ES2272261T3 - Anticuerpos especificos para cyp1b1. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de un anticuerpo que se une específicamente al citocromo P450 CYP1B1, comprendiendo el procedimiento raising inducir el anticuerpo utilizando un péptido que consiste en una secuencia de aminoacídica aminoácidos VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKGDGy, donde x es D o N e y es L o F, o un fragmento antigénico de la misma.
Description
Anticuerpos específicos para CYP1B1.
La presente invención se refiere al diagnóstico
y terapia de tumores y en particular a anticuerpos específicos del
citocromo P450 CYP1B1 específico tumoral.
El citocromo P450 (P450) CYP1B1 es el único
miembro conocido de una subfamilia recientemente identificada de la
familia de genes CYP1. El CYP1B1 humano fue aislado originalmente de
una línea celular de queratinocitos tratados con dioxina (Sutter
et al., 1994) como parte de una serie de investigaciones
llevadas a cabo para identificar la expresión diferencial de genes
causada por la exposición a dioxina. El gen CYP1B1 humano se
localiza en el cromosoma 2p22-21 abarcando 12 kb y
está compuesto por tres exones y dos intrones (Tang et al.,
1996). El ARNm es de 5,2 kb y codifica para una proteína de 543
aminoácidos (Sutter et al., 1994). Este es el gen de P450
humano más grande que se conoce tanto en términos de tamaño de ARNm
como en número de aminoácidos y también es estructuralmente el más
simple. El análisis tanto de la secuencia de ácido nucleico como de
aminoácidos muestra que CYP1B1 presenta únicamente el 40% de
homología aproximadamente con CYP1A1 y CYP1A2. El bajo grado de
similitud con miembros existentes de la familia CYP1 resultó en que
este P450 fuera asignado como una nueva subfamilia de CYP1 CYP1B la
cual hasta la fecha solo contiene el único miembro CYP1B1. De hecho,
estudios de hibridación de ADN humanos sugieren que únicamente
existe un único miembro de la familia de genes CYP1B (Sutter et
al., 1994). El gen CYP1B1 se activa transcripcionalmente
mediante ligandos del receptor Ah que incluyen hidrocarburos
aromáticos planos (Sutter et al., 1994, Hakkola et
al., 1997) y el más potente de estos agonistas del receptor Ah
para inducir la transcripción del gen de CYP1B1 parece ser la
dioxina (Hakkola et al., 1997).
Recientemente han sido aisladas formas ortólogas
de este P450 a partir de una línea celular inducida con
benzantraceno derivada de fibroblastos de embriones de ratón (Savas
et al., 1994; Shen et al., 1994) y de la corteza
adrenal de rata adulta (Bhattacharyya et al., 1995; Walker
et al., 1995). A pesar de que existe un grado elevado de
homología de secuencia (superior al 80%) tanto de ácido nucleico
como de aminoácidos entre las formas de CYP1B1 humana, de ratón y
rata, parecen considerables las diferencias entre especies respecto
a la expresión específica en tejido, regulación y especificidad
metabólica de CYP1B1 (Savas et al., 1994; Sutter et
al., 1994; Bhattacharyya et al., 1995; Savas et
al., 1997).
El cáncer más común que afecta a las mujeres es
el cáncer de mama y es un tumor dependiente de estrógeno. El CYP1B1
humano expresado en levadura (S. cerevisiae) muestra una
actividad específica elevada para la 4-hidroxilación
del 17\beta-estradiol (Hayes et al., 1996)
convirtiéndolo en el 4-hidroxiestradiol y, de hecho,
el CYP1B1 humano se considera que es la
4-hidroxilasa más eficiente del
17\beta-estradiol. Por el contrario, el CYP1B1 de
ratón no parece actuar como una hidroxilasa del estradiol (Savas
et al., 1997) indicando las diferencias entre especies en la
capacidad metabólica de CYP1B1. Liehr y Ricci (1996) demostraron
que existe un nivel significativo de
4-hidroxilación del
17\beta-estradiol en microsomas de cáncer de mama.
Ellos demostraron que la 4-hidroxilación del
17\beta-estradiol era considerablemente superior
en microsomas preparados a partir de cáncer de mama comparado con
únicamente un nivel muy bajo de 4-hidroxilación
presente en el tejido normal de mama. Tanto la proteína
inmunorreactiva CYP1B1 (Murray et al., 1997) como el ARNm de
CYP1B1 (McKay et al., 1995) han sido identificados en el
cáncer de mama lo que indica que CYP1B1 es una forma principal del
citocromo P450 expresado en el cáncer de mama.
Los estudios inmunohistoquímicos iniciales de
CYP1B1 en Murray et al. (1997) demostraron una expresión
intensificada de CYP1B1 en diversos tipos de cáncer humano,
incluyendo el cáncer de mama y se llevaron a cabo utilizando un
anticuerpo policlonal para CYP1B1. La presente invención se refiere
a desarrollos adicionales en este área y concierne a anticuerpos
adicionales específicos de CYP1B1 humano y, en particular, a
anticuerpos monoclonales obteninduciidos utilizando péptidos
sintéticos como inmunógenos basados en la secuencia de aminoácidos
de CYP1B1. El trabajo descrito en el presente documento indica las
utilizaciones de anticuerpos en inmunohistoquímica y en la
investigación de la expresión de CYP1B1 mediante inmunohistoquímica
en una serie de cánceres de mama humanos primarios.
De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona un procedimiento de preparación de
un anticuerpo que se une específicamente al citocromo P450 CYP1B1,
comprendiendo el procedimiento raising inducir el anticuerpo
utilizando un péptido que consiste en una secuencia aminoacídica
VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y es L o F, o
un fragmento antigénico de la misma.
De manera típica, los fragmentos antigénicos
contenidos en estas secuencias peptídicas consisten en 3 a 10
aminoácidos y más típicamente de 3 a 6 aminoácidos.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo
teniendo obtenido un hibridoma mediante el procedimiento de más
arriba, comprendiendo el procedimiento cultivar un hibridoma
productor del anticuerpo y aislar el anticuerpo así producido. El
procedimiento puede comprender la etapa adicional de conjugar el
anticuerpo a una unidad efectora como una etiqueta, una toxina, un
fármaco o una molécula de transporte.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente al
citocromo P450 CYP1B1, en donde el anticuerpo reconoce un epítopo en
la proteína del citocromo P450 CYP1B1 incluido en la secuencia de
aminoácidos VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y
es L o F.
Preferiblemente, el anticuerpo reconoce un
epítopo de entre 3 y 10 aminoácidos de las secuencias aminoacídicas
y más preferiblemente un epítopo de entre 3 y 6 aminoácidos de las
secuencias aminoacídicas.
Anticuerpos preferidos son los anticuerpos
monoclonales, obtenibles por ejemplo mediante:
(a) inmunizar un animal con el péptido conjugado
a un portador inmunogénico;
(b) sacrificar el animal y fusionar las células
de bazo obtenidas del animal con células de mieloma para producir
uno o más hibridomas; y
(c) cribar hibridomas para anticuerpos capaces
de unirse al péptido.
Los anticuerpos se pueden conjugar a un efector,
tal como una etiqueta, una toxina, un fármaco, un profármaco, un
enzima o una molécula de transporte.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona los anticuerpos de más arriba para utilizar en un
método de tratamiento médico.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona la utilización de estos anticuerpos para la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona un péptido que consiste esencialmente en la secuencia
de aminoácidos VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e
y es L o F.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona un método de ensayo para detectar células cancerígenas
presentes en una muestra de un paciente, comprendiendo el método
poner en contacto la muestra de tejido de un paciente con uno de
los anticuerpos de arriba y detectar la unión del anticuerpo a la
proteína CYP1B1 presente en la muestra como una indicación de la
presencia de células cancerígenas en la muestra de tejido.
Por ejemplo, la etapa de detección de la unión
de anticuerpo a la proteína CYP1B1 se lleva a cabo utilizando un
ensayo de captura de anticuerpo, un ensayo sándwich con dos
anticuerpos o un ensayo de captura de antígeno.
Preferiblemente, el método se utiliza para
ayudar en el diagnóstico o pronóstico del cáncer de mama, cáncer
colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de hígado o cáncer de
ovarios.
