ES2824162T3 - Dickkopf 3 (dkk3) de mamíferos como marcador urinario de fibrosis intersticial/atrofia tubular (if/ta) renal e insuficiencia renal progresiva - Google Patents
Dickkopf 3 (dkk3) de mamíferos como marcador urinario de fibrosis intersticial/atrofia tubular (if/ta) renal e insuficiencia renal progresiva Download PDFInfo
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Abstract
Un metodo in vitro para indicar la presencia de fibrosis intersticial y atrofia tubular (IF/TA) renal, que comprende las etapas de a) detectar la cantidad de proteina Dickkopf 3 (Dkk3) y/o aductos de la misma en una muestra de orina obtenida de un paciente mamifero a diagnosticar, y b) llegar a una conclusion sobre la extension de la IF/TA renal de dicho paciente, en donde una mayor cantidad de proteina Dkk3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparacion con la cantidad detectada en una muestra de orina de un paciente sano es indicativa de IF/TA renal de grado superior, y en donde dicha deteccion comprende el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, en donde dicho anticuerpo monoclonal es el que se produce por huDkk3-16.1, huDkk3-2.13 o huDkk3-24.20, lineas celulares de hibridoma, depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania con el numero de deposito DSM ACC3274, DSM ACC3275 y DSM ACC3276, respectivamente.
Description
DESCRIPCIÓN
Dickkopf 3 (dkk3) de mamíferos como marcador urinario de fibrosis intersticial/atrofia tubular (if/ta) renal e insuficiencia renal progresiva
La presente invención se refiere al Dickkopf 3 (Dkk3) de mamífero como marcador in vitro de fibrosis intersticial/atrofia tubular (IF/TA) renal y al efecto de las intervenciones terapéuticas sobre la progresión de la IF/TA en la CKD, así como también, a usos in vitro relacionados, de acuerdo con el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Antecedentes de la presente invención
La enfermedad renal crónica (CKD) causa una pérdida progresiva y permanente de la función renal, lo que finalmente requiere una terapia de reemplazo renal permanente cuando la uremia se vuelve potencialmente mortal. La CKD debe separarse de la lesión renal aguda, esta última caracterizada por una rápida pérdida de la función renal en unos días, que, sin embargo, suele ser reversible.
La guía internacional de práctica clínica para la evaluación y el tratamiento de la enfermedad renal crónica (KDIGO) 2012, define la CKD como anomalías de la estructura o función del riñón, presentes durante más de 3 meses, con implicaciones para la salud. Por otra parte, la guía además clasifica la CKD en diferentes estadios en base a la función renal, es decir, la tasa de filtración glomerular (GFR) y la excreción de albúmina en la orina. Los estadios de la CKD cubren una amplia gama de funciones renales, desde la GRF normal hasta el establecimiento de insuficiencia renal permanente, con una reducción final de la GFR por debajo de 15 % de lo normal. En este estadio, se considera que el paciente padece una enfermedad renal en etapa terminal, que tarde o temprano necesita terapia de reemplazo renal. Los estadios de la CKD se acompañan de diferentes grados de albuminuria, y el riesgo de progresión de la CKD se deduce de dos variables: la GFR y la excreción de albúmina en orina (Figura 1).
Durante las últimas décadas, tanto la tasa incidencia como la de prevalencia de todos los estadios de la CKD aumentaron sustancialmente en todo el mundo, pero el aumento fue particularmente evidente en los estadios 3 y 4 más avanzados de la CKD. Esto se documenta mejor con datos de grandes estudios epidemiológicos de Estados Unidos, Como la Encuesta de Examen de Salud y Nutrición (NHANES) (Figura 2). El crecimiento constante de la incidencia y prevalencia de la CKD se debe principalmente al envejecimiento de la población con un aumento de enfermedades que conducen a daño renal, como diabetes, hipertensión y enfermedad renovascular. Estas tres condiciones representan mucho más de 50 % de la CKD progresiva no solo en las sociedades occidentales, sino también en los países en desarrollo (Figura 3). Debido a los considerables costos de tratamiento para los pacientes con insuficiencia renal, especialmente aquellos que requieren terapia de reemplazo renal, la detección temprana y el tratamiento adecuado de la CKD progresiva es de suma importancia desde un punto de vista médico-económico.
La monitorización de la función renal y, por tanto, además de la progresión de la CKD se realiza usualmente con la medición de marcadores sustitutos de la GFR, principalmente la concentración de creatinina en sangre. La creatinina es el producto de degradación de los músculos esqueléticos, que atraviesa la barrera de filtración glomerular y se filtra libremente en la orina. Dado que prácticamente no se reabsorbe en el sistema tubular renal, su concentración en sangre depende casi exclusivamente de la GFR. En la CKD, los riñones afectados ya no filtran correctamente la creatinina, lo que provoca su acumulación en la sangre y otros fluidos corporales. Sin embargo, debido a la relación exponencial entre la disminución de la GFR y el aumento de los niveles sanguíneos de creatinina, este marcador sustituto proporciona solo una aproximación de la función renal. En niños y ancianos, la creatinina es aún más insuficiente con respecto a esto debido a su baja masa muscular. En la práctica clínica, un intento de evitar la inexactitud de las mediciones de creatinina en sangre es el cálculo de la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) mediante el uso de diferentes ecuaciones matemáticas que se basan en la edad, la raza, el sexo y la concentración de creatinina en sangre. Sin embargo, estas estimaciones de la función renal adolecen del problema inherente de que reflejan solo la GFR, una variable fisiológica, en lugar de la extensión real del daño total del tejido renal.
