KR100864648B1

KR100864648B1 - 단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장 및 그 제작 방법

Info

Publication number: KR100864648B1
Application number: KR1020037014699A
Authority: KR
Inventors: 야수히코 다바타; 아키히코 사이토; 게죠후미타케; 후루요시시게오; 야마시타겐지
Original assignee: 가부시키가이샤 가네카; 야수히코 다바타; 아키히코 사이토
Priority date: 2001-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2008-10-23
Also published as: US20040235161A1; CA2445785A1; EP1388327A4; EP1388327B1; HK1064024A1; TWI221421B; WO2002091955A1; JPWO2002091955A1; CA2445785C; JP4181877B2; CN1509155A; CN100335015C; EP1388327A1; KR20040004621A

Abstract

본 발명은 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장 및 그 제작 방법을 제공한다.

본 발명은, 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 근위 세뇨관 세포의 단백질 대사 기능에 중추적인 역할을 하는 엔도사이도시스 수용체인 메갈린이 표면에 발현된 세포를 구성 성분으로 하는 단백질 대사 기능을 가진 체내형 인공 신장, 및

혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스폰지 시트와 메갈린을 표면에 발현한 세포를 사용하는, 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장을 제작하는 방법을 제공한다.

인공 신장, 근위 세뇨관, 혈관신생, 히드로겔

Description

단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장 및 그 제작 방법{ARTIFICIAL KIDNEY HAVING FUNCTION OF METABOLIZING PROTEIN AND METHOD OF CONSTRUCTING THE SAME}

본 발명은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린이 표면에 발현된 세포를 구성 성분으로 하는 단백질 대사 기능을 가진 인공 신장, 및 그 제작 방법에 관한 것이다.

일본에서, 말기 신부전 치료는, 신장 이식 공여자의 수가 부족하기 때문에, 혈액 투석 요법이 주를 이룬다. 그러나, 혈액 투석 요법도 본래의 신장 기능을 충분히 보완하지 못하기 때문에, 여러 합병증이 야기되어, 환자의 삶의 질(QOL: Quality Of Life)과 생명 예후(豫後)를 해치고 있다.

혈액 투석 요법의 약점은, 근위 세뇨관 세포가 갖는 사구체에 의해 여과된 단백질의 대사 기능을 보상할 수 없는 점이다. 따라서, 본래 그 세포에 의해서 대사되는 저분자량 단백질이 혈액 투석 환자의 체내에 축적되어, 요독소 단백질로서 작용함으로써, 다양한 질병을 일으킨다. 그 대표 예로는 β2-미크로글로부린 (β2-m)의 축적에 의한 투석 아밀로이도시스(amyloidosis)가 있으며, 골관절증 및/또는 장기 부전을 일으킨다. 또한, 혈액 투석 환자에서는, 당화 수식 단백질인 AGE도 축적되어, 동맥 경화나 장기 장해에 관계한다. 근년, 혈액 투석막이나 혈액 여과법이 개량되고, β2-m 흡착 컬럼이 실용화되었지만, 이들에도 한계가 있어서, 지속적으로 단백질 대사 기능을 충분히 보상할 수 있는 인공 신장의 개발이 요망되어 왔다.

이러한 요구를 만족시키기 위해, 근위 세뇨관 세포 기능을 보상하기 위한 세포 이용 시스템이 개발되고 있다. 예를 들면, Humes, HD et al.(Nature Biotech. 17, 451-453 (1999))은 혈액 여과기와 불사화 근위 세뇨관 상피 세포를 홀로 파이버(hollow fiber)의 내강에 부착(adhere)시킨 모듈을 조합하여, 여과 혈액을 근위 세뇨관 세포를 배양한 내강에 순환시키는 인공 신장을 보고하였고, 또한 Saito, Akira et al.(제44회 일본 투석 의학회(1999))은 원위 세뇨관 상피 세포를 사용한 동일한 인공 신장(세뇨관)을 보고하였다. 그러나, 이들은 모두 체외형의 디바이스이므로, 간헐적인 혈액 처리라는 체외 순환 요법의 약점을 극복할 수 없다.

