KR101957013B1 - 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 전달하고자 하는 약물의 유실을 최소화하여 비용을 절감할 수 있고, 이를 통하여 상기 유실된 약물에 의한 부작용을 감소시킬 수 있으며, 전달하고자 하는 부위에 국소적으로 오랜 기간 동안 서서히 약물을 유출시켜 원하는 골 형성을 통한 치료 등의 효과를 나타낼 수 있다. 또한 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 전달 매체로 파티클 형태를 도입함으로써, 상기 파티클 형태 내에 전달하고자 하는 약물을 포함하여 전달이 가능하므로, 상기 약물의 생체 내의 안정성 및 골 형성능을 우수하게 유지시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 다른 단백질이나 약물에도 적용이 가능하므로 다양한 전달 시스템 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법{DRUG DELIVERY SYSTEM COMPRISING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

약물 전달 시스템은 약리학적 효과를 지니는 화합물 또는 분자들의 조직 및 세포 전달 효능 및 약동학적 효능을 증가시키기 위한 것으로 현재 다양한 형태의 약물 전달 시스템이 연구되고 있다. 대표적으로 마이크로/나노 수준의 입자, liposome, transdermal patches, 흡입제(inhalers), 약물유지용 이식재 또는 항체-약물 접합체 등이 약물 전달체로 사용되고 있으며, 사용되는 약물은 세포질 내에 존재하는 단백질 또는 신호전달체계의 구성 분자에 직접 작용할 수 있는 약물이 주로 많이 활용되고 있다.

이에 반해 다양한 분자량 및 친수성 특성을 가지는 약물(화합물 외에 DNA, RNA, Protein을 포함)이 자발적으로 세포막을 통과하는 것은 어려운 일이며, Multiple Drug Resistant(MDR), Lysosomal Degradation 등의 세포질 내 방어기재를 극복해야 하는 어려움이 존재한다. 이러한 경우 약물의 생체 유지 및 전달을 위해 약물전달체의 역할이 매우 중요하고 특히 세포질 내에 대상 약물의 활성을 유지하면서 고효율로 약물을 전달하기 위해 다양한 특징을 가지는 약물 후보의 약리학적 효과를 가장 직접적이고 효과적으로 유도할 수 있는 방법 및 다양한 약물 전달을 위한 재료(Materials)가 연구되고 있다.

한편, 현재 골절이나 부상 등으로 인해 생긴 뼈의 손실을 회복하는 데 여러가지 종류의 골이식 방법이 시도되고 있으며, 특히 줄기 세포나 성장인자 등을 함께 적용함으로서 그 효과를 증가시키려는 연구가 활발하게 일어나고 있다.

뼈 형성에 필수적인 성장 인자인 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)는 그 자체만으로도 뼈 세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 이러한 성질로 인해 뼈 이식 또는 뼈 재생과 같은 분야에서 널리 사용되고 있다. 현재 콜라겐 스펀지를 스캐폴드(scaffold)로 하여 생체내에 도입하는 방법이 허가되어 있으며 실제 임상에서는 척추유합술, open tibia fracture, alveolar ridge, sinus augmentation과 같은 목적으로 널리 사용되고 있다.

그러나, BMP-2의 짧은 반감기와 적절한 전달 시스템의 부재, 그리고 의사들의 'off-lable' 사용으로 인해 일어나는 여러가지 부작용들이 계속해서 보고되고 있는 상황이다.

현재 BMP-2는 콜라겐 스펀지를 스캐폴드(scaffold)로 하여 함께 사용하는 것이 미국 FDA에서 승인이 되어있는 상황이지만, 이 경우 초기 단계에서 최대 30%의 BMP-2가 빠져나가 손실의 우려가 크다는 문제가 있다. 더욱이, 이렇게 빠져나간 과량의 BMP-2가 수술 주위 주변에 심각한 염증 반응을 일으키거나, 주변 연조직 내에서 뼈 조직을 형성하는 등의 부작용을 초래할 수 있다는 심각한 문제점이 발생될 수 있다. 때문에 BMP-2의 경우 단백질의 반감기가 짧아 원하는 뼈 재생 및 치료를 위해서는 실제 필요한 양 보다 훨씬 많은 양을 넣어줘야 하며, 이러한 점 또한 부작용을 일으킬 수 있는 또 다른 원인이 될 수 있다는 문제점도 있다.