Varios aspectos y realizaciones adicionales de
la presente invención serán en parte evidentes para aquellos
expertos en la materia en vista de la presente descripción. Ciertos
aspectos y realizaciones de la invención serán ahora ilustrados
mediante ejemplos y con referencia a las siguientes figuras.
Figura 1: Inmunotransferencia del CYP1B1
expresado con anticuerpo monoclonal (5D3) que demuestra
especificidad por CYP1B1. Línea 1, CYP1B1 expresado (10 \mug de
proteína microsomal, 0,86 pmoles de CYP1B1); línea 2, CYP1A1
expresada (10 \mug de proteína microsomal, 0,53 pmoles de CYP1A1);
línea 3, microsomas control de linfoblastoides que contienen
únicamente el vector (10 \mug de proteína microsomal) y línea 4,
microsomas de hígado humano normal (10 \mug de proteína
microsomal). Los marcadores de peso molecular se muestran a la
derecha en kiloDaltons.
Figura 2: inmunotransferencia que demuestra la
cantidad mínima detectable de CYP1B1 utilizando el anticuerpo
monoclonal 5D3. Línea 1 a línea 6 cantidades decrecientes de CYP1B1
expresado. Línea 1, 0,86 pmoles de CYP1B1; línea 2, 0,43 pmoles de
CYP1B1; línea 3, 0,21 pmoles de CYP1B1; línea 4, 0,1 pmoles de
CYP1B1; línea 5, 0,05 pmoles de CYP1B1 y línea 6, 0,025 pmoles de
CYP1B1. Los marcadores de peso molecular se muestran a la derecha
en kiloDaltons.
Figura 3: Inmunotransferencia de microsomas de
CYP1B1 preparados a partir de varios tejidos humanos normales.
Línea 1, CYP1B1 expresado (10 \mug de proteína microsomal
correspondiente a 0,86 pmoles de CYP1B1); línea 2, hígado; línea 3,
riñón; línea 4, pulmón; línea 5, páncreas; línea 6, corteza adrenal;
línea 7, cerebro (médula); línea 8, estómago; línea 9, yeyuno;
línea 10, colon; línea 11, pecho y línea 12, ovario (30 \mug de
proteína microsomal cargada por línea de tejido humano normal). Los
marcadores de peso molecular se muestran a la derecha en
kiloDaltons.
Figura 4: Demostración inmunohistoquímica de
CYP1B1 en cáncer de mama utilizando el anticuerpo monoclonal 5D3,
A. Localización de CYP1B1 en un carcinoma invasivo ductal de grado
3. Existe una inmunorreactividad fuerte en células tumorales, B.
Localización de CYP1B1 en un carcinoma lobular invasivo que
demuestra una fuerte inmunorreactividad en células de cáncer de
mama y C. No existe inmunorreactividad en un carcinoma ductal
invasivo de grado 3 cuando el anticuerpo monoclonal primario de
CYP1B1 se sustituye por TBS en el procedimiento inmunohistoquímico.
La escala de barras representa 60 \mum.
En base a la descripción proporcionada en el
presente documento, la persona experta puede obtener más
anticuerpos que sean capaces de unirse específicamente a CYP1B1
utilizando técnicas que son estándar en el estado de la técnica.
Procedimientos de producción de anticuerpos incluyen la inmunización
de un mamífero (p.e. ratón, rata, conejo, cabra, oveja o mono) con
la proteína o un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden
obtener de los animales inmunizados utilizando cualquiera de las
técnicas conocidas en el estado de la técnica y cribar,
preferiblemente utilizando la unión de anticuerpo a antígeno de
interés. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de transferencia
Western o inmunoprecipitación (Amitage et al., Nature 357:
80-82, 1992). Se puede acompañar el aislamiento de
anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos procedentes del
animal de una etapa de sacrificio del animal.
Como alternativa o complemento a la inmunización
de un mamífero con un péptido, tal y como se muestra en los
ejemplos, se puede obtener un anticuerpo específico para una
proteína a partir de una librería producida de manera recombinante
de dominios variables de inmunoglobulinas expresados, utilizando,
p.e., el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso que
presentan dominios de unión a inmunoglobulina funcionales en su
superficie; por ejemplo, véase WO92/01047. La librería puede ser
naive que significa construida a partir de secuencias obtenidas de
un organismo que no ha sido inmunizado con ninguna de las proteínas
(o fragmentos) o puede ser una construida utilizando secuencias
obtenidas a partir de un organismo que ha sido expuesto al antígeno
de interés.
En la presente solicitud, el término
"anticuerpo" se define como que engloba cualquier sustancia de
unión que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida,
a saber, la propiedad de unirse específicamente a CYP1B1 y que
preferiblemente no se une sustancialmente a proteínas relacionadas
tales como CYP1A1 y CYP1A2 que comparten aproximadamente el 40% de
homología con CYP1B1 o a proteínas no relacionadas. El término
"anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo, derivados,
equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo
moléculas sintéticas y moléculas cuya forma mimetiza la de un
anticuerpo capaz de unirse a un antígeno o epítopo.
Preferiblemente, los anticuerpos se unen a un epítopo en las
secuencias de aminoácidos del péptido D o E, tales epítopos
consistiendo en 3 a 10, y más preferiblemente en 3 a 6 aminoácidos.
Los anticuerpos preferidos se unen a CYP1B1 con una afinidad de
unión superior a 10^{-6}, más preferiblemente superior a 10^{-8}
mol^{-1}, según se determina por el análisis de Scatchard (véase
Antibodies, A Laboratory Manual, ed. Harlow and Lane, Cold Spring
Harbor, 1988).
Ejemplos de fragmentos de anticuerpos que son
capaces de unirse a antígeno u otro patrón de unión son el
fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, Cl y CH1; el
fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; el fragmento Fv
que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un
anticuerpo; el fragmento dAb que consiste en un dominio VH;
regiones CDR aisladas y fragmentos F(ab’)_{2}, un fragmento
bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos mediante un puente
disulfuro en la región bisagra. Están también incluidos los
fragmentos Fv de cadena sencilla también están incluidos.
Se puede someter a mutación genética o a otros
cambios un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la presente invención. Será entendido además por
aquellos expertos en la materia que un anticuerpo monoclonal se
puede someter a las técnicas de tecnología de ADN recombinante para
producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retengan la
especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden
implicar la introducción de ADN codificante de la región variable
de inmunoglobulina o regiones de determinación complementarias
(CDRs) de un anticuerpo a las regiones constantes, o las regiones
constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina
diferente. Véase, por ejemplo, EP 0 184 187 A, GB 2 188 638 A o EP
0 239 400 A. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se
describen en EP 0 120 694 A y EP 0 125 023.
En una realización, los anticuerpos de la
invención están humanizados. Formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (p.e. murina) son las inmunoglobulinas quiméricas, cadenas
de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab,
Fab’, F(ab)’_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno
de anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivadas de una
inmunoglobulina no humana. Anticuerpos humanizados incluyen las
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que los
residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del
receptor se sustituyen por residuos de un CDR de una especie no
humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene
la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
los residuos de la estructura de Fv de la inmunoglobulina humana se
sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Los
anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se
encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en
las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente
dos, dominios variables en las que toda o sustancialmente todas las
regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humanizada
y todo o sustancialmente todo de las regiones FR son las de una
secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado óptimamente también comprenderá al menos un fragmento de
una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una
inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Jones et al.,
Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann et
al., Nature, 332: 323-329, 1988; y Presta, Curr
Op Struct Biol., 2: 593-596, 1992.
Los métodos de humanización de anticuerpos no
humanos son bien conocidos en el estado de la técnica.
Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos
aminoacídicos introducidos procedentes de una fuente que es no
humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos a menudo son
referidos como residuos "importados" que son habitualmente
cogidos de un dominio variable "importado". La humanización se
puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento
descrito en Jones et al., Nature, 321:
522-525, 1986; Riechmann et al., Nature,
332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al.,
Science, 239: 1534-1536, 1988 sustituyendo los CDRs
de roedor o las secuencias CDR por las correspondientes secuencias
de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, dichos anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US Nº
4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable
humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia
de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos
humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos
de los residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son
sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en
anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen
especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En
el presente caso, una de las especificidades de unión es para el
CYP1B1, la otra es para cualquier otro antígeno. Son conocidos en el
estado de la técnica métodos de preparación de anticuerpos
biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de
anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión
de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina
donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes,
véase Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539,
1983. Debido a la variedad aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de
inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla
potencial de diez moléculas de anticuerpos diferentes de las que
sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación
de la molécula correcta se lleva a cabo, habitualmente, mediante
etapas de cromatografía de afinidad.
