W. H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J. Ed. "Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991)]에 개시되어 있다.
바람직하게는 상기 핵산 전달 벡터는 (1) 포유류 세포에서 전사 및 번역될 수 있는 외인성 유전 물질을 포함하고, (2) 임의로 표면 상에 포유류 세포와 같은 표적 세포 표면 상의 수용체에 선택적으로 결합하는 리간드를 포함하여 표적 세포로 침투할 수 있다.
핵산이 시험관내에서 도입되는지 아니면 숙주에서 생체내로 도입되는지에 따라, 본 발명의 핵산을 세포로 도입하는데 다양한 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 핵산-CaP04침전의 트랜스펙션, DEAE와 결합된 핵산의 트랜스펙션, 관심 대상인 핵산을 포함하는 상기 바이러스로의 트랜스펙션 또는 감염, 리포좀 매개 트랜스펙션 등을 포함한다. 특정 용도를 위해, 특히 응괴가 표적 세포로부터 멀리 떨어진 위치에 이식되거나 투여된다면, 핵산을 특정 세포에 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 응괴로부터 방출된 후 세포 내로 본 발명의 핵산을 전달하는데 사용되는 비히클 (예를 들어, 레트로바이러스 또는 기타 바이러스; 리포좀)은 세포에 부착되 표적 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자는, 핵산 전달 비히클에 결합되거나 그 내부에 혼입될 수 있다. 유전자를 전달하는데 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입 (endocytosis)과 관련된 표면 막단백질에 결합하는 단백질은 표적화를 위해서 및(또는) 흡수를 용이하게 하기 위해 리포좀 제제 내에 혼입될 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 형태에 자극성 (tropic)인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 사이클링 동안 내입되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 목적으로 하며 세포내 반감기를 증진시키는 단백질 등을 포함한다.
성분은 임의의 상태, 예를 들어 용액, 고체, 벡터, 기체, 또는 조혈 세포와 혼합되어 응괴를 형성할 수 있는 기타 임의의 상태일 수 있다.
직접 유전자 전달을 위해, 수확된 혈액 또는 골수는 유전자 전달 벡터 (바이러스성 또는 비바이러스성)를 포함하는 용액, 또는 적절한 크기 및 형상의 용기 또는 세포 표본을 성분과 혼합하는 임의의 용기 중의 단백질에 첨가될 수 있다. 이 혼합물은 성분을 세포 표본과 혼합할 수 있는 피펫 또는 기타 임의의 기구 또는 시스템을 사용하여 역가측정할 수 있다.
생체외 유전자 전달 접근법을 위해, 조혈 세포, 예를 들어 혈액 또는 골수 흡인물은 추가의 벡터가 있거나 없는 천연 또는 유전적으로 변형된 세포의 현탁액과 혼합될 수 있다. 그 다음, 세포를 응괴에 혼입하고 신체로 돌려보낸다.
본 발명은 또한, 생성물을 포함한다. 생성물은 성분 전달 시스템이다. 본원에 사용된 "성분 전달 시스템"은, 성분을 대상자에게 전달할 수 있도록 성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴이다.
조성물 (성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴)은 투여되는 경우, 제약학상 허용되는 제제로 투여될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 제약학상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 혼화될 수 있는 담체, 및 임의로 기타 비혼입 치료제를 포함할 수 있다.
조성물은 주사 또는 시간에 따른 점진적인 주입을 포함하는 임의의 통상적인 경로로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 직접 주사 또는 이식, 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 강 내, 폐 내, 점막 (즉, 직장, 질, 안구, 진피, 비내 등), 피하, 에어로졸, 또는 경피로 이루어질 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이란 단독으로, 또는 추가 용량과 함께 목적 반응을 나타내는 조성물의 양이다. 목적 반응은 물론, 치료되는 특정 질환 및 응괴 내에서 투여되는 세포 또는 활성제의 형태에 의해 좌우될 것이다. 이러한 인자들은 당업자에게 공지되어 있고, 단지 통상적인 실험으로 해결될 수 있다. 일반적으로, 개별 성분 또는 그의 조합을 최대 용량, 즉 정상적인 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량으로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자는 환자들이 의학적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 다른 이유 때문에 보다 낮은 용량 또는 견딜 수 있는 용량을 요구할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 방법에 사용되는 조성물은 바람직하게는 무균이고, 환자에게 투여하기에 적합한 중량 또는 부피 단위에서 목적한 반응을 나타내기 위한 유효량의 성분을 포함한다.
