KR101820574B1 - 피브로인 미립구를 포함하는 약물 전달체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본원은 피브로인 입자의 코어 및 상기 코어를 피복하는 양전하성 물질의 외피층을 포함하는 약물 전달체, 그 제조방법 및 그 용도를 개시한다. 본원의 표면 특성을 개량한 실크 피브로인 미립구는 세포막 통과가 용이하여 다양한 종류의 약물, 유전물질 및 단백질등을 세포내로 도입하고, 결정성 조절을 통해 장기간 약물 방출 조절이 가능하여 우수한 약물전달체로 사용 할 수 있다.

Description

피브로인 미립구를 포함하는 약물 전달체 및 그 제조방법 {Drug delivery system comprising fibroin microparticle and method of preparing the same}

본원은 실크 피브로인 미립구의 표면 특성 개량 방법 및 이에 의해 생산된 약물 전달체와 관련된 것이다.

약물 전달 시스템은 약리학적 효과를 지니는 화합물 또는 분자들의 조직 및 세포 전달 효능 및 약동학적 효능을 증가시키기 위한 것으로 현재 다양한 형태의 약물 전달 시스템이 연구되고 있다. 대표적으로 마이크로/나노 수준의 입자, liposome, transdermal patches, 흡입제(inhalers), 약물유지용 이식재 또는 항체-약물 접합체 등이 약물전달체로 사용 되고 있으며, 사용되는 약물은 세포질 내에 존재하는 단백질 또는 신호전달체계의 구성 분자에 직접 작용할 수 있는 약물이 주로 많이 활용되고 있다.

세포질 내에서 작용하는 약물은 양친성(Amphiphilicity)을 가지는 인지질 이중층인 세포막을 통과해야 하는 어려움 때문에 약물의 물리-화학적 성질에 따라 그 약리학적 효능이 매우 크게 좌우될 수 밖에 없다. 일반적으로 몇몇 항암제로 대표되는 작은 분자량의 소수성 약물의 경우 생체 내에서 이들의 용해도(Solubility)는 매우 낮지만 분자가 세포외기질(ECM)에 도달하기만 하면 수동적 확산(Diffusion)을 통해 자발적으로 세포막을 통과하는 것으로 알려져있어 약물전달물질은 수용성 환경인 생체 내에서 이들의 불용성 문제를 해결하는데 집중되어 있다.

이에 반해 다양한 분자량 및 친수성 특성을 가지는 약물(화합물 외에 DNA, RNA, Protein을 포함)이 자발적으로 세포막을 통과하는 것은 어려운 일이며, Multiple Drug Resistant(MDR), Lysosomal Degradation 등의 세포질 내 방어기재를 극복해야 하는 어려움이 존재한다. 이러한 경우 약물의 생체 유지 및 전달을 위해 약물전달체의 역할이 매우 중요하고 특히 세포질 내에 대상 약물의 활성을 유지하면서 고효율로 약물을 전달하기 위해 다양한 특징을 가지는 약물 후보의 약리학적 효과를 가장 직접적이고 효과적으로 유도할 수 있는 방법 및 다양한 약물전달재료(Materials)가 연구되고 있다.

그 중 나노입자 및 미립구는 다양한 약물전달 용도로의 활용 가능성 때문에 생체 내에 적용가능한 단기간 작용하는 전달을 목적으로 많은 연구가 되어 있다. 이러한 입자의 약물 방출 메커니즘은 입자를 구성하는 폴리머 네트워크의 분해에 따른 약물 확산에 따른다. 너무 강한 결합력 및 생체 내에서 분해가 불가능한 폴리머 네트워크의 경우 내부에 포함된 약물의 유출을 불가능하게 할 수 있으나, 반대로 결합력이 약한 폴리머는 생체 내에서 약물의 충분한 전달을 어렵게 한다. 합성 유래 또는 천연유래 재료들이 입자를 만드는데 사용될 수 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 재료는 합성유래 재료인 폴리에스테르나 폴리안하이드라이드가 주로 사용되는데 이는 이러한 화합물들은 한두개 정도의 단량체로 구성이 되는데 이들의 분자량, 합성될 때 단량체간 비율, 결정화의 정도 등을 조절하여 생체 내 분해성 조절이 가능하기 때문이다. 그러나 화합물로 이루어진 입자의 경우 생분해의 결과 만들어지는 산성을 띠는 단량체에 의한 생체독성이 심하고, 대부분 소수성의 화학적 성격을 가지고 있어 유기용매에 녹여서 반응을 유도하게 되는데 이러한 유기용매 환경이 도입하고자 하는 대상약물 특히 그 약물이 단백질인 경우 거의 단백질의 활성을 잃게 하기 쉽기 때문에 한계가 명확하다. 이에 반해 천연물 유래 폴리머, 그 예로서 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로스, 히얄루론산, 알지네이트, 키토산과 같은 물질은 우수한 생체적합성을 타나내지만 그 분해 정도 및 결정화 정도를 조절하기 어려운 특성 때문에 약물 방출을 조절하기 어렵다는 단점이 있다.

