JPH10503098A

JPH10503098A - 生体人工細胞外マトリックスのための組成物および方法

Info

Publication number: JPH10503098A
Application number: JP8505272A
Authority: JP
Inventors: ラヴィブイ．ベランコンダ，; ジョンピー．ラニエリー，; パトリックアエビッシャー，
Original assignee: サイトセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-07-20
Filing date: 1995-07-20
Publication date: 1998-03-24
Also published as: IL114672A; US6156572A; KR970704481A; EP0772466A1; FI970218A0; ATE255425T1; IL114672A0; DE69532240D1; EP0772466B1; WO1996002286A1; AU3142395A; US5834029A; CA2194493A1; FI970218A; ZA956033B; NO970155D0; NO970155L; TR199500883A2; TR199500884A2

Abstract

(57)【要約】生体人工3-D細胞外マトリックスのための方法および組成物であって、ここで該マトリックスは、少なくとも１つのECM接着性分子またはそれらの接着性ペプチドフラグメントで誘導体化される。

Description

【発明の詳細な説明】生体人工細胞外マトリックスのための組成物および方法発明の分野本発明は、生体人工細胞外マトリックスのための組成物および方法に関する。発明の背景神経系における組織操作は、損傷組織の機能的置換および神経系再生を取り扱う。三次元(3-D)で細胞を組織化する能力は、組織操作の重要な構成要素である。細胞の挙動は、それらの内因性遺伝子プログラムおよび細胞外環境の両方により影響される。細胞外環境は、「受動的な」構造的構成要素および生物学的に「能動的な」構成要素を含む。多細胞生物中のほとんどの細胞は、細胞外マトリックス(ECM)を構成する、相互作用している細胞外高分子の複雑な網構造と接触状態にある。これらの高分子（主にタンパク質および多糖類）は、ほとんどの組織の細胞外隙において、局所的に分泌され、そして組織化3-D網構造にアセンブルされる。ECM分子は、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンを含み、このECM分子としては、例えば、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ラミニン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエラスチンが挙げられる。一般的な生体接着剤として供することに加えて、ECM分子はまた、高度に特殊化された構造体（例えば、軟骨、腱、基底膜、ならびに（リン酸カルシウムの二次沈着と共に）骨および歯）を形成する。 Albertsら、Molecular Biology of the Cell，Garland，NY．802-24頁（1989）。細胞外マトリックスは、細胞内骨格の組織化、細胞分化、ならびに細胞および組織の空間構築を調節する。実際、ECMは、細胞発生、移動、増殖、分化、形状、極性、および代謝機能に影響することにより、このECMと接触する細胞の挙動を調節することにおいて重要な役割を果たす。細胞付着を担ういくつかのペプチド活性部位が、種々のECM分子において同定されている。インビボにおいて、ラミニン(LN)免疫反応性が、胚のいくつかの領域において検出されている。この領域は、筋（ChuiおよびSanes、Dev ．Bio.，103，456-67 頁(1984)）、脊髄（Azziら、Matrix，9，479-85頁(1989)）、脊髄根（Rogersら、Dev ．Biol.，113，429-35頁(1986)）、視覚神経（McLoonら、J ．Neurosci.，8 ，1981-90頁(1988)）、大脳皮質（Liesi、EMBO，4，1163-70頁(1985)；Zhou，De v ．Brain Res. ，55，191-201頁(1990)）、海馬（Gordon-Weeksら、J ．Neurocyto l. ，18，451-63頁(1989)）、および中脳の内側縦束（Letourneauら、Developmen t ，105，505-19頁(1989)）を包含する。トリペプチド配列RGD（ArgGlyAsp；配列番号２のAA₂-AA₄）は、フィブロネクチン（PierschbacherおよびRuoslahti、Science，309，30-33頁(1984)）、ラミニン（Grantら、Cell，58，933-43頁(1989)）、エンタクチン（Durkinら、J ．Ce ll．Biol. ，107，2329-40頁(1988)）、ビトロネクチン（Suzukiら、EMBO，4，25 19-24頁(1985)）、Ｉ型コラーゲン（Dedharら、J ．Cell．Biol.，107，2749-56 頁(1987)）、IV型コラーゲン（Aumailleyら、Exp ．Cell Res.，187，463-74頁(1 989)）、トロンボスポンジン（Lawlerら、J ．Cell．Biol.，107，2351-61頁(198 8)）、およびテネイシン（Friedlanderら、J ．Cell．Biol.，107，2329-40頁(19 88)）の細胞接着特性のいくらかを担うことが同定されている。配列YIGSR（TyrIleGlySerArg；配列番号１のAA₅-AA₉）は、ラミニンのB1鎖上に見出されるが、これは上皮細胞付着を促進し（Grafら、Biochemistry，26，68 96-900頁(1987)）、そして腫瘍転移を阻害する（Iwamotoら、Science，238，113 2-34頁(1987)）。ラミニンのＡ鎖上に見出されるIKVAV配列は、神経突起成長を促進することが報告されている（Tashiroら、J ．Biol．Chem.，264，16174-182頁(1989)；Jucke rら、J ．Neurosci．Res．28，507-17頁(1991)）。これらのペプチド配列を用いる細胞付着および神経突起促進の全ての研究は、平坦な二次元の基質上で実施された（Smallheiserら、Dev ．Brain Res.，12，13 6-40頁(1984)；Grafら、Biochemistry，26，6896-900頁(1987)；Sephelら、Bi ochem ．Biophys．Res．Comm. ，2，821-29頁(1989)；Juckerら、J ．Neurosci．Re s. ，28，507-17頁(1991)）。培養基質の物理的性質および化学的性質は、細胞付着および神経突起伸長に影響を及ぼす。2-D培養基質の物理的微細構造は、細胞挙動に影響を及ぼし得る。許容性および非許容性の培養表面化学的性質の使用は、2-Dにおける神経誘導を促進する。種々の血清タンパク質（例えば、アルブミンおよびフィブロネクチン）の細胞付着調節機能は、それらが吸着される培養基質の化学的性質に依存している。遺伝子発現は、平坦な2-D基質により、水和3-D基質とは対照的に、異なった様式で調節されることが報告されている。例えば、初代ウサギ関節軟骨細胞およびヒト骨端軟骨細胞を2-D組織培養基質上で単層培養することにより、初代軟骨細胞はそれらの分化表現型を喪失する。分化軟骨細胞表現型は、それらが3-Dアガロースゲルにおいて培養される場合、再び発現される（BenyaおよびShaffer、Ce ll ，30，215-24頁(1982)；Aulthouseら、In Vitro Cell Dev ．Bio.，25，659-68 頁(1989)）。同様に、初代胆管上皮細胞におけるアルカリホスファターゼ遺伝子発現は、それた場合、2-D培養物とは対照的に、異なった様式で調節される（Mathisら、Can cer Res. ，48，6145-53頁(1988)）。従って、ECM成分を3-Dで提示することは、細胞または組織の応答への影響において、インビボ環境をより良好に模倣し得る。特に、ECM生体分子のインビボでの使用は、効率を最適にするために、このような3-Dシステムを必要とし得る。E CM分子またはそれらの活性部分を提示する規定の生体人工3-Dマトリックスの開発は、3-Dでのインビトロおよびインビボの細胞操作および細胞培養を可能にすることにより、神経系において組織操作を促進する。例えば、Koebeら、Cryobio logy 、27、576-84頁(1990)を参照のこと。さらに、規定の生合成マトリックスを開発する必要がある。なぜなら、いくつるために、そのECMは、いくつかのインビトロおよびインビボでの適用に対して興味のないものとなる。さらに、天然に存在するECM成分（例えば、コラーゲン）は生体内で酵素分解され得るが、合成ECMは、あまり分解を受けないようである。発明の要旨本発明は、三次元ヒドロゲルベースの生合成細胞外マトリックス(ECM)等価物、およびその製造方法を提供する。種々のECM接着性ペプチドおよびタンパク質での誘導体化を受けやすい化学的性質を有するアガロースマトリックスは、本発明の3-Dヒドロゲル基質の形成において好ましい。これらの生物学的に活性な3-D テンプレートは、組織再生または置換の促進において有用であり得る。図面の簡単な説明図１。平均孔半径(Y1)および培養72時間後の神経突起を伸長させる線条体細胞のパーセント(Y2)に対するアガロースゲル濃度の影響を示す二重Ｙ軸プロット。孔半径は、異なるゲル濃度の水圧透過性測定により算定した。孔半径のデータ点を通る実線は、ｒ²＝0.985での指数関数曲線適合（exponential fit）である。図２。CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）オリゴペプチドのアガロースゲルへの固定化のためのアガロビオース単位およびカルボニルジイミダゾールカップリング化学の模式図。図３。総神経突起拡張領域／神経節細胞体領域（TGSA/GCBA）の比としてE9ヒヨコDRG神経突起拡張を示すヒストグラム。種々のゲル中の神経突起拡張を、２日目のAg-Plainゲル中の神経突起拡張のパーセンテージとしてプロットする（ｎ＝６）。エラーバーは、標準偏差を表す；「^★」は、Ag-Plainに対して、統計学的に有意なより高い神経突起拡張（ｐ＜0.05）を示す。「＃」は、Ag-Plainに対して、統計学的に有意なより低い神経突起拡張（ｐ＜0.05）を示す。図４。非誘導体化および誘導体化アガロースゲルにおけるE9ヒヨコDRG神経突起伸長比較のヒストグラム（ｎ＝６）。エラーバーは、標準偏差を表す。「^★」は、Ag-Plainに比較して、統計学的に有意なより高い神経突起長（ｐ＜0.05）を示す；「＃」は、Ag-Plainに比較して、統計学的に有意なより低い神経突起長（ｐ＜0.05）を示す。図５。非誘導体化および誘導体化アガロースゲルにおけるPC12神経突起伸長比較を示すヒストグラム（ｎ＝６）。エラーバーは、標準偏差を表す。「^★」は、 Ag-Plainに対して有意な差異があることを示す（ｐ＜0.05）；「＃」は、全ての他のLNオリゴペプチド誘導体化アガロースゲルに対して有意な差異があることを示す（ｐ＜0.05）。