본 발명의 제약 제제는 투여될 경우 제약학상 허용되는 양으로, 그리고 제약학상 허용되는 조성물로 적용된다. "제약학상 허용되는"이란 용어는, 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 혼화될 수 있는 담체, 및 임의로 기타 치료제를 포함할 수 있다. 약제에 사용될 경우 염은 제약학상 허용되는 것이어야 하지만, 제약학상 불허되는 염은 통상적으로 그의 제약학상 허용되는 염을 제조하는데 사용될 수 있으며, 본 발명의 영역에서 배제되지 않는다. 상기 제약학적 및 제약학상 허용되는 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등 (이에 한정되지는 않음)으로부터 제조된 것을 포함한다. 또한, 제약학상 허용되는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로 제조될 수 있다.
시험관내:
실시예 1: 혈액 또는 골수 응괴의 부하능
응고 과정을 방해하지 않으면서 인간 혈액에 첨가될 수 있는 액체의 최대량을 평가하기 위해, 200 ㎕ 부피의 혈액을 점점 증가하는 양의 PBS와 혼합했다.PBS를 혈액의 거의 2배 부피로 첨가한 후에도 응고는 여전히 일어났다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이를 동일한 크기의 콜라겐-글리코스아미노글리칸-매트릭스 (콜라겐-gag-매트릭스)가 흡수할 수 있는 액체량과 비교했다. 응괴와 콜라겐-gag-매트릭스 간에는 액체 흡수에 있어서 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다.
인간 혈액 응괴가 세포를 혼입할 수 있는지 측정하기 위해, 토끼 골수 세포를 단층으로 배양하고 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 24 h 후, 약 600,000개의 형광 세포를 트립신 처리하여 원심분리로 회수했다. 세포 펠렛을 각각 450 ㎕의 인간 혈액에 재현탁했다. 그 다음, 상기 혈액-세포 구성물을 미세원심분리 튜브에서 응고시켰다. 1 h 후, 응괴를 수집하고 1 ml의 PBS에 침지하여, 햄 (Ham)의 F12 배지에서 24 h 동안 각각 12 웰 플레이트에서 배양했다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 혈액 응괴는 응고 24 h 후 고밀도의 녹색 형광 토끼 골수 세포를 나타냈다. 응고 후 에펜돌프 튜브 중의 잔류 액체를 분석한 결과 잔류하는 녹색 세포가 나타나지 않았는데, 이는 트랜스덕션된 모든 토끼 골수 세포가 인간 혈액 응괴에 보유되었음을 나타낸다.
실시예 2: 응괴의 형성
응고를 위해 각각 다른 용기를 사용한 실험은, 응괴가 다양한 모양 및 크기로 형성될 수 있음을 뒷받침해 주고 있다. 이렇게 형성된 응괴는 어떠한 크기 및 형상의 결함에도 이식될 수 있을 정도로 충분히 안정적으로 유지되었으며, 그 예는 도 4에 나타냈다.
실시예 3: 혈액 응괴 및 골수 응괴의 유전적으로 변형된 세포로의 시딩 (생체외 유전자 전달 접근법을 모방하기 위한 것)
생체외 유전자 전달 접근법을 모방하기 위해, 4 그룹의 토끼 혈액 응괴를 시험관내에서 검사했다.
1. 450 ㎕의 토끼 혈액만
2. 400,000개의 토끼 골수 세포 현탁액과 혼합한 450 ㎕의 토끼 혈액
3. GFP를 발현하도록 재조합 아데노바이러스로 유전적으로 변형시킨 400,000개의 토끼 골수 세포 현탁액과 혼합한 450 ㎕의 토끼 혈액
4. TGF-β를 발현하도록 재조합 아데노바이러스로 유전적으로 변형시킨 400,000개의 토끼 골수 세포 현탁액과 혼합한 450 ㎕의 토끼 혈액
각 그룹은 4회 반복실험을 포함한다. 응괴를 1, 3, 7, 14 및 21일째에 형광 현미경으로 검사했다. ELISA로 배지 내의 TGF-β 수치를 측정하여, TGF-β를 발현하도록 트랜스덕션된 세포를 시딩한 응괴에서 TGF-β 발현을 측정했다.
응괴 내의 형광 세포는 시험관내에서 적어도 21일째에 관찰되었다. 도 5a는 1일째의 세포를 보여주고, 도 5b는 21일 후의 세포를 보여주고 있다. 이와 유사하게, TGF-β는 적어도 21일째에 최대로 발현되는 것으로 관찰되었으며, 결과는 도 6에 도시했다.