Con respecto a esto, la evaluación de la cantidad de proteínas en la orina, tal como la albúmina, es un signo más confiable de lesión renal definitiva, ya que el hallazgo de cantidades patológicas de proteínas en la orina se debe tanto al daño de la barrera de filtración glomerular, así como también a la lesión en el túbulo renal-intersticio. De acuerdo con la Guía de práctica clínica KDIGO 2012 para la evaluación y el tratamiento de la enfermedad renal crónica, las pruebas de albúmina en orina se usan para la detección y clasificación de la lesión renal crónica y la evaluación del riesgo de la CKD progresiva (Figura 1). Las pruebas con tira reactiva realizadas con una almohadilla sensible al color se usan para indicar el nivel de albúmina en la orina, pero son semicuantitativas y solo proporcionan estimaciones aproximadas del contenido de albúmina en la orina. En cuanto a la medición de creatinina en sangre, la correlación de la albuminuria con el daño del tejido renal es bastante modesta. Adicionalmente, generalmente no se detectan pequeñas cantidades de albúmina en la orina cuando se realiza una prueba de tira reactiva de rutina.
En conjunto, la confirmación definitiva de la CKD progresiva y destructiva sólo puede obtenerse mediante una biopsia de riñón, es decir, un procedimiento invasivo que proporciona muestras de tejido renal para el examen histopatológico. Aquí, el hallazgo de daño túbulo renal-intersticial es un sello distintivo de daño tisular grave y, por lo tanto, de CKD progresiva. Específicamente, la IF/TA renal es la vía común final de la CKD, etiológicamente diferente, que
inevitablemente resulta en insuficiencia orgánica. Desafortunadamente, hasta la fecha no se dispone de pruebas diagnósticas no invasivas adecuadas para esta manifestación patológica decisiva de la CKD progresiva.
Durante la última década, la aplicación de perfiles de expresión génica en la investigación del cáncer ha resultado en el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas. En contraste con el éxito del perfil de expresión génica en oncología, varios desafíos han limitado gravemente la aplicación del perfil genómico en enfermedades renales no malignas. En primer lugar, la disponibilidad de tejido es limitada porque las biopsias renales de diagnóstico o las nefrectomías no malignas se realizan con relativa poca frecuencia. En segundo lugar, la composición de las muestras de tejido renal es intrínsecamente heterogénea y contribuye al error de muestreo, lo que hace que la elaboración de perfiles de expresión génica cuantitativa y estandarizada en una gran serie de biopsias renales sea un desafío técnico.
El documento PCT/EP2015/056975 se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad renal crónica, que comprende las etapas de a) obtener una muestra de orina que comprende la orina de la madrugada (EMU) de un mamífero, preferentemente un humano, paciente a diagnosticar, b) medir la cantidad de la proteína Dickkopf 3 (DKK3) y/o aductos de la misma en dicha muestra, y c) llegar a una conclusión sobre una CKD de dicho paciente, donde una mayor cantidad de proteína DKK3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparación con un paciente sano es indicativa de una enfermedad renal crónica.
El documento "Cross-Species Targeted Marker Discovery (CSTD)", protocolos del CKD Biomarkers Consortium, 23 de abril de 2014 (2014-04-23), páginas 1-4, describe el uso de reactivos de inmunodiagnóstico para detectar DKK3 en la orina para el diagnóstico de CKD.
Giuseppina Federico: "Blockade of Dickkopf-3 inhibits renal fibrosis and atrophy", HeiDOK, 21 de julio de 2015 (2015 07-21) y Giuseppina Fedrico: "Blockade of Dickkopf-3 inhibits renal fibrosis and atrophy", 22 de junio de 2015 (2015 -06-22), ambos sugieren la aplicación de Dkk3 como biomarcador para la enfermedad renal crónica, lo que incluye la fibrosis renal y la atrofia.
Los ensayos que usan anticuerpos para la detección de DKK3 están disponibles comercialmente, sin embargo, estos ensayos tienen, por ejemplo, tasas de recuperación en muestras preacondicionadas de 86,69 % en suero y 89,24 % en plasma (es decir, entre un 10 y un 15 % de divergencia en la prueba). Con las muestras de orina, se encontró que generalmente se requiere una optimización adicional, lo que dificulta el uso de estas pruebas en un formato estandarizado.
Así, una de las necesidades insatisfechas más importantes en la medicina renal es la identificación y validación de herramientas y ensayos eficientes para marcadores de CKD, y en particular de IF/TA renal, y la progresión de la CKD que faciliten el tratamiento dirigido de aquellos individuos con alto riesgo, lo que evita el tratamiento innecesario de los demás. Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para el experto en la materia cuando estudie la especificación de la presente invención.
La presente descripción proporciona un anticuerpo monoclonal específico para la proteína Dickkopf 3 (Dkk3), en donde dicho anticuerpo monoclonal se produce por huDkk3-16.1, huDkk3-2.13 o huDkk3-24.20, las líneas celulares de hibridoma depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania, con el número de depósito DSM ACC3274, DSM ACC3275 y DSM ACC3276, respectivamente.