[발명의 요약]

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해서, 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장 및 그 제작 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 저분자량 단백질이나 호르몬류 등과 결합하여 그들을 세포내로 도입(incoporate)하는 메갈린의 기능을 이용하여, 단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 근위 세뇨관 세포의 단백질 대사 기능의 중추적인 역할을 담당하는 엔도사이토시스 수용체인 메갈린이 표면에 발현된 세포를 구성 성분으로 하 는, 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린을 표면에 발현한 세포를 사용하는, 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 스펀지 시트에 주입하는 공정과, 그 스펀지 시트를 피하 이식하는 공정과, 이식된 그 스펀지 시트에 메갈린을 표면에 발현한 세포를 주입하는 공정을 포함하는 상기 인공 신장의 제작 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은,

혈관신생을 촉진하는 성장 인자가 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)이고;

상기 bFGF가 유전자 공학 기술에 의해 제조된 인간 bFGF이고;

상기 히드로겔이 젤라틴겔이고;

상기 젤라틴겔이 등전점 4.5∼5.5를 갖는 젤라틴종을 주성분으로 하고;

상기 스펀지 시트가 콜라겐으로 되고;

메갈린을 표면에 발현한 세포가, 인간 근위 세뇨관 상피 세포 및/또는 유전자 도입에 의해 메갈린을 고발현시킨 인간 근위 세뇨관 상피 세포이고; 및/또는

메갈린의 발현이 유전자 조작에 의한 것인, 상기 인공 신장 및 그 제작 방법에 관한 것이다.

[발명의 상세한 개시]

하기에, 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의한 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장은, 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린이 표면에 발현된 세포를 구성 성분으로 한다.

본 발명에 사용되는 혈관신생을 촉진하는 성장 인자로는, 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF; basic fibroblast growth factor), 산성 섬유아세포 증식 인자(aFGF; acidic fibroblast growth factor), 표피세포 증식 인자(EGF; epidermal growth factor), 트랜스포밍 성장 인자-α(TGF-α;transforming growth factor-α), 혈관내피세포 증식 인자(VEGF; vascular endotherial growth factor), 혈소판 유래 증식 인자-BB(PDGF-BB; platelet-derived growth factor-BB), 간세포 증식 인자(HGF; hepatocyte growth factor) 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 상술한 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 1종만 사용해도 좋고, 복수종을 조합하여 사용해도 좋다. 또한, 또다른 생물학적 활성을 갖는 인자를 조합하여 사용할 수도 있다.

상기 성장 인자 중, bFGF, PDGF-BB 등이 보다 강한 증식 활성을 발휘하는 관점에서 바람직하다. 또한, bFGF는 혈관신생 촉진 인자로서의 폭넓은 지견이 축적되어 있어, 보다 바람직하게 사용되는 성장 인자 중 하나이다.

본 발명에 사용되는 bFGF로는 뇌하수체, 뇌, 신장, 부신, 태반, 뼈 기질, 연골, 내피 세포 및 섬유아세포 등의 장기 또는 조직으로부터 추출된 종, 유전자 재조합 등의 유전공학 기술을 사용하여 제조한 종, 이들의 수식체 등의 섬유아세포 증식 인자로서 작용하는 종을 들 수 있다. 그 중에서도 유전자 공학 기술을 사용 하여 제조한 인간 bFGF는, 품질 및 공급의 안정성의 관점에서 특히 바람직하다. 또한, 상기 수식체로는 추출이나 유전자 공학 기술을 사용하여 얻은 bFGF의 아미노산 서열에 아미노산을 부가, 아미노산의 일부를 다른 아미노산으로 치환, 또는 아미노산의 일부를 결실함에 의해 유발된 것들을 들 수 있다. 본 발명에서는 이들의 bFGF를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 히드로겔은 함유된 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 그 주변에 서서히 방출함으로써, 혈관신생 효과를 지속시키기 위해서 사용한다.

본 발명에서 사용되는 히드로겔의 원재료로는, 예를 들면, 셀룰로스, 덱스트란, 아가로스, 풀룰란, 전분, 히알론산, 알긴산, 키틴 및 키토산 등의 다당류, 및, 히드록시에틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀룰로오스 등의 다당류 유도체; 폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산 및 폴리리신 등의 폴리아미노산; 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 글루텐 등의 폴리펩티드; 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리비닐메틸에테르, 폴리(N-비닐아세트아미드), 폴리아크릴산, 폴리(이소부틸렌-말레인산), 폴리(2-아크릴아미도-2-메틸프로판설폰산), 폴리아크릴옥시프로판설폰산, 폴리비닐설폰산, 폴리(메타크릴로일옥시에틸-4급화 암모늄클로라이드), 폴리비닐피리딘 및 폴리(N,N-디메틸-N-(2-메타크릴로일옥시에틸)-N-(3-설포프로필)암모늄 내부 염) 등의 친수성기를 측쇄에 갖는 합성 고분자; 및 폴리에틸렌글리콜, 폴리디옥솔란 및 폴리에틸렌이민 등의 주쇄 자체가 친수성인 합성 고분자 등을 들 수 있다.