실시예 4: 혈액 응괴 및 골수 응괴 내 세포의 직접 트랜스덕션 (직접 유전자 전달 접근법을 모방하기 위한 것)
혈액 응괴 또는 골수 응괴 내의 세포가 형질전환 유전자 (transgene)의 발현을 가능하게 하는지 결정하기 위해, 혈액 및 골수를 아데노바이러스 벡터, Ad TGF-β 및 Ad GFP와 혼합했다.
1. 450 ㎕의 토끼 혈액만
2. 450 ㎕의 토끼 혈액 및 10 ㎕의 Ad GFP
3. 450 ㎕의 토끼 혈액 및 10 ㎕의 Ad TGF-β
4. 450 ㎕의 토끼 골수-흡인물만
5. 450 ㎕의 토끼 골수-흡인물 및 10 ㎕의 Ad GFP
6. 450 ㎕의 토끼 골수-흡인물 및 10 ㎕의 Ad TGF-β
각 그룹은 4회의 반복실험으로 구성되었다. 응괴는 상기 기술한 바와 같이 형성되었고, 1, 3, 7, 14 및 21일째에 현미경으로 검사했다. TGF-β 발현을 측정하기 위해 동일한 시점에서 조절된 배지의 ELISA를 수행했다.
14일째까지 혈액 응괴 및 골수 응괴 내의 GFP 발현을 관찰했으며, 그 결과는 도 7에서 볼 수 있다.
골수 응괴에서 TGF-β의 생산은 7일째까지 검출되었고, 3일째에 최대였으며, 14일째까지 배경 수준으로 감소했다.
이와 대조적으로, Ad TGF-β로 감염된 혈액 응괴에서는 TGF-β가 검출가능한 수준으로 발현되지 않았다. 배지 내에 분비된 TGF-β가 없는 것은 성장 인자가 응괴 내에 트랩핑되었기 때문이거나, 벡터 내부의 일부 다른 차이점 때문일 수 있다.
혈액 응괴 내에 트랩핑되어 유지되는 이러한 형질전환 유전자 생성물을 정량화하기 위해 동일한 방법으로 추가의 실험을 수행했고, 그 결과는 도 8에서 볼 수있다.
1. 토끼 혈액 (450 ㎕)
2. 토끼 골수 (450 ㎕)
3. 토끼 혈액 (450 ㎕) 및 Ad TGF-β (10 ㎕)
4. 토끼 골수 (450 ㎕) 및 TGF-β (10 ㎕)
배양 2일째에 응괴를 수집하여 PBS에서 세척하고, 기계적으로 탈응집시켜 햄의 F12 배지에서 배양했다. TGF-β 수준을 3, 7, 14, 21일째에 분석했다.
혈액 및 골수 응괴 중의 TGF-β 수준은 유전자 전달 3일 후 높았지만, 7일에는 매우 낮은 수준으로 떨어졌다. 그러나, 골수 응괴는 혈액 응괴에 비해 TGF-β의 총 발현이 6배 정도 높은 것으로 나타났는데, 이는 골수 응괴의 보다 높은 세포성 때문일 가능성이 있다. 따라서, 직접 유전자 전달 후 형질전환 유전자 생성물의 발현에는 혈액보다 골수를 사용하는 것이 보다 효과적인 것 같았다.
실시예 5: 혈액 응괴 및 골수 응괴에서 아데노바이러스의 안정성
감염성 바이러스 벡터가 응괴 내에서 보유되고 트랜스덕션된 상태로 유지될 수 있는지 측정하기 위해 추가의 연구를 수행했고, 그 결과는 도 9에서 볼 수 있다.
혈액 응괴 및 골수 응괴를 Ad GFP로 감염시켜 상기 기술한 바와 같이 배양했다. 다양한 시점에서 응괴를 기계적으로 탈응집시키고, 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거했다. 상청액을 수집하여 293 세포의 단층 배양물을 감염시키는데 사용했다. 24시간 후, 세포의 형광을 분석했다.
형광 세포는 1, 3 및 7일째의 파괴된 응괴로부터의 상청액으로 감염시킨 배양액 내에 실제로 존재했다.
이러한 발견은 응괴 내에 트랩핑된 바이러스 벡터, Ad GFP가 적어도 7일 동안은 배양액 내에서 감염성을 유지할 수 있다는 것을 입증해주고 있다.
