DE10105041A1 - Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten - Google Patents

Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten

Info

Publication number
DE10105041A1
DE10105041A1 DE10105041A DE10105041A DE10105041A1 DE 10105041 A1 DE10105041 A1 DE 10105041A1 DE 10105041 A DE10105041 A DE 10105041A DE 10105041 A DE10105041 A DE 10105041A DE 10105041 A1 DE10105041 A1 DE 10105041A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
alkyl
alkoxy
derived
pro
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10105041A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Rapin
Hans Klaus Witzmann
Jean-Marie Grumel
Jacques Gonella
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TELL PHARM AG HERGISWIL
Original Assignee
TELL PHARM AG HERGISWIL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TELL PHARM AG HERGISWIL filed Critical TELL PHARM AG HERGISWIL
Priority to DE10105041A priority Critical patent/DE10105041A1/de
Priority to ES02711833T priority patent/ES2275849T3/es
Priority to DK02711833T priority patent/DK1359934T3/da
Priority to AT02711833T priority patent/ATE344673T1/de
Priority to AU2002231771A priority patent/AU2002231771A1/en
Priority to PCT/EP2002/001180 priority patent/WO2002062828A2/en
Priority to DE60215917T priority patent/DE60215917T2/de
Priority to PT02711833T priority patent/PT1359934E/pt
Priority to EP02711833A priority patent/EP1359934B1/de
Priority to JP2002563180A priority patent/JP4169597B2/ja
Publication of DE10105041A1 publication Critical patent/DE10105041A1/de
Priority to US10/635,797 priority patent/US7129213B2/en
Priority to CY20071100018T priority patent/CY1107990T1/el
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptidderivaten zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, umfasssend die Tripeptidderivate. DOLLAR A Die Tripeptidderivate werden durch die folgende Formel dargestellt: DOLLAR F1 wobei X OH, (C¶1-5¶)alkoxy, NH¶2¶, NH-C¶1-5¶-alkyl, N(C¶1-5¶ alkyl)¶2¶ darstellt; DOLLAR A R¶1¶ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C¶1-5¶) Alkoxy-Gruppen, (C¶1-5¶) Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein können, Ala, Val, Leu oder Ile ableitet; DOLLAR A R¶2¶ einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp und Asn ableitet; DOLLAR A Y¶1¶ und Y¶2¶ unabhängig voneinander H oder (C¶1-5¶) Alkyl darstellen; DOLLAR A R¶3¶ und R¶4¶ unabhängig voneinander H, OH, (C¶1-5¶) Alkyl oder (C¶1-5¶) Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R¶3¶ und R¶4¶ nicht beide OH oder (C¶1-5¶) Alkoxy sind; und DOLLAR A R¶5¶ H, OH, (C¶1-5¶) Alkyl oder (C¶1-5¶) Alkoxy darstellt; DOLLAR A oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptiden bzw. Tripeptid-Detivaten bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere der Alzheimer-Krankheit, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Neurodegenerative Krankheiten zeichnen sich durch einen Abbau bzw. eine Degeneration der Nerven aus, der in der Regel durch Apoptose hervorgerufen wird. Beispiele für neurodegenerative Krankheiten schließen die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson- Krankheit wie auch die mit AIDS verbundenen neurologischen Störungen ein. Bei z. B. der Alzheimer-Krankheit führt der Nervenabbau zu einer Gedächtnisstörung, einer Störung des Sprach- und Denkvermögens sowie einer Störung der Fähigkeit, Entscheidungen zu treffen. Wie es zu diesen Störungen im einzelnen kommt, ist bislang nicht geklärt. Biochemisch ist u. a. eine Veränderung des kortikalen cholinergen Systems mit einer Verminderung bei der Bildung des Neurotransmitters Acetylcholin nachweisbar. In der Hirnrinde von Patienten, die unter der Alzheimer-Krankheit leiden, ist die Acetylcholin- Konzentration um 20 bis 40% vermindert. In der Folge werden Nervenenden attackiert, und dies führt letztlich zu dem Absterben von Hirnzellen. Hiervon ist insbesondere der Hippokampus betroffen.
Vor diesem Hintergrund setzen Therapieansätze für die Alzheimer-Krankheit daher bei einer Stabilisierung der Acetylcholin-Konzentration an, und zwar durch Inhibierung der Acetylcholinesterase, die Acetylcholin zu Acetat und Cholin abbaut. Die Verwendung von Acetylcholinesterase-Inhibitoren weist jedoch den Nachteil auf, dass sie nur zu einer zeitweiligen Verbesserung führen, nicht jedoch die Nervendegeneration stoppen oder sogar rückgängig machen können.
Andererseits sind sogenannte neurotrophe Faktoren bzw. Neurotrophine bekannt, denen eine maßgebliche Rolle für das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung diskreter neuronaler Populationen zugeschrieben wird. Diese Neurotrophin-Familie schließt den Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF), vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor, BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) und die CNTF-Familie (ziliare neurotrophe Faktoren) ein. Neurotrophine sind kleine basische Proteine mit einem Molekulargewicht in dem Bereich von 26 bis 28 kDa. NGF ist das am besten charakterisierte Mitglied der Neurotrophin- Familie, und es hat sich herausgestellt, dass NGF eine Aktivität in vielen verschiedenen Geweben zeigt.
In dem peripheren Nervensystem (PNS) ist NGF für die Entwicklung von sympathischen und bestimmten sensorischen Nerven maßgeblich. In dem zentralen Nervensystem (ZNS) nimmt NGF eine trophische Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn ein. Es spielt zudem eine Rolle bei der neuronalen Regeneration im erwachsenen ZNS-Gewebe.
Es ist bekannt, dass cholinerge Neuronen Acetylcholin stärker in Anwesenheit von NGF als in dessen Abwesenheit herstellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in Primaten eine Verabreichung von NGF zu einer Regeneration von cholinergen Zellkörpern führte. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass eine veränderte Aktivität von NGF daher ein Ausgangspunkt bei der Degeneration von cholinergen Neuronen sein kann. Zumindest theoretisch scheinen daher neurotrophe Substanzen als geeignet für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten wie z. B. der Alzheimer-Krankheit. Diese physiologisch vorkommenden Substanzen weisen jedoch einen kurzen Wirkungsradius auf, der denen autokriner oder parakriner Substanzen ähnelt. Daher ist es bis heute nicht möglich, herkömmliche therapeutische Wege (enteral oder parenteral) für ihre Verabreichung zu nutzen, da sie im Blutkreislauf und anderen Geweben der Proteolyse unterliegen und hierdurch desaktiviert werden. Zudem ist bekannt, dass sie nicht die Bluthirnschranke überwinden können, was jedoch eine Voraussetzung für eine Wirkung auf das ZNS ist.