실크 피브로인 미립구는 펩타이드의 자발적인 조합에 의한 젤화에 의해서 제조되고 단백질의 전기적 특성인 약한 음전하를 띠게 된다. 실크피브로인 미립구의 높은 약물함유량, 생체친화성 및 생분해성을 지닌다. 그러나 세포막이 -40 ~ -80mV사이의 음전하를 띠고 있어 실크피브로인의 음전하와 전기적으로 서로 밀어내기 때문에 세포 내 약물을 전달하는 목적으로 사용될 수 없다. 그 결과 일반적인 양전하 미립구는 물론 기본적인 입자보다 실크피브로인 입자는 세포내로 도입될 확률이 더 적게 나타났는데, 보고된 바에 의하면 1mg/ml로 처리한 경우 약 20%정도의 세포에만 실크피브로인 입자가 도입되는 문제점이 있는 것으로 나타났다.

따라서 세포막의 전기적 성질을 극복하면서 세포내 독성이 없으며 생체 내 분해성 조절이 가능하고 약물의 활성 유지 및 약물 방출 조절이 용이한 천연유래의 약물전달체의 개발이 필요하다.

미국 공개특허공보 2013-0172995 (2013년 7월4일 공개)

본원은 세포 독성이 없는 실크 피브로인 미립구의 표면특성을 개량하여 세포내로의 약물 전달이 가능한 것은 물론, 약물 내재적 용량이 크고 약물 방출의 조절이 가능한 약물전달체 및 그의 제조방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 피브로인 입자의 코어 및 상기 코어를 피복하는 양전하성 물질의 외피층을 포함하는 약물 전달체, 약물 전달용 조성물 또는 시스템을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 약물 전달체는 약학적 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서 본원의 약물 전달체에 포함되는 양전하성 물질은 양전하성 지질; 라이신, 알지닌, 또는 오르니틴으로 으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 구성된 5 내지 30 mer의 폴리펩타이드; 또는 폴리브렌(hexadimethrine bromide), 폴리아크릴아마이드, 또는 p-DADMAC(poly-diallydimethyl ammonium) 중 어느 하나이다.

일 구현예에서 본원의 약물 전달체에 포함되는 양전하성 지질은 DOTAP (1,2-di-[cis-9-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSTAP (N-[1-(2,3-distearoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), DPTAP (N-[1-(2,3-dipalmitoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), DMTAP (N-[1-(2,3-dimyristoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), LPTAP (N-[1-(2-palmitoyloxy-3-lauroyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate) 또는 DLTAP (N-[1-(2,3-dilauroyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate) 또는 DOPE (1,2-di-[cis-9-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine); 또는 상기 지질의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 본원의 약물 전달체에 포함되는 피브로인 대 양전하성 지질은 1:0.1 내지 1;5의 질량비로 포함되고, 상기 피브로인 대 폴리펩타이드는 1:0.1 내지 1;2의 질량비로 포함되고, 상기 피브로인 대 폴리브렌은 1:0.1 내지 1;1000의 질량비로 포함된다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체를 포함하는 를 포함하는 약물 전달용 조성물, 또는 시스템이다.

또 다른 양태에서 본원은 약물 전달체의 제조방법으로 상기 방법은 피브로인 미립구를 제공하는 단계; 및 상기 피브로인 미립구와 양전하성 물질을 혼합하는 단계; 상기 혼합 단계에 의해 생성된 혼합물을 초음파 처리하여 상기 미립구를 상기 양전하성 물질로 코팅하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체, 조성물 또는 시스템을 이용한 목적 세포내로의 약물 전달방법이다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체, 조성물 또는 시스템을 이용한 인비트로에서 목적 세포내로의 약물 전달방법이다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체, 조성물 또는 시스템을 이용한 인간을 제외한 동물의 목적 세포내로의 약물 전달방법이다.

