JPWO2002091955A1 - 蛋白代謝機能を有する人工腎臓およびその作製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓およびその作製方法を提供する。血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと近位尿細管細胞の蛋白代謝機能の中心的役割を担うエンドサイトーシス受容体であるメガリンを表面に発現した細胞を構成成分とすることを特徴とする蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓、および血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートとメガリンを表面に発現した細胞を用いることを特徴とする蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓の作製方法である。

Description

技術分野
本発明は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、表面にメガリンを発現した細胞を構成成分とすることを特徴とする蛋白代謝機能を有する人工腎臓、およびその作製方法に関する。
背景技術
我が国の末期腎不全治療は、腎移植ドナーが不足しているため、血液透析療法がその主体となっている。しかしながら血液透析療法も本来の腎機能を十分代償していないため、様々な合併症が惹起され、患者のクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）と生命予後を損ねている。
血液透析療法の弱点は、近位尿細管細胞が有する糸球体濾過蛋白代謝機能を代償しえないことである。そのため、本来その細胞によって代謝される低分子量蛋白が血液透析患者の体内に蓄積し、尿毒素蛋白として作用することによって、様々な病態を惹起する。その代表例は、β２−ミクログロブリン（β２−ｍ）の蓄積による透析アミロイドーシスであり、骨関節障害や臓器不全をきたす。また血液透析患者では、糖化修飾蛋白であるＡＧＥも蓄積し、動脈硬化や臓器障害に関係する。近年、血液透析膜や血液濾過法の改良や、β２−ｍ吸着カラムの実用化がなされたものの、それらにも限界があり、持続的に蛋白代謝機能を十分代償できる人工腎臓の開発が望まれてきた。
これに対し、近位尿細管細胞機能を代償するために細胞を利用したシステムの開発が行われている。例えば、Ｈｕｍｅｓ ＨＤら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７，４５１−４５３（１９９９））は、血液濾過器と不死化近位尿細管上皮細胞をホローファイバーの内腔に生着させたモジュールを組み合わせ、近位尿細管細胞を培養した内腔に濾過血液を循環するという人工腎臓を、また斎藤明ら（第４４回日本透析医学会（１９９９））は遠位尿細管上皮細胞を用いた同様の人工腎臓（尿細管）を報告している。しかしながら、これらはいずれも体外型のデバイスであり、間欠的な血液処理という体外循環療法の弱点を克服できるものではない。
発明の要約
本発明は、上述の問題点を解決するために、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓およびその作製方法を提供するものである。また、本発明は、低分子量蛋白やホルモン類等と結合して細胞内に取り込むというメガリンの機能を利用して、蛋白代謝機能を有する人工腎臓を提供するものである。
すなわち、本発明は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、近位尿細管細胞の蛋白代謝機能の中心的役割を担うエンドサイトーシス受容体であるメガリンを表面に発現した細胞を構成成分とすることを特徴とする、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓に関する。
また、本発明は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、メガリンを表面に発現した細胞を用いることを特徴とする、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓の作製方法に関する。さらに、本発明は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルをスポンジシートに注入する工程と、該スポンジシートを皮下に埋植する工程と、埋植された該スポンジシートにメガリンを表面に発現した細胞を注入する工程を含む上記人工腎臓の作製方法に関する。
さらに、本発明は、以下の特徴を有する上記人工腎臓およびその作製方法に関する。血管新生を促進する成長因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である；ｂＦＧＦが遺伝子工学的手法を用いて製造したヒトｂＦＧＦである；ヒドロゲルがゼラチンゲルである；ゼラチンゲルが等電点４．５〜５．５のゼラチンを主成分とする；スポンジシートがコラーゲンよりなる；メガリンを表面に発現した細胞が、ヒト近位尿細管上皮細胞および／または遺伝子導入によりメガリンを高発現させたヒト近位尿細管上皮細胞である；メガリンの発現が遺伝子操作によるものである。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、メガリンを表面に発現した細胞を構成成分とすることを特徴とする。
