JP2002543765A - Ｃｙｐ１ｂ１に特異的な抗体 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
チトクロームP450 CYP1B1に特異的に結合できる抗体、及びそれらの調製方法が開示され、特にアミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より成るペプチド、またはその抗原性断片に結合する抗体が開示される。上記抗体は、乳ガン、前立腺ガン、大腸ガン、肝臓ガン、及び卵巣ガンを含む、増大したCYP1B1発現と結びついたガンの診断または治療において使用できる。上記CYP1B1タンパク質に対する抗体の結合を検出する工程は、抗体捕獲アッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、または抗原捕獲アッセイを使用して実施される。
Description
【０００１】
本発明は、腫瘍の診断及び治療、特に腫瘍特異的チトクロームP450 CYP1B1に
特異的な抗体に関する。
特異的な抗体に関する。
【０００２】
チトクロームP450（P450）CYP1B1は、CYP1遺伝子ファミリーの最近同定された
サブファミリーの唯一の周知のメンバーである。ヒトCYP1B1は、ジオキシンにさ
らすことによって引き起こされる遺伝子の特異的な発現を同定するための一連の
調査の一部として、ジオキシン処理されたケラチノサイト細胞系からもともと単
離された(Sutter等, 1994)。ヒトCYP1B1遺伝子は、12kbに亘る染色体2P22-21に
位置し、３個のエキソンと２個のイントロンよりなる(Tang等, 1996)。mRNAは5.
2kbであり、543アミノ酸のタンパク質をコードする(Sutter等, 1994)。これは、
mRNAサイズ及びアミノ酸数の両者の観点で最も周知のヒトP450遺伝子であり、構
造的に最も単純でもある。核酸及びアミノ酸配列の分析の両者により、CYP1B1は
CYP1A1及びCYP1A2と約40%のみのホモロジーを有することが示されている。CYP1
ファミリーの存在するメンバーとの低い度合いの相同性は、このP450が単一のメ
ンバーであるCYP1B1のみを今日まで含む新規なCYP1サブファミリーに分類するこ
とを生じた。実際、ヒトDNAのハイブリダイゼーション実験により、CYP1B1遺伝
子ファミリーにはたった一つのみのメンバーが存在することが示唆される(Sutte
r等, 1994)。CYP1B1遺伝子は、平面芳香族炭化水素を含むAhレセプターのリガン
ドによって転写的に活性化され(Sutter等, 1994; Hakkola等, 1997)、CYP1B1遺
伝子の転写を誘導するためのこれらのAhレセプターのアゴニストの中で最も強力
なものは、ジオキシンであるようである(Hakkola等, 1997)。
サブファミリーの唯一の周知のメンバーである。ヒトCYP1B1は、ジオキシンにさ
らすことによって引き起こされる遺伝子の特異的な発現を同定するための一連の
調査の一部として、ジオキシン処理されたケラチノサイト細胞系からもともと単
離された(Sutter等, 1994)。ヒトCYP1B1遺伝子は、12kbに亘る染色体2P22-21に
位置し、３個のエキソンと２個のイントロンよりなる(Tang等, 1996)。mRNAは5.
2kbであり、543アミノ酸のタンパク質をコードする(Sutter等, 1994)。これは、
mRNAサイズ及びアミノ酸数の両者の観点で最も周知のヒトP450遺伝子であり、構
造的に最も単純でもある。核酸及びアミノ酸配列の分析の両者により、CYP1B1は
CYP1A1及びCYP1A2と約40%のみのホモロジーを有することが示されている。CYP1
ファミリーの存在するメンバーとの低い度合いの相同性は、このP450が単一のメ
ンバーであるCYP1B1のみを今日まで含む新規なCYP1サブファミリーに分類するこ
とを生じた。実際、ヒトDNAのハイブリダイゼーション実験により、CYP1B1遺伝
子ファミリーにはたった一つのみのメンバーが存在することが示唆される(Sutte
r等, 1994)。CYP1B1遺伝子は、平面芳香族炭化水素を含むAhレセプターのリガン
ドによって転写的に活性化され(Sutter等, 1994; Hakkola等, 1997)、CYP1B1遺
伝子の転写を誘導するためのこれらのAhレセプターのアゴニストの中で最も強力
なものは、ジオキシンであるようである(Hakkola等, 1997)。
【０００３】 このP450のオルトローガスな形態もまた、マウス胚線維芽細胞(Savas等, 1994
; Shen等, 1994)及び成体ラット副腎皮質(Bhattachryya等, 1995; Walker等, 19
95)から由来するベンズアントラセン誘導性細胞から単離されている。CYP1B1の
ヒト、マウス及びラット形態の間で核酸及びアミノ酸配列のホモロジーの両者の
高い度合い(80%より大きい)が存在するが、CYP1B1の組織特異的発現、調節及び
代謝特性に関しては、かなりの種間差異が存在するようである(Savas等, 1994;
Sutter等, 1994; Bhattacharyya等, 1995; Savas等, 1997)。
; Shen等, 1994)及び成体ラット副腎皮質(Bhattachryya等, 1995; Walker等, 19
95)から由来するベンズアントラセン誘導性細胞から単離されている。CYP1B1の
ヒト、マウス及びラット形態の間で核酸及びアミノ酸配列のホモロジーの両者の
高い度合い(80%より大きい)が存在するが、CYP1B1の組織特異的発現、調節及び
代謝特性に関しては、かなりの種間差異が存在するようである(Savas等, 1994;
Sutter等, 1994; Bhattacharyya等, 1995; Savas等, 1997)。
【０００４】 乳ガンは、女性に影響する最も一般的なガンであり、エストロゲン依存性の腫
瘍である。酵母(S. cerevisiae)において発現したヒトCYP1B1は、17β-エストラ
ジオールを4-ヒドロキシエストラジオールに変換する4-ヒドロキシル化に向けた
高い特異的な活性を示し(Hayes等, 1996)、実際にヒトCYP1B1は、17β-エストラ
ジオールの最も有効な4-ヒドロキシラーゼであると解される。対照的にマウスCY
P1B1は、エストラジオールヒドロキシラーゼとして機能しないようであり(savas
等, 1997)、CYP1B1の代謝能力の種間差異を示す。Liehr及びRicci(1996)は、乳
ガンミクロソームにおいて17β-エストラジオールの顕著なレベルの4-ヒドロキ
シル化が存在することを示した。彼らは、正常な乳房組織に存在する非常に低い
レベルのみの4-ヒドロキシル化と比較して、乳ガンから調製されたミクロソーム
において17β-エストラジオールの顕著に高い4-ヒドロキシル化を示した。免疫
応答性CYP1B1タンパク質(Murray等, 1997)及びCYP1B1 mRNA(McKay等, 1995)の両
者が乳ガンにおいて同定されており、CYP1B1が乳ガンにおいて発現されるチトク
ロームP450の主要な形態であることを示す。
瘍である。酵母(S. cerevisiae)において発現したヒトCYP1B1は、17β-エストラ
ジオールを4-ヒドロキシエストラジオールに変換する4-ヒドロキシル化に向けた
高い特異的な活性を示し(Hayes等, 1996)、実際にヒトCYP1B1は、17β-エストラ
ジオールの最も有効な4-ヒドロキシラーゼであると解される。対照的にマウスCY
P1B1は、エストラジオールヒドロキシラーゼとして機能しないようであり(savas
等, 1997)、CYP1B1の代謝能力の種間差異を示す。Liehr及びRicci(1996)は、乳
ガンミクロソームにおいて17β-エストラジオールの顕著なレベルの4-ヒドロキ
シル化が存在することを示した。彼らは、正常な乳房組織に存在する非常に低い
レベルのみの4-ヒドロキシル化と比較して、乳ガンから調製されたミクロソーム
において17β-エストラジオールの顕著に高い4-ヒドロキシル化を示した。免疫
応答性CYP1B1タンパク質(Murray等, 1997)及びCYP1B1 mRNA(McKay等, 1995)の両
者が乳ガンにおいて同定されており、CYP1B1が乳ガンにおいて発現されるチトク
ロームP450の主要な形態であることを示す。
【０００５】
Murray等(1997)におけるCYP1B1の初期の免疫組織化学的な研究により、乳ガン
を含むヒトのガンのいくつかのタイプにおける増大したCYP1B1発現が示され、CY
P1B1に対するポリクローナル抗体を使用して実施された。本発明は、この領域の
さらなる発展に関し、さらにヒトCYP1B1に特異的な抗体、特に免疫原としてCYP1
B1アミノ酸配列に基づく合成ペプチドを使用して生産されたモノクローナル抗体
に関する。ここに記載された研究は、免疫組織化学と、一連の原発性ヒト乳ガン
における免疫組織化学によるCYP1B1の発現の調査における上記抗体の使用を開示
する。
を含むヒトのガンのいくつかのタイプにおける増大したCYP1B1発現が示され、CY
P1B1に対するポリクローナル抗体を使用して実施された。本発明は、この領域の
さらなる発展に関し、さらにヒトCYP1B1に特異的な抗体、特に免疫原としてCYP1
B1アミノ酸配列に基づく合成ペプチドを使用して生産されたモノクローナル抗体
に関する。ここに記載された研究は、免疫組織化学と、一連の原発性ヒト乳ガン
における免疫組織化学によるCYP1B1の発現の調査における上記抗体の使用を開示
する。
【０００６】
従って、第一の特徴点として本発明は、チトクロームP450 CYP1B1に特異的に
結合する抗体の調製方法に関し、上記方法は、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若
しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より成
るペプチド、またはその抗原性断片を使用して上記抗体を生産することを含む。
結合する抗体の調製方法に関し、上記方法は、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若
しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より成
るペプチド、またはその抗原性断片を使用して上記抗体を生産することを含む。
【０００７】 典型的にこれらのペプチド配列内の抗原性断片は、３から１０アミノ酸、より
典型的には３から６アミノ酸よりなる。
典型的には３から６アミノ酸よりなる。
【０００８】 さらなる特徴点として本発明は、上記の方法によってハイブリドーマを得て抗
体を生産する方法を提供し、上記方法は、上記抗体を生産するハイブリドーマを
培養し、かくして生産された抗体を単離することを含む。上記方法は、ラベル、
毒素、薬剤または輸送分子のようなエフェクター分子に対して抗体を接合するさ
らなる工程を含んでもよい。
体を生産する方法を提供し、上記方法は、上記抗体を生産するハイブリドーマを
培養し、かくして生産された抗体を単離することを含む。上記方法は、ラベル、
毒素、薬剤または輸送分子のようなエフェクター分子に対して抗体を接合するさ
らなる工程を含んでもよい。
【０００９】 さらなる特徴点として本発明は、チトクロームP450 CYP1B1に対して特異的に
結合可能な抗体を提供し、ここで上記抗体は、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若
しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]内に含
まれるチトクロームP450 CYP1B1中のエピトープを認識する。
結合可能な抗体を提供し、ここで上記抗体は、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若
しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]内に含
まれるチトクロームP450 CYP1B1中のエピトープを認識する。
【００１０】 好ましくは上記抗体は、上記アミノ酸配列由来の３から１０アミノ酸の間のエ
ピトープ、より好ましくは上記アミノ酸配列由来の３から６アミノ酸の間のエピ
トープを認識する。
ピトープ、より好ましくは上記アミノ酸配列由来の３から６アミノ酸の間のエピ
トープを認識する。
【００１１】 好ましい抗体は、例えば以下の工程によって入手可能なモノクローナル抗体で
ある： (a)免疫原性キャリアーに接合した上記ペプチドで動物を免疫化する工程； (b)上記動物を殺傷し、上記動物から得られた脾臓細胞をミエローマ細胞と融合
して、一つ以上のハイブリドーマを生産する工程；並びに (c)上記ペプチドを結合可能な抗体について上記ハイブリドーマをスクリーニン
グする工程。
ある： (a)免疫原性キャリアーに接合した上記ペプチドで動物を免疫化する工程； (b)上記動物を殺傷し、上記動物から得られた脾臓細胞をミエローマ細胞と融合
して、一つ以上のハイブリドーマを生産する工程；並びに (c)上記ペプチドを結合可能な抗体について上記ハイブリドーマをスクリーニン
グする工程。
【００１２】 上記抗体は、ラベル、毒素、薬剤若しくはプロドラッグ、酵素または輸送分子
のようなエフェクターに接合されてもよい。
のようなエフェクターに接合されてもよい。
【００１３】 さらなる特徴点として本発明は、医薬的治療の方法における使用のための上記
抗体を提供する。
抗体を提供する。
【００１４】 さらなる特徴点として本発明は、ガンの治療のための医薬の調製のためのこれ
らの抗体の使用を提供する。
らの抗体の使用を提供する。
【００１５】 さらなる特徴点として本発明は、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若しくはPExFD
PARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より必須になるペプ
チドを提供する。
PARFLDKDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より必須になるペプ
チドを提供する。
【００１６】 さらなる特徴点として本発明は、患者から得たサンプル中に存在するガン細胞
を検出するアッセイ方法を提供し、上記方法は、患者から得た組織サンプルを上