본원의 표면 특성을 개량한 실크 피브로인 미립구 또는 입자는 세포막 통과가 용이하여 다양한 종류의 약물, 유전물질 및 단백질 등을 세포내로 도입할 수 있으며, 결정성 조절을 통해 장기간 약물 방출 조절이 가능하여 우수한 약물전달체로 사용 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 한 구현예에 따른 실크 피브로인 입자 표면 특질 개선을 위한 양친성 (amphiphilic) 물질을 적용하는 방법을 도식적으로 나타낸 것으로, 양전하 리포좀 등을 포함하는 양전하를 띠는 물질이 음전하를 띠는 피브로인 미립구 표면을 코팅하여 양친성으로 바뀌는 것을 나타낸다.
도 2는 실크피브로인 미립구에 GFP, Rho-B, FITC, Dextran 및 BSA를 도입한 후 컨포컬 레이저 현미경 촬영 사진이다.
도 3은 피브로인 입자의 표면을 양전하 리포좀 (DOTAP)을 이용하여 표면 전화 증가시킨 실험결과로, Zeta-sizer로 측정하였으며 표면 전하의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 4는 피브로인 입자의 표면을 양전하를 띠는 리신(lysine) 아미노산 15개 반복 서열(K15)을 이용하여 표면 전하를 증가시킨 실험결과로, Zeta-sizer로 측정하였으며 표면 전하의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 5는 피브로인 입자의 표면을 양전하를 띠는 화합물인 폴리브렌(polybrene)을 이용하여 표면 전하를 증가시킨 실험결과로 Zeta-sizer로 측정하였으며 표면 전하의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6은 피브로인 미립구와 양전하 리포좀 (DOTAP, N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate) 반응 결과를 통해 미립구의 평균 사이즈가 변화된 정도 또는 여부를 Zeta-sizer로 측정한 결과이다.
도 7은 도 6과 같이 형성된 피브로인 입자-양전하 리포좀 간 반응물(fibroplex)의 SEM, TEM 관찰 결과이다.
도 8은 Red dye(Rho-B)로 표지된 피브로인 입자와 Green dye (FITC)로 표지된 양전하 리포좀을 서로 반응시켜 표면을 양전하 리포좀으로 코팅한 반응물 (fibroplex)의 컨포컬 레이저 현미경 촬영 사진이다.
도 9는 본원에 한 구현예에 따른 양전하 리포좀으로 처리된 피브로인 입자 (fibroplex)를 MC3T3-E1 cell에 처리하여 세포 내 도입이 된 것을 컨포컬 현미경으로 관찰한 결과로, 대조군으로 피브로인 입자만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 세포내에서 높은 형광신호가 관찰되었다.
도 10은 본원에 한 구현예에 따른 양전하 펩타이드로 처리된 피브로인 입자 (fibroplex)를 MC3T3-E1 cell에 처리하여 세포 내 도입이 된 것을 컨포컬 현미경으로 관찰한 결과로, 대조군으로 피브로인 입자만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 세포내에서 높은 형광신호가 관찰되었다.
도 11은 본원에 한 구현예에 따른 폴리브렌으로 처리된 피브로인 미립구 (fibroplex)를 MC3T3-E1 세포에 처리하여 세포 내 도입이 된 것을 컨포컬 현미경으로 관찰한 결과로, 대조군으로 피브로인 입자만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 세포내에서 높은 형광신호가 관찰되었다.
도 12는 본원에 한 구현예에 따른 양전하 리포좀으로 처리된 피브로인 입자 (fibroplex)를 HEK293 세포 및 NIH3T3 세포에 처리하여 세포 내 도입이 된 것을 컨포컬 현미경으로 관찰한 결과로, 대조군으로 피브로인 입자만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 세포내에서도 높은 세포로의 도입효율을 나타냈다. Y축의 단위는 %이다.
도 13은 피브로인 입자와 양전하 리포좀의 비율에 따른 피브로인 입자의 세포내로의 유입 변화를 나타내는 것을 양전하 리포좀의 비율이 높을수록 더 많은 양의 입자가 세포내로 유입되는 것을 나타낸다.
도 14는 피브로인 입자와 폴리브렌 또는 K15의 비율에 따른 피브로인 입자의 세포내로의 유입 변화를 나타내는 것을 표면의 양전하가 증가할수록 세포내로의 도입 양이 증가하는 것을 나타낸다.
도 15는 본원에 한 구현예에 따른 다양한 약물을 도입한 표면 개량된 실크피브로인 미립구가 세포질 내에 도입되었음을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다.

본원은 실크 피브로인 미립구의 표면특성을 개량하여 세포내로의 물질 전달의 효율성을 획기적으로 개선할 수 있다는 것에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 피브로인 입자의 코어 및 상기 코어를 피복하는 양전하성 물질의 외피층을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.

본원에 따른 약물 전달체는 코어에 약학적 활성 물질, 예를 들면 핵산 또는 단백질 기반의 약물을 탑재하고 본 이론으로 한정하는 것은 아니나 세포막과의 융합을 통해 세포내로 도입되어 약물을 충분한 농도로 유지시킨 채 목적 부위로 전달할 수 있다.

도 1은 본원에 따른 약물 전달체를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 1을 참조하면 본원의 코어를 형성하는 실크 피브로인은 누에(Bombyx mori)로 대표되는 견사충의 유충 견사샘에서 합성하는 섬유단백질로 분자 구조는 6개의 소수성 아미노산이 반복적으로 배열된 소수성 부위와 비교적 짧은 친수성 부위의 반복으로 이루어져 있으며, 소수성 부위는 자발적으로 안정화되기 위해 물리적 가교를 통한 베타-시트 구조를 기반으로 하는 단백질 결정구조를 형성할 수 있는 성질을 가지고 있다. 이러한 소수성 부위는 알라닌, 글라이신-알라닌, 글라이신-알라닌-세린과 같은 소수성 아미노산 또는 이러한 아미노산의 짧은 반복구조로 이루어져 있으며, 피브로인 단백질의 pI(isoelectirc point) 값은 약 4이고, 친수성을 띠는 하전된 아미노산은 대부분 N-과 C-말단 쪽에 위치하고 있다. 피브로인 미립구는 표면 전하가 약 -20mV로 세포내 약물의 전달에 사용하기 에는 부적합하나, 이러한 단점이 개선될 경우, 약물을 포함할 수 있는 내재적 용량이 크고 베타시트 구조의 결정성을 조절함으로서 약물 방출의 조절이 가능하여 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

코어를 형성하는 피브로인 미립구는, 표면 전하의 영향을 받지 않으면서 세포내로 유입될 수 있는 사이즈인 100nm 보다 큰 사이즈의 입자로 예를 들면 약 100 nm 내지 약 1500nm를 가지는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 실크 피브로인으로 미립구를 제조하는 방법은 예를 들면 에멀젼-용매 증발/추출 방법, 용매 교체 방법(solvent displacement), 상분리 방법(phase separation), 자가조립(self-assembly), 자발적 결정화 방법, 초임계 용액의 신속 확장법(rapid expansion of supercritical fluid solution) 및 분무 건조법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 특히 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.

