JP4865377B2 - ヒトメガリンの測定方法 - Google Patents
ヒトメガリンの測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4865377B2 JP4865377B2 JP2006089306A JP2006089306A JP4865377B2 JP 4865377 B2 JP4865377 B2 JP 4865377B2 JP 2006089306 A JP2006089306 A JP 2006089306A JP 2006089306 A JP2006089306 A JP 2006089306A JP 4865377 B2 JP4865377 B2 JP 4865377B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- megalin
- human megalin
- binding
- disease
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101001043562 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 2 Proteins 0.000 title claims description 239
- 102000052512 human LRP2 Human genes 0.000 title claims description 239
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 72
- 108010015372 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-2 Proteins 0.000 claims description 151
- 102000001846 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-2 Human genes 0.000 claims description 149
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 105
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 104
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 72
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 65
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 60
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 50
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 15
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000003780 Clusterin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000197 Clusterin Proteins 0.000 claims description 12
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims description 12
- 108010005094 Advanced Glycation End Products Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 8
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 8
- 108091006649 SLC9A3 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100030375 Sodium/hydrogen exchanger 3 Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 8
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 8
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 8
- 102100026745 Fatty acid-binding protein, liver Human genes 0.000 claims description 7
- 101710188974 Fatty acid-binding protein, liver Proteins 0.000 claims description 7
- 101710189565 Fatty acid-binding protein, liver-type Proteins 0.000 claims description 7
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 claims description 7
- 102100030802 Beta-2-glycoprotein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- -1 PAI-I-tPA Proteins 0.000 claims description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 6
- 102000050760 Vitamin D-binding protein Human genes 0.000 claims description 6
- 101710179590 Vitamin D-binding protein Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 6
- 108010023562 beta 2-Glycoprotein I Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims description 6
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 claims description 6
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 102000011409 Transcobalamins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010023603 Transcobalamins Proteins 0.000 claims description 5
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 claims description 5
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 claims description 4
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 102000052563 odorant-binding protein Human genes 0.000 claims description 4
- 108010000645 odorant-binding protein Proteins 0.000 claims description 4
- KINMYBBFQRSVLL-UHFFFAOYSA-N 4-(4-phenoxybutoxy)furo[3,2-g]chromen-7-one Chemical compound C1=2C=COC=2C=C2OC(=O)C=CC2=C1OCCCCOC1=CC=CC=C1 KINMYBBFQRSVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 claims description 3
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 claims description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 3
- 101001104199 Homo sapiens Retinitis pigmentosa 9 protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101001104198 Mus musculus Retinitis pigmentosa 9 protein homolog Proteins 0.000 claims description 3
- PHSRRHGYXQCRPU-AWEZNQCLSA-N N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)CC(=O)N[C@H]1CCOC1=O PHSRRHGYXQCRPU-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 claims description 3
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040073 Retinitis pigmentosa 9 protein Human genes 0.000 claims description 3
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 3
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 3
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 claims description 3
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 claims description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 3
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 3
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000010024 tubular injury Effects 0.000 claims description 3
- 208000037978 tubular injury Diseases 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 3
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 3
- 102000028728 vitamin binding proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091009357 vitamin binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 claims description 2
- 229940045999 vitamin b 12 Drugs 0.000 claims description 2
- 108090000195 villin Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 10
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 9
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 9
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 201000008350 membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 7
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 230000009092 tissue dysfunction Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010018372 Glomerulonephritis membranous Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 231100000855 membranous nephropathy Toxicity 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 4
- 102100031096 Cubilin Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 108010003082 intrinsic factor-cobalamin receptor Proteins 0.000 description 3
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 description 2
- 102000003669 Antiporters Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000026019 Fanconi renotubular syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000006328 Fanconi syndrome Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde Chemical compound OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001043602 Rattus norvegicus Low-density lipoprotein receptor-related protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 2
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000002441 uremic toxin Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004611 Abdominal Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000014777 Adipokines Human genes 0.000 description 1
- 108010078606 Adipokines Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 1
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 1
- 102100031329 Ankyrin repeat family A protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010048409 Brain malformation Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N Chlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)Cl VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101150046623 Dab2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064553 Dialysis amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 101100162766 Homo sapiens ANKRA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000967589 Homo sapiens LRP2-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000886818 Homo sapiens PDZ domain-containing protein GIPC1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100040470 LRP2-binding protein Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021922 Low-density lipoprotein receptor-related protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027240 Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710137278 Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100039983 PDZ domain-containing protein GIPC1 Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021025 Regulator of G-protein signaling 19 Human genes 0.000 description 1