이러한 문제점 해결을 위해 많은 노력들이 이루어지고 있으며, 대표적으로 합성중합체인 poly(lactic acid) (PLA)와 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)가 생체 재료로서 사용되는 기술이 제안되었다. 그러나, 이러한 합성중합체의 경우에도 효과적인 단백질의 도입과 전달은 가능하지만, 과량 사용 시 발생할 수 있는 독성이나 면역 반응 등의 문제점이 지적되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 키토산(chitosan), 히알루로난(hyaluronan), 알지네이트(alginate), 실크 피브로인(silk fibroin) 등과 같은 독성이 없는 천연물질로 이루어진 약물 전달 시스템이 관심을 받고 있다.

이 중 실크 피브로인 단백질은 Bombyx mori 누에로부터 추출이 가능한 천연 물질인 실크 피브로인 단백질은 독성이 없고 생체 적합성이 뛰어나 생체 재료로서 적합한 물질임이 잘 알려져 있다.

따라서, 이러한 골 형성 단백질을 상기 천연 물질을 전달 매체로 하여 보다 국소적인 부위에 오랜 기간 동안 효과를 나타낼 수 있으며, 발생 가능한 부작용을 최소한으로 감소시킬 수 있는 약물 전달 시스템에 대한 기술의 필요성이 절실한 상황이다.

한국 공개특허공보 제10-2016-0122656호

본 발명은 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 골 형성 단백질 코어 및 상기 코어를 피복하는 실크 피브로인을 포함하되, 상기 골 형성 단백질 코어는 양전하성 물질이고, 상기 실크 피브로인은 파티클(particle) 형태의 음전하성 물질인 약물 전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 폴리비닐알코올 용액 및 실크 피브로인 용액을 혼합하여 실크 피브로인 파티클 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 실크 피브로인 파티클 용액을 골 형성 단백질 수용액과 혼합하여 약물 전달체 용액을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 전달하고자 하는 약물의 유실을 최소화하여 비용을 절감할 수 있고, 이를 통하여 상기 유실된 약물에 의한 부작용을 감소시킬 수 있으며, 전달하고자 하는 부위에 국소적으로 오랜 기간 동안 서서히 약물을 유출시켜 원하는 골 형성을 통한 치료 등의 효과를 나타낼 수 있다. 또한 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 전달 매체로 파티클 형태를 도입함으로써, 상기 파티클 형태 내에 전달하고자 하는 약물을 포함하여 전달이 가능하므로, 상기 약물의 생체 내의 안정성 및 골 형성능을 우수하게 유지시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법은, 다른 단백질이나 약물에도 적용이 가능하므로 다양한 전달 시스템 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체의 형태를 투입된 BMP-2 함량에 따라 주사전자현미경(scanning electron microscophy, SEM)으로 관찰한 이미지 및 이를 그래프를 통하여 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 투입된 BMP-2 함량에 따라 조사한 도입 효율(encapsulation), 실크 피브로인 파티클로 형성된 효율(yield of silk fibroin particle) 및 실제 로딩된 양(actual loading)을 표로 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체의 생체 내와 비슷한 환경(in vitro)에서의 BMP-2의 유실 양상 및 안정성 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다[(a)는 시간에 따른 BMP-2의 유실 양상 실험에 대한 결과를 나타낸 도이고, (b)는 대조군(control BMP-2)과 비교하여 유실된 BMP-2의 안정성 실험에 대한 결과를 나타낸 도이다].
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 골 형성능이 우수하다는 점을 유전자 발현 수준에서 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다[(a)는 BMP-2의 양에 따른 ALP mRNA의 발현 수준을 나타낸 도이고, (b)는 BMP-2의 양에 따른 ALP의 활성을 그래프로 나타낸 도이며, (c)는 BMP-2의 양에 따른 ALP의 활성을 실제 관찰한 사진을 나타낸 것이고, 여기서, "BMP-2/SF"는 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체인 경우를 나타내며, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이다].
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 생체 내와 비슷한 환경(in vitro)에서의 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 대한 골 형성능을 mouse intramuscular ectopic bone model을 사용하여 나타낸 도이다[(a)는 soft X-ray로 관찰한 도이고, (b)는 micro CT로 관찰한 도이며, (c)는 이를 수치화하여 막대 그래프로 나타낸 도이고, 여기서, "PBS"는 대조군으로서 인산완충용액만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "BMP-2"는 대조군으로서 BMP-2만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "BMP-2/SF"는 본 발명의 약물 전달체를 사용한 경우를 나타낸 것이다].
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 대한 골 재생능을 보다 면밀하게 나타낸 도이다[(a)는 micro CT로 관찰한 도이고, (b)는 이를 수치화하여 막대 그래프로 나타낸 도이며, 여기서, "PBS"는 대조군으로서 인산완충용액만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "BMP-2"는 대조군으로서 BMP-2만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "BMP-2/SF"는 본 발명의 약물 전달체를 사용한 경우를 나타낸 것이다].

