ES2459165T3 - Método de determinación de megalina humana - Google Patents

Abstract

Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando un primer ligando que puede unirse a megalina humana y que se une a un soporte sólido y un segundo ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho primer ligando, permitir que la muestra reaccione con dicho segundo ligando y medir el segundo ligando que se une a dicho soporte sólido mediante formación de un complejo con megalina humana en la muestra y dicho primer ligando.

Description

Método de determinación de megalina humana

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar nefropatía midiendo megalina humana. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para detectar megalina humana que comprende detectar cuantitativamente megalina que se expresa de manera tópica y específicamente en células, tejidos y órganos donde se observa expresión de megalina de manera rápida y sencilla, para de ese modo permitir el diagnóstico temprano y directo del grado en el que células, tejidos y órganos están afectados y mejorar y evitar el empeoramiento de las condiciones de trastornos y el pronóstico mediante tratamiento. La presente invención puede aplicarse a diagnóstico de nefropatía.

Técnica anterior

1.

Clonación de megalina

Como resultado de una búsqueda de un antígeno etiológico de nefritis de Heymann, que es un modelo para nefropatía membranosa experimental, Kerjaschki, D. y Farquhar, M.G. identificaron una proteína de membrana celular, gp330, en 1982 (Kerjaschki D., Farquhar M.G., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 5557-5561). En 1994, Saito, A. et al. determinaron la estructura primaria completa de una gp330 de rata y la designaron como megalina, porque era la mayor proteína clonada de membrana celular de un vertebrado (Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729).

2.

Sitio de expresión de megalina

La megalina también se conoce como glicoproteína 330 (gp330) o proteína 2 relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL) (LRP-2). Es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 600 kDa, que se expresa en células epiteliales del túbulo proximal de riñón, en otros tejidos y células, tales como células alveolares de tipo II, tejido espermático, endometrio uterino, placenta o epitelio del oído interno, epitelio renal, germo-vitelario y ectodermo neural (véase Christensen E. I., Willnow, T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 22242236; Juhlin C., Klareskog L. et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 8275-8279; y Zheng G, McCluskey R. T. et al., 1994, J. Histochem. Cytochem. 42, 531-542). En el riñón, la megalina funciona como receptor de endocitosis asociado con endocitosis y reabsorción de proteínas y similares en el túbulo proximal antes de la excreción urinaria. Las proteínas reabsorbidas y similares se degradan entonces por lisosomas (véase Mausbach A. B., Christensen E. I., 1992, Handbook of Physiology: Renal Physiology, Windhager, editor, Nueva York, Oxford University Press, 42-207).

3.

Secuencia de nucleótidos de megalina

La megalina es una glicoproteína que es la que se expresa de manera más frecuente en la membrana epitelial del túbulo proximal de riñón de un animal mamífero. La secuencia codificante de ADNc de la misma tiene identidad de nucleótidos con la secuencia de ADNc de megalina humana que tiene el número de registro génico U04441 dado a conocer en Korenberg, J. R. et al. (1994) o la secuencia de ADNc de megalina humana que tiene el número de registro génico U33837 dado a conocer en Hjaeln, G., et al. (1996) (véase Korenberg J. R. et al., 1994, Genomics 22, 88-93; y Hjalm G. et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239, 132-137).

Además, se ha descubierto megalina de rata que tiene homología con megalina humana por Saito et al. (1994) y la secuencia de ADNc de la misma que tiene número de registro génico L34049 ya se ha dado a conocer (véase Saito

A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729).

4. Secuencia de aminoácidos y estructura proteica de megalina

La megalina es una proteína gigante de membrana celular que consiste en 4.655 aminoácidos (en el caso de la megalina humana) y en 4.660 aminoácidos (en el caso de la megalina de rata). El peso molecular deducido basándose en la secuencia de aminoácidos es aproximadamente 520 kDa y puede ser de hasta aproximadamente 600 kDa, cuando incluye una cadena de azúcar (véase Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 97259729). La megalina pertenece a la familia génica del receptor de LDL, teniendo una región extracelular gigante de la misma cuatro dominios funcionales y estando conectada la región extracelular a una región intracelular delgada a través de una región transmembrana individual. La megalina está principalmente presente en un hueco recubierto de clatrina en el glomérulo (rata) o la membrana luminal epitelial (membrana basal y luminal en la célula epitelial glomerular) del túbulo proximal, célula alveolar de tipo II, glándulas epididimales, glándulas tiroideas, glándulas tiroideas accesorias, membrana del saco vitelino, oído interno, intestino delgado o corioides, y se está asociada con la captación de diversos ligandos en las células y el metabolismo de las mismas (véase Farquhar M. G. et al., 1995,

J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; y Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). Proteinuria de bajo peso molecular, trastornos del metabolismo óseo, insuficiencia respiratoria, malformación del cerebro, y otros

trastornos se producen en ratones deficientes en megalina (véase Willnow T. E. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8460-8464). Un homólogo de megalina está también presente en nematodos (C. elegans) y se ha sugerido la importancia biológica de la misma (véase Yochem J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 45724576).

Norden et al., 2002, describen la deficiencia en megalina urinaria en pacientes con enfermedad de Dent y síndrome de Lowe pero no síndrome de Fanconi idiopático dominante autosómico. Se analizaron muestras urinarias mediante electroforesis en gel/inmunotransferencia.

5. Importancia de megalina como causa de nefritis

La megalina, que es un antígeno etiológico principal de nefropatía membranosa experimental (nefritis de Heymann), es un receptor eliminador epitelial y se han dilucidado papeles patológicos y biológicos de la misma. Se han usado modelos animales durante mucho tiempo para dilucidar el mecanismo de desarrollo de la nefropatía membranosa humana y la nefritis de Heymann en ratas es un modelo de nefropatía membranosa. El análisis de la nefritis de Heymann ha sido más avanzado que el de cualquier otro modelo. Saito A. et al. dieron a conocer los resultados del análisis del epítopo patológico y el dominio de unión a ligando de la nefritis de Heymann y también han demostrado la región antigénica principal de megalina y un dominio funcional de megalina que contribuye principalmente a la unión a un ligando (véase Kerjaschki D. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 11179-11183; Saito A., Farquhar M. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8601-8605; Yamazaki H., Farquhar M. G. et al., 1998,

J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1638-1644; y Orlando R. A., Farquhar M. G. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 2368-2373).

6. Diversos ligandos de megalina

La megalina se expresa de manera más abundante en el lado luminal de las células epiteliales del túbulo proximal in vivo. En el riñón humano, no se observa expresión de megalina en sitios distintos de las células epiteliales del túbulo proximal, incluyendo en los glomérulos. La megalina incorpora diversos ligandos (por ejemplo, fármacos o una proteína de bajo peso molecular) que se filtran por los glomérulos al interior de células mediante endocitosis, la megalina los transporta a lisosomas y reaparecen en la superficie celular mediante recirculación (véase Farquhar M.

G. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; y Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). Además, la megalina está asociada con transcitosis desde el lado luminal hasta el lado de membrana basal. La megalina también está asociada con la captación y el metabolismo de proteínas de unión, tales como vitaminas A, B12 y D (véase Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). Christensen y Willnow demostraron que la megalina media la reabsorción de tres proteínas portadoras de vitaminas, proteínas de unión a vitamina D (DBP), proteína de unión a retinol (RBP) y transcobalamina (TC) y vitaminas asociadas con las mismas; es decir, vitamina 25D3 (OH), vitamina A (retinol) y vitamina B12 (véase Christensen E. I., Willnow T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236). Saito A. et al. demostraron que la leptina, que se secreta a partir de adipocitos y aumenta en la sangre de pacientes obesos, se incorpora en y se metaboliza por las células epiteliales del túbulo proximal como el ligando de megalina (véase Saito A., Gejyo F. et al., 2004, Endocrinology. 145, 3935-3940). Los adipocitos, es decir, grasas viscerales acumuladas, dan como resultado estados patológicos combinados, es decir, síndrome metabólico. La leptina, que es una adipocitocina secretada a partir de adipocitos, aumenta en la sangre de un paciente con síndrome metabólico. Se sugiere que el riñón es el órgano en el que es más probable que se acumule la leptina en la sangre y que la leptina desempeña un papel nefropático (véase Tarzi R. M. Lord G. M. et al., 2004, Am. J. Pathol. 164, 385-390). También se encuentra un denominado receptor de leptina en una región entre el túbulo proximal y el túbulo colector ubicado posteriormente a la región de funcionamiento de la megalina.

El término “síndrome metabólico” se define como una complicación patológica de obesidad visceral, tensión arterial elevada, hiperlipidemia, tolerancia a glucosa afectada y otros síntomas, cuyo factor de riesgo principal es la resistencia a insulina. Es altamente probable que tales estados conduzcan a desarrollo de enfermedades arterioescleróticas y proteinuria, y pueden dar como resultado el desarrollo de nefropatía con hipertrofia tubular renal y del glomérulo como características histológicas. Cuando un caso de este tipo se combina con diabetes evidente, se desarrolla además la característica de hiperglucemia, se manifiesta nefropatía diabética y los estados patológicos pueden además volverse graves. La diabetes tipo II viene básicamente precedida por o se desarrolla simultáneamente con síndrome metabólico. Por consiguiente, la característica de nefropatía podría incluirse como nefropatía asociada con síndrome metabólico.

Saito A. et al. han realizado un experimento usando células derivadas de epitelio de saco vitelino de rata (células L2) en las que se expresa megalina en niveles altos y han encontrado que la incorporación de AGE (productos finales de glicación avanzada) marcado con 125I (derivado de glucosa) en células L2 estaría significativamente inhibida por un anticuerpo anti-megalina. Por tanto, demostraron que la megalina está asociada con una ruta para tal incorporación (véase Saito A. Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 1123-1131). Como mecanismo de desarrollo de nefropatía diabética, se ha señalado la asociación de productos finales de glicación avanzada (AGE) con proteínas glicadas y modificadas mediante la reacción de Maillard. Un AGE de bajo peso molecular en la sangre se filtra por los glomérulos y se reabsorbe y metaboliza por las células epiteliales del túbulo proximal. Si la nefropatía avanza adicionalmente, también se filtra un AGE de peso molecular superior por los glomérulos, se acumula en las células

epiteliales del túbulo proximal e impone cargas metabólicas excesivas. Además, Saito A. et al. también demuestran que la megalina también está asociada con la incorporación de AGE derivado de metilglioxal, gliceraldehído o glicolaldehído en células, además de glucosa. Además, el síndrome metabólico a menudo se complica con hepatopatía, tal como hígado graso. Las proteínas de unión a ácidos grasos de tipo hepático (L-FABP) que están presentes de manera abundante en el hígado se liberan a la sangre de una persona sana. En caso de hepatopatía, se libera más L-FABP y aumenta en la sangre. Saito A. et al. también han demostrado que L-FABP en la sangre se filtra rápidamente por los glomérulos y se reabsorbe por las células epiteliales del túbulo proximal a través de la megalina (véase Takeda T., Gejyo F., Saito A. et al., 2005, Lab. Invest. 85, 522-531).

7. Proteína funcional que interacciona con megalina

Con el fin de dilucidar el mecanismo del transporte de megalina en las células, se buscan moléculas adaptadoras que se unen a dominios intracelulares de megalina y se han identificado diversas proteínas, tales como Dab2, ANKRA, MAGI-1, GAIP, GIPC, Galphai3, MegBP y ARH (véase Oleinikov A. V. et al., 2000, Biochem. J. 347, 613621; Rader K., Farquhar M.G. et al., 2000, J. Am. Soc. Nephrol. 11, 2167-2178; Patrie K. M., Margolis B. et al., 2001,

J. Am. Soc. Nephrol. 12, 667-677; Lou X., Farquhar M.G. et al., 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 918-927; Petersen H.H., Willnow T. E., 2003, J. Cell. Sci. 116, 453-461; y Takeda T., Farquhar M.G. et al., 2003, Mol. Biol. Cell. 14, 4984-4996). A través de tales moléculas, la megalina está asociada con endocitosis o transcitosis, y la megalina está asociada también con transmisión de señales relacionada con la misma. Además, la megalina funciona de manera conjugada con un receptor de membrana celular, es decir, cubilina, en las células epiteliales del túbulo proximal, de manera que además está implicada en la incorporación de diversos ligandos en células (véase Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729). Por ejemplo, la cubilina es un receptor que se une directamente a transferrina, albúmina, vitamina endógena B12 o similares, y la megalina está implicada indirectamente en la endocitosis de las mismas. Además, se sabe que la megalina interacciona con la isoforma 3 del intercambiador de Na+-H+ (NHE3) en las células epiteliales del túbulo proximal (véase Biemesderfer D. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 17518-17524). NHE3 es un antiportador que desempeña un papel importante en la reabsorción de Na+, y NHE3 también influye en la incorporación de un ligando por megalina (véase Hryciw D. H. et al., 2004, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 372-379). Además, la megalina puede estar implicada en la inactivación y el metabolismo de NHE3. En una fase temprana de nefropatía diabética o nefropatía relacionada con síndrome metabólico, la filtración glomerular se vuelve excesiva. Se deduce que la reabsorción potenciada de Na+ del túbulo proximal es una causa principal (véase Vallon V. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 530-537), NHE3 desempeña un papel clave en tal caso y se considera que la inactivación y el metabolismo de MHE3 por megalina están implicados en ello (véase Hryciw D. H. et al., 2004, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 372-379).

8.

Correlación de la excreción urinaria de megalina y la excreción urinaria de ligando por megalina

Leheste et al. dan a conocer que ratones deficientes en megalina y pacientes con síndrome de Fanconi con funciones del túbulo proximal debilitadas experimentarían excreción incrementada de proteínas y retinol en la orina (véase Leheste J. et al., 1999, Am. J. Pathol. 155, 1361-1370). Además, Moestrup S. K. et al. demostraron que la cantidad de megalina excretada en orina de pacientes de síndrome de Fanconi es significativamente inferior que la excretada por individuos sanos. Esto produce deterioro de las funciones de megalina y expresión en el túbulo proximal y por consiguiente aumenta la cantidad de proteínas filtradas por el glomérulo que contienen proteínas de unión a retinol excretadas en orina (véase Anthony G. W., Moestrup S.K. et al., 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 125133).

9.