図６。神経誘導チャンネルを有する4.0mmの神経隙を横断する後根再生の模式図。このチャンネルの管腔はアガロースゲルでロードされている。図７。AgPlainゲルおよびAg-CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）ゲルを満たしたポリマー誘導チャンネルに沿って４週間で再生されたミエリン化軸索の数を示すグラフ。「^★」は、スチューデントｔ検定を用いて、ｐ＜0.05で統計学的に有意な差異があることを示す。図８。AgPlainおよびAg-CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）ゲルを満たしたポリマー誘導チャンネルに沿って４週間で再生されたミエリン化軸索の密度を示すグラフ。「^★」は、スチューデントｔ検定を用いて、ｐ＜ 0.05で統計学的に有意な差異があることを示す。図９。Ａ）生理食塩水；Ｂ）AgPlainゲル、およびＣ）Ag-CDPGYIGSR（CysAspP roGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を満たしたポリマー誘導チャンネル中の近位神経断端から2.0mmの距離での腓腹神経の再生における、ミエリン化軸索の数を示すヒストグラム。「^★」は、生理食塩水またはAgPlainと比較した場合、ｐ＜0.05で統計学的に有意な差異があることを示す。スチューデントｔ検定を用いて、統計学的な有意性を評価した。図１０。Ａ）生理食塩水；Ｂ）AgPlainゲル、およびＣ）Ag-CDPGYIGSR（CysAs pProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を満たしたポリマー誘導チャンネル中の近位神経断端から2.0mmの距離での腓腹神経の再生における、ミエリン化軸索の密度を示すヒストグラム。「^★」は、生理食塩水またはAgPlainと比較した場合、ｐ＜0.05で統計学的に有意な差異があることを示す。スチューデントｔ検定を用いて、統計学的な有意性を評価した。発明の詳細な説明本発明は、生合成のヒドロゲルベースの三次元生体人工ECMを提供する。本発明の生体人工細胞外マトリックスは、3-Dで細胞を操作する可能性を提供し、そしてインビトロおよびインビボでの組織操作の試みのための三次元テンプレートとして用いられ得る。用語「神経」は、非線維束神経および多線維束神経の両方を意味する。用語「活性因子」または「増殖因子」は、任意の活性アナログ、活性フラグメント、またはそれらの活性誘導体を包含する。任意の適切なヒドロゲルは、本発明の生体人工細胞外マトリックスのための基質として用いられ得る。ヒドロゲルを形成する組成物は、３つのクラスに分かれる。第１のクラスは、正味の負電荷を有する（例えば、アルギン酸）。第２のクラスは、正味の正電荷を有する（例えば、コラーゲンおよびラミニン）。市販の細胞外マトリックス成分ヒドロゲルの例としては、Matrigel^TMおよびVitrogen^TM が挙げられる。第３のクラスは、電荷的に正味中性である（例えば、高度に架橋されたポリエチレンオキシド、またはポリビニルアルコール）。本発明において用いられるのに適切なヒドロゲルは、好ましくは、規定のポリマーであり、最も好ましくは、合成されるか、または天然に存在する非腫瘍原性供給源（所望でない生物学的（例えば、細菌性またはウイルス性）、化学的、または他の混入物を含まない）から調製され得るポリマーである。マトリックス基質として最も好ましいのは、3-Dにおいて所望のECM接着性分子または接着性ペプチドフラグメントのみを提示することができる、所望でない接着性モチーフを実質的に含まない、十分に特徴付けされたヒドロゲルである。 Matrigel^TMは、規定の基質ではなく、そしてまた、マウス肉腫株に由来するのであまり望ましくない。さらに、全ての合成ポリマーヒドロゲルが適切であるわけではない。例えば、Woerlyら、Cell Transplantation，2，229-39頁(1993)によるアクリルベースのヒドロゲルの使用は、細胞障害性の可能性を示す。なぜなら、神経細胞の捕捉が、フリーラジカル開始剤の存在下での架橋反応と同時に行われ得るからである。ヒドロゲルマトリックス基質材料として有用であり得るポリマーは、高分子量ポリエチレンオキシド(PEO)およびヒアルロネートを包含する。安定化されたヒアルロネートは市販されている（Fidia Advanced Biopolymers）。種々のPEOポリマーもまた市販されている。多糖類は、本発明のヒドロゲル基質として有用である、一般式(CH₂O)_nの高分子のクラスである。多糖類は、いくつかの天然に存在する化合物を包含する（例えば、アガロース、アルギネート、およびキトサン）。アガロースが好ましい。アガロースは、多糖類、主として、1,4結合3,6-アンヒドロ-α-L-ガラクトースおよび1,3結合β-D-ガラクトースの交互コポリマーから製造される、透明な熱エチル化アガロースであり、これは17℃でゲル化する。ヒドロゲルの生体材料としての特定の適合性は、その物理的特性と生組織の物理的特性との類似性に由来する。この類似点は、その高含水量、軟ゴム状稠度、および低界面張力に基づく。アガロースゲルの熱可逆特性によりアガロースは室温で液体となり得、これにより、細胞−ゲル溶液は容易に混合され、次いで４℃まで冷却すると、ゲル化および細胞の捕捉が生じる。これは、比較的温和なプロセスであり、細胞に対して毒性の化学的作用を含まない。ヒドロゲルマトリックスの許容層のために、0.50〜1.25％(w/v)の、最も好ましくは1.0％のアガロース濃度が好ましい。本発明のヒドロゲルマトリックスのいくつかの物理的特性は、ゲル濃度に依存する。ゲル濃度の増加は、ゲル孔半径、形態、または異なる分子量タンパク質への透過性を変化させ得る。ゲル孔半径の測定は、任意の適切な方法により測定され得る。この方法としては、目盛り付き水カラムを用いる水圧透過性測定、走査型電子顕微鏡、および異なる寒天ゲル濃度による既知の半径の球体の篩分けが挙げられる。例えば、Grie ssら、Biophysical J.，65，138-48頁（1993）を参照のこと。水圧透過性に基づく孔半径測定が好ましい。この方法は、ゲル濃度の変化に最も感度が高いからである。目盛り付き水カラムを用いるゲル水圧透過性の測定は、実験される各ゲル濃度に対する平均孔半径の算定を可能にする。平均ゲル孔半径は、ゲル濃度が増加するにつれて、指数関数的に低下する。曲線の傾きは、孔半径のゲル濃度に対する感度を示す。平均ゲル孔半径は、好ましくは、120〜290nmの間で変化し、そして最も好ましくは、約150nmである。1.25％閾アガロースゲル濃度の孔半径は、150 nmである。本発明のアガロースヒドロゲルは、種々のECMタンパク質またはペプチド（例えば、ラミニン、フィブロネクチン）および／またはそれらのペプチドアナログを3-Dにおいて提示するために、キャリアとして用いられ得る。アガロースの化学的性質のために、このようなECM接着性タンパク質および／またはペプチドにより、容易に修飾が行われ得る。ECMタンパク質のヒドロゲル骨格への共有結合固定化が好ましい。このような固定化は重要である。なぜなら、低分子量オリゴペプチドのヒドロゲルとの物理的混合かゲル中にペプチドを保持しないからである。さらに、共有結合固定化は、ヒドロゲル−ECM分子混合物中の「自由移動性」ECM分子によって起こり得る細胞表面レセプターの飽和を防ぐ。任意の適切なカップリング系が、誘導体化のために用いられ得る。最も好ましくは、二官能性イミダゾールカップリング剤（例えば、1'1カルボニルジイミダゾール）を用いる共有結合カップリングが用いられる。このカップリングの化学的性質は、ゲルの物理的構造を有意に変化させない。本発明の生体人工ヒドロゲル細胞外マトリックスは、細胞接着に関与する完全長の細胞外マトリックスタンパク質を3-Dで存在させるのに有用である。さらに、細胞結合配列を含有するこのような接着性分子のペプチドフラグメントもまた用いられ得る（すなわち、接着ペプチドフラグメント）。このような接着ペプチドフラグメントのいくつかが当該分野において公知である。特定のペプチドフラグメントは、標準的な技術によりその結合能力または接着能力について試験され得る。本発明の生体人工ヒドロゲルマトリックスは、種々の細胞タイプに対して3-D で、ECM接着性分子、またはその接着ペプチドフラグメントを存在させるのに用いられ得る。これらの細胞タイプは、通常インビボでECMと接触している任意の細胞、またはECM接着性分子またはその接着ペプチドフラグメントに結合し得る細胞表面レセプターを有する任意の細胞を包含する。有用な細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、コンドロブラスト、骨芽細胞、および神経の幹細胞を包含する（Richardsら、PNAS 89、8591-95 頁（1992）；Rayら、PNAS 90、3602-06頁(1993)）。本発明の方法および組成物において有用であり得る他の細胞は、シュワン細胞（WO 92/03536）、星状細胞、乏突起膠細胞およびそれらの前駆体、副腎クロム親和性細胞などを包含する。幹細胞は、培養において容易に増殖され得る細胞のクラスを表し、そしてその子孫は特定の成長因子の投与により末期まで分化し得る。例えば、Weissら、(PC T/CA 92/00283)を参照のこと。筋芽細胞は、本来、中胚葉幹細胞集団に由来する筋前駆細胞であり、例えば、 L-6ならびにβ-CH3細胞が挙げられる。一次筋芽細胞は、剖検または生検から採取した組織から容易に単離され得、そして精製され、そして増殖され得る。筋芽細胞は、増殖し、そして共に融合し、分化した多核形成筋管を形成する。筋管はもはや分裂しないが、筋タンパク質を生産し続ける。増殖している間、筋芽細胞は、治療用分子を産生するように容易に遺伝子的に操作され得る。筋芽細胞は、移動し、既存線維と融合することが可能である。生体人工ECMマトリックスにおける使用のためのECM接着性分子または接着性ペプチドフラグメントの選択が、所望の標的細胞タイプに依存することは明らかである。例えば、Kleinman、米国特許第4,829,000号；EndおよびEngel、「細胞外マトリックスのマルチドメインタンパク質および細胞生育」、McDonald and Mec ham Biology of Extracellular Matrix Series，Academic Press，NY，79-129頁（1991）を参照のこと。当業者は、任意の特定のECM分子または接着ペプチドフラグメントモチーフを選択された細胞タイプに対する接着能力について日常的にアッセイし得る。従って、本発明の組成物および方法に従って、適切なECM媒介性分子合図を提供することにより、任意のECM応答性細胞タイプの挙動（すなわち、発生、移動、増殖、分化、形状、極性、および/または代謝機能）に影響を及ぼし得る。いくつかの実施態様では、ヒドロゲルECMマトリックスは、適切なECM接着性分子または接着ペプチドフラグメントで誘導体化され、そして宿主（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）における所望の位置に移植され得る。これらの実施態様では、マトリックスは、組織再生のための支持体として作用し、それによって、宿主細胞は、マトリックスに浸潤する。