CN100479863C - Cofilin 1与癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Cofilin 1与癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性，具体地涉及通过改变癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofi1in 1表达而提高/降低癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的方法、以及可以用于该方法中改变细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达的药剂及所述药剂的筛选方法和在制备药物试剂盒中的用途。此外，本发明还涉及用于检测和/或预后癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性的诊断方法和试剂盒。此外，本发明还涉及通过大剂量紫杉醇冲击癌细胞建立癌细胞耐药株的方法。在本发明中，所述癌症优选是卵巢癌，所述紫杉烷类化疗药物是紫杉醇。

Description

Cofilin 1与癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性

技术领域

本发明一般地涉及化疗药物耐药性领域，更具体地本发明涉及cofilin 1与紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性，涉及通过改变细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达而提高/降低癌症细胞和/或癌症患者的紫杉烷类化疗药物耐药性的方法、以及可以用于该方法中改变细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达的药剂、包含该药剂的药物组合物及所述药剂的筛选方法及用于制备改变癌症耐药性的药物的用途。此外，本发明还涉及用于检测和/或预后癌症细胞和/或癌症患者对紫杉烷类化疗药物的耐药性的方法、药剂、药物组合物及诊断方法和试剂盒、以及用于治疗癌症患者的方法。所述癌症优选是能够用紫杉烷类化疗药物治疗的癌症，更优选所述癌症是卵巢癌。

背景技术

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位，死亡率占第一位的恶性疾患。在满意的肿瘤细胞减灭术的基础上辅助紫杉烷类化疗药物+顺铂为主联合化疗的治疗策略虽然明显改善了初治卵巢癌的预后，但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15％-20％左右。紫杉烷类化疗药物作用于微管，通过防止多聚化过程而抑制微管网的正常重组，广泛用于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌等，但化疗后肿瘤原发或获得性对化疗药物广泛的交叉耐药是治疗失败的主要原因之一。目前对肿瘤耐药机制的认识已经相对深入，如MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi等已成为众所周知的耐药相关基因，而微管(微管蛋白)同型蛋白表达改变也是紫杉烷类化疗药物耐药的重要机制之一。但是究其对于临床的指导意义和应用价值却十分有限。已知的相关耐药基因在卵巢癌中的表达不能良好地预测肿瘤的耐药性和预后，有关肿瘤耐药性逆转的研究在体内也未达到理想效果。这说明尚有许多未知的耐药机制有待发现，耐药基因的表达和相应表达蛋白的功能之间可能存在差异。

蛋白质组学是1994年才提出并发展的一项新兴学科。它着眼于从生命功能的执行体-蛋白质水平研究基因的表达和功能，采用高通量，高分辨率，高效率的蛋白质分离和鉴定技术，试图从机体或细胞的整体水平上认识生物体蛋白质的表达、修饰、结构及功能，以期反映机体内代谢动态变化的过程。蛋白质组学技术用于肿瘤的生物学研究，与基因组学研究相比，其最大的优势在于，能够动态反映肿瘤发生发展各个不同时期蛋白质种类和数量变化，同时找出多个与肿瘤基因表达和功能相关的蛋白群，为探讨肿瘤发生机制，寻找肿瘤诊断和预后特异标记物提供了极大的可能。

Cofilin是Sakai等[Nishida E，et al.Biochemistry.1984；23(22)：5307-131]于1984年首先从猪脑中纯化的一种actin结合蛋白。Cofilin广泛分布在各种器官和组织中，在非肌肉组织中称为cofilin1，肌肉组织称为cofilin2。Cofilin是ADF/cofilin家族中最重要的成员，分子量为21KD，它的主要作用是和actin肌动蛋白单体结合，促进actin的解聚，是actin循环重要的调控因子。由于actin在细胞分裂(胞质分裂)和细胞运动中起主要作用，因此，作为actin重要调控因子的cofilin的细微变化可以引起actin重组和功能改变，从而导致相关疾病发生。研究发现ADF/cofilin的调节失控与阿尔茨海默病，肾病，肌肉萎缩变性有明确相关性[Bamburg JR，et al.Tends CellBio.2002；12：598-605]。2000年以后，学者们发现Cofilin与肿瘤细胞的活力，渗透力和转移能力的改变有直接相关性[WangW，et al.J CeliBiol.2006 May 8；173(3)：395-404]。目前认为cofilin可能在以下三方面[Pawlak G，et al.J.Biol.Chem.2002；277：26927 26933；Ichetovkin I，et al.Curr.Biol.2002；12：79 84；Abe H，et al.J.CeliBiol.1996；132：871 885]对肿瘤细胞起着重要的调控作用：1)细胞转化的启动，减少对粘附生长的依赖；2)细胞转移中细胞动力增强；3)细胞分裂。在卵巢癌和神经肿瘤细胞和组织中均检测到了cofilin的上调[Martoglio AM，et al.Mol。Med.2000；6：750 765]。因此阻断cofilin将可能成为抑制恶性肿瘤生长和蔓延新的靶点。但是，cofilin与肿瘤细胞化疗耐药的相关性目前尚无研究报道。