Importancia de la función de megalina hallada mediante experimentos usando modelos para uremia y modelos para regeneración de órganos

Tal como se describió anteriormente, la megalina está implicada en la captación de diversas proteínas de bajo peso molecular en las células epiteliales del túbulo proximal y en el metabolismo de las mismas. Cuando el estado patológico avanza hacia insuficiencia renal, el mecanismo del metabolismo se ve alterado y se acumulan por consiguiente proteínas de bajo peso molecular en la sangre y los tejidos como proteínas urémicas. Un ejemplo representativo de las mismas es !2-microglobulina (!2-m), que puede producir amiloidosis relacionada con diálisis en un paciente sometido a diálisis a largo plazo (véase Gejyo F., Schmid K. et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 701-706). También se sugiere que el AGE mencionado anteriormente es una causa de arteriosclerosis o insuficiencia orgánica debido a su acumulación en la sangre de pacientes con insuficiencia renal o diálisis, y se considera AGE un tipo de proteína urémica (véase Henle T., Miyata T., 2003, Adv. Ren. Replace Ther. 10, 321-331). Además, la leptina se acumula en la sangre de un paciente de diálisis y por tanto se considera que está implicada en malnutrición o inmunidad comprometida. Tabata Y. y Gejyo F. et al. dan a conocer los efectos y la eficacia de modelos para metabolizar la proteína urémica usando funciones de megalina (véase Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032 y documento WO 02/091955). Es decir, se trasplantan células que expresan megalina como proteínas de soporte in vivo y se incorporan proteínas de bajo peso molecular filtradas de vasos sanguíneos periféricos (vasos sanguíneos de nueva formación) en las células con la ayuda de megalina para la metabolización. Las células que expresan megalina usadas para el trasplante (es decir, células L2 derivadas del epitelio de saco vitelino) se incorporan y metabolizan !2-m con la ayuda de megalina (véase Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032). Se extirparon ambos riñones de un ratón

atímico en el que se habían trasplantado células L2 de manera subcutánea, se indujo el estado de insuficiencia renal y se midió la incorporación de células en la masa tisular en la que se había trasplantado !2-m marcada con 125Iy en los órganos mediante inyección intraperitoneal. Como resultado, se encontró que la masa celular en la que se habían trasplantado células L2 incorporaba de manera más significativa !2-m marcada con 125I en comparación con otros órganos, y se encontró que el aclaramiento de !2-m marcada con 125I avanzaba significativamente en un grupo al que se habían trasplantado células L2, en comparación con un grupo control en el que no se habían trasplantado células L2 (véase Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032).

10. Proteólisis y excreción urinaria de megalina

En los últimos años, se ha sugerido la posibilidad de que la megalina se someta a proteólisis en una ruta de señalización de tipo Notch (véase Zou Z., Biemesderfer D. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 34302-34310; y Grigorenko A. P. et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 14955-14960). Esto también incluye un sistema de escisión de dos etapas de pérdida de un ectodominio mediada por metaloproteasa y proteólisis intramembrana mediada por gamma-secretasa.

También, se sabe que la megalina se expresa en la célula alveolar de tipo II.

Por tanto, se ha estudiado ampliamente la megalina con respecto a su correlación con el metabolismo en órganos tales como el riñón. Sin embargo, la correlación entre enfermedades de órganos, incluyendo el riñón y megalina aún no se ha dilucidado y aún no se ha estudiado la expresión de megalina o la excreción de la misma al fluido corporal en relación con una variedad de enfermedades de órganos.

Hasta la fecha, se ha conocido un método que implica tinción tisular o inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo policlonal obtenido mediante inmunización de un animal inmune, tal como un conejo, como método para detectar megalina.

Esta técnica, sin embargo, implica tinción de una célula o una proteína separada a través de electroforesis y esto necesita procedimientos muy complicados y un largo periodo de tiempo para inmovilizar tejidos, preparar cortes de tejido, electroforesis y transferencia sobre la membrana. Por tanto, la megalina es difícil de cuantificar.

Desde el punto de vista del diagnóstico de los grados de trastornos funcionales de tejidos u órganos, particularmente en el caso de trastornos de riñón, no hay medios eficaces para diagnosticar la insuficiencia del túbulo renal de una manera sencilla y específica. Actualmente, se han empleado muchos métodos de diagnóstico que detectan albúmina, creatinina, !2-microglobulina, L-FABP o similares en orina o sangre como marcador de diagnóstico para enfermedades renales. Tales marcadores de diagnóstico, sin embargo, no se derivan de tejido renal y simplemente resultan de todos los fenómenos y funciones durante la filtración en los glomérulos renales y la reabsorción en los túbulos renales. Es decir, es difícil identificar insuficiencia del glomérulo e insuficiencia del túbulo renal, insuficiencia en el riñón incluso con el uso de tal marcador. Además, un marcador de este tipo es un marcador indirecto derivado de órganos distintos del riñón. Por tanto, la eficacia es escasa para el diagnóstico temprano de una enfermedad. Esto mismo se aplica a KL-6 (marcadores de inflamación aguda) que es un marcador de diagnóstico existente para enfermedades pulmonares y particularmente para inflamación.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar nefropatía midiendo megalina humana que puede realizarse de una manera más sencilla y en un periodo de tiempo más corto de lo que es posible con técnicas convencionales y que también puede cuantificar la megalina humana. Este método permite el diagnóstico de nefropatía. En particular, la presente invención proporciona un método de medición de los niveles de megalina en orina para detectar nefropatía.

Tal como se describió anteriormente, se han elaborado muchos informes en referencia a megalina humana y se ha sugerido la correlación de la misma con el metabolismo de órganos tales como el riñón o el pulmón. Sin embargo, cuando están afectadas las funciones orgánicas, se desconoce la forma en que varía la expresión de megalina y la forma en que cambia la prevalencia de megalina.

Los presentes inventores han realizado estudios intensos y continuados en cuanto a un método para medir megalina humana con alta sensibilidad de manera rápida. Por consiguiente, descubrieron un método para medir de manera precisa megalina en una muestra de fluido corporal, tal como orina, usando un ligando que puede unirse a megalina humana, y en particular, un anticuerpo anti-megalina humana.

Además, los presentes inventores midieron megalina humana en el fluido corporal de un paciente con funciones orgánicas afectadas y descubrieron que la megalina humana podría ser un marcador para detectar y diagnosticar nefropatía. Esto ha conducido a la conclusión de la presente invención.

Específicamente, la presente invención es tal como se describe en las reivindicaciones.

Efectos de la invención

El método de la presente invención permite la medición de megalina humana en una muestra, tal como orina, con alta sensibilidad y precisión. Cuando las funciones de células, tejidos u órganos que expresan megalina están dañadas, la megalina escapa de las células y se acumula en una muestra. Específicamente, la medición de megalina humana en una muestra permite la detección y el diagnóstico directos de nefropatía en lugar de la detección y el diagnóstico indirectos. Por consiguiente, la medición de megalina humana en una muestra mediante el método de la presente invención permite la detección de nefropatía en una fase temprana con alta precisión.

Esta descripción incluye parte o todo el contenido tal como se da a conocer en la descripción y/o los dibujos de la solicitud de patente japonesa n.º 2006-089306, que es un documento de prioridad de la presente solicitud.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un locus génico y una estructura proteica general de megalina humana.