- 101710148108 Regulator of G-protein signaling 19 Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000000478 adipokine Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000012056 cerebral malformation Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000001596 intra-abdominal fat Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229940089531 polyethylene glycol 3500 Drugs 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008663 renal system process Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/34—Genitourinary disorders
- G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
Description
本発明は、ヒトメガリンの測定方法に関する。ヒトにおいて、メガリンの発現の認められる細胞・組織・臓器に対して、局所特異的に発現しているメガリンを迅速かつ簡便に定量検出し、それによって細胞・組織・臓器の直接的な障害の程度の早期診断を可能とせしめ、障害の進行ならびにその治療による予後を維持・改善に向かわすことを可能とする検出方法に関する。本発明は、腎疾患や肺疾患等のメガリンの発現が認められる臓器の疾病の診断に適応することができる。
１．メガリンのクローニング
実験膜性腎症モデルであるHeymann腎炎の病因抗原の検索の結果、1982年、Kerjaschki D.とFarquhar M.G.は、細胞膜タンパク質gp330を同定した(非特許文献１参照)。1994年、Saito A.らはラットのgp330の完全一次構造を決定し、脊椎動物でクローニングされた最大の細胞膜タンパク質であることにちなんでメガリン(Megalin)と改名した(非特許文献２参照)。
実験膜性腎症モデルであるHeymann腎炎の病因抗原の検索の結果、1982年、Kerjaschki D.とFarquhar M.G.は、細胞膜タンパク質gp330を同定した(非特許文献１参照)。1994年、Saito A.らはラットのgp330の完全一次構造を決定し、脊椎動物でクローニングされた最大の細胞膜タンパク質であることにちなんでメガリン(Megalin)と改名した(非特許文献２参照)。
２．メガリンの発現部位
Glycoprotein330(gp330)あるいはLow Density Lipoprotein(LDL)-receptor related protein 2(LRP-2)としても知られるメガリン(Megalin)は、腎臓近位尿細管上皮、ならびに他の組織および細胞、例えば、肺のＩＩ型細胞、精巣、子宮内膜、胎盤、内耳の上皮細胞、腎上皮で、ならびに胚卵黄嚢、および神経外胚葉上に発現される分子量が約600kDaの糖タンパク質である(非特許文献３〜５を参照)。腎臓においては、メガリンは、尿排泄前に近位尿細管内のタンパク質等のエンドサイトーシス・再吸収に関係するエンドサイトーシス受容体として機能する。再吸収されたタンパク質等は、その後、リソゾームにより分解される(非特許文献６参照)。
Glycoprotein330(gp330)あるいはLow Density Lipoprotein(LDL)-receptor related protein 2(LRP-2)としても知られるメガリン(Megalin)は、腎臓近位尿細管上皮、ならびに他の組織および細胞、例えば、肺のＩＩ型細胞、精巣、子宮内膜、胎盤、内耳の上皮細胞、腎上皮で、ならびに胚卵黄嚢、および神経外胚葉上に発現される分子量が約600kDaの糖タンパク質である(非特許文献３〜５を参照)。腎臓においては、メガリンは、尿排泄前に近位尿細管内のタンパク質等のエンドサイトーシス・再吸収に関係するエンドサイトーシス受容体として機能する。再吸収されたタンパク質等は、その後、リソゾームにより分解される(非特許文献６参照)。
３．メガリンのヌクレオチド配列
メガリン(Megalin)とは、哺乳動物の腎近位尿細管上皮細胞膜上に最も多く発現する糖タンパク質であり、そしてそのcDNAコーディング配列は、Korenberg , J.R. et al.(1994)中に開示される遺伝子受託番号第U04441号、Hjaeln , G. et al.(1996)中に開示される遺伝子受託番号U33837号をもつヒトメガリンcDNA配列とヌクレオチド同一性を持つものである（非特許文献７および８を参照）。また、ラットにおいてもヒトメガリンと相同性をもつラットメガリンがSaito et al.(1994)により見出されており、そのcDNA配列は遺伝子受託番号第L34049号として開示されている（非特許文献２参照）。
メガリン(Megalin)とは、哺乳動物の腎近位尿細管上皮細胞膜上に最も多く発現する糖タンパク質であり、そしてそのcDNAコーディング配列は、Korenberg , J.R. et al.(1994)中に開示される遺伝子受託番号第U04441号、Hjaeln , G. et al.(1996)中に開示される遺伝子受託番号U33837号をもつヒトメガリンcDNA配列とヌクレオチド同一性を持つものである（非特許文献７および８を参照）。また、ラットにおいてもヒトメガリンと相同性をもつラットメガリンがSaito et al.(1994)により見出されており、そのcDNA配列は遺伝子受託番号第L34049号として開示されている（非特許文献２参照）。
４．メガリンのアミノ酸配列およびタンパク質構造
メガリンは、ヒトでは4655アミノ酸、ラットでは4660アミノ酸から成る巨大な細胞膜タンパク質であり、そのアミノ酸配列から予想される分子量は約520kDaで、糖鎖を加えると約600kDaに及ぶ(非特許文献２参照)。メガリンはLDLレセプター遺伝子ファミリーに属し、その巨大な細胞外領域は4つの機能的ドメインを有し、単一の細胞膜貫通領域を介して短い細胞内領域へ続く。メガリンは糸球体(ラット)、近位尿細管、肺胞ＩＩ型細胞、副睾丸腺、甲状腺、副甲状腺、卵黄嚢膜、内耳、小腸、脈絡膜などの上皮細胞膜の管腔側（糸球体上皮では管腔側と基底膜側の両方）のclathrin-coated pitに主に存在し、多様なリガンドの細胞内への取り込み・代謝に関係している(非特許文献９および１０を参照)。メガリンのノックアウトマウスでは、低分子量蛋白尿、骨代謝異常、呼吸不全、脳奇形などが起こる(非特許文献１１参照)。メガリンのホモログは線虫(C.elegans)にも存在し、生物学的重要性も示唆されている(非特許文献１２参照)。
メガリンは、ヒトでは4655アミノ酸、ラットでは4660アミノ酸から成る巨大な細胞膜タンパク質であり、そのアミノ酸配列から予想される分子量は約520kDaで、糖鎖を加えると約600kDaに及ぶ(非特許文献２参照)。メガリンはLDLレセプター遺伝子ファミリーに属し、その巨大な細胞外領域は4つの機能的ドメインを有し、単一の細胞膜貫通領域を介して短い細胞内領域へ続く。メガリンは糸球体(ラット)、近位尿細管、肺胞ＩＩ型細胞、副睾丸腺、甲状腺、副甲状腺、卵黄嚢膜、内耳、小腸、脈絡膜などの上皮細胞膜の管腔側（糸球体上皮では管腔側と基底膜側の両方）のclathrin-coated pitに主に存在し、多様なリガンドの細胞内への取り込み・代謝に関係している(非特許文献９および１０を参照)。メガリンのノックアウトマウスでは、低分子量蛋白尿、骨代謝異常、呼吸不全、脳奇形などが起こる(非特許文献１１参照)。メガリンのホモログは線虫(C.elegans)にも存在し、生物学的重要性も示唆されている(非特許文献１２参照)。
５．腎炎の病因としてのメガリンの重要性
実験膜性腎症(Heymann腎炎)の主要病因抗原であるメガリンは、上皮細胞型スカベンジャー受容体であり、その生理学的・病理学的役割が明らかにされてきている。その中で、ヒト膜性腎症の発症機序の解明の為に、古くから動物モデルが使われてきたが、なかでもラットHeymann腎炎(Heymann nephritis )は最も解析が進んでいる膜性腎症モデルである。Saito A.らは、Heymann腎炎の病的エピトープとリガンド結合ドメインについても解析した結果を開示しており、メガリンの主要抗原領域ならびにリガンドとの結合に主に寄与するメガリンの機能領域についても明らかにしている（非特許文献１３〜１６を参照）。
実験膜性腎症(Heymann腎炎)の主要病因抗原であるメガリンは、上皮細胞型スカベンジャー受容体であり、その生理学的・病理学的役割が明らかにされてきている。その中で、ヒト膜性腎症の発症機序の解明の為に、古くから動物モデルが使われてきたが、なかでもラットHeymann腎炎(Heymann nephritis )は最も解析が進んでいる膜性腎症モデルである。Saito A.らは、Heymann腎炎の病的エピトープとリガンド結合ドメインについても解析した結果を開示しており、メガリンの主要抗原領域ならびにリガンドとの結合に主に寄与するメガリンの機能領域についても明らかにしている（非特許文献１３〜１６を参照）。
６．メガリンの多様なリガンド
生体内でメガリンは近位尿細管上皮細胞の管腔側に最も豊富に発現している。ヒト腎では、近位尿細管上皮細胞以外は、糸球体を含め、発現は認められない。メガリンは糸球体を濾過する様々なリガンド（低分子量タンパク質や薬剤など）をエンドサイトーシスによって細胞内に取り込み、それらをライソゾームへ運搬した後、メガリン自身はリサイクリングによって細胞表面に再び現れる(非特許文献９および１０を参照)。あるいは管腔側から基底膜側へのトランスサイトーシスにも関係している。ビタミンA,B12,Dなどの結合タンパク質の取り込み・代謝にも関係する(非特許文献１０を参照)。ChristensenとWillnowは、メガリンは、３つのビタミン担体タンパク質、ビタミンD結合タンパク質(DBP)、レチノール結合タンパク質(RBP)、及びトランスコバラミン(TC)、ならびにそれらの会合ビタミンである(OH)ビタミン25D3 、ビタミンA(レチノール)、およびビタミンB12の再吸収を仲介することを明らかにしている(非特許文献３参照)。Saito A.らは、脂肪細胞から分泌され、肥満患者で血液中に増加するレプチンが、メガリンのリガンドとして近位尿細管上皮細胞に取り込まれ、代謝されることを明らかにしている(非特許文献１７参照)。この脂肪細胞つまり、内臓脂肪の蓄積の結果としてメタボリック症候群という複合的な病態を呈するが、脂肪細胞が分泌するアディポサイトカインのひとつであるレプチンは、メタボリック症候群患者の血液中において増加している。腎臓は血液中のレプチンが最も集積する臓器であるとともに、レプチンは腎障害性の役割を演ずることが示唆されている(非特許文献１８参照)。また、いわゆるレプチン受容体はメガリンの作用域より下流の近位尿細管から集合管にかけて存在することも判明している。
生体内でメガリンは近位尿細管上皮細胞の管腔側に最も豊富に発現している。ヒト腎では、近位尿細管上皮細胞以外は、糸球体を含め、発現は認められない。メガリンは糸球体を濾過する様々なリガンド（低分子量タンパク質や薬剤など）をエンドサイトーシスによって細胞内に取り込み、それらをライソゾームへ運搬した後、メガリン自身はリサイクリングによって細胞表面に再び現れる(非特許文献９および１０を参照)。あるいは管腔側から基底膜側へのトランスサイトーシスにも関係している。ビタミンA,B12,Dなどの結合タンパク質の取り込み・代謝にも関係する(非特許文献１０を参照)。ChristensenとWillnowは、メガリンは、３つのビタミン担体タンパク質、ビタミンD結合タンパク質(DBP)、レチノール結合タンパク質(RBP)、及びトランスコバラミン(TC)、ならびにそれらの会合ビタミンである(OH)ビタミン25D3 、ビタミンA(レチノール)、およびビタミンB12の再吸収を仲介することを明らかにしている(非特許文献３参照)。Saito A.らは、脂肪細胞から分泌され、肥満患者で血液中に増加するレプチンが、メガリンのリガンドとして近位尿細管上皮細胞に取り込まれ、代謝されることを明らかにしている(非特許文献１７参照)。この脂肪細胞つまり、内臓脂肪の蓄積の結果としてメタボリック症候群という複合的な病態を呈するが、脂肪細胞が分泌するアディポサイトカインのひとつであるレプチンは、メタボリック症候群患者の血液中において増加している。腎臓は血液中のレプチンが最も集積する臓器であるとともに、レプチンは腎障害性の役割を演ずることが示唆されている(非特許文献１８参照)。また、いわゆるレプチン受容体はメガリンの作用域より下流の近位尿細管から集合管にかけて存在することも判明している。
メタボリック症候群とは、内臓肥満、高血圧、高脂血症、耐糖能異常などを合併し、インスリン抵抗性を基盤とする病態として定義されるが、このような病態では動脈硬化性疾患の発症リスクが高く、蛋白尿を呈し、糸球体・尿細管肥大を組織学的な特徴とする腎症が発症することもある。このような症例が、明らかな糖尿病を合併すると、更に高血糖の病像が加わり、糖尿病性腎症が顕在化するとともに、重症化する可能性がある。あるいは２型糖尿病は基本的にメタボリック症候群の病態が先行あるいは並存する為、本来その腎症の病像は、メタボリック症候群関連腎症として内包しているともいえる。
また、Saito A.らはメガリンを高発現するラット卵黄嚢上皮由来細胞(L2細胞)を用いた実験において、125I標識AGE(advanced glycation end products)（グルコース由来）のL2細胞への取り込みが、抗メガリン抗体によって有意に抑制されることから、その取り込み経路にメガリンが関与することを明らかにしてきている(非特許文献１９)。糖尿病性腎症の発症機序として、メイラード反応による糖化修飾蛋白advanced glycation end products(AGE)の関与が指摘されている。血液中に存在する低分子量のAGEは糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞によって再吸収・代謝される。さらに腎症が進行すれば、より高分子量のAGEも糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞に蓄積し、過剰な代謝負荷となる。また更に、Saito A.らは、グルコース以外にも、メチルグリオキサールやグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド由来のAGEの細胞取り込みにもメガリンが関与することを明らかにしている。また、メタボリック症候群では脂肪肝などの肝障害を合併することが多い。肝臓内に豊富に存在するliver type fatty acid binding protein(L-FABP)は、健常者でも血液中に放出されているが、肝障害ではさらに血液中に逸脱し増加する。Saito A.らは血液中に存在するL-FABPも速やかに糸球体を濾過し、近位尿細管上皮細胞においてメガリンを介して再吸収されることを明らかにしている(非特許文献２０)。
７．メガリンと相互作用する機能性タンパク質
細胞内でのメガリンの輸送機序を明らかにする為に、メガリンの細胞内ドメインに結合するアダプター分子が探索され、Dab2 , ANKRA , MAGI-1 , GAIP , GIPC , Galphai3 ,MegBP , ARH等々の様々なタンパク質が同定されている(非特許文献２１〜２６を参照)。このような分子を介して、メガリンはエンドサイトーシスあるいはトランスサイトーシスに関わるとともに、これらに関連したシグナル伝達にも関与している。メガリンはまた、近位尿細管上皮細胞においキュビリン(Cubilin)という細胞膜受容体と共役的に働くことによって、更に多様なリガンドの細胞取り込みに関与する(非特許文献２参照)。たとえばキュビリンは、トランスフェリン、アルブミン、内因性ビタミンB12などに直接結合する受容体であるが、それらのエンドサイトーシスにメガリンが間接的に関与している。また、メガリンは、近位尿細管上皮細胞の、Na＋−H＋exchanger isoform 3(NHE3)と相互作用を及ぼしあうことも知られている(非特許文献２７参照)。NHE3はNa＋再吸収に重要な役割を演ずるアンチポーターであるが、メガリンによるリガンド取り込みにも影響を与えている(非特許文献２８参照)。メガリンはまた、NHE3の不活性化・代謝に関与している可能性がある。糖尿病性腎症やメタボリック症候群関連腎症の初期には糸球体過剰濾過が起こる。これは近位尿細管のNa＋再吸収の亢進が第一義的な原因であると推定されており(非特許文献２９参照)、その際、重要な役割を演ずるのがNHE3であり、ここに上述したメガリンによるNHE3の不活性化・代謝が関与していると考えられている(非特許文献２８参照)。