記抗体と接触させる工程、及び上記組織サンプル中のガン細胞の存在の指標とし
て、上記サンプル中に存在するCYP1B1タンパク質に対する抗体の結合を検出する
工程を含む。
を検出するアッセイ方法を提供し、上記方法は、患者から得た組織サンプルを上
記抗体と接触させる工程、及び上記組織サンプル中のガン細胞の存在の指標とし
て、上記サンプル中に存在するCYP1B1タンパク質に対する抗体の結合を検出する
工程を含む。
【００１７】 例として、CYP1B1タンパク質に対する上記抗体の結合を検出する工程は、抗体
捕獲アッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、または抗原捕獲アッセイを使用し
て実施される。
捕獲アッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、または抗原捕獲アッセイを使用し
て実施される。
【００１８】 好ましくは上記方法は、乳ガン、大腸ガン、前立腺ガン、肝臓ガンまたは卵巣
ガンの診断または予後において補助するために使用される。
ガンの診断または予後において補助するために使用される。
【００１９】 本発明の各種のさらなる特徴点及び実施態様は、本開示に照らして当業者に明
らかであろう。本発明の特定の特徴点及び実施態様は、実施例に照らし、及び以
下の図面を参考にして説明されるであろう。
らかであろう。本発明の特定の特徴点及び実施態様は、実施例に照らし、及び以
下の図面を参考にして説明されるであろう。
【００２０】
抗体 ここに提供される記載に基づいて、当業者は、当該技術分野で標準的な方法を
使用して、CYP1B1を特異的に結合可能なさなる抗体を得ることができる。抗体の
生産する方法は、上記タンパク質またはその断片で動物（例えばマウス、ラット
、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫化することを含む。抗体は、
当該技術分野で周知の各種の方法のいずれかを使用して免疫化された動物から得
られ、好ましくは興味ある抗原に対する抗体の結合を使用してスクリーニングさ
れてもよい。例えば、ウエスタンブロッティング法または免役沈降を使用しても
よい(Armitage等, Nature 357: 80-82, 1992)。動物からの抗体の単離、及び／
または抗体生産細胞の単離は、動物を殺傷する工程を伴ってもよい。
使用して、CYP1B1を特異的に結合可能なさなる抗体を得ることができる。抗体の
生産する方法は、上記タンパク質またはその断片で動物（例えばマウス、ラット
、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫化することを含む。抗体は、
当該技術分野で周知の各種の方法のいずれかを使用して免疫化された動物から得
られ、好ましくは興味ある抗原に対する抗体の結合を使用してスクリーニングさ
れてもよい。例えば、ウエスタンブロッティング法または免役沈降を使用しても
よい(Armitage等, Nature 357: 80-82, 1992)。動物からの抗体の単離、及び／
または抗体生産細胞の単離は、動物を殺傷する工程を伴ってもよい。
【００２１】 実施例において示されるペプチドでの動物の免疫化の代替法または補足法とし
て、タンパク質に特異的な抗体は、発現されたイムノグロブリン可変ドメインの
組換え的に生産されたライブラリーから得られてもよく、例えばその表面に機能
的なイムノグロブリン結合ドメインを展示するラムダバクテリオファージまたは
繊維状バクテリオファージを使用してもよい；例えばWO92/01047を参照。上記ラ
イブラリーは天然であってもよく、つまり上記タンパク質（または断片）のいず
れかで免役化されていない生物から得られた配列から構築されてもよく、または
興味ある抗原にさらされている生物から得られた配列を使用して構築されたもの
でもよい。
て、タンパク質に特異的な抗体は、発現されたイムノグロブリン可変ドメインの
組換え的に生産されたライブラリーから得られてもよく、例えばその表面に機能
的なイムノグロブリン結合ドメインを展示するラムダバクテリオファージまたは
繊維状バクテリオファージを使用してもよい；例えばWO92/01047を参照。上記ラ
イブラリーは天然であってもよく、つまり上記タンパク質（または断片）のいず
れかで免役化されていない生物から得られた配列から構築されてもよく、または
興味ある抗原にさらされている生物から得られた配列を使用して構築されたもの
でもよい。
【００２２】 本出願において、用語、「抗体」は、必要とされる特異性、特にCYP1B1に対し
て特異的に結合する特性を有する結合ドメインを有するいずれかの結合物質を包
含するものとして定義され、それは好ましくは、CYP1B1と約40%のホモロジーを
有するCYP1A1及びCYP1A2のような関連タンパク質、または非関連タンパク質に対
して実質的に結合しない。用語、「抗体」は、抗体断片、誘導体、機能的同等物
、及び抗体のホモローグを含み、合成分子並びに抗原またはエピトープを結合可
能な抗体の形状を模倣した形状を有する分子を含む。好ましくは上記抗体は、３
から１０の間、より好ましくは３から６の間のアミノ酸よりなるエピトープのよ
うな、ペプチドＤまたはＥのアミノ酸配列内のエピトープに対して結合する。好
ましい抗体は、Scathcard分析によって測定すると、10-6mol-1以上、より好まし
くは10-8mol-1以上の結合アフィニティーを有して、CYP1B1に結合する(Antibodi
es, A Laboratory Manual, Harlow及びLane編, Cold Spring Harbor, 1988参照)
。
て特異的に結合する特性を有する結合ドメインを有するいずれかの結合物質を包
含するものとして定義され、それは好ましくは、CYP1B1と約40%のホモロジーを
有するCYP1A1及びCYP1A2のような関連タンパク質、または非関連タンパク質に対
して実質的に結合しない。用語、「抗体」は、抗体断片、誘導体、機能的同等物
、及び抗体のホモローグを含み、合成分子並びに抗原またはエピトープを結合可
能な抗体の形状を模倣した形状を有する分子を含む。好ましくは上記抗体は、３
から１０の間、より好ましくは３から６の間のアミノ酸よりなるエピトープのよ
うな、ペプチドＤまたはＥのアミノ酸配列内のエピトープに対して結合する。好
ましい抗体は、Scathcard分析によって測定すると、10-6mol-1以上、より好まし
くは10-8mol-1以上の結合アフィニティーを有して、CYP1B1に結合する(Antibodi
es, A Laboratory Manual, Harlow及びLane編, Cold Spring Harbor, 1988参照)
。
【００２３】 抗原または他の結合パートナーを結合可能な抗体断片の例は、VL、VH、C1及び
CH1ドメインより成るFab断片；VH及びCH1ドメインより成るFd断片；抗体の単一
の腕のVL及びVHドメインより成るFv断片；VHドメインより成るdAb断片；単離さ
れたCDR領域及びF(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合され
た二つのFab断片を含む二価断片である。一本鎖Fv断片もまた含まれる。
CH1ドメインより成るFab断片；VH及びCH1ドメインより成るFd断片；抗体の単一
の腕のVL及びVHドメインより成るFv断片；VHドメインより成るdAb断片；単離さ
れたCDR領域及びF(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合され
た二つのFab断片を含む二価断片である。一本鎖Fv断片もまた含まれる。
【００２４】 本発明に従ったモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝学的な
ミューテーションまたは他の変化を受けてもよい。モノクローナル抗体が、元々
も抗体の特異性を維持した他の抗体またはキメラ分子を生産するために組換えDN
A法の技術を受けることができることは、当業者にさらに理解されよう。上記技
術は、抗体のイムノグロブリン可変領域または相補性決定領域(CDR)をコードす
るDNAを、異なるイムノグロブリンの定常領域または定常領域プラスフレームワ
ーク領域に導入することを含んでもよい。例えばEP 0 184 187 A、GB 2 188 638
AまたはEP 0 239 400 Aを参照。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP 0 1
20 694 A及びEP 0 125 023 Aに記載されている。
ミューテーションまたは他の変化を受けてもよい。モノクローナル抗体が、元々
も抗体の特異性を維持した他の抗体またはキメラ分子を生産するために組換えDN
A法の技術を受けることができることは、当業者にさらに理解されよう。上記技
術は、抗体のイムノグロブリン可変領域または相補性決定領域(CDR)をコードす
るDNAを、異なるイムノグロブリンの定常領域または定常領域プラスフレームワ
ーク領域に導入することを含んでもよい。例えばEP 0 184 187 A、GB 2 188 638
AまたはEP 0 239 400 Aを参照。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP 0 1
20 694 A及びEP 0 125 023 Aに記載されている。
【００２５】 一つの実施態様として、本発明の抗体はヒト化される。非ヒト（例えば齧歯類
）抗体のヒト化形態は、キメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖若しくは
その断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2のような)、または非ヒトイムノグロブリンか
ら由来する最小の配列を含む抗体の他の抗原結合サブ配列である。ヒト化抗体は
、受容者の相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、アフィニティー
及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）
由来の残基によって置換されたヒトイムノグロブリン（受容者抗体）を含む。あ
る場合、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基
によって置換される。ヒト抗体はまた、受容者抗体及びインポートされたCDRま
たはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。一般的
にヒト化抗体は、非ヒトイムノグロブリンのものに相当する全て若しくは実質的
に全てのCDR、または全て若しくは実質的に全てのFR領域が、ヒトイムノグロブ
リンコンセンサス配列のものである、少なくても一つ、典型的には二つの可変領
域の実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は任意に、典型的にはヒトイムノ
グロブリンのものである、イムノグロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含
むであろう。例えばJones等, Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann等, Natu
re, 332: 323-329, 1988；及びPresta, Curr Op Struct. Biol., 2: 593-596, 1
992参照。
）抗体のヒト化形態は、キメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖若しくは
その断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2のような)、または非ヒトイムノグロブリンか
ら由来する最小の配列を含む抗体の他の抗原結合サブ配列である。ヒト化抗体は
、受容者の相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、アフィニティー
及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）
由来の残基によって置換されたヒトイムノグロブリン（受容者抗体）を含む。あ
る場合、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基
によって置換される。ヒト抗体はまた、受容者抗体及びインポートされたCDRま
たはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。一般的
にヒト化抗体は、非ヒトイムノグロブリンのものに相当する全て若しくは実質的
に全てのCDR、または全て若しくは実質的に全てのFR領域が、ヒトイムノグロブ
リンコンセンサス配列のものである、少なくても一つ、典型的には二つの可変領
域の実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は任意に、典型的にはヒトイムノ
グロブリンのものである、イムノグロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含
むであろう。例えばJones等, Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann等, Natu
re, 332: 323-329, 1988；及びPresta, Curr Op Struct. Biol., 2: 593-596, 1
992参照。
【００２６】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般的に
ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一つ以上のアミノ酸残基を有
する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、
典型的に「インポート」可変ドメインから由来する。ヒト化は、齧歯類のCDRま
たはCDR配列をヒト抗体の相当する配列で置換することによって、Jones等, Natu
re, 321: 522-525, 1986；Riechmann等, Nature, 332: 323-327, 1988；Verhoey
en等, Science, 239: 1534-1536, 1988に開示された方法に引き続いて必須に実