So haben klinische Versuche mit rekombinant-humanen Neurotrophinen bislang nicht zum Erfolg geführt. Eine in Betracht kommende intrazerebrale Verabreichung sollte zudem aus praktischen Erwägungen ausgeschlossen sein. Daher ist eine Übertragung der Ergebnisse aus in vitro-Experimenten mit NGF oder anderen Neurotrophinen sowie mit Fragmenten dieser Peptide auf eine mögliche therapeutische Verabreichung nicht ohne weiteres möglich.
Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, bestimmte Substanzen bereitzustellen, die sowohl zu einer (Re-) Aktivierung des Nervenwachstums (insbesondere von Hippokampuszellen) führen als auch einer herkömmlichen therapeutischen Verabreichung zugänglich sind und die somit ihre Verwendung als Medikament für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten ermöglichen. Weiterhin ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen.
Dieses erfindungsgemäße Ziel wird gelöst durch die Verwendung der Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-C1-5-alkyl, N(C1-5 alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5) Alkoxy-Gruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein können, sowie Ala, Val, Leu oder Ile ableitet;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp, und Asn ableitet;
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-5) Alkyl darstellen;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5) Alkoxy sind; und
R5 H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellt;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;
zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst Verbindungen der obigen Formel (I), wobei
X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-(C1-5)-alkyl, N(C1-5 alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5) Alkoxygruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys ableitet;
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-5) Alkyl darstellen;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5) Alkoxy sind; und
R5 H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellt;
oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, und
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Sofern nicht anders angegeben, können die Aminosäurereste sowohl in der D- als auch in der L-Form vorliegen, wobei die L-Form bevorzugt ist.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in denen R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Ile ableitet oder sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp ableitet, die jeweils wahlweise durch eine oder mehrere (C1-5) Alkoxy-Gruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder ein oder mehrere Halogenatome substituiert sein können, insbesondere ein Rest, der sich von Phe ableitet, die wahlweise durch eine oder mehrere (C1-5) Alkoxy-Gruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder ein oder mehrere Halogenatomen substituiert sein kann.
In der Formel (I) ist X vorzugsweise (C1-5) Alkoxy, NH2, NH- (C1-5) Alkyl oder N(C1-5 Alkyl)2, besonders bevorzugt sind NH2 und N(C1-3 Alkyl)2.
R2 ist bevorzugt ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet.
Besonders bevorzugt als Verbindung der Formel (I) ist Glycyl- L-phenylalanyl-L-prolinamid bzw. dessen pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren (Phe für Phenylalanin usw. wie auch die teilweise unten verwendeten Einbuchstabenabkürzungen wie F für Phenylalanin) sind dem Fachmann geläufig (siehe z. B. Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988). So bedeutet Phe Phenylalanin, Gly Glycin usw. Der Ausdruck "ein Rest, der sich von der Aminosäure Phe ableitet", bezeichnet somit einen Benzyl (-CH2-C6H5)-Rest. Entsprechend bezeichnet "ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet", ein Wasserstoffatom, "ein Rest, der sich von der Aminosäure Ala ableitet", eine Methyl-Gruppe usw.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche Substanzen und somit für eine enterale oder parenterale Verabreichung geeignet.
Zudem zeigen die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der Formel (I) die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke überwinden zu können. Diese Fähigkeit konnte mit Hilfe eines Hirn-Blut- Verteilungskoeffizienten quantifiziert werden, dessen Definition und Bestimmung Molecular Modelling in Zusammenhang mit QSAR (quantitative structure activity relationships) unten genauer beschrieben werden wird. Erfindungsgemäß ist ein Hirn-Blut-Verteilungskoeffizient von -3,5 oder höher bevorzugt, besonders bevorzugt liegt er in dem Bereich von -3,0 und höher.
Die Synthese der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate ist nicht besonders beschränkt und kann gemäß bekannten Verfahren, vorzugsweise stereo-spezifischen Verfahren der Peptidchemie durchgeführt werden, bei denen die L- bzw. D-Konfiguration der jeweiligen Aminosäuren bzw. ihrer Derivate beibehalten wird. Verschiedene Peptidsynthesen sind in Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988, Seiten 829 bis 834 beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt sind insbesondere die N-Carbonsäureanhydrid-Methode (NCA-Methode) und die Methode unter Verwendung von gemischten Carbonsäureanhydriden, wie durch die folgenden Reaktionsgleichungen veranschaulicht:
NCA-Methode
1. Boc-AA1-NCA + H-L-Pro-NH2
→ BOC-AM-L-Pro-NH2
2. Boc-AA1-L-Pro-NH2 + TFA → TFA-H-AA1-L-Pro-NH2
3. Boc-AA2-NCA + TFA-H-AA1-L-Pro-NH2 → HCl-H-AA2-L-AA1-Pro-NH2
4. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2 + Hcl→ HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH2
Gemischte Carbonsäure-Anhydrid-Synthese
1. Boc-AA1OH + Cl-COOCH2
(CH3
)2
→ Boc-AA1-OCOO-CH2
CH(CH3
)2
2. Boc-AA1-OCOOCH2CH(CH3)2 → Boc-AA1-L-Pro-NH2
3. Boc-AA2-OH + Cl-COOCH2CH(CH3)2 → Boc-AA2-OCOOCH2CH)CH3)2
4. Boc-AA2-OCOOCH2CH(CH3)2 + TFA-H-AA1-L-Pro-NH2 → Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2
5. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2 + HCl → HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH2
wobei AA1 bzw. AA2 die mittlere bzw. endständige Aminosäure (abgeleitet von R1 bzw. R2) bezeichnen, Boc einen tert.- Butyloxycarbonyl-Rest bezeichnet, NCA N-Carbonsäureanhydrid bezeichnet, und TFA Trifluoressigsäure bezeichnet. Die Ausgangsstoffe sind jeweils im Handel erhältlich.
Bei Verwendung von Aminosäuren, die weitere funktionelle Gruppen aufweisen, wie z. B. Serin, können diese in dem Fachmann geläufiger Weise geschützt werden.
Zudem können die erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate in einer (gegebenenfalls modifizierten) Merryfield-Synthese an der Festphase synthetisiert werden, vorzugsweise unter Verwendung von Fluoren-9-yl-methoxy­ carbonyl-Schutzgruppen (Fmoc-Reste) bzw. Fmoc/tert-Butyl (tBu)-geschützten Aminosäuren.