細胞内でのメガリンの輸送機序を明らかにする為に、メガリンの細胞内ドメインに結合するアダプター分子が探索され、Dab2 , ANKRA , MAGI-1 , GAIP , GIPC , Galphai3 ,MegBP , ARH等々の様々なタンパク質が同定されている(非特許文献２１〜２６を参照)。このような分子を介して、メガリンはエンドサイトーシスあるいはトランスサイトーシスに関わるとともに、これらに関連したシグナル伝達にも関与している。メガリンはまた、近位尿細管上皮細胞においキュビリン(Cubilin)という細胞膜受容体と共役的に働くことによって、更に多様なリガンドの細胞取り込みに関与する(非特許文献２参照)。たとえばキュビリンは、トランスフェリン、アルブミン、内因性ビタミンB12などに直接結合する受容体であるが、それらのエンドサイトーシスにメガリンが間接的に関与している。また、メガリンは、近位尿細管上皮細胞の、Na＋−H＋exchanger isoform 3(NHE3)と相互作用を及ぼしあうことも知られている(非特許文献２７参照)。NHE3はNa＋再吸収に重要な役割を演ずるアンチポーターであるが、メガリンによるリガンド取り込みにも影響を与えている(非特許文献２８参照)。メガリンはまた、NHE3の不活性化・代謝に関与している可能性がある。糖尿病性腎症やメタボリック症候群関連腎症の初期には糸球体過剰濾過が起こる。これは近位尿細管のNa＋再吸収の亢進が第一義的な原因であると推定されており(非特許文献２９参照)、その際、重要な役割を演ずるのがNHE3であり、ここに上述したメガリンによるNHE3の不活性化・代謝が関与していると考えられている(非特許文献２８参照)。
８．メガリンの尿中排泄とメガリンのリガンドの尿中排泄の関連性
Lehesteらは、メガリン・ノックアウト・マウスおよび、近位尿細管機能が弱められたFanconi症候群を伴う患者が、その尿中にタンパク質およびレチノールの排泄増加を来すことを開示している(非特許文献３０)。更に、Moestrup S.K.らは、Fanconi症候群患者において、メガリンの尿中排泄量が正常に比して際立って低下しており、このことが近位尿細管におけるメガリンの機能・発現の低下およびそれに続く、レチノール結合タンパク質を含む糸球体濾過タンパク質の尿中排泄増加を来す要因であることを明らかにしている(非特許文献３１)。
Lehesteらは、メガリン・ノックアウト・マウスおよび、近位尿細管機能が弱められたFanconi症候群を伴う患者が、その尿中にタンパク質およびレチノールの排泄増加を来すことを開示している(非特許文献３０)。更に、Moestrup S.K.らは、Fanconi症候群患者において、メガリンの尿中排泄量が正常に比して際立って低下しており、このことが近位尿細管におけるメガリンの機能・発現の低下およびそれに続く、レチノール結合タンパク質を含む糸球体濾過タンパク質の尿中排泄増加を来す要因であることを明らかにしている(非特許文献３１)。
９．尿毒症モデル実験と臓器再生モデル実験によって得られたメガリンの機能の重要性
メガリンは前述のように様々な低分子量タンパク質の近位尿細管上皮細胞への取り込み・代謝に関わる。腎不全になると、そのような代謝機構が障害される結果、低分子量タンパク質が、いわゆる尿毒素タンパク質として、血液・組織に蓄積する。その代表例がβ2-ミクログロブリン(β2-m)であり、長期透析患者で透析アミロイドーシスを引き起こす原因となる(非特許文献３２参照)。前述のAGEも、腎不全・透析患者で血液中に蓄積し、動脈硬化や臓器障害の病因となることが示唆されており、一種の尿毒素タンパク質として考えられている(非特許文献３３参照)。さらにレプチンも透析患者で蓄積し、栄養障害や免疫低下に関係していると考えられている。Tabata Y.とGejyo F.らはメガリンの機能を利用した尿毒素タンパク質の代謝モデルの効果・有効性を開示している(非特許文献３４および特許文献１を参照)。これは、メガリンを発現する細胞を、生体内において足場タンパク質(scaffold)とともに移植し、周囲の血管(新生血管)から漏出する低分子量タンパク質を、メガリンを介してその細胞に取り込ませ代謝させるというものである。移植に用いたメガリン発現細胞（卵黄嚢上皮由来L2細胞）自体がメガリンを介してβ2-mを取り込み・代謝することを確認している(非特許文献３４参照)。L2細胞を皮下組織に移植したヌードマウスの両腎を摘出後、腎不全状態を惹起させ、その後服腔内注射した125I標識β2-mの移植組織塊および各種臓器での取り込みを測定した結果、移植L2細胞塊はその他の臓器に比較して有意に125I標識β2-m を取り込むこと、L2細胞を移植しない対照群と比して血液中の125I標識β2-mのクリアランスはL2細胞移植群で促進されることを明らかにしている(特許文献３４参照)。
メガリンは前述のように様々な低分子量タンパク質の近位尿細管上皮細胞への取り込み・代謝に関わる。腎不全になると、そのような代謝機構が障害される結果、低分子量タンパク質が、いわゆる尿毒素タンパク質として、血液・組織に蓄積する。その代表例がβ2-ミクログロブリン(β2-m)であり、長期透析患者で透析アミロイドーシスを引き起こす原因となる(非特許文献３２参照)。前述のAGEも、腎不全・透析患者で血液中に蓄積し、動脈硬化や臓器障害の病因となることが示唆されており、一種の尿毒素タンパク質として考えられている(非特許文献３３参照)。さらにレプチンも透析患者で蓄積し、栄養障害や免疫低下に関係していると考えられている。Tabata Y.とGejyo F.らはメガリンの機能を利用した尿毒素タンパク質の代謝モデルの効果・有効性を開示している(非特許文献３４および特許文献１を参照)。これは、メガリンを発現する細胞を、生体内において足場タンパク質(scaffold)とともに移植し、周囲の血管(新生血管)から漏出する低分子量タンパク質を、メガリンを介してその細胞に取り込ませ代謝させるというものである。移植に用いたメガリン発現細胞（卵黄嚢上皮由来L2細胞）自体がメガリンを介してβ2-mを取り込み・代謝することを確認している(非特許文献３４参照)。L2細胞を皮下組織に移植したヌードマウスの両腎を摘出後、腎不全状態を惹起させ、その後服腔内注射した125I標識β2-mの移植組織塊および各種臓器での取り込みを測定した結果、移植L2細胞塊はその他の臓器に比較して有意に125I標識β2-m を取り込むこと、L2細胞を移植しない対照群と比して血液中の125I標識β2-mのクリアランスはL2細胞移植群で促進されることを明らかにしている(特許文献３４参照)。
１０．プロテオライシスとメガリンの尿中排泄
また、近年、メガリンがNotchlike signal pathwayの下で、proteolysisを受けている可能性が示唆されてきている(非特許文献３５および３６を参照)。これは、metalloproteaseが媒介するectodomainのsheddingとgamma-secretaseが媒介するintramembrane proteolysisの2段階による切断様式を含む。
また、近年、メガリンがNotchlike signal pathwayの下で、proteolysisを受けている可能性が示唆されてきている(非特許文献３５および３６を参照)。これは、metalloproteaseが媒介するectodomainのsheddingとgamma-secretaseが媒介するintramembrane proteolysisの2段階による切断様式を含む。
また、肺胞ＩＩ型細胞上にもメガリンが発現することが知られている。
上記のように、メガリンについては、腎臓等の臓器における代謝との関係で多くの研究がされている。しかしながら、腎臓を含めた臓器疾患とメガリンとの関係は明確になっておらず、また種々の臓器疾患において、メガリンの発現や体液中への排泄等がどうなっているのかについては研究されていなかった。
上記のように、メガリンについては、腎臓等の臓器における代謝との関係で多くの研究がされている。しかしながら、腎臓を含めた臓器疾患とメガリンとの関係は明確になっておらず、また種々の臓器疾患において、メガリンの発現や体液中への排泄等がどうなっているのかについては研究されていなかった。
従来メガリンの検出方法としては、ウサギ等の免疫動物に免疫してえられたポリクローナル抗体を用いた組織染色あるいはWestern Blottingによる方法が知られている。
しかしながら、この従来法では、細胞や電気泳動で分離したタンパク質等を染色するため、組織の固定や切片の作成、電気泳動やその後の膜上への転写等、極めて煩雑で多くの時間を必要とし、また、メガリンの量を定量することは困難である。
また、組織・臓器の機能障害の程度を診断するという観点からいえば、特に腎疾患において尿細管障害を特異的かつ簡便に診断する有効な術は無い。腎疾患の診断マーカーとしては、尿や血液中のアルブミン、クレアチニン、β2-ミクログロブリン、L-FABP等々を検出するという数多くの診断方法が用いられている現状であるが、これらの診断マーカーは何れも腎組織由来のものではなく、腎糸球体での濾過と尿細管での再吸収の過程の総合的な現象・機能の結果を捉えたものでしかない。すなわち、上記マーカーを用いても腎臓における糸球体障害と尿細管障害の特定は困難であり、上記マーカーは腎臓外由来の間接的なマーカーであるため疾患の早期診断には有効性が乏しい。また、肺疾患、特に炎症に対する現状の診断マーカーであるKL-6(急性期炎症マーカー)等と比しても同様のことがいえる。
本発明の目的は、従来法に比較して簡便で所要時間が短く、且つ、ヒトメガリンの定量も可能なヒトメガリンの測定方法を提供することである。更に、本測定方法を用いることで、細胞・組織・臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可能とするものである。特に、尿中メガリンを測定することによる腎疾患を検出する方法の提供を目的とする。
上記のように、ヒトメガリンについては多数の報告がなされており、腎臓や肺等の臓器代謝との関連は示唆されていた。しかしながら、臓器機能に障害が表れた場合に、メガリンの発現がどのように変動し、メガリンの消長がどうなるか等については不明であった。
本発明者らは、高感度かつ迅速にヒトメガリンを測定する方法について鋭意検討を行い、ヒトメガリンに結合性を有するリガンド、特に抗ヒトメガリン抗体を用いた、尿等の体液検体中のメガリンを正確に測定する方法を見出した。
さらに、本発明者らは、臓器機能に障害を有する患者体液中のヒトメガリンを測定し、ヒトメガリンが臓器疾患を検出・診断するためのマーカーとなり得ることをはじめて見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体を反応させ、かつヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体とを反応させ、検体中のヒトメガリンとヒトメガリンに結合性を有するリガンドとの複合体形成により固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定することを含む検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[２] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応の後にヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体との反応を行わせる、２ステップからなる、[１]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[１] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体を反応させ、かつヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体とを反応させ、検体中のヒトメガリンとヒトメガリンに結合性を有するリガンドとの複合体形成により固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定することを含む検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[２] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応の後にヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体との反応を行わせる、２ステップからなる、[１]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[３] 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応とヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体との反応を同時に行わせる、１ステップからなる、[１]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[４] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが共に抗体である[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[５] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンであり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが抗体である[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[６] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドが抗体であり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンである[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[４] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが共に抗体である[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[５] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンであり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが抗体である[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[６] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドが抗体であり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンである[１]〜[３]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[７] ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよび／またはヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドがトランスコバラミンビタミンB12（Transcobalamin-vitamin B12）、ビタミンD結合タンパク質（Vitamin-D-binding protein）もしくはレチノール結合タンパク質（Retinol-binding protein）であるビタミン結合性タンパク質（Vitamin-binding proteins）；アポリポプロテインB（Apolipoprotein B）、アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）、アポリポプロテインJ/クラステリン（ApolipoproteinJ/clusterin）もしくはアポリポプロテインH（Apolipoprotein H）であるリポプロテイン；副甲状腺ホルモン(PTH)、インスリン、上皮細胞成長因子(EGF)、プロラクチン、レプチンもしくはサイログロブリンまたはこれらの受容体であるホルモンまたはそれらのホルモンの受容体；イムノグロブリン軽鎖、PAP-1もしくはβ2-マイクログロブリンである免疫およびストレス応答関連タンパク質；PAI-Ｉ、PAI-Ｉ-ウロキナーゼ、PAI-Ｉ-tPA、プロウロキナーゼ、リポプロテインリパーゼ、プラスミノーゲン、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、α1-マイクログロブリンもしくはリゾチームまたはこれらのインヒビターである酵素またはそれらの酵素のインヒビター；アミノグリコシド、ポリミキシンB、アプロチニン（Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Trichosantin）である薬剤または毒物；アルブミン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、匂い物質結合タンパク質（Odorant-binding protein）、トランスサイレチンもしくはL-FABPであるキャリアタンパク質；ならびにチトクローム-c、カルシウム(Ca2＋)、後期糖化生成物（advanced glycation end products(AGE)）、キュビリンもしくはNa＋-H＋交換輸送体アイソフォーム（Na＋-H＋exchanger isoform 3(NHE3)）である受容体関連タンパク質(RAP)、からなる群から選択される物質またはその結合性断片である[１]〜[６]のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[８] 固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体とヒトメガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前記固相に結合したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドを測定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少率に基づいて、検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[９] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である[８]の検体中のヒトメガリンを測定する方法。