Se proporcionan hibridomas capaces de producir
anticuerpos con las características de unión deseadas, como son
células hospedadoras, eucariotas o procariotas, que contienen ácido
nucleico codificante de anticuerpos (incluyendo fragmentos de
anticuerpos) y capaces de su expresión. La invención también
proporciona métodos de producción de los anticuerpos que incluyen
hacer crecer una célula capaz de producir el anticuerpo en
condiciones en las que se produce, y preferiblemente se secreta, el
anticuerpo.
Los anticuerpos de la invención se pueden
acoplar o conjugar a una unidad efectora tal como una etiqueta, una
toxina, un fármaco o molécula de transporte, utilizando técnicas
bien conocidas en el estado de la técnica. Para usos en
diagnóstico, los anticuerpos se unen habitualmente a una etiqueta.
Las reactividades de los anticuerpos en una muestra se pueden
determinar mediante cualquier medio adecuado. Etiquetando con
moléculas reporteras individuales es una posibilidad. Las moléculas
reporteras pueden generar de manera directa o indirecta señales
detectables y preferiblemente ponderables. La unión de moléculas
reporteras puede ser directa o indirecta, de manera covalente,
p.e., mediante un enlace peptídico, o no covalente. La unión
mediante un enlace peptídico puede ser el resultado de la expresión
recombinante de una fusión de genes que codifique un anticuerpo y
una molécula reportera.
Una manera favorita es mediante la unión
covalente de cada anticuerpo con un fluorocromo, fósforo o
colorante láser con características de absorción o emisión
espectralmente aisladas. Fluorocromos específicos incluyen
fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Colorantes
cromogénicos adecuados incluyen la diaminobenzidina.
Otros reporteros incluyen partículas coloidales
macromoleculares o material particulado tal como perlas de látex
que están coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes
biológicamente o químicamente activos que pueden causar de manera
directa o indirecta señales detectables a ser observadas
visualmente, detectadas electrónicamente o recogidas de otra
manera. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones
que desarrollan o cambian de color o causan cambios en las
propiedades eléctricas, por ejemplo. Estos pueden ser excitables
molecularmente, tal como transiciones electrónicas entre estados de
energía que resultan en absorciones o emisiones espectrales
características. Estos pueden incluir entidades químicas utilizadas
junto con biosensores. Se puede utilizar sistemas de detección
biotina/avidina o biotina/estreptavidina o fosfatasa alcalina.
Métodos para determinar la presencia o cantidad
de un marcador tal como CYP1B1 en una muestra de un individuo son
bien conocidos en el estado de la técnica y el experto en la materia
los adapta fácilmente para utilizar los anticuerpos descritos en el
presente documento como agentes de unión y/o agentes de desarrollo,
p.e., ayudar en la determinación de la presencia o cantidad de
CYP1B1 en un ensayo. Los resultados de estos ensayos pueden a la
vez permitir al médico determinar si un paciente sufre de una
enfermedad o el riesgo a desarrollar una enfermedad asociada con la
expresión de CYP1B1 (ya sea por sobre-expresión o
expresión reducida) tal como el cáncer. Los resultados del ensayo
pueden, a la vez, permitir al médico optimizar el tratamiento de
las enfermedades, proporcionar un tratamiento terapéutico y/o
profiláctico adecuado, permitir racionalizar (en inglés
"stream-lining") el tratamiento
dirigiéndolo a aquellos que más probablemente se beneficien.
\newpage
En realizaciones preferidas, la presencia o
cantidad de CYP1B1 se utiliza en el diagnóstico del cáncer y
especialmente cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer
colorrectal, cáncer de hígado o cáncer de ovario.
Los métodos habitualmente utilizan una muestra
biológica procedente de un paciente tal como sangre, suero, tejido,
suero, orina u otro fluido corporal adecuado. Una muestra de
paciente preferida es el tejido seleccionado de vejiga, cerebro,
pecho, colon, tejido conectivo, riñón, pulmón, nódulo linfático,
esófago, ovario, piel, estómago, testículos y uretra.
Los anticuerpos se pueden utilizar como agentes
de unión por tener sitios de unión capaces de unirse
específicamente a CYP1B1 con preferencia respecto a otras moléculas.
En algunos formatos de ensayos, los agentes de unión se inmovilizan
en un soporte sólido, e.g., en localizaciones definidas, separadas
espacialmente, para hacer fácil la manipulación durante el ensayo.
La muestra está generalmente en contacto con el/los agente(s)
de unión en condiciones adecuadas que permitan al analito en la
muestra unirse a/los agente(s) de unión. La ocupación
fraccional de los sitios de unión de/los agente(s) de unión
se puede determinar, a continuación, bien mediante etiquetado
directo o indirecto del analito o bien utilizando un agente o
agentes de desarrollo para llegar a una indicación de la presencia
o cantidad del analito en la muestra.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la
invención se pueden utilizar como agentes de desarrollo para
detectar CYP1B1 en muestras biológicas mediante etiquetado directo o
indirecto de los anticuerpos, p.e., con etiquetas radioactivas,
fluorescentes o enzimáticas, tales como la peroxidasa de rábano de
manera que se puedan detectar utilizando técnicas bien conocidas en
el estado de la técnica. Los agentes de desarrollo etiquetados
directamente tienen una etiqueta asociada con o acoplada al agente.
Los agentes de desarrollo etiquetados indirectamente pueden ser
capaces de unirse a especies etiquetadas (p.e. un anticuerpo
etiquetado capaz de unirse al agente de desarrollo) o pueden actuar
sobre otras especies para producir un resultado detectable. De esta
manera, las etiquetas radioactivas se pueden detectar utilizando un
contador de centelleo u otro dispositivo contador de radiación, las
etiquetas fluorescentes utilizando un láser y microcospio confocal y
etiquetas de enzima mediante la acción de una etiqueta enzimática
en un sustrato, para producir típicamente un cambio de color. En
realizaciones adicionales, el agente de desarrollo se marca para
permitir su detección, p.e., unido a una secuencia nucleotídica que
se pueda amplificar en una reacción de PCR para detectar el analito.
Otras etiquetas conocidas para aquellos expertos en la materia se
discuten más abajo. El/los agente(s) de desarrollo se pueden
utilizar en un método competitivo en el que el agente de desarrollo
compite con el analito para ocupar los sitios de unión del agente
de unión, o un método no competitivo en el que el agente de
desarrollo etiquetado se une al analito unido mediante el agente de
unión o ocupando los sitios de unión. Ambos métodos proporcionan
una indicación del número de sitios de unión ocupados por al analito
y, de esta manera, la concentración del analito en la muestra,
p.e., mediante comparación con estándares obtenidos utilizando
muestras que contienen concentraciones conocidas del analito. En
realizaciones alternativas, el analito se puede etiquetar antes de
aplicarlo al soporte que comprende el agente de unión.
Los anticuerpos de la invención se pueden
formular en composiciones para el uso diagnóstico o terapéutico. En
este caso, los anticuerpos se proporcionan en una forma aislada y/o
purificada y están presentes típicamente en las composiciones como
al menos aproximadamente el 90% de ingrediente activo, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 98%. Dicha composición
puede, sin embargo, incluir materiales portadores inertes u otros
excipientes farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables. Como
se indica más abajo, una composición de acuerdo con la presente
invención puede incluir, junto con el anticuerpo como se ha
descrito, una o más moléculas de uso terapéutico, tal como un agente
antitumoral. En una realización preferida, los anticuerpos se unen
a efectores que son fármacos o profármacos antitumorales para
dirigir al efector a células que expresan CYP1B1.