특히 약물 전달체로 사용하기 위해 유기용매를 사용하지 않으면서도 조절가능한 약물방출이 가능한 방법이 바람직하며, 예를 들면 PVA(poly vinyl alcohol)을 계면형성제로 사용하고 실크 피브로인 단백질에 초음파 처리와 같은 에너지를 공급하여 자발적으로 결정화를 유도하여 제조하는 방법을 들 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 PVA의 두 상의 분리를 유도하는 성질을 이용하여 실크 피브로인의 상호작용이 두 상의 계면에서 일어날 수 있도록 유도하며, 전단력(Shear force)나 초음파처리(Sonication)와 같은 외부 에너지의 공급을 통해 사이즈 및 결정형성 정도의 조절이 가능한 미립구의 형성 방법이 이용된다. PVA를 이용하여 만들어진 실크피브로인 미립구는 수용성 환경 및 약한 에너지의 공급이라는 온건한 조건에서 제조되기 때문에 내부에 도입될 약물, 특히 단백질 약물과 같이 민감한 약물의 활성 유지에 더욱 유리하다는 장점이 있으며, 실크 피브로인 단백질의 결정 형성을 통한 반응 후 물을 이용한 수회 세척을 통해 반응된 PVA를 90%이상 제거할 수 있는 장점이 있다.

본원에 따른 피브로인 미립구는 양전하를 띠는 물질로 개질된다.

본원에 따른 양전하 물질은 미립구 표면에서 상호작용을 통해 미립구 표면의 전기적 특성을 세포내로의 도입에 유리하게 개질한다. 예를 들면 이러한 양전하성 물질은 양전하성 지질; 라이신, 알지닌, 또는 오르니틴 등과 같은 양으로 하전된 하나 이상의 아미노산으로 구성된 약 5 내지 30mer, 약 10 내지 20mer, 약 10 내지 약 18mer, 약 10 내지 약 15mer의 폴리펩타이드; 또는 폴리브렌(hexadimethrine bromide), 폴리아크릴아마이드, 또는 p-DADMAC(poly-diallydimethyl ammonium) 중 어느 하나를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

예를 들면 상기 양전하성 지질은 DOTAP (1,2-di-[cis-9-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSTAP (N-[1-(2,3-distearoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), DPTAP (N-[1-(2,3-dipalmitoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), DMTAP (N-[1-(2,3-dimyristoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate), LPTAP (N-[1-(2-palmitoyloxy-3-lauroyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate) 또는 DLTAP (N-[1-(2,3-dilauroyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate) 또는 DOPE (1,2-di-[cis-9-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 또는 상기 물질의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일구현예에서는 DOTAP 또는 DOTAP:DOPE의 조합이 사용되며, 예를 들면 DOTAP:DOPE은 1:1이 비로 사용된다.

본원에 따른 약물 전달체는 이를 구성하는 코어 물질과 피복 물질의 비율을 조절하여 그 효율을 재현성 있게 조절할 수 있다. 예를 들면 피브로인 대 양전하성 지질은 1:0.1 내지 1;5의 질량비로 포함되고, 피브로인 대 폴리펩타이드는 1:0.1 내지 1;2의 질량비로 포함되고, 상기 피브로인 대 폴리브렌은 1:0.1 내지 1;1000의 질량비로 포함될 수 있다.

본원에 따른 약물 전달체는 피브로인에 탑재될 수 있는 다양한 물질을 포함하는 것으로, 특히 다른 방법으로는 전달이 어렵고, 활성유지가 중요한 생물학적 물질 예를 들면 핵산, 또는 단백질 성분의 약물 활성 물질의 목적 세포내로의 전달에 특히 유리하다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물 또는 약물 전달 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 약물 전달용 조성물 및 방법은 상술한 바와 같은 다양한 약리 활성 물질, 특히 생물학적 물질의 전달에 특히 유용하며 다양한 공지된 방법을 통해 투여될 수 있다. 예를 들면 전신투여, 또는 국소 투여를 포함하며, 주사, 흡입, 점막, 또는 경피 투여 등에 의해 달성될 수 있다. 또한 세포내로의 도입을 위해 인비트로에서 세포를 본원에 따른 약물전달체 또는 이를 포함하는 조성물과 직접 접촉시키거나 또는 배양액에 첨가하는 방식으로 도입될 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 약물 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 피브로인 미립구를 제공하는 단계; 상기 피브로인 미립구와 양전하성 물질을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합 단계에 의해 생성된 혼합물을 초음파 처리하여 상기 미립구를 상기 양전하성 물질로 코팅하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에서 미립구와 양전하성 물질은 초음파 처리를 통해 피브로인 코어에 양전하성 물질로 코팅된 약물전달체가 제조된다. 본원에 따른 방법에 사용되는 물질은 앞서 언급한 바를 참고할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 실크 피브로인 미립구의 제조

피브로인 미립구는 종전에 기재된 바와 같이 제조되었다. 실크 피브로인 미립구는 종전에 기재된 바와 같이 제조되었다(David L. Kaplan, biomaterials 31, 2010, 1025-1035). 제조된 미립구는 단백질과의 상호작용이 낮은 필터로 여과한 후에 사용되었다. 도 1은 본 발명의 한 구현예에 따른 실크 피브로인 미립구 제조 방법의 모식도이다.

