WO2013031757A1 - 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法 - Google Patents

膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法 Download PDF

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antibody
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祥徳 田中
道元 小林
基晩 鄭
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Definitions

  • the present invention relates to a test method for pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer based on measuring COTL1 protein as a marker for detection of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer and measuring their amount in a body fluid in a subject.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer comprising a substance capable of binding to the protein used for detection of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer.
  • pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, or prostate cancer Treatment of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, or prostate cancer is performed by endoscopic treatment, surgery, chemotherapy, radiation therapy, etc., taking into account the stage, size / depth of tumor, degree of metastasis, etc. .
  • early cancer it can be completely removed by endoscopic resection or surgery, and the recurrence rate is relatively low, so the prognosis is relatively good.
  • metastasis that is difficult to excise often occurs in other organs, lymph nodes, and the like, and even when excised, local recurrence may occur.
  • radiation therapy and chemotherapy anticancer drug treatment
  • treatment results are inferior. Accordingly, it is recognized in the art that early detection is extremely important for the treatment of cancer.
  • the amount of a cancer detection marker comprising a COTL1 protein, a variant thereof and / or a fragment thereof existing in a body fluid derived from a subject is measured in vitro, and pancreatic cancer or breast cancer in the subject is determined based on the amount.
  • a method for examining cancer comprising evaluating the presence or absence of lung cancer or prostate cancer.
  • a diagnostic kit for pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer comprising an anti-COTL1 antibody, an anti-COTL1 mutant antibody, a fragment thereof and / or a chemically modified derivative thereof.
  • pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, or prostate cancer can be detected with higher sensitivity than existing tumor markers. For example, by measuring the concentration of COTL1 protein contained in a body fluid sample such as blood collected from a patient suspected of having pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, the patient can have pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate Whether or not it is cancer can be determined.
  • the figure which detected the COTL1 protein in the liquid mixture of the serum of 30 healthy persons, and the blood serum of 17 breast cancer patients by the western blotting using an anti-COTL1 antibody The graph which measured the COTL1 protein density
  • the first aspect of the present invention relates to a cancer detection marker for detecting pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer.
  • the present invention is based on the finding that COTL1 protein is present more in body fluids of patients with pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer than healthy individuals.
  • the presence or absence of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer in the subject is evaluated by the amount of the protein present in the body fluid of the subject. obtain.
  • the “cancer detection marker” is a biological marker for detecting pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, and whether or not the subject suffers from pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer.
  • a substance that serves as an indicator of The marker for cancer detection of the present invention is composed of a COTL1 protein, a variant thereof and / or a fragment thereof (hereinafter collectively referred to as “COTL1 protein etc.” in the present specification).
  • the COTL1 protein and the like are produced by the present inventors by pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer cells, and in pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, a large amount may leak into body fluids compared to a healthy body. It became clear.
  • the COTL1 protein “variant” refers to one or more, preferably a part of the amino acid sequence of COTL1 protein, preferably the human-derived wild-type COTL1 protein shown in SEQ ID NO: 1, or a partial sequence thereof. About 80% or more, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about about 80% or more of a mutant comprising deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids, or the amino acid sequence or a partial sequence thereof. It means a variant exhibiting% identity of 95% or more, about 97% or more, about 98% or more, about 99% or more.
  • “several” refers to an integer of about 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 or less.
  • % Identity can be determined using a BLAST or FASTA protein search system with or without introducing a gap (Karlin, S. et al., 1993, Proceedings). of the National Academic Sciences USA, 90, p. 5873-5877; Altschul, SF, et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215, p. 403-410; W. R. et al., 1988, Proceedings'of'the'National'Academic'Sciences'U.S.A., 85, pp. 2444-2448).
  • Specific examples of the COTL1 protein mutant include the type of subject (for example, race in the case of a subject), polymorphism (including SNIPs) based on an individual, splice mutation, and the like.
  • the reason why such a peptide fragment is included in the COTL1 protein is that if the COTL1 protein in the body fluid can be quantified even if it is fragmented, the object of the present invention can be achieved, and the wild-type COTL1 protein in the body fluid (preferably This is because the full-length polypeptide of human-derived wild-type COTL1 protein represented by SEQ ID NO: 1) or a mutant thereof may be fragmented by, for example, proteases or peptidases present in body fluids. .
  • the cancer detection marker of the present invention by measuring the amount in a body fluid in a subject, whether or not the subject is suffering from pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer is determined more than the existing tumor marker. It can be detected with high sensitivity.
  • the second aspect of the present invention relates to a method for detecting pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer.
  • the present invention is based on the knowledge that COTL1 protein is present in a larger amount in the body fluid of patients with pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer than in healthy subjects, and for detecting cancer according to the present invention present in body fluid derived from a subject. In this method, the amount of marker is measured, and pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer is detected from the result.
  • the method of the present invention includes (1) a marker measurement step for cancer detection, and (2) a disease determination step.
  • a marker measurement step for cancer detection includes (1) a marker measurement step for cancer detection, and (2) a disease determination step.
  • the “subject” is a specimen to be detected for pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, and corresponds to a vertebrate, preferably a mammal, and particularly preferably a human.
  • a human when the subject is a human, it is hereinafter referred to as “subject” in particular.
  • the “body fluid” is a sample used for detection of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, and means a biological fluid.
  • the body fluid is not particularly limited as long as it is a biological fluid that may contain the cancer detection marker of the present invention.
  • blood, urine, lymphocyte culture supernatant, cerebrospinal fluid, digestive fluid (including pancreatic juice and saliva), sweat, ascites, runny nose, tears, vaginal fluid, milk, semen and the like are included.
  • blood or urine blood
  • blood includes whole blood, plasma and serum.
  • the whole blood may be venous blood, arterial blood or umbilical cord blood.
  • the body fluid may be a combination of two or more obtained from the same individual.
  • the method for examining pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer of the present invention is very useful as a simple detection method because it can be detected from blood and urine with low invasiveness.
  • Subject-derived body fluid refers to body fluid that has already been collected from the subject, and the act of collecting body fluid itself is not included in the aspect of the present invention.
  • the body fluid derived from the subject may be immediately subjected to the method of the present invention after being collected from the subject, or may be refrigerated or frozen directly after collection or after being subjected to appropriate treatment. It may be returned to room temperature before being used.
  • Appropriate treatment before refrigeration or freezing includes, for example, adding heparin or the like to whole blood for anticoagulation treatment, or separating it as plasma or serum. These processes may be performed based on techniques known in the art.
  • the “amount of the marker for cancer detection of the present invention” refers to the amount of COTL1 protein and the like present in a body fluid derived from a subject.
  • This quantity may be either an absolute quantity or a relative quantity.
  • an absolute amount it corresponds to the mass or volume of a cancer detection marker contained in a predetermined body fluid amount.
  • a relative amount it refers to a relative value represented by a measurement value of a marker for cancer detection derived from a subject with respect to a specific measurement value. For example, concentration, fluorescence intensity, absorbance and the like can be mentioned.
  • the amount of cancer detection marker can be measured in vitro using a known method.
  • a method of measuring using a substance that can specifically bind to the protein or the like can be mentioned.
  • telomere binding means that a substance is substantially complex only with a marker for detecting cancer that is a target of the present invention, ie, a COTL1 protein, a variant thereof and / or a fragment thereof. Means to form.
  • substantially means binding other than non-specific binding.
  • “substances that can specifically bind” include COTL1-binding protein. More specifically, for example, an “anti-COTL1 antibody” that recognizes and binds to an epitope contained in the antigen using COTL1 protein as an antigen, preferably recognizes and binds to a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or an antibody that recognizes and binds to a variant of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which recognizes and binds to a variant of COTL1 or a variant of COTL1 protein as an antigen, And / or antibody fragments thereof. Alternatively, a chemically modified derivative thereof may be used.
  • the “chemically modified derivative” is a functional function necessary to acquire or retain a specific binding activity of the anti-COTL1 antibody, the anti-COTL1 mutant antibody and / or a fragment thereof with the COTL1 protein, etc. Any of the modifications, or modifications for labeling necessary to detect the anti-COTL1 antibody, anti-COTL1 variant antibody and / or fragments thereof are included.
  • Examples of functional modifications include glycosylation, deglycosylation, and PEGylation.
  • fluorescent dyes FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5
  • fluorescent proteins eg, PE, APC, GFP
  • enzymes eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase
  • biotin avidin or streptavidin
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are preferred to allow specific detection.
  • An anti-COTL1 polyclonal antibody that specifically binds to the COTL1 protein or the like including an anti-COTL1 polyclonal antibody, an anti-COTL1 mutant polyclonal antibody and / or a polyclonal antibody against a fragment thereof) or a monoclonal antibody or the like (anti-COTL1 monoclonal antibody, Anti-COTL1 mutant monoclonal antibodies and / or monoclonal antibodies against fragments of these antibodies) can be prepared by the methods described below.