이하, 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법에 관하여 상세히 설명하나, 상기 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체 및 그 제조 방법의 범위가 하기 설명에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 골 형성 단백질 코어 및 상기 코어를 피복하는 실크 피브로인을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.

본 명세서상의 용어, "코어"는 통상적인 의미의 코어, 즉 어떤 물질에서 핵심적이고 중심적인 부분을 의미할 수 있으며, 중앙에 위치한 물질을 통칭하는 의미로 이해될 수 있다. 또한, 본 명세서상의 용어 "피복하는"이란, "어떤 물질의 주변을 둘러싸는"이라는 의미로 이해될 수 있다.

특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 골 형성 단백질 코어는 양전하성 물질일 수 있고, 상기 실크 피브로인은 파티클(particle) 형태의 음전하성 물질일 수 있다.

본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체는 후술하는 약물 전달체 제조 방법에서 사용되는 폴리비닐알코올(Poly vinyl alcohol, PVA)을 원형(template)으로 하여 파티클(particle) 형태의 실크 피브로인을 형성할 수 있으며, 그 과정에서 수용액 상태의 골 형성 단백질(예를 들어, BMP-2)을 섞음으로써, 정전기적으로 양전하성을 가지는 골 형성 단백질 및 음전하성을 가지는 실크 피브로인간 결합력에 의해 파티클이 형성되면서, 상기 파티클 내부에 골 형성 단백질이 들어간 파티클 형태를 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체는 상기 전달하고자 하는 약물이 실크 피브로인 파티클 내부에 포함되어 목적 부위로 이동이 가능하므로, 보다 전달하고자 하는 약물의 유실을 최소화하여 비용을 절감할 수 있고, 이를 통하여 상기 유실된 약물에 의한 부작용을 감소시킬 수 있으며, 전달하고자 하는 부위에 국소적으로 오랜 기간 동안 서서히 약물을 유출시켜 원하는 골 형성을 통한 치료 등의 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 상기 약물의 생체 내의 안정성 및 골 형성능을 우수하게 유지시킬 수 있다.

상기 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12 및 BMP-13로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 BMP-2일 수 있다.

상기 코어는 약학적 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 약물 전달체는 코어에 약학적 활성 물질, 예를 들면 핵산 또는 단백질 기반의 약물을 탑재하고 세포막과의 융합을 통해 세포내로 도입되어 약물을 충분한 농도로 유지시킨 채 전달하고자 하는 목적 부위로 전달할 수 있다.

상기 약물 전달체는 약물 방출이 전체 약물 대비 약 30% 이상, 약 35% 이상 또는 약 40% 이상일 수 있으나, 상한의 경우 전체 약물 중 보다 많은 약물이 방출되는 것이 효과적으로 전달되는 것으로 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 실크 피브로인 파티클(particle)의 직경은 100nm 내지 1,000nm, 300nm 내지 900nm 또는 500nm 내지 800nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 전술한 본 발명에 따른 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물이 특정 질환의 예방 또는 약학적인 용도로서도 사용 가능하며, 이 경우 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

또한, 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락 토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 용도의 약물을 전달하기 위한 약물 전달용 조성물일 경우, 약물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한, 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 약물 전달체의 제조 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 약물 전달체의 제조 방법은, (a) 폴리비닐알코올 용액 및 실크 피브로인 용액을 혼합하여 실크 피브로인 파티클 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 실크 피브로인 파티클 용액을 골 형성 단백질 수용액과 혼합하여 약물 전달체 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약물 전달체의 제조 방법은 전술한 본 발명의 약물 전달체를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로, 전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달체에서 설명한 구성과 유사한 구성에 대해서는 설명을 간략히 하거나 생략하기로 한다.