Un anticuerpo de la invención que sea dado como
administración individual es preferiblemente una "cantidad
profilácticamente efectiva" o una "cantidad terapéuticamente
efectiva" (según pueda ser el caso, a pesar de que la profilaxis
se pueda considerar terapia), ésta siendo suficiente para mostrar un
beneficio en un individuo. La cantidad actual administrada y la
velocidad y transcurso de la administración dependerán de la
naturaleza y severidad de lo que sea tratado. La prescripción del
tratamiento, p.e. decisiones sobre dosificación, etc está dentro de
la responsabilidad del médico general y otros doctores en
medicina.
Una composición se puede administrar sola o en
combinación con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o
secuencial dependiendo de la condición a ser tratada.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la presente invención, y para utilizar de acuerdo con la presente
invención, pueden incluir junto con el ingrediente activo, un
excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales
farmacéuticamente aceptables bien conocidos para aquellos expertos
en la materia. Dichos materiales no deberían ser tóxicos y no
deberían de interferir en la eficacia del ingrediente activo. La
naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la
ruta de administración, la cual puede ser oral o mediante
inyección, por ejemplo cutánea, subcutánea o intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas,
polvo o líquida. Un comprimido puede incluir un portador sólido tal
como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas
líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como agua,
petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite
sintético. Se puede incluir una solución salina fisiológica,
dextrosa u otra solución sacárida o glicoles como el etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o
subcutánea o la inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente
activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente
aceptable que está libre de pirógeno y tiene un pH, isotonocidad y
estabilidad adecuados. Aquellos con experiencia relevante serán
capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo,
vehículos isotónicos como cloruro de sodio para inyección, inyección
de Ringer, inyección de Ringer lactato. Conservantes,
estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos se
pueden incluir cuando se requieran.
Ejemplos de técnicas y protocolos mencionados
más arriba se pueden encontrar en Remingotn’s Pharmaceutical
Sciences, 16th Edition, Osol, A. (ed), 1980.
El agente se puede administrar de una manera
localizada en un sitio tumoral u otro sitio deseado o se puede
liberar de manera que se dirija al tumor u otras células.
Los anticuerpos de la invención se puede
utilizar en terapia diana para células o áreas del cuerpo donde
CYP1B1 se exprese. Las terapias de dirección se pueden utilizar para
liberar el agente activo, ya sean fármacos o profármacos, más
específicamente a células que expresan o exhiben CYP1B1. La
dirección puede ser deseable por varias razones, por ejemplo si el
agente es inaceptablemente tóxico o si sería requerido de otra
manera a una dosis demasiado alta o si por el contrario no fuera
capaz de entrar en las células diana. El agente se puede
administrar en una forma precursora, para la conversión a la forma
activa mediante un agente de activación producido, o dirigido a,
las células a ser tratadas. Este tipo de aproximación es conocido
algunas veces como ADEPT, implicando dirigir el agente de
activación a las células mediante conjugación a un anticuerpo de
células específicas de la invención.
En base a una combinación de modelación de
homología estructural y alineación de secuencia de la secuencia
aminoacídica de CYP1B1 humana con las secuencias aminoacídicas de
CYP1A1 y CYP1A2, se predijo un fragmento de 148 aminoácidos
localizado en el tercer C-terminal de la proteína
CYP1B1 que contenía regiones de aminoácidos que serían localizados
en el aspecto externo de la proteína CYP1B1. Se sintetizaron
péptidos de 14 o 15 residuos aminoacídicos correspondientes a este
segmento de la proteína CYP1B1 en la Facility Protein de la
Universidad de Aberdeen. Las secuencias peptídicas individuales y
la localización en la proteína CYP1B1 se muestran en la Tabla 1. La
columna de la derecha indica los fragmentos peptídicos que producían
una reacción inmune (péptidos D y E).
| A | NLPYVLAFLYEAMRF | 377-391 | - |
| B | SSFVPVTIPHATTAN | 392-406 | - |
| C | TSVLGYHIPKDTVVF | 407-421 | - |
| D | VNQWSVNHDPVKWPN | 422-436 | + |
| E | PENFDPARFLDKDGL | 437-451 | + |
| F | INKDLTSRVMIFSVG | 452-466 | - |
| G | KRRCIGEELSKMQLF | 467-481 | - |
| H | LFISILAHQCDFRAN | 482-496 | - |
| I | PNEPAKMNFSYGLT | 497-510 | - |
| J | IKPKSFKVNVTLRE | 511-524 | - |
Los péptidos individuales se conjugaron a
continuación a ovoalbúmina utilizando glutaraldehido tal y como se
había descrito anteriormente (Duncan et al., 1992) y cada
péptido conjugado se utilizó como inmunógeno. Los conjugados
peptídicos individuales mezclados con adyuvante incompleto de Freund
se inyectaron i.p. a ratones BALB/c y se volvieron a inmunizar los
ratones con el mismo péptido conjugado 2-4 semanas
después de la inmunización inicial. Se determinó la presencia de
una respuesta inmune a cada conjugado peptídico determinando en el
suero (obtenido 10 días después de de la segunda inmunización) de
cada ratón el reconocimiento de CYP1B1 expresado mediante
inmunotransferencia. Se dio una inmunización final a los ratones
cuyo suero dio el mejor reconocimiento de CYP1B1 con el conjugado
peptídico adecuado y se utilizó para la producción de anticuerpos
monoclonales.
Cuatro días después de la inmunización final con
el conjugado peptídico se sacrificaron los ratones, se aislaron sus
bazos y las células del bazo se fusionaron con células de mieloma de
ratón (Ag8.653). Los clones de hibridoma resultantes se cribaron, a
continuación, por la producción de anticuerpos mediante inmunoensayo
ligado a enzima (ELISA) utilizando el conjugado peptídico relevante
con albúmina de suero bovino (BSA). Los conjugados a BSA se unieron
a una placa de ELISA mediante incubación durante toda la noche a 4ºC
en un tampón de carbonato/bicarbonato de sodio, pH 9,6 y se llevó a
cabo el ELISA según se ha descrito previamente (Duncan et
al., 1992, Murray et al., 1998b). Los clones de hibridoma
que se fueron fuertemente positivos mediante ELISA se subclonaron
dos veces y se ensayaron otra vez mediante inmunotransferencia
utilizando el CYP1B1 expresado, el CYP1A1 expresado, microsomas
control y microsomas de hígado humano. Se determinó el isotipo de
los anticuerpos monoclonales utilizando un kit Isostrip (Roche
Diagnostics, Lewes, Sussex, UK) que se llevó a cabo de acuerdo con
la instrucciones del fabricante.
Se obtuvieron muestras de tejidos normales
(hígado, riñón, pulmón, páncreas, corteza adrenal, cerebro,
estómago, yeyuno, colon, pecho y ovario) de muestras de tejidos
frescos no fijados cedidos al Departamento de Patología de la
Universidad de Aberdeen para el diagnóstico. Las muestras de tejido
se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -75ºC antes
de la preparación de microsomas. Las muestras de cáncer de mama
primario (n= 61) se obtuvieron de muestras de tejido de mama
cedidos al Departamento de Patología, Universidad de Aberdeen para
el diagnóstico. Todas las muestras se tejido de mama procedían de
biopsias por aguja del núcleo de bultos en el pecho palpables
llevadas a cabo como protocolo de diagnóstico antes de un
tratamiento definitivo. Las biopsias del núcleo se fijaron con
formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente y, a
continuación, se fijaron en cera de manera rutinaria.