아울러 다양한 물질이 탑재된 피브로인 미립구는 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

실시예 2 실크 피브로인 미립구에 모델 약물의 탑재 및 특징 규명

실시예 1에서 제조된 피브로인에 모델약물을 탑재하고 그 특징을 규명하였다. 총 1ml의 피브로인 수용액 (50mg/ml 농도)에 GFP(500μg), Rhodamin B로 표지된 Dextran(50μg), FITC로 표지된 BSA (50μg), RhodaminB (5μg), 또는 FITC(5μg)을 혼합하고 잘 섞은 후 상기 혼합 용액에 5% PVA (50mg/ml) 4ml을 추가한 후 잘 섞어주었다. 이어 Ultrasonicator (cellvio, USA)를 이용하여 30% amplitude 강도로 30초간 초음파 처리한 후, 100파이 세포배양 접시에 도포하여 넓게 편 후에 통풍이 잘되는 곳에서 12~24시간 동안 건조하였다. 건조 후에 약 7~15μm 두께의 투명 필름이 형성되었다. 위의 필름을 물에 넣어 다시 녹인 후 10,000~15,000rpm으로 4℃, 30min간 원심분리하여 물질이 탑재된 미립구를 수득하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다 실크피브로인 미립구에 모델약물을 도입한 것으로 모델약물은 Rhodamine B(양성/친수성), FITC(중성/소수성)을 사용하였고, 당류로서 Rhodamin B로 표지된 Dextran(중성/친수성, 50kDa), 단백질로서 GFP, FITC로 표지된 BSA(친수성, 65kDa)를 사용하였다. 결과는 컨포칼 현미경으로 촬영하였으며, 다양한 특성의 각 약물이 입자 내부에 성공적으로 도입된 것을 확인할 수 있었다.

이어 제조된 미립구의 크기 분포 및 물질 로딩 (또는 내포)에 의한 사이즈의 변화를 관찰하였다.

사이즈를 DLS (Dynamic Light Scattering, Otuka portal, JP)를 제조사의 방법대로 이용하여 측정한 결과 약 300~400nm를 중심으로 최소 100nm, 최대 1300nm까지 넓은 분포를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 미립구의 사이즈는 내부에 단백질을 도입할 경우 차이가 났는데, 25kDa, 50kDa, 65kDa의 BSA를 각각 1:100 비율로 피브로인 미립구에 도입하였을 때 각각 입자의 크기가 차이가 나는 것을 관찰할 수 있었다 (표 1 참조).

[표 1]

이어 실크 피브로인 미립구의 표면 전하를 측정하였다. 실크 피브로인 미립구의 표면 전하를 DLS 기기를 제조자의 방법대로 사용하여 측정 결과 평균 -20mV의 표면전하를 띠는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 내부에 BSA 단백질을 로딩하였을 때와 큰 차이가 없었다. 이는 -20mV의 강한 음전하 및 100나노미터 이상 사이즈의 미립구는 자발적 세포내 도입이 어려운 특성으로 개질의 필요성을 나타낸다. 이러한 특징은 내부에 BSA와 같은 물질을 도입하여도 큰 차이가 없으며, 따라서 내부에 물질의 도입 여부와 관계없이 피브로인 미립구는 세포내 도입을 위해 개질이 필요하다.

실시예 3 실크 피브로인 미립구의 표면 개질 및 그 특성 분석

위와 같은 특성으로 인해 세포내 도입이 어려운 피브로인 미립구를 다음과 같이 그 표면 전기적 특성의 변화시키는 방법을 확립하였다.

실크 피브로인 미립구는 평균 -20mV의 음전하를 띠는 단백질 복합체로서, 양전하를 띠는 물질과 전기적 상호작용을 통해 표면 전기적 특성을 양전하로 변경하고자, 본 실시예에서는 양전하 리포좀(Cationic liposome), 양전하 펩타이드, 양전하 화합물을 통해 달성하였다. 이후 이렇게 표면 특성이 개선된 실크 피브로인 입자를 Fibroplex 라고 명명하였다.

실시예 3-1 양전하 리포좀을 이용한 표면 개질

실시예 2에서와 같이 피브로인 미립구는 평균 표면 전하를 측정 (Zetasizer SP6800 (Portal, JP)) 측정한 결과 그 값은 -21mV인 것으로 나타났다.

이어 이를 양전하 리포좀 (DOTAP, N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate, (avanti lipid, US, cat 58000)과 도 3에 기재된 질량비로 튜브 내에서 혼합한 다음, 이를 ultrasonication (10% amplitude, 10s, 4℃)으로 처리하여 코팅이 되도록 한 후, 1분 이하로 원심분리 (500rpm, 24℃)하여 초과 지질을 제거한 후 제타 전위를 측정하였다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 지질과 피브로인 입자의 혼합비에 따라 전하량이 재현성 있게 변화하는 것으로 나타났다. 즉 1:0.1(미립구 10μg 당 1μg의 지질)를 처리한 경우 약 -7 mV로 유의하지 않았으며, 1:0.5 비의 경우, 약 +6.3 mV로 유의성있게 양전하로 표면 전하가 변화하였으며, 1:1의 경우 +13 mV, 1:3의 경우 + 18 mV, 1:4의 경우 + 21 mV, 1:5의 경우 + 23 mV로 양전하로 표면 전하가 변화한 것으로 나타났다.