Los anticuerpos descritos son específicamente reactivos con epítopos de la proteína Dickkopf 3 (Dkk3), lo que significa que reconocen y se unen selectivamente a dichos epítopos. Puede usarse cualquier ensayo de unión convencional para evaluar esta unión, lo que incluye, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima.
Los péptidos descritos, que incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, tienen una utilidad particular en la detección de la proteína Dkk3 y en el diagnóstico, seguimiento y/o pronóstico de la CKD progresiva y destructiva, tal como la IF/TA renal.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal soluble intacto aislado. El anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo monoclonal aislado seleccionado del grupo que consiste en un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, SFv o scFv. Estos fragmentos se producen a partir de anticuerpos intactos mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, escisión proteolítica con enzimas como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir F (ab')2).
El anticuerpo monoclonal descrito se produce por huDkk3-16.1, huDkk3-2.13 o huDkk3-24.20, líneas celulares de hibridoma depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania con el número de depósito DSM ACC3274, DSM ACC3275, y DSM ACC3276, respectivamente.
Los anticuerpos de la presente descripción exhiben una unión muy fuerte (y por lo tanto tienen una alta afinidad), es decir, O.D. de aproximadamente dos veces el fondo en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima contra un anticuerpo de prueba. En una modalidad preferida, el nivel alto de unión es igual o superior a cinco veces el fondo. En otras modalidades, el nivel alto de unión es igual o superior a 10 veces el fondo. Por supuesto, cualquier aumento
significativo sobre el fondo (el nivel observado cuando todos los reactivos distintos del anticuerpo que se está probando) será reconocido por los expertos en la técnica como de alta unión y, por lo tanto, dentro del alcance de la invención.
En un aspecto particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo es un anticuerpo humano recombinante compuesto por regiones de los anticuerpos de la invención junto con regiones constantes de anticuerpos humanos (IgG). Por ejemplo, una cadena H puede comprender la región de unión al antígeno de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo de la invención, unido al menos a una parte de una región constante de la cadena pesada humana. Esta cadena pesada humanizada o quimérica puede combinarse con una cadena L quimérica que comprende la región de unión al antígeno de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo, unido al menos a una parte de la región constante de la cadena ligera humana.
Los anticuerpos recombinantes pueden ser inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Por ejemplo, un anticuerpo monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena H asociada a través de puentes disulfuro con una cadena L, como se indicó anteriormente. Un anticuerpo divalente es un tetrámero formado por dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente disulfuro. Un anticuerpo polivalente se basa en una agregación de cadenas.
Por supuesto, otros anticuerpos recombinantes compuestos de diferentes secciones de los anticuerpos de la invención están dentro de la invención. En particular, la región constante de la cadena pesada puede ser un anticuerpo IgG2, IgG3, IgG4, IgM o IgA.
Otro aspecto del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente descripción se refiere entonces a un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo se conjuga con un marcador detectable. Las etiquetas adecuadas para su uso en la detección de un complejo entre un epítopo y un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, una etiqueta de epítopo (etiqueta), una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina), una etiqueta interactiva, una enzima, una toxina o un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente.
Otro aspecto de la descripción abarca además un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo como se describió anteriormente. El ácido nucleico puede seleccionarse entre RNA, DNA, PNA, y/o cDNA. El (los) ácido(s) nucleico(s) de la invención pueden aislarse y/o clonarse en vectores, tales como plásmidos, por ejemplo, vectores de expresión. Por tanto, adicionalmente a los fragmentos de proteínas y las regiones de los anticuerpos, la presente descripción abarca además la secuencia de DNA del gen que codifica los anticuerpos, así como también, los péptidos codificados por dicho DNA. Las secuencias de DNA y péptidos particularmente preferidas son las que se relacionan con las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos preferidos, que incluyen las regiones determinantes de la complementariedad ("Cd R"), las secuencias hipervariables de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que interactúan con los aminoácidos en el antígeno complementario. La descripción incluye estas secuencias de DNA y péptidos, así como también, secuencias de DNA y péptidos que son homólogas (comparten identidad) con estas secuencias. En una modalidad preferida, estas secuencias son 80 % homólogas, aunque otras modalidades preferidas incluyen secuencias que son 85 %, 90 % y 95 % homólogas. La determinación de estos niveles de homología tanto para el DNA como para la secuencia de péptidos está dentro de la experiencia rutinaria de los expertos en la técnica.
Las secuencias de DNA pueden identificarse, aislarse, clonarse y transferirse a una célula procariota o eucariota para su expresión mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos se describen generalmente en Sambrook y otros, supra, así como también, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, Eds., John Wiley & Sons).
Adicionalmente, las secuencias de DNA y péptidos de los anticuerpos de la descripción, que incluyen los anticuerpos monoclonales y quiméricos, pueden formar la base de los "derivados" de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, las proteínas o péptidos codificados por genes truncados o modificados. Tales proteínas o péptidos pueden funcionar de manera similar a los anticuerpos de la descripción.
En otro aspecto, la descripción abarca además una línea celular de hibridoma que expresa un anticuerpo monoclonal de acuerdo la presente invención, en donde dicho anticuerpo monoclonal se produce por huDkk3-16.1 (DSM ACC3274), huDkk3-2.13 (DSM ACC3275) o huDkk3- 24.20 (DSM ACC3276), líneas celulares de hibridoma depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania, con los números de depósito indicados. Generalmente, un hibridoma se produce mediante fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma) con células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse de la sangre periférica o, preferentemente del bazo o de los ganglios linfáticos, de seres humanos u otros animales adecuados inmunizados con el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) pueden aislarse mediante el uso de condiciones de cultivo selectivas y clonarse mediante dilución limitante. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).