본 발명에서는, 이들 재료를 단독 또는 적합하게 복수 조합하여 사용할 수 있고, 또한 다른 화합물에 의해 더 수식하여 사용해도 좋다.

상기 히드로겔의 원재료 중, 셀룰로오스, 히알론산, 알긴산, 키틴 및 키토산 등의 다당류, 폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산 및 폴리리신 등의 폴리아미노산, 및 젤라틴, 콜라겐 및 피브린 등의 폴리펩티드 등은, 생체 흡수성이 있으므로 바람직하다. 특히 젤라틴은 가공 용이성, 함유된 성장 인자의 생물학적 활성 유지, 및 생체내(in vivo) 분해 속도(성장 인자의 서방성)의 관점에서 바람직하게 사용된다.

젤라틴은 생체 유래의 콜라겐을 산이나 알칼리 등으로 적합한 전처리를 행한 후, 온수를 사용하여 가열 추출하여 얻을 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 통상 입수할 수 있는 것이면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 젤라틴으로는, 예를 들면, 등전점이 4.5∼5.5인 알칼리 처리 젤라틴 및 등전점이 8∼9인 산처리 젤라틴 등을 들 수 있다. 혈관신생 촉진 인자로서 bFGF를 사용하는 경우에는, bFGF의 등전점이 약 9이고, 중성 수용액 중에서는 양으로 대전하고 있기 때문에, bFGF의 유지성(retention)의 관점에서, 등전점이 4.5∼5.5의 알칼리 처리 젤라틴이 바람직하게 사용된다. 또한, 젤라틴은 1종류만이 아니라, 원료가 다른 것이나, 용해성, 분자량 및 등전점 등의 물성이 다른 것을 2종 이상 혼합하여 사용해도 좋다. 또, 젤라틴은 다른 첨가제를 함유해도 좋으며; 예를 들면, 일본 특개평8-325160에 개시되어 있는 바와 같이, bFGF의 서방성을 부여하기 위해서 폴리음이온 화합물 등을 부가한 것 등도 사용할 수 있다. 또한, 혈관신생 촉진 인자로서 bFGF를 사용하고, 젤라틴 이외의 상기한 다른 상기 히드로겔을 사용하는 경우에도, bFGF의 유지성의 관점에서, 그 히드로겔은 등전점이 낮은 것이 바람직하다.

혈관신생 촉진 효과의 지속 시간은, 사용하는 히드로겔의 생분해성 및 함수율에 의해서 변화시킬 수 있다.

혈관신생을 촉진하는 성장 인자의 서방성의 관점에서, 수중에서 팽윤시켰을 때의 히드로겔의 함수율은 80%이상이 바람직하고, 85∼99%이 보다 바람직하고, 90∼98%가 더욱 바람직하다.

히드로겔의 함수율(w)은 이하와 같은 방식으로 구할 수 있다.

히드로겔의 형상이 입자상인 경우에는, 함수율은 다음과 같이 산출한다:

W[%]=1OO×(V_W-V_D)/V_W

식 중, V_D는 동결건조시켜 탭핑(tapping)(히드로겔을 메스실린더에 채우고, 메스실린더에 물리적 자극을 가하여, 히드로겔을 조밀하게 충전한)한 후의 히드로겔 체적이며, V_W는 37℃에서 24시간, 수중에서 팽윤시켜 탭핑(tapping)한 후의 히드로겔 체적이다. 또한, V_D와 V_W의 측정 방법으로는, 예를 들면, 메스실린더를 약 5cm의 높이로부터 낙하시키는 조작을 반복하여, 체적의 변화가 없을 때의 체적을 읽어내는 방법을 들 수 있다. V_W는 수중에서의 히드로겔의 침강에 시간을 요하는 경우가 있기 때문에, 상기 낙하 조작을 10회 정도 행하고, 30분간 정치한 후 체적의 변화가 없을 때의 체적을 읽어냄으로써 측정한다.

하이드로겔이 입자상이 아닌 경우에는, 함수율은 다음과 같이 산출한다:

W[%]=100×(W_W-W_D)/W_W

식 중, W_W는 37℃에서 24시간, 수중에서 히드로겔을 팽윤시킨 뒤, 히드로겔의 부착수(水)나 히드로겔 입자간에 생기는 간극수(水)를 흡인여과법이나 원심법 등에 의해 제거했을 때의 히드로겔의 (습윤)중량이고, W_D는 중량이 변화하지 않을 때까지 뒤이은 건조시킨 후의 히드로겔 (건조)중량이다.