La figura 2 muestra una curva de calibración de ELISA para detectar megalina humana con el uso de megalina humana patrón.

La figura 3 muestra los resultados clínicos de megalina humana en orina (parte 1).

La figura 4 muestra los resultados clínicos de megalina humana en orina (parte 2).

Mejores modos para llevar a cabo la invención

La presente invención se refiere a un método para medir megalina humana en una muestra. La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de nucleótidos de megalina humana y la SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de megalina humana.

En la presente invención, la megalina humana se mide usando un primer ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido. Puede usarse cualquier soporte sólido usado en inmunoanálisis convencional. Por ejemplo, pueden usarse preferiblemente pocillos de una placa de microtitulación de plástico o partículas magnéticas.

Un ejemplo de un ligando que puede unirse a megalina humana es un anticuerpo anti-megalina humana y puede usarse un anticuerpo monoclonal o policlonal.

Además, puede usarse lectina que es específica para una cadena de azúcar de la megalina humana como ligando que puede unirse a megalina humana. Los ejemplos de lectina incluyen, pero no se limitan a, concanavalina A, lectina de germen de trigo (WGA), lectina de Ricinus communis (RCA) y lectina de lenteja (LCA).

Además, los ejemplos de un ligando que puede unirse a megalina humana incluyen sustancias seleccionadas del grupo que consiste en: proteínas de unión a vitaminas, tales como transcobalamina-vitamina B12, proteína de unión a vitamina D o proteína de unión a retinol; lipoproteínas, tales como apolipoproteína B, apolipoproteína E, apolipoproteína J/clusterina o apolipoproteína H; hormonas, tales como hormona paratiroidea (PTH), insulina, factor de crecimiento epitelial (EGF), prolactina, leptina o tiroglobulina, un receptor de cualquiera de las mismas o un receptor de tales hormonas; proteínas asociadas a respuesta al estrés o inmunitaria, tales como cadena ligera de inmunoglobulina, PAP-1, o !2-microglobulina; enzimas, tales como PAI-I, PAI-I-urocinasa, PAI-I-tPA, prourocinasa, lipoproteína lipasa, plasminógeno, ∀-amilasa, !-amilasa, ∀1-microglobulina o lisozima, un inhibidor de cualquiera de las mismas o un inhibidor de tales enzimas; fármacos o toxinas, tales como aminoglucósido, polimixina B, aprotinina

o tricosantina; proteínas portadoras, tales como albúmina, lactoferrina, hemoglobina, proteína de unión a moléculas odorantes, transtiretina o L-FABP; y proteínas asociadas a receptores (RAP), tales como citocromo-c, calcio (Ca2+), productos finales de glicación avanzada (AGE), cubilina o isoforma 3 del intercambiador de Na+-H+ (NHE3) o fragmentos de unión de tales sustancias. El término “fragmento de unión” usado en el presente documento se refiere a un fragmento de la sustancia mencionada anteriormente que incluye un sitio que se une a megalina humana.

Un ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, puede unirse a un soporte sólido mediante una técnica bien conocida en la técnica. Cuando un ligando va a unirse a pocillos de placa de microtitulación, por ejemplo, se aplican aproximadamente de 3 a 10 #g/ml (de manera preferible aproximadamente 5 #g/ml) de una disolución de un ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo, a un soporte sólido y entonces se permite que el producto resultante repose a 4ºC durante la noche (preferiblemente 12 horas o más). La densidad recomendada de un soporte sólido mencionado anteriormente se determinó teóricamente cuando se inmovilizó un anticuerpo de longitud completa.

La densidad se determina mediante las fórmulas teóricas:

Q: densidad de peso molecular (ng/cm2)

MW: peso molecular (dalton: Da)

N: número de Avogadro = 6·1023 (mol-1)

r: radio de Stokes de molecular = (R·T20) / (6·∃·%20·D20·N) (cm)

R: constante de gas = 8,3·107 (g·cm2·s-2·ºK-1·mol-1)

T20: temperatura ambiente (20ºC) = 293ºK

-

1)

η20: viscosidad de agua a 20ºC = 1·10-2 (g·cm-1·s

-

1)

D20: coef. de dif. de ref. molecular con respecto al agua a 20ºC (cm2·s

Tal valor se aplica cuando la inmovilización es a través de adsorción física. Cuando se inmoviliza un ligando que puede unirse a megalina humana, se determina la densidad teórica del soporte sólido relevante y tal densidad está afectada por los factores de variación mencionados anteriormente, tales como el peso molecular individual. Por tanto, la densidad varía dependiendo del tipo de molécula del soporte sólido individual, de la configuración de la fase sólida o de otras condiciones. Por consiguiente, la densidad no se limita a los valores mencionados anteriormente. Cuando se absorbe sobre un soporte sólido mediante unión covalente, además, tal densidad se utiliza en la presente invención. En tal caso, también se tiene en cuenta el número de grupos funcionales que están presentes sobre la superficie de adsorción y que se usan para la unión covalente. La densidad de un soporte sólido no está limitada. Tras la unión, se lleva a cabo el bloqueo usando albúmina sérica bovina (abreviada a continuación en el presente documento como “BSA”) o caseína, para el fin de bloquear sitios de adsorción no específicos de una proteína, basándose en una técnica convencional. Cuando un soporte sólido es una perla magnética, el soporte sólido se trata de la misma manera que en el caso de una placa de microtitulación.

Se permite que un ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido reaccione con una muestra y la megalina humana en una muestra se une a un soporte sólido con la ayuda del ligando que puede unirse a megalina humana unido al soporte sólido mediante una reacción de unión ligando-receptor, tal como una reacción antígeno-anticuerpo. Específicamente, se forma un complejo de un primer ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido y megalina humana. Puede usarse cualquier muestra, siempre que contenga megalina humana. Los ejemplos de muestra incluyen orina, un lavado alveolar, sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo y un condensado de aire exhalado. Una reacción antígeno-anticuerpo de este tipo puede llevarse a cabo a de 4ºC a 45ºC, más preferiblemente de 20ºC a 40ºC, y preferiblemente de manera adicional de 25ºC a 38ºC. La duración de la reacción es de aproximadamente 10 minutos a 18 horas, más preferiblemente de 10 minutos a 1 hora y preferiblemente de manera adicional de 30 minutos a 1 hora.

Tras el lavado, se permite entonces que el segundo ligando que puede unirse a megalina humana reaccione con la megalina humana en una muestra unida a un soporte sólido. Específicamente, se forma un complejo de un primer ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido, megalina humana y un segundo ligando que puede unirse a megalina humana. Como segundo ligando que puede unirse a megalina humana, puede usarse la misma sustancia usada como primer ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana. Sin embargo, cuando tanto el primer ligando que puede unirse a megalina humana como el segundo ligando que puede unirse a megalina humana son anticuerpos monoclonales anti-megalina humana, es necesario que un epítopo reconocido por y al que se une el primer anticuerpo anti-megalina humana sea diferente de un epítopo reconocido por y al que se une el segundo antimegalina humana. Una combinación del primer anticuerpo anti-megalina humana y el segundo anticuerpo antimegalina humana puede ser cualquier combinación de un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal, un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal, y un anticuerpo policlonal y un anticuerpo policlonal. La reacción puede llevarse a cabo a de 4ºC a 45ºC, más preferiblemente de 20ºC a 40ºC y preferiblemente de manera adicional de 25ºC a 38ºC. La duración de la reacción es de aproximadamente 10 minutos a 18 horas, más preferiblemente de 10 minutos a 1 hora y preferiblemente de manera adicional de 30 minutos a 1 hora. Por tanto, el segundo ligando que puede unirse a megalina humana se une a un soporte sólido con la ayuda de megalina humana y el primer ligando que puede unirse a megalina humana.