피브로인 미립구과 양전하 지질의 상호작용을 통해 입자 표면 전기화학적 특성이 변화하는지를 알아보기 위해 제타 전위(Zeta-potential)를 측정해 본 결과, 평균 -20mV의 표면 전하를 가지던 입자는 상호작용하는 양전하 지질의 양이 증가할수록 그 음전하적 성격이 감소하고 양전하를 띠는 전기화학적 특성으로 변화하였다. 구체적으로 30μg의 입자에 대해 그의 1/10 무게 비율로 양전하 지질을 상호작용시켰을 경우 -4mV정도로 입자 표면의 전기화학적 특성이 변화하였으며 1/5무게 비율에서부터 양전하로 표면 전하가 변경되었고, 1/1 비율에서 약 +13mV의 표면전하를 나타내었다. 특정 비율과 표면 전하 변화량은 도 3에 기재되어 있다.

실시예 3- 2 양전하 펩타이드를 이용한 표면 개질

양전하를 띠는 리신(lysine) 아미노산 15개 반복 서열(K15)을 이용하여 피브로인 입자의 표면 전기화학적 특성이 변화하는지를 조사하였다.

K15 펩타이드의 제타포텐셜 측정 결과 전하량은 +13mV(pH 7.0) 이었으며, 이를 도 4에 기재된 비율로 피브로인 미립구와 튜브 내에 섞은 다음, 이를 ultrasonication(10% amplitude, 10s)으로 혼합하고 원심분리를 수행하여 여분의 펩타이드를 제거한 후 제타전위를 측정하였다.

결과는 도 4에 기재되어 있다. 미립구와 펩타이드의 혼합 무게비에 따라 재현성 있게 변화된 전하량이 측정 가능하였다. 즉 -20mV의 표면 전하를 가지던 피브로인 입자는 상호작용하는 양전하 펩타이드의 양이 증가할수록 그 음전하적 성격이 감소하고 양전하를 띠는 전기화학적 특성으로 변화하였다. 특정 비율과 표면 전하 변화량은 도 4에 기재되어 있다.

실시예 3- 3 폴리브렌(Polybrene)을 이용한 표면 개질

다음으로는 양전하를 띠는 화합물인 폴리브렌(polybrene)을 이용하여 피브로인 입자의 표면 전기화학적 특성이 변화하는지를 조사하였다.

양전하를 띠는 화합물(chemicals)의 대표로서 폴리브렌의 제타전위 측정 결과 전하량은 (100mg/ml 농도에서 +53mV) 이었으며, 이를 도 4에 기재된 비율로 피브로인 미립구와 튜브 내에 섞은 다음, 이를 ultrasonication(10% amplitude, 10s)으로 혼합하고 원심분리를 수행하여 여분의 폴리브렌을 제거한 후 제타전위를 측정하였다.

결과는 도 5에 기재되어 있다. 그 결과 평균 -20mV의 표면 전하를 가지던 입자는 상호작용하는 양전하 화합물의 양이 증가할수록 그 음전하적 성격이 감소하고 양전하를 띠는 전기화학적 특성으로 변화하였으며, 미립구의 혼합 무게비에 따라 재현성 있는 변화된 전하량이 측정 가능하였다. 특정 비율과 표면 전하 변화량은 도 5에 기재되어 있다.

실시예 3- 4 개질된 피브로인 입자의 크기 변화 여부 측정

피브로인 미립구와 양전하 리포좀 간 반응 결과를 통해 미립구의 평균 크기가 변화된 정도 여부를 측정하였다.

이를 위해 큐벳에 상기 실시예 3-1의 미립구-리포좀 반응물 도 6에 기재된 무게비율로 섞은 결과물을 1ml 증류수에 희석한 후 DLS (Dynamic Light Scattering) 를 제조자의 방법대로 이용하여 크기를 측정하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다. 측정 결과 사이즈의 변화가 거의 없었으며, 이를 통해 미립구와 지질간의 반응은 미립구의 표면의 얇은 층에서만 일어나는 것을 나타낸다. PDI(poly dispersion index : 표준편차) 값은 약간 증가하는 것으로 관찰되었다.

실시예 3-5 개질된 피브로인 입자의 크기 변화 여부 측정

지질이 피브로인 입자의 표면을 둘러싼 형상을 관찰하였다.

피브로인 미립구 30μg, 또는 실시예 3-1의 피브로인 미립구-리포좀 반응물 30μg을 10% 포르말린 700μl, 4% 글루타알데하이드 300μl를 섞은 고정액에 넣고 6시간 동안 고정하였다. SEM(S-4700,JP), TEM(JEM1200EXII,JP)으로 관찰하였다.

결과는 도 7에 기재되어 있다. 그 결과, 개질되지 않은 피브로인 미립구의 경우 매끈한 표면이 관찰되는 반면, fibroplex는 SEM상 표면에 얇은 막이 관찰되었으며, TEM사진 상에서도 미립구 표면에 얇은 막이 관찰되었다. 본원에서는 피브로인 미립구와 리포좀과 같은 양전하성 물질간의 상호작용이 미립구의 표면에서만 일어나도록 하여, 미립구의 전기적 성질을 음전하에서 양전하로 변화시켜 세포 내 도입을 가능하게 하였으며, 상기 결과는 표면에서만 리포좀과의 상호작용이 일어났음을 증명하는 것이다.