습윤 중량을 구하는 구체적인 방법으로는, 예를 들면 히드로겔을 글라스 필터상에 놓고, 아스피레이터(aspirator)를 사용하여 히드로겔을 흡인하고, 흡인 시간과 중량의 관계를 나타내는 중량 감소 곡선을 작성하여, 곡선의 기울기가 완만하게 되는 흡인 시간의 경과 후에 중량을 측정하는 방법을 들 수 있다. 건조 방법으로는, 항량을 얻을 수 있는 방법이면 특별한 제한은 없으나, 상압하의 105℃ 이상의 온도에서의 상압 건조가, 어떠한 특별한 장치가 필요없이 간편하게 채용할 수 있다. 다만, 이 온도에서의 건조에 의해 분해 등의 현상이 일어나는 경우에는, 동결 건조 등의 저온에서의 감압 건조 방법을 채용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 히드로겔은, 상기 원재료가 수용성인 경우에는 가교에 의해 수(水)불용화하여 얻는다. 또, 상기 재료의 유래나 성질 등에 따라, 열처리, 자외선이나 γ선의 조사, 경화제와의 반응 등의 가교 방법을 사용할 수 있다.

경화제로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 히드로겔의 재료로서 젤라틴을 사용하는 경우, 알루미늄이나 철 이온 등의 다가 금속 이온을 함유하는 염 등의 무기 화합물; 글루타르알데히드 및 포르말린 등의 알데히드류; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드 및 1-시클로헥실-3-(2-몰포리노 에틸)카보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트 등의 카보디이미드류; 에피클로로히드린 및 부탄디올디글리시딜 에테르 등의 에폭시 화합물, 이소시아네이트류(대표적으로 헥사메틸렌디이소시아네이트), 산무수물류 등의 유기 화합물을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 히드로겔의 형상으로는, 기둥상, 시트상, 디스크상, 구상, 입자상, 부정형 등을 들 수 있지만, 스펀지 시트로의 주입의 용이함의 관점에서, 구상, 입자상, 부정형의 것이 바람직하게 사용된다.

또한, 히드로겔의 크기로는, 평균 입경이 10㎛∼200㎛가 바람직하고, 20㎛∼150㎛가 보다 바람직하다.

본 발명에 사용되는 스펀지 시트는 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 고정하고 표면에 메갈린이 발현된 세포를 유지하기 위한 다공질 시트이다.

스펀지 시트의 원재료로는 상술한 히드로겔의 원재료 외에, 폴리글리콜산, 폴리젖산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리히드록시아세트산 및 폴리히드록시발레르산, 폴리트리메틸렌 카보네이트, 폴리(α-시아노아크릴레이트) 등의 생체흡수성 재료, 및 폴리우레핀 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 이들 재료를 단독 또는 복수 조합하여 사용할 수 있고, 또다른 화합물에 의해 수식하여 사용할 수도 있다.

상기 스펀지 시트의 원재료 중, 콜라겐, 폴리글리콜산, 폴리젖산 등이 생체적합성 재료로서의 실용적인 관점에서 바람직하다. 특히, 콜라겐 스펀지 시트는 생세포의 부착성이 양호하므로 바람직하게 사용된다.

본 발명에 사용되는 스펀지 시트는 다공 구조를 갖는다. 신생 혈관의 침입의 용이성 및 주입되는 세포에 산소나 영양분 공급의 용이성의 관점에서, 서로 통해있는 구멍을 가진 전(全)다공 구조를 갖는 것이 바람직하다.

그들의 평균 구멍 직경으로는, 60∼400㎛가 바람직하고, 70∼150㎛가 보다 바람직하다.

메갈린은, 본 발명자인 사이토 등이, 래트에서의 cDNA 클로닝에 성공하여, 전장(full-length) 1차 구조를 해석한 근위 세뇨관 세포의 단백질 대사 기능의 중심적 역할을 담당하는 엔도사이토시스 수용체이다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, pp.9725-9729 (1994)). 그 후, Hjalm G 등에 의해서, 인간의 메갈린/gp330이 클로닝된 전장 1차 구조가 해석되었다(Eur. J. Biochem. 239, pp.132-137, 1996)). 인간 메갈린은 4655-aa(분자량 519, 636)으로 구성되는 것으로 추정되고, N-말단(25-aa), 세포외 영역(4398-aa), 막관통 도메인(23-aa), C-말단 세포질내 영역(209-aa)으로 구성되고, 세포외 영역은 3 타입의 시스테인-리치 영역을 가지며, 상기 메갈린 유전자는 LDL 수용체 유전자 패밀리에 속하는 것으로 알려져 있다.