マトリックスにおける適切な3-D分子合図の存在下では、宿主組織再生が促進される。このような実施態様は、軟骨細胞浸潤に好都合なECM接着性分子または接着ペプチドフラグメントでマトリックスを誘導体化することにより、例えば、軟骨再生または腱再生における使用を有する。同様に、本発明のマトリックスは、筋芽細胞、骨芽細胞、または上皮細胞の挙動に影響する適切な分子合図を存在させることにより、筋肉、骨、または皮膚再生を促進することにおいて有用であり得る。好ましい実施態様では、本発明の生体人工マトリックスは、神経誘導チャンネルにおいて、神経再生を促進するために用いられる。他の実施態様では、本発明の生体人工マトリックスは、細胞が予め播種され得、それによって、細胞は、マトリックス中に懸濁され、そして3-Dにおいて適切な分子合図に曝される。これらの細胞を播種したマトリックスは、組織置換プロトコルにおいて有用である。これらの実施態様に従って、組織は、インビトロで再構成され得、次いでそれを必要とする宿主に移植され得る。例えば、心臓の筋芽細胞は、本発明の誘導体化ヒドロゲルマトリックス中に懸濁され、心臓壁に相当する厚さの組織パッチを作製し得る。次いで、再構成された心臓のパッチは、組織置換治療の一部として移植され得る。軟骨、腱、骨、皮膚、神経、血管、および他の組織について同様のプロトコルが考慮される。ヒドロゲル（例えばアガロース）を種々の形状に配列させる能力、ならびに「許容的な」ゲル濃縮物を作製する能力は、規定の平面において、または規定の「路（tract）」により細胞挙動に影響し得る生体人工マトリックスの産生を可能にする。先述の実施態様により、細胞は異種移植片、同種移植片、または自家移植片であり、好ましくは同種移植片、最も好ましくは自家移植片であり得ることが理解される。このような細胞を移植するための外科手順は、公知である。例えば、Ga ge、米国特許第5,082,670号を参照のこと。他の実施態様では、半透性膜中に細胞を播種したマトリックスをカプセル化し、生体人工器官を形成させることが望ましくあり得る。このような生体人工器官は当該分野で公知である。例えば、WO第92/019195号（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これらの実施態様では、カプセル化された細胞の代謝機能は、3-Dに存在するECM接着性分子または接着ペプチドフラグメントにより制御され得る。カプセル化細胞は、カプセル化細胞内で機能し得るかまたはカプセル化細胞から放出または分泌され得る生物学的に活性な分子を産生するように影響され、宿主において治療効果を示し得る。これは、宿主個体の固定された位置での細胞挙動におよぶ正確な制御を可能にする。好ましい実施態様では、ラミニン誘導体化オリゴペプチドフラグメント、RGD 含有配列（ArgGlyAsp；配列番号２のAA₂〜AA₄）、YIGSR含有配列（TyrIleGlySer Arg；配列番号１のAA₅〜AA₉）、および/またはIKVAV含有配列（IleLysValAlaVal ；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）は、任意の適切な方法を用いて、アガロースのヒドロキシル骨格に結合される。最も好ましくは、オリゴペプチドフラグメントGRGD SP（GlyArgGlyAspSerPro；配列番号２）、CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySe rArg；配列番号１）、または19マーの水溶性アミノ酸配列CSRARKQAASIKVAVSADR （CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAlaSerIleLysValAlaValSerAlaAspArg；配列番号３）が用いられる。 CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）は、メラノーマ細胞との走化性機能においてラミニンにより得られる最大応答の30％しか誘起しないことが示されている（Grafら、Biochemistry、26、6896-900頁(1987)）。従って、完全長ECM分子の使用は、より有意な細胞の効果を誘発し得る。しかし、最少のオリゴペプチドの使用は、よりストリンジェントな基質条件を作製し、そして完全長タンパク質の強力な生物学的効果がゲルの物理的効果を覆い隠すことなく、ゲルシステムの試験を容易にする。これは、細胞生存性を支持し、そして細胞挙動に影響するための物理的基底構造を有するシステムの開発および試験を可能にする。次いでヒドロゲルマトリックスは、適切な共有結合した細胞接着性分子または細胞外マトリックス分子の使用により次第により許容にされ得る。本発明の3-Dマトリックスは、ヘキソサミン残基を含むように、さらに改変され、好ましくは、化学的に改変され得る。炭水化物は、細胞接着に関与し得る。 DoddおよびJessel，J.Exp.Biol.，124，00．225-38(1986)。別の好ましい実施態様では、本発明の組成物は、神経細胞移植において用いられ得る。神経細胞からの神経突起伸長を組織化し、支持し、そして指揮する生合成ヒドロゲルの能力はまた、3-D神経細胞培養および神経再生のような応用に有用であり得る。本発明の生体人工細胞外マトリックスは、神経系の発達における細胞移動および神経突起伸長において重要な役割を果たすことが同定されているいくつかの細胞接着性分子の内の１つ以上を潜在的に保有し得、これは、N-CAM およびNg-CAM（Crossinら、Proc.Natl.Acad.Sci.，82，6942-46頁（1985）；Dan iloffら、J.Neurosci.，6，739-58頁(1986)、tenascin（Wehrleら、）Developme nt 1990，401-15頁(1990)）、ならびにL1（NiekeおよびSchachner，Differentia tion ，30，141-51頁(1985)）を包含する。細胞外マトリックス糖タンパク質の間で、ラミニンは、インビトロでの神経突起成長の最も強力なインデューサーの１つであることが示されている。これは、シュワン細胞基底層の成分であり、そしてインビボでの軸索の再生に関与すると考えられている（Baron-Van-Evercooren ら、J.Neurosci.Res.，8，179-93頁（1983）；Manthorpeら、J.Cell.Biol.，97 ，1882-90頁（1983）；Rogersら、Dev.Biol.，113，429-35頁(1983)）。 LNはまた、多くの神経細胞タイプの接着を増強し（McCarthyら、J.Cell.Bio1. ，97，772-77頁(1983)；Liesiら、J.Neurosci.Res.，11，241-51頁（1984）；Ha mmarbackら、J.Neurosci.Res.，13，213-20頁(1985)；Kleinmanら、Annals NY A cad.Sci. ，580，302-10頁(1990)）、交換神経および中隔神経の生存性を増強させ（Edgarら、EMBO，3，1463-68頁(1984)；Pixleyら、J.Neurosci.Res.，15，1- 17(1986)）、そして多くの末梢神経および中枢神経における神経突起の成長を刺激する（Baron van Evercoorenら、J.Neurosci.Res.，8，179-93頁(1983)；Mant horpeら、J.Cell.Biol.，97，1882-90頁(1983)；Rogersら、Dev.Biol.，113，42 9-35頁(1983)；Steeleら、J.Neurosci.Res.，17，119-27頁(1987)）。 LNおよび他のECM構成要素は、末梢神経系および中枢神経系の両方においてニューロンの発達に影響する。従って、3-Dにおける再生環境に対するECM-オリゴペプチド誘導体化アガロースゲルの提示は、適切な動物モデルに導入される場合、神経再生を増強し得る。細胞外マトリックスの複合体糖タンパク質およびプロテオグリカン成分は、発達の間、神経細胞移動および神経突起伸長のための許容される経路を提供すると考えられている。細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス（ECM）相互作用は、ニューロン細胞分化の種々の局面（神経細胞移動および神経突起伸長を包含する）を調節するようである。Sanes，Ann.Rev.Neurosci.，12，491-516頁(1989 )）神経の発達の解剖学的研究は、パイオニアニューロンの移動経路が、原線維および顆粒の網構造に組織化される3-D ECMからなるようであることを示している。ラミニン（LN）およびフィブロネクチン（FN）様ECM分子からなる許容される３次元迷路、および高度に水和したヒアルロン酸で満たされたいくつかの細胞非含有空間に結合した、それらの標的領域からのニューロンの成長円錐の化学屈性誘引力は、胚の神経系の発達に重要な役割を果たすと考えられている。ラミニン（LN）（基底薄層に由来するECM分子）は、広範な種々の神経細胞（後根神経節（DRG）およびPC12細胞(ラットクロム親和細胞腫由来の細胞株)を包含する）における神経突起成長を促進する。Kleinmanら、Annals NY Acad.Sci． 580，302-10頁（1990）。発達において、神経冠細胞およびパイオニア神経細胞の成長円錐により従事されるこの経路は、いくつかのECM成分を含有し、これはフィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、トロンボスポンジン、およびヒアルロン酸を包含する。Perr isおよびBronner-Fraser，Comments Dev.Neurobiol.，1，61-83頁（1989）。従って、１つの実施態様では、アガロースマトリックスは、神経突起促進因子およびアガロースゲル中で神経突起伸長を特異的に増強させる成長因子で誘導体化される。神経突起促進タンパク質ラミニンの活性は、神経突起成長により好都合な特定の分子相互作用を組織化することを補助するヘパリン硫酸プロテオグリカンで複合体化された後に増強することが示されている。宿主組織に移植された細胞の組込みは、機能的な界面（移植片−宿主相互接続およびシナプス関連を包含する）の確立を伴う、移植されたニューロンの成長、および移植の間に損傷した宿主ニューロンからの軸索の再生の結果である。Woer lyら、Cell Transplantation，2，229-39頁（1993）。本発明の3-Dアガロースマトリックスは、軸索の直接成長のための支持体として作用し得る。本発明者らは、Weissら、PCT/CA92/00283に従って単離された神経幹細胞を提唱し、最も好ましくはヒト幹細胞である。インビトロでの種々の細胞および組織の生理化学的環境は、それらから特定および特異的な応答を誘起するように調整され得る。特定のECMペプチドは、神経細胞からの神経突起成長の促進または許容性の程度を決定するのに重要であり得る。特に、3-Dで存在するペプチドの性質は、神経突起伸長に影響し得る。さらに、細胞タイプは、選択されたペプチドにより異なって影響され得る。２次元でのPC12細胞からの神経突起伸長は、LNのIKVAV（IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）フラグメントにより増強される（Tashiroら、J.Biol.Ch em. ，264，16174-182頁(1989)）。