또한 피브로인 미립구와 양전하 지질간 반응물(fibroplex)의 형성 결과를 형광으로 관찰하였다.

FITC로 표지된 미립구를 4% 포르말린 용액에서 3시간 동안 고정한 다음, 슬라이드 글라스상에서 처리하였다. 또한 FITC로 표지된 양전하 지질을 Rhodamin B로 표지된 입자와 함께 배양한 후 이를 콘포칼 레이저 현미경으로 관찰하였다. 대조군으로 Rhodamin B로 표지된 미립구 단독, 그리고 FITC로 표지된 지질을 단독으로 사용하였다.

결과는 도 8에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 녹색 형광을 띠는 양전하 지질이 입자의 표면을 균일하게 코팅하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. Rhodamin B를 내포한 피브로인 미립구는 붉은색으로 관찰되었다. 그 결과 표면을 얇게 덮은 양전하 지질 층을 관찰할 수 있었으며, 이는 양전하 지질이 입자의 표면을 균일하게 코팅하고 있는 것을 나타낸다. 이러한 표면 반응을 통해 피브로인 미립구의 표면 전하가 변화한 것으로 판단된다.

실시예 4 표면 전기특성이 변화된 실크 피브로인 미립구(Fibroplex)를 이용한 높은 효율로 GFP 단백질의 세포내 전달 규명

이어 상기와 같이 표면이 개질된 피브로인 입자 즉 전기화학적 변화가 유도된 입자가 인비트로에서 세포에 입자 전달의 효율성을 측정하였다.

이를 위해 MC3T3-E1 세포 (ATCC, CRL-2594)에 미립구와 양전하 지질이 후술하는 바와 같이 다양한 비율로 혼합된 개질된 미립구를 이용하여 세포내 도입 효율을 FACS 분석기기를 통해 분석한 결과 1/10에서 1/1 범위까지는 양전하 지질의 비율이 증가할수록 높은 세포도입효율을 나타내는 것으로 관찰되었다(실시예 5 참고).

이러한 실험결과를 토대로 후의 실험은 입자와 양전하지질을 1/1 무게비율로 섞은 후 상호작용시켜서 사용하였다.

실시예 4-1 MC3T3 E1 세포에서의 도입효율

MC3T3-E1 세포를 60파이 세포배양접시에 알파-MEM 배지(10% FBS 포함)를 이용하여 70% confluent로 배양하였다. 이어 5ml의 배지가 들어 있는 60파이 세포배양접시에 30μg의 1:1 비율 fibroplex를 넣은 후 조심스럽게 흔들었다. 이어 24시간 이 지난 후, PBS로 세포를 3번 세척하고, 4% 포르말린 용액에 고정한 후 컨포칼 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 9에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 피브로인 미립구만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 높은 형광을 관찰할 수 있었으며, 이는 세포내에 성공적으로 도입되었음을 나타낸다.

이어 위와 동일한 실험이나 양전하 펩타이드 (K15, 15개의 라이신 아미노산 잔기의 올리고펩타이드)로 개질된 피브로인 입자를 이용하여 세포내 도입을 관찰하였다. 이 경우, fibroplex의 피브로인 입자 대 펩타이드의 비는 1:2이었다.

결과는 도 10에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 피브로인 미립구만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 높은 형광을 관찰할 수 있었으며, 이는 세포내에 성공적으로 도입되었음을 나타낸다.

또한 위와 동일한 실험이나 폴리브렌으로 개질된 피브로인 입자를 이용하여 세포내 도입을 관찰하였다. 이 경우, fibroplex의 피브로인 입자 대 펩타이드의 비는 1:300이었다.

결과는 도 11에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 피브로인 미립구만을 처리한 경우에는 세포에 전혀 도입이 되지 않으나, fibroplex로 처리한 경우에는 높은 형광을 관찰할 수 있었으며, 이는 세포내에 성공적으로 도입되었음을 나타낸다.

이어 지질로 개질된 피브로인 입자를 MC3T3-E1 세포이외에 HEK293 cell(ATCC, CRL-1573), NIH3T3 cell (ATCC, CRL-2594)에 대하여 위와 동일한 실험을 수행하여 FACS로 관찰하였다. 이를 위해 fibroplex를 30μg을 각 세포에 처리하였다. 이어 세포를 트립신으로 처리하여 접시에서 분리한 후 1500rpm 3분간 침강 시켜 세포를 수득하였다. 이어 4% 포르말린으로 고정한 후 FACS (BD science, UK) 를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다.

결과는 도 12에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이. MC3T3-E1 세포에 FITC로 표지한 실크 피브로인 미립구와 Fibroplex를 처리하고 24시간 이후 FACS로 세포 내 도입 효율을 비교한 결과 실크 피브로인 미립구는 2~3%의 세포에만 도입이 되었는 반면 Fibroplex는 99%의 세포에 도입된 것을 확인할 수 있으며, 이는 본원에 따라 개질된 미립구가 다양한 세포로 높은 전달효율로 전달이 가능함을 나타내는 것이다.