本研究在认识肿瘤耐药相关基因的基础上，应用比较蛋白质组学技术，首次发现磷酸化cofilinl的表达上调为本研究的所有耐紫杉烷类化疗药物的癌细胞株所共有，并通过基因转染技术在细胞中验证了cofilin表达上调与紫杉烷类化疗药物的耐药性的明确相关性。同时，并在临床卵巢癌标本中验证了磷酸化cofilin在耐药卵巢癌组织中表达上调。

发明简述

因此，本发明一方面涉及调节癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的方法，包括改变癌症细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达，其中所述癌症优选是卵巢癌，其中所述紫杉烷类化疗药物优选是紫杉醇(Taxol)。本发明该方面的方法可以在体外作用于癌细胞；或者可以在体内施用于癌症患者。

在此方面的一个实施方案中，通过提高癌症细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达而提高癌症对紫杉烷类化疗药物的耐受性。

在再一实施方案中，通过在癌症细胞中表达cofilin 1基因而提高细胞中的cofilin 1表达，再优选地其中通过使用表达cofilin 1基因的正义质粒来提高所述细胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量。

在再一实施方案中，其中通过增加癌症细胞中的磷酸化cofilin 1而提高癌症对紫杉烷类化疗药物的耐受性。

在此方面的另一实施方案中，通过减少和/或抑制癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达而降低癌症对紫杉烷类化疗药物的耐受性。

在再一实施方案中，其中通过在癌细胞中表达cofilin 1的反义核苷酸而下调和/或抑制细胞中的cofilin 1表达，再优选地其中通过使用表达反义cofilin 1的反义质粒来降低细胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量。

在再一实施方案中，其中通过减少癌细胞中的磷酸化cofilin 1而降低癌症对紫杉烷类化疗药物的耐受性。

本发明另一方面涉及通过前述方法改变了对紫杉烷类化疗药物的耐受性的癌症细胞，优选地卵巢癌细胞。所述癌细胞可以例如用于筛选或鉴定与癌症的紫杉烷类化疗药物耐受性有关的其它基因。

本发明该方面的一个实施方案中，所述癌细胞包含表达正义cofilin1或反义cofilin 1的表达载体，优选地，所述载体是质粒。

本发明另一方面涉及一种治疗癌症患者的方法，包括步骤：a)通过本发明调节cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达的方法降低癌症患者对紫杉烷类化疗药物的耐受性；和b)向所述患者施用紫杉烷类化疗药物，任选地，在步骤(a)前检测癌症患者的紫杉烷类化疗药物的耐受性以确定耐药性患者。优选地，所述癌症是卵巢癌。

本发明另一方面涉及能够改变癌症细胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达的药剂在制备用于改变癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的药物中的用途。

在所述用途中，一个实施方案中，所述药剂能够降低癌症细胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表达，由此降低癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性。在本发明该方面的优选实施方案中，所述药剂是反义核苷酸、核酶，优选反义核苷酸。本发明反义核苷酸包含能够特异结合cofilin 1多核苷酸序列或其互补序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，更优选地所述反义核苷酸含有与cofinlin多核苷酸的一或多个部分互补、更优选地基本上互补、甚至更优选地完全互补的序列区域，更优选地，所述反义核苷酸包含与全长cofilin 1多核苷酸完全互补的DNA序列。本发明反义核苷酸优选是DNA或者RNA或者其衍生物，最优选地，所述反义核苷酸是反义质粒。根据本发明的核酶是能够特异切割cofilin1 mRNA的核酶。优选地，所述核酶具有与一或多个cofilin1RNA区域互补的特异底物结合位点，并且它在该底物结合位点中或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。根据本发明的核酶可以是锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型内含子型核酶或RNaseP RNA型核酶或链孢霉属VS RNA型核酶。

本发明此方面的另一实施方案中，所述药剂能够提高癌细胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表达，而所述药物用于提高癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性，其中所述药剂优选是表达cofilin1的DNA构建体。

本发明再一方面涉及一种筛选能够改变癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性的药剂的方法，其中所述癌症优选卵巢癌，所述方法包括步骤：提供候选药剂；使所述候选药剂与癌症细胞接触；检测所述癌症细胞中的cofilin1/磷酸化cofilin 1的表达；将所检测到的表达量与预定阈值比较。在本发明该方法中，优选地，所述癌症细胞是紫杉烷类化疗药物耐药细胞，所述方法用于筛选降低耐药性的药剂；或者优选地，所述癌症细胞是紫杉烷类化疗药物敏感细胞，所述方法用于筛选提高耐药性的药剂。根据本发明的筛选方法，所述预定阈值优选是所述癌症细胞在接触候选药剂之前测定的细胞内cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达量。