Die oben beschriebenen Reaktionen weisen in der Regel Ausbeuten in der Größenordnung von über 90%, bezogen auf den einzelnen Reaktionsschritt, und eine Gesamtausbeute von mehr als 60% auf. Die Reinheit der so synthetisierten Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate betrug im allgemeinen über 98% und war daher ausreichend für die Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Die Strukturen der Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate können durch Massenspektroskopie (MS), Hochleistungsflüssig-Chromatographie (HPLC), automatisierte Aminosäure-Analyse (AAA), optische Drehung (OR), Infrarot- und Ultraviolett-Spektroskopie (IR, UV) bestätigt werden.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Wirksamkeit der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate ist deren Konzentration im ZNS. Diese wird neben anderen Faktoren beeinflusst durch das Ausmaß der Passage der Blut- Hirn-Schranke und kann sowohl durch aktiven als auch passiven Transport erfolgen. Als Mechanismen kommen sogenannter "facilitated" Transport oder Transport über "lipid rafts" in Frage kommen. Die Bilanz des Transports wird unabhängig von dessen Art bzw. Mechanismus durch den Hirn-Blut- Verteilungskoeffizienten (log HB) ausgedrückt. Je höher dieser Koeffizient, desto höher die Konzentration im ZNS.
Regelmäßig wirksam ist eine Verabreichung in einer Dosis von mehr als 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht, insbesondere bei mehrfacher parenteraler Verabreichung.
Aufgrund ihrer molekularen Struktur weisen diese Substanzen eine sehr geringe Toxizität sowohl in akuten wie auch in chronischen Toxizitätsuntersuchungen auf. Die geringste letale Dosis (i. v.) in Ratten betrug 250 bis 350 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Daher zeigen die getesteten Substanzen ein komfortables therapeutisches Verhältnis, das eine Voraussetzung für eine therapeutische Anwendung im Menschen darstellt.
Die Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Verabreichung über verschiedene Wege geeignet sind, z. B. parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), über den Atemwegstrakt (bukkal, sublingual, nasal, bronchial), den transdermalen Weg (perkutan) und die enterale Route (peroral). Im letzten Falle ist eine geeignete Dosierung notwendig, um den "first pass effect" zu überwinden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel oder Adjuvantien. Zur Formulierung können Standardtechniken verwendet werden, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (letzte Ausgabe) offenbart.
Die Verabreichungsform wird in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg gewählt und umfasst u. a. Tabletten, Kapseln, Pulver und Lösungen.
Für die orale Verabreichung werden vorzugweise Tabletten und Kapseln verwendet, die ein geeignetes Bindemittel, z. B. Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einen geeigneten Füllstoff, wie z. B. Lactose oder Stärke, ein geeignetes Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat, und wahlweise weitere Zusatzstoffe enthalten.
Für die parenterale Verabreichung sind sterile wässrige Lösungen bevorzugt. Geeignete wässrige Lösungsmittel schließen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Hank-Lösung und Ringer-Lösung ein. Bevorzugt ist u. a. eine physiologische Kochsalzlösung enthalten 20 g/l des Tripeptides bzw. Tripeptid-Derivates, z. B. Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid.
Die anti-neurodegenerative Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate ist überraschend, da Peptide regelmäßig einer proteolytischen Spaltung durch Endo- oder Exopeptidasen und weiterer Metabolisierung unterliegen, so dass ein Erreichen der Blut- Hirn-Schranke und sogar deren Überwindung nicht erwartet werden konnte. Das Ausmaß und die Geschwindigkeit einer solchen Spaltung wird durch die Halbwertzeit des Tripeptids bzw. Tripeptid-Derivats im Plasma angezeigt. Es ist bekannt, dass die Halbwertzeit von Tripeptiden wie z. B. Thyroliberin sehr kurz ist. Daher war es überraschend, dass die erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid- Derivate unerwartet lange Halbwertzeiten (≧ 24 h) aufweisen. Diese lange Halbwertzeit ist eine weitere Voraussetzung für eine ausreichende anti-neurodegenerative Wirkung.
Zudem konnte an Hepatocyten experimentell gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate nicht in der Leber metabolisiert werden. Dieses Ergebnis wurde durch Analyse des Plasmas und der zugesetzten Hepatozyten bestätigt, in dem vier Stunden nach Exposition nur das unveränderte Tripeptid gefunden wurde.
Die hervorragenden therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid- Derivate werden im folgenden anhand eines besonders geeigneten Modells für die Alzheimer-Krankheit dargelegt. In diesem Modell konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid- Derivate nicht nur zu einer Erhöhung der Anzahl von Hippokampus-Neuronen führt, sondern auch zu einer Verbesserung der Lernfähigkeit der in den Tests verwendeten Ratten. Bevor diese Versuche im Detail beschrieben werden, wird jedoch zuvor die Bestimmung des Hirn-Blut- Verteilungskoeffizienten und eine ausgewählte Synthese des Tripeptidderivates beschrieben, das in den darauffolgenden Versuchsreihen verwendet wurde.
1. Bestimmung des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten
Wie bereits oben dargelegt, stellt die Blut-Hirn-Schranke für wasserlösliche Stoffe in der Regel ein Hindernis dar, das die Anwendung vieler wasserlöslicher Stoffe für die Behandlung des ZNS bei herkömmlicher Verabreichung verhindert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate diese Blut-Hirn-Schranke zu überwinden vermögen. Dieses Ausmaß der Blut-Hirn- Verteilung der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptid-Derivate kann wie folgt quantifiziert werden.
Als Technik zur Quantifizierung bestimmter physikochemischer oder pharmakologischer Eigenschaften chemischer Verbindungen hat sich die sogenannte QSAR (quantitative structure activity relationship)-Technik etabliert. Hierbei wird eine in der Regel lineare Korrelation zwischen einer bestimmten experimentellen Eigenschaft der Verbindungen (wie z. B. des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten (HB)) mit berechneten strukturellen Parametern A, B, C usw. durch Anpassung der sog. Deskriptoren (X1, X2 usw.) gefunden, wobei die Gleichung prinzipiell die folgende Form aufweist:
Log HB = (X1 × A) + (X2 × B) + (X3 × C) + . . . + Konstante.
Mit den so bestimmten Deskriptoren ist es dann möglich, die jeweilige experimentelle Eigenschaft wie z. B. den Hirn-Blut- Verteilungskoeffizienten von Verbindungen, für die diese experimentellen Daten nicht vorliegen, zu berechnen. Entsprechend wird erfindungsgemäß die Hirn-Blut-Verteilung wie folgt bestimmt.
Auf Grundlage von experimentellen Daten von 75 Verbindungen (siehe Luco, J. M., J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1999), 39, 396-404) und bestimmten Parametern, wie im folgenden dargelegt, konnte eine lineare Korrelation zwischen berechneten und experimentellen Werten erhalten werden.