En un primer aspecto, el objeto de la presente invención se resuelve al proporcionar un método in vitro para indicar la presencia de fibrosis intersticial y atrofia tubular (IF/TA) renal, que comprende las etapas de
a) detectar la cantidad de proteína Dickkopf 3 (Dkk3) y/o aductos de la misma en una muestra de orina obtenida de un paciente mamífero a diagnosticar, y
b) llegar a una conclusión sobre la extensión de la IF/TA renal de dicho paciente,
en donde una mayor cantidad de proteína Dkk3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparación con la cantidad detectada en una muestra de orina de un paciente sano es indicativa de IF/TA renal de grado superior, y en donde dicha detección comprende el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo monoclonal es el que se produce por huDkk3-16.1, huDkk3-2.13 o huDkk3-24.20, líneas celulares de hibridoma, depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania, con el número de depósito DSM ACC3274, DSM ACC3275 y DSM ACC3276, respectivamente.
En otro aspecto de la misma, el objeto de la presente invención se resuelve al proporcionar un método como el anterior, que comprende además llegar a una conclusión sobre el progreso de dicha IF/TA renal o CKD respectivamente, en dicho paciente, en donde en la etapa c) una mayor cantidad de proteína Dkk3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparación con una cantidad en una muestra anterior de dicho paciente es indicativa de IF/TA renal progresiva o CKD progresiva, respectivamente.
El paciente mamífero puede ser una rata, un ratón, una cabra, un conejo, una oveja, un caballo, un mono, un felino, por ejemplo, un gato o un ser humano; se prefiere un ratón, una rata, un gato o un ser humano.
En el contexto de los experimentos que condujeron a la presente invención, se encontró sorprendentemente que la proteína Dkk3, tal como se encuentra en la orina, puede ser un potente indicador de insuficiencia renal y en particular de la presencia de IF/TA renal.
En el contexto de la presente invención, un "aducto" de la proteína Dkk3 significará un producto de degradación de Dkk3 en la muestra que, no obstante, puede detectarse/se detecta en el contexto del presente método. Los aductos pueden formarse debido a una estabilidad reducida de la proteína que se va a detectar (aquí: Dkk3) a las temperaturas presentes durante el muestreo, envío, almacenamiento y/o análisis. Los aductos pueden formarse mediante actividades de proteasa presentes en la muestra biológica tomada del paciente que se va a diagnosticar. Adicionalmente, pueden incluirse además en el análisis aductos de proteínas covalentes formados después de la exposición a xenobióticos.
El gen Dkk3 se transcribe en tres isoformas diferentes (NM_015881,2650 pb, NM_013253, 2635 pb y NM_001018057, 2587 pb). Dos de ellos resultan del uso alternativo del primer exón (es decir, exón 1a y exón 1b, aunque ambos no son codificantes). Una variante más carece del exón 1. Todas las variantes comparten los exones 2 a 8 y codifican una proteína funcional de 350 aa. Como se usa en la presente descripción, el término "Dkk3" incluirá además estas isoformas.
Los presentes inventores establecieron dos modelos animales, uno mecánico y otro tóxico, en los que se estableció la insuficiencia renal. Ambas condiciones fisiopatológicas reflejan enfermedades humanas, a saber:
- El modelo de obstrucción ureteral unilateral (UUO); este se induce en ratones por ligadura ureteral unilateral del uréter izquierdo. Los animales desarrollan rápidamente, en unos pocos días, IF/TA renal grave con un infiltrado de células inflamatorias en el riñón afectado. Además, puede encontrarse una obstrucción del uréter en mamíferos, como gatos, niños y adultos humanos.
- El modelo de dieta con adenina (ADM); la alimentación con alto contenido de adenina en ratones resulta en la formación de cristales en los túbulos renales, con la consiguiente lesión e inflamación tubular, obstrucción y finalmente obliteración (atrofia), siempre acompañada de una marcada fibrosis intersticial. Estos cambios fisiopatológicos pueden encontrarse además en mamíferos como los humanos, tanto en niños como en adultos. (Para obtener más información sobre los modelos animales, ver, por ejemplo, Neven E & D'Haese PC. Vascular calcification in chronic renal failure - what have we learned from animal studies? Circulation Research 2011; 108: 249-264).
El documento WO 2010/132676 se refiere a métodos y composiciones para diagnosticar la CKD. El documento WO 2010/132676 generalmente busca proporcionar un diagnóstico de CKD basado en "paneles" (es decir, varios) de biomarcadores identificados mediante el uso de análisis de expresión (es decir, "firmas de expresión predictiva"). Uno de los biomarcadores mencionados es Dkk3, que se mide en un panel, y tal medición, supuestamente, puede realizarse en una muestra biológica tales como sangre, orina, saliva, jugos gástricos y similares. El documento WO 2010/132676 no realizó un análisis con orina y no se mencionan problemas con este análisis. En su lugar, se usó el análisis de expresión en un chip basado en RNA total de tejido renal (ejemplos 2-5) y muestras histológicas (ejemplo 6).