PC12細胞は、IKVAV（IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）に対する結合部位であると仮定されている110kDa細胞表面レセプター（Kibberyら、Proc.Natl.Acad.Sci.，90，10150-53頁(1993)）を保有する。特定の実施態様では、アガロースゲルは、IKVAV含有配列（IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）で誘導体化され、PC12細胞における神経突起伸長を促進する。神経成長因子（NGF）の存在は、神経突起伸長に必要とされ得る。例えば、Sep helら、Biochem.Biophys.Res.Comm.，2，821-29頁（1989）を参照のこと。これらの成長因子は、チャンネル膜に取り込まれ得る（米国特許第5,011,486号）か、または所望の分子を分泌する細胞、または緩徐に放出されるポリマーの挿入物をチャンネルに播種することによりチャンネル内に連続的に提供され得る。例えば、米国特許第5,156,844号および第5,106,627号を参照のこと。このような方法は、種々の成長因子の短い半減期に関連する問題、およびこれらの因子の非連続的送達または非制御送達に関連する問題を克服する。別の特定の実施態様では、RGD含有配列（ArgGlyAsp；配列番号２のAA₂〜AA₄） CDPGYIGSR含有配列（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）、IKVAV含有配列（IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）、または全ての３つの配列の混合物を含有する反応混液（PEPMIX）で誘導体化されたアガロースを用いて、 E9 ヒヨコ後根神経節における神経突起伸長を促進させた。本発明の別の方法では、非許容、許容、および非許容ゲル層の交互の薄板が、インビトロでの3-D細胞増殖または移動「路」の作製を可能にする。非許容層に関するアガロース濃度は、1.25％よりも高く、好ましくは2.0％以上のアガロース濃度であり得る。１つの実施態様では、神経細胞（例えば、後根神経節）を保有する１％ゲル層を有するゲル濃度２％：１％：２％の薄板は、3-D神経「路」の作製を促進する。本発明の指示される3-D神経路の組立ては、制御された様式で神経突起伸長許容および神経突起伸長非許容ゲルを物理的に配列することにより達成され得る。このような配列法は、当該分野で公知である。切除損傷後の隙を横切る神経再生を制御する因子は、十分には理解されていない。重篤な神経の再生は、通常では神経細胞の増殖を包含しない。しかし、損傷した神経細胞は、遠位に成長しかつ重篤な神経の遠位部分の完全な神経線維鞘外筒に再移入する神経突起を伸長する。修復に関する従来技術は、束の重篤な末端を整列することに関与する。この操作および縫合は、線維芽細胞および他の瘢痕形成結合組織細胞の成長および/または移動を刺激する。瘢痕組織は、近位の断端において再生する軸索が、神経荷電経路を再確立するように遠位の断端に到達することを妨げる。種々の神経誘導チャンネルが、これらの問題を克服しようとして発達してきた。例えば、米国特許第5,030,225号および第5,092,871号を参照のこと。滑面壁化シリコンエラストマーチューブ中の隙を横断する再生における重要な１つの事象は、遊走細胞および伸長軸索のための足場として作用するフィブリンケーブルの橋の形成である。シュワン細胞、軸索、内皮細胞、および線維芽細胞は、引き続いて隙領域に入り、それぞれ、再生ユニット、血管および神経上膜および末梢神経組織に方向付けられる。Aebisherら、Brian Research，531，211-18頁（1990 ）。本発明のアガロースヒドロゲル組成物は、神経誘導チャンネルにおいて有用であり得る。このような神経誘導チャンネルは、当該分野において周知である。合成誘導チャンネルは、軸索誘導を提供する不活性の導管として用いられており、これは成長因子を維持し、そして瘢痕組織浸潤を防止する。50,000ダルトンの分子量カットオフを有する選択透過性チャンネルは、マウス坐骨神経モデルにおいて神経の再生を可能にする。再生神経は、微細な神経上膜および多数の有髄の軸索により特徴付けられた。Aebischerら、「横断切開されたウサギ視神経のための誘導チャンネルとしての半透性チューブの使用」、GashおよびSladek（編）Pr ogress in Brain Research ，78，599-603頁（1988）。選択透過性チャンネルは、外部の宿主環境から栄養素および成長因子または栄養性因子の内部への輸送を可能にし、その一方で瘢痕形成細胞の内部への移動を防止することにより、再生を支持し得る。創傷治癒現象に関与する細胞は、種々のペプチド成長因子を放出することが知られている。これらの因子のいくつかは、10〜40,000ダルトンの分子量を有する。例えば、活性化されたマクロファージは、多数の成長因子（NGF、bFGF、およびアポリポプロテインＥを包含する）を分泌する。神経損傷に対して遠位であるシュワン細胞は、低親和性のNGFレセプター、ならびにアポリポプロテインＢおよびＥレセプターを発現する。アポリポプロテインＥのこれらのレセプターへの結合は、最終的に再ミエリン化に用いられ得る脂質取り込みを増強し得る。Aebisherら、Brain Research，454，179-87頁（1988 ）。選択透過性チャンネルに関する分子量カットオフの適切な選択は、神経誘導チャンネル内のラミニン（高分子量糖タンパク質）の保持を可能にする。同様に、近位の神経断端に位置する血管は、インビトロでニューロンの生存および神経突起伸長を支持している高分子量血清分子（例えば、フィブロネクチンまたは糖タンパク質）を供給し得る。Aebischerら、Brain Research，454，179-87頁（19 88）。本発明の神経誘導チャンネルは、切断神経を収容するための開口部を有する移植可能な生体適合性管状の選択透過性膜を含む。膜の管腔は、好ましくは約0.5m m〜約2.0cmの範囲の直径を有し、これを通しての神経の再生を可能にする。膜厚は、約0.05〜約1.0mmの範囲であり得る。いくつかの実施態様においては、膜は、約100,000ダルトン以下の分子量カットオフを有する。膜は、好ましくは線維芽細胞および他の瘢痕形成性結合組織細胞に対して不浸透性である。さらに、膜は、生分解性物質から構成され得る。アガロースマトリックスは、神経誘導チャンネルの管腔内に配置される。アガロース濃度は、0.5〜1.25％の範囲、好ましくは１％であるべきである。平均ゲル孔半径は、120〜290nmの間で変化し得、そして最も好ましくは約150nmである。再生マトリックスとして用いるためのアガロースゲルの最適濃度は、マトリックスの意図される使用によって変化する。インビトロで使用するための最適濃度は、インビボ環境で最適ではあり得ない。アガロースゲルにおける神経突起の成長(outgrowth)は、アガロースゲルの孔サイズに強く依存する。チャンネル中間点でのシネレシスは、アガロースゲルの孔サイズを十分に変化させて再生を阻害し得、従って、再生した神経束の中間部分での神経ケーブルが存在しなくなる。チャンネル中間点でのゲルのシネレシスを数え、そして可能であれば正しくすることが重要である。これは、２つのストラテジーにより克服され得る。１つは、チャンネルを満たすためのより希薄なアガロースゲルの使用は、中間においてシネレシスに適応し得、そしてチャンネルの中間点におけるゲルの孔サイズを、神経突起の伸長が可能である範囲に依然として維持し得る。第２に、荒いチャンネル内膜の使用は、誘導チャンネルのゲルの内側の、線維芽細胞の誘導シネレシスを防御するために作用し得る（Aebischerら，Brain Research，531，21〜18頁(1 990)）。本発明による切断神経の１つの修復方法においては、神経の切断末端が、管状誘導チャンネルの管腔内に互いに近接して配置される。神経の切断末端は、穏やかに手動操作または吸引によりチャンネル内に引き出される。神経末端は、過度の外傷を残さないようにして所定の位置に、縫合により、または生体適合性接着剤（例えば、フィブリン接着剤）を用いることにより、またはチャンネルを有する摩擦かみ合い(frictional engagement)により固定され得る。本発明のアガロースマトリックスに加えて、チャンネルの管腔は、その結果、神経増殖を保護、養育、および／または増強する物質を用いて「播種」され得る。有用な物質は、生物学的に活性な因子（例えば、神経増殖因子、脳由来増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、またはそれらの活性なフラグメント）を包含する。あるいは、管腔は、神経関連グリア細胞（例えば、シュワン細胞）で播種され得る。これらの増殖因子細胞および他の栄養分は、前述のように神経誘導チャンネル内に提供され得る。本発明の生体人工ECMはまた、神経系の発達において細胞の移動および神経突起の伸長における重要な役割を果たすことが同定されている、数種の細胞接着性分子の１種以上を有し得る。これらの分子は、N-CAM、Ng-CAM（Crossinら，Proc .Natl.Acad.Sci. ，82，6942〜46頁；Daniloffら，J.Neurosci.，6，739〜58頁（ 1986）；テナシン(Wehrleら，Development，1990，401〜15頁(1990)およびL1（N iekeら，Differentiation，30，141〜51頁(1985)）を包含する。他の有用な因子は、cAMPまたはそのアナログ（8-ブロモcAMPまたはクロロフェニチオcAMPを含む）を包含する。例えば、米国特許第5,030,225号および同第5,0 11,486号を参照のこと。本発明の神経誘導チャンネルは、さらにシュワン細胞で播種され得る。末梢神経幹中に内在するシュワン細胞は、再生プロセスにおいて重大な役割を果たす。選択透過性膜の合成誘導チャンネル中に播種されたシュワン細胞は、広範囲の末梢神経再生を支持する。シュワン細胞は、ラミニンを分泌する。これは、インビトロでの神経突起促進活性を有する。例えば、Aebischerら，Brain Research，4 54，179〜87頁(1988)を参照のこと。シュワン細胞を、好ましくは誘導チャンネルに沿って縦方向に配向させる。これは、当該分野で周知の方法を用いて、孔を縦方向に配向させるためにアガロースゲルの温度操作により達成され得る。インスリン様増殖因子１（IGF-1）はまた、横に切断した末梢神経の再生率を増大させることに有用であり得、そして永続的な神経機能欠損の持続を減少させ得る。例えば、米国特許第5,068,224号を参照のこと。好ましくは、選択的透過性膜は、再生神経末端の近傍に維持されるために、これらのいくつかの物質に対して不透過性であるように作製される。例えば、Aebi scher、米国特許第5,011,486号を参照のこと。簡略に記すれば、種々のポリマーおよびポリマー混合物は、神経誘導チャンネルを製造するために使用され得る。