메갈린은 PAI-1, PAI-1 우로키나제, PAI-1-tPA, 프로우로키나제, 리포단백질 리파아제 및 아프로티닌 등의 효소류 및 효소 저해제류, 비타민 D 결합 단백질 및 레티놀 결합 단백질 등의 비타민 결합 단백질류, 아포리포단백질 B 및 아포리포단백질 E 등의 아포리포단백질류, 아미노글리코시드 및 폴리믹신 B 등의 염기성 폴리펩티드류, 및 부갑상선 호르몬, 인슐린, β2-m, 표피세포 증식 인자, 프로락틴, 라이소자임 및 시트크롬 c 등의 저분자량 단백질류 및 호르몬류에 결합함이 보고된 다관능 엔도사이토시스 수용체이다.

메갈린은 예를 들면, 인간에서는 신장의 근위 세뇨관 상피 세포 뿐만 아니라, 부갑상선(상피 소체)세포, 태반융모간강 중의 상피성 세포층, 정소상체 상피 세포, 타입 II 폐포 상피 세포, 유방 상피 세포, 갑상선 소포 세포, 안구 모양체 상피 세포 등의 표면에 발현해 있는 것이 확인되었다. 그래서, 이들 세포는 메갈린 발현 세포라 칭할 수 있다. 상술한 세포 중에서, 환자 자가의 잔존신장으로부터 채취한 근위 세뇨관 상피 세포가 가장 바람직하게 사용된다.

본 발명에 사용되는 메갈린이 표면에 발현된 세포로는, 자가 또는 타가의 상술한 메갈린 발현 세포 이외에, 자가 또는 타가의 메갈린 발현 세포에 유전자 도입(gene transfer)을 행하여 메갈린을 고발현시킨 세포, 자가 또는 타가의 메갈린 비발현 세포에 유전자 도입을 행하여 메갈린을 발현시킨 세포, 또는 배아세포(embryonic cell)나 간(幹)세포(stem cell) 등으로부터 메갈린 발현 세포로 분화 유도한 세포 등을 들 수 있다. 또한, 유전자 도입 방법으로는 기존의 물리적 방법, 화학적 방법, 생물학적 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 분화 유도 방법으로는, 예를 들면, 분화 유도 물질을 첨가하는 방법, 다른 세포와 공배양하는 방법, 및 온도, 압력, pH, 침투압 등의 환경적인 인자를 변화시키는 방법 등을 사용할 수 있다.

상기 메갈린을 표면에 발현한 세포 중, 체내에 이식한 세포의 배제성(excludability)의 관점에서, 자가 세포인 것이 바람직하다. 인간 근위뇨 세관 상피 세포 및/또는 유전자 도입에 의해 메갈린을 고발현시킨 인간 근위 세뇨관 상피 세포인 것이 보다 바람직하다.

메갈린 비발현 세포로는, 환자의 자가 말초 혈액(peripheral blood)으로부터 유래하는 식세포능이 높은 마크로파지형 세포가 기술적으로 용이하다는 관점에서 바람직하게 사용된다.

또한, 메갈린의 발현은 유전자 조작에 의해 것이 바람직하다.

다음에, 본 발명에 의한 체내형 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법에 대해서 설명한다.

본 발명의 인공 신장은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린을 표면에 발현한 세포를 사용하여 제작된다. 바람직하게는, 인공 신장의 제작 방법은 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 스펀지 시트에 주입하는 공정과, 그 스펀지 시트를 피하에 이식하는 공정과, 이식된 스펀지 시트에 메갈린이 표면에 발현된 세포를 주입하는 공정을 포함한다.

상기 히드로겔은 공지의 방법을 특별한 제한없이 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 수소 결합, 이온 결합, 배위 결합 등에 의한 분자간의 물리적 응집 현상을 이용하는 방법, 가교제를 사용하여 화학적으로 가교하는 방법, 광이나 방사선 조사에 의해 가교하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 히드로겔의 성형(제조) 방법으로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 입자상 히드로겔의 제조에는 에멀션법, 용융 성형법, 스프레이 드라이법 등을 이용할 수 있다.

혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 히드로겔에 함유시키기 위해서는, 혈관신 생을 촉진하는 성장 인자의 생물학적 활성이 너무 손상되지 않는 한 어떠한 방법이라도 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 히드로겔을 제조한 후에 건조시킨 다음, 이것에 성장 인자를 함유하는 용액을 함침시키는 방법, 또는 제조된 히드로겔을 건조시키지 않은 채로 성장 인자 함유 용액에 함침시키는 방법, 또는 히드로겔의 제조 시에 그 원액 중에 성장 인자를 존재시키는 방법 등을 들 수 있다.

혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔은, 예를 들면 주사기를 사용하여 스펀지 시트에 주입할 수 있다.