Die Verbindungen wurden hierbei unter Verwendung des Molecular Modelling-Programmpakets SYBYL konstruiert (Tripos Associates Inc., 1699 S. Henley Road, Suite 303, St. Louis, MO63144, USA). Um Konformationen niedriger Energie der Verbindungen eines ausgewählten Satzes (A-F-P, A-dF-P, A-F- dP, A-dF-dP) zu bestimmen, wurde eine Zufallssuche ausgeführt. Alle Torsionswinkel mit Ausnahme der der Peptidbindung wurden als flexibel betrachtet. Die Grundgerüstkonformationen der Strukturen mit der geringsten Energie wurden dann als Ausgangskonformation für alle Verbindungen verwendet.
Alle manuell konstruierten Verbindungen wurden unter Verwendung des Tripos-Kraftfeldes (siehe Clark, M., Kramer, III, R. D, und von Optenbosch, N. (1989), J. Comp. Chem. 10, 982-991) mit Gasteiger (PEOE)-Partialladungen (Gasteiger, J., Marsili, M. (1980; Tetrahedron 36, 3219-3238)) und einer distanzabhängigen dielektrischen Konstante von 4 energetisch minimiert.
Das Molecular Graphics-Programm MOE (Chemical Computing Group Inc., Montreal, Canada, http:/ / www.chemcomp.com) ermöglicht dann die Berechnung von einem anwendbaren Satz von Deskriptoren, die nur von der Verknüpfung der Verbindungen und der Atomtypen (Typen im Sinne der Kraftfeldparameter) abhängen (siehe Labute auf der o. e. home page). Die hier verwendeten Deskriptoren schließen eine einfache Annäherung der von der Waals-Oberfläche der Verbindungen ein. Für die Testserie von 1947 organischen Verbindungen konnte eine hohe Korrelation (r2 = 0,9666) zwischen der exakten von der Waals- Oberfläche und der 2D-Annäherung erhalten werden. Der erste Satz der 14 Parameter (PEOE-VSA) zieht die Ladungsverteilung (PEOE) des Moleküls unter Verwendung gleichförmiger Intervallgrenzen in Betracht. Ein zweiter Satz von 10 Deskriptoren (SlogP-VSA) beschreibt das Log (P) der Verbindungen und ein dritter Satz von 8 Deskriptoren (SMR- VSA) hängt von der molekularen Polarisierbarkeit ab.
Die Werte für die oben beschriebenen 32 Deskriptoren wurden jeweils für die 75 Verbindungen berechnet (siehe Lucco, J. M., J. Chem. Inf. Comput. SCI. (1999), 39, 396-404), um eine Korrelation zu der experimentellen Hirnblutverteilung zu finden. Eine Regression der Hauptkomponenten wurde durchgeführt, um ein lineares Modell für Log (HB) als eine Funktion der Deskriptoren abzuschätzen. In einer ersten Berechnung ergab sich, dass 8 Deskriptoren aufgrund sehr geringen Beitrages vernachlässigt werden konnten. Nach dem zweiten Durchlauf ohne diese 8 Deskriptoren erschienen 9 Deskriptoren mit Beiträgen von weniger als 0,1. Letztendlich ergab sich auf Grundlage der Berechnungen von 70 Verbindungen (5 stark abweichende Verbindungen wurden weggelassen) unter Verwendung der verbleibenden 15 Deskriptoren eine relativ lineare Korrelation. Diese Korrelation ist graphisch in Fig. 1 gezeigt (in der Graphik: verwendete Komponenten: 15; condition number 663.7658; root mean square error (RMSE): 0.20126; correlation coefficient (R2): 0.93240; cross­ validated R2: 0.88321).
Wobei Log(HB) wie folgt definiert ist:
Log(HB) = Log (Konzentration im Gehirn)/(Konzentration im Blut)).
Die durch diese Korrelation erhaltenen Deskriptoren können dann für die Berechnung der Hirnblutverteilung von den erfindungsgemäßen Tripeptiden bzw. Tripeptid-Derivaten verwendet werden.
Unter anderem wurden folgende Werte erhalten, die sich auf die im physiologischen pH-Bereich vorliegenden Formen beziehen:
A1: aliphatische Aminosäuren einschließlich Substitution an der Aminogruppe, gemäß Formel (I) Y1Y2N-CR2H-CO-.
A2: aromatische Aminosäuren einschließlich Substitution an Phenylring, sowie aliphatische Aminosäuren, gemäß Formel (I) -NH-CHR1-CO-.
A3: Prolin und Derivate D: rechtsdrehend
Aus diesen Berechnungen können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
  • a) Die Verwendung des Prolinamids, des Prolin(diethyl)amids oder des Prolinmethylesters anstelle der freien Säure des Prolins ist im Hinblick auf die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke vorteilhaft.
  • b) Unter den verwendeten Bausteinen von A2 ist die aromatische Aminosäure F und deren Alkylderivate sowie Isoleucin vorteilhaft.
  • c) Unter den verwendeten Bausteinen von A1 sind die aliphatischen Aminosäuren L und I sowie die Substitution der Aminogruppe von G und I durch 2 Ethylgruppen besonders vorteilhaft.
  • d) Die optische Chiralität der Aminosäurebausteine spielt zumindest bei der passiven Überwindung der Blut-Hirn- Schranke offenbar keine Rolle.
2. Synthese von HCl-H-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 Schritt 1 Boc-L-Phe-OH + H-L-Pro-NH2 → Boc-L-Phe-L-Pro-NH2
87,6 g Boc-L-Phe-OH wurden in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid (DMF) und 300 ml 1,2-Dimethoxyethan (DME) gelöst und auf -15°C abgekühlt. Dann wurden 37 ml N- Methylmorpholin (NMM) (1 Äquivalent) auf einmal hinzugefügt und dann 45 ml Isobutylchloroformiat (IBCF)(1 Äquivalent) über einen Zeitraum von 10 min hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei -15°C weitere 5 min gerührt. 40 g TFA. H-L-Pro- NH2 (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 min hinzugefügt, und anschließend wurden 315 ml N,N-Diisopropyl-N-ethylamin (DIEA) (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton- Falle, aufkonzentriert, und der Rest wurde in 1 l Ethylacetat aufgenommen. Anschließend wurde zwölfmal mit jeweils 80 ml einer 1 N wässrigen KHSO4-Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, zehnmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO3-Lösung, einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 l Trenntrichter gewaschen. Das anschließende Trocknen erfolgte über 50 g Na2SO4. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben aufkonzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in 1 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt. Das anschließende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mm Hg (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/Aceton-Falle). So wurden 92,8 g Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 erhalten (Ausbeute: 77,8%).