神経誘導チャンネルを形成するポリマー膜は、ポリアクリレート（アクリル酸共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリビニルクロリド共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースニトレート、ポリスルホン、ポリホスファジン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）、ならびにそれらの誘導体、共重合体、および混合物を包含し得る。本発明の神経誘導チャンネルに用いられる膜は、当該分野で公知の任意の適切な方法により形成され得る。このような方法の１つは、ポリマーキャスト溶液、ならびにDionne、本明細書中に参考として援用されているWO 92/19195および米国特許第5,158,881号、同第5,283,187号、および同第5,284,761に記載のような凝固剤の共追し出し(coextruction)を包含する。被覆物は、一重スキン（１型）、または２重スキン（４型）を有し得る。一重スキンの中空ファイバーは、共追し出しされたままにポリマー溶液の表面の１つのみをクエンチすることにより作製され得る。２重スキン中空ファイバーは、共追し出しされたままにポリマー溶液の両方の表面をクエンチすることにより作製され得る。代表的には、４型中空ファイバーと比較してさらに大きな割合の１型中空ファイバーの外側表面が、マクロポア（macropore）により占められる。２型中空ファイバーは、中間である。神経誘導細胞の被覆物は、選択的透過膜の名目上の分子量カットオフ(nMWCO) を決定する孔サイズを有する。nMWCOよりも大きな分子は、膜を横切ることを物理的に妨げられる。名目上の分子量カットオフは、対流条件下で90％排除として定義される。代表的には、MWCOは、50と200kDとの間、好ましくは50と100kDとの間の範囲である。大きな隙を横切る末梢神経の再生を促進するための本発明による好ましい神経誘導チャンネルは、特定の神経の再増殖を適切にする再生環境に最適化されたアガロースマトリックス、チャンネルの管腔内に播種されたシュワン細胞の存在、および誘導チャンネルの壁からの増殖因子の局所的放出を包含する。１つの実施態様において、アガロースヒドロゲルは、神経再生を増強する試みにおいて神経損傷部位にラミニン由来オリゴペプチドであるCDPGYIGSR（CysAspP roGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を存在させるためのキャリアとして用いられる。脊髄神経節は、インビトロにおいてCDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySe rArg；配列番号１）を担うことが示されており、そしてラミニンに由来する他のフラグメントと比較して最大に増強された神経突起の進展および神経突起の成長を示す。前根と比較して、横に切断した後根は、４週間後、成熟ラットにおいて４mmの神経隙を横切るポリマー誘導チャンネルを通る限定された再生を有する。McCorm ackら，J.Cmp.Neurol.，313，449〜56頁(1991)。ラット後肢腓腹神経は、５％〜 10％の運動線維のみを有する感覚神経を主に含有することが示されている。Peyr onnardら，Muscle and Nerve，5，654〜60頁(1982)。後根および腓腹神経の横切断は、中枢神経系に近接し得る感覚神経（すなわち、後根）とより末梢である神経（すなわち、腓腹神経）との間の再生の比較を可能にする。本発明がより理解され得るように、以下の実施例を示す。これらの実施例は例示のみを目的とし、そしていかなる態様においても本願発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。実施例実施例１−アガロースヒドロゲルマトリックスの特徴付け E14線条体細胞アッセイ線条体を、14日齢のラット胚から取り出し、そして炎で細くした(firenarrowe d)パスツールピペットを用いて無血清培地中で機械的に解離させた。0.5％〜5.0 ％の範囲で異なる濃度のアガロースゲルを、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）中で作製した。ゲル溶液を、これらを滅菌0.2ミクロンフィルターを通すことにより滅菌した。単離されたE14線条体細胞を、１mlシリンジ中で室温にてゲル溶液中に混合した。それぞれは、300μlの適切なアガロースゲル濃度を含む。次いで、細胞−ゲル溶液混合物を、48ウェルCostar組織培養皿中に注いだ。培養皿を４℃に冷却し、細胞−ゲル溶液混合物をゲル化し、線条細胞を３次元的に懸濁させた。DMEM、および５％ウシ胎児血清、グルコース（33，M）、グルタミン（２m M）、重炭酸ナトリウム（３mM）、HEPES緩衝液（５mM、pH7.4）、インスリン（2 5μg/ml）、トランスフェリン（100μg/ml）、プトレッシン（60μg/ml）、プロゲステロン（20nM）、および亜セレン酸ナトリウム（30nM）（これらは全てSigm aから）を補充したF12栄養分（Gibco）との１：１混合物の１mlを、ゲル頂部に添加した。ゲルを、インキュベーター内で37℃にて95％空気、５％CO₂、お濁し、そして48ウェルCostar皿中にすばやく注ぎ、そして上記の方法で培養した。３次元的に懸濁した500細胞毎の、神経突起が伸長された線条体細胞の割合を、0.5％〜5.0％（wt/容量）の範囲のアガロースゲルについて、培養24、48、および72時間で測定した。神経突起の伸長を、Zeiss Axiovert MC100相反転顕微鏡を用いて光学顕微鏡下で観察した。線条体細胞の本体の直径の２倍よりも長い全ての神経突起を計数した。 E14線条体細胞は、１％アガロースゲル中で３次元状に神経突起を伸長した。１％アガロースゲル中におけるE14線条体細胞からの神経突起の伸長は、培養72 5％〜1.25％のゲル範囲で神経突起を伸長した。しかし、1.25％（wt/容量）の閾濃度を超えると神経突起を伸長しなかった。ヒヨコ後根神経節アッセイ後根神経節を、E9ヒヨコ胚から標準的なプロトコルにより取り出した。ヒヨコ胚をうつ伏せの位置で固定し、そして脊髄のいずれかの側を長さ３mmに切開して移植のためにDRGを曝らした。DRGを、１mlシリンジで１％アガロースの300μlの溶液に室温で添加し、ゆっくりと混合し、そして特注製の９×９mm立方体状ガラス培養皿に注いだ。次いで、９×９mm皿を、４℃に置いてアガロースをゲル化し、DRGを３次元でトラップした。立方体ガラス皿は、Ｘ−Ｚ軸の可視化を可能とする。これは、培養皿の底に垂直平面である。300μlの１％ Ag−プレーン(Ag-P lain)ゲル溶液を１mlシリンジ内に注ぎ、そしてDRGをマイクロピペットでゲル溶液に添加した。次いで、神経節−ゲル溶液混合物を９×９皿に注ぎ、そして４℃ で５分間冷却し、DRGをゲル中にトラップした。各ウェルは、２つのDRGをその中に懸濁された。10ng/ml 2.5s神経成長因子(Sigma)、グルコース（0.3％）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１％）、L-グルタミン（200mM）、KCI（1.5mM）、インスリン（0.08mg/ml）、トランスフェリン(transferring)（10mg/ml）、プトレッシン（６mM）、および５％ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地の１mlを、ゲルの頂部に添加した。培養物を100％加湿、95％空気、および５％CO₂を有するインキュベーター内で37℃で維持した。培養６日後に立方体ガラス皿をその側面で弾いて、光学顕微鏡での分析のためにＸ−Ｚ軸を露出させた。Ｘ−Ｙ軸（これは、培養皿の底面に対する平行面である）に沿った神経突起伸長分析のために、DRGを、立方体ガラス培養皿について上に記載した方法で標準的な48ウェルCoastar組織培養皿において、アガロースのみ、アガロース−GRGDS P（GlyArgGlyAspSerPro；配列番号２）、アガロース−CDPGYIGSR（CysAspProGly TyrIleGlySerArg；配列番号１）、アガロース-x-IKVAV（IleLysValAlaVAl；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）-X、アガロース−PEPMIX、およびアガロース−GGGGG（Gly GlyGlyGlyGly；配列番号４）ゲル内に懸濁した。少なくとも６つの神経節を、各タイプのアガロースゲルについて分析した。細胞−ゲル溶液混合物の最終濃度は、0.83％（重量／容量）であり、そして各培養ウェルにおける細胞−ゲル総量は、300μlであった。ヒヨコDRGは、注文設計した９×９mmガラス立方体皿で培養する場合、NGFの存在下で６日後に１％アガロースゲル中でＸ−ＹおよびＸ−Ｚ平面の両方で神経突起を伸長した。DRGは、長いそして湾曲した神経突起をＸ−Ｙ軸およびＸ−Ｚ軸に沿って伸長し、これは、アガロースゲル中の神経突起伸長の３次元的性質を示す。ゲルの特徴付けａ．水圧透過性：異なる濃度のゲルブロック（それぞれの厚さは0.5cmで、半径は１cmである）を、特注製の水カラムに固定した。各ブロックを、既知の水圧に供した。代表的には100cm高さのH₂Oカラムにより、約24525ダイン／cm²を得た。所定の水圧について単位時間あたりの水圧透過性を、種々のゲル濃度について測定した。0.5％〜5.0％の範囲のゲル濃度の平均孔半径を、Refojoら，J.Appl.P oly.Sci. ，9，3417〜26頁(1965)に記載のように計算した。種々のアガロースゲルの水圧透過性の測定から計算される平均孔半径は、ゲル濃度が増大するにつれて指数関数的に減少した（図１）。E14線条体細胞は、150 nmのアガロースゲル孔半径の閾を超えると神経突起を伸長しなかった。孔半径を描く曲線勾配は、１％と２％との間のゲル濃度で急勾配であった。これは、ゲル濃度への孔サイズの強い依存を示す。ｂ．走査電子顕微鏡(SEM)：0.5％〜2.0％の範囲のアガロースゲルを、凍結乾燥し、アルミニウムスタッブ(stub)上に固定し、金でコートし、そしてJoel 35M 走査電子顕微鏡下で分析した。走査電子顕微鏡写真の代表的な切片を、孔の形態およびサイズの評価のために選択した。異なる濃度のアガロースゲルの走査電子顕微鏡写真は、開口細胞形態を明らかにした。ｃ．電子顕微鏡(ESEM)：0.5％〜2.5％の濃度範囲のアガロースゲルを、部分水和状態の下で周辺走査電子顕微鏡写真（Electroscan ESEM、E3型）を用いて分析して、ゲルの孔形態を定性的に評価した。ゲル空隙半径の低下は、ゲル濃度の増大とともに示される。しかし、ESEMで得た画像の性質および品質は、信頼されるゲル孔サイズについての定性的な結論のみを可能にした。ｄ．ゲル電気泳動：１％、２％、および４％アガロースゲル中におけるインスリン（Mw 5,700）、ウシ血清アルブミン（Mw.66,000；半径140オングストローム）、およびウシチログロブリン（Mw．669,000）の電気泳動移動度を、一定の電気泳動電圧勾配の下で測定した。適切なアガロースゲル濃度の20mlを、プラチナ電極を備えたDANAPHORモデル100ミニゲル電気泳動装置（Tectate S.S，Switzerl and）に注いだ。次いで、タンパク質インスリン、アルブミン、およびチログロブリンを、１〜12Ｖの一定の電気泳動電圧勾配に供した。