施できる。従って、上記「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的
に小さいものが、非ヒト種から由来する相当する配列によって置換されている、
キメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際に、ヒト化抗体は、いくつか
のCDR残基及びもしかしたらいくつかFR残基が、齧歯類抗体中の類似する部位か
ら由来する残基によって置換された、典型的にヒト抗体である。
ヒト化抗体は、非ヒトであるソースから導入された一つ以上のアミノ酸残基を有
する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、
典型的に「インポート」可変ドメインから由来する。ヒト化は、齧歯類のCDRま
たはCDR配列をヒト抗体の相当する配列で置換することによって、Jones等, Natu
re, 321: 522-525, 1986；Riechmann等, Nature, 332: 323-327, 1988；Verhoey
en等, Science, 239: 1534-1536, 1988に開示された方法に引き続いて必須に実
施できる。従って、上記「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的
に小さいものが、非ヒト種から由来する相当する配列によって置換されている、
キメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際に、ヒト化抗体は、いくつか
のCDR残基及びもしかしたらいくつかFR残基が、齧歯類抗体中の類似する部位か
ら由来する残基によって置換された、典型的にヒト抗体である。
【００２７】 二特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、
モノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。この場合、結合特
異性の一方はCYP1B1に対するものであり、他方はいずれかの他の抗原に対するも
のである。二特異性抗体を調製する方法は、当該技術分野で周知である。伝統的
に、二特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特性を有する、二つのイ
ムノグロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づく；Milstein及びCuello, Nature
, 305: 537-539, 1983参照。イムノグロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類の
ため、これらのハイブリドーマ（クアッドローマ）は、10種の異なる抗体分子の
可能性を有する混合物を生産し、その中で一つのみが正確な二特異性構造を有す
る。正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程を伴う。
モノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。この場合、結合特
異性の一方はCYP1B1に対するものであり、他方はいずれかの他の抗原に対するも
のである。二特異性抗体を調製する方法は、当該技術分野で周知である。伝統的
に、二特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特性を有する、二つのイ
ムノグロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づく；Milstein及びCuello, Nature
, 305: 537-539, 1983参照。イムノグロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類の
ため、これらのハイブリドーマ（クアッドローマ）は、10種の異なる抗体分子の
可能性を有する混合物を生産し、その中で一つのみが正確な二特異性構造を有す
る。正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程を伴う。
【００２８】 所望な結合特性を有する抗体を生産可能なハイブリドーマは、本発明の範囲内
にあり、抗体（抗体断片を含む）をコードする核酸を含み、その発現が可能であ
る真核生物または原核生物宿主細胞も同様である。本発明はまた、抗体が生産さ
れ、好ましくは分泌される条件の下で、抗体を生産可能な細胞を生育させること
を含む、抗体の生産方法を提供する。
にあり、抗体（抗体断片を含む）をコードする核酸を含み、その発現が可能であ
る真核生物または原核生物宿主細胞も同様である。本発明はまた、抗体が生産さ
れ、好ましくは分泌される条件の下で、抗体を生産可能な細胞を生育させること
を含む、抗体の生産方法を提供する。
【００２９】 本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して、ラベル、毒素、薬剤
、または輸送分子のようなエフェクター分子に結合また接合できる。診断用途の
ため、上記抗体は典型的にラベルに結合される。サンプルに対する抗体の反応性
は、いずれかの適切な手段によって測定されてもよい。個々のレポーター分子で
のタグ化は、一つの可能性を示す。上記レポーター分子は、検出可能で好ましく
は測定可能なシグナルを直接的または間接的に生産してもよい。レポーター分子
の結合は、直接的または間接的でもよく、例えばペプチド結合を介するような共
有結合または非共有結合であってもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体と
レポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として達成されて
もよい。
、または輸送分子のようなエフェクター分子に結合また接合できる。診断用途の
ため、上記抗体は典型的にラベルに結合される。サンプルに対する抗体の反応性
は、いずれかの適切な手段によって測定されてもよい。個々のレポーター分子で
のタグ化は、一つの可能性を示す。上記レポーター分子は、検出可能で好ましく
は測定可能なシグナルを直接的または間接的に生産してもよい。レポーター分子
の結合は、直接的または間接的でもよく、例えばペプチド結合を介するような共
有結合または非共有結合であってもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体と
レポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として達成されて
もよい。
【００３０】 一つの好ましい態様は、各抗体と、スペクトル的に単離される吸収または放射
特性を有する個々の蛍光分子、燐光色素またはレーザー色素の共有結合によって
達成される。適切に蛍光分子には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリス
リン、及びテキサスレッドが含まれる。適切な発光色素には、ジアミノベンジジ
ンが含まれる。
特性を有する個々の蛍光分子、燐光色素またはレーザー色素の共有結合によって
達成される。適切に蛍光分子には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリス
リン、及びテキサスレッドが含まれる。適切な発光色素には、ジアミノベンジジ
ンが含まれる。
【００３１】 他のレポーターには、着色した磁性またはパラ磁性のラテックスビーズのよう
なマクロ分子状コロイド粒子または粒子状材料、及び検出可能なシグナルの視覚
的観察、電気的検出若しくはさもなければ記録を、直接または間接に生じること
ができる生物学的または化学的活性剤が含まれる。これらの分子は、例えば着色
を形成若しくは変化させる、または電気特性をの変化を生じる反応を触媒する酵
素であってもよい。それらは、エネルギー状態の間の電気的遷移が、特徴的なス
ペクトルの吸収または放射を引き起こすように、分子的に励起可能であってもよ
い。それらは、バイオセンサーと接合して使用される化学的分子を含んでもよい
。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプタビジン及びアルカリホスファ
ターゼ検出系が使用されてもよい。
なマクロ分子状コロイド粒子または粒子状材料、及び検出可能なシグナルの視覚
的観察、電気的検出若しくはさもなければ記録を、直接または間接に生じること
ができる生物学的または化学的活性剤が含まれる。これらの分子は、例えば着色
を形成若しくは変化させる、または電気特性をの変化を生じる反応を触媒する酵
素であってもよい。それらは、エネルギー状態の間の電気的遷移が、特徴的なス
ペクトルの吸収または放射を引き起こすように、分子的に励起可能であってもよ
い。それらは、バイオセンサーと接合して使用される化学的分子を含んでもよい
。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプタビジン及びアルカリホスファ
ターゼ検出系が使用されてもよい。
【００３２】 アッセイ 患者から得られたサンプル中のCYP1B1のようなマーカーの存在または量を測定
する方法は、当該技術分野で周知であり、例えばアッセイにおいてCYP1B1の存在
または量を測定することを補助するための、結合剤及び／または検出剤としてこ
こで開示される抗体を使用するために、当業者に容易に応用される。上記アッセ
イの結果は、続いて臨床医が、患者がガンのようなCYP1B1発現（過剰発現または
縮小発現）と関連する疾患に罹患しているかまたは該疾患にかかる危険があるか
を決定することを可能にできる。上記アッセイの結果は、続いて臨床医が、上記
疾患の治療を最適化することを可能にし、適切な治療及び／または予防的治療を
提供し、最も有益であると思われるものを標的化することによって治療の流れを
可能にすることを許容できる。
する方法は、当該技術分野で周知であり、例えばアッセイにおいてCYP1B1の存在
または量を測定することを補助するための、結合剤及び／または検出剤としてこ
こで開示される抗体を使用するために、当業者に容易に応用される。上記アッセ
イの結果は、続いて臨床医が、患者がガンのようなCYP1B1発現（過剰発現または
縮小発現）と関連する疾患に罹患しているかまたは該疾患にかかる危険があるか
を決定することを可能にできる。上記アッセイの結果は、続いて臨床医が、上記
疾患の治療を最適化することを可能にし、適切な治療及び／または予防的治療を
提供し、最も有益であると思われるものを標的化することによって治療の流れを
可能にすることを許容できる。
【００３３】 好ましい実施態様として、CYP1B1の存在または量は、ガン、特に乳ガン、前立
腺ガン、大腸ガン、肝臓ガン、または卵巣ガンの診断において使用される。
腺ガン、大腸ガン、肝臓ガン、または卵巣ガンの診断において使用される。
【００３４】 上記方法は典型的に、血液、血清、組織、血清、尿または他の適切な体液のよ
うな、患者から得た生物学的サンプルを使用する。好ましい患者サンプルは、膀
胱、脳、乳房、大腸、結合組織、腎臓、肺、リンパ節、食道、炭層、皮膚、胃、
精巣及び子宮から選択される組織である。
うな、患者から得た生物学的サンプルを使用する。好ましい患者サンプルは、膀
胱、脳、乳房、大腸、結合組織、腎臓、肺、リンパ節、食道、炭層、皮膚、胃、
精巣及び子宮から選択される組織である。
【００３５】 上記抗体は、他の分子より好んでCYP1B1に特異的に結合することが可能な結合
部位を有するため、結合剤として使用できる。アッセイのいくつかのフォーマッ
トにおいて、上記結合剤は、アッセイの間の操作を簡便にするために、例えば所
定の空間的に分離された位置で固相の支持体に固定化される。上記サンプルは一
般的に、サンプル中の分析物を上記結合剤に結合させる適切な条件下で、上記結
合剤と接触する。次いで、上記結合剤の結合部位の断片的な占有が、分析物の直
接的若しくは間接的にラベリングによって、またはサンプル中の分析物の存在若
しくは量の指標として機能する検出剤若しくは試薬を使用することによって測定
できる。
部位を有するため、結合剤として使用できる。アッセイのいくつかのフォーマッ
トにおいて、上記結合剤は、アッセイの間の操作を簡便にするために、例えば所
定の空間的に分離された位置で固相の支持体に固定化される。上記サンプルは一
般的に、サンプル中の分析物を上記結合剤に結合させる適切な条件下で、上記結
合剤と接触する。次いで、上記結合剤の結合部位の断片的な占有が、分析物の直
接的若しくは間接的にラベリングによって、またはサンプル中の分析物の存在若
しくは量の指標として機能する検出剤若しくは試薬を使用することによって測定
できる。
【００３６】 別の実施態様として、本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して
検出可能である、例えば放射性活性、蛍光性または西洋ワサビペルオキシダーゼ
のような酵素ラベルで、上記抗体を直接または間接にラベリングすることによっ
て、生物学的サンプル中のCYP1B1を検出するための検出剤として使用できる。直
接的にラベルされた検出剤は、該試薬と会合したまたは該試薬に結合したラベル
を有する。間接的にラベルされた検出剤は、ラベルされた種（例えば検出剤に結
合可能なラベル化抗体）に結合可能であってもよく、または検出可能な結果を生
ずるさらなる種に対して作用してもよい。かくして放射性活性ラベルは、シンチ
レーションカウンターまたは他の放射線計数装置を使用して検出でき、蛍光ラベ
ルは、レーザー及び共焦点顕微鏡を使用して検出でき、並びに酵素ラベルは、典
型的に発色の変化を生じる基質に対する酵素ラベルの作用によって検出できる。
さらなる実施態様として、検出剤は、その検出を可能にするようにタグ化され、
例えば分析物を検出するためのPCR反応において増幅できるヌクレオチド配列に
結合される。他のラベルは当業者に周知であり、以下で議論される。検出剤は、
それが結合剤の占有される結合部位に対して分析物と競合する競合的方法、また
はラベル化検出剤が結合剤によって結合された分析物、若しくは占有される結合
部位に結合する非競合的方法において使用できる。両者の方法は、分析物によっ
て占有された結合部位の数の指標を提供し、それ故例えば周知の濃度の分析物を