Analysedaten
Molmasse (Massenspektrometrie): 317 g/mol
Schmelzpunkt: 60°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC): 95,2%
optische Rotation [Na/20°C]: -23,9
H2
O [KF]: 1,84%
Schwermetalle: 25,4 ppm
Lösungsmittel: 2,02‰
Elementaranalyse: 64,0% C
7,4% H
11,4% N
17,0% O
Schritt 2 Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 → TFA.H-L-Phe-L-Pro-NH2
Das in Schritt 1 erhaltene Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 (180 g) wurde in einem 2 l Rundhalskolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührer, in 250 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert. Dann wurden 250 ml Trifluoressigsäure über eine Stunde mit der Lösung bei Raumtemperatur (15-25°C) und Atmosphärendruck umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann in 5 l tert-Butylmethylether (TBME) unter Rühren ausgefällt und das Präzipitat auf einem Sinterglastrichter aufgesammelt, und anschließend wurde zweimal mit 1,5 l Diethylether und zweimal mit 1 l Hexan gewaschen. Das anschließende Trocknen erfolgte wie in Schritt 1.
Schritt 3 Boc-Gly-OH + TFA.H-L-Phe-L-Pro-NH2 → Boc-Gly-L-Phe- L-Pro-NH2
44 g Boc-Gly-OH (1 Äquivalent) wurden in einer Mischung von 50 ml DMF und 300 ml DME gelöst und dann auf -15°C abgekühlt. Dann wurden 28 ml NMM (1 Äquivalent) in einem Schub hinzugefügt und dann 34 ml (1 Äquivalent) IBCF über einen Zeitraum von 10 min hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei -15°C über weitere 5 min gerührt. 94,5 g TFA.H-L-Phe-L- Pro-NH2 (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 min hinzugefügt, und anschließend wurden 44 ml DIEA (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton-Falle, aufkonzentriert, und der Rest wurde in 1,2 l Ethylacetat aufgenommen. Anschließend wurde fünfmal mit jeweils 80 ml einer 1N wässrigen KHSO4- Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, fünfmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO3-Lösung, und einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 l Trenntrichter gewaschen. Das anschließende Trocknen erfolgte über 50 g Na2SO4. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben aufkonzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in einer Mischung aus 1 l Diethylether und 2 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt. Das anschließende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mm HG (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/­ Acetonfalle). So wurden 100 g Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 erhalten (Ausbeute: 94,7%).
Analysedaten
Molmasse (Massenspektrometrie): 418 g/mol
Schmelzpunkt: 66°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC): 98,6%
optische Rotation [Na/20°C]: -27,9
H2
O [KF]: 3,78%
Schwermetalle: 40,2 ppm
Lösungsmittel: 1,8‰
Elementaranalyse: 61,2% C
7,5% H
12,8% N
18,4% O
Schritt 4 Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 → HCL.H-Gly-L-Phe-L-Pro- NH2
Das in dem 3. Schritt erhaltene Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 (149 g) wurde in 300 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert und dann wurden 300 ml 4N HCL/Dioxan hinzugefügt. Die Mischung wurde über eine Stunde bei Raumtemperatur (15-25°C) bei Atmosphärendruck in einem 2 l Rundhalskolben mit magnetischem Rührer umgesetzt. Anschließend wurde 1 l Diethylether zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und das Präzipitat mit einem Sinterglastrichter aufgesammelt. Das Präzipitat wurde dann zweimal mit 1,5 l Diethylether gewaschen und wie in Schritt 1 getrocknet.
Analysedaten
Molmasse (Massenspektrometrie): 318 g/mol
Schmelzpunkt: 93°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC): 98,8%
optische Rotation [Na/20°C]: -19,1
H2
O [KF]: 2,79%
Schwermetalle: 15,9 ppm
Lösungsmittel: 0,72‰
Elementaranalyse: 53,7% C
6,4% H
14,3% N
14,9% O
3. Bestimmung der Halbwertzeit im Plasma
Wie oben dargelegt, stellt eine ausreichende Halbwertzeit im Plasma eine notwendige Bedingung dafür dar, dass die erfindungsgemäß verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate eine ausreichende anti-neurodegenerative Wirkung zeigen können. Diese ausreichende Halbwertzeit wurde wie folgt bestimmt.
Mit C14-markiertes GFPNH2 wurde durch alkalische Hydrolyse von entsprechend markiertem RGFPNH2 synthetisiert, wobei R ein Cinnamoyl-Rest ist. Die spezifische Aktivität des C14- markierten RGFPNH2 betrug 62,7 nCi/mmol, die radiochemische und chemische Reinheit betrug ≧ 98%. Das Tripeptid GFPNH2 war an den Positionen 3 und 4 des Prolinringes markiert.
Nach der Hydrolyse wurde das Tripeptid durch Dünnschicht- Chromatographie gereinigt und anschließend durch Festphasen- Extraktion und Verdampfung des Lösungsmittels isoliert. Es wurde in den folgenden Experimenten in Form des Hydrochlorides verwendet.
Das C14-markierte GFPNH2 (100 nCi) wurde zu nicht-markiertem GFPNH2 hinzugegeben und in Form des wasserlöslichen HCl- Salzes parenteral (i. v.) Ratten bei einer Dosierung von 20 mg pro Kilogramm Körpergewicht und 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht.
Plasmaproben der Ratten wurden nach bestimmten Zeitpunkten entnommen und einer Dünnschicht-Chromatographie und HPLC- Analyse unterworfen. Die radioaktiven Punkte bzw. Peaks wurden bei RF-Werten von 3,0 und RT-Werten von 14,20 und 6,0 min detektiert und waren mit der externen Differenz (GFPNH2) identisch. Die Plasma-Radioaktivitäts-Niveaux nach bestimmten Zeitpunkten wurden zur Berechnung der Halbwertzeit (T durch 2) nach 24 Stunden verwendet.
4. Experimentelles Modell der Alzheimer-Krankheit an Ratten, denen das Glycoprotein GP 120 aus HIV-Membranen verabreicht wurde (a) Grundlagen
GP 120 ist ein Glycoprotein, das aus HIV-Membranen erhalten wird. Dieses Glycoprotein spielt eine fundamentale Rolle bei dem Übergang des RNS-Moleküls des HIV-Virus in die Wirtszelle. Das isolierte GP 120 führt in der Zellmembran zu einer Läsion, durch die Calciumionen eindringen, die letztlich zu dem Zelltod führen.
Das Virus vermag nicht die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, jedoch die mit dem Virus befallenen Makrophagen. Im ZNS stirbt dann die Makrophage ab und lässt ihren Zellinhalt einschließlich des GP 120 und anderer desaktivierter Viruspartikel frei. Das GP 120 ist dann für eine neuronale Einwirkung verantwortlich, und zwar die im Endstadium von AIDS beobachteten komplexen Demenzen. Die Läsionen sind sowohl histologisch wie scintigraphisch denen der Alzheimer- Krankheit benachbart, wobei jedoch Unterschiede bezüglich der Lokalisierung bestehen. Man findet bei Erkrankten Amyloid- Ablagerungen und neurofibrilläre Abbauerscheinungen. Vor diesem Hintergrund hat sich die Verabreichung von GP 120 als gutes Modell für die Alzheimer-Krankheit erwiesen.