タンパク質の電気泳動移動度を、１％、２％、および４％アガロースゲル中において、単位時間当たりの移動距離を測定することにより測定した。次いで、相対的電気泳動速度を、異なるタンパク質の等電点、用いた電圧、ならびにアガロースゲル中のインスリン、アルブミン、およびチオグロブリンの電気泳動移動度の比較を可能にする曝露時間を考慮した後、計算した。球状タンパク質であるインスリン、アルブミン、およびチオグロブリンの相対的電気泳動移動度は、ゲル濃度の増大に伴って減少した。インスリンおよびアルブミンの電気泳動移動度は、１％ゲルと比較して２％アガロースゲルにおいて比較的小さな割合で減少した。すなわち、それぞれ5.7％および2.9％である。対照的に、相対的な電気泳動移動度は、大きな分子量の球状タンパク質であるウシチログロブリンについて、１％アガロースゲルにおける電気泳動移動度と比較して２％アガロースゲルにおいて33.3％減少した。積層状ゲル厚さ３mmの非透過性１％アガロースゲル溶液の無細胞層、その中に混合されたヒヨコDRGを有する透過性１％ゲル溶液の１mm層、および非透過性２％アガロース溶液のさらなる３mm無細胞層を、注文設計した９×９mm立方体ガラス皿中で連続的に冷却し、そしてゲル化させた。次いで、皿をそれらのＸ−Ｚ軸に向いている側面に向け、そして培養６日後に光学顕微鏡下で分析した。ゲルの境界面を、１つのゲル層から他のゲル層への神経突起の交差について調べた。透過性１％アガロースゲル層内に懸濁したヒヨコDRGは、神経突起を１％ゲル内でのみ伸長し、そして１％：２％ゲル境界面で交差しなかった。対照的に、多くの神経突起は、コントロールゲルの１％：１％アガロースゲルの境界面で交差し得た。実験的設計により、境界面に出会った全ての神経突起は、培養皿の底に対して垂直な、ゲルのＸ−Ｚ軸に伸長した。実施例２−オリゴペプチド誘導体化アガロースの生体人工ECM アガロースゲルの調製 kland，Maine）ゲルを、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中にpH7.4でアガロースを溶解することにより調製した。ゲル溶液を、滅菌のために0.2ミクロンフィルターに通した。次いで、ゲル溶液を４℃に置き、ゲル化させ、そしてペプチドでそれらを誘導体化させるまで４℃で貯蔵した。ラミニンオリゴペプチドの固定化アガロースゲルを、Hearn，Methods Enzymol.，135，102〜17頁(1987)により記載されるプロトコルの改変版を用いて、1,1カルボニルジイミダゾール（CDI）（Sigma）で誘導体化した。模式的には、図２を参照のこと。３〜４mlの１％アガロースゲルブロックを、アセトン中での洗浄を繰り返し、続いて４オングストロームモレキュラーシーブス（Sigma）の下で乾燥させたアセトンにより脱水した。乾燥アセトン中で調製した150mg/25ml CDI溶液を、アセトン洗浄したアガロースゲル（５ml/３ｇゲルブロック）に添加した。活性化反応を、穏やかに撹拌しながら９分間進行させた。次いで、ゲルを乾燥アセトンで洗浄１回あたり６分間で５回洗浄し、非結合CDIを除去した。次いで、CDI活性化ゲルを、100mM重炭酸ナトリウム緩衝溶液中にpH8.5にて0.6 mg/mlの濃度で溶解した種々のオリゴペプチドに曝した。ペプチドカップリング反応を、穏やかに撹拌しながら36時間進行させた。次いで、ゲルをPBSで48時間、十分に洗浄し、さらに重炭酸ナトリウム中で室温にて２時間クエンチさせ、凍結乾燥し、そして所望の1.0％のゲル濃度に再溶解させた。用いたペプチドは、GRGDSP（GlyArgGlyAspSerPro；配列番号２）（Telios pha rmaceuticals，San Diego CA）、CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）、19マー配列CSRARKQAASIKVAVSADR（CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAlaSe rIleLysValAlaValSerAlaAspArg；配列番号３）、x-IKVAV-x含有配列（x-IleLysV alAlaVAl-x；配列番号３のAA₁₁〜AA₁₅）（Anawa，Wagen，Switzerland）、およびコントロールとしてGGGGG（GlyGlyGlyGlyGly；配列番号４）（Sigma）である。３つの上記のペプチドの混合物（PEPMIX）のカクテル(cocktail)もまた、５ml 緩衝溶液全体でそれぞれ２mgの濃度でヒドロゲル骨格に固定化した。アガロースゲルへのペプチドの固定化に用いた1,1カルボニルジイミダゾールカップリング反応を、種々のペプチドのモデルアミノ化合物として放射性標識¹⁴ Ｃグリシンを結合することにより確認した。CDIで活性化されず、しかし14Ｃグリシンに曝したゲルを、コントロールとして用いた。CDI活性化ゲルおよびCDI欠損ゲルからのβ計数を、12日間透析した後に、βカウンター（LKB Wallac，1217 RackBeta 液体シンチレーションカウンター）で計数した。 CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を、ラクトペルオキシダーゼ（Sigma）を用いて¹²⁵Ｉで標識した。CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleG lySerArg；配列番号１）の0.4M酢酸ナトリウム溶液10μl（５μg/10μlの酢酸ナトリウム）、１ミリキュリーの¹²⁵Ｉ（Amersham Radio Chemicals）、および10 μlの過酸化水素（H₂O₂；20,000部中の１）。反応を１分間進行させ、そして500 μlの0.1M酢酸溶液で停止させた。放射性標識したCDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を、オクトセサシリシン酸（octodesasilicic acid）(ODS)ゲルカラム（Shandon Sci entific Ltd.,Cheshire England）において20％〜50％のメタノールで溶出させた。¹²⁵Ｉ CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）を、アガロースゲルに上記の方法でカップリングさせた。γ計数を、Packard自動シンチレーション分光計（5416）で、洗浄して非結合ペプチドを除去した５日後に分析した。 ¹⁴Ｃグリシンのβ計数は、透析12日後のゲル１ｇあたり37μgまでのグリシンが保持されていることを明らかにした。CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerA rg；配列番号１）は、¹²⁵Ｉで首尾良く放射性標識され、そしてODSゲルでのピーク溶出は、40％メタノールであった。CDIの存在下で、５日間のゲルの透析後に、CDIを有さないゲルと比較して2.39倍を超える¹²⁵Ｉ標識CDPGYIGSR（CysAspPro GlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）が、アガロースゲル中に保持された。¹²⁵Ｉの短い半減期により、たとえCDI欠損ゲルにおけるγ計数が、CDI活性化ゲルにおける計数と比較して、それぞれの連続洗浄でより迅速に失われたとしても、さらなる洗浄が妨げられた。ゲルの特徴づけ非誘導体化アガロースゲルおよびグリシンカップリングアガロースのゲルの多孔性を実施例１に記載のように測定した。ゲルの平均ポア半径は、水圧透過性測定用水カラムを用いて測定したところ、0.5％非誘導体化アガロースゲルについては310nmであり、そして0.5％グリシンカップリングアガロースゲルについては 360nmであった。後根神経節アッセイ実施例１に記載のように、標準的なプロトコルによりE9ニワトリ胚からDRGを切り出した。神経突起伸長を、２日目、４日目および６日目に、Zeiss axiovert MC100 TV 光学顕微鏡を用いてＸ-Ｙ軸に沿って定性的に分析した。両方の細胞タイプの細胞生存性を、フルオレセインジアセテート(FDA)アッセイにより６日目に評価した。DRG研究のために、神経節細胞体領域(GCBA)ならびに神経節およびその神経突起により覆われた最大領域として定義されるおよび総神経節拡張領域(TGSA)を、NIH Image 1.47ソフトウェアパッケージを用いてＸ-Ｙ平面において測定した。神経節の総神経突起拡張として定義されるTGSA/GCBAの比を算出した。DRGにより伸長した５つの最も長い神経突起の長さもまた、神経突起伸長を評価するために測定した。アガロースヒドロゲルは、Ｘ-Ｙ平面およびＸ-Ｚ平面の両方においてDRGからの神経突起成長をサポートし、これはアガロースゲルにおける神経突起成長の３ -Ｄ特性を示す。フルオレセインジアセテートアッセイは、使用した全てのアガロースゲルにおいて、培養６日後に生存DRGニューロンを示した。 DRGニューロンは、Ag-PlainおよびAg-CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerAr g；配列番号１）を含む48ウェルCosterディッシュにおいてＸ-Ｙ平面で検査すると、全てのアガロースゲルにおいて神経突起を伸長した。切開後の後根神経節のサイズの変動を説明するために、そしてゲルにおける総神経拡張の尺度として、総神経節拡張領域/神経節細胞体領域の比(TGSA/GCBA)を２日目、４日目および65日目に算出した(図３)。AgPlainゲルと比較して、Ag-PE PMIXゲルは、全ての測定時点において有意により多くの神経突起拡張を示し(p＜ 0.05)、一方、CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）は、６日目においてのみ有意により多くの神経突起拡張を有した(p＜0.05)。対照的に、全ての測定時点でのAgPlainゲルと比較して、IKVAV-誘導体化(IleLysValAlaVal ；配列番号３のAA₁₁-AA₁₅)ゲルは、全ての測定時点で有意により少ない神経突起拡張を有し、一方、GRGDSP(GlyArgl1yAspSerPro；配列番号２)は２日目および４日目でのみ有意により低い神経突起拡張を有した(p＜0.05)。 CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)誘導体化アガロースゲルおよびPEPMIX誘導体化アガロースゲルは、６日目に非誘導体化アガロースゲルよりも有意に長い神経突起を支持した(p＜0.05)(図４)。対照的に、IKVAV-誘導体化(IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁-AA₁₅)アガロースゲルは２日目、４日目および６日目に神経突起成長を阻害した(p＜0.05)。Ag-GGGGG(GlyGlyGlyGlyGl y；配列番号４)ゲルは、Ag-Plainと比較して２日目には有意に短い神経突起長を有したが(p＜0.05)、４日目および６日目においては２つのゲル間に神経突起長の統計的な差異は存在しなかった。全てのアガロースゲルにおいて、神経突起はＸ-Ｚ平面を含めて３次元的に伸長した。