[１０] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメガリンを測定するヒトメガリンを測定する方法。
[１１] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体であり、凝集反応が免疫凝集反応である、[１０]のヒトメガリンを測定する方法。
[１２] [１]〜[１１]のいずれかの方法によりヒトメガリンを測定することによりメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出する方法。
[１０] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメガリンを測定するヒトメガリンを測定する方法。
[１１] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体であり、凝集反応が免疫凝集反応である、[１０]のヒトメガリンを測定する方法。
[１２] [１]〜[１１]のいずれかの方法によりヒトメガリンを測定することによりメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出する方法。
[１３] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である[１２]の臓器の疾患を検出する方法。
[１４] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である[１２]の臓器の疾患を検出する方法。
[１５] 腎疾患が尿細管障害である、[１４]の腎臓疾患を検出する方法。
[１６] 検体が尿である、[１４]または[１５]の方法。
[１７] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを含む、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[１８] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である、[１７]のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[１９] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である[１８]のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[１４] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である[１２]の臓器の疾患を検出する方法。
[１５] 腎疾患が尿細管障害である、[１４]の腎臓疾患を検出する方法。
[１６] 検体が尿である、[１４]または[１５]の方法。
[１７] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを含む、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[１８] ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である、[１７]のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[１９] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である[１８]のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[２０] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である[１８]のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
[２１] 腎疾患が尿細管障害である、[２０]の腎疾患を検出するためのキット。
[２２] ヒトメガリンからなる、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出用マーカー。
[２３] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である[２２]の疾患検出用マーカー。
[２１] 腎疾患が尿細管障害である、[２０]の腎疾患を検出するためのキット。
[２２] ヒトメガリンからなる、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出用マーカー。
[２３] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である[２２]の疾患検出用マーカー。
[２４] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である[２２]の疾患検出用マーカー。
[２５] 腎疾患が尿細管障害である、[２４]の疾患検出用マーカー。
[２６] ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出用マーカーとしての使用。
[２７] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である、[２６]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[２８] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である、[２６]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[２９] 腎疾患が尿細管障害である、[２８]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[２５] 腎疾患が尿細管障害である、[２４]の疾患検出用マーカー。
[２６] ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出用マーカーとしての使用。
[２７] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である、[２６]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[２８] メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である、[２６]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
[２９] 腎疾患が尿細管障害である、[２８]のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
本発明の方法により、尿等の検体中のヒトメガリンを高感度にかつ正確に測定することができる。また、メガリンを発現する細胞、組織または臓器の機能に障害が生じた場合に、細胞からメガリンが逸脱し検体中に蓄積する。すなわち、検体中のヒトメガリンを測定することにより、細胞、組織または臓器の機能障害を間接的にではなく、直接的に検出・診断することができる。従って、本発明の方法を用いて検体中のヒトメガリンを測定することにより、腎疾患、肺疾患等のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を早期にかつ正確に検出することが可能になる。
本発明は、検体中のヒトメガリンを測定する方法である。配列番号１にヒトメガリンのヌクレオチド配列、配列番号２にヒトメガリンのアミノ酸配列を表す。
本発明のヒトメガリンの測定においては、ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドを固相に結合したものを用いる。固相としては、従来の免疫分析において用いられている何れのものをも用いることができ、例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレートのウェルや、磁性粒子等を好ましく用いることができる。
ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとしては、例えば抗ヒトメガリン抗体が挙げられ、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も用いることができる。
また、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとして、ヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンを用いることもできる。レクチンとしては、コンカナバリンA、コムギ胚レクチン（WGA)、ヒマレクチン（RCA)、レンズマメレクチン（LCA）等が挙げられるがこれらには限定されない。
さらに、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドとして、トランスコバラミンビタミンB12（Transcobalamin-vitamin B12）、ビタミンD結合タンパク質（Vitamin-D-binding protein）もしくはレチノール結合タンパク質（Retinol-binding protein）等のビタミン結合性タンパク質（Vitamin-binding proteins）；アポリポプロテインB（Apolipoprotein B）、アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）、アポリポプロテインJ/クラステリン（ApolipoproteinJ/clusterin）もしくはアポリポプロテインH（Apolipoprotein H）等のリポプロテイン；副甲状腺ホルモン(PTH)、インスリン、上皮細胞成長因子(EGF)、プロラクチン、レプチンもしくはサイログロブリンまたはこれらの受容体等のホルモンまたはそれらのホルモンの受容体；イムノグロブリン軽鎖、PAP-1もしくはβ2-マイクログロブリン等の免疫およびストレス応答関連タンパク質；Enzymes and enzyme inhibitors : PAI-Ｉ、PAI-Ｉ-ウロキナーゼ、PAI-Ｉ-tPA、プロウロキナーゼ、リポプロテインリパーゼ、プラスミノーゲン、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、α1-マイクログロブリンもしくはリゾチームまたはこれらのインヒビター等の酵素またはそれらの酵素のインヒビター；アミノグリコシド、ポリミキシンB、アプロチニン（Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Trichosantin）等の薬剤または毒物；アルブミン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、匂い物質結合タンパク質（Odorant-binding protein）、トランスサイレチンもしくはL-FABPであるキャリアタンパク質；ならびにチトクローム-c、カルシウム(Ca2＋)、後期糖化生成物（advanced glycation end products(AGE)）、キュビリンもしくはNa＋-H＋交換輸送体アイソフォーム（Na＋-H＋exchanger isoform 3(NHE3)）等の受容体関連タンパク質(RAP)、からなる群から選択される物質またはその結合性断片等が挙げられる。ここで、結合性断片とは、前記物質の断片であって、ヒトメガリンと結合する部位を含む断片をいう。
抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリガンドの固相への結合は、従来からこの分野において周知の方法で行うことができ、例えば、マイクロタイタープレートのウェル等に結合する場合には3〜10μg/mL程度（好ましくは5μg/mL程度）の抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリガンド溶液を固相に加え、4℃で一夜（好ましくは12時間以上）放置することにより行うことができる。尚、固相濃度に関しては、上記記載の推奨濃度幅は完全長の抗体を固相する際に、理論的に算出した値である。その理論式は、
Q = (2 / √3)・(MW / N)・(2r)−2・109 (ng / cm2)
Q ： molecular weight density (ng / cm2)
MW ： molecular weight (dalton：Da)
N ： Avogadro’s number = 6・1023 (mole−1)
r ： Stokes radius of molecular = (R・T20) / (6・π・η20・D20・N) (cm)
R ： gas constant = 8.3・107 (g・cm2・sec−2・°K−1・mole−1
T20 ： room temperature(20℃) = 293°K
η20 ： viscosity of water at 20℃ = 1・10−2(g・cm−1・sec−1)
D20 ： diff. coeff. of molecular ref. to water at 20℃ (cm2・sec−1)
であり、これは物理吸着様式による固相化の際に適応される。従って、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの固相化においては、個々の分子量等の上記変動因子に左右された理論上の固相濃度が設定される為、個々の固相分子種及び、固相面の形状等で異なる。従って、上記の固相濃度に限定されるものではない。また、固相吸着様式が、共有結合の場合にも、本発明は適応されるが、この場合は吸着面に存在する、共有結合に用いる官能基の数等も加味される為、これについても、固相濃度は限定されるものではない。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックする為に、定法に基づき、ウシ血清アルブミン(以下、BSAと略す)やカゼイン等でブロッキングを行う。また、固相が磁性粒子の場合も、上記マイクロタイタープレートの場合と同様である。
Q = (2 / √3)・(MW / N)・(2r)−2・109 (ng / cm2)
Q ： molecular weight density (ng / cm2)
MW ： molecular weight (dalton：Da)
N ： Avogadro’s number = 6・1023 (mole−1)
r ： Stokes radius of molecular = (R・T20) / (6・π・η20・D20・N) (cm)
R ： gas constant = 8.3・107 (g・cm2・sec−2・°K−1・mole−1
T20 ： room temperature(20℃) = 293°K
η20 ： viscosity of water at 20℃ = 1・10−2(g・cm−1・sec−1)
D20 ： diff. coeff. of molecular ref. to water at 20℃ (cm2・sec−1)
であり、これは物理吸着様式による固相化の際に適応される。従って、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの固相化においては、個々の分子量等の上記変動因子に左右された理論上の固相濃度が設定される為、個々の固相分子種及び、固相面の形状等で異なる。従って、上記の固相濃度に限定されるものではない。また、固相吸着様式が、共有結合の場合にも、本発明は適応されるが、この場合は吸着面に存在する、共有結合に用いる官能基の数等も加味される為、これについても、固相濃度は限定されるものではない。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックする為に、定法に基づき、ウシ血清アルブミン(以下、BSAと略す)やカゼイン等でブロッキングを行う。また、固相が磁性粒子の場合も、上記マイクロタイタープレートの場合と同様である。