상기 (a) 단계에서 상기 폴리비닐알코올 용액의 농도는 1% 내지 10%, 2.5% 내지 8% 또는 4% 내지 6%일 수 있고, 상기 실크 피브로인 용액의 농도는 1% 내지 10%, 2.5% 내지 8% 또는 4% 내지 6%일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약물 전달체의 제조 방법은 상기 (a) 단계 후에 (c) 상기 파티클 용액을 초음파 처리(sonication)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 (c) 단계의 초음파 처리 단계는 진폭(amplitude)이 약 10% 내지 50%, 약 20% 내지 40% 또는 바람직하게는 약 30%일 수 있으며, 펄스(pulse)는 약 10초 내지 50초, 약 20초 내지 40초 또는 바람직하게는 약 30초의 조건으로 1회 이상 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약물 전달체의 제조 방법은, 상기 (b) 단계 후에 (d) 상기 약물 전달체 용액을 원심분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 특별히 제한되는 것은 아니다, 예를 들어 상기 (d) 단계의 원심분리하는 단계는 5,000rpm 내지 20,000rpm 또는 10,000rpm 내지 15,000rpm의 조건에서, 온도가 0℃ 내지 10℃ 또는 2℃ 내지 8℃ 조건에서 약 1분 내지 60분 또는 10분 내지 40분의 조건으로 수행되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조로 상세히 설명한다.

[실시예]

1. 약물 전달체의 제조

본 발명에 따른 약물 전달체의 구체적인 실시예를 위하여, 약물 전달체를 하기와 같은 방식으로 제조하였다.

이와 관련하여 도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.

실크 피브로인 용액(5%(w/v)) 1ml과 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 용액(5%(w/v)) 4ml을 혼합한 후, 상기 혼합물에 초음파 처리(sonication)를 가해준다(amplitude: 30%, 30초). 그 후, 적당량의 BMP-2를 drop-wise로 넣은 후, 살짝 vortex하여 패트리 접시(Patri dish, 90 X 15mm)에 부어 골고루 펴준 뒤 완전히 건조시켜 필름 형태로 만든다. 필름 형태로 완전히 건조된 BMP-2 피브로인 파티클을 떼어내 conical tube에 담고 30ml의 증류수를 부어 완전히 풀어준다(rocking). 11,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 BMP-2 피브로인 파티클은 가라 앉히고, 이를 추출하여 본 발명에 따른 약물 전달체를 제조하였다.

2. 약물 전달체의 형태 관찰

주사전자현미경(Scanning electron microscophy, SEM)을 사용하여 제조된 약물 전달체의 형태를 관찰하였다.

도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체의 형태를 투입된 BMP-2 함량에 따라 주사전자현미경(scanning electron microscophy, SEM)으로 관찰한 이미지 및 이를 그래프를 통하여 나타낸 도이다.

도 2를 참조하면, 약물 전달체의 형태는 거의 대부분 모두 구 형태를 갖는 파티클 형태를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 정밀 분석 결과 BMP-2가 들어있지 않은 실크 피브로인 파티클(silk fibroin particle) 의 경우는 약 500nm의 직경을 보였고, BMP-2가 들어있는 파티클의 경우는 직경이 약 100nm 더 ?게 형성되었다. 또한, 도입한 BMP-2 양에 따른 크기 변화는 관찰되지 않았고, 표면 전하의 경우 실크 피브로인 파티클(SF) 및 BMP-2가 들어가 있는 실크 피브로인 파티클(BMP-2/SF) 모두 비슷한 정도의 음전하를 나타냈다. 이러한 결과로부터, 양전하를 갖는 BMP-2 단백질이 파티클 표면에 붙어있는 것이 아니라 파티클 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 피브로인 단백질 1mg 당 10ug의 BMP-2를 사용할 경우는 침전이 생기는 것을 확인하였다.

3. 약물 전달체의 도입 효율 및 형성 효율 측정

상기 약물 전달체의 제조 과정 중, 원심분리를 통하여 본 발명에 따른 약물 전달체, 즉 BMP-2 피브로인 파티클은 가라 앉히고, 나머지 반응하지 않은 BMP-2와 피브로인 단백질들이 포함된 상등액으로부터 BMP-2의 도입 효율 측정을 하였다. 또한, 상기 약물 전달체의 제조 과정 중, 원심분리를 통하여 본 발명에 따른 약물 전달체, 즉 가라앉은 BMP-2 피브로인 파티클을 동결 건조하여 파티클 형성 효율 측정에 사용하였다.