Tras un análisis más detallado del documento WO 2010/132676, el documento no contiene ninguna información que lo califique como un trampolín prometedor para desarrollar una prueba de orina para Dkk3 en el contexto de la IF/TA renal como sigue. Por ejemplo, el documento WO 2010/132676 usa una pluralidad de marcadores, una indicación de que no se identificaron marcadores individuales eficaces. El documento WO 2010/132676 después menciona cambios de expresión "significativos", pero esto no debe confundirse con la importancia general para el diagnóstico. Además, el documento WO 2010/132676 no dice nada con respecto a los problemas con los anticuerpos comúnmente disponibles al detectar Dkk3.
Por tanto, de acuerdo con la presente invención, la expresión de Dkk3 y su cantidad y/o concentración en la orina muestra una clara correlación con la lesión del tejido renal, específicamente para IF/TA renal en un paciente mamífero, preferentemente, humano.
Con el uso de ratones de tipo salvaje en lugar de ratones transgénicos como se usa en el documento WO 2010/132676, los inventores pudieron demostrar además que, en condiciones de estrés en el riñón, Dkk3 no se expresa en los glomérulos, sino únicamente en el epitelio de los túbulos. Estos epitelios proporcionan más de 90 % de las células del riñón y tienen un contacto directo con el sistema urinario.
Se prefiere el método de acuerdo con la presente invención, en donde dicho paciente a diagnosticar es un niño o un adolescente. En el contexto de la presente invención, se analizaron muestras de orina tomadas de una cohorte de niños con enfermedad glomerular (glomerulonefritis) y enfermedad tubular primaria (nefronoptisis). Además, se analizaron muestras de orina de una cohorte de pacientes adultos con diferentes enfermedades renales, que han sido sometidos a biopsia renal.
Para la medición y/o una detección del mamífero tal como Dkk3 humano y/o aductos de la misma en la muestra, pueden usarse métodos estándar para evaluar la expresión de proteínas, tales como, por ejemplo, un método seleccionado del grupo de espectrometría de masas, cromatografía, electroforesis en gel de SDS y reacciones de antígeno/anticuerpo, tales como, por ejemplo, transferencias Western y/o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Se prefiere ELISA.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere entonces a un uso in vitro del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo como se define en el primer aspecto para detectar la cantidad de proteína Dickkopf 3 (Dkk3) y/o aductos de la misma en una muestra de orina de mamífero para indicar la presencia y/o monitorizar la IF/TA renal progresiva en un paciente mamífero Se prefiere un uso de acuerdo con la presente invención, en el que dicha detección comprende el uso del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de acuerdo con la invención.
Se prefiere el uso para la monitorización de acuerdo con la presente invención, en donde dicha muestra consiste o consiste esencialmente en orina, ya sea de un paciente a diagnosticar o de un grupo de pacientes, tal como, por ejemplo, un grupo de niños (es decir, una muestra combinada). Se prefiere el uso para la monitorización de acuerdo con la presente invención, en donde dicho paciente a diagnosticar es un niño o un adolescente.
Para la medición y/o una detección del mamífero, tal como humano, Dkk3 y/o aductos de la misma en la muestra, además en el contexto de la monitorización pueden usarse métodos estándar para evaluar la expresión de proteínas, como, por ejemplo, un método seleccionado del grupo de espectrometría de masas, cromatografía, electroforesis en gel de SDS y reacciones antígeno/anticuerpo, tales como, por ejemplo, transferencias Western y/o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Se prefiere ELISA. Se prefiere un método de acuerdo con la presente invención, en donde dicha detección comprende el uso del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de acuerdo con la invención.
Se prefiere un método para la monitorización de acuerdo con la presente invención, en donde dicho paciente se somete a tratamiento para la IF/TA renal, respectivamente CKD. Dicho tratamiento puede realizarse, preferentemente, como se describe más abajo.
Se prefiere que dicha muestra consista o consista esencialmente en orina, ya sea de un paciente a diagnosticar o de un grupo de pacientes, como, por ejemplo, un grupo de niños (es decir, una muestra combinada).
La presente invención se describirá ahora aún más en los siguientes ejemplos con referencia a las figuras adjuntas, sin embargo, sin limitarse a las mismas.
La Figura 1 muestra una descripción general del riesgo de progresión de la CKD de acuerdo con: Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease. La categorización se basa en la tasa de filtración glomerular (GFR) y la tasa de excreción de albúmina en orina (albuminuria). En: Stevens PE y Levin A; Kidney Disease: Improving Global Outcomes Chronic Kidney Disease Guideline Development Work Group Members. Evaluation and management of chronic kidney disease: synopsis of the kidney disease: improving global outcomes 2012 clinical practice guideline. Annals of Internal Medicine 2013; 158: 825-830.
La Figura 2 muestra la prevalencia de estadios de CKD por grupo de edad en la Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición (NHANES) 1988-1994 y 1999-2004. En: Coresh J, Selvin E, Stevens LA, Manzi J, Kusek JW, Eggers P, Van Lente F, Levey AS. Prevalence of chronic kidney disease in the United States. JAMA 2007; 298: 2038-2047.
La Figura 3 resume la distribución de las causas de la CKD en todo el mundo. CGN = glomerulonefritis crónica, HT = nefroesclerosis hipertensiva, CIN = nefritis intersticial crónica, RVD = enfermedad renovascular. En: Jha V, García-García G, Iseki K, Li Z, Naicker S, Plattner B, Saran R, Wang AY, Yang CW. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet 2013; 382: 260-272.