このように固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有するリガンドと、検体を反応させ、検体中のヒトメガリンを、抗原抗体反応等のリガンド-レセプター結合反応により前記固相に結合されたヒトメガリンに結合性を有するリガンドを介して固相に結合させる。すなわち、固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンド-ヒトメガリンの複合体を形成させる。ここで、検体はヒトメガリンを含むかもしれないものであれば何であってもよい。検体としては、例えば、尿、肺胞洗浄液、血液・血清・血漿、呼気凝縮液等を挙げることができる。この抗原抗体反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。
次いで、洗浄後、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを、前記固相に結合された検体中のヒトメガリンと反応させる。すなわち、固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンド-ヒトメガリン-ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドの複合体を形成させる。ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドとしては抗ヒトメガリン抗体等、ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと同じものを用いることができる。但し、ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドの両方が抗ヒトメガリンモノクローナル抗体である場合、第１の抗ヒトメガリン抗体と第２の抗ヒトメガリン抗体が認識・結合するエピトープは異なっている必要がある。なお、第１の抗ヒトメガリン抗体および第２の抗ヒトメガリン抗体の組合せとしては、モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体およびポリクローナル抗体の組合せがあるが、いずれの組合せも用いることができる。この反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。これにより、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドは、ヒトメガリン及びヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドを介して固相に結合される。
次いで、洗浄後、固相に結合された第２の抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定する。これは、免疫分析の分野において定用されている種々の方法により行うことができる。例えば、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを、酵素、蛍光、ビオチン、放射標識等で標識して酵素標識体を作製しておき、これらの標識を測定することにより固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定することができる。これらのうち、酵素あるいは蛍光による標識が好ましく、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等が、蛍光としてはFluorescein Isothiocyanate(FITC)等が挙げられるがこの限りではない。標識の検出は、対応する基質と酵素標識体とを反応させ、反応の結果生じる色素、蛍光、発光等を測定することにより行うことができる。あるいは、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが標識されていない場合には、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドに対する、標識された第３の抗体を反応させ、この標識に基づき第３の抗体を測定することによってもヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定することができる。
なお、固相あるいは標識に用いる抗ヒトメガリン抗体は、ヒトメガリンに対して特異的なFabやF(ab’)2のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、ヒトメガリンに特異的なこれらの断片をも包含する。これらの断片の調製方法はこの分野において周知である。
上記の方法は、固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体を反応させ、次いで洗浄し、その後にヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを反応させる２ステップからなる方法である。固相に結合された抗ヒトメガリン抗体等のヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応と検体とヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドとの反応を同時に行わせる１ステップからなる方法を採用してもよい。
本発明は、さらに固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体とヒトメガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前記固相に結合したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドを測定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少率に基づいて、検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測定する方法をも包含する。この方法のためには、ヒトメガリンを固相に結合する必要があるが、前記の物質の固相へ結合の方法に従って行うことができる。また、ヒトメガリンの一部断片は限定されず、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが結合するヒトメガリンの一部断片を用いればよい。ヒトメガリンの一部断片としては、配列番号２に表されるヒトメガリンのアミノ酸配列の一部部分配列を化学合成や遺伝子工学の手法により作製して用いることができる。ヒトメガリンに結合性を有するリガンドは前記のものを用いることができ、その中でも抗ヒトメガリン抗体が好ましい。競合法においては、用いる固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合性を有するリガンドの量が重要であるが、競合法は公知であり、公知技術に基づいて、適宜決定することができる。
さらに、本発明は、ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメガリンを測定するヒトメガリンを測定する方法を包含する。
該方法において用いられる粒子としては、直径0.05〜10μmの、好ましくは直径0.1〜0.4μmのラテックス、直径0.5〜10μmのゼラチン粒子及び動物赤血球を挙げることができる。粒子への抗体の結合方法は、この分野において周知であり、物理吸着あるいは共有結合のどちらの結合様式をも適応可能である。
該方法において、粒子上に抗ヒトメガリン抗体が結合されている粒子と検体とを、例えば、黒色のスライドグラス上で混合し、凝集して沈殿する粒子の有無を観察することにより検対中のヒトメガリンを検出することができる。また、この凝集の吸光度測定によりヒトメガリンを定量することもできる。更にまた、Pulse Immunoassayにより検出することも可能である。
本発明のヒトメガリンの測定方法を用いることにより、インタクトなヒトメガリンだけではなく、ヒトメガリンの断片を測定することもできる。
検体中のヒトメガリンを測定することにより、検体を採取した被験体がヒトメガリンを発現する細胞・組織・臓器等に障害を有しているかどうかを判定することができる。すなわち、臓器の疾患等を検出または診断することができる。
細胞、組織または臓器としては、メガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器ならばいずれも対象となり得るが、好ましくは肺および腎臓であり、さらに好ましくは腎臓である。また、腎臓疾患では、特に腎炎や尿細管障害を検出することができる。また、糖尿病性腎障害も好適に検出することができる。さらに、メタボリック症候群やメタボリック症候群関連腎症の検出にも利用できる。
上記の細胞、組織または臓器の機能障害を有する被験体においては、細胞からヒトメガリンが逸脱し、検体中のヒトメガリン量が増加する。被験体から採取した検体中のヒトメガリンをin vitroで測定し、正常人に比較して検体中のヒトメガリン濃度が有意に増加している場合、細胞、組織または臓器の機能障害を有していると診断することができる。
ここで、検体は上記のように、尿、肺胞洗浄液、血液・血清・血漿、呼気凝縮液等を用いることができるが、肺疾患を検出する場合には特に肺胞洗浄液を用いるのが好ましく、腎疾患を検出する場合には、尿が好ましい。
さらに、被験体から採取した検体中のヒトメガリンを測定することにより、腎疾患等の細胞、組織または臓器の機能障害に罹患するリスクを評価することができる。被験体から採取した検体中のヒトメガリンをin vitroで測定し、正常人に比較して検体中のヒトメガリン濃度が有意に増加している場合、細胞、組織または臓器の機能障害に罹患するリスクが高いと評価することができる。すなわち、検体中のヒトメガリンを測定することにより、腎疾患予備軍等の疾患に罹患するリスクの高い被験体をスクリーニングし、適切な処置を施すことが可能になる。
さらに、被験体から採取した検体中のヒトメガリンを定期的に測定し、ヒトメガリン濃度をモニタすることにより、臓器機能の管理をすることができる。
ヒトメガリンは、ヒトメガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器の機能障害の検出または診断のためのマーカーとして用いることができる。本発明は、ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の機能障害すなわち疾患を検出するための検出用マーカーとしての使用を包含し、さらにヒトメガリンからなる、メガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器の機能障害すなわち疾患を検出・診断するための疾患検出・診断用マーカーを包含する。
また、ヒトメガリンの発現が認められる細胞、組織または臓器の機能障害の検出または診断においては、インタクトなヒトメガリンだけではなく、ヒトメガリンの断片を測定してもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。尚、実施例に用いたEnzyme -Linked Immunosorbent Assay(ELISA)という方法は、1971年にEngvall E.とPerlmann P.が最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立っている(Engvall E , Perlmann P. (1971) Immunochemistry. 8 , 871-874)。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
Enzyme -Linked Immunosorbent Assay(ELISA)を用いた尿中ヒトメガリンの検出
（１）抗ヒトメガリン・マウスモノクローナル抗体の作製
ヒトメガリン50μgをマウス腹腔にアジュバントと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。追加免疫（静脈内）後3日目に脾臓を取り出し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール3500の存在下(10：1細胞)で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を1週間CO2気下37℃で培養し、その培養上清中の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。そこで抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈し2週間培養し、同様に培養上清の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。更にその後、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ヒトメガリン抗体を産生している細胞を、フラスコにて培養し、その一部をジメチルスルホキシド(DMSO) 10%含有ウシ胎児血清(FCS)にサスペンドし(5×106個/mL)、液体窒素中に保存した。
（１）抗ヒトメガリン・マウスモノクローナル抗体の作製
ヒトメガリン50μgをマウス腹腔にアジュバントと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。追加免疫（静脈内）後3日目に脾臓を取り出し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール3500の存在下(10：1細胞)で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を1週間CO2気下37℃で培養し、その培養上清中の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。そこで抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈し2週間培養し、同様に培養上清の抗ヒトメガリン抗体の有無を調べた。更にその後、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ヒトメガリン抗体を産生している細胞を、フラスコにて培養し、その一部をジメチルスルホキシド(DMSO) 10%含有ウシ胎児血清(FCS)にサスペンドし(5×106個/mL)、液体窒素中に保存した。
次に各ウェルの上清を用い、ヒトメガリンに対する培養上清中の産生抗体の反応性を調べた。ヒトメガリンを140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.3(以下、PBS,pH7.3と略す)に溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc-ImmunoTMModule F8 MaxisorpTM Surface plate, Nalge Nunc International社製）のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記ヒトメガリン/PBS,pH7.3溶液を加え、3pmol/ウェル、4℃、12時間の条件下で、ヒトメガリンをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたヒトメガリン/PBS,pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、145mM NaCl,3.6mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,0.05%(v./v.) Tween20(以下、PBS-Tと略す)を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分のヒトメガリンを洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。その後、145mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM KH2PO4,1%(wt./v.) BSA,5%(wt./v.) ラクトース(以下、抗原固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件化でヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。培養上清中の抗体の反応性を確認する為に、このブロッキング完了後のヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートを用いた。上記ヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェルへ、ハイブリドーマ培養上清を100μL/ウェルで加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えておいた培養上清をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins(DAKO社製)を100μL/ウェル(2000倍希釈：0.55μg/mL)で加え、37℃、1時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には、145mM NaCl,3.6mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,0.05%(v./v.) Tween20,0.5%(wt./v.) BSA(以下、酵素標識抗体希釈液と称す)を用いた。その後、ウェルに加えておいた酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへ3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(以下、TMBと略す)溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO社製)をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分放置した。その後直ちに、そのウェル内の基質反応液へ313mM H2SO4溶液(以下、反応停止液と称する)を100μL/ウェルで添加し、ウェル内での酵素反応を停止させた。その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした(Josephy P.D. , Mason R.P. et al.(1982) J. Biol. Chem. 257 , 3669-3675)。尚、TMBを用いた比色定量の方法は、1981年にBos E.S.らが最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立っている(Bos E.S. et al. (1981) J. Immunoassay. 2 , 187-204)。