El diagnóstico del cáncer de mama se llevó a
cabo con secciones teñidas con hematoxilina y eosina utilizando un
criterio histopatológico estándar. Los tumores se clasificaron de
acuerdo con el criterio descrito por Elston y Ellis (1991) y el
estado del receptor de estrógenos de los cánceres de pecho se
determinó mediante inmunohistoquímica para la proteína receptora de
estrógeno según se había descrito previamente (King et al.,
1997). Se evaluó el estado del nódulo linfoide procedente de
muestras subsiguientes de un nódulo linfoide axilar proporcionadas
para el examen histopatológico. Las características
clínico-patológicas de los cánceres de mama se
describen en la Tabla 2.
| Edad (media y rango) | 52,3 años (34-76) | |
| Tipo histológico | ||
| \hskip0.5cm Carcinoma ductal invasivo | 52 (85,2%) | |
| \hskip0.5cm Carcinoma lobular invasivo | 8 (13,1%) | |
| \hskip0.5cm Carcinoma túbulo-lobular | 1 (1,7%) | |
| Grado del cáncer de mama | ||
| \hskip0.5cm Grado 1 | 10 (16,4%) | |
| \hskip0.5cm Grado 2 | 27 (44,3%) | |
| \hskip0.5cm Grado 3 | 24 (39,3%) | |
| Estado del nódulo linfoide | ||
| \hskip0.5cm Negativo (sin metástasis) | 34 (55,7%) | |
| \hskip0.5cm Positivo (presencia de metástasis) | 22 (36,1%) | |
| \hskip0.5cm Sin determinar | 5 (8,2%) | |
| Estado del receptor de estrógenos | ||
| \hskip0.5cm Negativo | 25 (41%) | |
| \hskip0.5cm Positivo | 34 (55,7%) | |
| \hskip0.5cm Sin determinar | 2 (3,3%) |
Se obtuvieron microsomas preparados a partir de
células linfoblastoides humanas que contenían el CYP1B1 humano
expresado, el CYP1A1 humano expresado o células linfoblastoides que
únicamente contenían el vector de Gentest Corp. Woburn, Ma.
Las muestras congeladas de tejidos se
descongelaron en hielo en Tris-HCl 0,01 M a pH 7,4
que contenía 1,15% de KCl. Las muestras descongeladas de tejido se
diseccionaron del tejido conectivo y grasa, se cortaron muy finas
utilizando un escarpelo y a continuación se homogeneizaron en
Tris-HCl 0,01M que contenía sacarosa 0,25 M y
glicerol al 15% utilizando un homogeneizador Politron PT3000
(Kinematica AG, Suiza). Los homogenados se centrifugaron a
continuación a 15.000 g durante 20 minutos a 4ºC utilizando una
centrífuga Centrikon T-124 (Kontron Instruments,
Cumbernauld, UK). Los sobrenadantes resultantes se centrifugaron a
continuación a 180.000 g (44.000 rpm) durante una hora a 4ºC
utilizando una centrífuga Centrikon T-1160 (Kronton
Instruments). Los pellets obtenidos después de la centrifugación se
volvieron a suspender en Tris-HCl 0,1 M que contenía
un 15% de glicerol y EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich Co.
Poole, Dorset, UK) y se centrifugó otra vez a 180.000 g (44.000
rpm) durante una hora a 4ºC. El pellet microsomal final se volvió a
suspender en Tris-HCl 0,1 M que contenía un 15% de
glicerol y EDTA 1 mM y las muestras microsomales se guardaron a
continuación a -75ºC antes de su uso. La concentración de proteína
de cada muestra de microsomas se determinó utilizando el método de
Bradford (Bradford, 1976). La albúmina de suero bovino
(Sigma-Aldrich) se utilizó como proteína
estándar.
Las muestras de proteínas microsomales se
separaron electroforéticamente a corriente constante en un gel de
poliacrilamida al 10% utilizando un aparato de electroforesis de gel
vertical SE600 (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Bucks,
UK) y a continuación se transfirió a corriente constante durante 18
horas a nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech)
mediante electrotransferencia utilizando un sistema de
transferencia Hoefer TE42 (Amersham Pharmacia Biotech). Después de
la transferencia electroforética se bloquearon los sitios de unión
a proteína no específicos mediante incubación de la membrana de
nitrocelulosa durante 60 minutos a temperatura ambiente en tampón
de lavado que consistía en un 2% de leche desnatada (Marvel,
Premier Beverages, Stafford, UK) en un salino tamponado con fosfato
que contenía Tween 20 al 0,05% (Sigma). La nitrocelulosa se incubó
a continuación secuencialmente con suero de ratón inmune (1/250) o
anticuerpo monoclonal CYP1B1 (1/100) e inmunoglobulina
anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa de rábano
(1/2000; Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Después de
la incubación con cada anticuerpo la membrana se lavó durante cinco
periodos de 10 minutos con tampón de lavado y después de eliminar
el anticuerpo secundario no unido, se lavó otra vez la membrana con
salino tamponado con fosfato 10 mM durante cinco periodos de 10
minutos. Se demostró la peroxidasa de rábano utilizando una técnica
de quimioluminiscencia potente (ECL plus, Amersham Pharmacia
Biotech) la cual se llevó a cabo según se había descrito
previamente (McKay et al., 1995; Murray et al., 1997).
Brevemente, se incubó la membrana de nitrocelulosa en una solución
que consistía en 4 ml de reactivo de detección 1 (lumigen
PS-3, Amersham Pharmacia Biotech) y 100 \muL de
solución de detección 2 (luminol PS-3, Amersham
Pharmacia Biotech) durante 5 minutos a temperatura ambiente, se
secó, se envolvió en film de plástico transparente y se expuso a un
film de rayos X (Amersham Pharmacia Biotech).
La detección inmunohistoquímica de CYP1B1 se
llevó a cabo utilizando un método de amplificación de señal
catalizada (King et al., 1997). En este estudio se utilizó
tiramida fluoresceína en lugar de tiramida biotinilada la cual se
había utilizado en nuestro estudio anterior (King et al.,
1997) para evitar cualquier posible interferencia con la biotina
endógena. Se cortaron secciones (4 \mum de grosor) sobre
portaobjetos recubiertos con aminoetilpropoxisilano, a continuación
se eliminó la cera con xileno, se rehidrataron en etanol al 100%,
etanol al 95% y se lavaron en Tris-HCl 0,05 M a pH
7,6 que contenía NaCl 150 mM (TBS). Se inhibió la peroxidasa
endógena utilizando una solución que consistía en 90 ml de metanol y
3 ml de peróxido de hidrógeno. En algunos experimentos, la
recuperación de antígeno se llevó a cabo sometiendo a microondas las
secciones en un tampón con citrato 0,01 M pH 6,0 durante 20 minutos
en un microondas (Proline TM, Proline, UK) que operó a potencia
máxima (800 W) mientras que en otros experimentos no se llevó a cabo
la recuperación de antígeno. Después de la etapa de recuperación de
antígeno, se dejaron enfriar las secciones a temperatura ambiente y
se aplicaron a continuación los anticuerpos
anti-CYP1B1 monoclonales primarios.
El anticuerpo primario se aplicó en el
sobrenadante del cultivo de tejido a varias diluciones (sin diluir
hasta 1/160) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de
la incubación con el anticuerpo primario, se lavaron las secciones
con TBS durante tres periodos sucesivos de 5 minutos y a
continuación se aplicó la inmunoglobulina
anti-ratón de conejo conjugada a peroxidasa (1/100
en TBS que contenía un 4% de suero humano normal, Dako, High
Wycombe, UK) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las
secciones se lavaron a continuación con TBS y TBS que contenía
Tween 20 al 0,05% (tampón TNT). Las secciones se lavaron a
continuación con tampón TNT y se aplicó la tiramida fluoresceína
(NEN, Hounslow, Middlesex, UK) durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se lavaron a continuación con tampón TNT
seguido de la aplicación de la anti-fluoresceína
monoclonal de ratón (720 Dako) durante 30 minutos a temperatura
ambiente. A continuación, se lavó con tampón TNT y se aplicó la
inmunoglobulina anti-ratón de conejo conjugada a
peroxidasa (1/100 en TBS que contenía un 4% de suero humano normal)
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con TBS
se demostraron colorimétricamente los sitios donde se había unido
la peroxidasa utilizando una solución que contenía diaminobenzidina
y peróxido de hidrógeno (Liquid DAB plus, Dako). Después de incubar
las secciones durante 10 minutos a temperatura ambiente en una
solución con el sustrato de peroxidasa, se paró la reacción lavando
los portaobjetos con agua fría de grifo y el producto de la
reacción enzimática se intensificó utilizando sulfato de cobre al
0,5%. Los portaobjetos se lavaron a continuación con agua fría de
grifo y se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron en
alcohol, se aclararon con xileno y se montaron en un medio de
soporte sintético (DPX, BDH, Poole, Dorset, UK). Las secciones
fueron examinadas utilizando un microscopía óptica de campo
brillante por dos observadores diferentes con el fin de establecer
la presencia o ausencia de inmunotinción y su distribución y
localización e intensidad. Se consideró positivo un tumor si
cualquiera de las células tumorales mostraba inmunotinción mientras
que un tumor se clasificó como negativo cuando existía una ausencia
completa de inmunotinción de las células tumorales.