本発明で用いられる血管新生を促進する成長因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ；ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α；ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ；ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等が挙げられる。
なお、本発明においては、上記血管新生を促進する成長因子を一種類のみ用いてもよいし、複数組み合わせて用いてもよい。さらには他の生物学的活性を有する因子を組み合わせて用いることも可能である。
上記成長因子のうち、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ等がより強い増殖活性の発揮の観点から好ましい。また、ｂＦＧＦは、血管新生促進因子としての幅広い知見が蓄積されており、より好ましく用いられる成長因子の一つである。
本発明で用いられるｂＦＧＦとは、脳下垂体、脳、腎、副腎、胎盤、骨基質、軟骨、内皮細胞、繊維芽細胞等の臓器または組織より抽出されるもの、遺伝子組換え等の遺伝子工学的手法を用いて製造されるもの、さらにこれらの修飾体等、繊維芽細胞増殖因子として作用するものを含む。なかでも遺伝子工学的手法を用いて製造したヒトｂＦＧＦは、品質並びに供給の安定性の観点から特に好ましい。なお、上記修飾体とは、抽出や遺伝子工学的手法を用いて得られたｂＦＧＦのアミノ酸配列にアミノ酸が付加されたもの、アミノ酸の一部が他のアミノ酸で置換されたもの、さらにはアミノ酸の一部が欠損したもの等を含む。本発明においては、これらのｂＦＧＦを単独または混合して用いることが可能である。
本発明で用いられるヒドロゲルは、含有させた血管新生を促進する成長因子をその周辺に徐放させることにより、血管新生効果を持続させるために用いる。
本発明で用いられるヒドロゲルの原材料としては、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、プルラン、デンプン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キチン、キトサン等の多糖類、並びに、ヒドロキシエチルセルロースやカルボキシメチルセルロースをはじめとする多糖類の誘導体；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン等のポリアミノ酸；ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、グルテン等のポリペプチド；ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルメチルエーテル、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、ポリアクリル酸、ポリ（イソブチレン−マレイン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）、ポリアクリロキシプロパンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリ（メタクリロイロキシエチル四級化アンモニウムクロリド）、ポリビニルピリジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−メタクリロイルオキシエチル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウム内部塩）等の親水性基を側鎖に有する合成高分子；ポリエチレングリコール、ポリジオキソラン、ポリエチレンイミン等の主鎖自体が親水性の合成高分子等が挙げられる。
本発明においては、これらの材料を単独または適切に複数組み合わせ、さらには他の化合物により修飾して用いることもできる。
前記ヒドロゲルの原材料のうち、セルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、キチン、キトサン等の多糖類、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン等のポリアミノ酸、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン等のポリペプチド等は、生体吸収性があり好ましい。特にゼラチンは、加工の容易性、含有させる成長因子の生物学的活性維持、さらには生体内での分解速度（成長因子の徐放性）の観点からより好ましく用いられる。