本发明也涉及通过前述筛选方法获得的能够改变癌症细胞对紫杉烷类化疗药物的耐药性的药剂，包含所述药剂的组合物、以及所述筛选出的药剂在制备用于改变癌症细胞/癌症患者对紫杉烷类化疗药物的耐受性的药物中的用途。

本发明又一方面涉及一种检测癌症细胞对紫杉烷类化疗药物的耐药性的方法，包括检测癌症细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表达，和将所得表达量与预定阈值进行比较，由此指示癌症细胞对紫杉烷类化疗药物的耐药性，其中优选地检测磷酸化cofinlin的表达量。在该方面的一个实施方案中，所述预定阈值为紫杉烷类化疗药物敏感的癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1含量。

本发明又一方面涉及能够检测癌症细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达量的药剂在制备用于检测癌症细胞的紫杉烷类化疗药物耐受性的检测试剂盒中的用途。一个实施方案中，所述药剂为cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质的抗体，优选单克隆抗体。再优选地，其中所述药剂检测细胞中cofilin 1基因的mRNA水平表达量，所述药剂优选是杂交探针或是特异于cofilin 1基因的引物。

本发明又一方面涉及一种预测或预后紫杉烷类化疗药物在癌症患者中的治疗效果的方法，包括检测癌症患者的肿瘤组织中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表达量，和将所得的量与预定阈值进行比较，由此获得所述患者对紫杉烷类化疗药物的耐药性。

在本发明此方面的一个实施方案中，所述预定阈值为来自对紫杉烷类化疗药物敏感的癌患者的癌细胞的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的含量。

本发明再一方面涉及治疗癌症患者的方法，所述方法包括：根据前述本发明的预测或预后方法确定患者的紫杉烷类化疗药物耐药性，调整患者的紫杉烷类化疗药物给药方案。所述调整包括替换紫杉烷类化疗药物、加大或减少紫杉烷类化疗药物的给药频率和/或给药量，等。

在本发明上下文中，根据本发明的对cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表达量的检测发生在cofilin1的mRNA水平或蛋白质水平上，或者通过检测磷酸化cofilin1的蛋白质水平来实现，优选地检测磷酸化cofilin1的蛋白质水平。在mRNA水平的检测，优选地采用Northern印迹或PCR方法来实现。在蛋白质水平上的检测，优选地采用特异地结合cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的抗体或寡核苷酸适配体来实现。

本发明又一方面涉及能够检测癌症细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1含量的药剂在制备用于预测或预后紫杉烷类化疗药物对癌症的治疗效果的诊断试剂盒中的用途。优选地，所述药剂为cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质的抗体，优选单克隆抗体。再优选地，所述药剂检测细胞中cofilin 1基因的mRNA水平表达量，所述药剂优选是杂交探针或是特异于cofilin 1基因的引物。

本发明其它方面还涉及表达cofilin1蛋白质的DNA构建体和载体、cofilin1的反义核苷酸及核酶、以及cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的抗体和寡核苷酸适配体，以及包含它们之一或任何组合的药物组合物或诊断组合物，以及它们之一或任何组合在制备改变癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的药物中的用途和/或在制备诊断/预后癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的药物中的用途。

本发明最后一方面涉及一种建立紫杉烷类化疗药物耐药性癌症细胞株的方法，包括：以大剂量紫杉烷类化疗药物冲击来诱导癌症细胞。优选地，所述大剂量紫杉烷类化疗药物为2μM至2.5μM。再优选地，所述方法还包括在耐药细胞形成后每隔数周用所述大剂量的紫杉烷类化疗药物冲击一次，其中优选地每12周冲击一次。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述癌症是能够用紫杉烷类化疗药物治疗的癌症，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌等，优选卵巢癌，在一个实施方案中，优选卵巢上皮癌，包括内膜样癌、浆乳癌、腺癌、移行细胞癌、子宫内膜癌、透明细胞癌，在另一实施方案中，优选人浆液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，特别是A2780类型卵巢癌。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述紫杉烷类(taxanes)化疗药物是具有抗癌活性的那些紫杉烷类化合物，更优选是紫杉醇(paclitaxel，Taxol)和多西他赛(docetaxel，Taxotere)，特别是紫杉醇。

附图说明

图1 Taxol小剂量浓度递增间歇诱导法示意图。

图2 Taxol大剂量冲击诱导法示意图。

图3 SKOV3，SK-TR30和SKOV3-TR2500对Taxol的剂量反应曲线

图4 光镜下SKOV3，SK-TR30和SK-TR2500光镜下细胞形态(×20，×40)。a，b，c：20×光镜下的细胞形态；d，e，f：40×光镜下的细胞形态；g，h，i：紫杉醇冲击后24h的细胞形态(×40)；a，d，g：SKOV3细胞；b，e，h：SK-TR30细胞；c，f，i：SK-TR2500细胞。