보다 구체적으로, 1mg의 피브로인 단백질에 각각 0ug, 2ug, 6ug 그리고 10ug의 BMP-2를 사용하여 파티클을 제조하였고 BMP-2의 도입 효율(encapsulation efficiency)과 사용한 피브로인 단백질 중 실제 파티클로 형성된 효율 (Yield of silk fibroin particle)을 측정하였다. 이를 통해 실제 silk fibroin 1mg 당 들어있는 BMP-2의 양을 계산할 수 있다.

이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.

즉, 도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 투입된 BMP-2 함량에 따라 조사한 도입 효율(encapsulation), 실크 피브로인 파티클로 형성된 효율(yield of silk fibroin particle) 및 실제 로딩된 양(actual loading)을 표로 나타낸 도이다.

도 3을 참조하면, 피브로인 파티클이 형성되는 효율은 약 40% 정도로 BMP-2의 양에 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다.

이후, 모든 실험에서 BMP-2가 들어가 있는 실크 피브로인 파티클(BMP-2/SF)은 1mg silk fibroin 당 12.63ug의 BMP-2가 들어있는 파티클을 사용하였다.

4. 약물 전달체의 안전성(활성 유지) 실험

본 발명에 따른 약물 전달체의 안전성을 알아보기 위해, 생체 내와 비슷한 환경(in vitro)에서의 BMP-2/피브로인 파티클의 릴리즈 패턴을 측정하였다. 보다 구체적으로, 10%의 fetal bovine serum (FBS)이 들어있는 세포 배양액을 사용하여, 각 튜브에 총 5ug 의 BMP-2가 들어있는 파티클을 세포 배양액과 함께 넣고 37℃에서 반응시켰다. 이후 Rotator를 이용하여 파티클이 가라앉지 않도록 하였고 각각의 시간대 별로 샘플을 원심분리하여 상등액은 -80℃에서 보관하고, 새로운 배양액을 넣어 반응을 계속하였다. 상등액에 들어있는 BMP-2의 양은 ELSIA를 통해 측정되었고 총 30일 동안 릴리즈된 양을 측정하였다(도 4(a) 참조). 또한, 이렇게 릴리즈 되어 나온 BMP-2가 생체 활성을 유지하고 있는지를 알아보기 위해, 같은 양의 BMP-2를 같은 조건에서 반응 시킨 후, BMP-2가 포함된 세포배양액을 C2C12 세포에 3일간 처리한 다음, ALP 염색을 실시하여 관찰하였다(도 4(b) 참조).

이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체의 생체 내와 비슷한 환경(in vitro)에서의 BMP-2의 유실 양상 및 안정성 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다[(a)는 시간에 따른 BMP-2의 유실 양상 실험에 대한 결과를 나타낸 도이고, (b)는 대조군(control BMP-2)과 비교하여 유실된 BMP-2의 안정성 실험에 대한 결과를 나타낸 도이다].

도 4를 참조하면, 전체 중 약 40%의 BMP-2가 릴리즈 되었음을 확인할 수 있었고, 또한 파티클 내의 BMP-2는 14일이 넘게 활성을 유지하고 있는 반면, 일반 BMP-2는 11일 이후부터 거의 활성을 잃어 염색 정도에 차이가 난 점을 확인하였다. 따라서, 파티클 내부로 도입된 BMP-2는 외부 환경으로부터 보호를 받으면서 오랜시간 동안 활성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었다.

5. 약물 전달체의 골 형성능에 대한 유전자 수준에서의 측정

본 발명의 약물 전달체의 골 형성능에 대한 유전자 수준에서의 측정을 위해, 조골세포의 전구체인 MC3T3-E1 세포에 BMP-2/SF와 SF를 농도별로 처리하여 골 형성 마커인 ALP의 mRNA 발현과 활성 변화를 관찰하였다. 농도가 각각 100ng/ml, 300ng/ml 그리고 500ng/ml의 BMP-2가 들어있는 BMP-2/SF를 처리하였고 이와 같은 농도의 SF를 대조군으로 모두 처리하였다.

이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.