통상 미립구는 100nm 이하의 직경을 가지는 경우 또는 표면이 양전하를 띠는 경우 세포내로 도입이 일어난다고 알려져있다. 실크 피브로인 미립구는 평균 450nm의 직경을 가지고 있으며 표면 전하가 -20mV의 음전하를 나타내는 바 현재까지 세포 내 약물 전달 용도로 효율적이지 못하나, 양전하 지질로 표면의 전기화학적 성질을 개량한 Fibroplex는 단순한 피브로인 미립구에 비해 현저히 높은 세포질 도입 효율을 나타냈다.

부가적으로 Fibroplex의 세포 내 도입여부를 확인하기 위해 GFP를 하적한 Fibroplex를 MC3T3-E1 세포에 처리한 후 24시간 이후 Heparan sulphate(5unit/ml) PBS로 3회 wash 한 후 Confocal laser 현미경으로 관찰하였다. Z 축으로 세포의 크기와 유사한 약 5um높이 내에 핵 주변을 중심으로 세포질에 형광을 띠는 particle이 다수 관찰되었으며 이는 거의 모든 세포에서 나타나는 것을 확인할 수 있었다. Actin filament를 선택적으로 염색하는 Rho-palloidin 염색을 하여 관찰하였을 때 세포질의 분포와 유사한 범위 내에서 Fibroplex의 녹색 형광이 주로 나타났는 바Fibroplex는 세포 내로 들어가 있는 것으로 관찰되었다 (결과는 나타내지 않음). 이어 처리한 Fibroplex가 세포질 내에 존재한다는 것을 검증하기 위한 방법으로, Calcein-AM dye를 포함하는 Fibroplex를 MC3T3-E1 cell에 처리하였다. Calcein-AM은 세포질 내 존재하는 Esterase에 의해 효소 반응을 거쳐야만 특유의 녹색형광을 나타내는 Dye로서 대사를 멈춘 세포 또는 세포 외에서는 형광을 나타내지 않는다. MC3T3-E1 세포에 Calcein-AM을 포함하는 피브로인 미립구 및 Fibroplex를 처리하고 3시간 뒤 씻어내고 24시간 동안 배양한 결과, Calcein-AM을 포함하는 피브로인 미립구만을 처리한 군에서는 형광이 나타나지 않은 반면 Fibroplex를 처리한 군에서는 세포질 내부의 효소 반응에 의해 형광이 나타나는 것을 확인하였다(결과는 나타내지 않음). CLM에 의해 관찰한 결과에서는 세포질 내부에 도입된 Fibroplex의 주변으로 푸른색 형광이 관찰되었으며, FACS로 관찰한 결과 99%의 세포에서 형광이 나타나는 것으로 확인되었다.

실시예 4-2 피브로인 입자의 개질에 사용된 물질의 양에 따른 세포내 도입 효율

피브로인 입자와 양전하 지질을 혼합하여 상기 실시예에서와 같이 fibroplex를 만들 때 양전하 지질의 비율에 따른 미립구의 세포내 유입 변화를 조사하였다. 30μg의 피브로인 미립구에 도 13에 기재된 양으로 지질을 반응시켜 fibroplex를 얻은 뒤에, 이를 MC3T3-E1 cell에 처리하여, 24시간 뒤에 CLM으로 관찰하였다. 결과는 도 13에 나타난 바와 같이 피브로인 입자와 양전하 리포좀의 비율이 높을 수록 더 많은 양의 입자가 세포내로 유입되는 것을 나타낸다.

이어 위와 동일한 실험을 폴리브렌 또는 K15에 대하여 수행하였으며, 사용한 비율은 도 14에 기재된 바와 같다. 결과는 도 14에 나타난 바와 같이 비율 증가에 따라 피브로인 입자의 세포내로의 유입이 증가하였으며 나타내는 것을 표면의 양전하가 증가할 수록 세포내로의 도입 양이 증가하는 것을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (11)

1. 피브로인 입자의 코어 및 상기 코어를 피복하는 양전하성 물질의 외피층을 포함하는 약물 전달체로,
   상기 양전하성 물질은
   DOTAP (1,2-di-[cis-9-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine),
   15mer의 라이신 폴리펩타이드 또는
   폴리브렌(hexadimethrine bromide) 이고,
   상기 피브로인 대 양전하성 지질은 1:0.1 내지 1:5의 질량비로 포함되고, 상기 피브로인 대 폴리펩타이드는 1:0.1 내지 1:2의 질량비로 포함되고, 상기 피브로인 대 폴리브렌은 1:0.1 내지 1:1000의 질량비로 포함되는 것인, 약물 전달체.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 코어는 약학적 활성 물질을 추가로 포함하는 것인, 약물 전달체.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 약물 전달체를 포함하는 약물 전달용 조성물.
   
4. 제 1 항에 따른 약물 전달체의 제조방법으로 상기 방법은
   피브로인 미립구를 제공하는 단계; 및
   상기 피브로인 미립구와 양전하성 물질을 혼합하는 단계;
   상기 혼합 단계에 의해 생성된 혼합물을 초음파 처리하여 상기 미립구를 상기 양전하성 물질로 코팅하는 단계를 포함하는, 약물 전달체의 제조방법.
   
   
   
   
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