Tras el lavado, se mide entonces el segundo ligando que puede unirse a megalina humana, tal como el segundo anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido. Esto puede llevarse a cabo mediante una variedad de

técnicas que se emplean comúnmente en el campo del inmunoanálisis. Por ejemplo, el segundo ligando que puede unirse a megalina humana se marca con una enzima, fluorescencia, biotina o marcador de radiación para preparar una sustancia marcada con enzima. Al someter a ensayo un marcador de este tipo, puede medirse el segundo ligando que puede unirse a megalina humana unida a un soporte sólido. El marcaje con una enzima o fluorescencia es particularmente preferible. Los ejemplos de enzima incluyen peroxidasa, fosfatasa alcalina, !-galactosidasa y glucosa oxidasa, y un ejemplo de fluorescencia es isotiocianato de fluoresceína (FITC), aunque los marcadores no se limitan a los mismos. Un marcador puede detectarse permitiendo que un sustrato relevante reaccione con una sustancia marcada con enzima, y luego midiendo el colorante, fluorescencia, emisión resultantes, o similares. Cuando el segundo ligando que puede unirse a megalina humana no está marcado, se permite que un tercer anticuerpo marcado reaccione con el segundo ligando que puede unirse a megalina humana, y el tercer anticuerpo puede medirse basándose en tal marcaje. Por tanto, puede medirse el segundo ligando que puede unirse a megalina humana.

Un soporte sólido o un anticuerpo anti-megalina humana usado para marcaje puede ser un fragmento de inmunoglobulina, tal como Fab o F(ab’)2, específico para megalina humana o un anticuerpo recombinante, tal como scFv, dsFv, diacuerpo o minicuerpo, expresado como recombinante. En la presente invención, el término “anticuerpo” también se refiere a un fragmento específico para megalina humana. Un método para preparar un fragmento de este tipo se conoce bien en la técnica.

El método mencionado anteriormente comprende las dos etapas de la reacción entre un primer ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido y una muestra, seguido por lavado, y la reacción de un segundo ligando que puede unirse a megalina humana con una muestra. Alternativamente, un método que comprende una única etapa en el que la reacción entre un primer ligando que puede unirse a megalina humana, tal como un anticuerpo anti-megalina humana, unido a un soporte sólido y una muestra se lleva a cabo simultáneamente con la reacción entre un segundo ligando que puede unirse a megalina humana y una muestra.

La presente invención comprende además un método para medir megalina humana en una muestra usando megalina humana o un fragmento parcial de megalina humana que se une a un soporte sólido y un ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que una muestra reaccione con un ligando que puede unirse a megalina humana, permitir que el producto de reacción reaccione con la megalina humana que se une a un soporte sólido, medir el ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido y cuantificar competitivamente la megalina humana en una muestra basándose en una disminución en un porcentaje del ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido. Este método requiere la unión de megalina humana a un soporte sólido, y tal unión puede llevarse a cabo según el método para unir una sustancia a un soporte sólido. Además, un fragmento parcial de megalina humana no está limitado y puede usarse un fragmento parcial de megalina humana al que se une un ligando que puede unirse a megalina humana. Como fragmento parcial de megalina humana, puede prepararse una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos de megalina humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2 mediante síntesis química o ingeniería genética. Puede usarse el ligando mencionado anteriormente que puede unirse a megalina humana y es particularmente preferible un anticuerpo anti-megalina humana. En un método competitivo, es importante la cantidad de megalina humana o un fragmento parcial de megalina humana que se une a un soporte sólido y un ligando que puede unirse a megalina humana que va a usarse. Un método competitivo es una técnica conocida y tal cantidad puede determinarse de manera adecuada basándose en una técnica conocida.

Además, la presente invención comprende un método para medir megalina humana usando un ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que una muestra reaccione con un ligando que puede unirse a megalina humana que se une a una partícula para inducir aglutinación y medir la megalina humana basándose en el grado de aglutinación resultante.

Los ejemplos de partículas que se usan en un método de este tipo incluyen partículas que tienen diámetros de 0,05 a 10 #m, preferiblemente partículas de látex que tienen diámetros de 0,1 a 0,4 #m, partículas de gelatina que tienen diámetros de 0,5 a 10 #m y eritrocitos animales. Un anticuerpo puede unirse a una partícula mediante un método bien conocido en la técnica, tal como adsorción física o unión covalente.

En este método, se mezclan partículas que comprenden anticuerpos anti-megalina humana unidos a las mismas con una muestra sobre, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio negro, y se observan las partículas precipitadas como resultado de la aglutinación. Por tanto, puede detectarse la megalina humana en una muestra. También, puede medirse la absorción del aglutinado para cuantificar la megalina humana. Además, también puede detectarse la megalina humana mediante inmunoensayo por pulsos.

El método para medir megalina humana de la presente invención permite la medición no sólo de la megalina humana intacta sino también de fragmentos de megalina humana.

Mediante la medición de la megalina humana en una muestra, puede evaluarse, detectarse o diagnosticarse si un sujeto del que se ha obtenido una muestra tiene o no nefropatía.

En enfermedades renales, puede detectarse particularmente nefritis o trastorno tubular renal. Además, puede detectarse adecuadamente nefropatía diabética. Además, tales células, tejidos u órganos pueden usarse también para detectar síndrome metabólico o nefropatía asociada a síndrome metabólico.

En el sujeto mencionado anteriormente que tiene trastornos funcionales de células, tejidos u órganos, la megalina humana escapa de las células y aumenta la cantidad de megalina humana en una muestra. Cuando la megalina humana en una muestra obtenida del sujeto se mide in vitro y la concentración de megalina humana en una muestra está significativamente potenciada en comparación con la concentración de megalina humana obtenida de un individuo sano, puede diagnosticarse que el sujeto tiene una nefropatía.

Tal como se describió anteriormente, puede usarse orina como muestra.

Además, la medición de megalina humana en una muestra obtenida de un sujeto permite la evaluación del riesgo de estar aquejado de nefropatía. Cuando la megalina humana en una muestra obtenida del sujeto se mide in vitro y la concentración de megalina humana en una muestra está significativamente potenciada en comparación con la concentración de megalina humana obtenida de un individuo sano, puede evaluarse que el sujeto tiene probabilidad elevada de estar aquejado de nefropatía. Es decir, la medición de megalina humana en una muestra permite examinar sujetos que tienen probabilidad elevada de estar aquejados de nefropatía tal como futuros pacientes con nefropatía y proporcionar el tratamiento adecuado.

Además, la medición periódica de megalina humana en una muestra obtenida del sujeto y la monitorización de la concentración de megalina humana permiten la gestión de las funciones orgánicas.

