JPWO2011108626A1 - 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(概要)
本発明の第一の態様は、胃癌を検出するための胃癌検出用マーカーに関する。本発明は、Cofilin1タンパク質が健常者よりも胃癌患者の血液中に多く存在する知見に基づくものである。後述の本発明の第二の態様で説明するように、被検体の血液中に存在する当該タンパク質の量の多寡によって、その被検体の胃癌の罹患を検出し得る。
本発明において「胃癌検出用マーカー」とは、胃癌を検出するための生物学的マーカーであって、被検体が胃癌に罹患していることを示す指標となる物質をいう。本発明の胃癌検出用マーカーは、Cofilin1タンパク質、その変異体及び/又はそれらの断片(以降、本明細書において、これらをまとめて、しばしば「Cofilin1タンパク質等」と呼ぶ)で構成される。
(概要)
本発明の第二の態様は、胃癌を検出する方法に関する。本発明は、Cofilin1タンパク質が健常者よりも胃癌患者の血液中に多く存在する知見に基づき、被検体由来の体液中の存在する本発明の胃癌検出用マーカーCofilin1の量を測定し、その結果から胃癌を検出する方法である。
本発明の方法は、(1)胃癌検出用マーカーCofilin1測定工程、及び(2)罹患決定工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明をする。
「胃癌検出用マーカーCofilin1測定工程」とは、被検体由来の体液中に存在する本発明の胃癌検出用マーカー、すなわち、Cofilin1タンパク質、その変異体及び/又はそれらの断片の量をインビトロで測定する工程である。
以下、本発明で使用する抗Cofilin1ポリクローナル抗体等及びモノクローナル抗体等の作製方法について具体的に説明をする。
本発明において抗体を作製するにあたり、免疫原(抗原)としてのCofilin1タンパク質等を調製する。本発明において免疫原として使用可能なCofilin1タンパク質は、例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するヒトCofilin1タンパク質若しくはその変異体又はそのポリペプチド断片、あるいはそれらと他のペプチド(例えば、シグナルペプチド、標識ペプチド等)との融合ポリペプチドである。免疫原としてのCofilin1タンパク質は、例えば、配列番号1のアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により、免疫原として使用するためのCofilin1タンパク質断片を合成することができる。免疫原としてCofilin1タンパク質断片を使用する場合は、KLH、BSA等のキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。
このようにして得られたCofilin1タンパク質等を抗原としてCofilin1タンパク質等を特異的に認識する抗体を得ることができる。
ポリクローナル抗体を作製するために、まず、得られたCofilin1タンパク質等を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント(FCA)、不完全フロイントアジュバント(FIA)等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。
免疫動物からの抗体産生細胞の回収
本発明によれば、Cofilin1タンパク質等を特異的に認識する抗Cofilin1モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマを産生するための1つの方法は、動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を採取し、その抗体産生細胞を骨髄腫(ミエローマ)細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そしてCofilin1タンパク質等に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定すればよい。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。これらの細胞は、Cofilin1タンパク質等で免疫した動物から摘出又は採取したものを用いればよい。動物に免疫する方法は、前記ポリクローナル抗体の作製の項に準ずる。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウス等の動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株であるP3X63−Ag.8株(ATCC TIB9)、P3X63‐Ag.8.U1株(JCRB9085)、P3/NSI/1‐Ag4‐1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)又はSp2/0‐Ag14株(JCRB0029)等が挙げられる。
細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約1:1〜 20:1の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1500〜4000ダルトンのポリエチレングリコール等を約10〜80%の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる(Nature, 1977, Vol.266, 550‐552)。
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗Cofilin1抗体等を産生するハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等で適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に200万個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、20〜40℃ 、好ましくは約37℃である。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10% ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で2〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1000万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水又は血清を採取する。
前記(1)で作製した抗Cofilin1抗体等を用いた被検者由来の体液中に存在する本発明の胃癌検出用マーカー、すなわち、Cofilin1タンパク質等の量をインビトロで測定する方法(免疫学的測定法)としては、例えば、酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法が挙げられる。