含むサンプルを使用して得られたスタンダードと比較して、サンプル中の分析物
の濃度を提供する。別の実施態様として、分析物は、結合剤を含む支持体に適用
される前に、タグ化できる。
検出可能である、例えば放射性活性、蛍光性または西洋ワサビペルオキシダーゼ
のような酵素ラベルで、上記抗体を直接または間接にラベリングすることによっ
て、生物学的サンプル中のCYP1B1を検出するための検出剤として使用できる。直
接的にラベルされた検出剤は、該試薬と会合したまたは該試薬に結合したラベル
を有する。間接的にラベルされた検出剤は、ラベルされた種（例えば検出剤に結
合可能なラベル化抗体）に結合可能であってもよく、または検出可能な結果を生
ずるさらなる種に対して作用してもよい。かくして放射性活性ラベルは、シンチ
レーションカウンターまたは他の放射線計数装置を使用して検出でき、蛍光ラベ
ルは、レーザー及び共焦点顕微鏡を使用して検出でき、並びに酵素ラベルは、典
型的に発色の変化を生じる基質に対する酵素ラベルの作用によって検出できる。
さらなる実施態様として、検出剤は、その検出を可能にするようにタグ化され、
例えば分析物を検出するためのPCR反応において増幅できるヌクレオチド配列に
結合される。他のラベルは当業者に周知であり、以下で議論される。検出剤は、
それが結合剤の占有される結合部位に対して分析物と競合する競合的方法、また
はラベル化検出剤が結合剤によって結合された分析物、若しくは占有される結合
部位に結合する非競合的方法において使用できる。両者の方法は、分析物によっ
て占有された結合部位の数の指標を提供し、それ故例えば周知の濃度の分析物を
含むサンプルを使用して得られたスタンダードと比較して、サンプル中の分析物
の濃度を提供する。別の実施態様として、分析物は、結合剤を含む支持体に適用
される前に、タグ化できる。
【００３７】 医薬用途 本発明の抗体は、診断用途または治療用途のための組成物中に処方できる。こ
の場合上記抗体は、単離された形態及び／または精製形態で提供され、典型的に
少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少な
くとも約９８％の活性成分として組成物中に存在する。しかしながら上記組成物
は、不活性キャリアー物質または他の製薬学的及び生理学的に許容可能な賦形剤
を含んでもよい。以下に記載されるように、本発明に従った組成物は、開示され
た抗体に加えて、抗腫瘍剤のような一つ以上のための治療用途の分子を含んでも
よい。好ましい実施態様として、上記抗体は、CYP1B1を発現する細胞に対してエ
フェクターを標的なするために、抗腫瘍薬剤またはプロドラッグであるエフェク
ターに結合される。
の場合上記抗体は、単離された形態及び／または精製形態で提供され、典型的に
少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少な
くとも約９８％の活性成分として組成物中に存在する。しかしながら上記組成物
は、不活性キャリアー物質または他の製薬学的及び生理学的に許容可能な賦形剤
を含んでもよい。以下に記載されるように、本発明に従った組成物は、開示され
た抗体に加えて、抗腫瘍剤のような一つ以上のための治療用途の分子を含んでも
よい。好ましい実施態様として、上記抗体は、CYP1B1を発現する細胞に対してエ
フェクターを標的なするために、抗腫瘍薬剤またはプロドラッグであるエフェク
ターに結合される。
【００３８】 患者に与えられる本発明の抗体の投与は、好ましくは「予防上の有効量」また
は「治療上の有効量」（この場合予防は治療と解されてもよい）で存在し、これ
は患者に利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、投与の割合及び
タイムコースは、治療されるものの性質及びひどさに依存するであろう。例えば
投与量の等の決定といった治療の処方箋は、一般的な実施者及び他の医療の医者
の責任の範囲内にある。
は「治療上の有効量」（この場合予防は治療と解されてもよい）で存在し、これ
は患者に利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、投与の割合及び
タイムコースは、治療されるものの性質及びひどさに依存するであろう。例えば
投与量の等の決定といった治療の処方箋は、一般的な実施者及び他の医療の医者
の責任の範囲内にある。
【００３９】 組成物は、単独でまたは他の治療と組み合わせて、治療される疾患に依存して
同時的にまたは連続して投与されてもよい。
同時的にまたは連続して投与されてもよい。
【００４０】 本発明に従った製薬組成物、及び本発明に従った使用のための製薬組成物は、
活性成分に加えて、当業者に周知の製薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアー、
バッファー、安定剤または他の物質を含んでもよい。上記物質は非毒性であるべ
きであり、活性成分の効力を妨げないものであるべきである。キャリアーまたは
他の物質の正確な性質は、経口かまたは皮膚、皮下若しくは静脈内といった注射
によるのかという投与の経路に依存するであろう。
活性成分に加えて、当業者に周知の製薬学的に許容可能な賦形剤、キャリアー、
バッファー、安定剤または他の物質を含んでもよい。上記物質は非毒性であるべ
きであり、活性成分の効力を妨げないものであるべきである。キャリアーまたは
他の物質の正確な性質は、経口かまたは皮膚、皮下若しくは静脈内といった注射
によるのかという投与の経路に依存するであろう。
【００４１】 経口投与のための製薬組成物は、錠剤、カプセル、パウダー若しくは液体形態
で存在してもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体のキャリ
アーを含んでもよい。気体製薬組成物は一般的に、水、ワセリン、動物若しくは
植物油、鉱油若しくは合成油のような液体のキャリアーを含む。生理食塩水溶液
、デキストロース若しくは他のサッカリド溶液、またはエチレングリコール、プ
ロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含ま
れてもよい。
で存在してもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体のキャリ
アーを含んでもよい。気体製薬組成物は一般的に、水、ワセリン、動物若しくは
植物油、鉱油若しくは合成油のような液体のキャリアーを含む。生理食塩水溶液
、デキストロース若しくは他のサッカリド溶液、またはエチレングリコール、プ
ロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含ま
れてもよい。
【００４２】 静脈内、皮膚若しくは皮下注射、または疾患部位での注射のために、活性成分
は、病原体を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する全身で許容可能な水
溶液の形態で存在するであろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リン
ガー注射液、乳酸化リンガー注射液のような等張性ビヒクルを使用して、適切な
溶液を調製可能である。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、及び／または
他の添加剤が、必要に合わせて含まれてもよい。
は、病原体を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する全身で許容可能な水
溶液の形態で存在するであろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リン
ガー注射液、乳酸化リンガー注射液のような等張性ビヒクルを使用して、適切な
溶液を調製可能である。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、及び／または
他の添加剤が、必要に合わせて含まれてもよい。
【００４３】 上述の方法及びプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Science,
第１６版, Osol, A,(編), 1980に見出すことができる。
第１６版, Osol, A,(編), 1980に見出すことができる。
【００４４】 上記試薬は、腫瘍部位または他の所望の部位に局所的な態様で投与されてもよ
く、あるいは腫瘍または他の細胞を標的化する態様で輸送されてもよい。
く、あるいは腫瘍または他の細胞を標的化する態様で輸送されてもよい。
【００４５】 本発明の抗体は、CYP1B1を発現する細胞または身体の領域に治療を標的化する
ために使用できる。治療の標的化は、とりわけCYP1B1を発現または展示する細胞
に、薬剤またはプロドラッグのいずれかの活性剤を輸送するために使用されても
よい。例えば試薬が許容不可能に毒性である場合、または試薬がさもないとあま
りに高い投与量を必要とする場合、または試薬がさもないと標的細胞に侵入でき
ない場合といった各種の理由のため、標的化は望ましいであろう。上記試薬は、
治療される細胞中で生産される、または上記細胞に標的化される活性化剤によっ
て活性形態に変換するために、前駆体形態で投与されてもよい。このタイプのア
プローチは、場合によりADEPTとして周知であり、これは本発明の細胞特異的抗
体に対する接合によって、細胞に対して活性化剤を標的化することを含む。
ために使用できる。治療の標的化は、とりわけCYP1B1を発現または展示する細胞
に、薬剤またはプロドラッグのいずれかの活性剤を輸送するために使用されても
よい。例えば試薬が許容不可能に毒性である場合、または試薬がさもないとあま
りに高い投与量を必要とする場合、または試薬がさもないと標的細胞に侵入でき
ない場合といった各種の理由のため、標的化は望ましいであろう。上記試薬は、
治療される細胞中で生産される、または上記細胞に標的化される活性化剤によっ
て活性形態に変換するために、前駆体形態で投与されてもよい。このタイプのア
プローチは、場合によりADEPTとして周知であり、これは本発明の細胞特異的抗
体に対する接合によって、細胞に対して活性化剤を標的化することを含む。
【００４６】
P450配列整列、ペプチド選択及び免疫化 ヒトCYP1A1とCYP1A2アミノ酸配列と、ヒトCYP1B1アミノ酸配列との構造的ホモ
ロジーモデリングと配列整列の組み合わせに基づき、CYP1B1タンパク質のC末端
側３分の１に位置する148アミノ酸部分が、CYP1B1タンパク質の外側部分に位置
するであろうアミノ酸の領域を含むと予測された。CYP1B1タンパク質のこの部分
に相当する１４または１５のアミノ酸残基のペプチドを、University of Aberde
en Protein Facilityにおいて合成した。CYP1B1タンパク質上の個々のペプチド
配列及びアミノ酸位置は、表１に示される。右側の欄は、免疫反応を生産するペ
プチド断片を示す（ペプチドＤ及びＥ）。
ロジーモデリングと配列整列の組み合わせに基づき、CYP1B1タンパク質のC末端
側３分の１に位置する148アミノ酸部分が、CYP1B1タンパク質の外側部分に位置
するであろうアミノ酸の領域を含むと予測された。CYP1B1タンパク質のこの部分
に相当する１４または１５のアミノ酸残基のペプチドを、University of Aberde
en Protein Facilityにおいて合成した。CYP1B1タンパク質上の個々のペプチド
配列及びアミノ酸位置は、表１に示される。右側の欄は、免疫反応を生産するペ
プチド断片を示す（ペプチドＤ及びＥ）。
【００４７】
【表１】
【００４８】 次いで個々のペプチドを、以前に記載されたように(Duncan等, 1992)グルタル
アルデヒドを使用してオボアルブミンに接合し、各ペプチド接合物を免疫原とし
て使用した。フロイント不完全アジュバントと混合した個々のペプチド接合物を
、BALB/cマウス内に腹膜内で注射し、最初の免疫化の後の２−４週で、同じペプ
チド接合物でマウスを再免疫化した。各ペプチド接合物に対する免疫応答の存在
を、イムノブロッティングによって発現されたCYP1B1の認識について、各マウス
から得た血清（第二の免疫化の後１０日で得られた）を試験することによって測
定した。CYP1B1の認識が最大である血清を有するマウスに、適切なペプチド接合
物での最終免疫化を与え、モノクローナル抗体の生産として使用した。
アルデヒドを使用してオボアルブミンに接合し、各ペプチド接合物を免疫原とし
て使用した。フロイント不完全アジュバントと混合した個々のペプチド接合物を
、BALB/cマウス内に腹膜内で注射し、最初の免疫化の後の２−４週で、同じペプ
チド接合物でマウスを再免疫化した。各ペプチド接合物に対する免疫応答の存在
を、イムノブロッティングによって発現されたCYP1B1の認識について、各マウス
から得た血清（第二の免疫化の後１０日で得られた）を試験することによって測
定した。CYP1B1の認識が最大である血清を有するマウスに、適切なペプチド接合
物での最終免疫化を与え、モノクローナル抗体の生産として使用した。
【００４９】 CYP1B1に対するモノクローナル抗体 ペプチド接合物での最終免疫化の４日後、マウスを殺傷し、その脾臓を単離し
、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞(Ag8.653)と融合した。生成したハイブリド
ーマクローンを、ウシ血清アルブミン(BSA)と接合した関連ペプチドを使用して
、固相酵素免疫検定法(ELISA)によって抗体生産に対してスクリーニングした。B
SA接合物を、50mM 炭酸／二炭酸ナトリウムバッファー、pH9.6中で４℃で一晩イ
ンキュベーションすることによってELISAプレートに結合し、以前に記載された
ようにELISAを実施した(Duncan等, 1992; Murray等, 1998b)。ELISAによって強
力にポジティブであるハイブリドーマクローンを、二度サブクローン化し、発現
したCYP1B1、発現したCYP1A1、コントロールミクロソーム、及びヒト肝ミクロソ
ームを使用するイムノブロッティングによってさらに試験した。製造者の説明書
に従って実施するIsostripキット(Roche Diagnostics, Lewes, Sussex, UK)を使
用して、モノクローナル抗体を単離した。
、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞(Ag8.653)と融合した。生成したハイブリド