CDPGYIGSR誘導体化(CysAspProGlyTyrIl eGlySerArg；配列番号１)ゲルにおいて、６日目に神経突起は長く曲がりくねっており、1600μmまで伸長した。 PC12細胞アッセイ PC12細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Maryland) を、10％ウシ胎児血清、５％ウマ血清、L-グルタミン(200mM)および１％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したGibco RPMI 1640で増殖させた。これらを10 継代目で、10ng/mlの2.5s神経成長因子(NGF)で、使用の48時間前にプライムした。プライムしたPC12細胞を、次いてDRGについて上述した方法と同様の方法を用いて、1mlあたり50,000細胞の密度で種々のアガロースゲル溶液と混合した。細胞-ゲル溶液混合物を48ウェルCoaster組織培養ディッシュに注ぎ、そして４℃に冷却してゲル化させた。１mlのPC12培地を10ng/mlのNGFと共にゲルの上部に添加した。培養物を100％加湿した37℃のインキュベーター(93％空気および７％CO₂) 中に配置した。種々のアガロースゲルにおいて、神経突起を伸長させるPC12細胞の比率を、光学顕微鏡下の200倍拡大での分析のために光学的円筒形ゲル切片を選択することにより評価した。光学的円筒形切片を、顕微鏡の視野を平行軌道に沿ってディッシュの中心から側方に連続的に移動させることにより選択した。各ウェルにおいて少なくとも900のPC12細胞を、神経突起伸長について検査し、そして各タイプのアガロースゲルのうち少なくとも６つのウェルを分析した。ポジティブと計数するために有すべき基準は、神経突起がPC12細胞体の直径より長いことであった。両側スチューデントt-検定を用いて統計的有意性を決定した。p＜0.05であれば有意であると考えた。 PC12細胞は、Ag-GGGGG(GlyGlyGlyGlyGly；配列番号４)を除く全てのゲルにおいてFDAアッセイにより証明したところ生存性であった。PC12細胞はまた、Ag-GG GGG(GlyGlyGlyGlyGly；配列番号４)ゲルを除いて、培養６日後に全てのゲル中で神経突起を伸長させた。しかし、神経突起を伸長させたPC12細胞の比率は使用したゲルのタイプに依存した。全ての測定時点において、ラミニンオリゴペプチド誘導体化アガロースゲルは、非誘導体化Ag-Plainゲルよりも有意に高い比率の神経突起伸長を支持した(p＜0.05)。Ag-x-IKVAV(IleLysValAlaVal；配列番号３のA A酸₁₁-AA酸₁₅)-xゲルにおける神経突起伸長は、４日目および６日目で、Ag-GRGD SP(GlyArgGlyAspSerPro；配列番号２)、Ag-CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySe rArg；配列番号１)、Ag-PEPMIXおよび非誘導体化アガロースゲルと比較して有意に高かった(p＜0.05)(図５)。 NGFの非存在下では、いずれのアガロースゲルにおいても神経突起伸長は観察されなかった。Ag-plainと種々の誘導体化アガロースゲルとの間には神経突起長の測定可能な差異は観察されなかった(データは示さず)。IKVAV誘導体化(IleLys ValAlaVal；配列番号３のAA₁₁-AA₁₅)ゲルを包含する種々の誘導体化アガロースゲ神経突起を伸長させる細胞の比率より低かった。実施例３横断切断したラットの脊髄後根の再生に対する誘導体化アガロースゲルの効果を、横断切断した後根モデルにおける４mmの隙をつなぐ、CDPGYIGSR(CysAspProG lyTyrIleGlySerArg；配列番号１)-アガロースで充填した6mm長のポリマー誘導チャンネルを用いることによって評価した。４週間後、CDPGYIGSR(CysAspProGlyTy rIleGlySerArg；配列番号１)アガロースゲルで充填したチャンネルにおいて、非誘導体化アガロースゲルで充填したチャンネルと比較して、有意により多くのミエリン化された軸索が観察された。誘導チャンネル誘導チャンネルを、アクリロニトリル-塩化ビニル(PAN/PVC)コポリマーから湿式紡糸(wet-jet wet spinning)により作製した。Cabasso,I.、Encyclopedia of Chemical Technology 、12、492-517頁(1978)；Aebischerら、Biomaterials、12 、 50-56頁(1991)。チャンネルは、分子量カットオフ50,000Daの滑らかな内膜と外膜とからなり、その間にチャンネルに構造的支持をもたらす開口柱状網状構造(n etwork)を有する。内径0.8mmおよび0.5mmのチャンネルを、それぞれ脊髄根および腓腹神経モデル用に作製した。 CDPGYIGSR誘導体化アガロースゲル１％(重量/容積)のアガロースゲルを、実施例２に記載のようにLNオリゴペプチドCDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)で誘導体化した。PA N/PVC誘導チャンネルを一晩70％エタノール中に保存することにより滅菌した。誘導チャンネルをCDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)誘導体化アガロースゲル溶液および非誘導体化アガロースゲル溶液で充填し、そしてチャンネルの端部を加熱してシールし、ゲル溶液の漏れを防いだ。次いで、チャンネルを４℃まで冷却してアガロース溶液をゲル化させた。チャンネル内でアガロース溶液が「ゲル化」した後、これらを、それぞれ後根移植片用および腓腹神経移植片用に６mmおよび10mmの標準長に切断した。動物モデルおよび誘導チャンネル移植 180g〜220gの重さの成体雄アルビノラット(Wistar)を、ペントバルビタールの腹腔内注射(60mg/kg)により麻酔した。背部手術部位を剃毛し、そしてヨードフォア(Butadiene)を綿球で塗布した。腸骨稜を標識点として用いて５mmの背部正中切開を行った。両刺筋の退縮はＬ２〜Ｌ６脊椎を露出させた。両側の椎弓切除をＬ２〜Ｌ５に行って骨髄を露出させた。硬膜を正中切開することにより脊髄根を露出させた。鋭利でない神経フック(blunt nerve hook)を用いて、Ｌ４脊椎から出る後根を同定し、そして２mmの切片を取り出した。非誘導体化アガロースおよびCDPGYIGSR誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)アガロースを保持する６mm長の誘導チャンネルを用い、10-0単線維ナイロン縫合糸(Ethicon )を使用して神経の２つの端部をつないだ(概略のため、図６を参照のこと)。５匹のラットには非誘導体化アガロースで充填したチャンネルを導入し、そして６匹の動物にはCDPGYIGSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１) アガロースで充填したチャンネルを導入した。腓腹神経モデルについては、後肢手術部位を剃毛し、そしてヨードフォアで清浄した。180ｇ〜220ｇのアルビノラット(Wistar)の左後肢に、大腿に沿っておよび大腿の後部ならびに継続して膝を超えて「Ｌ］型の切開を行った。大殿筋麻痺筋を退縮させ、そして座骨神経を露出させた。座骨神経の腓腹分枝を同定し、それをたどって膝関節の下に下がり、そして２mm長の神経片を横断切断した。次いで神経の端部を、生理食塩水または非誘導体化アガロースまたはCDPGYIGSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)アガロースのいずれかで充填した誘導チャンネルにつないだ。５匹の動物には生理食塩水で充填したチャンネルを導入し、５匹にはアガロースPlainチャンネルを導入し、そして４匹はCDPGY IGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)-アガロースで充填したチャンネルを導入した。全ての動物を12時間のオン-オフ光サイクルの制御環境中で飼育した。食事と水は任意に与えた。移植片の回収および評価移植後４週目、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で動物を深く麻酔にかけ、そして200mlのヘパリン化生理食塩水、続いて250mlの冷リン酸緩衝化生理食塩水(ph7.4)中４％パラホルムアルデヒド2.5％グルテルアルデヒド溶液を経心的に(transcardially)潅流させた。手術部位を再開口し、そして誘導チャンネルを回収した。標本を事後固定(post-fix)し、脱水し、そしてグリコメタクリレート中に包埋した。後根チャンネルの1.5mm、２mmおよび3.5mmでの索断面領域(c able cross-section area)、ミエリン化された軸索数を、Zeiss Axiovert MC100 顕微鏡と接続したNIHソフトウェア1.47を用いて分析した。近位の神経断端を０m m点と定義し、そして遠位の神経断端を後根中の４mm神経隙の４mm点と定義した。腓腹神経移植片については、チャンネルに沿った２mmm点で、索断面領域およびミエリン化軸索数を６μmの半薄(semi-thin)切片で評価した。全ての切片を四酸化オスミウムおよびクレシルバイオレットで染色した。後根再生誘導チャンネルの縦に沿った半薄断面切片により、ミエリン化軸索は、４mmの神経隙の全体に沿って存在することが示された。再生された後根を保持する、アガロースゲルで充填した誘導チャンネルの組織学的切片は、ドーナッツ形の中心に位置した神経索を示した。PAN/PVCポリマーに対する組織反応は、多核巨細胞および結合組織浸潤からなった。血管新生は、シュバン細胞浸潤に沿って再生した神経組織の中心において明らかであった。誘導チャンネルの中心点における移植後４週間での再生している後根索の光学顕微鏡写真は、CDPGYIGSR(CysAspProG lyTyrIleGlySerArg；配列番号１)ゲルを含むチャンネルでは、非誘導体化アガロースを含むチャンネルと比較してかなり多くの神経組織を示した。４mm神経隙の中心点においては、AgCDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)で充填したチャンネルは、アガロースPlainゲルを有するチャンネルと比較して有意により多くの数のミエリン化軸索を有した(p＜0.05)(図７を参照のこと)。アガロースPlainで充填したチャンネルの中心点におけるミエリン化軸索数は、McC ormackら、J ．Comp．Neurol.、313、449-56頁(1991)に記載の生理食塩水で充填したチャンネルと同等であった。CDPGYIGSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySe rArg；配列番号１)アガロースゲルは、移植後４週目にチャンネルに沿って0.5mm および2.0mmにおいて、有意により高いミエリン化軸索密度を有した(p＜0.05)( 図８)。ミエリン化軸索密度は、索領域の10⁵平方μmあたりのミエリン化軸索数として定義される。腓腹神経の再生横断切断した腓腹神経をつなぐために移植される全ての10mm長の誘導チャンネルは、ラット膝関節の屈曲によりねじれが生じた。