ゼラチンは、生体に含まれるコラーゲンを酸やアルカリ等による適切な前処理後、温水を用いて加熱抽出して得られるが、本発明においては通常入手できるものであれば特別な制限はなく用いることができる。このようなゼラチンとしては、例えば等電点が４．５〜５．５のアルカリ処理ゼラチン、等電点が８〜９の酸処理ゼラチン等が挙げられる。血管新生促進因子としてｂＦＧＦを用いる場合には、ｂＦＧＦの等電点が約９であり、中性水溶液中では正に帯電していることから、ｂＦＧＦの保持性の観点から、等電点が４．５〜５．５のアルカリ処理ゼラチンが好ましく用いられる。また、ゼラチンは、一種類のみでなく、原料の異なるものや、溶解性、分子量および等電点等の物性の異なるものを混合して用いることもできる。さらには、他の添加剤を含んでいてもよく、例えば特開平８−３２５１６０に開示されているごとく、ｂＦＧＦの徐放性を付与するためにポリアニオン化合物等を付加したもの等も用いることができる。なお、血管新生促進因子としてｂＦＧＦを用いる場合には、ゼラチン以外の上記ヒドロゲルを用いる場合にも、ｂＦＧＦの保持性の観点から、ヒドロゲルの等電点が低いものが好ましい。
血管新生効果の持続時間は、使用するヒドロゲルの生分解性並びに含水率によって変化させることができる。
また、ヒドロゲルの含水率は、血管新生を促進する成長因子の徐放の観点から、水中で膨潤させたときの含水率として８０％以上が好ましく、８５〜９９％がより好ましく、９０〜９８％がさらに好ましい。
ヒドロゲルの含水率ｗは、以下のようにして求めることができる。
ヒドロゲルの形状が粒子状の場合には、凍結乾燥させたヒドロゲルのタッピング（ヒドロゲルをメスシリンダーに採り、メスシリンダーに物理的刺激を加えて、ヒドロゲルを密に充填した）後の体積をＶ_Ｄ、３７℃で２４時間、水中で膨潤させたヒドロゲルのタッピング後の体積をＶ_Ｗとすると、
ｗ［％］＝１００×（Ｖ_Ｗ−Ｖ_Ｄ）／Ｖ_Ｗ
で算出される。なお、Ｖ_Ｄ、Ｖ_Ｗの測定方法としては、例えば、メスシリンダーを約５ｃｍの高さから落下させる操作を繰り返し、体積が変化しなくなった時の体積を読み取る方法が挙げられる。なお、Ｖ_Ｗは、水中でのヒドロゲルの沈降に時間を要する場合があるため、上記落下操作を１０回程度行い、３０分間静置した時の体積が変化しなくなった時の体積を読み取ることにより測定する。
また、ヒドロゲルの形状が粒子状でない場合には、３７℃で２４時間、水中でヒドロゲルを膨潤させた後、ヒドロゲルの付着水やヒドロゲル粒子間の間隙水を吸引濾過法や遠心法等により除去したときの重量（湿潤重量Ｗ_Ｗ）と、続いて乾燥させて重量が変化しなくなったときの重量（乾燥重量Ｗ_Ｄ）とすると、
ｗ［％］＝１００×（Ｗ_Ｗ−Ｗ_Ｄ）／Ｗ_Ｗ
で算出される。
なお、具体的な湿潤重量を求める方法としては、例えばヒドロゲルをグラスフィルターにとり、アスピレーターを用いて吸引し、吸引時間と重量の関係を示す重量減少曲線を作成した際に、曲線の傾きが緩やかになる吸引時間の経過後に重量を測定する方法等が挙げられる。また、乾燥方法としては、恒量化が達成できる方法であれば特に制限はないが、１０５℃以上の温度での常圧乾燥が、特別な装置が不要で簡便に採用できる。ただし、この温度での乾燥により分解等が起こる場合には、凍結乾燥等の低温での減圧乾燥方法を採用することもできる。
本発明で用いられるヒドロゲルは、前記原材料が水溶性である場合には架橋により水不溶化して得られるが、材料の由来や性質等に応じて、熱処理、紫外線やγ線の照射、硬化剤との反応等の架橋方法を用いることができる。
硬化剤としては、特に限定されないが、例えばヒドロゲルの材料としてゼラチンを用いる場合、アルミニウムや第二鉄等の多価金属イオンを含む塩等の無機化合物；グルタルアルデヒド、ホルマリン等のアルデヒド類、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート等のカルボジイミド類、エピクロルヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテル等のエポキシ化合物、ヘキサメチレンジイソシアネートをはじめとするイソシアネート類、酸無水物等の有機化合物等が挙げられる。
本発明で用いられるヒドロゲルの形状としては、柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状、不定形等が挙げられるが、スポンジシートへの注入の容易さの観点から、球状、粒子状、不定形のものが好ましく用いられる。
また、ヒドロゲルの大きさとしては、平均粒径が１０μｍから２００μｍが好ましく、２０μｍから１５０μｍがより好ましい。
本発明で用いられるスポンジシートは、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを固定するため、並びに、メガリンを表面に発現した細胞を保持するための多孔質のシートである。