즉, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 골 형성능이 우수하다는 점을 유전자 발현 수준에서 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다[(a)는 BMP-2의 양에 따른 ALP mRNA의 발현 수준을 나타낸 도이고, (b)는 BMP-2의 양에 따른 ALP의 활성을 그래프로 나타낸 도이며, (c)는 BMP-2의 양에 따른 ALP의 활성을 실제 관찰한 사진을 나타낸 것이고, 여기서, "BMP-2/SF"는 본 발명에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체인 경우를 나타내며, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이다].

도 5를 참조하면, SF를 처리한 곳에서와는 다르게 BMP-2/SF를 처리한 곳에서는 BMP-2의 농도가 증가함에 따라 ALP의 mRNA와 활성이 증가하는 것을 확인하였다.

6. 약물 전달체의 세포 독성 실험

본 발명의 약물 전달체의 세포 독성 실험을 위하여, C2C12 세포에 각각 다른 양의 약물 전달체를 처리하였다. 최대 830ug의 BMP-2/피브로인 파티클을 24시간 동안 처리한 후, cell viability assay를 이용하여 살아있는 세포의 양을 측정하였다.

이에 대한 결과는 도 6에 나타내었다.

즉, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 생체 내와 비슷한 환경(in vitro)에서의 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

도 6을 참조하면, 모든 그룹에서 거의 100%의 세포가 살아있는 것으로 보아 본 발명에 따른 약물 전달체의 세포 독성은 거의 없다는 것을 확인하였다.

7. 약물 전달체의 골 형성능의 측정

본 발명의 약물 전달체의 골 형성능을 측정하기 위해, mouse intramuscular ectopic bone model을 사용하여, 4주령된 암컷 C57BL/6 마우스 뒷다리 근육에 각각 PBS, SF, BMP-2(5ug) 그리고 BMP-2/SF(5ug의 BMP-2 포함)를 적신 콜라겐 스펀지를 삽입한 후, 8주가 지난 다음 새로 형성된 뼈를 soft X-ray 및 micro CT를 통하여 각각 분석 및 확인하였다.

이에 대한 결과는 도 7에 나타내었다.

즉, 도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 대한 골 형성능을 mouse intramuscular ectopic bone model을 사용하여 나타낸 도이다[(a)는 soft X-ray로 관찰한 도이고, (b)는 micro CT로 관찰한 도이며, (c)는 이를 수치화하여 막대 그래프로 나타낸 도이고, 여기서, "PBS"는 대조군으로서 인산완충용액만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "BMP-2"는 대조군으로서 BMP-2만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "BMP-2/SF"는 본 발명의 약물 전달체를 사용한 경우를 나타낸 것이다].

도 7을 참조하면, PBS나 SF을 삽입한 실험군과는 다르게 BMP-2나 BMP-2/SF을 삽입한 곳에서는 콜라겐 스펀지를 중심으로 구형에 가까운 새로운 뼈(ectopic bone)가 형성되었음을 확인할 수 있었고, 또한 두 실험군(BMP-2 및 BMP-2/SF)에서는 비슷한 수준의 뼈가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

8. 약물 전달체의 골 재생능의 측정

본 발명에 따른 약물 전달체의 골 재생능의 측정을 위해, 8주령 된 암컷 Sprague Dawely rat의 두개골에 직경 8mm의 ciritial-sized defect을 유도한 다음, 직경 8mm의 콜라켄 스펀지에 각각 PBS, SF, BMP-2 그리고 BMP-2/SF을 앞의 실험(7. 약물 전달체의 골 형성능의 측정)과 동일한 양으로 적셔 삽입하였다. 4주 후에 어느 정도의 defect가 회복되었는지를 micro CT분석을 통해 확인하였다.

이에 대한 결과는 도 8에 나타내었다.

즉, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 단백질을 포함하는 약물 전달체에 대한 골 재생능을 보다 면밀하게 나타낸 도이다[(a)는 micro CT로 관찰한 도이고, (b)는 이를 수치화하여 막대 그래프로 나타낸 도이며, 여기서, "PBS"는 대조군으로서 인산완충용액만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "SF"는 대조군으로서 실크 피브로인만을 사용한 경우를 나타낸 것이며, "BMP-2"는 대조군으로서 BMP-2만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, "BMP-2/SF"는 본 발명의 약물 전달체를 사용한 경우를 나타낸 것이다].