생체내:
실시예 6: 토끼 무릎의 연골 결함에 직접 유전자를 전달하기 위한 자가 혈액 응괴 및 골수 응괴의 사용
이 목적을 위해 루시퍼라제, GFP 및(또는) LacZ 유전자를 코딩하는 아데노바이러스 유전자 전달 벡터를 혼합하고, 뉴질랜드 백색 토끼로부터 수득한 혈액 또는 골수 흡인물과 응고시켰다. 응고 (약 30분) 후, 혈액 또는 골수-벡터 구성물을 토끼 (상기와 동일한 토끼)의 대퇴 과두에 외과적으로 만든 골연골 결함에 이식했다. 이식 후, 관절 캡슐을 봉합하고 동물을 소생시켰다. 3일 후 토끼를 희생시키고, 결함으로부터 응괴를 수집했다. 정량적인 분석을 위해, 응괴에서 루시퍼라제 활성을 측정했다. 정성적인 분석을 위해, 형광 세포를 현미경으로 관찰했다. 또한, 인접한 활막을 형질전환 유전자의 발현에 대해 검사했다.
도 10에 나타낸 바와 같이, Ad 루시퍼라제와 혼합한 수집된 혈액 응괴 및 골수 응괴에서는 높은 수준의 루시퍼라제 형질전환 유전자의 발현이 관찰되었다. 이와 유사하게, Ad GFP로 감염시킨 수집한 응괴에서는 다수의 형광 세포가 관찰되었다. 결함 부위에 바로 인접한 활막 내면에서도 소수의 녹색 세포가 관찰되었다. 그러나, 활막의 다른 영역에서는 발현이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Ad GFP를 포함하는 콜라겐-gag 매트릭스의 골연골 결함으로의 직접 유전자 전달 후에는 매우 녹색인 형광 활막 내면이 관찰된 것과는 대조적이다. 따라서, 혈액 및 골수 응괴는 생체내에 이식할 경우 보다 저지된 국소적인 형질전환 유전자의 발현을 제공한다.
실시예 7: 토끼 혈액 응괴 및 골수 응괴를 사용할 경우 연골형성 또는 골형성 가능성
이 실험에서는 내인성 전구 세포가 혈액 및 골수 응괴 내에서 표현형을 바꾸어 연골형성 또는 골형성 분화를 일으킬 수 있는지에 대해 연구했다. 이를 위해, 뉴질랜드 백색 토끼로부터 혈액 및 골수를 수집하고, "총" 6 그룹으로 응고시켰다.
1. 토끼 혈액 (450 ㎕) (1 응괴)
2. 토끼 혈액 (450 ㎕) 및 Ad GFP (10 ㎕) (3 응괴)
3. 토끼 혈액 (450 ㎕) 및 Ad TGF-β (10 ㎕) (4 응괴)
4. 토끼 골수 (450 ㎕) (1 응괴)
5. 토끼 골수 (450 ㎕) 및 GFP (10 ㎕) (5 응괴)
6. 토끼 골수 (450 ㎕) 및 TGF-β (10 ㎕) (3 응괴)
응괴를 햄의 F12 배지에서 6주 동안 배양했다. 수집 후 고정화하고 파라핀에 매몰시켜, 절단하고 조직학적으로 검사했다. 절편을 헤마톡실린-에오신 및 고모리의 삼색단 키트 (콜라겐 블루 염색)으로 염색했다. 절편을 맹검 방식으로 3개의 각기 다른 개체마다 검사했다.
성장 인자로 유전적으로 변형되지 않은 골수 응괴 (골수만, 그리고 Ad GFP와혼합한 골수)에서 내인성 세포의 다능성 (pluripotent) 특성은 명백했다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 6주 후에 상기 모든 응괴에서 근육-유사, 지방-유사 및 섬유 조직 영역을 발견했다. Ad TGF-β를 첨가한 골수 응괴는 근육-유사 조직은 나타나지 않고 보다 균일한 분화를 보였다. 대신, 도 12에 나타낸 바와 같이 보다 섬유성인 조직이 관찰되었다.
세포 분화는 혈액 응괴에서 명백하지 않았다. 그러나, 각기 다른 농도 및 조합의 벡터는 분화를 야기할 수 있었다. 이러한 결과는 골수 응괴 내의 세포가 다수의 조직 형태로 분화할 수 있는 다중-잠재적 능력이 있음을 암시한다.