スポンジシートの原材料としては、前述のヒドロゲルの原料の他に、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリヒドロキシ酢酸、ポリヒドロキシ吉草酸等のポリエステル類、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（α−シアノアクリレート）等の生体吸収性材料、ポリウレタン等が挙げられる。本発明においては、これらの材料を単独または複数組み合わせ、さらには他の化合物により修飾して用いることもできる。
前記スポンジシートの原材料のうち、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸等が、生体適合性材料としての実績の観点から好ましい。特にコラーゲンスポンジシートは、細胞の生着性が良好であることからより好ましく用いられる。
本発明で用いられるスポンジシートは多孔構造を有するが、新生血管の侵入のしやすさ、注入される細胞へ酸素や栄養分の供給のしやすさの観点から、連通した孔を有する全多孔構造を有することが好ましい。
その平均細孔径としては、６０〜４００μｍが好ましく、７０〜１５０μｍがより好ましい。
メガリンとは、本発明者である斎藤らがラットにおいてｃＤＮＡクローニングに成功し、全一次構造を解析した近位尿細管細胞の蛋白代謝機能の中心的役割を担うエンドサイトーシス受容体である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，ｐｐ．９７２５−９７２９（１９９４））。その後、Ｈｊａｌｍ Ｇらによって、ヒトのメガリン／ｇｐ３３０がクローニングされ全一次構造が解析された（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，ｐｐ１３２−１３７，１９９６））。ヒトメガリンは、４６５５−ａａ（分子量５１９，６３６）と推定され、Ｎ末端（２５−ａａ）、細胞外領域（４３９８−ａａ）、膜貫通ドメイン（２３−ａａ）、Ｃ末端細胞質内領域（２０９−ａａ）からなり、細胞外領域は３つのタイプのシステインリッチな領域を有し、ＬＤＬレセプター遺伝子ファミリーに属することが知られている。
メガリンは、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−１ウロキナーゼ、ＰＡＩ−１−ｔＰＡ、プロウロキナーゼ、リポ蛋白リパーゼ、アプロチニン等の酵素や酵素インヒビター類、ビタミンＤ結合蛋白、レチノール結合蛋白等のビタミン結合蛋白類、アポリポ蛋白Ｂ、アポリポ蛋白Ｅ等のアポリポ蛋白類、アミノグリコシド類やポリミキシンＢ等の塩基性ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、インスリン、β２−ｍ、上皮成長因子、プロラクチン、リゾチーム、チトクロームＣ等の低分子量蛋白やホルモン類等と結合することが報告されている、多機能エンドサイトーシス受容体である。
また、メガリンは、例えばヒトでは、腎の近位尿細管上皮細胞以外に、副甲状腺（上皮小体）細胞、胎盤絨毛間腔中の上皮性細胞層、精巣上体上皮細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、乳房上皮細胞、甲状腺小胞細胞、眼球毛様体上皮細胞等の表面に発現していることが確認されている。つまり、これら細胞等が、メガリン発現細胞として挙げられる。メガリン発現細胞としては、上記細胞のうち、自家の残存腎から採取した近位尿細管上皮細胞が特に好ましく用いられる。
本発明で用いられるメガリンを表面に発現した細胞としては、自家又は他家の上述のメガリン発現細胞以外に、自家又は他家のメガリン発現細胞に遺伝子導入を施しメガリンを高発現させた細胞、自家又は他家のメガリン非発現細胞に遺伝子導入を施しメガリンを発現させた細胞、さらには胚細胞や幹細胞等からメガリン発現細胞に分化誘導した細胞等が挙げられる。なお、遺伝子導入の方法としては、既知の物理的方法、化学的方法、生物学的方法等を用いることができる。また、分化誘導の方法としては、分化誘導物質を与える方法、他の細胞と共培養する方法、温度、圧力、ｐＨ、浸透圧等の環境を変化させる方法等を用いることができる。
上記メガリンを表面に発現した細胞のうち、体内に埋植した細胞の被排除性の観点から、自家の細胞であることが好ましい。さらに、ヒト近位尿細管上皮細胞および／または遺伝子導入によりメガリンを高発現させたヒト近位尿細管上皮細胞であることがより好ましい。
メガリン非発現細胞としては、手技的な簡便さから、自家の末梢血に由来する貪食能の高いマクロファージ様の細胞が好ましく用いられる。
また、メガリンの発現は、遺伝子操作によることが好ましい。
次に、本発明の蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓の作製方法について説明する。
本発明の人工腎臓は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、メガリンを表面に発現した細胞を用いて作製される。好ましくは、当該人工腎臓の作製方法は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルをスポンジシートに注入する工程と、該スポンジシートを皮下に埋植する工程と、埋植された該スポンジシートにメガリンを表面に発現した細胞を注入する工程を含むものである。