La Figura 4 muestra que la producción renal de Dkk3 se induce en las células epiteliales tubulares durante el desarrollo de la fibrosis intersticial. (A+D) Imágenes de bioluminiscencia ex vivo de riñones fibróticos de ratones Dkk3-LCh (A) 2, 7 y 21 días después de la inducción de obstrucción ureteral unilateral (UUO). Como control, se usaron riñones de ratones Dkk3-LCh no tratados. 5 minutos después de la inyección i.p. de 150 mg/kg de D-luciferina, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los órganos. Después de 5 minutos de incubación en una solución de D-luciferina de 1 mg/ml en PBS a 37 °C, se obtuvieron imágenes de los órganos durante 5 minutos. Los colores muestran la intensidad de la luz emitida (ver escala). Se muestra un experimento representativo de cada 3. (B+E) Cantidad de proteína Dkk3 en relación con al peso del órgano en lisados de riñones fibróticos (B) 2, 7 y 21 días después de la inducción de UUO o (E) 2, 7 y 28 días después del inicio de la alimentación con adenina. Como control, se usaron riñones de ratones no tratados. (C) Detección de la expresión de mCherry en riñones fibróticos de ratones Dkk3-LCh 7 días después de la inducción de UUO. Como control se usaron riñones de ratones Dkk3-LCh no tratados. Se prepararon crio secciones de riñones aislados y se realizó tinción anti-mCherry conjugada con fluorocromo (rojo) y tinción anti-CD45 (verde). Los núcleos se tiñeron por contraste con DAPI (azul). La forma y localización de las células positivas a mCherry las identificaron como células epiteliales tubulares. Se muestra un experimento representativo de cada tres.
La Figura 5 muestra la falla en la detección confiable de Dkk3 en muestras de orina combinadas de ratones mediante el uso del modelo de jaulas metabólicas.
La Figura 6 muestra que se encontró que la orina era adecuada para una detección significativa de Dkk3; muestra la detección de Dkk3 en la orina de ratones en el modelo de ratón alimentado con dieta de adenina. Se encontró un claro aumento del cociente entre creatinina y Dkk3 a partir de los 7 días.
La Figura 7 muestra mediciones en muestras de orina derivadas de niños con CKD, tales como nefronoptisis frente a muestras de adultos (B), que muestran una ventaja de los ensayos de acuerdo con la presente invención para niños. eGFR = tasa de filtración glomerular estimada; R2 para menores de 12 años = 0,30; R2 para mayores de 12 años = 0,24
La Figura 8 muestra que Dkk3 en la orina de pacientes con diferentes tipos de CKD es un marcador de IF/TA renal (ver además el ejemplo 4). (a) Nivel de Dkk3 detectado en la orina de ratones alimentados con dieta enriquecida con adenina durante 2, 7, 14, 21 y 28 días. Como control, se tomó orina de ratones antes del inicio de la administración de adenina. (b) Nivel de Dkk3 detectado en la orina de voluntarios jóvenes sanos (control) y pacientes con CKD. (c) Correlación entre la eGFR y los niveles de orina de Dkk3 observados en muestras de pacientes pediátricos (d) Curva ROC derivada para Dkk3, mediante el uso de un umbral de 25 ml/min/1,73 m2 para la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) y la definición de los dos grupos de pacientes como aquellos con eGFR <25 que tienen enfermedad grave, y aquellos con eGFR> 25 que tienen enfermedad no grave. AUC = 0,88 (intervalo de confianza de 95 %: 0,81-0,96). La sensibilidad (al 90 % de especificidad) es 0,71 (IC de 95 %: 0,51 0,90). La especificidad (al 90 % de sensibilidad) es 0,52 (IC del 95 %: 0,26 a 0,83). (e) Imágenes representativas de cortes teñidos con PAS y tricromo de biopsias renales de pacientes adultos con CKD y concentraciones de Dkk3 en orina relacionadas. (f) Correlación entre los niveles de orina Dkk3 y el grado de atrofia tubular (TA) en muestras de biopsia renal de pacientes adultos. (g) Curva ROC derivada para Dkk3, con el uso de un umbral del área de atrofia tubular de 25 %. AUC = 0,87 (IC de 95 %: 0,73-1,00). (h) Correlación entre los niveles de orina de Dkk3 y el grado de fibrosis intersticial (IF) en muestras de biopsia de riñón de pacientes adultos. (i) Curva ROC derivada para Dkk3, con el uso de un umbral del área de fibrosis intersticial de 25 %. AUC = 0,83 (IC de 95 %: 0,69-0,96). (j) Correlación entre los niveles sanguíneos de creatinina y el grado de atrofia tubular (TA) en muestras de biopsia renal de pacientes adultos. (k) Curva ROC derivada de la creatinina, con el uso de un umbral de 25 % del área de atrofia tubular. AUC = 0,76 (IC de 95 %: 0,59-0,93). (1) Correlación entre los niveles de creatinina en sangre y el grado de fibrosis intersticial (IF) en muestras de biopsia renal de pacientes adultos. (m) Curva ROC derivada de la creatinina, con el uso de un umbral de 25 % del área de fibrosis intersticial. AUC = 0,68 (IC de 95 %: 0,45-0,92).