(b) Versuche
15 männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem mittleren Gewicht von 300 g wurden für dieses Experiment verwendet. Die Tiere wurden in einer Offenstallhaltung über 1 Woche gehalten, wobei die folgenden Parameter kontrolliert wurden:
Tag/Nacht-Rhythmus: 7 Std./19 Std.
Temperatur: 22 ± 1°C
Luftfeuchtigkeit: 50 ± 10%
Die Tiere erhielten nach Belieben Trinkwasser und eine Standardernährung UARA03.
Für die Versuchsdurchführung wurden die Ratten wie folgt operiert: Die Ratten werden leicht mit Chloral (300 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert, die Schädelhaut dann aufgeschnitten und die Schädeldecke wird mit Hilfe eines Zahnfräsers durchbohrt. Eine Metallkanüle wird unter Stereotaxie bis zum lateralen Hohlraum abgesenkt und dann mit einem Zahnzement fixiert. Die Durchlässigkeit der Kanüle wird an jedem Tag des Experimentes kontrolliert.
3 Tage nach Einführen der Kanüle (Erholung vom Operationsschock) werden die Tiere in 2 Gruppen aufgeteilt:
  • - 1 Gruppe von 5 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl eines physiologischen Serums über eine Hamilton-Spritze, die an der Metallkanüle befestigt war, erhalten;
  • - 1 Gruppe von 10 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl physiologisches Serum enthaltend Gp120 in einer Menge von 3 nM (10 nM pro Kilogramm) erhalten.
Die Experimente zeigten, dass eine Degenerierung in Abhängigkeit der Dosierung des verabreichten Gp120 insbesondere in den Hippokampus-Bereichen CAII und CAIII besteht. Eine Dosis von 10 nM/kg führt zu einem 40-50%igen Verlust an Hippokampus-Neuronen.
10 Tage nach der letzten Verabreichung von Gp120 wurden die Tiere der zweiten Gruppe in zwei Untergruppen à 5 Ratten aufgeteilt. (Die Versuche zur Durchführung des Modells hatten gezeigt, dass die Degenerierung während der Verabreichung von GP120 und nach den ersten Tagen nach der letzten Verabreichung sehr stark war. Ein Gleichgewichtszustand wird ab dem achten Tag nach der letzten Verabreichung erhalten, der über ungefähr einen Monat stabil bleibt):
  • a) eine Kontrollgruppe, die täglich intravenös (Pudendavene) über einen Zeitraum von 5 Tagen 1 ml pro Kilogramm körpergerecht physiologisches Serum morgens um 9.00 Uhr erhielten; und
  • b) eine Gruppe, die intravenös (Pudendavene) über einen Zeitraum von 5 Tagen 1 ml physiologisches Serum pro Kilogramm Körpergewicht, in dem Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 zu 20 mg gelöst war, um 9.00 Uhr morgens erhielten.
Die erste Gruppe von 5 Ratten (ohne GP-120-Verabreichung) erhielt unter den gleichen Bedingungen 1 ml/kg physiologisches Serum.
(c) Lernverhalten
An den letzten 5 Tagen des Experiments wurden die Tiere in einen Lern-Käfig eingebracht ("Pole Climbing Test"). Die Tiere sollen bei diesem Test lernen, auf eine Stange zu klettern, um einen elektrischen Schock zu vermeiden. Die Vermeidung wird durch eine Vermeidungskonditionierung durch einen Ton erreicht (conditioning avoidance response). Ein Signal ertönt fünf Sekunden vor dem elektrischen Schock. Die konditionierte Ratte steigt bei Ertönen des Signales auf die Stange und vermeidet so den elektrischen Schock. Es wurden über einen Zeitraum von 5 Tagen 10 Versuche täglich durchgeführt.
Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozentsatz der richtigen Antworten. Am fünften Tag zeigten alle Testtiere positive Antworten. Das Maximum der Kurve stellt die Lernfähigkeit dar. Die Steigung der Kurve beschreibt die Lerngeschwindigkeit. Die Fläche unter der Kurve ergibt ein gutes Bewertungmaß der Gesamtheit der Konditionierungsparameter. Der max. Wert der Fläche beträgt 500, wenn alle Tiere am nullten Tag positive Antworten ergeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Für jeden Lerntag entsprechen die angegebenen Werte in der Tabelle dem Prozentsatz der Vermeidung. Am ersten Tag wird keine Vermeidung beobachtet. Die Lerngeschwindigkeit und das Lernvermögen sind bei den Ratten stark vermindert, denen das Gp 120 verabreicht worden war. Die Behandlung mit der erfindungsgemäß verwendeten Substanz Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 führt zur teilweisen Wiederherstellung des Lernvermögens. Dieses bedeutsame Resultat wird insbesondere an den Tagen 4 und 5 beobachtet.
Tabelle 1
(d) Neuronenanzahl
Nach dem letzten Lernversuch wurden die Tiere enthauptet, und das Gehirn wurde isoliert und auf -80°C in flüssigem Stickstoff eingefroren. Schnitte einer Dicke von 25 µm wurden in einem "Cryocut" bei einer Temperatur von -18°C erhalten. Die Schnitte im Hippokampus sind rötlich gefärbt. Die Anzahl an Neuronen in dem CA III Hippokampus-Bereich wurde durch Zählen unter dem Mikroskop bestimmt. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz des Ergebnisses der Gruppe ohne GP120- Behandlung ausgedrückt.
Tabelle 2
Wie aus der Tabelle ersichtlich, führt die Verabreichung von Gp120 zu einer starken Abnahme der Neuronenanzahl. Bei Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz erhöht sich jedoch der Prozentsatz an Neuronen deutlich. Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der mit der erfindungsgemäßen Substanz behandelten Gruppe ist signifikant.

Claims (11)

1. Verwendung von Verbindungen der folgenden Formel (I)
wobei X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-C1-5-alkyl, N(C1-5 alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5) Alkoxy-Gruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein können, sowie Ala, Val, Leu oder Ile ableitet;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp, und Asn ableitet;
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-5) Alkyl darstellen;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5) Alkoxy sind; und
R5 H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellt;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;
zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die neurodegenerative Krankheit die Alzheimer-Krankheit ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, die jeweils wahlweise durch eine (C1-5) Alkoxy-Gruppe, eine (C1-5) Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein können oder Ile ableitet.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei R1 ein Rest ist, der sich von Phe ableitet, das wahlweise durch eine (C1-5) Alkoxy-Gruppe, eine (C1-5) Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein kann.
5. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X (C1-5) Alkoxy, NH2, NH-(C1-5) Alkyl oder N(C1-5 Alkyl)2 ist.
6. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei R2 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Gly ableitet.
7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung der Formel (I) Glycyl-L- phenylalanyl-L-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassen Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-C1-5-alkyl, N(C1-5 alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5) Alkoxy- Gruppen, (C1-5) Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys ableitet;
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-5) Alkyl darstellen;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5) Alkoxy sind; und
R5 H, OH, (C1-5) Alkyl oder (C1-5) Alkoxy darstellt;
oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon und
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei X (C1-5) Alkoxy, NH2, NH-C1-5 Alkyl oder N(C1-5 Alkyl)2 ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei R2 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Gly ableitet.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 9 und 10, wobei die Verbindung der Formel (I) Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.
DE10105041A 2001-02-05 2001-02-05 Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten Withdrawn DE10105041A1 (de)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10105041A DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2001-02-05 Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
PCT/EP2002/001180 WO2002062828A2 (en) 2001-02-05 2002-02-05 Tripeptides and tripeptide derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases
DK02711833T DK1359934T3 (da) 2001-02-05 2002-02-05 Tripeptider og tripeptidderivater til behandling af neurodegenerative sygdomme
AT02711833T ATE344673T1 (de) 2001-02-05 2002-02-05 Tripepide und tripepdid-derivte zur behandlung von neurodegenerativen erkrankungen
AU2002231771A AU2002231771A1 (en) 2001-02-05 2002-02-05 Tripeptides and tripeptide derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases
ES02711833T ES2275849T3 (es) 2001-02-05 2002-02-05 Tripeptidos y derivados tripeptidicos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
DE60215917T DE60215917T2 (de) 2001-02-05 2002-02-05 Tripepide und tripepdid-derivte zur behandlung von neurodegenerativen erkrankungen
PT02711833T PT1359934E (pt) 2001-02-05 2002-02-05 Tripeptidos e derivados de tripeptidos para o tratamento de doenças neurodegenerativas
EP02711833A EP1359934B1 (de) 2001-02-05 2002-02-05 Tripepide und tripepdid-derivte zur behandlung von neurodegenerativen erkrankungen
JP2002563180A JP4169597B2 (ja) 2001-02-05 2002-02-05 神経変性疾患の処置のためのトリペプチド及びトリペプチド誘導体
US10/635,797 US7129213B2 (en) 2001-02-05 2003-08-05 Tripeptides and tripeptide derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases
CY20071100018T CY1107990T1 (el) 2001-02-05 2007-01-08 Τριπεπτιδια και παραγωγα τριπεπτιδιων για τη θepαπεια νευροεκφυλιστικων ασθενειων

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10105041A DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2001-02-05 Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10105041A1 true DE10105041A1 (de) 2002-08-14

Family

ID=7672834

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10105041A Withdrawn DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2001-02-05 Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
DE60215917T Expired - Lifetime DE60215917T2 (de) 2001-02-05 2002-02-05 Tripepide und tripepdid-derivte zur behandlung von neurodegenerativen erkrankungen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60215917T Expired - Lifetime DE60215917T2 (de) 2001-02-05 2002-02-05 Tripepide und tripepdid-derivte zur behandlung von neurodegenerativen erkrankungen

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7129213B2 (de)
EP (1) EP1359934B1 (de)
JP (1) JP4169597B2 (de)
AT (1) ATE344673T1 (de)
AU (1) AU2002231771A1 (de)
CY (1) CY1107990T1 (de)
DE (2) DE10105041A1 (de)
DK (1) DK1359934T3 (de)
ES (1) ES2275849T3 (de)
PT (1) PT1359934E (de)
WO (1) WO2002062828A2 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10105040A1 (de) * 2001-02-05 2002-08-14 Tell Pharm Ag Hergiswil Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2002-08-14 Tell Pharm Ag Hergiswil Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
DE10105038B4 (de) 2001-02-05 2005-07-07 Neurotell Ag Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
BR0312408A (pt) * 2002-07-02 2005-04-19 Novartis Ag Inibidores de peptìdeo de ligação de proteìna smac a inibidor de apoptose de proteìnas (iap)
WO2007079977A2 (en) * 2006-01-16 2007-07-19 Dsm Ip Assets B.V. Nutraceutical compositions comprising tripeptides
US7838971B2 (en) * 2006-07-11 2010-11-23 Atmel Corporation Method to provide substrate-ground coupling for semiconductor integrated circuit dice constructed from SOI and related materials in stacked-die packages
WO2011014661A2 (en) 2009-07-29 2011-02-03 The University Of Chicago Liver x receptor agonists
JP6344796B2 (ja) * 2014-09-30 2018-06-20 森永乳業株式会社 高齢者用アルツハイマー型認知症改善剤
JP6589011B2 (ja) * 2018-05-17 2019-10-09 森永乳業株式会社 脳機能障害改善用経口組成物

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1323301C (en) 1987-06-05 1993-10-19 Alan I. Faden Thyrotropin-releasing hormone analogs in cns injury
FR2622581B1 (fr) * 1987-11-03 1990-02-16 Inorgan Sa Rech Develop Pharm Nouveaux derives de l-proline, leur preparation et leurs applications biologiques
DE69124274T2 (de) * 1990-02-27 1997-08-14 Agency Ind Science Techn Oligopeptide, sie enthaltende pharmazeutische und Futterzusammensetzung und Benützung von Oligopeptiden
DE4007869A1 (de) 1990-03-13 1991-09-19 Merck Patent Gmbh Aminosaeurederivate
JPH045240A (ja) * 1990-04-20 1992-01-09 Taisho Pharmaceut Co Ltd 抗痴呆剤
US5091391A (en) * 1990-08-16 1992-02-25 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Method of resisting neurodegenerative disorders
WO1992011850A2 (en) * 1990-12-28 1992-07-23 Cortex Pharmaceuticals, Inc. Use of calpain inhibitors in the inhibition and treatment of neurodegeneration
WO1992013549A1 (en) * 1991-02-07 1992-08-20 Research Corporation Technologies, Inc. Inhibition of cell proliferation by hydrophobic peptides