ヒドロゲルの作製方法としては、既知の方法を特別な制限なく用いることができる。例えば、水素結合、イオン結合、配位結合等による分子間の物理的凝集を利用する方法、架橋剤を用いて化学的に架橋する方法、光や放射線照射により架橋する方法等が挙げられる。また、ヒドロゲルの成型（製剤化）方法としては、特に限定されないが、例えば粒子状のものを作製する場合にはエマルジョン法、溶融成型法、スプレードライ法等が利用できる。
血管新生を促進する成長因子をヒドロゲルに含有させる方法としては、血管新生を促進する成長因子の生物学的活性を著しく損なわない方法であれば特別な制限なく用いることができる。例えば、ヒドロゲルの作製後にヒドロゲルを乾燥させ、これに成長因子を含有する溶液を吸収させる方法、あるいはヒドロゲル作製後、乾燥させずにそのまま成長因子含有溶液に含浸させる方法、さらにはヒドロゲルの作製時にその原液中に成長因子を存在させる方法等が挙げられる。
血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルは、例えば注射器等を用いてスポンジシートに注入することができる。
スポンジシートは、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを固定するため、並びに、メガリンを表面に発現した細胞を保持するために、皮下等の生体内に埋植して用いられるが、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルをスポンジシートに注入後、埋植してもよいし、スポンジシートを埋植後、該ヒドロゲルをこれに注入してもよい。
本発明の体内型人工腎臓は、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルが注入され、かつ、生体内に埋植されているスポンジシートに、メガリンを表面に発現した細胞を注入することにより作製することができる。
メガリンを表面に発現した細胞は、例えば、注射器、マイクロキャピラリー等によりスポンジシートに注入することができる。
メガリンを表面に発現した細胞の注入のタイミングには特別な制限はないが、メガリンを表面に発現した細胞の生着、増殖を確実なものとするために、血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートを埋植後、あるいは埋植したスポンジシートに成長因子含有ヒドロゲルを注入後、血管新生に必要な日数が経過した時点で、注入することが望ましい。この血管新生に必要な日数は、使用する血管新生を促進する成長因子並びにヒドロゲルの性質にもよるが、例えばｂＦＧＦを含有させたアルカリ処理ゼラチンゲルを用いる場合には、概ね３〜８日である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
（実施例）
（１）ｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル粒子の調製
ｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル粒子は、田畑らの方法（Ｔａｂａｔａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．，１０：９５７−９６８，１９９９）により調製した。すなわち、４０℃に予備加熱した１０ｍＬの１０ｗｔ％アルカリ処理ゼラチン（等電点５．０）水溶液（新田ゼラチン製）と２５μＬの２５ｗｔ％グルタルアルデヒド水溶液を混合し、４０℃、４２５ｒｐｍで攪拌条件下の３７５ｍＬのオリーブ油中に滴下し、ｗ／ｏエマルジョンを形成させた。その後２５℃で２４時間継続攪拌することにより、ゼラチンを化学的に架橋させた。これに１００ｍＬのアセトンを添加後、得られた粒子を遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、５分間）により集め、さらに５回のアセトン中での遠心分離で洗浄した。洗浄後の粒子を、０．１ｗｔ％のＴｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＬの１００ｍＭグリシン水溶液中で３７℃、１時間保つことにより、グルタルアルデヒドの未反応アルデヒド基を封止した。得られた架橋ゼラチンゲル粒子は、２回の蒸留水中での遠心分離で洗浄した後、凍結乾燥させ、エチレンオキサイドガスで滅菌した。水中、３７℃で２４時間膨潤後のゼラチンゲル粒子の含水率は９５％であった。また、光学顕微鏡で粒子径（直径）を計測した結果、６０〜１３０μｍであった。１０ｍｇ／ｍＬの等電点９．６のリコンビナントｂＦＧＦ水溶液（科研製薬株式会社製）１０μＬを、上記で得られた２ｍｇの乾燥ゼラチンゲル粒子に滴下し、２５℃で１時間放置することにより、ｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル粒子を得た。
（２）ゲルスポンジシートの調製