图5 SKOV3及其耐药细胞的7天对数生长曲线。SKOV3增殖速度最快，SK-TR30次之，SK-TR2500增殖速度最慢。

图6 SKOV3及耐药细胞细胞周期分布。

图7-12：电镜下SKOV3，SK-TR30和SK-TR2500细胞形态(×8000、×22000)。图7，8：SKOV3细胞形态：细胞核膜光滑、染色质呈团块聚集；图9，10，11，12：耐药细胞：细胞内外间隙增宽、在细胞表面附近出现很多囊泡样结构、它们有类似细胞膜的双层膜样结构(图9)；细胞壁皱褶、细胞核膜双层结构粗糙或中断、出现胞膜内陷形成瓶颈样改变(图11，12)；耐药细胞的线粒体体积增大、并伴有嵴的缺失(图10)。

图13 基因MDR-1、MRP-1、GST-pi、LRP-1在卵巢癌敏感细胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中的表达。1SKOV3；2 SK-TR30；3 SK-TR2500；4 A2780；5 A2780-TR

图14 5种β-微管蛋白亚型基因在卵巢癌敏感细胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中的表达。1 SKOV3；2SK-TR30；3 SK-TR2500；4 A2780；5 A2780-TR

图15 MDR-1蛋白在卵巢癌敏感细胞和紫杉醇耐药细胞中的表达。SKOV3，A2780不表达或表达量很低；SK-TR30，A2780-TR表达显著升高；SK-TR2500低表达。

图16 SKOV3细胞全蛋白双向电泳图谱(箭头所指点为差异表达蛋白质点)。

图17 SK-TR30细胞全蛋白双向电泳图谱(箭头所指点为差异表达蛋白质点)。

图18 SK-TR2500细胞全蛋白双向电泳图谱(箭头所指点为差异表达蛋白质点)。

图19 A2780细胞全蛋白双向电泳图谱(箭头所指点为差异表达蛋白质点)。

图20 A2780-TR细胞全蛋白双向电泳图谱(箭头所指点为差异表达蛋白质点)。

图21 卵巢癌紫杉醇敏感和耐药细胞中差异表达的蛋白点。

图22 69号点cofilin的肽质量指纹图谱。

图23 卵巢癌敏感细胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中总的cofilin1和磷酸化cofilin1蛋白的表达。结果：1.卵巢癌敏感和耐药细胞中蛋白cofilin1表达量相同；2.磷酸化cofilin1蛋白在卵巢癌耐药细胞中表达明显增高，以SK-TR2500细胞增高最明显。

图24 载体pcDNA3.1(+)示意图(NheI和EcoRI为酶切位点)

图25 载体pcDNA3.1(+)和cofilin cDNA经NheI和EcoRI双酶切后电泳图(电泳方向向下)。a载体pcDNA3.1(+)；1-未酶切的pcDNA3.1(+)，2-双酶切后的pcDNA3.1(+)；b cofilin cDNA；1，2，3均是酶切后的cofilin cDNA。

图26 pcDNA-cof重组载体构建过程示意图

图27 pcDNA-antisense-cof重组载体构建过程示意图

图28 pcDNA-cof重组载体经NheI和EcoRI双酶切后电泳鉴定(电泳方向向下)

泳道1，2，5-7的pcDNA-cof重组载体双酶切后得到500bp cofilincDNA，被选取测序。

图29 pcDNA-antisense-cof重组载体经BamHI和XhoI双酶切后电泳鉴定(电泳方向向下)。泳道1-6的pcDNA-cof重组载体双酶切后得到500bp cofilin cDNA，选取1，4，5质粒测序。

图30 载体pEGFP-cof分别转染A2780，SKOV3细胞，24h后在荧光显微镜下观察的转染效率。a，b：载体pEGFP-cof转染A2780细胞24后的转染效率约为60％(×40)；c，d：载体pEGFP-cof转染SKOV3细胞24后的转染效率约为20％(×20)

图31 稳定转染pcDNA-cof的SKOV3、A2780和稳定转染pcDNA-antisense-cof的SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR细胞克隆的Western Blot鉴定结果。P-原代细胞；C-转染pcDNA3.1(+)的对照细胞(即，转染空载体的原代细胞)；S-转染pcDNA-cof的SKOV3；A-转染pcDNA-antisense-cof的SK-TR2500；T-转染pcDNA-antisense-cof的A2780-TR

图32 cofilin1免疫组化染色结果。A cofilin1染色阴性；B cofilin1染色阳性，阳性部分为细胞浆

图33 磷酸化cofilin1免疫组化染色结果。A磷酸化cofilin1染色阴性；B磷酸化cofilin1染色阳性，阳性部分为细胞浆；C磷酸化cofilin1染色阳性，阳性部分为细胞核。