US6235929B1 (en) * 1991-12-27 2001-05-22 Georgia Tech Research Corporation Tripeptide α-ketoamides
KR960705808A (ko) * 1993-11-09 1996-11-08 조셉 에프. 디프리마 성장 호르몬의 방출을 촉진시키는 피페리딘, 피롤리딘 및 헥사하이드로-1H-아제핀(Piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone)
JP2800877B2 (ja) * 1993-12-28 1998-09-21 伊藤ハム株式会社 血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド及び当該ペプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤
EP0739486A4 (de) * 1994-01-13 1998-09-09 Univ Columbia Synthetische rezeptoren, bibliotheken und ihre verwendung
US5716929A (en) * 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5834029A (en) * 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment
JPH0940577A (ja) * 1995-05-24 1997-02-10 Mitsui Toatsu Chem Inc トリペプチド、ジペプチドを含有する医薬組成物
WO1996041638A1 (en) 1995-06-13 1996-12-27 Sanofi Winthrop, Inc. Calpain inhibitors for the treatment of neurodegenerative diseases
AU708938B2 (en) * 1995-06-23 1999-08-19 MG Pharma, Inc. A peptide inhibiting elevations of triglyceride levels in blood and an agent for inhibiting elevations of triglyceride levels in blood comprising the peptide as an active component
JPH09169797A (ja) * 1995-12-22 1997-06-30 Mitsui Toatsu Chem Inc プロテアーゼアクティベーター活性を有するペプチド
US5840838A (en) * 1996-02-29 1998-11-24 University Of Kentucky Research Foundation Process for enhancing the activity of amyloid β peptides
JP2805194B2 (ja) * 1996-03-22 1998-09-30 阪急共栄物産株式会社 血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド及び当該ペプチドを有効成分として含む血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤
US6365573B1 (en) * 1996-10-04 2002-04-02 Neuronz Ltd. Regulation of neural enzymes
JP4727770B2 (ja) * 1997-09-26 2011-07-20 カルピス株式会社 尿中カテコールアミン低下、尿中ノルアドレナリン低下、尿中ドーパミン低下及びＦｉｓｃｈｅｒ比低下の少なくとも１つの軽減剤
JPH11124398A (ja) * 1997-10-22 1999-05-11 Japan Energy Corp Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原ペプチドとそれを用いる抗体検査薬
JP3108675B2 (ja) * 1998-03-17 2000-11-13 阪急共栄物産株式会社 脂質代謝改善剤
US6080848A (en) * 1998-05-01 2000-06-27 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human brain associated protein
WO2001028578A2 (en) 1999-10-22 2001-04-26 Wrair A PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING pGLU-GLU-PRO-NH2 AND METHOD FOR TREATING DISEASES AND INJURIES TO THE BRAIN, SPINAL CORD AND RETINA USING SAME
JP4633876B2 (ja) * 1999-11-11 2011-02-16 カルピス株式会社 トリペプチドの製造方法
AU2001247334A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-24 Monsanto Company Novel peptides with anti-hypertensive activity
DE10105038B4 (de) 2001-02-05 2005-07-07 Neurotell Ag Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2002-08-14 Tell Pharm Ag Hergiswil Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
US6846641B2 (en) * 2002-04-23 2005-01-25 Agy Therapeutics, Inc. In vitro ischemia model

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBASE-Abstr. 881 60 985 zu Guiloff, R.J.: Thyro- tropin releasing hormone and motorneurone disease.In: Reviews in the Neurosciences, 1987, Vol. 1, No. 3-4, S. 201-219 *
EMBASE-Abstr. 911 26 963 zu Sarti, G. [u.a.]: TRH-analogues: A possible treatment for symptoms of dementia in elderly patients. In: Archives of Gerontology and Geriatrics, 1991, Vol. 12, Suppl. 2, S. 173-178 *
Szirtes, T. [u.a.]: Synthesis of Thyrotropin-Rel- easing Hormone Analogues. 1. Complete Dissociationof Central Nervous System Effects from Thyrotro- pin-Releasing Activity. In: J. Med. Chem. 1984, Vol. 27, S. 741-745 *

Also Published As

Publication number Publication date
CY1107990T1 (el) 2013-09-04
AU2002231771A1 (en) 2002-08-19
WO2002062828A3 (en) 2002-10-10
ES2275849T3 (es) 2007-06-16
WO2002062828A2 (en) 2002-08-15
DK1359934T3 (da) 2007-03-12
DE60215917D1 (de) 2006-12-21
US20050101538A1 (en) 2005-05-12
EP1359934B1 (de) 2006-11-08
JP4169597B2 (ja) 2008-10-22
JP2004526704A (ja) 2004-09-02
ATE344673T1 (de) 2006-11-15
US7129213B2 (en) 2006-10-31
EP1359934A2 (de) 2003-11-12
PT1359934E (pt) 2007-01-31
DE60215917T2 (de) 2007-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60003837T2 (de) Tetrapeptid, das die funktionelle aktivität von neuronen stimuliert, dieses enthaltendes pharmakologisches mittel und seine verwendung
DE2602193A1 (de) Peptid-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel
EP1071409A2 (de) Verwendung von phosphororganischen verbindungen zur therapeutischen und prophylaktischen behandlung von infektionen
DE19825804A1 (de) 1,4-Benzothiazepin-1,1-dioxidderivate, Verfahren zu deren Herstellung, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
WO1999067278A1 (de) Prodrugs von dp iv-inhibitoren
EP0490379A2 (de) Diaminosäurederivate und pharmazeutische Zusammensetzungen
EP0090341A2 (de) Spiro(4.(3+n))-2-aza-alkan-3-carbonsäure-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung, diese enthaltende Mittel und ihre Verwendung
DE10105041A1 (de) Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
EP0110224A2 (de) Benzoylthioverbindungen, ihre Herstellung und Verwendung als Arzneimittel
DE10105038B4 (de) Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
DE2518160C2 (de)
DE2112057A1 (de) Neue Penicillinester
DE2063996C3 (de) Alpha-Aminoxyhydroxamsäurederivate, Verfahren zur Herstellung derselben und diese enthaltende Arzneimittel
DE3209330C2 (de)
DE10105039A1 (de) Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
DE2364704C2 (de) Ca-Doppelsalz des Lysins und der Chlorwasserstoffsäure und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Säureadditionssalze enthaltende Arzneimittel
DE2525250C2 (de) N,N'-Phenylendioxamsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten
DE3200662C2 (de) Nitrosoharnstoffderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel diese enthaltend
DE3212027C2 (de)
CH695417A5 (de) Verfahren zur Umsetzung von Alkaloiden.
WO2003082906A2 (de) Neurotrophe und neuroprotektive peptide
DE3615512A1 (de) Prolinderivate
DE3236484A1 (de) Tripeptide, verfahren zur herstellung derselben und diese enthaltende arzneimittel
DD158397A5 (de) Verfahren zur herstellung von isophthalsaeurepicolylamidmonohydrat
DE2525164C2 (de) m-Phenylendioxamsäurediester, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8139 Disposal/non-payment of the annual fee