ねじれの近位側の神経の組織学的評価により、チャンネルの中心に位置する、ミエリン化軸索を有する再生した索が示された。ねじれの遠位側のチャンネルに存在する索は全て、繊維状の索を有したが、ミエリン化軸索は有さなかった。ほぼ全てのねじれは神経隙中の２ mm〜４mmの間に生じた。従って、本研究においては2mm点のみをミエリン化軸索について分析した。移植後４週目のAg-CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg ；配列番号１)で充填したポリマー誘導チャンネルの２mm点における再生腓腹神経の光学顕微鏡写真は、他の誘導チャンネルの場合よりも比較的多くの神経束および血管新生を示した。８mmの神経隙中への２mmでは、AgCDPGYIGSR(CysAspProG lyTyrIleGlySerArg；配列番号１)ゲルで充填した誘導チャンネルは、生理食塩水充填チャンネルまたはアガロースPlain充填チャンネルのいずれかと比較して、有意により多くのミエリン化軸索を有した(p＜0.05)。図９を参照のこと。この点において、CDPGYIGSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１) アガロースチャンネル中のミエリン化軸索密度もまた、アガロースPlain充填チャンネルおよび生理食塩水充填チャンネル中の軸索密度より有意に高かった(p＜ 0.05)(図10を参照のこと)。４週目にミエリン化軸索数を正常なコントロール腓腹神経に存在する数と比較すると、生理食塩水充填チャンネルを横切って再生したミエリン化軸索数は、コントロール腓腹神経の12％であり、AgPlain充填チャンネルチャンネルについてはコントロールの13％、AgCDPGYIGSR(CysAspProGlyTy rIleGlySerArg；配列番号１)充填チャンネルについてはコントロールの40％であった。横断切断したラット後根は、LNオリゴペプチドで誘導体化したアガロースゲルで充填した半透過性誘導チャンネルにおいて４週間後に４mm隙を横切って再生する。これは、生理食塩水のみで充填したチャンネルを用いる同一モデルにおける初期の実験(McCormackら、J ．Comp．Neutrol.、313、449-56頁(1991)により得られた限定された再生と対照的である。神経隙中へ0.5cmでのミエリン化軸索数には有意な差異は存在しないが、チャンネルの中心点において、CDPGYIGSR(CysAsp ProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)誘導体化アガロースゲルで充填したチャンネルは、アガロースPlainで充填したチャンネルと比較して有意により大きなミエリン化軸索を有した。この観察は、AgPlainゲルに比較して、CDPGYIGSR(CysAs pProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)で誘導体化したゲルにおいては神経再生速度がより速いことを示唆する。非誘導体化アガロースゲル中のチャンネルの中心点におけるミエリン化軸索数は、生理食塩水で充填したMcCormackのチャンネルにおいて得られた数と同等でックスが、示されたように、半透過性チャンネル中での再生を阻害しないことを示す。例えば、Valentiniら、Exp ．Neurol.、98、350-56頁(1987)を参照のこと。CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)誘導体化アガロースゲルはまた、神経隙の0.5mm点および2.0mm点で、再生した索において非誘導体化アガロースゲルと比較してより高いミエリン化軸索密度を有する。この観察をチャンネルに沿ったミエリン化軸索数のデータと合わせると、誘導体化アガロースゲル中の索領域あたりの繊維性組織は、非誘導体化AgPlainゲルに比較してより少ないことを示す。チャンネルの中心点での再生索のドーナッツ形状から、再生環境中での細胞の活動によるアガロースゲルのシネレシスの可能性が指摘される。 8mmの腓腹神経隙を横切る10mm長の誘導チャンネルの全ては、ラット膝関節を横切って位置するため、神経隙への2mm点の遠位側でねじれが生じた。しかし、C DPGYIGSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)アガロースゲルで充填したチャンネル中の、２mm点でのミエリン化軸索の数および密度の両方は、非誘導体化アガロースゲルまたは生理食塩水で充填したチャンネルと比較してより大きかった。従って、後根モデルおよびより末梢の腓腹神経モデルの両方において、CDPGYI GSR-誘導体化(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１)アガロースチャンネルは、非誘導体化アガロースまたは生理食塩水で充填したチャンネルと比較して、索領域あたりより高い密度でより多くのミエリン化軸索を有した。このデータは、神経突起促進生体分子をアガロースヒドロゲルにカップリングすることにより、神経再生を増強するように設計されたマトリックスを容易に開発し得ることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＡＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アエビッシャー，パトリックスイス国シーエイチ−1095 ルトリー, チェミンデプランタス 65

Claims

【特許請求の範囲】１．生体人工3-Dヒドロゲル細胞外マトリックスであって、ここで該ヒドロゲルは、少なくとも１つのECM接着性分子またはそれらの接着性ペプチドフラグメントで誘導体化される、マトリックス。２．前記ヒドロゲルが、RGD含有配列（ArgGlyAsp；配列番号２のAA₂-AA₄）、Y IGSR含有配列（TyrIleGlySerArg；配列番号１のAA₅-AA₉）、IKVAV含有配列（Ile LysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁-AA₁₅）、および該配列の任意の組合せからなる群から選択されるペプチドフラグメントで誘導体化される、請求項１に記載のマトリックス。３．前記ヒドロゲルが、配列CDPGYISR（GlyAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）で誘導体化される、請求項２に記載のマトリックス。４．前記ヒドロゲルが、配列GRGDSP（CysArgGlyAspSerPro；配列番号２）で誘導体化される、請求項２に記載のマトリックス。５．前記ヒドロゲルが、配列CSRARKQAASIKVAVSADR（CysSerArgAlaArgLysGlnAl aAlaSerIleLysValAlaValSerAlaAspArg；配列番号３）で誘導体化される、請求項２に記載のマトリックス。６．前記ヒドロゲルが多糖類である、請求項１から５のいずれか一項に記載のマトリックス。７．前記ヒドロゲルがアガロースである、請求項６に記載のマトリックス。８．前記アガロースの濃度範囲が0.5から1.25％(w/v)であり、そして平均アガロースのゲル孔半径が120nmより大きい、請求項７に記載のマトリックス。９．前記アガロース濃度が約1.0％(w/v)であり、そして前記平均アガロースゲル孔半径が約150nmである、請求項８に記載のマトリックス。１０．重篤な神経の再生に用いられる神経誘導チャンネルであって：ａ）管状の生体適合性の半透過性膜であって、該膜は、重篤な神経の末端を受容するように適合された開口部、および該神経が再生され得る内腔を有する、およびｂ）生体人工3-Dヒドロゲル細胞外マトリックスであって、該マトリックスは、該半透過性膜の内腔中に堆積されており、ここで該ヒドロゲルが、神経細胞接着に関与する、少なくとも１つのECM接着性分子、またはそれらの接着性ペプチドフラグメントで誘導体化される、を含む、神経誘導チャンネル。１１．前記接着性ペプチドフラグメントが、RGD含有配列（ArgGlyAsp；配列番号２のAA₂-AA₄）、YIGSR含有配列（TyrIleGlySerArg；配列番号１のAA₅-AA₉）、 IKVAV含有配列（IleLysValAlaVal；配列番号３のAA₁₁-AA₁₅）、および該配列の任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の神経誘導チャンネル。１２．前記ヒドロゲルが、配列CDPGYIGSR（CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；配列番号１）で誘導体化される、請求項１１に記載の神経誘導チャンネル。１３．前記ヒドロゲルが、配列GRGDSP（GlyArgGlyAspSerPro；配列番号２）で誘導体化される、請求項１１に記載の神経誘導チャンネル。１４．前記ヒドロゲルか、配列CSRARKQAASIKVAVSADR（CysSerArgAlaArgLysGln AlaAlaSerIleLysValAlaValSerAlaAspArg；配列番号３）で誘導体化される、請求項１１に記載の神経誘導チャンネル。１５．前記ヒドロゲルが多糖類である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の神経誘導チャンネル。１６．前記ヒドロゲルがアガロースである、請求項１５に記載の神経誘導チャンネル。１７．前記アガロースの濃度範囲が0.5から1.25％(w/v)であり、そして平均アガロースのゲル孔半径が120nmより大きい、請求項１６に記載の神経誘導チャンネル。１８．前記アガロース濃度が約1.0％であり、そして前記平均アガロースゲル孔半径が約150nmである、請求項１６に記載の神経誘導チャンネル。１９．重篤な神経のインビボでの再生を促進するための方法であって、該重篤な神経の近位および遠位末端を、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の管状の神経誘導チャンネルの各末端に固定する工程を包含する、方法。２０．インビボでの組織置換を促進するための方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載のヒドロゲルマトリックスにおいて細胞を懸濁し、細胞が播種されたヒドロゲルマトリックスを形成する工程、および該細胞が播種されたヒドロゲルマトリックスを宿主中の適切な移植部位へ移植する工程を包含する、方法。２１．前記細胞が播種されたマトリックスが、前記宿主中に移植する前にインビトロで培養される、請求項２０に記載の方法。２２．インビボでの組織再生を促進するための方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載のヒドロゲルマトリックスを宿主中の適切な移植部位へ移植する工程を包含する、方法。２３．宿主中のインビボ移植で移植された細胞の代謝機能を制御するための方法であって、以下の工程：ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の生体人工細胞外マトリックス中で細胞を懸濁して、細胞が播種されたマトリックスを形成する工程；ｂ）半透過性膜中に該マトリックスをカプセル化し、生体人工器官を形成する工程；ｃ）該生体人工器官を宿主中の適切な移植部位に移植する工程、を包含する、方法。