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de anticuerpos monoclonales eficaces preferidos contra la proteína Dickkopf 3 (huDkk3) humana recombinante
Se inmunizaron varias veces por vía subcutánea ratones hembra Dickkopf 3 silenciado (Dkk3-/-) con proteína de fusión Dkk3 humana purificada-IgG2b de ratón. Tres días después del último refuerzo, se fusionaron células de bazo con la línea celular de mieloma X63-Ag8.653 mediante el uso de polietilenglicol 4000. Los sobrenadantes de hibridomas en crecimiento se seleccionaron mediante ELISA para determinar la reactividad con la proteína Dkk3 humana recombinante (huDkk3). Por tanto, los hibridomas huDkk3-2.13 (isotipo IgG1 kappa), huDkk3-16.1 (isotipo IgG1 kappa) y huDkk3-24.20 (isotipo IgG1 kappa) se identificaron y clonaron mediante dilución limitante.
La producción en masa de anticuerpos se realizó en un biorreactor modular MiniPERM (Greiner, Frickenhausen, Alemania) y la inmunoglobulina se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre proteína A sefarosa CL-4B (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). La especificidad de los anticuerpos purificados se verificó mediante transferencia Western de lisados derivados de transfectantes HEK293T huDkk3 o células HEK293T transfectadas de forma simulada y citometría de flujo intracelular mediante el uso de las mismas líneas celulares. Según lo revelado por el ensayo de inhibición de la unión competitiva, los tres anticuerpos monoclonales reconocen diferentes epítopos en la molécula huDkk3.
Las líneas celulares de hibridoma huDkk3-2.13, huDkk3-16.1 y huDkk3-24.20 se depositaron (entidad depositante: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) - Stiftung offentlichen Rechts, Heidelberg, Alemania) en el Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlmenung von Mikrokro en 38124 Braunschweig, Alemania el 8 de septiembre de 2015 con los números de depósito DSM ACC3275, DSM ACC3274 y DSM ACC3276, respectivamente.
Ejemplo 2: Establecimiento de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la detección mejorada de huDkk3 en orina
En un método preferido, para el análisis de la proteína huDkk3, se analizaron muestras de orina humana mediante el uso de un método basado en ELISA. La placa de ensayo flexible Micro Test III (BD Falcon #353912, BD Biosciences, Estados Unidos) se usó como placa de muestra.
Aunque podrían usarse otros kits de ELISA humanos de Dkk3 (por ejemplo, de Creative Diagnostics, Estados Unidos; o de Antibodies-online Inc., Estados Unidos), se encontró que la sensibilidad y la especificidad de los anticuerpos monoclonales huDkk 3 recombinantes recién producidos (ver Ejemplo 1) fueron superiores después del ajuste a las condiciones en las muestras de orina. Las muestras de orina se usaron sin diluir o las muestras se diluyeron adicionalmente en PBS-Tween.
Como ya se mencionó, aunque se encuentran disponibles otros kits de ELISA humanos de Dkk3 (por ejemplo, de Creative Diagnostics, Estados Unidos; o de Antibodies-online Inc., Estados Unidos), los tres anticuerpos monoclonales huDkk recién producidos tienen propiedades superiores, porque proporcionan una reproducibilidad de 100 % en el (los) ensayo(s), y de ese modo evitar variaciones en la sensibilidad y especificidad, a medida que se introducen, por ejemplo, mediante el uso de antisueros de diferentes animales. Adicionalmente, el uso combinado de 2 o de los 3 anticuerpos mejora aún más los ensayos, ya que se descubrió que reconocen (se unen a) diferentes epítopos de DKK3, lo que hace que el ensayo sea aún más robusto, en particular en un entorno de alto rendimiento.
Tampones
PBS pH 7,2
Na2HPO4 x 2 H2O 8,1 mM
K2H2PO41,5 mM
KCl 2,6 mM
NaCl 137 mM
PB S-Tween
PBS 0,05 % Tween 20
Tampón de sustrato pH 6,0
KH2 PO40,1 M
Gelatina al 0,2 % en PBS con NaN3 al 0,1 %
H2SO42 M
Recubrimiento: Anticuerpo monoclonal huDkk3-16.1 (1 mg/ml)
Conjugados: Anticuerpos monoclonales biotinilados huDkk3-2.13 y huDkk3-24.20
(1 mg/ml)
Estreptavidina-peroxidasa (#016-030-084, Dianova)
Sustrato: Ortofenilendiamina (OPD, Sigma); H2O2 (3 %) (Perhydrol, Merck)
Proteína de calibración: Proteína Dkk3 humana recombinante (1118-DK; R&D Systems, Estados Unidos) Equipamiento: Pipeta de 8 canales Titertek
Puntas y pipetas Eppendorf
Pipeta Vaccu-Pette de 96 canales para placas de microtitulación, Neo-Lab) Titertek Multiscan Plus MKII (fotómetro ELISA)
Para el recubrimiento, la placa se incubó durante la noche a 4 °C con 100 ng de anticuerpo monoclonal huDkk3-16.1 en PBS en 100 pl por pocillo.
Después, las placas se lavaron al invertir las placas y aplicar aproximadamente 200 pl de PBS-Tween (0,05 % de Tween 20 en PBS). Después de la segunda etapa de lavado, se eliminó la mayor cantidad de líquido posible. Para el bloqueo, se introdujeron en cada pocillo 200 pl de gelatina al 0,2 % en PBS más azida sódica al 0,1 %, seguido de incubación durante 1 hora a 37 °C. Las placas recubiertas se almacenaron hasta su uso a 4 °C (el almacenamiento es posible durante varios meses, pero debe evitarse el secado).