스펀지 시트는 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 고정시키기 위하여, 및 메갈린을 표면에 발현한 세포를 유지하기 위해서, 피하 등의 생체내로 이식하여 이용된다. 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 스폰지 시트에 주입한 후, 그 스폰지 시트를 이식해도 좋고, 또는 스펀지 시트를 이식한 뒤, 이식된 스폰지 시트에 히드로겔을 주입해도 좋다.

본 발명의 체내형 인공 신장은, 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔이 주입된, 생체내에 이식되어 있는 스펀지 시트에, 메갈린을 표면에 발현한 세포를 주입함에 의해 제작할 수 있다.

메갈린을 표면에 발현한 세포는, 예를 들면, 주사기, 마이크로캐피랠리 등에 의해 스펀지 시트에 주입할 수 있다.

메갈린을 표면에 발현한 세포의 주입 타이밍에 특별한 제한은 없지만, 메갈린을 표면에 발현한 생세포의 부착 및 증식을 보장하기 위해서, 혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트를 이식한 뒤, 또는 미리 이식해 놓은 스펀지 시트에 성장 인자 함유 히드로겔을 주입한 후, 혈관신생에 필요한 일수(日數)가 경과한 시점에, 주입하는 것이 바람직하다. 이 혈관신생에 필요한 일수는 사용하는 혈관신생 촉진 성장 인자 및 히드로겔의 특성에 따라 달라진다. 예를 들면, bFGF를 함유하는 알칼리-처리 젤라틴 겔을 사용하는 경우에는, 필요한 일수가 대체로 3∼8일이다.

도 1은 실시예와 비교예의 여러 조직에의 ¹²⁵I-표지 β2-m의 도입에 관한 데이터를 나타내는 그래프이다. 도면 중에서, 표기는 이하와 같다.

transpl.;실시예, cont.;비교예, T;이식세포 종류(phyma), L;간, P;폐, H;심장, S;골격근.

도 2는 이식 세포에 도입된 ¹²⁵I-표지 β2-m의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 결과를 나타낸 도면이다. 또한, 도면 중의 각 레인의 샘플은 이하와 같다.

레인1; 복강내 투여에 사용한 ¹²⁵I-표지 β2-m,

레인2; 시험 후 채취한 이식 세포 종류(phyma)의 호모게네이트,

레인3; 시험 후 채취한 세포 이식 마우스의 혈액.

도 3은 실시예와 비교예에서의 혈액의 트리클로로아세트산(TCA) 침전 중의 방사성 동위체 카운트 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도면 중의 표기는 이하와 같다.

대조군; 비교예,

이식군; 실시예.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

(1) bFGF 함유 젤라틴 겔 입자의 제조

bFGF 함유 젤라틴 겔 입자는 Tabata 등(Tabata, Y., et al, J. Biomateri. Sci. Polymer Edn., 10:957-968, 1999)의 방법에 의해 제조하였다. 즉, 40℃에서 예열한 10중량%의 알칼리 처리 젤라틴(등전점 5.0) 수용액(Nitta Gelatin제) 10㎖와 25중량%의 글루타르알데히드 수용액 25㎕를 혼합하고, 그 혼합물을 40℃, 425rpm으로 교반하면서 375㎖의 올리브유 중에 적하 첨가하여, w/o 에멀젼을 형성시켰다. 그 후 25℃에서 24시간 교반을 계속하여 젤란틴을 화학적으로 가교시켰다. 이것에 100㎖의 아세톤을 첨가한 뒤, 얻어진 입자를 원심분리(4℃, 3000rpm, 5분간)에 의해 모으고, 5회의 아세톤 중에서의 원심분리로 세정하였다. 세정 후의 입자를, 0.1중량%의 Tween80을 함유하는 100㎖의 100mM 글리신 수용액 중에서 37℃, 1시간 유지함으로써, 글루타르알데히드 기원의 잔류 미반응 알데히드기를 블로킹(blocking)하였다. 이렇게 얻어진 가교 젤라틴 입자는 2회의 증류수 중에서의 원심분리로 세정한 뒤, 동결건조시켜, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하였다. 37℃의 수중에서 24시간 팽윤시킨 뒤의 젤라틴 겔 입자의 함수율은 95%였다. 또, 광학 현 미경으로 입자 크기(직경)를 측정한 결과, 60∼130㎛였다. 등전점 9.6의 재조합 bFGF 수용액(Kaken Pharmaceutical Co.제) 10mg/㎖(10㎕)를, 상기에서 얻어진 2mg의 건조 젤라틴 겔 입자에 적하하여 첨가하고, 25℃에서 1시간 방치하여, bFGF 함유 젤라틴 겔 입자를 얻었다.