El tejido control positivo fue secciones de un
cáncer de mama que previamente habíamos demostrado que contenía
CYP1B1 tanto mediante inmunotransferencia como mediante
inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal para CYP1B1 (Murray
et al., 1997). Los controles negativos utilizados en lugar
del anticuerpo monoclonal primario fueron los medios TBS y de
cultivo de tejido. En un experimento el anticuerpo fue
pre-adsorbido en fase líquida con el péptido
(péptido E, 10 nmol de péptido/ml de anticuerpo) el cual había sido
utilizado como inmunógeno para los anticuerpos monoclonales antes
de llevar a cabo la inmunohistoquímica.
La detección inmunohistoquímica de CYP1B1 con un
anticuerpo monoclonal para CYP1B1 se llevó a cabo utilizando un
método de amplificación de señal de tiramina. Se demostraron
colorimétricamente los sitios de inmunorreactividad con
diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno (Liquid DAB plus, Dako Ltd
High Wycombe, Bucks, UK). El tejido control positivo fue secciones
de cáncer de mama que contenía CYP1B1 y el control negativo usado
fue salino tamponado con Tris (TBS) en lugar del anticuerpo
monoclonal primario. Con el fin de establecer la presencia o
ausencia de CYP1B1 y su distribución, intensidad y localización
celular, las secciones fueron examinadas por dos observadores
diferentes utilizando microscopía óptica de campo brillante. Se
evaluó la inmunorreactividad a CYP1B1 en tumores como fuerte,
moderada, débil o negativa. Los tumores que exhibieron
inmunorreactividad a CYP1B1 en más de un 5% de las células fueron
considerados como positivo.
La respuesta inmune de los sueros procedentes de
ratones inyectados con cada uno de los conjugados peptídicos se
evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilfulfato e inmunotransferencia utilizando como antígeno el
CYP1B1 expresado. Los sueros de los ratones inyectados con
diferentes péptidos mostraron una respuesta inmune variable (Tabla
1 de más arriba). Los sueros de los ratones que habían sido
inyectados con péptidos D y E mostraron el reconocimiento de CYP1B1
y se consideró que habían producido una respuesta inmune positiva.
Los sueros procedentes de ratones inyectados con péptido E dieron un
reconocimiento ligeramente más fuerte de CYP1B1 humano que con el
péptido D. Sin embargo, los sueros procedentes de ratones
inyectados con péptidos A y B y péptidos F a J no mostraron un
reconocimiento aparente de CYP1B1 y se consideró que no habían
producido una respuesta inmune significativa. Los ratones que se
habían inmunizado con el péptido E fueron escogidos, por lo tanto,
para desarrollar anticuerpos monoclonales para CYP1B1. La secuencia
peptídica utilizada para desarrollar los anticuerpos monoclonales
muestra un grado elevado de similitud con las secuencias
correspondientes a CYP1B1 de rata y CYP1B1 de ratón con 13 de los 15
residuos aminoacídicos siendo idénticos.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CYP1B1 humano \+ \hskip2cm \+ PENFDPARFLDKDGL\cr CYP1B1
de rata \+ \+ PEDFDPARFLDKDGF\cr CYP1B1 de ratón \+ \+
PEDFDPARFLDKDGF\cr \+ \+ **
***********\cr}
Los residuos aminoacídicos comunes para los tres
P450 se indican con un asterisco.
Se desarrollaron cinco anticuerpos monoclonales
procedentes de ratones inmunizados con el péptido E. Los
anticuerpos individuales se designaron 5C4, 5D3, 5D9, 5E2 y 5G7 y la
determinación del isotipo mostró que todos los anticuerpos eran del
subtipo IgG1x. Todos los anticuerpos monoclonales reconocían una
única banda inmunorreactiva de peso molecular de 52 kDa
correspondiente al tamaño molecular esperado del CYP1B1 humano
expresado mediante inmunotransferencia y no reconocieron CYP1A1
humano expresado o ninguna proteína presente en microsomas control
con únicamente el vector o microsomas de hígado humano (Figura 1).
Las diluciones en serie de CYP1B1 expresado indicaron que la
cantidad mínima detectable de CYP1B1 mediante inmunotransferencia
era de 0,05 pmoles de CYP1B1 expresado (Figura 2). No se identificó
CYP1B1 mediante inmunotransferencia de microsomas preparados a
partir de una variedad de tejidos humanos normales de adulto que
incluían riñón, estómago, intestino delgado, colon y pulmón (Figura
3).
La inmunohistoquímica en secciones de cáncer de
mama embebidas en cera y fijadas con formalina utilizadas como
control positivo mostró que tres de los anticuerpos monoclonales
(5D3, 5E2 y 5G7) demostraron una tinción fuerte mientras que dos de
los anticuerpos (5C4, 5D9) no mostraron inmunorreactividad. Todos
los anticuerpos monoclonales que mostraron una inmunorreactividad
positiva requirieron una etapa de recuperación de antígeno para
resultados inmunohistoquímicos óptimos y los tres anticuerpos
mostraron un patrón idéntico de localización y distribución de
tinción inmunohistoquímica. Por lo tanto, únicamente uno de los
anticuerpos monoclonales (5D3) se utilizó para los subsiguientes
estudios inmunohistoquímicos de cáncer de mama. La
pre-incubación en fase líquida de anticuerpo
anti-CYP1B1 con el péptido E antes de llevar a cabo
la inmunohistoquímica casi suprimió completamente la
inmunorreactividad.
La inmunorreactividad de CYP1B1 se identificó en
47 casos de cáncer de mama (77%) mientras que no existió
inmunorreactividad detectable en 14 casos (23%). En cada caso en el
que existía inmunorreactividad de CYP1B1, la inmunorreactividad se
localizó en el citoplasma de células tumorales. La intensidad de la
inmunorreactividad varió entre inmunorreactividad fuerte en 10
casos (16,4%), moderada en 12 casos (19,7%) y débil en 25 casos
(41%). La presencia de CYP1B1 en diferentes grados, tipos
histológicos de cáncer de mama y el estado del nódulo linfoide se
resumen en las Tablas 3-5.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo histológico de cáncer de mama | |||
| Inmunorreactividad | Ductal Invasivo | Lobular Invasivo | Túbulo-lobular |
| a CYP1B1 | (n= 52) | (n= 8) | (n= 1) |
| Negativo (n= 14) | 12 | 2 | 0 |
| Débil (n= 25) | 20 | 4 | 1 |
| Moderado (n= 12) | 11 | 1 | 0 |
| Fuerte (n= 10) | 9 | 1 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Grado del cáncer de mama | |||
| Inmunorreactividad | Grado 1 (n= 10) | Grado 2 (n= 27) | Grado 3 (n= 24) |
| a CYP1B1 | |||
| Negativo (n= 14) | 2 | 6 | 6 |
| Débil (n= 25) | 4 | 12 | 9 |
| Moderado (n= 12) | 3 | 5 | 4 |
| Fuerte (n= 10) | 1 | 4 | 5 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Estado de Nódulo Linfoide | ||
| Inmunorreactividad | Nódulo linfoide positivo | Nódulo Linfoide negativo |
| a CYP1B1 | (n= 34) | (n= 22) |
| Negativo (n= 14) | 6 | 8 |
| Débil (n= 25) | 16 | 8 |
| Moderado (n= 12) | 6 | 5 |
| Fuerte (n= 10) | 6 | 1 |
No existió inmunorreactividad a CYP1B1 en
células del estroma o tejido conectivo ni en los siguientes tipos
celulares que incluían linfocitos y células de plasma cuando estaban
presentes en biopsias individuales. La presencia de CYP1B1 se
asoció con la presencia de la proteína de receptor a estrógeno
(Tabla 6, X^{2}= 8,54; p= 0,03) mientras que no existió ninguna
relación entre la presencia de CYP1B1 y el tipo histológico del
tumor, grado del tumor o la presencia o ausencia de metástasis en el
nódulo linfoide.