Para el control positivo, se emplearon diluciones en serie de la proteína huDkk3 recombinante con el fin de preparar una curva de calibración (estándar). Las muestras se prepararon en PBS Tween, se añadieron 100 pl a cada pocillo.
Proteína de calibración: huDkk3 recombinante; dilución en serie de 0,5 a 32 ng/ml
Muestras de prueba: cuatro diluciones 1:50; 1:100; 1:500; y 1:1000
Incubación: 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 4 lavados con PBS-Tween como se describió anteriormente
Después de eliminar el tampón de bloqueo, se tomaron con pipeta muestras de orina en la placa de ensayo a un volumen de 100 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las placas se lavaron 4 veces con PB S-Tween y se añadieron 100 pl/pocillo de una mezcla 1:1 de anticuerpos monoclonales biotinilados huDkk3-2.13 y huDkk3-24.20 a una concentración final de 2 pg/ml cada uno, durante otra hora a temperatura ambiente. Después de 4 lavados, se añadieron 100 pl/pocillo de estreptavidina-peroxidasa diluida 1:2000 en PBS-Tween durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de otros 4 ciclos de lavado se obtuvo una reacción de sustrato al pesar en ortofenilendiamina (OPD) con disolución completa en tampón de fosfato de hidrógeno de sodio 100 mM (a una concentración de 1 mg/ml) que contenía peróxido (H2O2) al 0,03 %. Después de la posterior agitación, se añadieron rápidamente a cada pocillo 100 pl de solución de sustrato. La placa se cubrió para proteger las reacciones de la luz.
La reacción de color se detuvo después de aproximadamente 1-10 minutos mediante la adición de 50 pl de ácido sulfúrico 2 M (H2SO4) por pocillo.
Finalmente, las reacciones se midieron mediante análisis fotométrico en un fotómetro Multiscan Plus MKII con densidades ópticas a 492 nm (DO492). Primero, se generó la curva de calibración para huDkk3. Todas las concentraciones de las muestras se determinaron con referencia a dicha curva, y la concentración real de proteína se calculó por multiplicación con el factor de dilución respectivo.
Ejemplo 3: análisis de expresión de Dkk3 en un modelo de ratón
Con el uso de la tecnología transgénica estándar en ratones, se produjeron ratones indicadores que contenían construcciones Dkk3 transgénicas, donde el promotor Dkk3 estaba ligado a la proteína marcadora de fluorescencia verde (GFP) que proporciona una señal fluorescente cuando se expresa. Dado que la fisiología del riñón en ratones es comparable a la de los riñones humanos, se espera que la expresión en ratones sea idéntica a la de los humanos. Se encontró que Dkk3 se expresaba exclusivamente en el epitelio de los túbulos renales (ver Figura 4).
Ejemplo 4: Análisis de Dkk3 en la orina de adultos con enfermedades renales
Con el uso del ensayo descrito anteriormente, se detectaron cantidades significativas de Dkk3 en la orina de adultos que tenían diferentes tipos de enfermedad renal y se sometían a biopsia renal. Los resultados como se muestran en la siguiente Tabla 1 muestran un aumento de Dkk3 en la orina de pacientes con mayor porcentaje/grado de IF/TA renal, lo que indica una lesión renal más grave. FSGS = esclerosis focal-segmentaria.
Tabla 1: aumento de Dkk3 en orina de pacientes con mayor porcentaje/grado de IF/TA renal. FSGS = esclerosis focal-segmentaria.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1 Un método in vitro para indicar la presencia de fibrosis intersticial y atrofia tubular (IF/TA) renal, que comprende las etapas dea) detectar la cantidad de proteína Dickkopf 3 (Dkk3) y/o aductos de la misma en una muestra de orina obtenida de un paciente mamífero a diagnosticar, yb) llegar a una conclusión sobre la extensión de la IF/TA renal de dicho paciente,en donde una mayor cantidad de proteína Dkk3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparación con la cantidad detectada en una muestra de orina de un paciente sano es indicativa de IF/TA renal de grado superior, yen donde dicha detección comprende el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, en donde dicho anticuerpo monoclonal es el que se produce por huDkk3-16.1, huDkk3-2.13 o huDkk3-24.20, líneas celulares de hibridoma, depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 8 de septiembre de 2015 en DSMZ en Braunschweig, Alemania con el número de depósito DSM ACC3274, Ds M ACC3275 y DSM ACC3276, respectivamente.
- 2. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además llegar a una conclusión sobre el progreso de dicha IF/TA renal en dicho paciente, en donde en la etapa b) una mayor cantidad de proteína Dkk3 y/o aductos de la misma en dicha muestra en comparación con una cantidad en una muestra anterior de dicho paciente es indicativa de IF/TA renal progresiva.
- 3. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha detección comprende un método seleccionado del grupo de espectrometría de masas, cromatografía, electroforesis en gel de SDS y reacciones antígeno/anticuerpo, tales como, por ejemplo, transferencias Western y/o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
- 4. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho paciente es un niño o adolescente.
- 5. Uso in vitro del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo como se define en la reivindicación 1 para detectar la cantidad de proteína Dickkopf 3 (Dkk3) y/o aductos de la misma en una muestra de orina de mamífero para indicar la presencia y/o monitorizar la IF/TA renal progresiva en un paciente mamífero.
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