(2) 겔 스펀지 시트의 제조

0.3%의 아테로콜라겐 염산 용액(pH3.0)을 냉장 호모게나이저를 사용하여 1800∼2000rpm으로 60분간 교반하였다. 거품이 생긴 용액을 금형에 부어 넣어 -40℃로 급속히 동결시켜, 48시간 동결 건조하고, 감압 하, 105℃에서 24시간 건조시켰다. 그 후, 0.2% 글루타르알데히드의 0.05M 아세트산 용액 중에서, 4℃, 24시간동안 가교시킨 다음, 그 성형물을 인산 완충화 생리식염액(PBS)(pH 7.4)으로 세정하고, 15%의 에탄올 수용액에 침지시킨다. 그 후, 그 성형물을 -135℃에서 급속히 동결시키고, 동결건조(48시간)한 후, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하여, 콜라겐 스펀지 시트를 얻었다.

(3) 메갈린 발현 세포의 피하 이식

상기(1)에서 얻어진 bFGF 함유 젤라틴 겔 입자를 0.15㎖의 PBS에 현탁시키고, 그 현택액을 상기(2)에서 얻어진 1cm×1cm×0.5cm의 콜라겐 스펀지 시트에 1㎖용 주사기(23G 주사바늘)를 사용하여 주입하였다. 그 스펀지 시트를, 디에틸에테르 흡입에 의한 마취 하에, 5주된 암컷 누드 마우스(BALB/.cA Jc1-nu; CLEA Japan)의 등측의 피하에 이식하였다.

1주일 후, 혈관신생을 병리학적으로 확인한 스펀지 시트에, 10%(vol/vol)의 신생아기 소 혈청(neonatal bovine serum)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle 배지(LIFE TECHNOLOGIES, GIBCO BRL, Rockville, MD, USA)에서 배양한, 메갈린을 표면에 발현한 세포인 래트 난황낭 상피 암세포 유래의 세포(rat yolk sac epithelial cancer cell)(L2 세포)를 PBS 중에 현탁(1×1O⁷/㎖)시킨 O.15㎖의 세포 현탁액을, 마우스의 마취 하에, 1㎖용 주사기(23G 주사바늘)을 사용하여 주입하였다. 세포 주입 2주 후에, 세포 종류(phyma)의 최장 직경이 2cm이상일 때, 마우스의 양쪽 신장을, 마취 하에, 등측으로부터 외과적으로 잘라내어, 신부전 상태로 하였다. 이식한 L2 세포의 전이는 관측되지 않았다.

(비교예)

상기 실시예의 (3)에서, 세포 현탁액은 주입하지 않고, PBS만을 콜라겐 스펀지 시트에 주입한 것 외에는 실시예와 동일한 방법으로 행하였다.

(시험예)

상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 신부전 상태의 마우스를 사용하여, 이하의 시험을 행하였다.

(1)β2-미크로글로불린(Oriental Yeast Co.제)을 IODOGEN(Pierce사제)을 사용하여 ¹²⁵I-표지하였다. 요오드화의 비(比)활성은 6×10³cpm/ng 단백질이었다. ¹²⁵I-표지 β2-m은 1lng/㎕의 농도로 되도록 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 함유 PBS로 희석하였다. 상기 신부전 상태의 15마리의 마우스의 각각에 ¹²⁵I-표지 β2-m(2.8㎍/250㎕)을 복강내 투여하고, 이하의 각 항목을 평가하기 위해서, ¹²⁵I-표지 β2-m 투여 후, 3, 6 및 14시간 후에, 각각 5마리의 마우스의 전신을 생리 식염액으로 관류시켜 도살하였다.

(2) 도살한 각 마우스로부터, 이식된 세포 종류(phyma), 심장, 폐, 간 및 골격근을 채취하여, 각 조직·기관의 중량을 측정한 다음, 에펜도르프 튜브 중에서 감마선의 계수를 행하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1은 실시예와 비교예에서의 조직으로의 ¹²⁵I-표지 β2-m의 도입에 관한 데이터를 나타내는 그래프이다. 세로축은 조직 단위 중량당의 ¹²⁵I 카운트를 나타낸다. 이식된 세포에서의 ¹²⁵I 카운트는, 측정 시간에 관계없이, 항상 심장, 폐, 간 및 골격근에서의 ¹²⁵I 카운트보다 유의(*:p<0.05)하게 높았다. 한편, 심장, 폐, 간 및 골격근에서의 ¹²⁵I 카운트는, 실시예 및 비교예 간에 측정시간에 관계없이 유의 차는 없었다. 이들은, 이식 세포에 ¹²⁵I-표지 β2-m가 효율적으로 삽입되어 있음을 나타낸다.