发明详述

本申请的发明人利用蛋白质组学首次确立了cofilin1与癌症，尤其是卵巢癌的紫杉醇化疗药物耐受性相关。因此，本说明书就以下几个方面对本发明作进一步详细阐述。

Cofilin1蛋白及其编码核苷酸

本发明所指的cofilin1或cofilin1蛋白质包括cofilin1的同源物、等位变体、功能等同物，特别是保守变体，优选指人cofilin1蛋白质。cofilin1蛋白质保守变体包括与本文公开的cofilin1蛋白质相比具有一个或者多个(例如1-20个，1-10个，1-5个)氨基酸的插入、缺失、和/或添加的蛋白质。在本发明中，“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，可以表示任何长度的多肽。

本领域技术人员将明了，多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一形式与DNA分子对应的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。

多核苷酸可以含有天然序列(即编码cofilin1蛋白质或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体、或生物学或功能等同物。多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，优选地，这些改变是保守性的或者这些改变产生的多核苷酸变体保持编码本发明蛋白质的能力。

当进行多核苷酸或多肽序列比较时，如果在按下述方法进行最大匹配比对后，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则认为这两个序列是“一致的”。

适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschu1等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschu1等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

因此，本发明包括与本文所公开序列基本一致的多核苷酸和多肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析，描述如下)时，与本发明多核苷酸或多肽序列相比含有至少50％序列一致性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些序列。本领域技术人员将明了，考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框的定位等，可以对这些值进行适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。

在其它实施方案中，本发明提供含有与本文所公开的一或多个序列一致或互补的各种长度连续序列段的分离多核苷酸和多肽。例如，本发明提供含有本文所公开的一或多个序列的至少约15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸、以及含有之间的所有居中长度的连续核苷酸的多核苷酸。易于明了的是，“居中长度”在本文中是指这些引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之间的所有整数。

本发明的多核苷酸、或其片段，无论其本身的编码序列有多长，均可以和其它DNA序列，如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点、其它的编码区段等组合，以致它们的整个长度可能出现相当大的变化。因此，预期可以采用几乎任何长度的核苷酸片段，其总长度优选被限制在易于在期望的重组DNA程序中进行操作和应用的范围内。例如，预期总长度约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有的居中长度)的示例性DNA区段在本发明的许多实施方案中是有用的。

在其它实施方案中，本发明涉及在中等严紧条件(优选高严紧条件)下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

本发明的多核苷酸和多肽可以按照本领域已知的方法制备。参见例如常见实验室手册。

表达的改变

本发明一方面涉及通过改变癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达，来调节癌症的紫杉醇类紫杉烷类化疗药物耐药性。

在此方面，所述表达的改变包括上调和/或激活表达并由此增加癌症的紫杉醇类紫杉烷类化疗药物耐药性，也包括下调和/或抑制表达，由此降低癌症的紫杉醇类紫杉烷类化疗药物的耐药性。本发明对癌症的耐药性的调节可以发生在体外施用于癌细胞上以例如获得耐药性细胞株或降低原耐药性细胞的耐药性。本发明对癌症的耐药性的调节也可以发生在体内以患有所述癌症的患者为施用对象，以改变优选降低患者的紫杉醇类紫杉烷类化疗药物耐药性。

这里所用的“表达的上调”或者“表达的激活”是指增加基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。例如，可以通过在癌细胞中表达外源cofilin1、增强癌细胞的内源cofilin1表达等方式实现。在本发明中，外源cofilin1指通过遗传工程技术引入的cofilin；而内源cofilin1指细胞中原有的cofilin1。由于磷酸化cofilin1在癌症的紫杉醇耐药性中的作用，在本发明中的一个优选实施方案中，通过调节磷酸化cofilin1的活性水平来改变癌细胞的耐药性。此外，本领域技术人员已知的任何其它能够增加目的基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平的方法也适用于本发明此方面，由此包括在本发明范围内。

这里所用的“表达的下调”或者“表达的抑制”是指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通过，例如以相对于启动子序列的有义方向(如果引起共抑制)或者反义方向添加编码序列或其部分，和通过，例如插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过基因沉默策略可以完成表达的降低。目的在于沉默基因表达的基因构建体可以有以相对于启动子序列有义和/或反义方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一个或多个部分)。另一个下调基因表达的方法包括核酶的应用。

可以通过向细胞、组织、器官或生物体施用或使之暴露于所述本发明化合物或药剂由此实现调节，包括降低活性基因产物或基因产物活性的水平。

免疫调节是具有下调活性基因产物和/或基因产物活性水平能力的另一种技术的例子，包括施用或暴露所述基因产物的抗体于其中要调节所述基因产物的水平和/或基因产物活性的细胞、组织、器官或生物体，或在这种细胞、组织、器官或生物体中表达所述基因产物的抗体。这种抗体包括单链抗体、IgG抗体及其片段。