０．３％のアテロコラーゲン塩酸溶液（ｐＨ３．０）を、冷蔵ホモジナイザーを用いて１８００〜２０００ｒｐｍで６０分間攪拌した。泡立った溶液を型に流し込み−４０℃で急速に凍結させ、４８時間凍結乾燥、さらに減圧下、１０５℃で２４時間乾燥させた。続いて０．２％グルタルアルデヒド／０．０５Ｍ酢酸溶液中、４℃で２４時間架橋させた後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で洗浄し、１５％のエタノール水溶液中に浸した。−１３５℃で急速に凍結させ、凍結乾燥（４８時間）後、エチレンオキサイドガスで滅菌し、コラーゲンスポンジシートを得た。
（３）メガリン発現細胞の皮下移植
上記（１）で得られたｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル粒子を０．１５ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、上記（２）で得られた１×１×０．５ｃｍのコラーゲンスポンジシートに１ｍＬ用注射器（２３Ｇ注射針）により注入した。そのスポンジシートを、ジエチルエーテル吸入による麻酔下、５週齢の雌ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ；日本クレア）の背側皮下に埋植した。
１週間後、血管新生を病理学的に確認したスポンジシートに、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の新生仔ウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）にて培養した、メガリンを表面に発現した細胞であるラット卵黄嚢上皮癌細胞由来細胞（Ｌ２細胞）をＰＢＳ中に懸濁（１×１０^７／ｍＬ）させた０．１５ｍＬの細胞懸濁液を、マウスの麻酔下、１ｍＬ用注射器（２３Ｇ注射針）により注入した。細胞注入の２週間後に、細胞腫瘤の最長径が２ｃｍ以上に成長したマウスの両腎を、麻酔下、背側から外科的に摘出し、腎不全状態とした。なお、移植したＬ２細胞の転移は認められなかった。
（比較例）
上記実施例の（３）において、細胞懸濁液は注入せず、ＰＢＳのみをコラーゲンスポンジシートに注入した以外は、実施例と同様に行った。
（試験例）
上記実施例および比較例で得られた腎不全状態のマウスを用いて、それぞれ以下の試験を行った。
（１）β２−ミクログロブリン（オリエンタル酵母株式会社製）を、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（ピアース社製）を用いて^１２５Ｉ標識した。ヨウ素化の比活性は６×１０^３ｃｐｍ／ｎｇ蛋白質であった。^１２５Ｉ標識β２−ｍは、１１ｎｇ／μＬの濃度となるように０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで希釈した。上記腎不全状態の１５匹のマウスの腹腔内に^１２５Ｉ標識β２−ｍ（２．８μｇ／２５０μＬ）を投与し、以下の各項目を評価するために、^１２５Ｉ標識β２−ｍ投与後３，６および１４時間後に、それぞれ５匹のマウスの全身を生理食塩液でかん流してと殺した。
（２）と殺後の各マウスより、移植された細胞腫瘤、心臓、肺、肝臓および骨格筋を採取し、各組織・器官の重量を測定し、エッペンドルフチューブ中でのガンマ線の計数に供した。この結果を図１に示す。
図１は、実施例と比較例における組織への^１２５Ｉ標識β２−ｍの取り込みを示したグラフである。縦軸は組織単位重量当たりの^１２５Ｉカウントを示す。移植された細胞での^１２５Ｉカウントは、測定したいずれの時間においても心臓、肺、肝臓および骨格筋のそれらより有意（＊：ｐ＜０．０５）に高かった。一方、心臓、肺、肝臓および骨格筋での^１２５Ｉカウントは、実施例並びに比較例において測定したいずれの時間でも有意な差はなかった。これらは、移植細胞に^１２５Ｉ標識β２−ｍが効率的に取り込まれていることを示す。
（３）さらに、移植された細胞腫瘤を、２％のβ−メルカプトエタノールを添加したＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で、ＵＬＴＲＡ ＴＵＲＲＡＸ（ＩＫＡ ＬＡＢＯＲＴＥＣＨＮＩＫ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてホモジネートし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に供した。この結果を図２に示す。
図２は、移植細胞に取り込まれた^１２５Ｉ標識β２−ｍのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す図である。腹腔内投与に使用した^１２５Ｉ標識β２−ｍとの比較により、移植細胞は^１２５Ｉ標識β２−ｍ単量体とその分解物を含んでいることが分かる。一方、細胞移植を受けたマウスの血液サンプルでは、分解物に加えβ２−ｍ鎖状体が移植細胞中よりも大量に認められた。これらより、移植細胞中の放射性同位体カウントは、血液中の不純物によるものではなく、移植細胞が取り込んだβ２−ｍを分解したことを意味するといえる。