ーマクローンを、ウシ血清アルブミン(BSA)と接合した関連ペプチドを使用して
、固相酵素免疫検定法(ELISA)によって抗体生産に対してスクリーニングした。B
SA接合物を、50mM 炭酸／二炭酸ナトリウムバッファー、pH9.6中で４℃で一晩イ
ンキュベーションすることによってELISAプレートに結合し、以前に記載された
ようにELISAを実施した(Duncan等, 1992; Murray等, 1998b)。ELISAによって強
力にポジティブであるハイブリドーマクローンを、二度サブクローン化し、発現
したCYP1B1、発現したCYP1A1、コントロールミクロソーム、及びヒト肝ミクロソ
ームを使用するイムノブロッティングによってさらに試験した。製造者の説明書
に従って実施するIsostripキット(Roche Diagnostics, Lewes, Sussex, UK)を使
用して、モノクローナル抗体を単離した。
【００５０】 組織 正常な組織（肝臓、腎臓、肺、膵臓、副腎皮質、脳、胃、空腸、大腸、乳房及
び卵巣）のサンプルを、診断のためDepartment of Pathology, University of A
berdeenに寄託された新鮮な未固定組織サンプルから得た。組織のサンプルを液
体窒素中で凍結し、ミクロソームの調製の前に−７５℃で貯蔵した。原発性乳ガ
ンのサンプル(n=61)を、診断のためDepartment of Pathology, University of A
berdeenに寄託された乳房組織のサンプルから得た。乳房組織の全てのサンプル
を、最終的な治療の前に診断プロトコールとして実施する触知可能な乳房の針コ
ア生検標本から得た。コア生検標本を、室温で１０％中性緩衝ホルマリン中で固
定し、ワックス中に従来通り埋め込んだ。
び卵巣）のサンプルを、診断のためDepartment of Pathology, University of A
berdeenに寄託された新鮮な未固定組織サンプルから得た。組織のサンプルを液
体窒素中で凍結し、ミクロソームの調製の前に−７５℃で貯蔵した。原発性乳ガ
ンのサンプル(n=61)を、診断のためDepartment of Pathology, University of A
berdeenに寄託された乳房組織のサンプルから得た。乳房組織の全てのサンプル
を、最終的な治療の前に診断プロトコールとして実施する触知可能な乳房の針コ
ア生検標本から得た。コア生検標本を、室温で１０％中性緩衝ホルマリン中で固
定し、ワックス中に従来通り埋め込んだ。
【００５１】 乳ガンの診断を、標準的な組織病理学的基準を使用してヘマトキシリンとエオ
シンで染色した切片で実施した。Elston及びEllis(1991)に記載された基準に従
って腫瘍を段階化し、乳ガンのエストロゲンレセプター状態を、以前に記載され
たようにエストロゲンレセプタータンパク質に対する免疫組織化学によって評価
した(King等, 1997)。リンパ節状態を、組織病理学的調査のため寄託された後腋
窩リンパ節から評価した。乳ガンの臨床的病理学的特徴は、表２に記載される。
シンで染色した切片で実施した。Elston及びEllis(1991)に記載された基準に従
って腫瘍を段階化し、乳ガンのエストロゲンレセプター状態を、以前に記載され
たようにエストロゲンレセプタータンパク質に対する免疫組織化学によって評価
した(King等, 1997)。リンパ節状態を、組織病理学的調査のため寄託された後腋
窩リンパ節から評価した。乳ガンの臨床的病理学的特徴は、表２に記載される。
【００５２】
【表２】
【００５３】 発現したCYP1B1及びCYP1A1 発現したヒトCYP1B1、発現したCYP1A1を含むヒトリンパ芽細胞、またはベクタ
ーのみを含むコントロールリンパ芽細胞から調製されたミクロソームを、Gentes
t Corp. Woburn, Maから得た。
ーのみを含むコントロールリンパ芽細胞から調製されたミクロソームを、Gentes
t Corp. Woburn, Maから得た。
【００５４】 ミクロソームの調製 組織の凍結サンプルを、1.15% KClを含む0.01M Tris-HClpH7.4中で氷上で解凍
した。解凍した組織サンプルを、結合組織と脂肪を含まないように解剖し、外科
用メスを使用して均一に切断し、Polytron PT3000ホモゲナイザー(Kinematica A
G, Switzerland)を使用して、0.25Mスクロースと15%グリセロールを含む0.01M T
ris-HCl中で均質化した。ホモゲネートを、Centrikon T-124遠心機(Kontron Ins
truments, Cumbernauld, UK)を使用して４℃で２０分15000gで遠心分子した。次
いで生成した上清を、Centrikon T-1160遠心機(Kontron Instruments)を使用し
て４℃で１時間180,000g(44,000rpm)で遠心分離した。遠心分離の後に得られた
ペレットを、15%グリセロールと1mM EDTA(Sigma-Aldrich Co. Poole, Dorset, U
K)を含む0.1M Tris-HCl中に再懸濁し、４℃で１時間180,000g(44,000rpm)で再び
遠心分離した。最終ミクロソームペレットを、15%グリセロールと1mM EDTAを含
む0.1M Tris-HCl中に再懸濁し、ミクロソームサンプルを使用前に−７５℃で貯
蔵した。ミクロソームの各サンプルのタンパク質濃度を、Bradford法(Bradford,
1976)を使用して測定した。ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich)を、タンパク
質スタンダードとして使用した。
した。解凍した組織サンプルを、結合組織と脂肪を含まないように解剖し、外科
用メスを使用して均一に切断し、Polytron PT3000ホモゲナイザー(Kinematica A
G, Switzerland)を使用して、0.25Mスクロースと15%グリセロールを含む0.01M T
ris-HCl中で均質化した。ホモゲネートを、Centrikon T-124遠心機(Kontron Ins
truments, Cumbernauld, UK)を使用して４℃で２０分15000gで遠心分子した。次
いで生成した上清を、Centrikon T-1160遠心機(Kontron Instruments)を使用し
て４℃で１時間180,000g(44,000rpm)で遠心分離した。遠心分離の後に得られた
ペレットを、15%グリセロールと1mM EDTA(Sigma-Aldrich Co. Poole, Dorset, U
K)を含む0.1M Tris-HCl中に再懸濁し、４℃で１時間180,000g(44,000rpm)で再び
遠心分離した。最終ミクロソームペレットを、15%グリセロールと1mM EDTAを含
む0.1M Tris-HCl中に再懸濁し、ミクロソームサンプルを使用前に−７５℃で貯
蔵した。ミクロソームの各サンプルのタンパク質濃度を、Bradford法(Bradford,
1976)を使用して測定した。ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich)を、タンパク
質スタンダードとして使用した。
【００５５】 イムノブロッティング ミクロソームタンパク質のサンプルを、Hoefer SE600垂直ゲル電気泳動ゲル(A
mersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Bucks, UK)を使用して10%ポリ
アクリルアミドゲルで一定電流で電気泳動により分離し、Hoefer TE42ブロッテ
ィングシステム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して電気ブロットによりニ
トロセルロース(Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech)に１８時間一定電流
でトランスファーした。電気泳動トランスファーの後、非特異的タンパク質結合
部位を、0.05% Tween 20(Sigma)を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水中の2%ノンフ
ァットミルク(marvel, Premier Beverages, Stafford, UK)より成る洗浄バッフ
ァー中で、室温で６０分ニトロセルロース膜にインキュベーションによりブロッ
クした。次いでニトロセルロース膜を、免疫マウス血清(1/250)またはCYP1B1モ
ノクローナル抗体(1/100)、及び西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗
マウスイムノグロブリン(1/2000; Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)と共に連続的
にインキュベートした。各抗体とのインキュベーションに引き続き、膜を洗浄バ
ッファーで５回１０分間洗浄し、非結合二次抗体の除去の後、膜を10mMリン酸緩
衝生理食塩水で５回１０分間さらに洗浄した。次いで西洋ワサビペルオキシダー
ゼを、以前に記載されたように実施する(McKay等, 1995; Murray等, 1997)、普
及した化学発光法を使用して発光させた(ECL plus, Amersham Pharmacia Biotec
h)。略記すると、ニトロセルロース膜を、4mlの検出試薬１(lumigen PS-3, Amer
sham Pharmacia Biotech)及び100μlの検出試薬２(luminol PS-3, Amersham Pha
rmacia Biotech)より成る溶液中に、室温で５分インキュベートし、乾燥してブ
ロットし、透明なプラスチックフィルムに包み、X線フィルムにさらす(Amersham
Pharmacia Biotech)。
mersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Bucks, UK)を使用して10%ポリ
アクリルアミドゲルで一定電流で電気泳動により分離し、Hoefer TE42ブロッテ
ィングシステム(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して電気ブロットによりニ
トロセルロース(Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech)に１８時間一定電流
でトランスファーした。電気泳動トランスファーの後、非特異的タンパク質結合
部位を、0.05% Tween 20(Sigma)を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水中の2%ノンフ
ァットミルク(marvel, Premier Beverages, Stafford, UK)より成る洗浄バッフ
ァー中で、室温で６０分ニトロセルロース膜にインキュベーションによりブロッ
クした。次いでニトロセルロース膜を、免疫マウス血清(1/250)またはCYP1B1モ
ノクローナル抗体(1/100)、及び西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗
マウスイムノグロブリン(1/2000; Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)と共に連続的
にインキュベートした。各抗体とのインキュベーションに引き続き、膜を洗浄バ
ッファーで５回１０分間洗浄し、非結合二次抗体の除去の後、膜を10mMリン酸緩
衝生理食塩水で５回１０分間さらに洗浄した。次いで西洋ワサビペルオキシダー
ゼを、以前に記載されたように実施する(McKay等, 1995; Murray等, 1997)、普
及した化学発光法を使用して発光させた(ECL plus, Amersham Pharmacia Biotec
h)。略記すると、ニトロセルロース膜を、4mlの検出試薬１(lumigen PS-3, Amer
sham Pharmacia Biotech)及び100μlの検出試薬２(luminol PS-3, Amersham Pha
rmacia Biotech)より成る溶液中に、室温で５分インキュベートし、乾燥してブ
ロットし、透明なプラスチックフィルムに包み、X線フィルムにさらす(Amersham
Pharmacia Biotech)。
【００５６】 免疫組織化学 CYP1B1の免疫組織化学的検出を、触媒化シグナル増幅法を使用して実施した(K
ing等, 1997)。この研究において我々は、内因性ビオチンによるいずれかの考慮
される妨害を避けるため、我々の以前の研究で使用した(King等, 1997)ビオチン
化チラミドよりむしろフルオレセインチラミドを使用した。切片(4μmの厚さ)を
、アミノエチルプロポキシシランコート化スライド上で切断し、次いでキシレン
中で脱ワックス化し、100%エタノール、95%エタノール中で再水和し、150mM NaC
lを含む0.05M Tris-HCl pH7.6(TBS)中で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを、
90mMメタノールと3ml過酸化水素より成る溶液を使用して阻害した。ある実験で
は、フルパワー(800W)で操作するマイクロ波(ProlineTM, Proline, UK)で２０分
、0.01Mクエン酸バッファーpH6.0中に切片をマイクロ波処理することによって、
抗原の回復を実施し、別の実験では抗原の回復は実施しなかった。抗原の回復工
程の後、切片を室温に冷却し、一次モノクローナル抗CYP1B1抗体を適用した。
ing等, 1997)。この研究において我々は、内因性ビオチンによるいずれかの考慮
される妨害を避けるため、我々の以前の研究で使用した(King等, 1997)ビオチン
化チラミドよりむしろフルオレセインチラミドを使用した。切片(4μmの厚さ)を
、アミノエチルプロポキシシランコート化スライド上で切断し、次いでキシレン
中で脱ワックス化し、100%エタノール、95%エタノール中で再水和し、150mM NaC
lを含む0.05M Tris-HCl pH7.6(TBS)中で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを、
90mMメタノールと3ml過酸化水素より成る溶液を使用して阻害した。ある実験で