  • the anti-human COTL1 polyclonal antibody is commercially available from Protein Group, etc., and can also be used.
  • the globulin type of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics, and may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD, with IgG and IgM
  • Antibody fragments include, but are not limited to, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv and the like. Also included are antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques. Such antibodies include, for example, synthetic antibodies, recombinant antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies), single chain antibodies and the like.
  • the anti-COTL1 protein antibody of the present invention is an antibody against one or several epitopes consisting of at least 5, preferably at least 8 amino acids of the protein.
  • a COTL1 protein (hereinafter referred to as “immunogen COTL1 protein”) as an immunogen (antigen) is prepared.
  • the COTL1 protein that can be used as an immunogen in the present invention is, for example, a human COTL1 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof or a fragment thereof, or other peptides thereof (for example, a signal peptide, a label A fusion polypeptide with a peptide etc.).
  • the immunogenic COTL1 protein can be synthesized by a technique known in the art, for example, a solid phase peptide synthesis method, using the amino acid sequence information of SEQ ID NO: 1.
  • a carrier protein such as KLH or BSA.
  • the immunogen COTL1 protein and the like can also be obtained using a known DNA recombination technique.
  • a cDNA encoding the COTL1 protein or the like may be prepared by a cDNA cloning method known in the art. Extraction of total RNA from biological tissues such as epithelial cells expressing the immunogen COTL1 gene, etc., and treatment with an oligo dT cellulose column, cDNA library by RT-PCR method using poly A (+) RNA as a template And a target cDNA clone can be obtained from this library by screening methods such as hybridization screening, expression screening, and antibody screening. If necessary, the cDNA clone may be further amplified by the PCR method.
  • cDNA corresponding to the target gene can be obtained.
  • cDNA cloning techniques are described, for example, in Sambrook, J. et al. And Russel, D .; Written by Molecular Cloning, A LABORARY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, published January 15, 2001, Volumes 7.42-7.45, Volumes 8.9-8.17. .
  • the cDNA clone obtained by the above method or the like is incorporated into an expression vector, and the target COTL1 protein or the like is obtained by culturing a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with the vector or transfected with the vector. Can be obtained from the cells. Further, the mature polypeptide can be secreted outside the cell by flanking the nucleotide sequence encoding the secretory signal sequence at the 5 ′ end of the DNA encoding the target protein. Can be obtained from the culture supernatant.
  • expression vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pET21a, pGEX4T, pC118, pC119, pC18, pC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5 etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24). , YCp50, etc.), and phage DNA includes ⁇ phage ( ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • Cloning vectors and expression vectors are commercially available from manufacturers such as Merck, Takara Shuzo, Daiichi Chemicals, Qiagen, Promega, Roche Diagnostics, Life technologies, Genetics Institute, GE Healthcare, etc. Can also be used.
  • a cDNA such as COTL1 protein into an expression vector
  • the vector may contain regulatory elements such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, ribosome binding sites, replication origins, terminators, selectable markers, and the like.
  • an expression vector is constructed so that it is expressed in the form of a fusion polypeptide with a labeled peptide at the C-terminus or N-terminus of COTL1 protein, etc.
  • the protein may be prepared.
  • Representative labeled peptides include 6-10 residue histidine repeat tags, FLAG tags, myc peptide tags, GFP proteins, etc., but the labeled peptides are not limited to these.
  • a known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. For details of DNA recombination technology, see Sambrook, J. et al. & Russel, D. (Above), and may be performed in accordance therewith.
  • host cells include prokaryotic cells such as bacteria (for example, Escherichia coli, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, etc.), yeast (for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae). Saccharomyces pombe, insect cells (eg, Sf cells, S2 cells), mammalian cells (eg, HEK293, HeLa, COS, CHO, BHK) and the like can be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into a host cell is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into each host.
  • Examples of the method for introducing the vector into bacteria include a heat shock method, a method using calcium ions, and an electroporation method. These techniques are all known in the art and are described in various documents. For example, Sambrook, J. & Russel, D. See (above). Examples of methods for introducing the vector into animal cells include the lipofectin method (PNAS 1989, Vol. 86, 6077; PNAS 1987, Vol. 84, 7413), electroporation method, calcium phosphate method (Virology 1973, Vol. 52, 456-467), a method using liposome, the DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
  • the medium As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the culture is usually performed at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the pH is preferably maintained near neutrality. The pH may be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium (for example, DMEM, RPMI-1640) as necessary.
  • the medium for example, DMEM, RPMI-1640
  • transformants such as mammalian cells are cultured, they are cultured in a medium suitable for each cell. At this time, the medium may or may not contain serum, but culture in a serum-free medium is more desirable.
  • the COTL1 protein or the like is produced in the microbial cells or cells, the microbial cells or cells may be disrupted and the protein extracted by a method known in the art.
  • the culture solution may be used as it is, or the supernatant may be used after removing the cells or cells by centrifugation or the like.
  • a method by ion exchange chromatography may be used as a purification method.
  • a method of combining gel filtration, hydrophobic chromatography, isoelectric point chromatography and the like may be used.
  • a labeled peptide such as a histidine repeat tag, a FLAG tag, a myc tag, or GFP
  • a method by affinity chromatography suitable for each generally used labeled peptide can be employed. Whether or not COTL1 protein or the like has been obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.
  • an appropriate animal is immunized with the protein of the present invention.
  • the immunization method may be carried out in accordance with the method described in the above section “Preparation of polyclonal antibody”.
  • antibody-producing cells are collected from the immunized animal. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred. These cells may be those extracted or collected from animals immunized with COTL1 protein or the like.
  • the method for immunizing animals is in accordance with the above-mentioned section “Preparation of polyclonal antibodies”.
  • the myeloma cells are HGPRT-deficient strain or thymidine kinase-deficient strain
  • cells having the ability to produce antibodies and bone marrow can be obtained by using a selective medium (HAT medium) containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine.
  • HAT medium a selective medium containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine.
  • Only hybridomas of tumor cell lines can be selectively cultured and propagated. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be carried out according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma is grown is collected and screened by enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), etc. be able to. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established.
  • enzyme immunoassay EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA
  • RIA Radio Immuno Assay
  • the hybridoma of the present invention is stable in culture in a basic medium such as RPMI-1640, DMEM, etc., and specifically reacts with COTL1 protein derived from pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer Is produced and secreted.
  • a basic medium such as RPMI-1640, DMEM, etc.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques known in the art. For example, as a method for collecting a monoclonal antibody from an established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for 2-10 days and obtain antibody from the culture supernatant.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • hybridomas In the case of the ascites formation method, about 10 million hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites fluid or serum is collected after 1 to 2 weeks.
  • a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography or the like is appropriately selected, or these are used.
  • a purified monoclonal antibody of the present invention can be obtained.
  • the monoclonal antibodies of the present invention include chimeric antibodies (for example, human antibodies having the variable region of mouse monoclonal antibodies) and humanized antibodies (for example, human antibodies having the CDRs of mouse monoclonal antibodies).
  • the present invention also provides an antigen-binding fragment of the above antibody. Examples of antigen-binding fragments that can be produced by conventional techniques include, but are not limited to, Fab and F (ab ′) 2 fragments. Also provided are multivalent antibodies (eg, diabodies), antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody of the present invention can be used in an assay for detecting the presence of the polypeptide of the present invention or a (poly) peptide fragment thereof both in vitro and in vivo.
  • the antibodies of the present invention can also be used to purify proteins or protein fragments by immunoaffinity chromatography.
  • polyclonal antibodies may be bound by a so-called absorption method involving binding of the antibody to an affinity column to which the purified polypeptide is bound, Specific antibodies can be obtained.
  • (B) In vitro measurement of marker for cancer detection of the present invention using anti-COTL1 antibody or the like Marker for cancer detection of the present invention present in body fluid derived from a subject using anti-COTL1 antibody or the like prepared in (A) above, That is, as a method for measuring the amount of COTL1 protein or the like in vitro (immunological assay), for example, enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunity Measurement methods, immunoturbidimetric methods, latex agglutination reactions, latex turbidimetry methods, erythrocyte agglutination reactions, particle agglutination reactions, or Western blotting methods may be mentioned.
  • enzyme immunoassay ELISA, EIA
  • fluorescence immunoassay fluorescence immunoassay
  • radioimmunoassay RIA
  • luminescence immunity Measurement methods immunoturbidimetric methods, latex
  • the cancer detection marker measurement method of the present invention is performed by an immunoassay using a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay, the anti-COTL1 antibody It is preferable to immobilize the components or the like, or to immobilize the components in the sample and perform their immunological reaction.
  • a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • solid phase carriers beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials Insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used.