（４）また、と殺後の各マウスより血液を採取し、１０μＬの血液サンプルを４１５μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと混合した後、７５μＬの１００％トリクロロ酢酸（以下、ＴＣＡ）と混合し、未分解蛋白を沈殿させ、遠心分離後、沈殿蛋白をγカウンターで計数することにより、血液中の未分解の^１２５Ｉ標識β２−ｍ量を評価した。この結果を図３に示す。
図３は、実施例と比較例における血液のＴＣＡ沈殿中の放射性同位体カウント結果を示したグラフである。血液のＴＣＡ沈殿中の放射性同位体カウントは、^１２５Ｉ標識β２−ｍ投与６及び１４時間後で、比較例に比べて実施例で有意（＊：ｐ＜０．０５）に減少した。このことは、比較例に比べて実施例で、^１２５Ｉ標識β２−ｍがより大量に分解されていることを示す。つまり、移植された細胞が蛋白代謝能を発揮していることを意味する。
産業上の利用可能性
本発明の蛋白代謝機能を有する人工腎臓は、体内で機能を発揮でき、腎不全患者のＱＯＬの改善に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例と比較例における組織への^１２５Ｉ標識β２−ｍの取り込みを示したグラフである。なお、図中表記は以下の通り。
ｔｒａｎｓｐｌ．；実施例、ｃｏｎｔ．；比較例、Ｔ；移植細胞腫瘤、Ｌ；肝臓、Ｐ；肺、Ｈ；心臓、Ｓ；骨格筋。
図２は、移植細胞に取り込まれた^１２５Ｉ標識β２−ｍのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す図である。なお、図中の各レーンの試料は以下の通り。
レーン１；腹腔内投与に用いた^１２５Ｉ標識β２−ｍ、
レーン２；試験後採取した移植細胞腫瘤のホモジネート、
レーン３；試験後採取した細胞移植マウスの血液。
図３は、実施例と比較例における血液のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿中の放射性同位体カウント結果を示したグラフである。なお、図中表記は以下の通り。
ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；比較例、
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｇｒｏｕｐ；実施例。

Claims (17)

1. 血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、メガリンを表面に発現した細胞を構成成分とすることを特徴とする、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓。
2. 血管新生を促進する成長因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である請求の範囲１記載の人工腎臓。
3. ｂＦＧＦが遺伝子工学的手法を用いて製造したヒトｂＦＧＦである請求の範囲２記載の人工腎臓。
4. ヒドロゲルがゼラチンゲルである請求の範囲１記載の人工腎臓。
5. ゼラチンゲルが等電点４．５〜５．５のゼラチンを主成分とする請求の範囲４記載の人工腎臓。
6. スポンジシートがコラーゲンよりなる請求の範囲１記載の人工腎臓。
7. メガリンを表面に発現した細胞が、ヒト近位尿細管上皮細胞および／または遺伝子導入によりメガリンを高発現させたヒト近位尿細管上皮細胞である請求の範囲１記載の人工腎臓。
8. メガリンの発現が遺伝子操作によるものである請求の範囲１記載の人工腎臓。
9. 血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルを注入したスポンジシートと、メガリンを表面に発現した細胞を用いることを特徴とする、蛋白代謝機能を有する体内型人工腎臓の作製方法。
10. 血管新生を促進する成長因子を含有するヒドロゲルをスポンジシートに注入する工程と、該スポンジシートを皮下に埋植する工程と、埋植された該スポンジシートにメガリンを表面に発現した細胞を注入する工程を含む請求の範囲９記載の人工腎臓の作製方法。
11. 血管新生を促進する成長因子がｂＦＧＦである請求の範囲９記載の人工腎臓の作製方法。
12. ｂＦＧＦが遺伝子工学的手法を用いて製造したヒトｂＦＧＦである請求の範囲１１記載の人工腎臓の作製方法。
13. ヒドロゲルがゼラチンゲルである請求の範囲９に記載の人工腎臓の作製方法。
14. ゼラチンゲルが等電点４．５〜５．５のゼラチンを主成分とする請求の範囲１３記載の人工腎臓の作製方法。
15. スポンジシートがコラーゲンよりなる請求の範囲９記載の人工腎臓の作製方法。
16. メガリンを表面に発現した細胞が、ヒト近位尿細管上皮細胞および／または遺伝子導入によりメガリンを高発現させたヒト近位尿細管上皮細胞である請求の範囲９記載の人工腎臓の作製方法。
17. メガリンの発現が遺伝子操作によるものである請求の範囲９記載の人工腎臓の作製方法。

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