아데노바이러스 벡터는 유전자 생성물 과발현의 효과를 연구하는데 강력한 도구이므로, 본원에 기술한 실험에서 선택한 벡터였다. 그러나, 다른 유전자 전달 벡터, 예를 들어 아데노 관련 바이러스 (AAV) 및 레트로바이러스 벡터는 아데노바이러스로부터 유래한 벡터보다 더욱 많은 임상 용도를 가질 수 있는 것으로 기대된다.
실시예 8: 연골 조직을 회복시키기 위한 Ad.TGF-β1으로 변형된 골수 응괴의 사용
이 실험은 연골 조직을 회복시키는데 있어서 골수 응괴의 사용에 대한 연구이다. 드릴로 토끼 무릎의 연골을 통해, 그리고 뼈 및 골수 속으로 3 mm 너비 및 8 mm 깊이의 구멍을 뚫어 골연골 결함을 만들었다. 대조군 결함은 처치하지 않거나 (결함이 없음) 변형되지 않은 골수 응괴를 투여한 것이었다. 형질전환 성장 인자 베타-1 (TGF-β1)에 대한 유전자를 포함하는 아데노바이러스로 사전 감염시킨 골수 응괴를 잔류하는 골연골 결함에 이식했다.
수술 6주 후 슬라이드를 제작하고 헤마톡실린-에오신 (H & E) 및 톨루이딘 블루로 염색했다. H & E는 통상적인 산-염기 조직학적 염료이며, 톨루이딘 블루는 글리코스아미노글리칸 (GAGs)의 지표가 된다.
처치하지 않고 둔 대조군 결함에서는, 옆구리 연골과 유사하지 않은 섬유성 회복이 나타났다. 변형되지 않은 골수 응괴 이식으로 처리한 다른 대조군 결함에서는 뼈 표면만이 나타났고 GAGs는 없었다.
TGF-β1을 함유하는 사전 감염된 골수 응괴로 처리한 결함에서는 연골형성 외관이 보였고, 견고한 세포외 매트릭스가 나타났다. 대부분 회복의 경우, 회복 매트릭스는 진한 파란색으로 염색되어 GAG가 존재함을 보여주었다. 회복 매트릭스 내의 세포는 연골 세포와 형태학적으로 유사했지만, 군집으로 나타났다. 연골 아래쪽의 회복 조직에는 견고한 뼈가 형성되었다. 또한, 연골층은 대략 옆구리 조직과 동일한 깊이였다.
이러한 결과는 회복 조직이 완전하지는 않지만, 유전자 전달에 의한 이러한 접근법을 사용하는 경우 응고된 골수 흡인물 내의 세포 생물학에 긍정적인 방향으로 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
Claims (104)
- 성분을 대상자에게 전달하기 위해 상기 성분을 포함하는 비중합성 조혈 세포 응괴를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상자로의 성분 전달 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 골수 세포를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 혈액 세포를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 유전자 전달 비히클을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 추가의 세포를 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 추가의 세포가 유전공학적으로 처리된 세포를 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 추가의 세포가 천연 세포를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 단백질을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 재조합 단백질을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 가용성 단백질을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 생활성 분자를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 뼈 속으로 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연조직 속으로 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연골, 인대, 힘줄, 반월 및 추간판 중 적어도 하나로 전달되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴의 형상 및 크기가 주형에 의해 결정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분과 균질화되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성장 인자 및 조직 회복을 촉진하는 기타 유전자 생성물 중 하나 이상을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 회복되는 조직의 크기에 의해 결정되는 부피를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 대상자로부터 수집되는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 골수 세포가 장골릉으로부터 수집되는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 골수 세포가 하부 골수를 노출시키는 골연골 결함으로부터 수집되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 성분이 용액 형태인 방법.
- 제1항에 있어서, 성분을 포함하는 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 역가측정 (titration)된 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 역가측정이 피펫을 사용하여 수행되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 천연 및 유전적으로 변형된 세포 중 하나 이상의 현탁액과 혼합되어 세포 현탁액을 형성하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 하나 이상의 유전자 벡터를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 추가의 유전자 벡터를 포함하지 않는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 전달이 비중합성 조혈 세포 응괴로부터의 느리고 국소적인 성분 방출인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분을 효과적으로 전달하는 방식으로 형상화된 방법.
- 제1항에 있어서, 성분 전달 영역의 조직을 재생시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 15-30분 동안 응고된 조혈 세포 표본으로부터 제조되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 실온에서 응고된 조혈 세포 표본으로부터 제조되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 용기 내에 두어 응고된 조혈 세포 표본으로부터 제조되는 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 상기 용기로부터 수집되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 인산염 완충 식염수 중에서 세척된 조혈 세포 표본으로부터 제조되는 방법.