| Estado del Receptor de Estrógeno | ||
| Inmunorreactividad a CYP1B1 | Negativo (n= 25) | Positivo (n= 34) |
| Negativo (n=13) | 2 | 11 |
| Débil (n= 25) | 14 | 11 |
| Moderado (n= 12) | 7 | 5 |
| Fuerte (n= 9) | 2 | 7 |
Los anticuerpos se utilizaron a continuación
para investigar la expresión de CYP1B1 en 80 cánceres colorrectales
primarios y 14 metástasis de hígado derivadas del cáncer colorrectal
primario. De las 14 metástasis estudiadas, 13 mostraron expresión
de CYP1B1.
| Frecuencia | Porcentaje | Porcentaje Válido | Porcentaje acumulativo | |||||
| Válido 0,00 | 11,0 | 13,8 | 13,8 | 13,8 | ||||
| \hskip0.3cm 1 | 4,0 | 5,0 | 5,0 | 18,8 | ||||
| \hskip0.3cm 2 | 28,0 | 35,0 | 35,0 | 53,8 | ||||
| \hskip0.3cm 3 | 37,0 | 46,3 | 46,3 | 100,0 | ||||
| \hskip0.8cm Total | 80,0 | 100,0 | 100,0 | |||||
| Total | 80,0 | 100,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Intensidad del Caso | Porcentaje de células positivas a CYP1B1 |
| 1 | 0 |
| 2 | 1 > 75% |
| 3 | 1 50-75% |
| 4 | 3 > 75% |
| 5 | 2 50-75% |
| 6 | 3 25-50% |
| 7 | 3 50-75% |
| 8 | 3 > 75% |
| 9 | 3 > 75% |
| 10 | 3 > 75% |
| 11 | 1 25-50% |
| 12 | 3 50-75% |
| 13 | 3 > 75% |
| 14 | 3 > 75% |
Se identificó la inmunorreactividad a CYP1B1 en
la mayoría de secciones de cáncer primario de ovario (153/167; 92%)
y se localizó especialmente en el citoplasma de las células
tumorales. La expresión de CYP1B1 no fue detectable en ninguna de
las muestras de tejido de ovario normal. En un elevado porcentaje de
los cánceres de ovario, existió una inmunorreactividad a CYP1B1
fuerte (85/167; 50,9%) o moderada (39/167; 23,4%). Además, se
observó la presencia de CYP1B1 en la mayoría de depósitos
metastáticos (45/48; 94%) con una elevada proporción mostrando una
inmunorreactividad de moderada (22/48; 45,8%) a fuerte (18/48;
37,5%). Un nivel similar de expresión de CYP1B1 se observó para
diferentes subtipos histológicos tanto en tumores primarios como
metastáticos. En los casos en que estaban disponibles los depósitos
de tumores de ovario tanto primarios como metastásicos, se observó
una correlación significativa con la expresión de CYP1B1 (p= 0,02,
ensayo de correlación de Spearman).
CYP1B1 muestra una expresión elevada en una
diversidad de tumores que incluye el cáncer de mama (Murray et
al., 1997) y existe una actividad elevada de la
4-estradiol hidroxilasa asociada a CYP1B1 en cáncer
de mama (Liehr y Ricci et al., 1996). CYP1B1 también es
capaz de metabolizar una diversidad de carcinógenos humanos
putativos que incluyen hidrocarburos aromáticos policíclicos y
aminas heterocíclicas (Shimada et al., 1996; Crespi et
al., 1997). De esta manera, CYP1B1 parece tener funciones
potencialmente importantes en el desarrollo y progreso de tumores,
como diana potencial para fármacos anticancerígenos y como
biomarcador tumoral. Los estudios iniciales de la presencia de
CYP1B1 en tipos individuales de tumores se llevaron a cabo con un
anticuerpo policlonal para CYP1B1 y para cada tipo de tumor se
investigó únicamente un pequeño grupo de muestras (Murray et
al., 1997). Con el fin de evaluar más completamente el potencial
de CYP1B1 (desarrollo y progresión tumoral) como marcador tumoral
se requirieron anticuerpos monoclonales descritos en el presente
documento que específicamente reconocen CYP1B1 en secciones de
tejido incrustados con cera y fijados con formaldehído y también
requiere de un número mayor de tumores a ser estudiados. El
presente trabajo describe el desarrollo de dichos anticuerpos
monoclonales para CYP1B1 y demuestra que detectan sensiblemente y
específicamente CYP1B1 mediante inmunotransferencia e
inmunohistoquímica y, de esta manera utiliza estos anticuerpos para
investigar la presencia de CYP1B1 en una serie de cánceres
primarios de mama, cáncer de próstata y cáncer de ovario.
La estrategia utilizada para desarrollar
anticuerpos monoclonales para CYP1B1 fue una combinación de
modelación estructural molecular y alineación de secuencia para
identificar las regiones de CYP1B1 que eran más probables que se
ubicaran en el aspecto externo de la proteína de CYP1B1 y de esta
manera que fueran más probablemente inmunogénicas. Se identificó
una región ubicada en el tercer C-terminal de la
proteína CYP1B1 que comprendía una región de unión hemo y se
sintetizaron péptidos que consistían en 14 ó 15 residuos
aminoacídicos y se conjugaron a una proteína portadora. Cada
péptido se inyectó en ratones y se evaluó la inmunorreactividad de
cada péptido para CYP1B1 mediante inmunotransferencia utilizando
microsomas preparados a partir de células linfoblastoides humanas
que contenían el CYP1B1 expresado y microsomas que contenían
únicamente el vector. Únicamente los sueros procedentes de ratones
inmunizados con los péptidos D y E mostraron reconocimiento a
CYP1B1 mientras que ninguno de los otros péptidos mostró una
inmunorreactividad significativa a CYP1B1. Se seleccionaron los
ratones que habían sido inmunizados con péptido E para desarrollar
anticuerpos monoclonales para CYP1B1. La secuencia peptídico
utilizada para generar anticuerpos monoclonales muestra un grado
elevado de similitud (13 de los 15 aminoácidos idénticos) con
CYP1B1 de rata y CYP1B1 de ratón y sería anticipado que los
anticuerpos monoclonales también reconocerían CYP1B1 de rata y
CYP1B1 de ratón. Todos los anticuerpos monoclonales fueron
específicos para CYP1B1 y no reconocieron ni CYP1A1 ni CYP1A2, los
otros miembros conocidos de la familia de genes CYP1. Además, los
anticuerpos no reconocieron ninguna proteína en microsomas de hígado
humano. Los microsomas de hígado humano se utilizaron como fuente
de CYP1A2 ya que CYP1A2 es una de las formas principales de P450
que se expresa de manera constitutiva en hígado y los microsomas de
hígado también actuaban como fuente de otras formas de P450
proporcionando de esta manera una criba amplia para confirmar la
especificidad de anticuerpos para CYP1B1.
El presente estudio no fue capaz de detectar
CYP1B1 mediante inmunotransferencia en una diversidad de tejidos
humanos normales. La ausencia de la proteína CYP1B1 humana tanto en
hígado humano normal como en una diversidad de tejidos
extrahepáticos está de acuerdo con los estudios inmunohistoquímicos
previos (Murray et al., 1997) en los que la proteína CYP1B1
no se detectaba. En este estudio se cargó una cantidad relativamente
elevada de proteína microsomal (30 \mug) por línea y se utilizó
un sistema de detección quimioluminiscente altamente sensible por
lo que parece probable que incluso un nivel muy bajo de CYP1B1 en
los tejidos normales estudiados habría sido detectado utilizando
este sistema.
Otro objetivo principal de este estudio era
desarrollar anticuerpos para CYP1B1 que se pudieran utilizar en
inmunohistoquímica y que fueran efectivos en secciones de tejido
embebidos en cera y fijados con formalina. Todos los anticuerpos
monoclonales se evaluaron por inmunohistoquímica utilizando
secciones de cáncer de mama embebidos en cera y fijados con
formalina los cuales han mostrado previamente, mediante
inmunohistoquímica, contener un nivel relativamente elevado de
CYP1B1 (Murray et al., 1997) y se encontró que tres de los
anticuerpos monoclonales detectaban de manera efectiva CYP1B1
mediante inmunohistoquímica. Puesto que los tres anticuerpos que
dieron inmunorreactividad positiva produjeron un patrón e intensidad
idénticos de inmunorreactividad, solo se utilizó uno de los
anticuerpos para investigar la expresión de CYP1B1.