  • the solid phase can be formed by binding a solid phase carrier and the anti-COTL1 antibody or the like or a sample component according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
  • the reaction in order to easily detect the reaction of the anti-COTL1 antibody and the like with the marker for cancer detection of the present invention derived from pancreatic cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells or prostate cancer cells in body fluid,
  • the reaction is directly detected by labeling a COTL1 antibody or the like, or indirectly by using a labeled secondary antibody.
  • labeling substance in the case of enzyme immunoassay, peroxidase (POD), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, amidase, biotin-avidin complex, etc.
  • POD peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • ⁇ -galactosidase urease
  • catalase glucose oxidase
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase
  • amidase biotin-avidin complex
  • the component in the body fluid is solid-phased and brought into contact with the labeled anti-COTL1 antibody or the like, so that the cancer detection marker of the present invention (COTL1 protein or the like) -anti-antibody A complex such as a COTL1 antibody is formed. Then, the unbound labeled antibody can be washed and separated, and the amount of a marker for cancer detection (COTL1 protein etc.) in the body fluid can be measured based on the amount of the bound labeled antibody or the amount of the unbound labeled antibody.
  • immune complex aggregates such as immunoturbidimetry, latex agglutination, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination, or particle agglutination can be measured by measuring the transmitted light and scattered light using optical methods, or by visual inspection. It can also be implemented by the method of measuring.
  • a phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good buffer, or the like can be used as a solvent, and a reaction accelerator such as polyethylene glycol or a nonspecific reaction inhibitor is included in the reaction system. May be.
  • the “secondary antibody that reacts with the marker for cancer detection at a site different from the primary antibody” used herein is particularly an antibody that recognizes a site other than the binding site between the primary antibody and the marker for cancer detection (COTL1 protein, etc.).
  • COTL1 protein the marker for cancer detection
  • any of polyclonal antibodies, antisera, and monoclonal antibodies may be used, and fragments of these antibodies (Fab, F (ab ′) 2 , Fab, Fv, etc.) can also be used.
  • multiple types of monoclonal antibodies may be used as secondary antibodies.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with a marker for detecting cancer derived from pancreatic cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells or prostate cancer cells, as described above, it can be used as a cancer detection agent.
  • the detection agent of the present invention contains the antibody of the present invention.
  • the detection agent of the present invention by detecting the cancer detection marker contained in a sample collected from an individual suspected of suffering from pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, the individual's pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer Alternatively, the presence or absence of prostate cancer can be detected.
  • the detection agent of the present invention can be used in any means as long as it is a means for performing immunological measurement, but in combination with means known in the art such as a test strip for immunochromatography. By using it, cancer can be detected more easily and rapidly.
  • the test strip for immunochromatography has been developed, for example, a sample receiving part made of a material that easily absorbs a sample, a reagent part containing the detection drug of the present invention, a development part where a reaction product of the sample and the detection drug moves, It is composed of a labeling part for coloring the reaction product, a presentation part for developing the colored reaction product, and the like, and can be in the same form as the pregnancy diagnostic agent.
  • the immunochromatographic test strips can be used for monitoring at home because they do not pose any pain or danger to the use of reagents to the users, and the results are examined and treated (surgical excision) at the level of each medical institution. Etc.) and can be linked to prevention of metastasis / recurrence.
  • This test strip can be mass-produced at low cost by a manufacturing method as described in, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 10-54830. Further, by using the detection agent of the present invention in combination with a known detection agent for a tumor marker of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, a more reliable diagnosis is possible.
  • “BREAST CANCER” refers to a malignant tumor that occurs in breast tissue.
  • Breast cancer is pathologically classified into invasive ductal cancer, invasive lobular cancer, medullary cancer, mucinous cancer, tubular cancer, invasive micropapillary cancer, metaplastic cancer and the like, but is not particularly limited thereto.
  • Lung cancer refers to a malignant tumor derived from epithelial cells that occurs in the lung. Lung cancer is pathologically classified into small cell cancer and non-small cell cancer, and non-small cell cancer is further classified into lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, bronchioloalveolar carcinoma, etc. It is not limited.
  • Prostate cancer refers to a malignant tumor that develops in the prostate. Most prostate cancers are classified as adenocarcinoma as a pathological histological type, but are not particularly limited thereto.
  • Healthy body refers to an individual who is not suffering from at least pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, preferably a healthy individual. Furthermore, the healthy body needs to be the same species as the subject. For example, when the subject to be examined is a human (subject), the healthy body must also be a human (in this specification, particularly “healthy person”).
  • the physical condition of a healthy body is preferably the same as or close to that of the subject. For example, in the case of a human, the physical condition corresponds to race, sex, age, height, weight, and the like.
  • “Statistically significant” includes, for example, a case where the risk value (significance level) of the obtained value is less than 5%, 1%, or 0.1%. Therefore, “statistically significant” means that there is a significant difference between the two when statistically treating the quantitative difference between the cancer detection markers obtained from the subject and the healthy subject. And the amount of the protein in the subject is larger than that in the healthy subject. Usually, the amount of the cancer detection marker in the body fluid corresponds to the case where the subject is 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, most preferably 5 times or more that of a healthy body. In the present invention, if the quantitative difference is three times or more, the reliability is high, and it can be said that the reliability is statistically significant.
  • the test method for statistical processing is not particularly limited as long as a known test method capable of determining the presence or absence of significance is appropriately used. For example, Student's t test or multiple comparison test can be used.
  • the amount of the cancer detection marker in the body fluid of the healthy body is preferably measured by the same method as the method for measuring the amount of the marker for cancer detection in the body fluid of the subject described in the above step.
  • the amount of the cancer detection marker in the body fluid of the healthy body can be measured every time the amount of the cancer detection marker in the body fluid of the subject is measured, but the amount of the cancer detection marker measured in advance Can also be used.
  • the mass of a marker for cancer detection under various physical conditions of a healthy body is measured in advance and the value is input to a computer and stored in a database, the physical condition of the subject is input to the computer.
  • the amount of the cancer detection marker of a healthy subject having the optimal physical condition for comparison with the subject can be used immediately.
  • a subject has pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, or prostate cancer if the amount of cancer detection marker in the subject's body fluid is statistically significantly greater than the amount of cancer detection marker in the healthy body fluid Determine that you are doing.
  • the stage of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer that is the subject of the present invention is not particularly limited, and ranges from early stage cancer to end stage cancer.
  • the method includes immunologically measuring a cancer detection marker in a body fluid sample using an antibody.
  • the method of the present invention can not only determine whether a subject suffers from pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer, but also distinguish between pancreatic cancer patients and non-pancreatic cancer patients, distinguish between breast cancer patients and non-breast cancer patients. Enabling discrimination between lung cancer patients and non-lung cancer patients, or prostate cancer patients and non-prostate cancer patients.
  • Cancer diagnostic kit The third aspect of the present invention is a cancer diagnostic kit.
  • Cancer diagnostic kit is used for detecting the presence or absence of cancer, the degree of morbidity, the presence or absence of improvement, and the degree of improvement, and for screening candidate substances useful for the prevention, improvement or treatment of cancer. , which is used directly or indirectly.
  • the kit of this embodiment has as its component a COTL1 protein, preferably SEQ ID NO: 1, whose expression varies in a body fluid sample, particularly blood, preferably serum, plasma, in relation to the onset of pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer.
  • a substance capable of specifically recognizing and binding to a protein having the amino acid sequence shown in FIG. Specifically, for example, an anti-COTL1 protein antibody or the like or a fragment thereof or a chemically modified derivative thereof is included. These antibodies may be bound to a solid phase carrier.
  • a labeled secondary antibody further, a substrate necessary for detection of the label, a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, a COTL1 protein as a purified standard substance, instructions for use, etc. May be included.
  • Module B is a mini-module used for concentration of low molecular weight protein produced using a membrane having a pore size of about 3,000 in the molecular weight cutoff.
  • Each module has an inlet connected to the hollow fiber lumen at one end and an outlet at the other end. The inlet and the outlet are connected by a silicon tube to form a closed circulation system flow path.
  • Each module is configured so that liquid is driven and circulated in the flow path by a peristaltic pump, and each module is connected in tandem as described above by a T-shaped connector provided in the middle of the flow path. ing. Further, the glass tube of the hollow fiber mantle is provided with a port for discharging the liquid leaked from the hollow fiber.
  • the hollow fiber filter was washed with distilled water and then filled with an aqueous solution of PBS (phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4).
  • PBS phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4
  • the fraction raw material serum or plasma injected from the flow path inlet of the hollow fiber filter is fractionated by molecular sieve with a molecular weight of about 50,000 every time it passes through three modules A, and about 3,000 low molecules in module B After the components are concentrated, the components are discharged from the outlet of the flow path.