その結果、固相化したヒトメガリンへ抗ヒトメガリン抗体の強い反応性を示すモノクローナル化ハイブリドーマ細胞を選択し、本培養上清中のイムノグロブリンのクラスとサブクラスをImmunoglobulin Typing Kit,Mouse(和光純薬工業社製)を用いて、培養上清原液100μLから、各クローン毎に確認した。その結果を基に、得られた単クローン細胞ライブラリーの中から、IgGクラスに限定して後述する腹水化へ移行した。
次に、これらの細胞を25mLのフラスコで培養し、更に75mLのフラスコで培養した。この細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。
（２）抗ヒトメガリン・マウスモノクローナル(IgG)抗体の精製
得られた腹水(10mL)と混濁血清処理剤(FRIGEN（登録商標）ＩＩ：協和純薬工業社製)を、腹水1.5容に対してFRIGEN（登録商標）ＩＩを1容の比率で混和し、1〜2分攪拌振とうすることで、腹水からの脱脂を行った。遠心機で3000rpm(1930×g)、10分間遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清(10mL)を分取した。この腹水遠心上清(10mL)に硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降したイムノグロブリン画分をPBSで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、腹水からのイムノグロブリン粗画分を得た。得られたイムノグロブリン粗画分(10mL)に対して等量の20mMリン酸ナトリウム, pH7.0(以下、20mM NaPB,pH7.0と称す)を混合し、プロテインGカラム(HiTrap Protein G HP,5mL：Amersham BioSciences社製)を用いてアフィニティー精製を行った。サンプルをプロテインGカラムに吸着後、20mM NaPB,pH7.0(50mL)をプロテインGカラム内に通し、サンプル中のIgG以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインGカラムにアフィニティー吸着したIgGは、0.1M グリシン-HCl,pH2.7で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl,pH9.0(以下、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneをTrisと略す)で中和し回収した。中和後、アフィニティー精製物に対して500倍容のPBSで4℃、6時間の透析を行い、本透析は計2回行った。本透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)で行った。そこで得られたIgG溶出画分を、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の精製物とし、4℃での保存ならびに後述する操作に用いることとした。尚、本精製には、BioLogic LPシステム(Bio Rad Laboratories社製)に上述のプロテインGカラムを接続し、流速は1mL/minで一貫して行った。
得られた腹水(10mL)と混濁血清処理剤(FRIGEN（登録商標）ＩＩ：協和純薬工業社製)を、腹水1.5容に対してFRIGEN（登録商標）ＩＩを1容の比率で混和し、1〜2分攪拌振とうすることで、腹水からの脱脂を行った。遠心機で3000rpm(1930×g)、10分間遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清(10mL)を分取した。この腹水遠心上清(10mL)に硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降したイムノグロブリン画分をPBSで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、腹水からのイムノグロブリン粗画分を得た。得られたイムノグロブリン粗画分(10mL)に対して等量の20mMリン酸ナトリウム, pH7.0(以下、20mM NaPB,pH7.0と称す)を混合し、プロテインGカラム(HiTrap Protein G HP,5mL：Amersham BioSciences社製)を用いてアフィニティー精製を行った。サンプルをプロテインGカラムに吸着後、20mM NaPB,pH7.0(50mL)をプロテインGカラム内に通し、サンプル中のIgG以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインGカラムにアフィニティー吸着したIgGは、0.1M グリシン-HCl,pH2.7で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl,pH9.0(以下、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneをTrisと略す)で中和し回収した。中和後、アフィニティー精製物に対して500倍容のPBSで4℃、6時間の透析を行い、本透析は計2回行った。本透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)で行った。そこで得られたIgG溶出画分を、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の精製物とし、4℃での保存ならびに後述する操作に用いることとした。尚、本精製には、BioLogic LPシステム(Bio Rad Laboratories社製)に上述のプロテインGカラムを接続し、流速は1mL/minで一貫して行った。
（３）抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートの作成
精製抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をPBS,pH7.3に終濃度5μg/mLで溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc-ImmunoTMModule F8 MaxisorpTM Surface plate, Nalge Nunc International社製）のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/PBS,pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下で、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいた抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/PBS,pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。その後、86mM NaCl,100mM Tris,0.5%(wt./v.) BSA,0.05%(v./v.) Tween20(以下、抗体固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件化でヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。
精製抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をPBS,pH7.3に終濃度5μg/mLで溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc-ImmunoTMModule F8 MaxisorpTM Surface plate, Nalge Nunc International社製）のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/PBS,pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下で、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいた抗ヒトメガリンモノクローナル抗体/PBS,pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。その後、86mM NaCl,100mM Tris,0.5%(wt./v.) BSA,0.05%(v./v.) Tween20(以下、抗体固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件化でヒトメガリン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。
（４）ペルオキシダーゼ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体の作成
西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下、HRPと略す)(Peroxidase from horseradish TypeVI：Sigma社製)を純水に4mg/mLの濃度で溶かし、このHRP溶液500μL(2mg)に対して、100mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液(100μL)を加えて、20分間、室温で攪拌した。これを、該HRP溶液に対して500倍容の1mM酢酸ナトリウム,pH4.0溶液(以下、1mM酢酸緩衝液と称す)で4℃、6時間の透析を２回行った。透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)であった。次に、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を、2.4mM Na2CO3, 7.6mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、10mM 炭酸緩衝液と称す）に8mg/mLの濃度で溶かした。上述のHRP溶液500μL(2mg)に、HRP溶液に対して1/3倍容の120mM Na2CO3, 380mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、0.5M 炭酸緩衝液と称す）を加え、ここに、上述の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体500μL(4mg)を混合し、室温で2時間攪した。その後、4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(50μL)を加え、氷水浴中で2時間攪拌した。これに対し、硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降した画分を100mM Tris,145mM NaCl,1%(v./v.)BSA,pH7.6溶液(以下、標識抗体浮遊液と称す)1mLで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、標識抗体溶液量に対して3/4倍容の2.8mM KH2PO4,7.2mM Na2HPO4,145mM NaCl,1%(wt./v.)BSA,0.02%(v./v.) フェノール,40%(wt./v.) D-ソルビトール溶液（以下、標識抗体保存液と称す）を加えた。HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を得た。尚、本HRP標識化の方法は、1974年にNakane P.K.とKawaoi A.が最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立っている(Nakane P.K. , Kawaoi A. (1974) J.Histochem.Cytochem. 22 , 1084)。
西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下、HRPと略す)(Peroxidase from horseradish TypeVI：Sigma社製)を純水に4mg/mLの濃度で溶かし、このHRP溶液500μL(2mg)に対して、100mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液(100μL)を加えて、20分間、室温で攪拌した。これを、該HRP溶液に対して500倍容の1mM酢酸ナトリウム,pH4.0溶液(以下、1mM酢酸緩衝液と称す)で4℃、6時間の透析を２回行った。透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)であった。次に、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を、2.4mM Na2CO3, 7.6mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、10mM 炭酸緩衝液と称す）に8mg/mLの濃度で溶かした。上述のHRP溶液500μL(2mg)に、HRP溶液に対して1/3倍容の120mM Na2CO3, 380mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、0.5M 炭酸緩衝液と称す）を加え、ここに、上述の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体500μL(4mg)を混合し、室温で2時間攪した。その後、4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(50μL)を加え、氷水浴中で2時間攪拌した。これに対し、硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降した画分を100mM Tris,145mM NaCl,1%(v./v.)BSA,pH7.6溶液(以下、標識抗体浮遊液と称す)1mLで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、標識抗体溶液量に対して3/4倍容の2.8mM KH2PO4,7.2mM Na2HPO4,145mM NaCl,1%(wt./v.)BSA,0.02%(v./v.) フェノール,40%(wt./v.) D-ソルビトール溶液（以下、標識抗体保存液と称す）を加えた。HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を得た。尚、本HRP標識化の方法は、1974年にNakane P.K.とKawaoi A.が最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立っている(Nakane P.K. , Kawaoi A. (1974) J.Histochem.Cytochem. 22 , 1084)。
（５）尿中ヒトメガリンの測定