「罹患決定工程」とは、前記胃癌検出用マーカー測定工程で測定されたタンパク質量に基づいて胃癌の罹患を決定する工程である。測定された胃癌検出用マーカー、すなわち、Cofilin1タンパク質等の質量に基づいて胃癌の罹患を決定する。決定方法の一例として、例えば、被検体の胃癌検出用マーカーの量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に多いときに胃癌に罹患していると決定する方法が挙げられる。
本発明の第三の態様は、胃癌検出キットである。
(1)中空糸フィルターの作製
分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を100本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール(モジュールA)は血清又は血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約7mm、長さは約17cmである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール(モジュールB)を分画分子量約3千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、1つモジュールセットが構成される。流路途中にT字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールA3本と、モジュールB1本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、PBS(0.15mM NaClを含むリン酸緩衝液、pH7.4)水溶液を充填した。分画原料の血清又は血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清又は血漿は、モジュールA毎に分子量約5万で分子篩が作用し、分子量5万よりも低分子の成分はモジュールBで濃縮され、調製されるようになっている。
(1)健常者及び胃癌患者血液のタンパク質同定
50〜70歳代の胃癌患者6名から得た血清の混合液、及び同年代の健常者6名から得た血清の混合液を調製した。各混合液をポアサイズ0.22μmのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度50mg/mLとなるように調製した。この血漿をさらに25mM重炭酸アンモニウム溶液(pH8.0)12.5mg/mLに希釈し、参考例(1)に示した中空糸フィルターによって分子量による分画を行った。分画後の血清サンプル(全量1.8mL、最大250μgのタンパク質を含む)を凍結乾燥した後、100μLの25mM重炭酸アンモニウム溶液(pH8.0)に再溶解した。このサンプルについて、総タンパク質の50分の1量のトリプシンで37℃、2〜3時間の条件でペプチド消化を行い、脱塩カラム(Waters社)による脱塩処理を行った後、さらにイオン交換カラム(KYAテクノロジーズ)によって8分画化した。その各々の分画を、逆相カラム(KYAテクノロジーズ)でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Q−TOF Ultima(Micromass社)を用いて、サーベイスキャンモードで3回測定した。
胃癌患者16名(ステージI:7名、ステージIII:5名、ステージIV:4名)及び健常対照12名より血漿サンプルを得た。各サンプル100μLに対し、100μLのアフィゲルブルー(Bio−Rad)と50μLのProteinA−セファロース(GEヘルスケア)を加え、4℃で一晩反応させ、サンプル中のアルブミン及びイムノグロブリンを除去した。このようにして得られたサンプルをSDSサンプルバッファー(50mM トリス塩酸、pH6.8、1mM DTT、5% SDS、10% グリセロール)で可溶化及び沸騰処理を行い、SDS−ポリアクリルアミドゲル(16%)電気泳動にかけた後、タンパク質をPVDF膜へ移した。これをウサギポリクローナル抗体(Proteintech Group社)、さらにパーオキシダーゼ標識2次抗体と反応させた。免疫反応するタンパク質をSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce社)を用いてX線フィルムに感光させ可視化し、Cofilin1に相当するバンドのシグナル強度を、Scion Image(Scion Corporation)を用いて画像解析により数値化した。その結果、早期及び進行性胃癌患者において、健常対照者と比べて高値の血漿中Cofilin1タンパク質濃度が検出された(図1)。
(1)胃癌検出におけるCEA及びCA19−9との性能比較
比較対象の腫瘍マーカーとして、CEA、及びCE19−9を選んだ。CEA(癌胎児性抗原)は,臨床的に最も広範囲かつ頻繁に利用されている腫瘍マーカーの一種であり、胃癌以外にも、肺癌,乳癌,胆道癌,膵癌,大腸癌等の検出に有用である。一方、CA19−9は、主に胃癌、大腸癌及び膵癌や胆嚢・胆管癌の進行例で高い陽性率を示すことが知られている。しかしながら、両マーカーともに感受性が低く、早期癌の検出には適していない。
Claims (9)
- 被検体由来の体液中に存在するCofilin1タンパク質、その変異体及び/又はそれらの断片からなる胃癌検出用マーカーの量をインビトロで測定し、その量に基づいて胃癌の罹患を決定する胃癌検出方法。
- 前記Cofilin1タンパク質が配列番号1に示されるポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 被検体の前記胃癌検出用マーカーの量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に多いときに胃癌に罹患していると決定する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記統計学的に有意に多い量が健常体の2倍以上である、請求項3に記載の方法。
- 前記測定が前記胃癌検出用マーカーと特異的に結合可能な物質を用いる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合可能な物質が抗Cofilin1抗体、抗Cofilin1変異体抗体及び/又はそれらの断片である、請求項5に記載の方法。
- 前記胃癌が早期胃癌である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液試料が血液又は尿である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 抗Cofilin1抗体、抗Cofilin1変異体抗体、それらの断片及び/又はそれらの化学修飾誘導体を含む、胃癌検出用キット。
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