Además, cuando se detecta o diagnostica, pueden medirse fragmentos de megalina humana, así como megalina humana intacta.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, la presente invención se describe en mayor detalle con referencia a los ejemplos, aunque la presente invención no se limita a esos ejemplos. Debe observarse que el método de ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) usado en los ejemplos se ha notificado hasta ahora por muchos investigadores, desde que Engvall E. y Perlmann P. presentaron el primer informe en 1971. Hay bases sólidas para usar esta técnica (Engvall E, Perlmann P., 1971, Immunochemistry, 8, 871-874).

A continuación en el presente documento, la presente invención se describe en mayor detalle con referencia a los ejemplos, aunque la presente invención no se limita a esos ejemplos.

Detección de megalina humana en orina mediante ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA)

(1) Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón anti-megalina humana

Se inmunizó un ratón por vía intraperitoneal con 50 #g de megalina humana con un adyuvante varias veces y se confirmó el elevado título en sangre sérica. Se extrajo el bazo 3 días después de una dosis de refuerzo (inmunización intravenosa) y se obtuvieron células del bazo. Se fusionaron las células del bazo con células de mieloma de ratón (10:1) en presencia de polietilenglicol 3500 para preparar células de hibridoma. Las células resultantes se cultivaron durante una semana en presencia de CO2 a 37ºC y se inspeccionó la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-megalina humana en el sobrenadante de cultivo. Se diluyeron las células en los pocillos positivos en los que se observó producción de anticuerpos mediante dilución limitativa, se cultivaron los productos resultantes durante 2 semanas y se inspeccionó la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-megalina humana en el sobrenadante de cultivo de la misma manera. Después, se diluyeron las células en los pocillos positivos en los que se observó producción de anticuerpos mediante dilución limitante, y se cultivaron los productos resultantes de la misma manera. En esta fase, se cultivaron las células en las que se habían producido anticuerpos anti-megalina humana en un matraz, se suspendió parte de las mismas en suero de ternero fetal (FCS) que contenía dimetilsulfóxido al 10% (DMSO) (5x106 células/ml) y se almacenó el producto resultante en nitrógeno líquido.

Posteriormente, se usaron los sobrenadantes en los pocillos para inspeccionar la reactividad de los anticuerpos frente a megalina humana producidos en los sobrenadantes en cultivo. Se disolvió la megalina humana en NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM y KH2PO4 1,8 mM (pH 7,3; abreviado a continuación en el presente documento como “PBS, pH 7,3”). A los pocillos de una placa de microtitulación de plástico (Nunc-Immuno™Module F8 Maxisorp™ Surface plate, Nalge Nunc International), se añadieron 100 #l de la disolución de megalina humana en PBS (pH 7,3) por pocillo y entonces se inmovilizó la megalina humana en la placa de microtitulación a 3 pmol/pocillo a 4ºC durante 12 horas. Después, se eliminó a través de decantación la disolución de megalina humana en PBS (pH 7,3) que se había añadido a los pocillos, se aplicaron a los pocillos NaCl 145 mM, Na2HPO4 3,6 mM, KH2PO4 1,4 mM y Tween 20 al 0,05% (v/v) (abreviado a continuación en el presente documento como “PBS-T”) a los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo, se eliminó a través de decantación el PBS-T y

se lavó la megalina humana adsorbida en exceso en los pocillos. Este proceso de lavado se llevó a cabo dos veces en total. A continuación, se aplicaron NaCl 145 mM, Na2HPO4 7,2 mM, KH2PO4 2,8 mM, BSA al 1% (p/v) y lactosa al 5% (p/v) (abreviado a continuación en el presente documento como una “disolución de bloqueo para una placa con antígeno inmovilizado) a 200 #l/pocillo y se bloqueó la parte interior de los pocillos de la placa de microtitulación en la que se había inmovilizado la megalina humana a 4ºC durante 12 horas. A continuación, se almacenó el producto resultante a 4ºC. Para inspeccionar la reactividad de los anticuerpos en el sobrenadante de cultivo, se usó la placa de microtitulación en la que se había inmovilizado la megalina humana tras el tratamiento de bloqueo. A los pocillos de la placa de microtitulación en la que se había inmovilizado la megalina humana, se añadió un sobrenadante de cultivo de hibridoma a 100 #l/pocillo y se calentó la placa a 37ºC durante 1 hora. A continuación, se retiró a través de decantación el sobrenadante de cultivo que se había aplicado a los pocillos, se aplicó PBS-T a los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo, se eliminó a través de decantación el PBS-T y se lavó entonces la parte interior de los pocillos. Este proceso de lavado se llevó a cabo tres veces en total. A continuación, se aplicaron inmunoglobulinas de cabra anti-ratón conjugadas con peroxidasa (DAKO) a los pocillos a 100 #l/pocillo (diluidas

2.000 veces, 0,55 #g/ml) y se calentó el producto resultante a 37ºC durante 1 hora. Se diluyó el anticuerpo marcado con enzima usando NaCl 145 mM, Na2HPO4 3,6 mM, KH2PO4 1,4 mM, Tween 20 al 0,05% (v/v) y BSA al 0,5% (p/v) (denominado a continuación en el presente documento “diluyente de anticuerpo marcado con enzima”). A continuación, se eliminaron a través de decantación los anticuerpos marcados con enzima que se habían aplicado a los pocillos, se aplicó PBS-T a los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo, se eliminó a través de decantación el PBS-T y se lavó entonces la parte interior de los pocillos. Este proceso de lavado se llevó a cabo tres veces en total. A continuación, se aplicó a los pocillos una disolución de 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (abreviada a continuación en el presente documento como “TMB”) (sistema de sustrato de una etapa TMB: DAKO) a 100 #l/pocillo como una disolución de sustrato para la reacción de la enzima peroxidasa y se dejó reposar el producto resultante a 25ºC durante 30 minutos. Inmediatamente a continuación, se aplicó una disolución de H2SO4 313 mM (denominada a continuación en el presente documento “terminador de reacción”) a 100 #l/pocillo a la disolución de sustrato para su reacción en los pocillos para terminar la reacción enzimática en los pocillos. A continuación, se midió la absorción de los pocillos y se designó el valor obtenido restando la absorción a 630 nm de la obtenida a 450 nm como un indicador para la evaluación de reactividad (Josephy P.D., Mason R.P. et al., 1982, J. Biol. Chem. 257, 3669-3675). Hasta ahora se han elaborado muchos informes en cuanto a colorimetría basada en TMB desde que Bos E. S. et al elaboraron el primer informe en 1981 y hay bases sólidas para usar esta técnica (Bos

E. S. et al., 1981, J. Immunoassay, 2, 187-204).

Como resultado, se seleccionaron células de hibridoma monoclonadas que mostraban fuerte reactividad de un anticuerpo anti-megalina humana con megalina humana inmovilizada y se examinó la clase y la subclase de inmunoglobulina en el sobrenadante de cultivo en cuanto a cada clon a partir de 100 #l de la disolución de sobrenadante de cultivo madre usando el kit de tipificación de inmunoglobulina de ratón (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Basándose en los resultados, se seleccionaron clones de la clase de IgG de la biblioteca de células monoclonales resultante y luego se llevó a cabo el proceso de preparación de líquido de ascitis tal como se describe a continuación.

Posteriormente, se cultivaron estas células en un matraz de 25 ml y luego en un matraz de 75 ml. Se inyectaron las células por vía intraperitoneal en un ratón tratado con pristano y se tomaron muestras de líquido de ascitis.