- 제1항에 있어서, 임의의 미결합 성분이 비중합성 조혈 세포 응괴로부터 제거되는 방법.
- 성분을 조혈 세포 표본에 첨가하고;성분을 포함하는 조혈 세포 표본이 비중합성 조혈 세포 응괴를 형성하도록 하는 것을 포함하는,비중합성 조혈 세포 응괴 성분 전달 시스템의 제조 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 대상자에게 이식되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 대상자에게 전달되는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 전달이 비중합성 조혈 세포 응괴로부터의 느리고 국소적인 성분 방출인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분을 효과적으로 전달하는 방식으로 형상화된 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴 전달 시스템이 조직을 재생시키는데 사용되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 조혈 세포 표본이 대상자로부터 수집되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 용기 중에서 형성되는 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 용기로부터 비중합성 조혈 세포 응괴를 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 비중합성 조혈 세포 응괴를 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제46항에 있어서, 임의의 미결합 성분이 세척에 의해 제거되는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 인산염 완충 식염수 중에서 세척되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 15-30분 동안 응고된 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 실온에서 응고된 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 조혈 세포가 골수 세포를 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 조혈 세포가 혈액 세포를 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 유전자 전달 비히클을 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 추가의 세포를 포함하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 추가의 세포가 유전공학적으로 처리된 세포를 포함하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 추가의 세포가 천연 세포를 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 단백질을 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 재조합 단백질을 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 가용성 단백질을 포함하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 생활성 분자를 포함하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 뼈 속으로 전달되는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연조직 속으로 전달되는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연골, 인대, 힘줄, 반월 및 추간판 중 적어도 하나로 전달되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴의 형상 및 크기가 주형에 의해 결정되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분과 균질화되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 조혈 세포가 성장 인자 및 조직 회복을 촉진하는 기타 유전자 생성물 중 하나 이상을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 회복되는 조직의 크기에 의해 결정되는 부피를 갖는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 골수 세포가 장골릉으로부터 수집되는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 골수 세포가 하부 골수를 노출시키는 골연골 결함으로부터 수집되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 성분이 용액 형태인 방법.
- 제37항에 있어서, 성분을 포함하는 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 역가측정된 것인 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 역가측정이 피펫을 사용하여 수행되는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 조혈 세포가 천연 및 유전적으로 변형된 세포 중 하나 이상의 현탁액과 혼합되어 세포 현탁액을 형성하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 하나 이상의 유전자 벡터를 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 추가의 유전자 벡터를 포함하지 않는 방법.
- 성분이 혼입된 비중합성 조혈 세포 응괴를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분을 효과적으로 전달하는 방식으로 형상화된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 골수 세포를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 혈액 세포를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 성분이 유전자 전달 비히클을 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 성분이 추가의 세포를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제81항에 있어서, 상기 추가의 세포가 유전공학적으로 처리된 세포를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제81항에 있어서, 상기 추가의 세포가 천연 세포를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제81항에 있어서, 상기 성분이 단백질을 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제81항에 있어서, 상기 성분이 재조합 단백질을 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 성분이 가용성 단백질을 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 성분이 생활성 분자를 포함하는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 뼈 속으로 전달되도록 제제화된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연조직 속으로 전달되도록 제제화된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 연골, 인대, 힘줄, 반월 및 추간판 중 적어도 하나로 전달되도록 제제화된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴의 형상 및 크기가 주형에 의해 결정되는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성분과 균질화된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 성장 인자 및 조직 회복을 촉진하는 기타 유전자 생성물 중 하나 이상을 발현하도록 유전적으로 변형된 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 회복되는 조직의 크기에 의해 결정되는 부피를 갖는 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 단리된 조혈 세포 표본으로부터 제조되는 성분 전달 시스템.
- 제78항에 있어서, 상기 골수 세포가 장골릉 골수 세포로부터 단리된 것인 성분 전달 시스템.
- 제78항에 있어서, 상기 골수 세포가 하부 골수를 노출시키는 골연골 결함으로부터 단리된 것인 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 성분이 천연 및 유전적으로 변형된 세포 중 하나 이상인 성분 전달 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 조혈 세포 표본이 15-30분 동안 응고되도록 하는 방법에 의해 제조되는 성분 전달 시스템.
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- 제76항에 있어서, 상기 비중합성 조혈 세포 응괴가 임의의 미결합 성분을 비중합성 조혈 세포 응괴로부터 제거하는 방법에 의해 제조되는 성분 전달 시스템.
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