El presente estudio encontró que el 77% de
cánceres de mama contenía CYP1B1 y en cada tumor se localizó
específicamente CYP1B1 en células tumorales. La frecuencia elevada
de expresión de CYP1B1 en cáncer de mama es muy similar a los
estudios previos de un pequeño número de cánceres de mama y
corroboraría el concepto que CYP1B1 es una forma mayoritaria de
citocromo P450 presente en el cáncer de mama (McKay et al.,
1995; Murray et al., 1997). Se encontró CYP1B1 en todos los
tipos histológicos de cáncer de mama y la presencia de CYP1B1 no se
asoció con ningún tipo particular histológico de cáncer de mama ni
con la presencia o ausencia de metástasis del nódulo linfoide, sin
embargo la expresión de CYP1B1 se correlacionó con la presencia de
la proteína del receptor de estrógeno. Esto es de interés ya que
recientemente se ha descrito una asociación entre un polimorfismo
de CYP1B1 (valina/leucina) en el aminoácido 432 y el estado del
receptor de estrógeno en cáncer de mama (Bailey et al.,
1998). Existe también el potencial para la "comunicación
cruzada" (en inglés "cross talk") entre el complejo
de receptor de estrógeno y el complejo de receptor hidrocarburo de
arilo (Wang et al., 1998) el cual está implicado en la
regulación transcripcional de CYP1B1 (Schmidt y Bradfield,
1996).
Puesto que CYP1B1 está implicado en el
metabolismo de estrógenos, actuando como una C4 hidroxilasa de
estradiol específica (Hayes et al., 1996) entonces la
presencia de CYP1B1 en células de cáncer de mama es probable que
haga una contribución significativa al metabolismo intratumoral del
estradiol. La presencia de CYP1B1 en cáncer de mama también
proporciona una diana molecular para fármacos específicamente
activados por CYP1B1.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales para
CYP1B1 que son efectivos en tejidos embebidos en cera y fijados con
formalina debería hacerlos útiles en la investigación de la
expresión de CYP1B1 en diferentes tipos de tumores y lesiones
pre-neoplásicas relacionadas. Los anticuerpos se
pueden utilizar para el diagnóstico del cáncer. Los anticuerpos se
pueden desarrollar como base de inmunoquímica en pruebas de
diagnóstico in vivo y como agentes terapéuticos dirigidos a la
proteína CYP1B1 o un producto de degradación del mismo.
Bailey et al, Cancer Res., 58:
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\hskip1cmMurray, Graeme I
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CYP1B1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SJK/BP5846076
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB00/01030
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2000-03-20
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\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-19
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asn Gln Trp Ser Val Asn His Asp Pro Val
Lys Trp Pro Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Asp Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp
Lys Asp Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Asp Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp
Lys Asp Gly Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Asn Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp
Lys Asp Gly Leu}
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Asn Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp
Lys Asp Gly Phe}
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Leu Pro Tyr Val Leu Ala Phe Leu Tyr Glu
Ala Met Arg Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Phe Val Pro Val Thr Ile Pro His Ala
Thr Thr Ala Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Val Leu Gly Tyt His Ile Pro Lys Asp
Thr Val Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\sa{Ile Asn Lys Asp Leu Thr Ser Arg Val Met Ile
Phe Ser Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Glu Leu Ser Lys
Met Gln Leu Phe}
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\newpage
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\sa{Leu Phe Ile Ser Ile Leu Ala His Gln Cys Asp
Phe Arg Ala Asn}
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<210> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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\sa{Pro Asn Glu Pro Ala Lys Met Asn Phe Ser Tyr
Gly Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Lys Pro Lys Ser Phe Lys Val Asn Val Thr
Leu Arg Glu}
Claims (28)
1. Procedimiento de preparación de un anticuerpo
que se une específicamente al citocromo P450 CYP1B1, comprendiendo
el procedimiento raising inducir el anticuerpo utilizando un péptido
que consiste en una secuencia de aminoácidos VNQWSVNHDPVKWPN o
PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y es L o F, o un fragmento
antigénico de la misma.
2. Procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el péptido consiste en 3 a 10 aminoácidos.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 o
reivindicación 2 en el que el péptido consiste en 3 a 6
aminoácidos.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que el péptido está conjugado a un
portador inmunogénico.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
6. Procedimiento según la reivindicación 5 en el
que el anticuerpo monoclonal es obtenible mediante un procedimiento
que comprende:
(a) inmunizar un animal con el péptido conjugado
a un portador inmunogénico;
(b) sacrificar el animal y fusionar las células
del bazo obtenidas del animal con células de mieloma para producir
uno o más hibridomas; y
(c) cribar hibridomas para anticuerpos capaces
de unirse al péptido.
7. Procedimiento de producción de un hibridoma
capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente al
citocromo P450 CYP1B1, comprendiendo el procedimiento:
(a) inmunizar un animal con un péptido conjugado
a un portador inmunogénico, en el que el péptido consiste en una
secuencia aminoacídica VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es
D o N e y es L o F, o un fragmento antigénico de la misma;
(b) sacrificar el animal y fusionar las células
del bazo obtenidas del animal con células de mieloma para producir
uno o más hibridomas; y
(c) cribar los hibridomas para anticuerpos
capaces de unirse al péptido.
8. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que el péptido consiste en 3 a 10 aminoácidos.
9. Procedimiento según la reivindicación 1 o
reivindicación 2 en el que el péptido consiste en 3 a 6
aminoácidos.
10. Hibridoma obtenible mediante el
procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Procedimiento de producción de un anticuerpo
que comprende proporcionar un hibridoma según la reivindicación 10,
cultivar dicho hibridoma y aislar el anticuerpo así producido.
12. Procedimiento de la reivindicación 11 que
comprende además conjugar el anticuerpo a un efector.
13. Procedimiento de la reivindicación 12 en el
que el efector es una etiqueta, una toxina, un fármaco o
profármaco, un enzima o una molécula de transporte.
14. Anticuerpo que es capaz de unirse
específicamente al citocromo P450 CYP1B1, en donde el anticuerpo
reconoce un epítopo en la proteína del citocromo P450 CYP1B1
incluido en la secuencia de aminoácidos VNQWSVNHDPV
KWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y es L o F.
KWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y es L o F.
15. Anticuerpo de la reivindicación 14 en el que
el anticuerpo reconoce un epítopo de entre 3 y 10 aminoácidos de
las secuencias aminoacídicas.
16. Anticuerpo de la reivindicación 14 en el que
el anticuerpo reconoce un epítopo de entre 3 y 6 aminoácidos de las
secuencias aminoacídicas.
17. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
18. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 el cual está humanizado.
19. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18 en el que el anticuerpo está conjugado a un
efector.
20. Anticuerpo de la reivindicación 19 en el que
el efector es una etiqueta, una toxina, un fármaco o un profármaco,
un enzima o una molécula de transporte.
21. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20 para utilizar en un método de tratamiento
médico.
22. Utilización de un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
23. Péptido que consiste en la secuencia de
aminoácidos VNQWSVNHDPVKWPN o PExFDPARFLDKDGy, donde x es D o N e y
es L o F, o un fragmento antigénico de la misma.
24. Método de ensayo para detectar células
cancerígenas presentes en una muestra de un paciente, comprendiendo
el método poner en contacto la muestra de tejido de un paciente con
un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20 y
detectar la unión del anticuerpo a la proteína CYP1B1 presente en la
muestra como una indicación de la presencia de células cancerígenas
en la muestra de tejido.
25. Método de la reivindicación 24 en el que la
etapa de detectar la unión del anticuerpo a la proteína CYP1B1 se
lleva a cabo utilizando el ensayo de captura de anticuerpo, un
ensayo sándwich con dos anticuerpos o un ensayo de captura de
antígeno.
26. Método de la reivindicación 24 o
reivindicación 25 en el que el anticuerpo específico de la proteína
CYP1B1 se inmoviliza en un inmunoensayo basado en soporte
sólido.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26 en el que el cáncer es cáncer de mama,
cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de hígado o cáncer
de ovarios.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27 en el que la muestra de tejido se
selecciona de vejiga, cerebro, mama, colon, tejido conectivo,
riñón, pulmón, nódulo linfoide, esófago, ovario, piel, estómago,
testículos y uretra.
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