上述した抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートと、HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて、尿中のヒトメガリンを測定した。先ず、原尿90μLと2M Tris,0.2M Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid(以下、Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acidをEDTAと略す),pH8.0溶液10μLを混合し、該混合液100μLを抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいた尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。その後、HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体(上記調製原液を標識抗体希釈液で10000倍希釈)溶液を100μL/ウェルで加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいたHRP標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。次に、ウェルへTMB溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO社製)をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分放置した。その後直ちに、そのウェル内の基質反応液へ反応停止液100μL/ウェルで添加し、ウェル内での酵素反応を停止させた。その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を尿中ヒトメガリン測定評価の指標とした。検量線の標準品としては、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体作出時に免疫用抗原として用いたヒトメガリンを使用し、その検量線結果を表１および図２に記載した。尚、実際の尿中ヒトメガリン測定の臨床結果については、表２、図３および図４に示した。この結果、健常人に比して、腎疾患患者および腎疾患予備軍で有意に、尿中へのヒトメガリンの排泄が認められた（図３および４）。尚、尿中へのメガリン排泄量のクレアチニンクリアランスの結果からも、同様の結果が得られ、尿排泄時の濃縮率の影響ではないことも示された(図３および４)。本発明の目的は、従来法に比較して簡便で所要時間が短く、且つ、ヒトメガリンの定量も可能なヒトメガリンの測定方法を提供することであり、更に、本測定方法を用いることで、細胞・組織・臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可能とするものであるが、上述の臨床結果は、これを大きく支持するものである。
上述した抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートと、HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて、尿中のヒトメガリンを測定した。先ず、原尿90μLと2M Tris,0.2M Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid(以下、Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acidをEDTAと略す),pH8.0溶液10μLを混合し、該混合液100μLを抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいた尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。その後、HRP標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体(上記調製原液を標識抗体希釈液で10000倍希釈)溶液を100μL/ウェルで加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいたHRP標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。次に、ウェルへTMB溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO社製)をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分放置した。その後直ちに、そのウェル内の基質反応液へ反応停止液100μL/ウェルで添加し、ウェル内での酵素反応を停止させた。その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を尿中ヒトメガリン測定評価の指標とした。検量線の標準品としては、抗ヒトメガリンモノクローナル抗体作出時に免疫用抗原として用いたヒトメガリンを使用し、その検量線結果を表１および図２に記載した。尚、実際の尿中ヒトメガリン測定の臨床結果については、表２、図３および図４に示した。この結果、健常人に比して、腎疾患患者および腎疾患予備軍で有意に、尿中へのヒトメガリンの排泄が認められた（図３および４）。尚、尿中へのメガリン排泄量のクレアチニンクリアランスの結果からも、同様の結果が得られ、尿排泄時の濃縮率の影響ではないことも示された(図３および４)。本発明の目的は、従来法に比較して簡便で所要時間が短く、且つ、ヒトメガリンの定量も可能なヒトメガリンの測定方法を提供することであり、更に、本測定方法を用いることで、細胞・組織・臓器特異的な機能性疾患を部位直接的かつ、早期に診断可能とするものであるが、上述の臨床結果は、これを大きく支持するものである。
Claims (18)
- 以下の（１）〜（１１）のいずれかの方法によりヒトメガリンを測定することによりメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出する方法：
（１） 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体を反応させ、かつヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体とを反応させ、検体中のヒトメガリンとヒトメガリンに結合性を有するリガンドとの複合体形成により固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドを測定することを含む検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（２） 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応の後にヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体との反応を行わせる、２ステップからなる、（１）の検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（３） 固相に結合したヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドと検体との反応とヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドと検体との反応を同時に行わせる、１ステップからなる、（１）の検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（４） ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよびヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが共に抗体である（１）〜（３）のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（５） ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンであり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドが抗体である（１）〜（３）のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（６） ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドが抗体であり、ヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドがヒトメガリンの糖鎖に特異的なレクチンである（１）〜（３）のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（７） ヒトメガリンに結合性を有する第１のリガンドおよび／またはヒトメガリンに結合性を有する第２のリガンドがトランスコバラミンビタミンB 12 （Transcobalamin-vitamin B 12 ）、ビタミンD結合タンパク質（Vitamin-D-binding protein）もしくはレチノール結合タンパク質（Retinol-binding protein）であるビタミン結合性タンパク質（Vitamin-binding proteins）；アポリポプロテインB（Apolipoprotein B）、アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）、アポリポプロテインJ/クラステリン（ApolipoproteinJ/clusterin）もしくはアポリポプロテインH（Apolipoprotein H）であるリポプロテイン；副甲状腺ホルモン(PTH)、インスリン、上皮細胞成長因子(EGF)、プロラクチン、レプチンもしくはサイログロブリンまたはこれらの受容体であるホルモンまたはそれらのホルモンの受容体；イムノグロブリン軽鎖、PAP-1もしくはβ 2 -マイクログロブリンである免疫およびストレス応答関連タンパク質；PAI-Ｉ、PAI-Ｉ-ウロキナーゼ、PAI-Ｉ-tPA、プロウロキナーゼ、リポプロテインリパーゼ、プラスミノーゲン、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、α 1 -マイクログロブリンもしくはリゾチームまたはこれらのインヒビターである酵素またはそれらの酵素のインヒビター；アミノグリコシド、ポリミキシンB、アプロチニン（Aprotinin)もしくはトリコサンチン（Trichosantin）である薬剤または毒物；アルブミン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、匂い物質結合タンパク質（Odorant-binding protein）、トランスサイレチンもしくはL-FABPであるキャリアタンパク質；ならびにチトクローム-c、カルシウム(Ca 2＋ )、後期糖化生成物（advanced glycation end products(AGE)）、キュビリンもしくはNa ＋ -H ＋ 交換輸送体アイソフォーム（Na ＋ -H ＋ exchanger isoform 3(NHE3)）である受容体関連タンパク質(RAP)、からなる群から選択される物質またはその結合性断片である（１）〜（６）のいずれかの検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（８） 固相に結合したヒトメガリンもしくはヒトメガリンの一部断片およびヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体とヒトメガリンに結合性を有するリガンドを反応させ、次いで、該反応物と前記固相に結合したヒトメガリンを反応させ、固相に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドを測定し、固相に結合した該ヒトメガリンに結合性を有するリガンドの減少率に基づいて、検体中のヒトメガリンを競合的に定量する、検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（９） ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である（８）の検体中のヒトメガリンを測定する方法；
（１０） ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを用いて検体中のヒトメガリンを測定する方法であって、検体と粒子に結合したヒトメガリンに結合性を有するリガンドとを反応させ、凝集反応を生起させた後、得られた凝集の程度に基づいてヒトメガリンを測定するヒトメガリンを測定する方法；および
（１１） ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体であり、凝集反応が免疫凝集反応である、（１０）のヒトメガリンを測定する方法。 - メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項１記載の臓器の疾患を検出する方法。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項１記載の臓器の疾患を検出する方法。
- 腎疾患が尿細管障害である、請求項３記載の腎臓疾患を検出する方法。
- 検体が尿である、請求項３または４に記載の方法。
- ヒトメガリンに結合性を有するリガンドを含む、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
- ヒトメガリンに結合性を有するリガンドが抗ヒトメガリン抗体である、請求項６記載のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項７記載のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項７記載のメガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するためのキット。
- 腎疾患が尿細管障害である、請求項９記載の腎疾患を検出するためのキット。
- ヒトメガリンからなる、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための診断用マーカー。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である請求項１１記載の疾患検出用マーカー。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である請求項１１記載の疾患検出用マーカー。
- 腎疾患が尿細管障害である、請求項１３記載の疾患検出用マーカー。
- ヒトメガリンの、メガリンの発現が認められる臓器の疾患を検出するための疾患検出用マーカーとしての使用。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が肺疾患である、請求項１５記載のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
- メガリンの発現が認められる臓器の疾患が腎疾患である、請求項１５記載のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
- 腎疾患が尿細管障害である、請求項１７記載のヒトメガリンの疾患検出用マーカーとしての使用。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006089306A JP4865377B2 (ja) | 2006-03-28 | 2006-03-28 | ヒトメガリンの測定方法 |
| PCT/JP2007/056660 WO2007119563A1 (ja) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | ヒトメガリンの測定方法 |
| KR1020087026247A KR101500756B1 (ko) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | 인간 메갈린의 측정 방법 |
| RU2008142534/15A RU2463608C2 (ru) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Способ измерения мегалина человека |
| AU2007239885A AU2007239885B2 (en) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Method for measuring human megalin |
| CA2647580A CA2647580C (en) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Method for measuring human megalin |
| CN2007800194819A CN101454670B (zh) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | 测量人巨蛋白的方法 |
| ES07740098.4T ES2459165T3 (es) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Método de determinación de megalina humana |