は、フルパワー(800W)で操作するマイクロ波(ProlineTM, Proline, UK)で２０分
、0.01Mクエン酸バッファーpH6.0中に切片をマイクロ波処理することによって、
抗原の回復を実施し、別の実験では抗原の回復は実施しなかった。抗原の回復工
程の後、切片を室温に冷却し、一次モノクローナル抗CYP1B1抗体を適用した。
【００５７】 一次抗体を、室温で６０分各種の希釈（希釈しないものから1/160まで）で組
織培養上清として適用した。一次抗体中でのインキュベーションの後、切片を５
分間３回連続してTBS中で洗浄し、次いでペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス
イムノグロブリン(4%正常ヒト血清を含むTBSで1/100, Dako, High Wycombe, UK)
を、室温で３０分適用した。次いで切片を、TBS及び0.5% Tween 20を含むTBS(TN
Tバッファー)中で洗浄した。次いで切片をTNTバッファーでさらに洗浄し、フル
オレセインチラミド(NEN, Hounslow, Middlesex, UK)を、室温で１０分間適用し
た。次いで切片をTNTバッファー中でさらに洗浄し、引き続き室温で３０分モノ
クローナルマウス抗フルオレセイン(1/20, Dako)を適用した。TNTバッファー中
でのさらなる洗浄の後、ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスイムノグロブリン
(4%正常ヒト血清を含むTBS中で1/100)を、室温で３０分適用した。TBS中で洗浄
した後、結合ペルオキシダーゼの部位を、ジアミノベンジジン及び過酸化水素を
含む溶液(Liquid DAB plus, Dako)を使用して発色生産的に示した。ペルオキシ
ダーゼ基質溶液中で室温で１０分切片をインキュベートした後、氷冷水中でスラ
イドを洗浄することによって反応を停止し、酵素反応産物を0.5%硫酸銅を使用し
て検出した。次いでスライドを氷冷水中で洗浄し、ヘマトキシリンでカウンター
染色し、アルコールで脱水し、キシレンで清浄化し、合成マウンティング媒体に
乗せた(DPX, BDH, Poole, Dorset, UK)。二人の独立の観察者による明視野光学
顕微鏡を使用して切片を観察し、イムノグロブリンの存在または非存在、及びそ
の配置と局在と強度を確立した。もしいずれかの腫瘍細胞が免疫染色を示すので
あれば、腫瘍はポジティブとして考慮され、もし腫瘍細胞における免疫染色が完
全に存在しなければ、腫瘍はネガティブとして分類される。
織培養上清として適用した。一次抗体中でのインキュベーションの後、切片を５
分間３回連続してTBS中で洗浄し、次いでペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス
イムノグロブリン(4%正常ヒト血清を含むTBSで1/100, Dako, High Wycombe, UK)
を、室温で３０分適用した。次いで切片を、TBS及び0.5% Tween 20を含むTBS(TN
Tバッファー)中で洗浄した。次いで切片をTNTバッファーでさらに洗浄し、フル
オレセインチラミド(NEN, Hounslow, Middlesex, UK)を、室温で１０分間適用し
た。次いで切片をTNTバッファー中でさらに洗浄し、引き続き室温で３０分モノ
クローナルマウス抗フルオレセイン(1/20, Dako)を適用した。TNTバッファー中
でのさらなる洗浄の後、ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスイムノグロブリン
(4%正常ヒト血清を含むTBS中で1/100)を、室温で３０分適用した。TBS中で洗浄
した後、結合ペルオキシダーゼの部位を、ジアミノベンジジン及び過酸化水素を
含む溶液(Liquid DAB plus, Dako)を使用して発色生産的に示した。ペルオキシ
ダーゼ基質溶液中で室温で１０分切片をインキュベートした後、氷冷水中でスラ
イドを洗浄することによって反応を停止し、酵素反応産物を0.5%硫酸銅を使用し
て検出した。次いでスライドを氷冷水中で洗浄し、ヘマトキシリンでカウンター
染色し、アルコールで脱水し、キシレンで清浄化し、合成マウンティング媒体に
乗せた(DPX, BDH, Poole, Dorset, UK)。二人の独立の観察者による明視野光学
顕微鏡を使用して切片を観察し、イムノグロブリンの存在または非存在、及びそ
の配置と局在と強度を確立した。もしいずれかの腫瘍細胞が免疫染色を示すので
あれば、腫瘍はポジティブとして考慮され、もし腫瘍細胞における免疫染色が完
全に存在しなければ、腫瘍はネガティブとして分類される。
【００５８】 ポジティブコントロール組織は、CYP1B1に対するポリクローナル抗体でのイム
ノブロッティング及び免疫組織化学の両者によって、我々が以前にCYP1B1を含む
ことを示した乳ガンの切片である(Murray等, 1997)。一次モノクローナル抗体の
代わりに使用されたネガティブコントロールは、TBS及び組織培養培地である。
一つの実験において、抗体は、免疫組織化学を実施する前にモノクローナル抗体
に対する免疫原として使用されたペプチド（ペプチドＥ, 10nmolのペプチド／抗
体のml)で予備吸収された液相である。
ノブロッティング及び免疫組織化学の両者によって、我々が以前にCYP1B1を含む
ことを示した乳ガンの切片である(Murray等, 1997)。一次モノクローナル抗体の
代わりに使用されたネガティブコントロールは、TBS及び組織培養培地である。
一つの実験において、抗体は、免疫組織化学を実施する前にモノクローナル抗体
に対する免疫原として使用されたペプチド（ペプチドＥ, 10nmolのペプチド／抗
体のml)で予備吸収された液相である。
【００５９】 卵巣ガンにおけるCYP1B1の局在 CYP1B1に対するモノクローナル抗体でのCYP1B1の免疫組織化学的検出を、チラ
ミンシグナル増幅法を使用して実施した。免疫反応性の部位を、ジアミノベンジ
ジン及び過酸化水素での発色生産により示した(Liquid DAB plus, Dako Ltd Hig
h Wycombe, Bucks, UK)。ティ不コントロール組織は、CYP1B1を含む乳ガンの切
片であり、ネガティブコントロールは、一次モノクローナル抗体の代わりにTris
緩衝食塩水(TNS)を使用した。CYP1B1の存在または非存在、並びにその配置、強
度、及び細胞局在を調べるために、二人の独立の観察者による明視野光学顕微鏡
を使用して、切片を調べた。腫瘍中のCYP1B1の免疫反応を、強、中、弱またはネ
ガティブとして評価した。5%より多い細胞でCYP1B1免疫反応を示す腫瘍を、ポジ
ティブとして考慮した。
ミンシグナル増幅法を使用して実施した。免疫反応性の部位を、ジアミノベンジ
ジン及び過酸化水素での発色生産により示した(Liquid DAB plus, Dako Ltd Hig
h Wycombe, Bucks, UK)。ティ不コントロール組織は、CYP1B1を含む乳ガンの切
片であり、ネガティブコントロールは、一次モノクローナル抗体の代わりにTris
緩衝食塩水(TNS)を使用した。CYP1B1の存在または非存在、並びにその配置、強
度、及び細胞局在を調べるために、二人の独立の観察者による明視野光学顕微鏡
を使用して、切片を調べた。腫瘍中のCYP1B1の免疫反応を、強、中、弱またはネ
ガティブとして評価した。5%より多い細胞でCYP1B1免疫反応を示す腫瘍を、ポジ
ティブとして考慮した。
【００６０】 結果 CYP1B1に対するモノクローナル抗体の開発 ペプチド接合物で注射したマウスから得た血清の免疫応答を、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動と、抗原として発現したCYP1B1を使用
するイムノブロットによって評価した。異なるペプチドで注射したマウスの血清
は、可変的な免疫応答を示した（上記表１）。ペプチドＤ及びＥで注射されたマ
ウスの血清は両者とも、CYP1B1の認識を示し、ポジティブな免疫応答を生ずると
判断された。ペプチドＥで注射されたマウスから得た血清は、ペプチドＤよりも
発現したヒトCYP1B1のわずかに強力な認識を与えた。しかしながら、ペプチドＡ
及びＢ並びにペプチドＦからＪで注射されたマウスから得た血清は、CYP1B1の明
らかな認識を示さず、有意な免疫応答は生じないと考慮された。それ故ペプチド
Ｅで注射されたマウスを、CYP1B1に対するモノクローナル抗体を開発するために
選択した。モノクローナル抗体を開発するために使用されるペプチド配列は、対
応するラットCYP1B1及びマウスCYP1B1配列と高い度合いの相同性を示し、１５の
アミノ残基の中で１３が同一である。
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動と、抗原として発現したCYP1B1を使用
するイムノブロットによって評価した。異なるペプチドで注射したマウスの血清
は、可変的な免疫応答を示した（上記表１）。ペプチドＤ及びＥで注射されたマ
ウスの血清は両者とも、CYP1B1の認識を示し、ポジティブな免疫応答を生ずると
判断された。ペプチドＥで注射されたマウスから得た血清は、ペプチドＤよりも
発現したヒトCYP1B1のわずかに強力な認識を与えた。しかしながら、ペプチドＡ
及びＢ並びにペプチドＦからＪで注射されたマウスから得た血清は、CYP1B1の明
らかな認識を示さず、有意な免疫応答は生じないと考慮された。それ故ペプチド
Ｅで注射されたマウスを、CYP1B1に対するモノクローナル抗体を開発するために
選択した。モノクローナル抗体を開発するために使用されるペプチド配列は、対
応するラットCYP1B1及びマウスCYP1B1配列と高い度合いの相同性を示し、１５の
アミノ残基の中で１３が同一である。
【００６１】 ペプチドＥ ヒトCYP1B1 PENFDPARFLDKDGL ラットCYP1B1 PEDFDPARFLDKDGF マウスCYP1B1 PEDFDPARFLDKDGF ** ***********
【００６２】 全ての３種のP450に共通のアミノ酸残基は、星印で示される
【００６３】 ペプチドＥで免疫化されたマウスから、５種のモノクローナル抗体を開発した
。個々の抗体は、5C4、5D3、5D9、5E2及び5G7と名付けられ、アイソタイプは全
ての抗体がIgG1κサブタイプであることを示した。全てのモノクローナル抗体は
、イムノブロッティングにより発現されたヒトCYP1B1の予想される分子量に相当
する52kDaの分子サイズの単一の免疫応答性バンドを認識し、発現されたヒトCYP
1A1、またはベクターのみのコントロールミクロソーム若しくはヒト肝ミクロソ
ームに存在するいずれのタンパク質も認識しなかった（図１）。発現されたCYP1
B1の連続的な希釈により、イムノブロッティングによる最小の検出可能なCYP1B1
の量は、発現されたCYP1B1の0.05pmolであった（図２）。CYP1B1は、腎臓、胃、
小腸、大腸及び肺を含む正常な成人ヒト組織の範囲から調製されたミクロソーム
のイムノブロッティングによっては同定されなかった（図３）。
。個々の抗体は、5C4、5D3、5D9、5E2及び5G7と名付けられ、アイソタイプは全
ての抗体がIgG1κサブタイプであることを示した。全てのモノクローナル抗体は
、イムノブロッティングにより発現されたヒトCYP1B1の予想される分子量に相当
する52kDaの分子サイズの単一の免疫応答性バンドを認識し、発現されたヒトCYP
1A1、またはベクターのみのコントロールミクロソーム若しくはヒト肝ミクロソ
ームに存在するいずれのタンパク質も認識しなかった（図１）。発現されたCYP1
B1の連続的な希釈により、イムノブロッティングによる最小の検出可能なCYP1B1
の量は、発現されたCYP1B1の0.05pmolであった（図２）。CYP1B1は、腎臓、胃、
小腸、大腸及び肺を含む正常な成人ヒト組織の範囲から調製されたミクロソーム
のイムノブロッティングによっては同定されなかった（図３）。
【００６４】 ポジティブコントロールとして使用された乳ガンのホルマリン固定化ワックス
埋没切片に対する免疫組織化学により、３種のモノクローナル抗体(5D3、5E2及
び5G7)は強力な染色を示す一方で、２種の抗体(5C4,5D9)は免疫反応性を示さな
いことが明らかとなった。ポジティブな免疫反応性を示すモノクローナル抗体は
全て、最適な免疫組織化学的結果のために抗原回復工程を必要とし、全ての３種
の抗体は、免疫組織化学的染色の局在と配置の同一のパターンを示した。それ故
モノクローナル抗体の１種のみ(5D3)が、乳ガンの後の免疫組織化学的研究のた
めに使用された。免疫組織化学を実施する前のペプチドＥでの抗ＣＹＰ１Ｂ１抗
体の液相予備インキュベーションにより、免疫反応性はほぼ完全に失われた。
埋没切片に対する免疫組織化学により、３種のモノクローナル抗体(5D3、5E2及
び5G7)は強力な染色を示す一方で、２種の抗体(5C4,5D9)は免疫反応性を示さな
いことが明らかとなった。ポジティブな免疫反応性を示すモノクローナル抗体は
全て、最適な免疫組織化学的結果のために抗原回復工程を必要とし、全ての３種
の抗体は、免疫組織化学的染色の局在と配置の同一のパターンを示した。それ故
モノクローナル抗体の１種のみ(5D3)が、乳ガンの後の免疫組織化学的研究のた
めに使用された。免疫組織化学を実施する前のペプチドＥでの抗ＣＹＰ１Ｂ１抗
体の液相予備インキュベーションにより、免疫反応性はほぼ完全に失われた。
【００６５】 CYP1B1免疫反応性は、乳ガンの場合４７（７７％）で同定され、１４の場合（
２３％）で検出可能なCYP1B1免疫反応性が存在しなかった。CYP1B1免疫反応性が
存在する各場合で、この免疫反応性は、腫瘍細胞の細胞質に局在した。免疫反応
性の強度は、１０（１６．４％）の場合で強く、１２（１９．７％）の場合で中
程度で、２５（４１％）の場合で弱い免疫反応性が存在した。異なるグレードの
CYP1B1の存在、乳ガンの組織学的タイプ、リンパ節状態が、表３−５に要約され
る。
２３％）で検出可能なCYP1B1免疫反応性が存在しなかった。CYP1B1免疫反応性が
存在する各場合で、この免疫反応性は、腫瘍細胞の細胞質に局在した。免疫反応
性の強度は、１０（１６．４％）の場合で強く、１２（１９．７％）の場合で中
程度で、２５（４１％）の場合で弱い免疫反応性が存在した。異なるグレードの
CYP1B1の存在、乳ガンの組織学的タイプ、リンパ節状態が、表３−５に要約され