(3) 또한, 이식된 세포 종류(phyma)를, 2%의 β-머캅토에탄올을 첨가한 Laemmli 샘플 완충액 중에서, ULTRA TURRAX(IKA LABORTECHNIK, Staufen, Germany)를 사용하여 호모게네이트하여, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동분석에 제공하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.

도 2는 이식 세포에 도입된 ¹²⁵I-표지 β2-m의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동분석의 결과를 나타낸 도면이다. 복강내 투여에 사용한 ¹²⁵I-표지 β2-m와의 비교에 의해, 이식 세포는 ¹²⁵I-표지 β2-m 단량체와 그 분해물을 함유하고 있음을 알 수 있다. 한편, 세포 이식을 받은 마우스의 혈액 샘플에서는, 분해물 외에도 β2-m 연쇄상체(concatemer)가 이식 세포중에서 대량으로 관측되었다. 이 결과들은, 이식 세포 중의 방사성 동위체 카운트는 혈액 중의 불순물에 의한 것이 아니라, 이식 세포 중에 도입된 β2-m의 분해에 의한 것을 의미한다고 할 수 있다.

(4) 또한, 도살 후의 각 마우스로부터 혈액을 채취하고, 10㎕의 혈액 샘플을 415㎕의 1% BSA함유 PBS와 혼합한 뒤, 75㎕의 100% 트리클로로아세트산(이하, TCA)과 혼합하고, 미분해 단백질을 침전시켜, 원심분리한 뒤, 침전된 단백질을 γ카운터로 계수하여, 혈액 중의 미분해 ¹²⁵I-표지 β2-m 양을 평가하였다. 그 결과를 도 3에서 나타낸다.

도 3은 실시예와 비교예에서의 혈액의 TCA 침전 중의 방사성 동위체 카운트 결과를 나타낸 그래프이다. ¹²⁵I-표지 β2-m 투여 6 및 14 시간 후에, 혈액의 TCA 침전 중의 방사성 동위체 카운트는 비교예에 비해서 실시예에서 유의(*: p < 0.05)하게 감소하였다. 이것은 ¹²⁵I-표지 β2-m이 비교예에 비해서 실시예에서 보다 대량으로 분해됨을 나타낸다. 즉, 상기 이식 세포가 단백질 대사 기능을 발휘함을 나타낸다.

본 발명의 단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장은 생체내에서 기능을 발휘할 수 있어, 신부전 환자의 QOL의 개선에 유용하다.

Claims

혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린이 표면에 발현된 세포를 구성 성분으로 하는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제1항에 있어서,

혈관신생을 촉진하는 성장 인자가 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제2항에 있어서,

bFGF가 유전자 공학 기술에 의하여 제조한 인간 bFGF인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제1항에 있어서,

히드로겔이 젤라틴 겔인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제4항에 있어서,

젤라틴 겔이 등전점 4.5∼5.5의 젤라틴을 주성분으로 하는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제1항에 있어서,

스펀지 시트가 콜라겐으로 되는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제1항에 있어서,

메갈린이 표면에 발현된 세포가, 인간 근위 세뇨관 상피 세포 및/또는 유전자 도입(gene transfer)에 의해 메갈린을 고발현시킨 인간 근위 세뇨관 상피 세포인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
제1항에 있어서,

메갈린의 발현이 유전자 조작에 의한 것인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장.
혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 주입한 스펀지 시트와, 메갈린이 표면에 발현된 세포를 사용하는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법으로서,

혈관신생을 촉진하는 성장 인자를 함유하는 히드로겔을 스펀지 시트에 주입하는 공정과, 그 스펀지 시트를 피하에 이식하는 공정과, 이식된 그 스펀지 시트에 메갈린이 표면에 발현된 세포를 주입하는 공정을 포함하는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
삭제
제9항에 있어서,

혈관신생을 촉진하는 성장 인자가 bFGF인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제11항에 있어서,

bFGF가 유전자 공학 기술에 의하여 제조한 인간 bFGF인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제9항에 있어서,

히드로겔이 젤라틴 겔인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제13항에 있어서,

젤라틴 겔이 등전점 4.5∼5.5의 젤라틴을 주성분으로 하는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제9항에 있어서,

스펀지 시트가 콜라겐으로 되는 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제9항에 있어서,

메갈린이 표면에 발현된 세포가, 인간 근위 세뇨관 상피 세포 및/또는 유전자 도입에 의해 메갈린을 고발현시킨 인간 근위 세뇨관 상피 세포인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.
제9항에 있어서,

메갈린의 발현이 유전자 조작에 의한 것인 단백질 대사 기능을 갖는 체내형 인공 신장의 제작 방법.