  • Example 1 Protein identification in blood of healthy subjects and breast cancer patients A serum mixture obtained from 17 breast cancer patients who obtained informed consent and a serum mixture obtained from 30 healthy subjects of the same age were prepared. Each mixed solution was filtered through a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m to remove contaminants, and the protein concentration was adjusted to 50 mg / mL. This serum was further diluted to 12.5 mg / mL of 25 mM ammonium bicarbonate solution (pH 8.0), and fractionation based on molecular weight was performed using the hollow fiber filter shown in the reference example.
  • Fractionated serum samples (total volume 1.8 mL, containing up to 250 ⁇ g protein) were lyophilized and redissolved in 100 ⁇ L 25 mM ammonium bicarbonate solution (pH 8.0). The sample was digested with peptide at 37 ° C. for 2 to 3 hours with trypsin that is 1/50 of the total protein, desalted with a desalting column (Waters), and then further subjected to an ion exchange column. (KYA Technologies). Each of the fractions was further fractionated on a reverse phase column (KYA Technologies), and the eluted peptides were measured three times using a mass spectrometer Q-TOF Premier (Micromass) linked online. did.
  • the measurement data was analyzed by MASCOT (Matrix Science), which is analysis software, and the proteins contained in each sample were identified. At the time of the protein identification, the existence reliability score is calculated for each protein at the same time. The score is compared between healthy subjects (healthy 1 to 3) and breast cancer patients.
  • the COTL1 protein was found as a protein in which the average of the three score measurements of patients (breast cancer 1 to breast cancer 3) was significantly higher than the average of healthy samples (Table 1).
  • pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, or prostate cancer can be detected with high reliability, efficiency, and efficiency by a simple and inexpensive method. Diagnosis and treatment become possible. Further, according to the method of the present invention, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer can be detected noninvasively using patient blood, so that pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer or prostate cancer can be detected easily and rapidly. .

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Abstract

　被験体に与える侵襲性が低く、かつ検出感度と正確性の高い、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法を提供することを目的とする。　被験体由来の体液試料中のＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片をインビトロで測定し、その量に基づいて膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患の有無を検出する方法、並びに、該タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌診断用キットを提供する。

Description

膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法
　本発明は、ＣＯＴＬ１タンパク質を膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカーとし、被験体における体液中のそれらの量を測定することに基づく膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法に関する。
　本発明はまた、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出のために使用される前記タンパク質と結合可能な物質を含む膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の診断用キットに関する。
　日本人の死亡原因の中で、癌（悪性腫瘍、又は悪性新生物）による死亡の占める割合は年々増加しており、いまや日本人の３人に１人は癌で死亡する時代である。癌の発生部位を臓器別に見ると、膵癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌の罹患数・死亡数が比較的大きな割合を占めている。厚生労働省による人口動態調査によると、２００５年の前記各癌の罹患数は、膵癌２４,７９９人、乳癌５０,６９５人、肺癌８３,８８１人、前立腺癌４２,９９７人であり、２００９年の日本における各癌での死亡数は、膵癌２６,７９１人、乳癌１１,９１８人、肺癌６７,５８３人、前立腺癌１０,０３６人であった。これらの罹患数、死亡数は、いずれも年々増加傾向にある。
　膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の治療は、病期、腫瘍の大きさ・深達度、転移の度合などを勘案して、内視鏡治療、外科手術、化学療法、放射線療法などが行われる。早期癌である場合には、内視鏡切除、又は外科手術によって完全に切除することが可能であり、再発率も比較的低いため予後は比較的良好である。一方、進行癌である場合には、他の臓器、リンパ節などに切除困難な転移が生じていることが多く、また切除した場合であっても局所再発を起こすことがある。進行癌の時期には、手術に加え放射線療法や化学療法（抗癌剤治療）が行われるが、治療成績は劣る。したがって、癌の治療に関しては、早期発見が極めて重要であることが当該分野で認識されている。
　しかしながら、自覚症状のみによって、これらの癌を早期に発見することは困難である。いずれも早期癌の段階ではほとんど無症状であり、はっきりとした自覚症状が現れるのは、癌がある程度進行した後であることが多いためである。それ故、自覚症状による受診時に発見される癌は、既に転移が生じている等の理由により、通常、予後不良である。また、それらの自覚症状は、他の病気と混同される場合が多いという問題もある。
　膵癌、乳癌、肺癌の従来の検査法として、膵癌の場合には、超音波、ＣＴなどの画像検査等の方法が、乳癌の場合には、問診、触診、軟X線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が、肺癌の場合には、胸部エックス線写真等が、一般的に採用されている。しかしながら、これらの方法は、癌を確定するのに時間を要する他、結果の解釈が難しく、偽陽性率が高いといった欠点がある。
　そこで、これらの癌に対して感受性が高い血中腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ　ｍａｒｋｅｒ）を発見し、それを用いたスクリーニング検査によって癌を早期に発見する方法が注目されている。血中マーカーのレベルを計測することにより、比較的安価でハイスループットな検査・診断が可能になると考えられる。これまでに、膵癌のマーカーとして、ＣＡ１９－９（非特許文献１）、ＣＥＡ及びＤＵＰＡＮ－２などが、乳癌のマーカーとして、ＣＡ１５－３（非特許文献２）、及びＣＥＡなどが、そして肺癌の場合にはそれぞれ組織型に応じたマーカーとしてＳＬＸ、ＳＣＣ、及びＮＳＥ（非特許文献３）などが、それぞれ臨床応用されている。また、前立腺癌の検査法としては、腫瘍マーカーとしてＰＳＡ（非特許文献４）が存在し、スクリーニングのレベルにおいても臨床応用されている。
Ｍｅｔｚｇａｒ　ＲＳ．ら、１９８２年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、第４２巻、ｐ.６０１-６０８ Ｂａｓｔ　ＲＣ．　Ｊｒ.ら、２００１年、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．、第１９巻、ｐ.１８６５-１８７８ Ｓｈｉｂａｙａｍａ　Ｔ．ら、２００１年、Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ．、第３２巻、ｐ.６１-６９ Ｇｒｅｔｚｅｒ　Ｍ．Ｂ．ら、２００３年、Ｕｒｏｌ　Ｃｌｉｎ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ．、第３０巻、ｐ.６７７-６８６
　しかしながら、現在臨床応用されている上記のマーカーは、いずれも癌の検出感度に乏しいという問題がある。最もよく利用されているＣＥＡでも、各癌において４割程度が陽性を示すのみである。それ故、これらの腫瘍マーカーの利用は、治療後の経過観察といった限られた目的に限定されており、ＰＳＡ以外の腫瘍マーカーは、健康診断でのスクリーニングを目的とした測定には用いられていない。また、ＰＳＡは、前立腺癌の罹患時に血清中の含有量が上昇するが、炎症(前立腺炎)や、前立腺肥大症などの他の疾患でも上昇することがある。 また、いわゆる「グレイゾーン（ＰＳＡ値：４～１０ｎｇ／ｍＬ）」の範囲での前立腺癌の発見率は３０％前後と低く、擬陽性率が高いというリスクがある。
　したがって、より検出感度が高い膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌のマーカーの開発が切望されている。
　本発明の課題は、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出に有用な新規の腫瘍マーカー、及び該腫瘍マーカーを用いた膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法を開発し、提供することである。
　上記の課題を解決するために、本発明者らは、膵癌患者の血液、乳癌患者の血液、肺癌患者の血液、前立腺癌患者の血液及び健常体の血液に存在するタンパク質群を比較し、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の血液に検出される新規腫瘍マーカーとしてＣＯＴＬ１タンパク質を見出し、本発明を完成するに至った。
　「ＣＯＴＬ１」（ｃｏａｃｔｏｓｉｎ－ｌｉｋｅ１）タンパク質とは、アクチン細胞骨格結合性タンパク質で、細胞内で５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅと結合することが報告されており、ロイコトリエンの生合成に関与すると考えられている（Ｐｒｏｖｏｓｔ　Ｐ．ら、２００１年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７６巻、ｐ.１６５２０-１６５２７）。また、このタンパク質は、リウマチの発症に伴い、その血中濃度が高まることが報告されている（Ｅｕｎ－Ｈｅｕｉ　Ｊ．ら、２００９年、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４１巻、ｐ.３５４-３６１）。しかしながら、ＣＯＴＬ１タンパク質と、乳癌、肺癌又は前立腺癌との関連性に関する報告は、現在まで知られていない。膵癌に関しては、ＳＥＲＥＸ法により癌抗原として同定されているものの（Ｎａｋａｔｓｕｒａ　Ｔ．ら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、第２５６巻、ｐ．７５－８０）、血液や尿に含まれる体液中の腫瘍マーカーとしての報告は無い。
　したがって、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）被験体由来の体液中に存在するＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片からなる癌検出用マーカーの量をインビトロで測定し、その量に基づいて、被験体における膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌への罹患の有無を評価することを含む、癌の検査方法。
（２）前記ＣＯＴＬ１タンパク質が配列番号１に示されるポリペプチドである、（１）に記載の方法。
（３）被験体の前記癌検出用マーカーの量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に多いときに膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患していると決定する、（１）又は（２）に記載の方法。　
（４）前記統計学的に有意に多い量が健常体の２倍以上である、（３）に記載の方法。
（５）前記測定が前記癌検出用マーカーと特異的に結合可能な物質を用いる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記結合可能な物質が抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体及び／又はそれらの断片である、（５）に記載の方法。
（７）前記体液試料が血液又は尿である、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体、それらの断片及び／又はそれらの化学修飾誘導体を含む、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の診断用キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-186155号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を、既存の腫瘍マーカーよりも高い感度で検出することが可能である。例えば、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌への罹患が疑われる患者から採取された血液などの体液試料中に含まれるＣＯＴＬ１タンパク質の濃度を測定するだけで、その患者が膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌であるか否かを決定することができる。
健常者３０名の血清の混合液及び乳癌患者１７名の血清の混合液中のＣＯＴＬ１タンパク質を、抗ＣＯＴＬ１抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した図。 健常者４名及び乳癌患者８名の、それぞれの血清中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、その相対値を示したグラフ。 健常者３０名の血清の混合液及び膵癌患者４名の血清の混合液中のＣＯＴＬ１タンパク質を、抗ＣＯＴＬ１抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した図。 健常者４名及び膵癌患者３名の、それぞれの血清中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、その相対値を示したグラフ。 健常者４名及び肺癌患者４名の、それぞれの血清中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、その相対値を示したグラフ。 健常者４名及び前立腺癌患者６名の、それぞれの血清中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定し、その相対値を示したグラフ。
１．癌検出用マーカー
　本発明の第一の態様は、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を検出するための癌検出用マーカーに関する。本発明は、ＣＯＴＬ１タンパク質が健常者よりも、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌患者の体液中に多く存在する知見に基づくものである。後述の本発明の第二の態様で説明するように、被験体の体液中に存在する当該タンパク質の量の多寡によって、その被験体の膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患の有無を評価し得る。
　本発明において「癌検出用マーカー」とは、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を検出するための生物学的マーカーであって、被験体が膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患しているか否かを示す指標となる物質をいう。本発明の癌検出用マーカーは、ＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片（以降、本明細書において、これらをまとめて、しばしば「ＣＯＴＬ１タンパク質等」と呼ぶ）で構成される。
　本発明の「ＣＯＴＬ１タンパク質」は、前述のようにアクチン細胞骨格結合性タンパク質をいう。本発明においては、１４２アミノ酸からなる約１７ｋＤａの各生物種ＣＯＴＬ１タンパク質が該当するが、好ましくはヒト由来のＣＯＴＬ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ　アクセッションＮｏ．ＮＰ＿０６６９７２．１）、具体的には、配列番号１に示されるポリペプチドである。また、ＣＯＴＬ１タンパク質は、ＣＯＴＬ１タンパク質、特にヒト由来のＣＯＴＬ１タンパク質の変異体又は野生型及び／又は変異体のＣＯＴＬ１タンパク質の断片であってもよい。ＣＯＴＬ１タンパク質等は、本発明者らにより、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌細胞によって産生され、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌では、健常体に比べて多くの量が体液中に漏出することが明らかとなった。
　本明細書において前記ＣＯＴＬ１タンパク質「変異体」とは、ＣＯＴＬ１タンパク質の、好ましくは配列番号１に示されるヒト由来の、野生型ＣＯＴＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列又はその部分配列において、１以上、好ましくは１～数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。ここで、「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個以下の整数を指す。また、「％同一性」とは、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。ＣＯＴＬ１タンパク質の変異体の具体例として、被験体の種類(例えば、被験者の場合は人種)や個体に基づく多型（ＳＮＩＰｓを含む）、スプライス変異等が挙げられる。
　本明細書において「断片」とは、野生型ＣＯＴＬ１タンパク質、好ましくは配列番号１で示されるヒト由来の、野生型ＣＯＴＬ１タンパク質又はその変異体を構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７個以上全数未満、少なくとも１０個以上全数未満、少なくとも１５個以上全数未満、好ましくは少なくとも２０個以上全数未満、少なくとも２５個以上全数未満、より好ましくは少なくとも３５個以上全数未満、少なくとも４０個以上全数未満、少なくとも５０個以上全数未満の連続するアミノ酸残基からなり、１個又は複数のエピトープを保持するポリペプチド断片をいう。このようなペプチド断片は、後述する本発明に関わる抗体又はその断片と免疫特異的に結合することができる。このようなペプチド断片をＣＯＴＬ１タンパク質に包含する理由は、たとえ断片化されていても体液中のＣＯＴＬ１タンパク質を定量できれば、本発明の目的を達し得、また、体液中の上記野生型ＣＯＴＬ１タンパク質（好ましくは配列番号１で示されるヒト由来の野生型ＣＯＴＬ１タンパク質）又はその変異体の全長ポリペプチドが、例えば、体液中に存在するプロテアーゼやペプチダイーゼ等によって断片化されて存在する可能性があるからである。
　本発明の癌検出用マーカーによれば、被験体における体液中の量を測定することで、その被験体が膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患しているか否かを既存の腫瘍マーカーよりも高い感度で検出することができる。
２．膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法
　本発明の第二の態様は、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を検出する方法に関する。本発明は、ＣＯＴＬ１タンパク質が健常者よりも、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌患者の体液中に量的に多く存在する知見に基づき、被験体由来の体液中に存在する本発明の癌検出用マーカーの量を測定し、その結果から膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を検出する方法である。
　本発明の方法は、（１）癌検出用マーカー測定工程、及び（２）罹患決定工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明をする。
（１）癌検出用マーカー測定工程
　「癌検出用マーカー測定工程」とは、被験体由来の体液中に存在する本発明の癌検出用マーカー、すなわち、ＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片の量をインビトロで測定する工程である。
　本明細書において「被験体」とは、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患の検出対象となる検体であって、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトが該当する。本明細書において、被験体がヒトの場合には、以降、特に「被験者」とする。
　本明細書において「体液」とは、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出のために供される試料であって、生物学的流動体を意味する。体液は、本発明の癌検出用マーカーが含まれる可能性のある生物学的流動体であればよく、特に限定はされない。例えば、血液、尿、リンパ球培養上清、髄液、消化液（膵液、唾液を含む）、汗、腹水、鼻水、涙、膣液、乳、精液等が含まれる。好ましくは血液又は尿である。ここでいう「血液」とは、全血、血漿及び血清を含む。全血は、静脈血、動脈血又は臍帯血を問わない。体液は、同一個体から得られる異なる二以上の組合せであってもよい。本発明の膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法は、侵襲性の低い血液や尿からも検出可能であることから、簡便な検出法として非常に有用である。
　「被験体由来の体液」とは、被験体から既に採取されている体液をいい、体液を採取する行為自体は、本発明の態様には包含されない。被験体由来の体液は、被験体から採取されたものを直ちに本発明の方法に供してもよいし、採取後、直接、又は適当な処理を施した後に冷蔵又は凍結したものを本発明の方法に供する前に室温に戻して、使用してもよい。冷蔵又は凍結前の適当な処理としては、例えば、全血にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後、又は血漿若しくは血清として分離すること等が含まれる。これらの処理は、当該分野で公知の技術に基づいて行なえばよい。
　本明細書において「本発明の癌検出用マーカーの量」とは、被験体由来の体液中に存在するＣＯＴＬ１タンパク質等の分量をいう。この分量は、絶対量又は相対量のいずれであってもよい。絶対量の場合、所定の体液量中に含まれる癌検出用マーカーの質量又は容量が該当する。相対量の場合、特定の測定値に対する被験体由来の癌検出用マーカーの測定値によって表わされる相対的な値をいう。例えば、濃度、蛍光強度、吸光度等が挙げられる。
　癌検出用マーカーの量は、インビトロで公知の方法を用いて測定することができる。例えば、前記タンパク質等と特異的に結合可能な物質を用いて測定する方法が挙げられる。
　本明細書において「特異的に結合可能」とは、ある物質が、本発明の標的である癌検出用マーカー、すなわち、ＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片とのみ実質的に複合体を形成することを意味する。ここで、「実質的に」とは、非特異的な結合以外の結合を意味する。
　「特異的に結合可能な物質」としては、例えば、ＣＯＴＬ１結合タンパク質が挙げられる。より具体的には、例えば、ＣＯＴＬ１タンパク質を抗原とし、その抗原に含まれるエピトープを認識して結合する「抗ＣＯＴＬ１抗体」、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識し結合する抗体、又はＣＯＴＬ１タンパク質の変異体を抗原とし、それを認識して結合する「抗ＣＯＴＬ１変異体抗体」、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体を認識し結合する抗体、及び／又はそれらの抗体断片である。あるいは、それらの化学修飾誘導体であってもよい。ここで、「化学修飾誘導体」とは、前記抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体及び／又はそれらの断片のＣＯＴＬ１タンパク質等との特異的な結合活性を獲得又は保持する上で必要な機能上の修飾、又は前記抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体及び／又はそれらの断片を検出する上で必要な標識のための修飾のいずれをも含む。
　機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、脱グリコシル化、ＰＥＧ化が挙げられる。
　標識上の修飾には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン、アビジン、ストレプトアビジンによる標識が挙げられる。
　抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。特異的検出を可能にするため、好ましくはモノクローナル抗体である。ＣＯＴＬ１タンパク質等と特異的に結合する抗ＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体等（抗ＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体ポリクローナル抗体及び／又はそれらの抗体の断片に対するポリクローナル抗体を含む）又はモノクローナル抗体等（抗ＣＯＴＬ１モノクローナル抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体モノクローナル抗体及び／又はそれらの抗体の断片に対するモノクローナル抗体を含む）は、後述する方法によって作製することができる。その他、抗ヒトＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｒｏｕｐ社等より市販されており、それを利用することもできる。本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。
　抗体断片は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片及び誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば、合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体等が含まれる。
　本発明の抗ＣＯＴＬ１タンパク質抗体等は、前記タンパク質の少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸からなる１若しくは数個のエピトープに対する抗体である。
（Ａ）抗ＣＯＴＬ１抗体の作製
　以下、本発明で使用する抗ＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体等及びモノクローナル抗体等の作製方法について具体的に説明をする。
　（Ａ－１）免疫原の調製
　本発明において抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）としてのＣＯＴＬ１タンパク質（以下、「免疫原ＣＯＴＬ１タンパク質」とする）等を調製する。本発明において免疫原として使用可能なＣＯＴＬ１タンパク質は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＯＴＬ１タンパク質若しくはその変異体又はそれらの断片、あるいはそれらと他のペプチド（例えば、シグナルペプチド、標識ペプチド等）との融合ポリペプチドが挙げられる。免疫原ＣＯＴＬ１タンパク質は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば、固相ペプチド合成法等により合成することができる。免疫原ＣＯＴＬ１タンパク質断片を使用する場合は、ＫＬＨ、ＢＳＡ等のキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。
　また、免疫原ＣＯＴＬ１タンパク質等は、公知のＤＮＡ組換え技術を利用して得ることもできる。ＣＯＴＬ１タンパク質等をコードするｃＤＮＡは、当該分野で公知のｃＤＮＡクローニング法によって作製すればよい。免疫原ＣＯＴＬ１遺伝子等を発現する上皮細胞等の生体組織からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、それをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニング等のスクリーニング法によって目的のｃＤＮＡクローンを得ることができる。必要に応じてｃＤＮＡクローンをさらにＰＣＲ法によって増幅してもよい。これによって目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを得ることができる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及び Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２～７．４５、第２巻８．９～８．１７に記載されている。
　続いて、上記の方法等で得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換された又は該ベクターをトランスフェクションした原核又は真核宿主細胞を培養することによって、目的のＣＯＴＬ１タンパク質等を該細胞から得ることができる。また、目的のタンパク質等をコードするＤＮＡの５’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができ、その結果、目的のタンパク質等を培養上清中から得ることが可能となる。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＣ１１８、ｐＣ１１９、ｐＣ１８、ｐＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λ ｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。クローニングベクター及び発現ベクターは、Ｍｅｒｃｋ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ＧＥ　ヘルスケア社等の各メーカーで市販されており、それらを利用することもできる。
　発現ベクターにＣＯＴＬ１タンパク質等のｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等を採用することができる。ベクターには、該タンパク質をコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー等を含んでいてもよい。またＣＯＴＬ１タンパク質等の単離、精製を容易にするためにＣＯＴＬ１タンパク質等のＣ末端又はＮ末端に標識ペプチドをつけた融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該タンパク質を調製してもよい。代表的な標識ペプチドには、６～１０残基のヒスチジンリピートタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃペプチドタグ、ＧＦＰタンパク質等が挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。ＤＮＡ組換え技術の詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．（上記）に記載されており、それに準じて行えばよい。
　宿主細胞としては、細菌等の原核細胞（例えば、エシェリヒア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の大腸菌、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の枯草菌）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ細胞、Ｓ２細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）等を用いることができる。宿主細胞への組換えベクターの導入方法は、それぞれの宿主へＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。細菌に該ベクターを導入する方法であれば、例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．（上記）を参照されたい。また、動物細胞に該ベクターを導入する方法であれば、例えば、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ １９８９, Ｖｏｌ.８６, ６０７７；ＰＮＡＳ １９８７, Ｖｏｌ.８４, ７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３, Ｖｏｌ.５２, ４５６－４６７）、リポソームを用いる方法、ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
　大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下、３７℃で６～２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０）に添加してもよい。哺乳類細胞等の形質転換体を培養する場合においても、それぞれの細胞に適した培地中で培養する。このとき培地には血清を含んでもよく、含まなくてもよいが、無血清培地での培養がより望ましい。ＣＯＴＬ１タンパク質等が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕し、当該分野で公知の方法によってタンパク質を抽出すればよい。また、ＣＯＴＬ１タンパク質等が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去した後に上清を使用すればよい。
　標識ペプチドを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、その精製法として、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を用いればよい。またこれに加えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等を組み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピートタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＧＦＰといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を採用することができる。ＣＯＴＬ１タンパク質等が得られたか否かは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
　（Ａ－２）抗体の作製
　上記方法によって得られたＣＯＴＬ１タンパク質等を抗原としてＣＯＴＬ１タンパク質等を特異的に認識する抗体を得ることができる。
　より具体的には、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質変異体、融合タンパク質等に含まれるエピトープ（抗原決定基）に対して抗体を形成させる。エピトープは、一次構造（アミノ酸配列）に基づくものであってもよいし、二次構造や立体構造などの高次構造（断続的）に基づくものであってもよい。なお、該抗原決定基又はエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。
　本発明のＣＯＴＬ１タンパク質等によってあらゆる態様の抗体が誘導され得る。具体的には、該タンパク質の全部若しくは一部又はエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。抗体調製方法は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： 　Ａ　Ｎｅｗ 　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８０を参照すればよい。
　（Ａ－２－１）ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製するために、まず、得られたＣＯＴＬ１タンパク質等を緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。
　次に、前記調製した免疫原溶液を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原溶液の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０～２００μｇの免疫原を含んでいればよい。免疫原溶液の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１～４週間間隔で、２～１０回、好ましくは３～４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原溶液を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。免疫後は、血液からＣＯＴＬ１タンパク質等に対するポリクローナル抗体が回収できる。モノクローナル抗体が必要な場合には、後述の抗ＣＯＴＬ１抗体産生ハイブリドーマを作製すればよい。
　（Ａ－２－２）モノクローナル抗体の作製
（ハイブリドーマの作製）
　ＣＯＴＬ１タンパク質等を特異的に認識する抗ＣＯＴＬ１モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、慣用的技術によって作製することが可能である。以下、抗ＣＯＴＬ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの具体的作製方法を例を挙げて説明する。
ａ．免疫動物からの抗体産生細胞の回収
　まず、適当な動物を本発明のタンパク質で免疫する。免疫方法については、前記「ポリクローナル抗体の作製」の項に記載の方法に準じて行えばよい。続いて、免疫された動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。これらの細胞は、ＣＯＴＬ１タンパク質等で免疫した動物から摘出又は採取したものを用いればよい。動物に免疫する方法は、前記「ポリクローナル抗体の作製」の項に準ずる。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫（ミエローマ）細胞株としては、マウス等の動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３－Ａｇ.８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３‐Ａｇ.８.Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１‐Ａｇ４‐１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳｐ２／０‐Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）等が挙げられる。
ｂ．細胞融合
　次に、調製した抗体産生細胞と骨髄腫細胞株と融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１～ ２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行えばよい。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００～４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０～８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ, １９７７, Ｖｏｌ.２６６, ５５０‐５５２）。
ｃ．ハイブリドーマの選別及びクローニング
　最後に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ＣＯＴＬ１抗体産生ハイブリドーマを選別する。まず、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地等で適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウエル程度でまき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して、２０～４０℃ 、好ましくは約３７℃で培養を行う。ここで、ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマを生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
　本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に由来するＣＯＴＬ１タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
（Ａ－３）抗体の回収
　モノクローナル抗体は、当該分野で公知の慣用的技術によって回収可能である。例えば、樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法には、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２～１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水又は血清を採取する。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
　本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体の可変領域を有するヒト抗体）や、ヒト化抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを有するヒト抗体）が含まれる。また本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な多価抗体（例えば、ダイアボディ）、抗体断片及び誘導体もまた提供される。本発明の抗体は、インビトロ及びインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチド又はその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質又はタンパク質断片を精製することにも使用することができる。
　アッセイにおける特異的検出を可能にするためには、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
（Ｂ）抗ＣＯＴＬ１抗体等を用いた本発明の癌検出用マーカーのインビトロ測定
　前記（Ａ）で作製した抗ＣＯＴＬ１抗体等を用いた被験者由来の体液中に存在する本発明の癌検出用マーカー、すなわち、ＣＯＴＬ１タンパク質等の量をインビトロで測定する方法（免疫学的測定法）としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法が挙げられる。
　本発明の癌検出用マーカー測定方法を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、前記抗ＣＯＴＬ１抗体等を固相化するか、又は試料中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応を行うことが好ましい。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。固相化は、固相担体と前記抗ＣＯＴＬ１抗体等又は試料成分とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
　本発明においては、前記抗ＣＯＴＬ１抗体等と、体液中の膵癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は前立腺癌細胞に由来する本発明の癌検出用マーカーとの反応を容易に検出するために、前記抗ＣＯＴＬ１抗体等を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の癌検査方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（例えば、サンドイッチ法等）を利用することが好ましい。
　標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミダーゼ又はビオチン－アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ等を、そして放射免疫測定法の場合にはトリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を、また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ－、ＦＭＮＨ２－、ルシフェラーゼ系、ルミノール－過酸化水素－ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
　標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。測定の操作法は、公知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．）に従えばよい。
　例えば、前記抗ＣＯＴＬ１抗体等を直接標識した場合には、体液中の成分を固相化し、標識した前記抗ＣＯＴＬ１抗体等と接触させて、本発明の癌検出用マーカー（ＣＯＴＬ１タンパク質等）－抗ＣＯＴＬ１抗体等の複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量に基づいて体液中の癌検出用マーカー（ＣＯＴＬ１タンパク質等）の量を測定することができる。
　また、例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体を一次抗体として試料と反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を一次抗体に反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化した本発明の癌検出用マーカー－抗ＣＯＴＬ１抗体等－標識二次抗体の複合体が、又は固相化した抗ＣＯＴＬ１抗体等－本発明の癌検出用マーカー－標識二次抗体の複合体が形成される。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量より試料中の癌検出用マーカーの質量を測定することができる。
　具体的には、酵素免疫測定法の場合は、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定すればよい。この場合、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定すればよい。
　また、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る方法により実施することもできる。この場合、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、さらに、ポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反応系に含ませてもよい。
　本発明の検出法の好ましい実施形態の一例を示す。最初に、本発明の抗体を一次抗体として不溶性担体に固定する。抗原が吸着していない固相表面を、抗原とは無関係のタンパク質（仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン等）によりブロッキングするのが好ましい。続いて、固定化された一次抗体と被検試料とを接触させる。次いで、上記一次抗体と異なる部位で本発明の癌検出用マーカーと反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からの信号を検出する。ここで用いる「一次抗体と異なる部位で癌検出用マーカーと反応する二次抗体」は、一次抗体と癌検出用マーカー（ＣＯＴＬ１タンパク質等）との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はない。免疫原の種類を問わず、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ等）を用いることもできる。さらに、二次抗体として複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。
　また、これとは逆に、本発明の抗体に標識を付して二次抗体とし、本発明の抗体と異なる部位で、癌検出用マーカーと反応する抗体を一次抗体として不溶性担体に固定し、この固定化された一次抗体と被検試料とを接触させ、次いで、二次抗体として標識を付した本発明の抗体とを接触させ、前記標識からの信号を検出してもよい。
　さらに、本発明の抗体は、上述したように、膵癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は前立腺癌細胞に由来する癌検出用マーカーと特異的に反応するため、癌の検出薬として用いることができる。本発明の検出薬は、本発明の抗体を含む。本発明の検出薬を用いて、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患が疑われる個体から採取した試料中に含まれる前記癌検出用マーカーを検出することによって、その個体の膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患の有無を検出することができる。
　また、本発明の検出薬は、免疫学的測定を行うための手段であればいずれの手段においても利用することができるが、当技術分野で公知の免疫クロマト用テストストリップ等の手段と組み合わせて用いることによって、さらに簡便かつ迅速に癌を検出することができる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、本発明の検出薬を含有する試薬部、試料と検出薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部等から構成されるものであり、妊娠診断薬と同様の形態とすることができる。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は、試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の膵癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は前立腺癌細胞由来の癌検出用マーカーと抗ＣＯＴＬ１抗体等との反応が起こり、反応した複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が起こって、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性をほとんど与えないため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。このテストストリップは、例えば、特開平１０－５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できる。また、本発明の検出薬と、既知の膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の腫瘍マーカーに対する検出薬とを組み合わせて使用することにより、さらに信頼性の高い診断が可能になる。
（２）罹患決定工程
　「罹患決定工程」とは、前記癌検出用マーカー測定工程で測定されたタンパク質の量に基づいて膵癌、乳癌、肺癌または前立腺癌の罹患の有無を決定する工程である。測定された癌検出用マーカー、すなわち、ＣＯＴＬ１タンパク質等質量に基づいて膵癌、乳癌、肺癌または前立腺癌の罹患の有無を決定する。決定方法の一例として、例えば、被験体の癌検出用マーカーの量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に多いときに膵癌、乳癌、肺癌または前立腺癌に罹患していると決定する方法が挙げられる。
　「膵癌」又は「膵臓癌」とは、膵臓組織に発生する悪性腫瘍をさす。膵癌は、発生する組織に応じて病理学的に、浸潤性膵管癌、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)などに分類されるが、特にこれらに限定されない。
　「乳癌」とは、乳房組織に発生する悪性腫瘍をさす。乳癌は病理学的に浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、粘液癌、管状癌、浸潤性微小乳頭癌、化生癌などに分類されるが、特にこれらに限定されない。
　「肺癌」とは、肺に発生する、上皮細胞由来の悪性腫瘍をさす。肺癌は病理学的に、小細胞癌と非小細胞癌に分類され、非小細胞癌はさらに肺扁平上皮癌、肺腺癌、細気管支肺胞上皮癌などに分類されるが、特にこれらに限定されない。
　「前立腺癌」とは、前立腺に発生する悪性腫瘍をさす。大部分の前立腺癌は病理学的な組織型として腺癌に分類されるが、特にこれに限定されない。
　「健常体」とは、少なくとも膵癌、乳癌、肺癌または前立腺癌に罹患していない個体、好ましくは健康な個体をいう。さらに、健常体は、被験体と同一の生物種であることを要する。例えば、検査に供する被験体がヒト（被験者）の場合には、健常体もヒト（本明細書では、特に「健常者」とする）でなければばらない。健常体の身体的条件は、被験体と同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、身長、体重等が該当する。
　「統計学的に有意」とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合が挙げられる。それ故、「統計学的に有意に多い」とは、被験体と健常体のそれぞれから得られた癌検出用マーカーの量的差異を統計学的に処理したときに両者間に有意差があり、かつ被験体の前記タンパク質量が健常体のそれと比較して多いことをいう。通常、体液中の癌検出用マーカーの量に関して、被験体が健常体の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上多い場合が該当する。本発明では、量的差異が３倍以上であれば信頼度は高く、統計学的にも有意に多いといえる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
　健常体の体液中における癌検出用マーカーの量は、前記工程で説明をした被験体の体液中における癌検出用マーカーの量の測定方法と同様の方法で測定することが好ましい。健常体の体液中における癌検出用マーカーの量は、被験体の体液中における癌検出用マーカーの量を測定する都度、測定することもできるが、予め測定しておいた癌検出用マーカーの量を利用することもできる。特に、健常体の様々な身体的条件における癌検出用マーカー質量を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被験体の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被験体との比較に最適な身体的条件を有する健常体の癌検出用マーカーの量を即座に利用できるので便利である。
　被験体の体液中の癌検出用マーカーの量が健常体の体液中の癌検出用マーカーの量よりも統計学的に有意に多い場合、その被験体は膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患していると決定する。本発明において対象となる膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の病期は、特に限定はなく、早期癌から末期癌に及ぶ。
　このように、本発明の膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検査方法によれば、体液試料中の癌検出用マーカーを、抗体を用いて免疫学的に測定することを含む。本発明の方法によって、被験体が膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患しているか否かを判定することができるだけでなく、膵癌患者と非膵癌患者の識別、乳癌患者と非乳癌患者の識別、肺癌患者と非肺癌患者の識別、又は前立腺癌患者と非前立腺癌患者の識別を可能にする。
３．癌診断用キット
　本発明の第三の態様は、癌診断キットである。
　「癌診断用キット」とは、癌の罹患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度を検出するために、また癌の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。
　本態様のキットは、その構成物として、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の罹患に関連して体液試料中、特に血液、好ましくは血清、血漿において発現が変動するＣＯＴＬ１タンパク質、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその変異体配列を有するタンパク質を特異的に認識し、また結合可能な物質が包含される。具体的には、例えば、抗ＣＯＴＬ１タンパク質抗体等若しくはその断片又はそれらの化学修飾誘導体が含まれる。これらの抗体は、固相担体に結合されていてもよい。その他、例えば、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのＣＯＴＬ１タンパク質、使用説明書等を含んでいてもよい。
　本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
＜参考例：中空糸フィルターの作製＞
　分画原料の血清又は血漿を分画・濃縮するための中空糸フィルターを作製した。１つの中空フィルターは、３本のモジュールＡと１本モジュールＢをタンデムに連結して構成されている。ここで、モジュールＡは、分画分子量約５万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を１００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定して作製されたミニモジュールである。モジュールＡは、血清又は血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は、約７ｍｍ、長さは、約１７ｃｍである。また、モジュールＢは、分画分子量約３千の孔径の膜を用いて作製された低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュールである。各モジュールは、片端に中空糸内腔に連結する入口を、また他端に出口を備えており、当該入口と出口は、シリコンチューブによって連結され、閉鎖循環系流路を形成している。各モジュールは、この流路内を液体がペリスタポンプによって駆動され、循環するように構成されており、それぞれのモジュールは、流路途中に備えられたＴ字コネクターによって、上記のようにタンデムに連結されている。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出した液体を排出するポートを備えている。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄した後、ＰＢＳ（０．１５ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）水溶液を充填した。中空糸フィルターの流路入口から注入された分画原料の血清又は血漿は、３本のモジュールＡを通過する毎に分子篩によって分子量約５万で分画され、モジュールＢで約３千の低分子成分が濃縮された後、流路出口から排出されるように構成されている。
＜実施例１＞
（１）健常者及び乳癌患者血液中のタンパク質同定
　インフォームドコンセントを得た乳癌患者１７名から得た血清の混合液及び同年代の健常者３０名から得た血清の混合液をそれぞれ調製した。各混合液をポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。この血清をさらに２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）１２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、参考例に示した中空糸フィルターを用いて分子量に基づいた分画を行った。分画後の血清サンプル（全量１．８ｍＬ、最大２５０μｇのタンパク質を含む）を凍結乾燥した後、１００μＬの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に再溶解した。このサンプルについて、総タンパク質の５０分の１量のトリプシンで３７℃、２～３時間の条件でペプチド消化を行い、脱塩カラム（Ｗａｔｅｒｓ社）による脱塩処理を行った後、さらにイオン交換カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）によって８分画化した。その各々の分画を、逆相カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Ｑ－ＴＯＦ　Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）を用いて、３回測定した。その測定データを、解析ソフトウェアであるＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンス社）によって解析し、それぞれのサンプルに含まれるタンパク質を同定した。そのタンパク質同定の際に、同時に各タンパク質について存在信頼性のスコアが算出されるが、そのスコアを健常者（健常１～健常３）と乳癌患者間で比較し、同定されたタンパク質のうち、乳癌患者（乳癌１～乳癌３）のサンプル測定の３回のスコア平均が、健常者サンプルの平均と比べ、有意に高いタンパク質としてＣＯＴＬ１タンパク質を見いだした（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）ウェスタンブロット法による乳癌患者混合血液中のＣＯＴＬ１タンパク質の検出
　乳癌患者１７名から得た血清の混合液及び健常者３０名から得た血清の混合液をそれぞれ調製した。各サンプル１００μＬに対し、１００μＬのアフィゲルブルー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎＡ－セファロース（ＧＥヘルスケア）を加え、４℃で一晩反応させ、サンプル中のアルブミン及びイムノグロブリンを除去した。得られたサンプルをＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、１mＭ　ＤＴＴ、５％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール）で可溶化及び沸騰処理を行い、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル（１６％）電気泳動にかけた後、タンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。これをウサギ抗ＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ社）、さらにペルオキシダーゼ標識２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）と反応させた。免疫反応するタンパク質をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてX線フィルムに感光させ可視化した。
　結果を図１に示す。乳癌患者では、健常者と比べて高値の血清中ＣＯＴＬ１タンパク質濃度が検出された。
（３）ＥＬＩＳＡ法による各乳癌患者血液中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度の測定
　乳癌患者８名（乳癌１～乳癌８）及び健常者４名（健常１～健常４）より血清サンプルを得た。各サンプル３３μＬ中のＣＯＴＬ１タンパク質の濃度を、Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｕｓｃｎ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の方法は、キットに添付のマニュアル法に従った。
　結果を図２に示す。この図は、各人から得られたＣＯＴＬ１の濃度の相対値を示している。血清中のＣＯＴＬ１濃度は、全ての乳癌患者において、健常者より有意に高い値を示した。
　上記（１）、（２）及び（３）の結果から、本発明は、乳癌の検出において有用であることが立証された。
＜実施例２＞
（１）ウェスタンブロット法による膵癌患者混合血液中のＣＯＴＬ１タンパク質の検出
　膵癌患者４名から得た血清の混合液及び健常者３０名から得た血清の混合液をそれぞれ調製した。各サンプル１００μＬに対し、１００μＬのアフィゲルブルー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎＡ－セファロース（ＧＥヘルスケア）を加え、４℃で一晩反応させ、サンプル中のアルブミン及びイムノグロブリンを除去した。得られたサンプルをＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、１mＭ　ＤＴＴ、５％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール）で可溶化及び沸騰処理を行い、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル（１６％）電気泳動にかけた後、タンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。これをウサギ抗ＣＯＴＬ１ポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ社）、さらにペルオキシダーゼ標識２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）と反応させた。免疫反応するタンパク質をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてX線フィルムに感光させ可視化した。
　結果を図３に示す。膵癌患者では、健常者と比べて高値の血清中ＣＯＴＬ１タンパク質濃度が検出された。
（２）ＥＬＩＳＡ法による各膵癌患者血液中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度の測定
　膵癌患者３名（膵癌１～膵癌３）及び健常者４名（健常１～健常４）より血清サンプルを得た。各サンプル３３μＬ中のＣＯＴＬ１タンパク質の濃度を、Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｕｓｃｎ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の方法は、キットに添付のマニュアルに従った。
　結果を図４に示す。この図は、各人から得られたＣＯＴＬ１の濃度の相対値を示している。血清中のＣＯＴＬ１濃度は、全ての膵癌患者において、健常者より有意に高い値を示した。
　上記（１）及び（２）の結果から、本発明は、膵癌の検出において有用であることが立証された。
＜実施例３：ＥＬＩＳＡ法による各肺癌患者血液中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度の測定＞
　肺癌患者４名（肺癌１～肺癌４）及び健常者４名（健常１～健常４）より血清サンプルを得た。各サンプル３３μＬ中のＣＯＴＬ１タンパク質の濃度を、Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｕｓｃｎ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の方法は、キットに添付のマニュアルに従った。
　結果を図５に示す。この図は、各人から得られたＣＯＴＬ１の濃度の相対値を示している。血清中のＣＯＴＬ１濃度は、全ての肺癌患者において、健常者より有意に高い値を示した。
　以上の結果から、本発明は、肺癌の検出において有用であることが立証された。
＜実施例４：ＥＬＩＳＡ法による各前立腺癌患者血液中のＣＯＴＬ１タンパク質濃度の測定＞
　前立腺癌患者６名（前立腺癌１～前立腺癌６）及び健常者４名（健常１～健常４）より血清サンプルを得た。各サンプル３３μＬ中のＣＯＴＬ１タンパク質の濃度を、Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｕｓｃｎ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の方法は、キットに添付マニュアルに従った。
　結果を図６に示す。この図は、得られたＣＯＴＬ１の濃度の相対値を示している。血清中のＣＯＴＬ１濃度は、全ての前立腺癌患者において、健常者より有意に高い値を示した。
　以上の結果から、本発明は、前立腺癌の検出において有用であることが立証された。
　本発明により、簡便かつ安価な方法で、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を高い信頼性で、効率的、かつ効果的に検出することができるため、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を非侵襲的に検出できるため、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　被験体由来の体液中に存在するＣＯＴＬ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片からなる癌検出用マーカーの量をインビトロで測定し、その量に基づいて、被験体における膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌への罹患の有無を評価することを含む、癌の検査方法。
  2. 　前記ＣＯＴＬ１タンパク質が配列番号１に示されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 　被験体の前記癌検出用マーカーの量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に多いときに膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌に罹患していると決定する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記統計学的に有意に多い量が健常体の２倍以上である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記測定が前記癌検出用マーカーと特異的に結合可能な物質を用いる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記結合可能な物質が抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体及び／又はそれらの断片である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記体液試料が血液又は尿である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　抗ＣＯＴＬ１抗体、抗ＣＯＴＬ１変異体抗体、それらの断片及び／又はそれらの化学修飾誘導体を含む、膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の診断用キット。 
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