还可以通过向细胞、组织、器官或生物体施用或使之暴露于所述基因产物或其活性的激动剂/拮抗剂实现调节，包括增强/降低活性基因产物或基因产物活性的水平。这种激动剂/拮抗剂包括按照所述本发明鉴定的蛋白质和化学化合物。

在本发明上下文中设想了cofilin1基因表达的上调/下调。本发明还包括cofilin1活性水平的上调/下调。

此外，可以考虑通过重组来使基因沉默。

“重组酶”意指位点特异性重组酶或转座酶。“重组位点”意指位点特异性重组位点或转座子边界序列。“位点特异性重组事件”意指由一般由3个元件：一对DNA序列(位点特异性重组序列或位点)和特异性酶(位点特异性重组酶)组成的系统催化的事件。位点特异性重组酶根据位点特异性重组序列的方向，仅催化两个位点特异性重组序列间的重组反应。在位点特异性重组酶存在的情况下，当位点特异性重组序列以相互相反方向定向(即，反向重复)时，间插在两个位点特异性重组位点之间的序列将倒置。如果位点特异性序列以相互相同的方向定向(即，同向重复)，那么一旦与位点特异性重组酶相互作用，任何间插序列将缺失。因此，如果位点特异性重组序列做为同向重复在整合进入真核生物基因组中的外源DNA两个末端存在，那么所述序列的这种整合随后可以被位点特异性重组序列与相应的位点特异性重组酶的相互作用所逆转。

可以利用大量不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母的FLP/FRT系统，噬菌体Mu的Gin重组酶，大肠杆菌(E.coli)的Pin重组酶，志贺氏菌属(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1质粒的R/RS系统。重组酶通常都是整合酶、解离酶或翻转酶(flippases)。而且，双特异性重组酶可以与对应双特异性重组酶的两个不同位点特异性重组位点的同向重复或不同向重复(indirect repeats)联合使用(WO99/25840)。两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1Cre/lox和酵母FLP/FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)与其各自位点特异性重组序列(分别是lox或FRT)相互作用以倒置或切除间插序列。

尽管位点特异性重组序列必须与待切除或待倒置的DNA的末端连接，但是编码位点特异性重组酶的基因可以定位在其它地方。例如，重组酶基因可以已经存在真核生物DNA中或者可以由后来引入的DNA片段提供，该DNA片段可以通过交换或通过异体授粉或直接引入细胞中。做为可替代方案，例如，可以通过显微注射或粒子轰击将基本纯化的重组酶蛋白质直接引入真核细胞。典型地，位点特异性重组酶编码区将可操作地连接调节序列，该调节序列能够使位点特异性重组酶在真核生物细胞中表达。

在实施本发明时，优选地，例如通过细胞中重组酶蛋白质的表达，该蛋白质接触遗传因子的整合位点，并促进其中重组事件，在原始整合位点完整地切除遗传因子或者可替代地留下“足迹”，通常约20个核苷酸长或更长，来诱导遗传因子运动。可以通过标准核酸杂交和/或扩增技术以检测可动遗传因子或包含其的基因构建体的存在鉴定根据本发明方法产生的这些宿主和宿主部分。做为可替代方案，在可动遗传因子已经切除的转化的宿主细胞、组织和宿主的情况下，可以用这种技术检测切除事件后留下的宿主基因组中足迹。如这里所用术语“足迹”应该理解为指这里所述可动遗传因子或含该因子的基因构建体的任何衍生物，通过先前所述基因构建体转化的细胞基因组中可动遗传因子的切除、缺失或其它去除可以产生它。通常地，足迹包含至少用于促进切除的转座子或重组位点的单拷贝。然而，足迹可以包含来源于基因构建体的其它序列，例如，如果使用，来源于左边界序列、右边界序列、复制起点、重组酶编码序列或转座酶编码序列的核苷酸序列，或其它载体来源的核苷酸序列。因此，根据所用基因构建体重组基因座或转座子的核苷酸序列，如，例如与lox位点或frt位点对应或互补的核苷酸序列，可鉴定足迹。

本发明还涉及通过使用反义技术在体外和体内抑制cofilin1。可利用反义技术通过三链螺旋形成或者通过反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，将编码本发明多肽的多核苷酸的5’编码部分用于设计长度为大约10-40碱基对的反义RNA核苷酸。设计与基因中参与转录的区域互补的DNA核苷酸(三链螺旋参阅Lee等人，Nucl.Acids Res.，6：3073，1979；Cooney等人，Science，241：456，1988；和Dervan等人，Science，251：1360，1991)，由此防止cofilin1的转录和生成。反义RNA核苷酸与mRNA在体内发生杂交，并阻断mRNA分子翻译成cofilin1蛋白(反义参与Okano，J.Neurochem.，56：560，1991；《Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression》(寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂)，CRC出版社，Boca Raton，FL，1988)。