도 8을 참조하면, PBS나 SF를 삽입한 곳에서는 defect의 가장 자리에서부터 새로운 뼈가 형성되어 안으로 들어오는 것으로 확인되었고, 회복되는 정도는 두 그룹에서 비슷하게 낮은 수준이었다. 반면, BMP-2나 BMP-2/SF을 삽입한 곳에서는 defect 부분이 완전히 회복된 것을 확인하였다. 또한, Bone volume이나 bone mineral contents (BMC)는 PBS나 SF 처리 군에 비해 3배 내지 4배 높게 나타났고, BMP-2와 BMP-2/피브로인 파티클 두 실험군간에는 마찬가지로 큰 차이를 보이지 않았음을 확인하였다.

상기 실험 1 내지 8 및 도 1 내지 8에 나타난 결과들로부터, 본 발명에 따른 약물 전달체는, 전달하고자 하는 약물의 유실을 최소화할 수 있고, 전달하고자 하는 부위에 국소적으로 오랜 기간 동안 서서히 약물을 유출시킬 수 있으며, 세포 독성도 없을 뿐만 아니라 생체 내의 안정성 및 골 형성능을 우수하게 유지시킬 수 있으므로, 약물 등의 전달 시스템 분야에 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1. 골 형성 단백질 코어 및 상기 코어를 피복하는 실크 피브로인을 포함하되,
   상기 골 형성 단백질 코어는 양전하성 물질이고, 상기 실크 피브로인은 파티클(particle) 형태의 음전하성 물질인 약물 전달체에 있어서,
   상기 파티클(particle) 형태는 상기 양전하성 골 형성 단백질 코어와 상기 음전하성 실크 피브로인과의 결합력에 의하여 형성되고, 상기 음전하성 실크 피브로인을 포함하는 용액 및 폴리비닐알코올을 혼합한 혼합물에 초음파 처리(amplitude: 30%, pulse: 30초)를 한 후, 상기 골 형성 단백질 코어를 필름 형태로 제조 및 건조하여 투입 후, 증류수로 상기 필름 형태의 골 형성 단백질 코어를 풀어준 다음 원심분리하는 과정을 포함하여 제조된 것이며,
   상기 파티클의 직경은 500nm 내지 800nm이고, 상기 실크 피브로인 파티클 내부에 포함된 골 형성 단백질 코어는 30일 동안 초기 투입량 대비 40%의 방출이 되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 골 형성 단백질은 BMP-2인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 코어는 약학적 활성 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물.
7. (a) 폴리비닐알코올 용액 및 실크 피브로인 용액을 혼합하여 음전하성 물질인 실크 피브로인 파티클 용액을 제조하는 단계; 및
   (b) 상기 음전하성 물질인 실크 피브로인 파티클 용액을 양전하성 물질인 필름 형태의 골 형성 단백질을 증류수로 희석하여 풀어준 수용액과 혼합하여 약물 전달체 용액을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달체의 제조 방법에 있어서,
   상기 (a) 단계 후에 (c) 상기 파티클 용액을 초음파 처리(sonication)하는 단계를 포함하고, 상기 초음파 처리 단계는 진폭(amplitude) 30% 및 펄스(pulse) 30초의 조건으로 수행되며,
   상기 (b) 단계 후에 (d) 상기 약물 전달체 용액을 원심분리하는 단계를 추가로 포함하고,
   상기 파티클 형태는 상기 양전하성 골 형성 단백질 수용액에 포함된 양전하성 골 형성 단백질과 상기 음전하성 실크 피브로인과의 결합력에 의하여 형성되고, 상기 실크 피브로인 파티클 용액에 포함된 상기 실크 피브로인 파티클의 직경은 500nm 내지 800nm이며, 상기 실크 피브로인 파티클 내부에 포함된 골 형성 단백질 코어는 30일 동안 초기 투입량 대비 40%의 방출이 되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체의 제조 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 폴리비닐알코올 용액의 농도(w/v)는 1% 내지 10%이고, 상기 실크 피브로인 용액의 농도(w/v)는 1% 내지 10%인 것을 특징으로 하는 약물 전달체의 제조 방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 7 항에 있어서, 상기 (d) 단계의 원심분리하는 단계는 5000rpm 내지 20,000rpm, 0℃ 내지 10℃ 및 1분 내지 60분의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체의 제조 방법.

Images