る。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】 個々の生検に存在する場合、間質細胞または結合組織、並びにリンパ球及びプ
ラズマ細胞を含むその後の細胞タイプにおいて、CYP1B1免疫応答性は存在しなか
った。CYP1B1の存在は、エストロゲンレセプタータンパク質の存在と関連し（表
６，χ2＝８．５４；ｐ＝０．０３）、その一方で、CYP1B1の存在と、腫瘍の組
織学的タイプ、腫瘍のグレード、またはリンパ節転移の存在の有無の間には関係
が存在しなかった。
ラズマ細胞を含むその後の細胞タイプにおいて、CYP1B1免疫応答性は存在しなか
った。CYP1B1の存在は、エストロゲンレセプタータンパク質の存在と関連し（表
６，χ2＝８．５４；ｐ＝０．０３）、その一方で、CYP1B1の存在と、腫瘍の組
織学的タイプ、腫瘍のグレード、またはリンパ節転移の存在の有無の間には関係
が存在しなかった。
【００７０】
【表６】
【００７１】 原発性大腸ガンにおけるCYP1B1の発現 次いで、８０の原発生大腸ガンと、原発生大腸ガンからの１４の肝臓転移にお
けるＣＹＰ１Ｂ１の発現を調べるために、上記抗体を使用した。試験された１４
の肝臓転移のうち１３が、CYP1B1の発現を示した。
けるＣＹＰ１Ｂ１の発現を調べるために、上記抗体を使用した。試験された１４
の肝臓転移のうち１３が、CYP1B1の発現を示した。
【００７２】
【表７】
【００７３】
【表８】
【００７４】 卵巣ガンにおけるCYP1B1の局在 CYP1B1免疫反応性を、原発性卵巣ガンの多数(153/167；９２％)において同定
し、腫瘍細胞の細胞膜に特異的に局在していた。正常な卵巣組織サンプルのいず
れにも、検出可能なCYP1B1発現は存在しなかった。卵巣ガンの高いパーセンテー
ジにおいて、強力な(85/167；５０．９％)または中程度の(36/167；２３．４％)
CYP1B1に対する免疫反応性が存在した。さらにCYP1B1の存在は、転移沈着物の多
数(18/48；３７．５％)で観察され、高い割合で中程度(22/48；４５．８％)から
強力な(18/48；３７．５％)反応性を示した。同様なレベルのCYP1B1の発現が、
原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両者において異なる組織学的サブタイプについて示
された。原発性卵巣腫瘍及び転移性沈着物が入手可能である場合、CYP1B1発現に
ついての有意な相関関係（ｐ＝０．０２Spearman相関テスト）が観察された。
し、腫瘍細胞の細胞膜に特異的に局在していた。正常な卵巣組織サンプルのいず
れにも、検出可能なCYP1B1発現は存在しなかった。卵巣ガンの高いパーセンテー
ジにおいて、強力な(85/167；５０．９％)または中程度の(36/167；２３．４％)
CYP1B1に対する免疫反応性が存在した。さらにCYP1B1の存在は、転移沈着物の多
数(18/48；３７．５％)で観察され、高い割合で中程度(22/48；４５．８％)から
強力な(18/48；３７．５％)反応性を示した。同様なレベルのCYP1B1の発現が、
原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両者において異なる組織学的サブタイプについて示
された。原発性卵巣腫瘍及び転移性沈着物が入手可能である場合、CYP1B1発現に
ついての有意な相関関係（ｐ＝０．０２Spearman相関テスト）が観察された。
【００７５】 議論 CYP1B1は、乳ガンを含む各種の腫瘍において増大した発現を示し(Murray等, 1
997)、乳ガンにおける上昇したCYP1B1関連4-エストラジオールヒドロキシラーゼ
活性が存在する(Liehr及びRicci等, 1996)。CYP1B1はまた、多環式芳香族炭化水
素及び複素環式アミンを含む推定の各種のヒト発ガン物質を代謝することが可能
である(Shimada等, 1996; Crespi等, 1997)。かくしてCYP1B1は、抗ガン剤に対
する潜在的な標的として、及び腫瘍バイオマーカーとして、腫瘍の形成及び進行
において重要な役割を有する可能性が存する。腫瘍の個々のタイプにおけるCYP1
B1の存在に初期の研究は、CYP1B1のポリクローナル抗体を使用して実施され、各
腫瘍タイプについて少量のみの腫瘍サンプルが研究された(Murray等, 1997)。腫
瘍マーカーとしてのCYP1B1の可能性（腫瘍形成及び進行）をより完全に評価する
ために、ホルマリンに固定されワックスに埋め込まれた組織切片におけるCYP1B1
を特異的に認識する、ここに開示されたモノクローナル抗体が必要とされ、また
よりたくさんの研究される腫瘍が必要とされる。本研究は、CYP1B1に対する上記
モノクローナル抗体の開発を記載し、それらがイムノブロッティング及び免疫組
織化学によってCYP1B1を感度よく且つ特異的に検出することを示し、さらに原発
性乳ガン、前立腺ガン及び卵巣ガンのシリーズにおけるCYP1B1の存在を調査する
ためのこれらの抗体を使用する。
997)、乳ガンにおける上昇したCYP1B1関連4-エストラジオールヒドロキシラーゼ
活性が存在する(Liehr及びRicci等, 1996)。CYP1B1はまた、多環式芳香族炭化水
素及び複素環式アミンを含む推定の各種のヒト発ガン物質を代謝することが可能
である(Shimada等, 1996; Crespi等, 1997)。かくしてCYP1B1は、抗ガン剤に対
する潜在的な標的として、及び腫瘍バイオマーカーとして、腫瘍の形成及び進行
において重要な役割を有する可能性が存する。腫瘍の個々のタイプにおけるCYP1
B1の存在に初期の研究は、CYP1B1のポリクローナル抗体を使用して実施され、各
腫瘍タイプについて少量のみの腫瘍サンプルが研究された(Murray等, 1997)。腫
瘍マーカーとしてのCYP1B1の可能性（腫瘍形成及び進行）をより完全に評価する
ために、ホルマリンに固定されワックスに埋め込まれた組織切片におけるCYP1B1
を特異的に認識する、ここに開示されたモノクローナル抗体が必要とされ、また
よりたくさんの研究される腫瘍が必要とされる。本研究は、CYP1B1に対する上記
モノクローナル抗体の開発を記載し、それらがイムノブロッティング及び免疫組
織化学によってCYP1B1を感度よく且つ特異的に検出することを示し、さらに原発
性乳ガン、前立腺ガン及び卵巣ガンのシリーズにおけるCYP1B1の存在を調査する
ためのこれらの抗体を使用する。
【００７６】 CYP1B1に対するモノクローナル抗体を開発するために使用されるストラテジー
は、CYP1B1タンパク質の外部表面に位置し、それ故免疫原性と考えられるCYP1B1
の領域を同定するための、構造的分子モデリングと配列整列の組み合わせである
。ヘム結合領域を包含するCYP1B1タンパク質のC末端３分の１に位置する領域が
同定され、１４または１５アミノ酸配列より成るペプチドが合成されてキャリア
ータンパク質に接合された。各ペプチドをマウスに注射し、CYP1B1に対する各ペ
プチドの免疫反応性が、発現したCYP1B1を含むヒトリンパ芽細胞から調製された
ミクロソーム、及びベクターのみを含むミクロソームを使用するイムノブロッテ
ィングによって評価された。ペプチドＤ及びＥで免疫化されたマウスから得た血
清のみがCYP1B1の認識を示し、他のペプチドの全てがCYP1B1に対する有意な免疫
反応性を示さなかった。ペプチドＥで免疫化されたマウスは、CYP1B1に対するモ
ノクローナル抗体の開発のために選択された。モノクローナル抗体の生産のため
に使用されたペプチド配列は、ラットCYP1B1及びマウスCYP1B1と高い度合いの相
同性（１５アミノ酸のうち１３アミノ酸が同一）を示し、上記モノクローナル抗
体はまた、ラットCYP1B1及びマウスCYP1B1をも認識するものと予想できた。全て
のモノクローナル抗体はCYP1B1に対して特異的であり、CYP1A1若しくはCYP1A2、
及びCYP1遺伝子ファミリーの他の周知のメンバーのそれぞれを認識しなかった。
さらに上記抗体は、ヒト肝ミクロソームのいずれの他のタンパク質をも認識しな
かった。CYP1A2が肝臓において構成的に発現されるP450の主要な形態の一つであ
るため、ヒト肝ミクロソームは、CYP1A2についてのソースとして使用され、肝ミ
クロソームはまた、P450のいくつかの他の形態についてのソースとして機能し、
CYP1B1に対する抗体の特異性を確認するために、広範なスクリーニングを提供し
た。
は、CYP1B1タンパク質の外部表面に位置し、それ故免疫原性と考えられるCYP1B1
の領域を同定するための、構造的分子モデリングと配列整列の組み合わせである
。ヘム結合領域を包含するCYP1B1タンパク質のC末端３分の１に位置する領域が
同定され、１４または１５アミノ酸配列より成るペプチドが合成されてキャリア
ータンパク質に接合された。各ペプチドをマウスに注射し、CYP1B1に対する各ペ
プチドの免疫反応性が、発現したCYP1B1を含むヒトリンパ芽細胞から調製された
ミクロソーム、及びベクターのみを含むミクロソームを使用するイムノブロッテ
ィングによって評価された。ペプチドＤ及びＥで免疫化されたマウスから得た血
清のみがCYP1B1の認識を示し、他のペプチドの全てがCYP1B1に対する有意な免疫
反応性を示さなかった。ペプチドＥで免疫化されたマウスは、CYP1B1に対するモ
ノクローナル抗体の開発のために選択された。モノクローナル抗体の生産のため
に使用されたペプチド配列は、ラットCYP1B1及びマウスCYP1B1と高い度合いの相
同性（１５アミノ酸のうち１３アミノ酸が同一）を示し、上記モノクローナル抗
体はまた、ラットCYP1B1及びマウスCYP1B1をも認識するものと予想できた。全て
のモノクローナル抗体はCYP1B1に対して特異的であり、CYP1A1若しくはCYP1A2、
及びCYP1遺伝子ファミリーの他の周知のメンバーのそれぞれを認識しなかった。
さらに上記抗体は、ヒト肝ミクロソームのいずれの他のタンパク質をも認識しな
かった。CYP1A2が肝臓において構成的に発現されるP450の主要な形態の一つであ
るため、ヒト肝ミクロソームは、CYP1A2についてのソースとして使用され、肝ミ
クロソームはまた、P450のいくつかの他の形態についてのソースとして機能し、
CYP1B1に対する抗体の特異性を確認するために、広範なスクリーニングを提供し
た。
【００７７】 本研究では、各種の正常なヒト組織におけるイムノブロッティングによってCY
P1B1を検出することができなかった。正常なヒト肝臓及び一定範囲の肝臓外組織
の両者におけるCYP1B1タンパク質の非存在は、CYP1B1タンパク質が検出されない
という以前の免疫組織学的研究と一致する(Murray等, 1997)。この研究において
、比較的高量のミクロソームタンパク質(30μg)がレーン当たり乗せられ、研究
された正常組織における非常に低レベルのCYP1B1を検出可能であると思われるた
め、好感度の化学発光検出システムが使用された。
P1B1を検出することができなかった。正常なヒト肝臓及び一定範囲の肝臓外組織
の両者におけるCYP1B1タンパク質の非存在は、CYP1B1タンパク質が検出されない
という以前の免疫組織学的研究と一致する(Murray等, 1997)。この研究において
、比較的高量のミクロソームタンパク質(30μg)がレーン当たり乗せられ、研究
された正常組織における非常に低レベルのCYP1B1を検出可能であると思われるた
め、好感度の化学発光検出システムが使用された。
【００７８】 本研究のさらなる主要な目的は、免疫組織化学において使用可能であり、ホル
マリン固定化ワックス埋め込み組織切片に対して有効な、CYP1B1に対する抗体を
開発することであった。全てのモノクローナル抗体を、比較的高レベルのCYP1B1
を含むためにイムノブロットによって以前に示されてる(Murray等, 1997)乳ガン
のホルマリン固定化ワックス埋め込み切片を使用して、免疫組織化学によって評
価し、モノクローナル抗体のうち３種が、免疫組織化学によって有効にCYP1B1を
検出することが見出された。免疫組織化学でポジティブを生ずる３種の抗体は全
て、免疫反応性の同一のパターン及び強度を生じたため、抗体の１種のみをCYP1
B1発現を調査するために使用した。
マリン固定化ワックス埋め込み組織切片に対して有効な、CYP1B1に対する抗体を
開発することであった。全てのモノクローナル抗体を、比較的高レベルのCYP1B1
を含むためにイムノブロットによって以前に示されてる(Murray等, 1997)乳ガン
のホルマリン固定化ワックス埋め込み切片を使用して、免疫組織化学によって評
価し、モノクローナル抗体のうち３種が、免疫組織化学によって有効にCYP1B1を
検出することが見出された。免疫組織化学でポジティブを生ずる３種の抗体は全
て、免疫反応性の同一のパターン及び強度を生じたため、抗体の１種のみをCYP1
B1発現を調査するために使用した。
【００７９】 本研究は、乳ガンの７７％がCYP1B1を含み、各種用のにおいてCYP1B1が腫瘍細
胞に特異的に局在することを見出した。乳ガンにおける高頻度のCYP1B1の発現は
、少数の乳ガンの以前の研究と同様であり、CYP1B1が乳ガンに存在するチトクロ
ームP450の主要な形態であるという主張を支持するであろう(McKay等, 1995; Mu
rray等, 1997)。CYP1B1は、乳ガンの全ての組織学的タイプで見出され、CYP1B1
の存在は、乳ガンのいずれかの特定の組織学的タイプ、及びリンパ節転移の存在
の有無とは関連しないが、CYP1B1の発現は、エストロゲンレセプタータンパク質
の存在と相関した。これは、乳ガンにおけるアミノ酸４３２でのCYP1B1の多型（
バリン／ロイシン）と、エストロゲンレセプターの状態との間の相関関係が最近
記載されているため興味深い(Bailey等, 1998)。エストロゲンレセプター複合体
と、CYP1B1の転写調節に関与する(Schmidt及びBradfield, 1996)アリール炭化水
素レセプター複合体(Wang等, 1998)の間の「クロストーク」についての可能性も
また存在する。
胞に特異的に局在することを見出した。乳ガンにおける高頻度のCYP1B1の発現は
、少数の乳ガンの以前の研究と同様であり、CYP1B1が乳ガンに存在するチトクロ
ームP450の主要な形態であるという主張を支持するであろう(McKay等, 1995; Mu
rray等, 1997)。CYP1B1は、乳ガンの全ての組織学的タイプで見出され、CYP1B1