| US12/293,992 US7955809B2 (en) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Method for measuring human megalin |
| BRPI0709271A BRPI0709271B8 (pt) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | métodos para a detecção de uma doença renal |
| EP07740098.4A EP2006683B1 (en) | 2006-03-28 | 2007-03-28 | Human megalin determination method |
| US13/093,984 US8703430B2 (en) | 2006-03-28 | 2011-04-26 | Method for measuring human megalin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006089306A JP4865377B2 (ja) | 2006-03-28 | 2006-03-28 | ヒトメガリンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007263750A JP2007263750A (ja) | 2007-10-11 |
| JP4865377B2 true JP4865377B2 (ja) | 2012-02-01 |
Family
ID=38609340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006089306A Active JP4865377B2 (ja) | 2006-03-28 | 2006-03-28 | ヒトメガリンの測定方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7955809B2 (ja) |
| EP (1) | EP2006683B1 (ja) |
| JP (1) | JP4865377B2 (ja) |
| KR (1) | KR101500756B1 (ja) |
| CN (1) | CN101454670B (ja) |
| AU (1) | AU2007239885B2 (ja) |
| BR (1) | BRPI0709271B8 (ja) |
| CA (1) | CA2647580C (ja) |
| ES (1) | ES2459165T3 (ja) |
| RU (1) | RU2463608C2 (ja) |
| WO (1) | WO2007119563A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014181970A (ja) * | 2013-03-18 | 2014-09-29 | Jichi Medical Univ | イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4865377B2 (ja) | 2006-03-28 | 2012-02-01 | 国立大学法人 新潟大学 | ヒトメガリンの測定方法 |
| EP2196803B1 (en) * | 2007-09-27 | 2015-07-29 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein determination, urine pretreatment method, and urinary protein determination method |
| JP5374682B2 (ja) * | 2008-03-24 | 2013-12-25 | 静岡県公立大学法人 | ストレス状態の評価方法及びストレス状態の評価試薬キット |
| WO2009132660A1 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Recepticon Aps | Agents binding to megalin or sex hormone binding globulin and compositions therof for treatment of steroid dependent cancers |
| WO2010126055A1 (ja) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | 国立大学法人新潟大学 | 腎障害の検出用マーカーとしての尿中メガリンの使用 |
| JP5424702B2 (ja) * | 2009-04-27 | 2014-02-26 | 国立大学法人 新潟大学 | 尿中ヒトメガリンを測定することを含む腎疾患検出方法 |
| KR101441163B1 (ko) * | 2010-04-05 | 2014-09-19 | 울산대학교 산학협력단 | 메갈린을 표적으로 하는 체중 조절 장애 관련 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법 |
| JP6083937B2 (ja) * | 2012-03-01 | 2017-02-22 | 国立大学法人 新潟大学 | 急性腎障害の検査方法 |
| JP6091158B2 (ja) * | 2012-10-23 | 2017-03-08 | デンカ生研株式会社 | 尿を変性剤で前処理することによる免疫測定系の感度を上げる方法 |
| CN103995130B (zh) * | 2014-05-08 | 2016-02-10 | 北京玖佳宜科技有限公司 | α1-微球蛋白检测试剂盒及其制备 |
| US20210072263A1 (en) * | 2018-01-03 | 2021-03-11 | Immundiagnostik Ag | Method of measuring the endocytic vitamin d status |
| EP3902917A4 (en) * | 2018-12-27 | 2022-11-30 | bioAffinity Technologies, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04351962A (ja) * | 1991-05-29 | 1992-12-07 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 特異結合分析方法および特異結合分析装置 |
| JPH08105889A (ja) * | 1994-10-07 | 1996-04-23 | Tomakomai Rinshiyou Kensa Center:Kk | 尿中トランスフェリン測定試薬および糖尿病合併症の早期診断方法 |
| US6946246B1 (en) * | 1997-04-08 | 2005-09-20 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Production of functional proteins: balance of shear stress and gravity |
| WO2002091955A1 (fr) | 2001-05-17 | 2002-11-21 | Kaneka Corporation | Rein artificiel presentant la fonction de metabolisme de proteine et son procede de fabrication |
| US7169559B2 (en) * | 2002-05-13 | 2007-01-30 | Fonterra Corporate Research and Development Ltd. | LDL receptor-related proteins 1 and 2 and treatment of bone or cartilage conditions |
| US6666123B1 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-23 | Raytheon Company | Method and apparatus for energy and data retention in a guided projectile |
| AU2003228052A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Pfizer Products Inc. | Methods for avoiding renal injury |
| WO2004084953A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Schering Ag | Modulators of the megalin-mediated uptake of radiotherapeutics and/or radiodiagnostics into kidney cells and their use in therapy and diagnostics |
| US7776824B2 (en) | 2004-05-06 | 2010-08-17 | The Trustees Of Columbia University | NGAL for reduction and amelioration of ischemic and nephrotoxic injuries |
| JP4351962B2 (ja) * | 2004-07-05 | 2009-10-28 | 株式会社東芝 | 露光システム及び半導体装置の製造方法 |
| JP2006089306A (ja) | 2004-09-21 | 2006-04-06 | Tokyo Yogyo Co Ltd | 高プロトン導電性ガラス及びその製造方法 |
| US20070037232A1 (en) | 2005-03-31 | 2007-02-15 | Barasch Jonathan M | Detection of NGAL in chronic renal disease |
| JP4865377B2 (ja) | 2006-03-28 | 2012-02-01 | 国立大学法人 新潟大学 | ヒトメガリンの測定方法 |
| EP2196803B1 (en) | 2007-09-27 | 2015-07-29 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein determination, urine pretreatment method, and urinary protein determination method |
| JP5424702B2 (ja) | 2009-04-27 | 2014-02-26 | 国立大学法人 新潟大学 | 尿中ヒトメガリンを測定することを含む腎疾患検出方法 |
-
2006
- 2006-03-28 JP JP2006089306A patent/JP4865377B2/ja active Active
-
2007
- 2007-03-28 EP EP07740098.4A patent/EP2006683B1/en active Active
- 2007-03-28 BR BRPI0709271A patent/BRPI0709271B8/pt active IP Right Grant
- 2007-03-28 ES ES07740098.4T patent/ES2459165T3/es active Active
- 2007-03-28 CN CN2007800194819A patent/CN101454670B/zh active Active
- 2007-03-28 AU AU2007239885A patent/AU2007239885B2/en active Active
- 2007-03-28 KR KR1020087026247A patent/KR101500756B1/ko active IP Right Grant
- 2007-03-28 US US12/293,992 patent/US7955809B2/en active Active
- 2007-03-28 RU RU2008142534/15A patent/RU2463608C2/ru active
- 2007-03-28 WO PCT/JP2007/056660 patent/WO2007119563A1/ja active Application Filing
- 2007-03-28 CA CA2647580A patent/CA2647580C/en active Active
-
2011
- 2011-04-26 US US13/093,984 patent/US8703430B2/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014181970A (ja) * | 2013-03-18 | 2014-09-29 | Jichi Medical Univ | イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0709271B1 (pt) | 2018-01-23 |
| AU2007239885A1 (en) | 2007-10-25 |
| CA2647580C (en) | 2016-05-10 |
| KR20090015030A (ko) | 2009-02-11 |
| JP2007263750A (ja) | 2007-10-11 |
| CN101454670B (zh) | 2012-10-03 |
| EP2006683B1 (en) | 2014-01-29 |
| ES2459165T3 (es) | 2014-05-08 |
| BRPI0709271A2 (pt) | 2011-06-28 |
| RU2008142534A (ru) | 2010-05-10 |
| WO2007119563A1 (ja) | 2007-10-25 |
| BRPI0709271B8 (pt) | 2021-05-25 |
| EP2006683A4 (en) | 2009-09-23 |
| CN101454670A (zh) | 2009-06-10 |
| KR101500756B1 (ko) | 2015-03-09 |
| CA2647580A1 (en) | 2007-10-25 |
| RU2463608C2 (ru) | 2012-10-10 |
| EP2006683A1 (en) | 2008-12-24 |
| US7955809B2 (en) | 2011-06-07 |
| AU2007239885B2 (en) | 2013-10-03 |
| US20090117594A1 (en) | 2009-05-07 |
| US20110195523A1 (en) | 2011-08-11 |
| US8703430B2 (en) | 2014-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4865377B2 (ja) | ヒトメガリンの測定方法 | |
| US8663931B2 (en) | Method for detecting renal disease comprising measuring human megalin in urine | |
| US8628930B2 (en) | Use of megalin in urine as marker for detecting renal disorder | |
| AU2010279302B2 (en) | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure | |
| EP3132269B1 (en) | Diagnosis of chronic kidney disease by quantitative analysis of post-translational modifications of plasma proteins | |
| JP5861870B2 (ja) | 終末期腎不全の検出方法 | |
| JP5777149B2 (ja) | 糸球体濾過膜の異常に関連した疾患の検査方法、およびこれに使用するための検査用キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081023 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111006 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111101 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111110 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141118 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4865377 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |