ES2324029T3 - Diagnostico de carcinoma hepatocelular. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar a un sujeto con carcinoma hepatocelular (CHC) que comprende: determinar el nivel de glipicano-3 (GPC3) en una muestra de fluido corporal de un sujeto; en el que la presencia de un nivel detectable de GPC3 en la muestra es indicativo de CHC en el sujeto.
Description
Diagnóstico de carcinoma hepatocelular.
La invención se refiere al diagnóstico de
carcinoma hepatocelular. En particular, la invención se refiere a
anticuerpos y a métodos para determinar el nivel de
glipicano-3 como marcador para detectar carcinoma
hepatocelular.
A lo largo de esta solicitud, se citan diversas
referencias para describir de manera más completa el estado de la
técnica a la que pertenece esta invención.
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el tumor de
víscera maciza más común en el mundo, siendo responsable de más de
1 millón de muertes anualmente (Parkin, et al., (1999) CA.
Cancer J. Clin., 49:33-64, y Okuda, et al.,
(1993), Neoplasms of the Liver in Diseases of fhe Liver, 7ª edición
1236).
La incidencia de CHC está aumentando en la
mayoría de los países occidentales (Deuffic, et al., (1998),
Lancet 351:214-215). Aunque no están disponibles
buenos estudios epidemiológicos, los datos del Health Canada
indican que la tasa de muerte por CHC en hombres casi se ha
duplicado a lo largo de los últimos 15 años. La demografía de los
pacientes con hepatitis viral sugiere que la incidencia se
duplicará de nuevo en los próximos 10 años (Zou, et al.,
(2000), Can. J. Gastroenterol., 14:575-580).
El CHC es normalmente asintomático en los
estadios tempranos y tiene una gran propensión a invasión
intravascular o intrabiliar, incluso cuando el tumor primario es
pequeño (Fong, et al., (2001), Cancer of the Liver and
Biliary Tree. en Cancer Principles & Practice of Oncology, 6ª
Edición, 1162-1199). Como resultado, el CHC está en
general en un estadio avanzado cuando se descubre. Desde siempre,
se encuentra que solamente el 10-20% de los CHC
primarios pueden reseccionarse en el momento del diagnóstico (Fong,
et al., (2001), Cancer of the Liver and Biliary Tree en
Cancer: Principles & Practice of Oncology,
1162-1199). Más recientemente, con la llegada de
programas de examen de CHC, la proporción de tumores potencialmente
curables está aumentando, aunque todavía la mayoría de los
pacientes tengan enfermedad incurable en el momento del
diagnóstico.
El CHC está asociado con lesión hepática
crónica, principalmente hepatitis viral crónica y hepatopatía
alcohólica (Rustgi, (1987), Gastroenterol. Clin. North Am., 16:
545-551). La incidencia más alta de CHC se
encuentra en áreas en las que el virus de la hepatitis B (VHB) y el
virus de la hepatitis C (VHC) son endémicos. En el caso del VHB, se
ha demostrado que el riesgo relativo de desarrollar CHC es de 50 a
100 veces superior en individuos con evidencias de infección
crónica que en individuos no infectados (Beasley, et al.,
(1994), Epidemiology of hepatocellular carcinoma en Viral hepatitis
and liver disease, 209). A diferencia de otras causas de CHC, la
cirrosis por hepatitis B crónica no es una precondición necesaria
para el desarrollo de CHC. No hay valoraciones del riesgo relativo
con VHC crónico, pero la incidencia de CHC en portadores cirróticos
del VHC puede ser tan alta como el 5% por año, en comparación con
el 0,5% para portadores del VHB (Di Bisceglie, (1995), Semin. Liver
Dis., 15:64-69). La infección por VHC persistente
es la causa del 70% de los casos de CHC en Japón, y la razón más
probable para la incidencia creciente de CHC en Norteamérica es el
aumento de propagación de infección por VHC en la población (Hasan,
et al., (1990), Hepatology, 12:589-591 y
El-Serag, et al., (1999), N. Engl. J. Med.,
340:745-750).
Varios productos químicos se han relacionado con
el desarrollo de CHC. El más importante de ellos es el etanol, y el
abuso de alcohol se ha relacionado a CHC (Schiff, (1997),
Hepatology, 26:39S-42S y Nalpas, et al.,
(1995), Alcohol, 12:17-120). Se cree que el etanol
produce CHC a través de la generación de cirrosis hepática o como
carcinógeno conjunto con otros agentes tales como VHB y VHC.
Aflatoxinas producidas por varios hongos también se han relacionado
a CHC (Yu, (1995), J. Gastroenterol. Hepatol.,
10:674-682). Estos hongos tienden a crecer en
cereales, cacahuetes y otros productos alimenticios, y son la causa
más frecuente de deterioro de los alimentos.
El diagnóstico de CHC es relativamente sencillo
en pacientes con una lesión expansiva según ecografía o tomografía
computarizada (TC), y alfafetoproteína (AFP) sérica de más de 500
ng/ml (Fong, et al., (2001), en Cancer of the Liver and
Biliary Tree in Cancer: Principles & Practice of Oncology, 6ª
Edición, 1162-1199). En general, sin embargo, en el
momento en el que se cumplen estas condiciones, el CHC no puede
tratarse, puesto que muy frecuentemente la AFP no está elevada de
manera diagnóstica.
El diagnóstico mediante obtención de imágenes de
lesiones pequeñas es relativamente impreciso, ya sea mediante
ecografía, exploración mediante TC o mediante RMN (Fong, et
al., (2001), en Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer:
Principles & Practice of Oncology, 6ª Edición,
1162-1199); y Murakami, et al., (1995),
Detectability of hypervascular hepatocellular carcinoma by arterial
phase images of MR and spiral CT. Acta Radiol., 36:
372-376). En particular, las dos lesiones que
pueden imitar CHC radiológicamente son nódulos cirróticos y nódulos
displásicos. La biopsia hepática de lesiones pequeñas también es
insuficientemente sensible o específica (Levy, et al.,
(2001), Ann. Surg., 234:206-209). Incluso con una
biopsia por punción, un cáncer bien diferenciado puede ser difícil
de distinguir de lesiones benignas debido a la cantidad limitada de
material normalmente obtenido mediante este procedimiento (Fong,
et al., (2001), en Cancer of the Liver and Biliary Tree in
Cancer: Principles & Practice of Oncology, 6ª Edición,
1162-1199). Por tanto a pesar de los avances en la
tecnología de obtención de imágenes, todavía hay una necesidad de
un marcador molecular adecuado para distinguir CHC de lesiones
hepáticas benignas en casos difíciles.
El tamaño de un tumor es un factor de riesgo
significativo de propagación intrahepática y metástasis de CHC
(Yuki, et al., (1990), Cancer,
66:2174-2179). Además, muchas más opciones de
tratamientos están disponibles para pacientes con tumores pequeños.
Los tumores sintomáticos en general son grandes, y ya no tienen
intervención terapéutica. Otra situación en la que un marcador
sensible y específico para CHC sería útil es en el examen de
pacientes en riesgo, tales como portadores crónicos del VHB e
individuos con VHC cirrótico. Aunque este examen se aplica
ampliamente, todavía hay pocos datos para sugerir que es eficaz
para reducir la enfermedad (Collier, et al., (1998),
Hepatology, 27:273-278). Uno de los motivos por el
que el examen no se ha mostrado eficaz es que la prueba serológica
actualmente usada, concretamente ensayos de AFP secuenciales, tiene
poca sensibilidad y especificidad (Collier, et al., (1998),
Viral Hepatitis Reviews, 4:31-41). Por tanto,
sistemas de prueba mejorados son necesarios para mejorar el examen
para detectar CHC.
El único marcador molecular que se ha usado
ampliamente para el examen y diagnóstico de CHC es la
alfafetoproteína (AFP). Esta proteína se sintetiza en grandes
cantidades durante el desarrollo embrionario por el saco vitelino y
por el hígado (Chan, et al., (1999), en Tumor Markers. en
Tietz textbook of clinical chemistry, 3º, 722-749,
Taketa, K (1990), Hepatology, 12:1420-1432). La
concentración de AFP disminuye gradualmente tras el nacimiento
hasta < 10 ng/ml en 12-18 meses. La AFP
reaparece en el suero materno durante el embarazo. El aumento de
AFP circulante se ha asociado con CHC, carcinoma gástrico, cáncer
de pulmón, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar y carcinoma
testicular (Chan, et al., (1999), en Tumor Markers. en Tietz
textbook of clinical chemistry, 3º, 722-749).
Si los niveles de AFP de 20 ng/ml o superiores
se consideran diagnósticos, se detectan del 60 al 80% de los casos
de CHC pero, en el caso de tumores pequeños, la sensibilidad es
significativamente inferior (40%) (Trevisani, et al., (2001),
J. Hepatol., 34:570-575). Otro problema con el uso
de AFP como marcador para CHC es su ausencia de especificidad;
aumentos significativos de AFP (20-200 ng/ml) se
observan en un número considerable de pacientes con hepatopatías
crónicas (Collier, et al., (1998), Viral Hepatitis Reviews,
4:31-41). Se ha notificado que el
15-58% de los pacientes con hepatitis crónica, y el
11-47% con cirrosis tienen un aumento de AFP sérica
(Taketa, (1990), Hepatology, 12:1420-1432). Por
tanto, no es raro que coincidan niveles de AFP sérica en pacientes
con CHC y cirrosis, lo que confunde la interpretación de los
resultados del ensayo de AFP. Por consiguiente, se ha puesto en
duda la utilidad de la medición de AFP como herramienta de
vigilancia para pacientes en riesgo de CHC (Sherman, (2001), J.
Hepatol., 34:603-605). Se ha propuesto, por tanto,
que la única circunstancia en la que la medición de AFP se
justifica es para la confirmación de un diagnóstico inicial
basándose en una técnica de obtención de imágenes (Sherman, (2001),
J. Hepatol., 34:603-605).
En vista de lo poco fiable que son los niveles
de AFP, la mayoría de los regímenes de examen incluyen ecografía,
que es sumamente sensible para masas hepáticas. Sin embargo, la
ecografía carece de especificidad, y no puede distinguir de manera
fiable entre CHC, nódulo cirrótico y nódulo displásico cuando las
lesiones son menores de aproximadamente 2 cm.
En los últimos años, se han investigado varios
nuevos marcadores potenciales para detectar CHC, pero no se ha
encontrado ninguno claramente superior a AFP (Seow, et al.,
(2001), Proteomics, 1:1249-1263). Por ejemplo, se ha
propuesto la desgamma-carboxi protrombina como
marcador potencial. Sin embargo, esta molécula, similar a AFP, no
es útil para la detección de tumores pequeños (Nomura, et
al., (1999), Am. J. Gastroenterol.,
94:650-654).
En 1997, Hsu et al., notificaron que,
realizando análisis de presentación de ARNm diferencial de hígado
normal y CHC, identificaron un transcrito que se reguló por
incremento en CHC (Hsu, et al., (1997), Cancer Res.,
57:5179-5184). Este transcrito, que denominaron
MXR7, resultó que era Glipicano-3 (GPC3). GPC3 es
un heparan sulfato proteoglicano que está unido a la superficie
celular mediante una cola lipídica (Duenas Gonzales, et al.,
(1998), J. Cell. Biol., 141:1407-1414). Hsu et
al., encontraron que el ARNm de GPC3 se expresaba en 143 de 191
(74,8%) CHC primarios y recurrentes, pero en solamente 5 de 154
(3,2%) hígados normales.
Un segundo estudio encontró la sobreexpresión de
ARNm de GPC3 en el 75% de los casos de CHC, pero no se detectó
sobreexpresión en hiperplasia nodular focal e hígado cirrótico (Zhu
et al., (2001), Gut, 48, 558-564).
Estos estudios analizaron solamente los niveles
de ARNm y se conoce que los niveles de ARNm no siempre se
correlacionan con la expresión y secreción de proteínas. Además,
solamente un número limitado de proteínas hepáticas se secretan
normalmente en la circulación.
Aunque estos resultados sugirieron que el
análisis de ARNm de GPC3 en tejido hepático podría ser útil para la
detección de CHC, este tipo de de análisis es invasivo, puesto que
requiere el aislamiento de tejido tumoral. Además, el análisis de
ARNm requiere mucho tiempo y es difícil de realizar de manera
rutinaria.
Capurro M. I. et al., Proceedings of the
American Association for Cancer Research, Annual meeting, marzo de
2002, vol. 43, página 219 hacen referencia a la sobreexpresión de
Glipicano-3 en carcinomas hepatocelulares humanos
determinada mediante inmunohistoquímica en muestras de tejido
hepático usando un anticuerpo monoclonal.
\newpage
Trevisiani F. et al., J. Hepatology,
2001, vol. 34, páginas 570-575 hacen referencia a
la influencia de la situación de HBsAg y anti-HcV
en el uso de alfa-feto proteína sérica para el
diagnóstico de carcinoma hepatocelular en pacientes con hepatopatía
crónica.
Por tanto hay una necesidad de un marcador
sérico que pueda usarse para examinar (es decir que será positivo
en una alta proporción de pacientes asintomáticos con CHC
pequeños). En pacientes en los que una ecografía ha identificado
una lesión de masa pequeña, la prueba también debería poder separar
de manera fiable pacientes con CHC de aquellos sin lesiones
malignas.
En conclusión, todavía hay una necesidad de
marcadores moleculares mejores para detectar CHC, particularmente
para la vigilancia de poblaciones de alto riesgo, tales como
pacientes con VHC con cirrosis establecida. La búsqueda de tales
marcadores ha sido muy difícil debido al alto grado de
heterogeneidad que caracteriza los CHC (Thorgeirsson, et al.,
(2002), Nature Genet., 31:339-346).
Los inventores han encontrado un nuevo marcador
sérico para detectar CHC, glipicano-3 (GPC3), que
proporciona una base para un ensayo nuevo, rápido, conveniente y no
invasivo que ofrece especificidad mejorada en el diagnóstico de
CHC.
Según una realización de la presente invención,
se proporciona un método para detectar a un sujeto con carcinoma
hepatocelular (CHC) que comprende:
determinar el nivel de
glipicano-3 (GPC3) en una muestra de fluido
corporal de un sujeto;
en el que la presencia de un nivel detectable de
GPC3 en la muestra es indicativo de CHC en el sujeto.
Según otra realización de la presente invención,
se proporciona un método para detectar la presencia de GPC3 en una
muestra de fluido corporal, comprendiendo el método:
poner en contacto una muestra de fluido corporal
con un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une
específicamente a GPC3 o a un fragmento del mismo para permitir la
formación de un complejo anticuerpo-GPC3 o un
complejo anticuerpo-fragmento de GPC3; y
detectar el complejo
anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3.
Según otra realización de la presente invención,
se proporciona un método para determinar el nivel de GPC3 en una
muestra de fluido corporal, que comprende:
poner en contacto una muestra de fluido corporal
con un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une
específicamente a GPC3 o a un fragmento del mismo para permitir la
formación de un complejo anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3; y
determinar el nivel de complejo
anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3.
Se describen realizaciones preferidas de la
invención con respecto a los dibujos, en los que:
la figura 1 muestra fotomicrografías de células
293 transfectadas con GPC3 (Paneles C y D) y células control
transfectadas solamente con vector (Paneles A y B), teñidas con
anticuerpo monoclonal anti-GPC3 1G12. Los paneles A
y C son micrografías de contraste de fase y los paneles B y D son
micrografías fluorescentes.
La figura 2 muestra un análisis de
inmunotransferencia de tipo Western (WB) de proteínas de células
293 transfectadas con vector solo (EF) o GPC3 con etiqueta de HA
(GPC3). Las membranas se incubaron con anticuerpo
anti-GPC3 1G12 o anticuerpo anti-HA
(12CA5). Flecha en negro: proteína del núcleo de GPC3; flecha en
blanco: formas con glicanos de GPC3; punta de flecha: un producto
de escisión que contiene el extremo N-terminal de
GPC3 que no contiene el epítopo detectado por 1G12. Los números en
la derecha corresponden a marcadores de peso molecular.
La figura 3 muestra fotomicrografías de
secciones teñidas inmunohistoquímicamente de carcinoma
hepatocelular usando anticuerpo monoclonal 1G12. Panel A: visión
general de 16X de CHC sumamente positivo para GPC3 (T) rodeado por
tejido hepático no tumoral no teñido (N); Panel B: vista de 400X
del mismo tejido que muestra tinción de membrana y gránulos
citoplasmáticos.
La figura 4 muestra la relación entre la
concentración de GPC3 y la densidad óptica en un ensayo ELISA para
detectar GPC3.
\newpage
La figura 5 muestra los niveles de GPC3 en suero
de controles, pacientes con hepatitis (H), pacientes con hepatitis
más cirrosis (H + LC) y pacientes con carcinoma hepatocelular
(CHC), determinado mediante ELISA, los resultados mostrados
representan el promedio de cuadruplicados. La significación de la
diferencia entre los valores promedio de GPC3 para los pacientes
con CHC y pacientes cirróticos se muestra en la parte superior de
la figura.
La presente invención proporciona un nuevo
método para examinar a un sujeto mamífero para detectar carcinoma
hepatocelular (CHC). Los inventores han establecido que el
proteoglicano de superficie celular GPC3 puede detectarse en la
circulación, en el suero o plasma, de sujetos con CHC, pero no se
produce a un nivel detectable, es decir un nivel significativamente
superior al de base, usando una prueba convencional de
significación tal como se describe en el presente documento, en el
suero o plasma de sujetos normales. También se ha mostrado que
puede detectarse poco o ningún GPC3 en el suero o plasma de sujetos
que padecen hepatitis o hepatitis más cirrosis.
Por tanto se proporciona un método conveniente,
no invasivo para identificar a un sujeto con CHC determinando los
niveles de GPC3 en un fluido corporal del sujeto. Fluidos
corporales adecuados para someter a prueba incluyen suero, plasma y
sangre completa. Se prefiere el examen de suero o de plasma.
Los niveles de GPC3 en un fluido corporal pueden
determinarse mediante cualquier método adecuado para medir esa
proteína. Métodos inmunológicos de determinación de niveles de GPC3
son sumamente convenientes, y los expertos en la técnica conocerán
tipos adecuados de métodos, y se describen adicionalmente en el
presente documento.
Por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo que se unen específicamente a GPC3 humano proporcionan
la base de una variedad de métodos de ensayo basados en anticuerpos
para determinar GPC3. Puede diagnosticarse CHC poniendo en contacto
un fluido corporal del sujeto con un anticuerpo o un fragmento que
se une específicamente a GPC3 en condiciones que permiten la
formación de un complejo anticuerpo-GPC3 y entonces
detectando y/o determinando el nivel de ese complejo. La cantidad
de complejo anticuerpo-GPC3 se correlaciona con el
nivel de GPC3 en la muestra.
El término "anticuerpo", tal como se usa en
el presente documento y si no se especifica de otro modo, incluye
un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo de cadena
sencilla.
La expresión "fragmento de anticuerpo"
significa una parte de un anticuerpo que muestra la unión
específica del anticuerpo original e incluye fragmentos Fab,
F(ab')_{2} y F_{v}.
Tal como se usa en el presente documento, se
dice que un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo "se une
específicamente" a una molécula diana si el anticuerpo o el
fragmento de anticuerpo reconoce y se une a la molécula diana pero
no reconoce y no se une sustancialmente a otras moléculas presentes
en una muestra que contiene moléculas diana.
Anticuerpos quiméricos son anticuerpos que
contienen partes de anticuerpos de diferentes especies. Por
ejemplo, un anticuerpo quimérico puede tener una región constante
humana y una región variable de otras especies. Pueden producirse
anticuerpos quiméricos mediante métodos recombinantes bien
conocidos, tal como se describe en las patentes estadounidenses
números 5.354.847 y 5.500.362, y en la literatura científica (Couto
et al., (1993), Hybridoma, 12:485-489).
Anticuerpos humanizados son anticuerpos en los
que solamente las regiones determinantes complementarias, que son
responsables de la especificidad y unión a antígeno, provienen de
una fuente no humana, mientras que sustancialmente todo el resto de
la molécula de anticuerpo es humana. Anticuerpos humanizados y su
preparación también se conocen bien en la técnica, véase, por
ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.225.539; 5.585.089;
5.693.761 y 5.693.762.
Anticuerpos de cadena sencilla son secuencias de
polipéptido que pueden unirse específicamente a un péptido o un
epítopo, en el que el anticuerpo de cadena sencilla se deriva de o
bien la cadena ligera o bien la cadena pesada de un anticuerpo
monoclonal o policlonal. Anticuerpos de cadena sencilla incluyen
polipéptidos derivados de anticuerpos humanizados, quiméricos o
totalmente humanos en los que el anticuerpo de cadena sencilla se
deriva de o bien la cadena ligera o bien la cadena pesada de los
mismos.
Con el fin de preparar anticuerpos policlonales,
puede obtenerse GPC3 purificado, humano o no humano.
Puede purificarse GPC3 a partir de, por ejemplo,
placenta humana mediante métodos convencionales, por ejemplo tal
como se describe en Bonneh-Barkay et al.,
(1997), J. Biol. Chem., v. 272, páginas
12415-12421.
La proteína purificada puede acoplarse, si se
desea, a una proteína portadora tal como hemocianina de lapa
californiana, tal como se conoce bien en la técnica, y entonces se
mezcla con adyuvante de Freund y se inyecta en conejos u otros
animales de laboratorio adecuados.
Alternativamente, toda o una parte de la
proteína GPC3 puede sintetizarse de manera recombinante en un
huésped adecuado, tal como una bacteria, mediante la expresión de
una secuencia de ADN apropiada insertada en un vehículo de
clonación adecuado. El ADN que codifica para GPC3 puede clonarse
mediante métodos descritos anteriormente (Filmus et al.,
(1988), Molec. & Cell Biol., v. 8, páginas
4243-4249; Linsley et al., (1993), Ann. Rev.
Immunol., v. 11, páginas 191-212; Peach et
al., (1994), J. Exp. Med., v. 180, páginas
2049-2058). GPC3 o una parte del mismo puede
expresarse como una proteína de fusión mediante métodos
similares.
Dos sistemas de expresión ampliamente usados
para producir proteínas de fusión recombinantes en E. coli
son glutation-S-tranferasa o
fusiones de proteína de unión a maltosa usando la serie pUR de
vectores y fusiones trpE usando los vectores pATH.
Entonces puede purificarse la proteína GPC3
expresada, por ejemplo usando una columna de glutatión, puede
acoplarse a una a proteína portadora si se desea, y puede mezclarse
con adyuvante de Freund (para ayudar a estimular la respuesta
antigénica del animal) y puede inyectarse en conejos u otros
animales de laboratorio apropiados. Tras las inyecciones de
inmunización de refuerzo en intervalos semanales, entonces se
extrae sangre de los conejos u otros animales de laboratorio y se
aíslan los sueros. Los sueros pueden usarse directamente o pueden
purificarse antes de su uso mediante diversos métodos incluyendo
cromatografía de afinidad empleando Proteína
A-Sepharose, Sepharose antígeno o Sepharose
Anti-Ig de ratón.
También pueden prepararse anticuerpos
policlonales usando un fragmento de GPC3 como antígeno. Pueden
usarse fragmentos de tres o más aminoácidos consecutivos de la
secuencia de aminoácidos de GPC3. Un fragmento de GPC3 que comprende
la secuencia de aminoácidos carboxilo-terminales de
70 aminoácidos, o una parte de la misma, es un antígeno preferido.
Pueden producirse fragmentos de manera recombinante, opcionalmente
como proteínas de fusión, tal como se describe en el presente
documento. Tales antígenos de péptido pueden estar conjugados con
hemocianina de lapa californiana para mejorar la antigenicidad
in vivo.
También pueden producirse anticuerpos
anti-GPC3 monoclonales mediante métodos
convencionales tras inyectar en ratones GPC3 purificado o
fragmentos del mismo, opcionalmente como proteínas de fusión,
obtenidas tal' como se describió anteriormente para la preparación
de anticuerpos policlonales.
En resumen, el péptido o proteína purificados se
inyecta en ratones en adyuvante de Freund, por ejemplo nueve veces
a lo largo de un periodo de tres semanas. Se extraen los bazos de
los ratones y se resuspenden en solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Las células del bazo sirven como fuente de
linfocitos, algunas de las cuales son productoras de anticuerpos de
la especificidad apropiada. Entonces estas se fusionan con una
célula asociada a mieloma de crecimiento permanente, y los
productos de la fusión, hibridomas, se cultivan en placa en varios
pocillos de cultivo de tejido en presencia de un agente selectivo
tal como HAT. Entonces se examinan los pocillos mediante ELISA para
identificar aquéllos que contienen células que producen anticuerpos
específicos para GPC3. Entonces se cultivan en placa estas células
y tras un periodo de crecimiento, estos pocillos se examinan de
nuevo para identificar células que producen anticuerpos. Varios
procedimientos de clonación se llevan a cabo hasta que más del 90%
de los pocillos contienen clones individuales que son positivos
para la producción de anticuerpos. A partir de este procedimiento,
se establece una línea estable de clones que producen el
anticuerpo. Entonces puede purificarse el anticuerpo monoclonal
mediante cromatografía de afinidad usando cromatografía de
intercambio fónico o proteína A Sepharose, así como variantes y
combinaciones de estas técnicas.
En una realización adicional, se preparan
fragmentos de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a
fragmentos F(ab)_{2},
F(ab^{1})_{2} y F_{v} o componentes de cadena
sencilla de anticuerpos monoclonales específicos para GPC3. Pueden
generarse tales fragmentos usando escisión proteolítica de
anticuerpos anti-GPC3 intactos, por ejemplo tal
como se describe en Lin et al., (1978), PNAS, 75(6);
2649-2653, o mediante manipulación genética de
genes que codifican para tales fragmentos y fermentación de
sistemas de producción transfectados que pueden secretar tales
fragmentos de anticuerpo anti-GPC3.
Se prefieren anticuerpos
anti-GPC3 de una afinidad de antígeno de al menos 1
x 10^{8}.
Pueden usarse diversos tipos de formatos de
ensayo para someter a ensayo GPC3 en una muestra. Éstos incluyen
ELISA de tipo sándwich, radioinmunoanálisis, fluoroinmunoensayo,
transferencia de puntos, tira reactiva e inmunotransferencia de
tipo Western.
En una realización preferida, se usa un
anticuerpo que se une específicamente a GPC3 o a un fragmento del
mismo y porta un marcador detectable y el complejo
GPC3-anticuerpo resultante se determina midiendo el
marcador detectable, determinando de ese modo el nivel de GPC3 en
la muestra. Alternativamente, se emplea un primer anticuerpo
específico para GPC3 o un fragmento del mismo, seguido de un
segundo anticuerpo específico para el primer anticuerpo y que porta
un marcador que puede ser un marcador directamente detectable o
puede ser un componente de un sistema de generación de señal. Tales
anticuerpos y sistemas marcados se conocen bien en la técnica.
La detección y determinación del marcador o de
la señal generada por el sistema de generación de señal, en
comparación con patrones de calibración adecuados, permite la
determinación del complejo GPC3-anticuerpo presente
en la muestra y por tanto de GPC3.
El segundo anticuerpo porta un marcador que
puede ser cualquier marcador directamente detectable adecuado o un
componente de cualquier sistema de generación de señal adecuado.
Muchos ejemplos de éstos se conocen bien a partir del campo de
inmunoensayo.
El marcaje del segundo anticuerpo con un
marcador detectable o un componente de un sistema de generación de
señal puede llevarse a cabo mediante técnicas bien conocidas en la
técnica. Ejemplos de marcadores que pueden utilizarse para
proporcionar un anticuerpo detectable incluye radioisótopos,
enzimas, sustancias fluorescentes y quimioluminiscentes. Por
ejemplo, puede usarse un elemento radioactivo como marcador
directamente detectable; los marcadores radioactivos a modo de
ejemplo incluyen los emisores \gamma ^{124}I, ^{125}I,
^{128}I y ^{131}I. También puede usarse un marcador fluorescente
como marcador directamente detectable; por ejemplo, los fluoróforos
adecuados incluyen cumarina, iones metálicos de tierras raras,
quelatos o complejos quelatos, fluoresceína, rodamina y derivados
de rodamina.
Los marcadores adecuados también incluyen
complejos metálicos, radicales libres estables, vesículas,
liposomas, partículas coloidales, partículas de látex, marcadores
de espín, biotina/avidina y sus derivados.
Pueden usarse sistemas de generación de señal
unidos a enzima, incluyendo fosfatasa alcalina, amilasa,
luciferasa, catalasa, beta-galactosidasa, glucosa
oxidasa, glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, hexocinasa, peroxidasa de rábano, lactamasa, ureasa
y malato deshidrogenasa. La actividad de la enzima puede detectarse
midiendo la absorbancia, intensidad de fluorescencia o
luminiscencia tras hacer reaccionar la enzima con un sustrato
apropiado. Cuando se usan enzimas como marcador, puede lograrse la
unión entre enzima y anticuerpo mediante métodos convencionales
tales como métodos de glutaraldehído, ácido peryódico y
maleimida.
Las matrices sólidas para actuar como soportes
sólidos adecuados para inmovilizar un anticuerpo incluyen placas de
microtitulación, tales como aquéllas que pueden obtenerse de
Falcon Plastics, Oxnard, Calif., o, por ejemplo, placas de
microtitulación de ELISA regulares (Immulon II, Dynax, Chantilly,
VA) y placas de microtitulación de ELISA recubiertas con
estreptavidina (Reacti-Bind, Pierce, Rockford, IL) y
tiras de microtitulación, tales como aquéllas que pueden obtenerse
de Dynatech, Alejandría, VA. Los pocillos de las tiras o las placas
de microtitulación estás fabricados de material plástico
transparente, preferiblemente poli(cloruro de vinilo) o
poliestireno. Otras matrices sólidas útiles para la inmovilización
de anticuerpos incluyen tubos de poliestireno, barras o paletas de
cualquier tamaño conveniente o perlas de poliestireno o matrices de
poliacrilamida.
Pueden inmovilizarse anticuerpos en un soporte
sólido mediante métodos convencionales que se conocen bien en la
técnica, por ejemplo tal como se describe en la patente
estadounidense número 5.352.583.
Según una realización preferida de la invención,
se pone en contacto una muestra de un fluido corporal con un primer
anticuerpo que se une específicamente a GPC3 para formar un
complejo, estando inmovilizado el primer anticuerpo en un soporte
sólido. Se deja tiempo suficiente para permitir la unión del GPC3
de la muestra al anticuerpo inmovilizado. Entonces se lava el
soporte sólido y se pone en contacto con un segundo anticuerpo que
se une específicamente al primer anticuerpo y se marca con un
marcador detectable o está unido al mismo un sistema de generación
de señal. Se determina el marcador o la señal generada unidos al
soporte sólido, proporcionando una medida del complejo presente en
la muestra, y por tanto determinando el nivel de GPC3 en la
muestra.
Según una realización adicional, la muestra se
pone en contacto simultáneamente con el primer anticuerpo
inmovilizado en el soporte sólido y el segundo anticuerpo
marcado.
En una realización adicional, el segundo
anticuerpo puede carecer de un marcador o de un componente de
sistema de generación de señal y el segundo anticuerpo unido al
soporte sólido se determina por medio de un tercer anticuerpo que
porta un marcador o componente de sistema de generación de señal
detectable, uniéndose el tercer anticuerpo selectivamente al
segundo anticuerpo unido.
Según una realización adicional, la muestra se
pone en contacto, o bien simultáneamente o bien gradualmente, con
un primer anticuerpo que se une específicamente a GPC3 y al que se
une un miembro de una pareja de captura y con un segundo anticuerpo
marcado que se une al primer anticuerpo. Entonces se pone en
contacto la mezcla resultante con un soporte sólido en el que se
inmoviliza el otro miembro de la pareja de captura. Tras dejar
tiempo suficiente para que el complejo marcado se una al soporte
sólido mediante interacción de los miembros de la pareja de
captura, se lava el soporte sólido y se determina la cantidad de
marcador unido al mismo, para determinar el nivel de GPC3 en la
muestra. Las parejas de captura adecuadas incluyen
biotina/estreptavidina. Otras parejas adecuadas las conocen los
expertos en la técnica. Pueden revertirse las especificidades de
los anticuerpos, uniéndose el primer anticuerpo específicamente al
complejo y uniéndose el segundo anticuerpo marcado específicamente
a GPC3.
\newpage
El método de identificación descrito en el
presente documento parecer ser sumamente específico para detectar
CHC, porque GPC3 no era detectable en muestras de sujetos normales
y enfermos de hepatitis, y se encontró a niveles insignificantes
en enfermos de hepatitis más cirrosis ocasionales.
En ensayos que usan sujetos con CHC
diagnosticado, desde el 53 hasta el 55% de sujetos tenían niveles
de GPC3 séricos detectables, que oscilaban desde 151 ng/ml hasta
2924 ng/ml.
Cuando se usó AFP sérica como marcador para
detectar CHC en los mismos pacientes, y se usaron 20 ng/ml como el
umbral de anormalidad, se detectó el 59% de los pacientes con CHC.
Si se aumenta el nivel umbral de AFP indicativo de enfermedad hasta
100 ng/ml, solamente se detecta el 32% de los casos de CHC. Un
nivel umbral de 20 ng/ml de AFP, sin embargo, incluirá varios
falsos positivos, puesto que se observan los niveles de AFP
superiores a 20 ng/ml en muchas hepatopatías crónicas diferentes de
CHC.
Los inventores han encontrado que niveles
elevados de GPC3 en pacientes con CHC no se correlacionaba bien con
niveles de AFP (tabla 4). Por tanto, el método de la invención
proporciona una herramienta útil adicional para identificar casos de
CHC no detectados mediante el examen con AFP. El método de la
invención puede usarse solo o además del examen con AFP mediante
métodos convencionales para mejorar la capacidad de identificar CHC
en un estadio temprano y tratable.
En una realización adicional de la invención,
puede usarse el examen con GPC3 y AFP en combinación para
proporcionar una prueba que combina la especificidad del examen
para detectar altos niveles de AFP con la sensibilidad mejorada del
examen con GPC3. Por ejemplo, tal como se observar a partir de los
datos de la tabla 4, si se determinan los niveles séricos de AFP y
GPC3 y se usa un umbral de 100 ng/ml de AFP como el umbral de
significación, el 70% de los pacientes con CHC mostraron elevación
de al menos uno de AFP y GPC3, a diferencia del 32% si se usa 100
ng/ml de AFP solo como marcador para detectar CHC, o el 53% si se
usa GPC3 solo como marcador. Si se consideran tanto AFP como GPC3 y
se usa un valor umbral de 20 ng/ml de AFP, el 82% de pacientes
mostraron elevación de al menos uno de AFP y GPC3.
Los ensayos de GPC3 serológicos de la invención
son de especial utilidad para una evaluación adicional de sujetos
que muestran indicaciones clínicas de una masa hepática. Los
ensayos también pueden usarse para examinar poblaciones en riesgo
de CHC, por ejemplo enfermos o portadores de hepatitis crónica B o
C.
Métodos de química, biología molecular,
bioquímica de proteínas y péptidos e inmunología a los que se hace
referencia pero no se describen explícitamente en esta descripción
y ejemplos se notifican en la literatura científica y los conocen
bien los expertos en la técnica.
Tejidos de paciente: Se obtuvieron
muestras de tejido hepático del departamento de anatomía
patológica, Hospital General de Toronto. Todas las muestras de
hígado eran bloques grandes de tumores y parénquima adyacentes
resecados quirúrgicamente. Se fijó todo el tejido en formalina al
10% y se incrustó en parafina para el examen histológico de
rutina.
Sueros de paciente: Se obtuvieron
muestras de sangre de 34 pacientes con CHC (véase la tabla 3 para
las características de los pacientes), 20 pacientes con hepatitis
más cirrosis hepática (12 con VHC y 8 con VHB), 18 pacientes con
hepatitis (12 con VHC, 1 con VHC más VIH, 1 con VHC más talasemia,
1 infectado conjuntamente con VHC y VHB y 3 con VHB) (Hospital
General de Toronto) y de 53 donantes de sangre sanos (Sunnybrook
and Women's College Health Sciences Centre, Toronto, Canadá) con un
consentimiento firmado de los pacientes. Se diagnosticó
histológicamente el CHC cuando la biopsia hepática estaba
disponible o a partir de la información clínica siguiendo las
directrices de la Asociación Europea para el Estudio de Enfermedad
Hepática (European Association for Study of Liver
Disease)^{20}. Se separó inmediatamente el suero mediante
centrifugación y se congeló a -20ºC. Los sueros de los pacientes
que se diagnosticaron con enfermedad hepática no maligna (hepatitis
con cirrosis hepática y hepatitis) en el momento de la recogida del
suero se incluyeron solamente en este estudio si no había
indicación de enfermedad maligna 6 meses tras esta recogida.
Líneas celulares: Se cultivaron las
líneas celulares de CHC HepG2, Hep3B y
PLC-PRF-5 en medio mínimo esencial
(MEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Gibco BRL) y
complementado con disolución de aminoácidos no esenciales en MEM y
piruvato de sodio (1 mM). Se cultivó la línea celular 293 en DMEM y
FBS al 10%. Se obtuvieron todas las líneas celulares de la
Colección Americana de Cultivos Tipo, y se mantuvieron a 37ºC en
una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. Para recoger los
medios condicionados se hicieron crecer las líneas celulares en
alta densidad durante la noche en ausencia de suero. Se
concentraron los medios recogidos usando filtros Centricon
YM-10.000 (Millipore).
Transfección de GPC3: Se transfectó la
línea celular 293 con un ADNc de GPC3 con etiqueta de hemaglutinina
A (HA)^{21} introducido en el vector pEF (o vector vacío
como control), y se seleccionaron las células transfectadas con
G418 800 \mug/ml (Gibco BRL). Se clasificaron las células que
expresaban altos niveles de GPC3 mediante FACS tras la tinción de
las células seleccionadas con G418 con un AcM
anti-HA 12CA5 y un anticuerpo secundario conjugado
con FITC. Entonces, las células clasificadas se expandieron en
cultivo de tejido.
Producción de anticuerpos monoclonales de
ratón anti-GPC3: Se inmunizaron ratones hembra
Balb/C con una única inyección i.p. de 50 \mug de un fragmento de
GPC3 con etiqueta de His que contenía los últimos 70 aminoácidos de
la proteína del núcleo. Se emulsionó el inmunógeno con adyuvante
Titermax Gold (Cedarlane). Tras 21 días, se les realizó a los
ratones una inmunización de recuerdo con 50 \mug del mismo
inmunógeno en ausencia de adyuvante. Dos días después, se
recogieron muestras de sangre de la vena de la cola, y se
obtuvieron los correspondientes sueros. Se estimó el título
anti-GPC3 en las muestras de suero mediante un
ELISA usando como control negativo el suero preinmunizado de los
mismos ratones. Se fusionaron los esplenocitos obtenidos de los dos
ratones con el título más alto con células de mieloma de ratón
SP2/0 Ag14 (relación 6:1) en presencia de polietilenglicol 4000
(Sigma) usando procedimientos habituales. Se cultivaron en placa
las células fusionadas en placas de 96 pocillos y se expandieron en
\alpha-MEM, Hepes 10 mM,
2-mercaptoetanol 50 \muM, FBS al 20%
complementado con Nutridoma-CS (Roche) e
hipoxantina, aminopterina y timidina (complemento HAT, Gibco BRL).
Para seleccionar para la producción de hibridomas, se examinaron
los clones expandidos mediante ELISA, usando placas de 96 pocillos
cargadas con 0,05 \mug de inmunógeno GPC3 por pocillo. Se
bloquearon las placas durante 2 h con albúmina sérica bovina al 1%
(BSA) en solución salina tamponada con fosfato, y se añadieron
medios condicionados para cada clon. Se detectó la presencia de
anticuerpos anti-GPC3 unidos al antígeno usando
anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón y anticuerpo
de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa
de rábano (StressGen) con O-fenilendiamina (Sigma)
y peróxido de hidrógeno como sustratos. Se expandieron entonces
adicionalmente los clones positivos y se sometió a prueba su
capacidad de teñir células 293 transfectadas con GPC3 mediante
inmunofluorescencia. Los hibridomas positivos, denominados 1G12 y
8H5, se volvieron a clonar dos veces y se determinó su isotipo
(IgGl, K) usando Isostrip (Roche). Se purificaron los anticuerpos
de los sobrenadantes de cultivo condicionados usando columnas de
proteína A (kit Affi-Gel Proteína A MAPS II,
Bio-Rad).
Inmunofluorescencia: Se sembraron en
portaobjetos tratados con
poli-L-lisina células 293
transfectadas con GPC3 o vector solo, y se fijaron con
paraformaldehído al 4% en PBS. Tras la incubación de 1 hora con AcM
anti-GPC3 o IgG de ratón normal (Santa Cruz
Biotechnology) (15 \mug/ml), se lavaron los portaobjetos 3 veces
con PBS, y se detectó la unión del anticuerpo primario con el
fragmento F(ab')_{2} de oveja anti-IgG de
ratón conjugado con FITC (StressGen).
Análisis de inmunotransferencia de tipo
Western: Se lisaron las células en tampón RIPA que contenía
inhibidores de proteasa (PMSF 2 mM, leupeptina 10 \mu/ml,
aprotinina 10 \mug/ml) durante 30 min. en hielo. Se hicieron
correr las muestras de proteína en gel de
SDS-poliacrilamida al 6% y se transfirieron a una
membrana de PVDF (Pall Corporation). Se bloquearon las membranas en
tampón de bloqueo (Tris-HC1 10 mM pH 8,0, NaCl 150
mM, Tween20 al 0,1%, leche en polvo desnatada al 5%) durante 1 hora
a temperatura ambiente, y entonces se incubaron con AcM 1G12 ó
12CA5 1 \mug/ml durante la noche a 4ºC. Tras la incubación con
anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado
con peroxidasa de rábano durante una hora, se detectaron bandas de
proteína usando reactivos ECL quimioluminiscentes (DuPont NEN).
Inmunohistoquímica: Se desparafinizaron
secciones de tejido incrustadas en parafina con xileno y de
rehidrataron en una serie de disoluciones de etanol. Entonces se
realizó una técnica de recuperación de antígenos calentando los
portaobjetos en tampón citrato 10 mM pH 6 en un horno de microondas
Kenmore (2 min. a nivel de energía 10, 1,5 min. a nivel de energía
6 y 2,5 min. a nivel de energía 9 y repitiendo estas tres etapas
dos veces). Se enjuagaron los portaobjetos con agua destilada, se
deshidrataron en una serie graduada de etanol y se sumergieron en
peróxido de hidrógeno al 10% en metanol durante 10 minutos para
bloquear la peroxidasa endógena. Se rehidrataron los portaobjetos y
se realizó la inmunotinción usando el AcM anti- GPC3 a 20 \mug/ml
(o IgG de ratón normal y PBS como controles negativos) según las
instrucciones del kit Histostain-SP (Zymed
Laboratories) y TSATM Biotin System (NEN Life Science Products). Se
tiñeron secciones en serie con un anticuerpo policlonal de conejo
frente a AFP (Dako, A008) a una dilución de 1/400. Se bloqueó la
peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno acuoso, y se detectó
la unión a anticuerpo con el sistema Ultra HRP (ID Labs).
ELISA de tipo sándwich: Se cubrieron
placas de ELISA de 96 pocillos con 0,5 \mug de AcM
anti-GPC3 1G12 en 50 \mul de PBS por pocillo. Se
bloquearon las placas durante 2 h con BSA al 1% en PBS, y se
añadieron 50 \mul de muestras de suero diluidas (1:3 en PBS) y se
incubaron durante la noche a 4ºC. Tras lavar el material no unido
con BSA al 0,1% en PBS, se detectó GPC3 unido usando un
anticuerpo^{22} policlonal de oveja anti-GPC3,
seguido de una incubación con anticuerpo de burro
anti-IgG de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano (Sigma) usando O-fenilendiamina (Sigma) y
peróxido de hidrógeno como sustratos. Con el fin de cuantificar el
GPC3 presente en el suero, se realizó en paralelo una curva de
calibración de GPC3 purificado añadido a la misma dilución de una
combinación de suero normal. Para determinar la presencia de GPC3
en suero normal, se realizó la curva de calibración de GPC3 en PBS.
Se midió cada muestra tres veces por cuadruplicado.
Análisis estadístico: Se determinó la
significación de diferencias entre los grupos mediante la prueba de
Mann-Whitney.
Concentración serológica de AFP: Se
determinaron los niveles de AFP en muestras de suero en paralelo
mediante un kit ELISA disponible comercialmente (Axsym,
Abbott).
Se expresó una parte del ADNc de GPC3 clonado
(Filmus et al., citado anteriormente) que codifica para los
70 aminoácidos C-terminales consecutivos de GPC3
humano como una proteína de fusión a
glutation-S-transferasa en un
sistema de expresión de E. coli convencional.
Se usó la proteína de fusión, purificada en una
columna de glutatión para inmunizar ovejas, usando un protocolo
habitual. Se purificaron por afinidad los anticuerpos policlonales
frente al inmunógeno de 70 aminoácidos, mediante métodos
convencionales, tal como se describió en "Antibodies, a
Laboratory Manual", (1988), Ed. Harlow et al., Cold Spring
Harbor. Se usaron los anticuerpos policlonales para la
inumnotransferencia de tipo Western y los estudios de
inmunoprecipitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el mismo inmunógeno, una proteína de
fusión a GST, que incluía los 70 aminoácidos
C-terminales de GPC3 humano, para producir
anticuerpos monoclonales. Esta región de 70 aminoácidos es la menos
conservada a través de la especie y por tanto se usó para generar
anticuerpos específicos frente a GPC3 humano. Se generaron
hibridomas usando métodos conocidos para los expertos en la
técnica, por ejemplo tal como se describió en Kohler y Milstein,
Nature, 256:495-497, (1975).
En resumen, se inmunizaron ratones hembra Balb/C
con una única inyección i.p. que contenía 50 \mug de un fragmento
de GPC3 humano de 70 aminoácidos carboxilo terminales con etiqueta
de His emulsionado con adyuvante Titermax Gold^{TM} (Cedarlane).
Tras 21 días, se les realizó a los ratones una inmunización de
recuerdo con 50 \mug del mismo inmunógeno en ausencia de
adyuvante. Dos días más tarde, se recogieron las muestras de sangre
de la vena de la cola, y se obtuvieron sueros de ratón. Se sometió
a prueba el título anti-GPC3 en las muestras de
sueros mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
usando como control negativo el suero preinmunizado de los mismos
ratones. Se fusionaron los esplenocitos obtenidos de los dos
ratones con el título más alto con células de mieloma de ratón
SP2/0 Ag14 (relación 6:1) con polietilenglicol 4000 usando
procedimientos^{1} habituales (Parkin, D.M., Pisani, P. &
Ferlay, J., Global cancer statistics. CA. Cancer J. Clin., 49,
33-64, 1, (1999). Se cultivaron en placa en placas
de 96 pocillos en \alpha-MEM, Hepes 10 mM,
2-mercaptoetanol 50 \muM, FBS al 20%
complementado con Nutridoma-CS^{TM} (Roche) como
fuente de factores de crecimiento e hipoxantina, aminopterina y
timidina para seleccionar los híbridos. Se examinaron los clones
obtenidos mediante ELISA, usando placas de 96 pocillos cargadas con
0,05 \mug de fragmento de GPC3
carboxilo-terminal/pocillo. Se bloquearon las
placas durante 2 horas con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con los
sobrenadantes de cultivo condicionados. Se detectó la unión del
primer anticuerpo usando anticuerpo de cabra
anti-IgM de ratón y anticuerpo de cabra
anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa del
rábano (StressGen^{TM}) con O-fenilendiamina y
peróxido de hidrógeno como sustratos. Se volvieron a examinar los
clones positivos mediante inmunofluorescencia usando células
transfectadas con GPC3. Se clonaron dos veces los hibridomas
seleccionados (1G12 y 8H5), se determinó su isotipo (IgGl, K)
usando Isostrip^{TM} (Roche) y se purificaron a partir de
sobrenadantes de cultivo condicionados usando el kit
Affi-Gel Proteína A MAPS II de cromatografía en
columna de proteína A, (Bio-Rad^{TM}).
Se examinaron los anticuerpos producidos por los
hibridomas frente al fragmento GPC3 de 70 aminoácidos usando un
ELISA. Entonces se sometieron a prueba los clones positivos para
determinar su capacidad para teñir células transfectadas con GPC3
específicamente. Dos hibridomas (1G12 y 8H5) produjeron anticuerpos
que mostraron inmunotinción específica e intensa de células
transfectadas con GPC3. La figura 1 ilustra la tinción de células
293 con anticuerpos 1G12, seguido de un segundo anticuerpo
fluorescente. Los paneles A y C son micrografías de contraste de
fase y los paneles B y D son micrografías fluorescentes. Los
paneles A y B muestran células 293 transfectadas con el vector
solo, mientras que los paneles C y D muestran células transfectadas
con el vector que contenía GPC3. En este ejemplo, las células se
tiñeron en presencia de 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal (AcM)
1G12. El panel D muestra claramente la tinción específica con AcM
1G12. No se observa tinción en las células transfectadas con el
vector solo (panel B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirmó la especificidad de los dos
anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 1G12 y 8H5
mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western de lisados
de proteínas de células transfectadas con GPC3 con etiqueta de HA.
Tal como se muestra en la figura 2, el anticuerpo 1G12 detectó la
banda correspondiente a la proteína del núcleo GPC3, y la mancha
correspondiente a la forma gliconada de GPC3. Como control, se
ejecutó una inmunotransferencia de tipo Western paralela con un
anticuerpo anti-HA (12CA5).
Se tiñeron de manera inmunohistoquímica
secciones en parafina de tumor de CHC y las células no malignas
circundantes con anticuerpo monoclonal anti-GPC3
1G12 tal como se describió anteriormente. Se detectó el anticuerpo
anti-GPC3 usando un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina de ratón biotinilado y se
detectó el segundo anticuerpo unido usando estreptavidina conjugada
a peroxidasa de rábano.
La figura 3 muestra que el anticuerpo monoclonal
anti-GPC3, 1G12, se unió fuertemente a células
tumorales, pero no se unió nada a los hepatocitos normales. Además
de la presencia predicha de GPC3 en la membrana celular, también se
observó tinción significativa en el citoplasma. La tinción
citoplasmática era en gran parte granular y próxima a la superficie
celular.
Ocasionalmente se observó tinción perinuclear.
Las células no parenquimatosas eran generalmente negativas, con la
excepción de los macrófagos. Estos resultados indican que los
anticuerpos monoclonales anti-GPC3 pueden usarse
para diagnosticar HCC en secciones de tejido hepático mediante la
detección de GPC3.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 1 resume los resultados de un estudio
inmunohistoquímico de anticuerpos monoclonales frente a GPC3 que
reaccionan con quince carcinomas hepatocelulares diferentes. Doce
(80%) de estos CHC reaccionaron con los anticuerpos monoclonales
frente a GPC3. Hubo alguna variación en el número de células
teñidas que reaccionaron con el AcM anti-GPC3 en
cada tumor. Normalmente se agruparon las células positivas en
regiones de tipo clon. En todos los casos, las células hepáticas no
malignas que rodean al tumor eran negativas.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La tabla 2 muestra un resumen de los resultados
de reacciones de un anticuerpo monoclonal anti-GPC3
con tejidos hepáticos malignos y no malignos. 6 adenomas hepáticos
y 9 displasias hepáticas eran negativas para GPC3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos indican que GPC3 no se expresa en
hígado normal y en lesiones benignas, mientras que la mayoría de
los CHC expresan niveles detectables de
glipicano-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ELISA de tipo sándwich para determinar
GPC3 en el suero de pacientes diagnosticados con CHC. Para el
ELISA, se cubrieron placas de 96 pocillos con anticuerpo monoclonal
anti-GPC3 1G12, y se añadió una alícuota de suero
de prueba. Se extrajo el material no unido mediante lavado, y se
detectó GPC3 unido usando anticuerpos policlonales de oveja
anti-GPC3 preparados tal como en el ejemplo 1, se
complejaron directa o indirectamente con un reactivo de detección
útil para detectar la presencia del complejo inmunitario. Se midió
la densidad óptica de la muestra y se comparó con los resultados de
una curva patrón. La figura 4 ilustra la curva patrón para el
ensayo. Los resultados del ensayo eran lineales dentro del
intervalo sometido a prueba.
Se estableció un protocolo para recoger sueros
de pacientes que estaban tratándose de CHC en el Hospital General
de Toronto, y de quienes se obtuvo el consentimiento por escrito.
En un estudio preliminar, se recogieron los sueros de 9 pacientes
con CHC establecido. También se recogieron los sueros normales de
38 donantes de sangre y se combinaron. Se determinaron los niveles
de GPC3 mediante un ensayo de ELISA de tipo sándwich, usando una
dilución 1:3 (suero:PBS) de la muestra. Se analizó cada muestra por
cuadruplicado. Se obtuvo la concentración de GPC3 comparando la DO
obtenida de cada muestra con una curva patrón generada añadiendo
diversas cantidades de GPC3 a la misma dilución de una combinación
de suero normal.
La tabla 3 resume los resultados del estudio.
Cinco de los nueve pacientes con CHC (55%) tenían valores de GPC3
que eran significativamente elevados. Ninguno de estos pacientes
tenía aumento significativo de niveles de AFP. GPC3 no era
detectable en ninguna de las muestras normales.
Se realizaron estudios adicionales usando un
ELISA de tipo sándwich para medir los niveles de GPC3 en suero en
53 individuos sanos, 18 pacientes con hepatitis, 20 con hepatitis
más cirrosis y 34 con CHC. Se encontró que GPC3 era indetectable en
todos los individuos sanos y que 18 de los 34 pacientes con CHC
(53% de sensibilidad) tenían niveles de GPC3 en suero
significativamente elevados, con valores que oscilaban de desde 151
hasta 2924 ng/ml (figura 5 y tabla 4). Además, GPC3 era
indetectable en todos los pacientes con hepatitis y se detectó en
solamente 1 de 20 (5%) pacientes con hepatitis más cirrosis, a un
nivel de 117 ng/ml (95% de especificidad). Los análisis
estadísticos que usan la prueba de Mann-Whitney
mostró que los niveles promedio de suero (ng/ml) de GPC3 en
pacientes con CHC son significativamente superiores que aquéllos
con hepatitis más cirrosis, hepatitis y donantes sanos y no había
diferencia significativa entre los tres últimos grupos.
Se midieron los niveles de AFP en suero en el
mismo conjunto de 34 pacientes con CHC descrito en el ejemplo 6,
usando un ELISA disponible comercialmente (Axsym, Abbott). La tabla
4 muestra una comparación de los valores de AFP y GPC3
obtenidos.
Claims (19)
1. Método para detectar a un sujeto con
carcinoma hepatocelular (CHC) que comprende:
determinar el nivel de
glipicano-3 (GPC3) en una muestra de fluido
corporal de un sujeto;
en el que la presencia de un nivel detectable de
GPC3 en la muestra es indicativo de CHC en el sujeto.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende además determinar el nivel de alfafetoproteina (AFP) en
la muestra,
en el que al menos uno de un nivel detectable de
GPC3 en la muestra y un nivel de AFP superior al nivel de AFP de
sujetos control normales en la muestra es indicativo de CHC en el
sujeto.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el nivel de AFP de la muestra es superior a 20 ng/ml.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
el nivel de AFP de la muestra es superior a 100 ng/ml.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de GPC3 de la muestra se
determina mediante un método inmunológico.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
el método emplea un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se
une específicamente a GPC3 humano o a un fragmento del mismo.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el anticuerpo o el fragmento se une específicamente a un epítopo
dentro de los 70 aminoácidos carboxilo-terminales
consecutivos de GPC3 humano.
8. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el
que el anticuerpo o el fragmento es un anticuerpo policlonal.
9. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el
que el anticuerpo o el fragmento es un anticuerpo monoclonal.
10. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el
que el anticuerpo o fragmento es un fragmento seleccionado del
grupo que consiste en Fab, F(ab')_{2} y F_{v}.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que el anticuerpo o fragmento de
anticuerpo porta un marcador detectable.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que el anticuerpo o fragmento de
anticuerpo se detecta usando un segundo anticuerpo que se une
específicamente al anticuerpo o fragmento de anticuerpo
anti-GPC3 y comprende un componente de un sistema de
generación de señal.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que el anticuerpo o fragmento
anti-GPC3 se une a un sustrato sólido, la muestra
se pone en contacto con el sustrato sólido para permitir que el
GPC3 en la muestra se una al anticuerpo o fragmento
anti-GPC3 unido, el sustrato sólido se lava y el
GPC3 unido se determina usando un segundo anticuerpo que se une
específicamente al anticuerpo o fragmento de anticuerpo
anti-GPC3 y comprende un componente de un sistema
de generación de señal.
14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en
el que el segundo anticuerpo está conjugado a peroxidasa de
rábano.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, en el que el nivel de AFP se determina
mediante un ensayo ELISA.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que el fluido corporal es suero o
plasma.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que el sujeto es un sujeto
humano.
18. Método para detectar la presencia de GPC3 en
una muestra de fluido corporal, comprendiendo el método:
poner en contacto una muestra de fluido corporal
con un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente
a GPC3 o a un fragmento del mismo para permitir la formación de un
complejo anticuerpo-GPC3, o un complejo
anticuerpo-fragmento de GPC3; y detectar el complejo
anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3.
19. Método para determinar el nivel de GPC3 en
una muestra de fluido corporal, que comprende:
poner en contacto una muestra de fluido corporal
con un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente
a GPC3 o a un fragmento del mismo para permitir la formación de un
complejo anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3; y determinar el nivel
de complejo anticuerpo-GPC3 o
anticuerpo-fragmento de GPC3.
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| KR101413402B1 (ko) * | 2004-07-09 | 2014-06-27 | 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 | 항 글리피칸 3 항체 |
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| US20070087005A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Lazar Gregory A | Anti-glypican-3 antibody |
| WO2007053659A2 (en) * | 2005-11-01 | 2007-05-10 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Method of screening for hepatocellular carcinoma |
| EP2270509B1 (en) * | 2008-03-17 | 2014-01-15 | University of Miyazaki | Method for detection of liver cancer cell using anti-glypican-3 antibody |
| CN101393217B (zh) * | 2008-09-27 | 2012-05-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种原发性肝癌血清标志物的检测试剂盒 |
| WO2010048304A2 (en) * | 2008-10-21 | 2010-04-29 | Bayer Healthcare Llc | Identification of signature genes associated with hepatocellular carcinoma |
| WO2010098613A2 (ko) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | 포항공과대학교 산학협력단 | Ｔｍ７ｓｆ３를 유효성분으로 함유하는 간암 진단용 조성물, 및 항 ｔｍ７ｓｆ３ 항체를 유효성분으로 함유하는 간암 진단 키트, 및 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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Family Cites Families (6)
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