の存在は、乳ガンのいずれかの特定の組織学的タイプ、及びリンパ節転移の存在
の有無とは関連しないが、CYP1B1の発現は、エストロゲンレセプタータンパク質
の存在と相関した。これは、乳ガンにおけるアミノ酸４３２でのCYP1B1の多型（
バリン／ロイシン）と、エストロゲンレセプターの状態との間の相関関係が最近
記載されているため興味深い(Bailey等, 1998)。エストロゲンレセプター複合体
と、CYP1B1の転写調節に関与する(Schmidt及びBradfield, 1996)アリール炭化水
素レセプター複合体(Wang等, 1998)の間の「クロストーク」についての可能性も
また存在する。
【００８０】 CYP1B1は、エストラジオールの特異的なC4ヒドロキシラーゼ(Hayes等, 1996)
として機能し、エストロゲン代謝において関与しているため、乳ガン細胞におけ
るCYP1B1の存在は、エストラジオールの腫瘍内代謝に有意に寄与しているようで
ある。乳ガンにおけるCYP1B1の存在はまた、CYP1B1によって特異的に活性化され
る薬剤に対する分子標的を提供する。
として機能し、エストロゲン代謝において関与しているため、乳ガン細胞におけ
るCYP1B1の存在は、エストラジオールの腫瘍内代謝に有意に寄与しているようで
ある。乳ガンにおけるCYP1B1の存在はまた、CYP1B1によって特異的に活性化され
る薬剤に対する分子標的を提供する。
【００８１】 ホルマリン固定化ワックス埋め込み切片において有効であるCYP1B1に対するモ
ノクローナル抗体の開発は、異なる腫瘍タイプ及び関連する予備新形成病変にお
けるCYP1B1発現を調査するために有用なはずである。上記抗体は、ガンの診断の
ために使用できる。上記抗体はまた、in vivo診断試験における免疫化学的な基
準として、及びCYP1B1タンパク質及びその分解産物に標的化した治療薬として開
発することもできる。
ノクローナル抗体の開発は、異なる腫瘍タイプ及び関連する予備新形成病変にお
けるCYP1B1発現を調査するために有用なはずである。上記抗体は、ガンの診断の
ために使用できる。上記抗体はまた、in vivo診断試験における免疫化学的な基
準として、及びCYP1B1タンパク質及びその分解産物に標的化した治療薬として開
発することもできる。
【００８２】 ここに引用された参考文献は、参考として明白に取り込まれる。
【参考文献】
【図１】 図１は、CYP1B1に対する特異性を示すモノクローナル抗体(5D3
)での発現したCYP1B1のイムノブロットを示す図である。レーン１：発現したCYP
1B1(10μgのミクロソームタンパク質、0.86pmolのCYP1B1)；レーン２：発現した
CYP1A1(10μgのミクロソームタンパク質、0.53pmolのCYP1A1)；レーン３：ベク
ターのみを含むコントロールリンパ芽細胞ミクロソーム(10μgのミクロソームタ
ンパク質；レーン４：正常なヒト肝ミクロソーム(10μgのミクロソームタンパク
質）。分子量マーカーは、キロドルトン単位で右側に示される。
)での発現したCYP1B1のイムノブロットを示す図である。レーン１：発現したCYP
1B1(10μgのミクロソームタンパク質、0.86pmolのCYP1B1)；レーン２：発現した
CYP1A1(10μgのミクロソームタンパク質、0.53pmolのCYP1A1)；レーン３：ベク
ターのみを含むコントロールリンパ芽細胞ミクロソーム(10μgのミクロソームタ
ンパク質；レーン４：正常なヒト肝ミクロソーム(10μgのミクロソームタンパク
質）。分子量マーカーは、キロドルトン単位で右側に示される。
【図２】 図２は、モノクローナル抗体5D3を使用するCYP1B1の最小検出
可能量を表すイムノブロットを示す図である。レーン１からレーン６にかけて、
発現したCYP1B1の減少した量を表す。レーン１：0.86pmolのCYP1B1;レーン２：0
.43pmolのCYP1B1；レーン３：0.21pmolのCYP1B1；レーン４：0.1pmolのCYP1B1；
レーン５；0.05pmolのCYP1B1；レーン６；0.025pmolのCYP1B1。分子量マーカー
は、キロドルトン単位で右側に示される。
可能量を表すイムノブロットを示す図である。レーン１からレーン６にかけて、
発現したCYP1B1の減少した量を表す。レーン１：0.86pmolのCYP1B1;レーン２：0
.43pmolのCYP1B1；レーン３：0.21pmolのCYP1B1；レーン４：0.1pmolのCYP1B1；
レーン５；0.05pmolのCYP1B1；レーン６；0.025pmolのCYP1B1。分子量マーカー
は、キロドルトン単位で右側に示される。
【図３】 図３は、各種の正常ヒト組織から調製されたミクロソームのCY
P1B1のイムノブロットを示す図である。レーン１：発現したCYP1B1(0.86pmolのC
YP1B1に相当する10μgのミクロソームタンパク質)；レーン２：肝臓；レーン３
：腎臓；レーン４：肺；レーン５：膵臓；レーン６：副腎皮質；レーン７：脳（
髄質）；レーン８：胃；レーン９：空腸；レーン１０：大腸；レーン１１；乳房
；レーン１２：卵巣（正常なヒトの組織のレーン当たりに乗せたミクロソームタ
ンパク質は30μg）。分子量マーカーは、キロドルトン単位で右側に示される。
P1B1のイムノブロットを示す図である。レーン１：発現したCYP1B1(0.86pmolのC
YP1B1に相当する10μgのミクロソームタンパク質)；レーン２：肝臓；レーン３
：腎臓；レーン４：肺；レーン５：膵臓；レーン６：副腎皮質；レーン７：脳（
髄質）；レーン８：胃；レーン９：空腸；レーン１０：大腸；レーン１１；乳房
；レーン１２：卵巣（正常なヒトの組織のレーン当たりに乗せたミクロソームタ
ンパク質は30μg）。分子量マーカーは、キロドルトン単位で右側に示される。
【図４】 モノクローナル抗体5D3を使用する乳ガンにおけるCYP1B1の免
疫組織化学的説明を示す図である。Ａ：第３段階の侵襲性管ガンにおけるCYP1B1
の局在を示す。腫瘍細胞におけるCYP1B1に対する強力な免疫応答性が存在する。
Ｂ：乳ガン細胞における強力な免疫反応性を示す侵襲性小葉ガンにおけるCYP1B1
の局在を示す；Ｃ：一次CYP1B1モノクローナル抗体を免疫組織化学的な方法でTB
Sによって置換した場合、第３段階の侵襲性小葉ガンにおいて免疫応答性は存在
しない。スケールバーは60μmを表す。
疫組織化学的説明を示す図である。Ａ：第３段階の侵襲性管ガンにおけるCYP1B1
の局在を示す。腫瘍細胞におけるCYP1B1に対する強力な免疫応答性が存在する。
Ｂ：乳ガン細胞における強力な免疫反応性を示す侵襲性小葉ガンにおけるCYP1B1
の局在を示す；Ｃ：一次CYP1B1モノクローナル抗体を免疫組織化学的な方法でTB
Sによって置換した場合、第３段階の侵襲性小葉ガンにおいて免疫応答性は存在
しない。スケールバーは60μmを表す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月３日（２００１．５．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ｃ０７Ｋ 14/80 ４Ｈ０４５ 51/00 16/18 Ａ６１Ｐ 35/00 16/46 Ｃ０７Ｋ 14/80 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 16/46 33/531 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/531 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ 33/574 Ａ６１Ｋ 43/00 33/577 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA44 GA03 HA11 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA01 DA14 4C076 AA95 CC27 EE59 4C084 AA12 AA16 DC01 DC50 NA13 ZB262 4C085 AA14 BB22 CC23 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA40 BA41 BA50 CA40 DA76 DA86 EA20 EA51 FA40 FA50 FA72 FA74
Claims (25)
- 【請求項１】 チトクロームP450 CYP1B1に特異的に結合する抗体の調製方
法であって、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若しくはPExFDPARFLDKDGy[式中、xは
DまたはNであり、yはLまたはFである]より成るペプチド、またはその抗原性断片
を使用して上記抗体を生産することを含む方法。 - 【請求項２】 上記ペプチドが、３から１０アミノ酸より成る、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 上記ペプチドが、３から６アミノ酸より成る、請求項１また
は２記載の方法。 - 【請求項４】 上記ペプチドが、免疫原性キャリアーに接合される、請求項
１から３のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項５】 上記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から４の
いずれか一項記載の方法。 - 【請求項６】 上記モノクローナル抗体が、以下の工程： (a)免疫原性キャリアーに接合した上記ペプチドで動物を免疫化する工程； (b)上記動物を殺傷し、上記動物から得られた脾臓細胞をミエローマ細胞と融合
して、一つ以上のハイブリドーマを生産する工程；並びに (c)上記ペプチドを結合可能な抗体について上記ハイブリドーマをスクリーニン
グする工程； によって入手可能なものである、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 請求項６記載の方法によってハイブリドーマを得ることによ
って抗体を生産する方法であって、工程(c)で見出されたハイブリドーマを培養
し、かくして生産された上記抗体を単離することを含む方法。 - 【請求項８】 エフェクターに対して上記抗体を接合することをさらに含む
、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 上記エフェクターが、ラベル、毒素、薬剤若しくはプロドラ
ッグ、酵素、または輸送分子である、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 チトクロームP450 CYP1B1に特異的に結合することが可能
な抗体であって、アミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若しくはPExFDPARFLDKDGy[式中
、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]内に含まれる、チトクロームP450 CY
P1B1タンパク中のエピトープを認識する抗体。 - 【請求項１１】 上記アミノ酸配列から得られる３から１０の間のアミノ酸
のエピトープを認識する、請求項１０記載の抗体。 - 【請求項１２】 上記アミノ酸配列から得られる３から６の間のアミノ酸の
エピトープを認識する、請求項１０記載の抗体。 - 【請求項１３】 モノクローナル抗体である、請求項１０から１２のいずれ
か一項記載の抗体。 - 【請求項１４】 ヒト化されている、請求項１０から１２のいずれか一項記
載の抗体。 - 【請求項１５】 モノクローナル抗体であり、以下の工程： (a)免疫原性キャリアーに接合した上記ペプチドで動物を免疫化する工程； (b)上記動物を殺傷し、上記動物から得られた脾臓細胞をミエローマ細胞と融合
して、一つ以上のハイブリドーマを生産する工程；並びに (c)上記ペプチドを結合可能な抗体について上記ハイブリドーマをスクリーニン
グする工程； によって入手可能なものである、請求項１３記載の抗体。 - 【請求項１６】 エフェクターに接合されている、請求項１０から５のいず
れか一項記載の抗体。 - 【請求項１７】 上記エフェクターが、ラベル、毒素、薬剤若しくはプロド
ラッグ、酵素、または輸送分子である、請求項１６記載の抗体。 - 【請求項１８】 医学的治療の方法における使用のための、請求項１０から
１７のいずれか一項記載の抗体。 - 【請求項１９】 ガンの治療のための医薬の調製のための、請求項１０から
１７のいずれか一項記載の抗体の使用。 - 【請求項２０】 必須にアミノ酸配列VNQWSVNHDPVKWPN若しくはPExFDPARFLD
KDGy[式中、xはDまたはNであり、yはLまたはFである]より成るペプチド。 - 【請求項２１】 患者から得たサンプル中に存在するガン細胞を検出するた
めのアッセイ方法であって、請求項１０から１７のいずれか一項記載の抗体と、
患者から得た組織サンプルを接触させる工程と、及び組織サンプル中のガン細胞
の存在の指標として、サンプル中に存在するCYP1B1タンパク質に対する抗体の結
合を検出する工程とを含む方法。 - 【請求項２２】 上記CYP1B1タンパク質に対する抗体の結合を検出する工程
が、抗体捕獲アッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、または抗原捕獲アッセイ
を使用して実施される、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 上記CYP1B1タンパク質に対して特異的な抗体が、固相の支
持体ベースのイムノアッセイに固定化されている、請求項２１または２２記載の
方法。 - 【請求項２４】 上記ガンが、乳ガン、大腸ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、
または卵巣ガンである、請求項２１から２３のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項２５】 上記組織サンプルが、膀胱、脳、乳房、大腸、結合組織、
腎臓、肺、リンパ節、食道、卵巣、皮膚、胃、精巣、及び子宮から選択される、
請求項２１から２４のいずれか一項記載の方法。
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