(2) Purificación de anticuerpo monoclonal (IgG) de ratón anti-megalina humana

Se mezcló el líquido de ascitis obtenido (10 ml) con un agente de tratamiento de suero sanguíneo opacificado (FRIGEN (marca comercial registrada) II: Kyowa Pure Chemical Co., Ltd.) a una razón de 1:1,5 en volumen y se removió y se agitó el producto resultante durante de 1 a 2 minutos para deslipidar el líquido de ascitis. Se centrifugó el líquido de ascitis usando una centrífuga a 3.000 rpm (1930x g) durante 10 minutos y se fraccionó el sobrenadante centrifugado del líquido de ascitis aclarado (10 ml). Se sometió el sobrenadante centrifugado del líquido de ascitis (10 ml) a fraccionamiento con sulfato de amonio (concentración final: sulfato de amonio saturado al 50%) en un baño de hielo durante 1 hora y se suspendió la fracción de inmunoglobulina precipitada y se disolvió en PBS. Este proceso de fraccionamiento con sulfato de amonio se llevó a cabo dos veces en total para obtener una fracción de inmunoglobulina en bruto a partir del líquido de ascitis. Se mezcló la fracción de inmunoglobulina en bruto resultante (10 ml) con una cantidad equivalente de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0; denominado a continuación en el presente documento “NaPB 20 mM (pH 7,0)” y luego se sometió a purificación por afinidad usando una columna de proteína G (HiTrap Protein G HP, 5 ml; Amersham BioSciences)). Se adsorbió la muestra sobre una columna de proteína G, se purgó NaPB 20 mM (pH 7,0, 50 ml) a través de la columna de proteína G y se eliminaron por lavado los contaminantes distintos a la IgG en la muestra. A continuación, se eluyó la IgG adsorbida por afinidad en la columna de proteína G con glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) y se neutralizó la fracción de elución inmediatamente tras la elución de las columna con tris(hidroximetil)aminometano-HCl 1 M (pH 9,0) y luego se recuperó (a continuación en el presente documento el “tris(hidroximetil)aminometano” se abrevia como “Tris”). Tras la neutralización, se dializó el producto purificado por afinidad frente a PBS en una cantidad 500 veces mayor que el producto purificado en volumen a 4ºC durante 6 horas y este proceso de diálisis se llevó a cabo dos veces en total. La membrana de diálisis usada para la diálisis fue un tubo de celulosa para diálisis (Viskase Companies). La fracción de elución de IgG resultante se designó anticuerpo monoclonal anti-megalina humana purificado y se sometió a almacenamiento a 4ºC y a los

procedimientos descritos a continuación. El proceso de purificación se llevó a cabo conectando la columna de proteína G mencionada anteriormente al sistema BioLogic LP (Bio Rad Laboratories) a una velocidad de flujo constante de 1 ml/min.

(3)

Preparación de placa de microtitulación en la que se ha inmovilizado anticuerpo monoclonal anti-megalina humana

Se disolvió el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana purificado en PBS (pH 7,3) para dar como resultado una concentración final de 5 #g/ml en el mismo. A los pocillos de una placa de microtitulación de plástico (Nunc-Immuno™Module F8 Maxisorp™ Surface plate, Nalge Nunc International), se añadieron 100 #l de la disolución del anticuerpo monoclonal anti-megalina humana en PBS (pH 7,3) por pocillo y se inmovilizó el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana en la placa de microtitulación a 4ºC durante 12 horas. A continuación, se eliminó a través de decantación la disolución del anticuerpo monoclonal anti-megalina humana en PBS (pH 7,3) que se había añadido a los pocillos, se añadió PBS-T a los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo, se eliminó a través de decantación el PBS-T y se lavó el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana adsorbido en exceso en los pocillos. Este proceso de lavado se llevó a cabo dos veces en total. A continuación, se añadieron NaCl 86 mM, Tris 100 mM, BSA al 0,5% (p/v) y Tween 20 al 0,05% (v/v) (denominado a continuación en el presente documento disolución de bloqueo para una placa con antígeno inmovilizado) a 200 #l/pocillo y se sometió la parte interior de los pocillos de la placa de microtitulación inmovilizada con megalina humana a bloqueo a 4ºC durante 12 horas. A continuación, se almacenó el producto resultante a 4ºC.

(4)

Preparación de anticuerpo monoclonal anti-megalina humana marcado con peroxidasa

Se disolvió peroxidasa del rábano (abreviada a continuación en el presente documento como “HRP”) (peroxidasa del rábano, tipo VI, Sigma) en agua pura a una concentración de 4 mg/ml, se añadieron 100 #l de una disolución de metaperyodato de sodio 100 mM a 500 #l de la disolución de HRP (2 mg) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se dializó el producto resultante frente una disolución de acetato de sodio 1 mM (pH 4,0) (denominada a continuación en el presente documento “tampón acetato 1 mM”) en una cantidad 500 veces mayor que la de la disolución de HRP en volumen a 4ºC durante 6 horas y este procedimiento se llevó a cabo dos veces. La membrana de diálisis usada para la diálisis fue un tubo de celulosa para diálisis (Viskase Companies). Posteriormente, se disolvió el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana en una disolución de Na2CO3 2,4 mM y NaHCO3 7,6 mM (pH 9,6) (denominada a continuación en el presente documento “tampón carbonato 10 mM”) a una concentración de 8 mg/ml. Se añadió una disolución de Na2CO3 120 mM y NaHCO3 380 mM (pH 9,6) (denominada a continuación en el presente documento “tampón carbonato 0,5 M”) a 500 #l de la disolución de HRP (2 mg) en una cantidad de un tercio de la misma en volumen, se añadieron a la misma 500 #l del anticuerpo monoclonal antimegalina humana mencionado anteriormente (4 mg) y se agitó el producto resultante a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, se añadieron 50 #l de una disolución de borohidruro de sodio (4 mg/ml) y se agitó el producto resultante en un baño de hielo durante 2 horas. Se sometió el producto resultante a fraccionamiento con sulfato de amonio (concentración final: sulfato de amonio saturado al 50%) en un baño de hielo durante 1 hora, y se suspendió la fracción precipitada y se disolvió en 1 ml de una disolución de Tris 100 mM, NaCl 145 mM y BSA al 1% (v/v) (pH 7,6) (denominada a continuación en el presente documento “suspensión de anticuerpo marcado”). Este fraccionamiento con sulfato de amonio se llevó a cabo dos veces en total y se añadió una disolución de KH2PO4 2,8 mM, Na2HPO4 7,2 mM, NaCl 145 mM, BSA al 1% (p/v), fenol al 0,02% (v/v) y D-sorbitol al 40% (p/v) (denominada a continuación en el presente documento disolución madre de anticuerpo marcado) a la disolución del anticuerpo marcado en una cantidad de tres cuartos de la disolución del anticuerpo marcado (denominada a continuación en el presente documento disolución madre de anticuerpo marcado). Se obtuvo el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana marcado con HRP. Hasta ahora se han elaborado muchos informes en cuanto al método de marcaje con HRP, desde que Nakane, P. K. y Kawaoi, A. elaboraron el primer informe en 1974. Por tanto, hay bases sólidas para usar esta técnica (Nakane, P. K., Kawaoi, A., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1084).

(5)

Medición de megalina humana en orina

Se usaron la placa de microtitulación con anticuerpo monoclonal anti-megalina humana inmovilizado y el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana marcado con HRP mencionados anteriormente para medir megalina humana en orina. Al comienzo, se mezclaron 90 #l de filtrado glomerular con 10 #l de una disolución de Tris 2 M y ácido etilendiamino-N,N,N’,N’-tetraacético 0,2 M (a continuación en el presente documento el “ácido etilendiaminoN,N,N’,N’-tetraacético” se abrevia como EDTA, pH 8,0) y se aplicaron 100 #l de la disolución resultante a los pocillos de la placa de microtitulación en la que se ha inmovilizado el anticuerpo monoclonal anti-megalina humana. Se dejó reposar el producto resultante a 37ºC durante 1 hora, se eliminó a través de decantación la disolución de muestra de orina que se había aplicado a los pocillos, se aplicó PBS-T a los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo y se eliminó el PBS-T a través de decantación, seguido por lavado. El proceso de lavado se llevó a cabo tres veces. A continuación, se añadió la disolución de anticuerpo monoclonal anti-megalina humana marcado con HRP (la disolución madre anterior se diluyó hasta 10.000 veces con la disolución del anticuerpo marcado diluido) a 100 #l/pocillo. Se dejó reposar el producto resultante a 37ºC durante 1 hora, se eliminó a través de decantación la disolución de anticuerpo marcado con HRP que se había aplicado a los pocillos, se añadió PBS-T a

los pocillos de la placa de microtitulación a 200 #l/pocillo y se eliminó el PBS-T a través de decantación, seguido por lavado. El proceso de lavado se llevó a cabo tres veces. Posteriormente, se aplicó una disolución de TMB (sistema de sustrato de una etapa TMB: DAKO) a los pocillos como una disolución de sustrato para la reacción de enzima peroxidasa a 100 #l/pocillo y se dejó reposar el producto resultante a 25ºC durante 30 minutos. Inmediatamente a 5 continuación, se añadió el terminador de reacción a la disolución de sustrato en los pocillos a 100 #l/pocillo para terminar la reacción enzimática en los pocillos. A continuación, se midió la absorbancia de los pocillos y se designó el valor obtenido restando la absorbancia a 630 nm de la obtenida a 450 nm como un indicador para la evaluación de medición de megalina humana en la orina. Como muestra de referencia para la curva de calibración, se usó megalina humana que se usó como antígeno inmunológico en el momento de la preparación de un anticuerpo 10 monoclonal anti-megalina humana y los resultados del análisis se muestran en la tabla 1 y en la figura 2. Los resultados de la medición clínica real de megalina humana en la orina se muestran en la tabla 2, figura 3 y figura 4. Como resultado, se encontró que la cantidad de megalina humana excretada a la orina era significativamente mayor en pacientes con enfermedades renales y en futuros pacientes de enfermedades renales, en comparación con los individuos sanos (figuras 3 y 4). Los resultados de las pruebas de aclaramiento de creatinina en cuanto a la cantidad 15 de megalina excretada a la orina también fueron similares. Esto indica que la concentración en el momento de la excreción urinaria no importaría (figuras 3 y 4). La presente invención proporciona un método para medir megalina humana que puede realizarse de una manera más sencilla dentro de un periodo de tiempo más corto de lo que es posible con técnicas convencionales y que también puede cuantificar megalina humana. Además, este método permite el diagnóstico de enfermedades funcionales que son específicas para células, tejidos u órganos, de una

20 manera dirigida al sitio en una fase temprana. Los resultados clínicos mostrados anteriormente apoyan aparentemente tal característica de la presente invención.

Tabla 1

[megalina h] (nM)

Curva de calibración de ELISA para detectar megalina humana

n = 1

n = 2 n = 3 Promedio D.E.

6,250

2,4356 2,4416 2,3576 2,4116 0,0469

3,125

1,2551 1,2596 1,2261 1,2469 0,0182

1,563

0,6288 0,6576 0,6358 0,6407 0,0150

0,781

0,3282 0,3296 0,3282 0,3287 0,0008

0,313

0,1341 0,1359 0,1370 0,1357 0,0015

0,156

0,0788 0,0917 0,0858 0,0854 0,0065

0,078

0,0582 0,0638 0,0727 0,0649 0,0073

0,031

0,0390 0,0503 0,0468 0,0454 0,0058

0,000

0,0465 0,0409 0,0431 0,0435 0,0028

25 Tabla 2

Elemento

Creatinina en orina Megalina en orina

Método de medición

Método enzimático: Método de color ELISA

Fondo de muestras

N.º de muestra [Cre-o] D.O. (450 nm) – D.O. (630 nm) [Megalina] Aclaramiento de creatitina

(mg/dl)

(nM) (nmol de megalina/g de Cre)

Diabetes

D-1 117,96 0,241 0,513 0,435

D-2

68,16 0,110 0,168 0,246

D-3

102,53 0,102 0,146 0,142

Nefropatía

N-1 178,52 2,472 6,398 3,584

N-2

33,55 0,459 1,088 3,243

N-3

41,24 0,161 0,302 0,732

N-4

78,29 0,110 0,168 0,215

N-5

36,97 0,129 0,218 0,590

Síndrome metabólico

M-1 302,32 0,169 0,323 0,107

M-2

59,56 0,086 0,104 0,175

Individuos sanos

H-1 44,11 0,061 0,038 0,086

H-2

92,72 0,082 0,094 0,101

H-3

134,72 0,056 0,025 0,019

H-4

123,59 0,063 0,044 0,036

H-5

104,31 0,052 0,015 0,014

H-6

96,64 0,050 0,009 0,009

Lista de secuencias

<110> UNIVERSIDAD DE NIIGATA \201G DENKA SEIKEN Co., Ltd. 12

<120> Método para detectar megalina humana

5

<130> PH-3116-PCT <150> documento JP 2006-089306 <151>

10

<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1

15

<210> 1 <211> 13968 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 4655

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando un primer ligando que puede unirse a megalina humana y que se

   5 une a un soporte sólido y un segundo ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho primer ligando, permitir que la muestra reaccione con dicho segundo ligando y medir el segundo ligando que se une a dicho soporte sólido mediante formación de un complejo con megalina humana en la muestra y dicho primer ligando.

   10 2. Método para detectar nefropatía según la reivindicación 1, en el que el primer ligando que puede unirse a megalina humana y el segundo ligando que puede unirse a megalina humana son ambos anticuerpos.
2. 3. Método según la reivindicación 2, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales anti-megalina

   humana. 15
3. 4. Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando megalina humana o un fragmento parcial de megalina humana que se une a un soporte sólido y un ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho ligando, permitir que el producto reaccione con la

   20 megalina humana que se une a un soporte sólido, medir el ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido y cuantificar la megalina humana en la muestra basándose en una disminución en un porcentaje del ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido.

   25 5. Método para detectar nefropatía según la reivindicación 4, en el que el ligando que puede unirse a megalina humana es un anticuerpo monoclonal anti-megalina humana.
4. 6. Uso de megalina humana como marcador de detección de enfermedad para detectar nefropatía en el

   método según la reivindicación 1. 30