或者，可以通过本领域的流程将上文所述核苷酸投递至细胞，使得反义RNA或DNA能够在体内表达，从而以上文所述方式抑制cofilin1的生成。

反义核苷酸

遗传信息流的最终结果是蛋白质的合成。DNA通过聚合酶转录为信使RNA，然后在核糖体上经翻译产生折叠的功能性蛋白质。因此，沿该路径有几个在其上可以实现蛋白质合成抑制的步骤。编码本文所述多肽的天然DNA区段，和所有这样的哺乳动物DNA链一样，具有通过氢键结合在一起的两条链：有义链和反义链。除了DNA中的胸苷被尿苷所替代外，编码多肽的信使RNA具有与有义DNA链相同的核苷酸序列。因此，合成的反义核苷酸序列将与mRNA结合，并抑制由该mRNA编码的蛋白质的表达。

因此，使反义核苷酸靶向mRNA是关闭蛋白质合成的一个机制，并由此成为一种有力的定向治疗方法。例如，多聚半乳糖醛酸酶和2型毒蝇碱性乙酰胆碱受体的合成受到指向它们各自mRNA序列的反义核苷酸的抑制(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829，两份文献特此完整地并入本文作为参考)。而且，采用细胞周期核蛋白、广谱抗药基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABA_A受体和人EGF(Jaskulski等，1988；Vasanthakumar和Ahmed，1989；Peris等，1998；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5，610,288，所有文献特此完整地并入本文作为参考)也显示了反义抑制的例子。

因此，在示例性实施方案中，本发明提供含有能够特异结合本文所述多核苷酸序列或其互补序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，该反义核苷酸含有DNA或其衍生物。在另一实施方案中，该核苷酸含有RNA或其衍生物。在第三个实施方案中，该核苷酸是含有硫代磷酸酯修饰的主链的修饰DNA。在第四种实施方案中，该核苷酸序列含有肽核酸或其衍生物。在所有的情况下，优选的组合物含有与本文所公开多核苷酸的一个或多个部分互补、更优选地基本上互补、甚至更优选地完全互补的序列区域。所述一个或多个部分可以是约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸、以及具有它们之间的所有居中长度的连续核苷酸。易于明了的是，“居中长度”在本文中是指这些引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之间的所有整数。因此，本领域技术人员将理解，本发明的核苷酸可以具有少至约10个、多至约1000个或者更多个核苷酸。

特异于指定基因序列的反义组合物的选择是基于对所选靶序列(例如，示例性实例中的人序列)的分析、和对二级结构、Tm、结合能、相对稳定性的测定来进行的，并且反义组合物还基于它们相对缺乏形成二聚体、发夹、或其它将降低或妨碍与宿主细胞中靶mRNA特异结合的二级结构的能力来选择。

mRNA中高度优选的靶区域是那些位于或靠近AUG翻译起始密码子的区域，和那些基本上与该mRNA的5’区域互补的序列。对这些二级结构的分析和对靶位点选择的考虑是采用第4版OLIGO引物分析软件(Rychlik，1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschu1等，1997)来实现的。

本发明人还考虑采用通过称作MPG(27个残基)的短肽载体进行的反义递送方法。MPG肽含有一个来源于HIV gp41融合序列的疏水域和一个来源于SV40T抗原细胞核定位序列的亲水域(Morris等，1997)。已经阐明，几个MPG肽分子即可包被反义核苷酸，而且它们能够在不足1小时内以相对高的效率(90％)被递送至培养的哺乳动物细胞中。而且，与MPG的相互作用极大地增加了该核苷酸对抗核酸酶的稳定性和跨越质膜的能力(Morris等，1997)。

核酶

尽管蛋白质传统上一直被用于核酸的催化反应，但另一类大分子已表现出在此方面是有用的。核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白质复合物。核酶具有特异的催化域，该催化域具有内切核酸酶活性(Kim和Cech，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，很多核酶以高度的特异性加速磷酸酯转移反应，常常仅切割寡核苷酸底物的几个磷酸酯中的一个(Cech等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。该特异性被归因于如下必要条件，即该底物在化学反应前通过特异碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合。

起初，核酶的催化反应是作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的部分被观察到的(Joyce，1989；Cech等1981)。例如，美国专利5，354，855(特此并入本文作为参考)报道，某些核酶能够起到内切核酸酶的作用，而且其序列特异性高于已知的核糖核酸酶的序列特异性，并接近于DNA限制性酶的序列特异性。因此，序列特异性核酶介导的基因表达抑制可能尤其适于治疗应用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。近来，有报道称，核酶在其所应用的某些细胞系中引发遗传改变；这些改变的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV的基因。该工作的大部分涉及到基于特异核酶切割特异突变密码子进行的靶mRNA修饰。

目前已知天然存在的酶性RNA的6种基本变体。每一种均能在生理条件下反式催化RNA磷酸二酯键的水解(因此能够切割其它RNA分子)。一般，酶性核酸通过首先与靶RNA的结合来作用。该结合通过酶性核酸的靶结合部分来进行，该部分与该分子中进行靶RNA切割的酶性部分紧靠在一起。因此，该酶性核酸通过互补碱基配对首先识别，然后结合靶RNA，一旦与正确位点结合后，通过酶学作用切开该靶RNA。对该靶RNA的策略性切割将破坏其指导所编码蛋白合成的能力。在酶性核酸对其RNA靶标实现结合和切割后，它将从该RNA上被释放出来以寻找另一靶标，并能重复结合和切割新的靶标。

核酶的酶学性质优于许多技术，例如反义技术(在该技术中核酸分子简单地与核酸靶标结合以阻断其翻译)，因为实现治疗性处理所必需的核酶浓度比所需的反义寡核苷酸浓度低。此优点反映了核酶通过酶学方式起作用的能力。因此，单一一个核酶分子能够切割许多靶RNA分子。此外，核酶还是一种高度特异的抑制剂，其抑制特异性不仅依赖于与靶RNA结合的碱基配对机制，还依赖于对靶RNA实行切割的机制。靠近切割位点的单个碱基错配、或碱基替代可以完全地消除核酶的催化活性。在反义分子中的相似错配并不妨碍其作用(Woolf等，1992)。因此，核酶作用的特异性比与相同RNA位点结合的反义寡核苷酸的作用特异性高。

在锤头、发夹、丁型肝炎病毒、I型内含子或RNaseP RNA(与RNA引导序列相关)或链孢霉属(Neurospora)VS RNA的基序中可以形成酶性核酸分子。锤头基序的例子描述于Rossi等(1992)。发夹基序的例子描述于Hampel等(欧洲专利申请公开文本EP 0360257)、Hampel和Tritz(1989)、Hampel等(1990)和美国专利5,631,359(特此并入本文作为参考)。丁型肝炎病毒基序的例子描述于Perrotta和Been(1992)；RNaseP基序的例子描述于Guerrier-Takada等(1983)；链孢霉属VS RNA的核酶基序描述于Collins(Saville和Collins，1990；Saville和Collins，1991；Collins和Olive，1993)；I型内含子的例子描述于美国专利4,987,071(特此并入本文作为参考)。对于本发明的酶性核酸分子重要的仅是，该分子具有与一或多个靶基因RNA区域互补的特异底物结合位点，并且它在该底物结合位点中或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，无需将该核酶的结构限定于本文所提及的具体基序。

在某些实施方案中，制备对目的靶标(例如本文所公开的其中一个序列)的RNA表现出高度特异性的酶性切割剂可能是重要的。该酶性核酸分子优选定向于靶mRNA的高度保守序列区。根据需要可以向特定细胞递送外来的这些酶性核酸分子。或者，可以从递送至特定细胞的DNA或RNA载体表达核酶。

小的酶性核酸基序(例如锤头或发夹结构的基序)也可以用于外来递送。这些分子的简单结构增加了该酶性核酸侵入mRNA结构的靶区的能力。或者，可以在细胞中从真核启动子表达催化性RNA分子(例如Scanlon等，1991；Kashani-Sabet等，1992；Dropulic等，1992；Weerasinghe等，1991；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Sarver等，1990)。本领域技术人员明了，任何核酶都可以在真核细胞中从适合的DNA载体上表达。这些核酶的活性可以通过它们借助于第二种核酶自初级转录本中释放而得以提高(国际专利申请公开文本WO93/23569，和国际专利申请公开文本WO 94/02595，两者均籍此并入本文作为参考；Ohkawa等，1992；Taira等，1991；和Ventura等，1993)。

可以将核酶直接加入靶细胞中，或可以使其与阳离子脂质、脂类复合物混合、或包装在脂质体中、或以其它方式递送至靶细胞中。该RNA或RNA复合物可以通过注射、气雾剂吸入、输注泵或支架，以掺入或不掺入生物聚合物中的形式，离体或体内局部施用给相关组织。

核酶可按国际专利申请公开文本WO 93/23569和WO 94/02595(均引入本文作为参考)所述设计，并按所述合成用于体外和体内实验。也可优化这些核酶便于递送。尽管提供了具体实例，但本领域技术人员将知晓，必要时可采用其它物种的等同RNA靶标。

可以通过计算机折叠(Jaeger等，1989)单独地对锤头或发夹核酶进行分析，以评价该核酶序列是否折叠成适当的二级结构。将在结合臂和催化核心之间具有不利分子间相互作用的那些核酶排除在考虑之外。可以选择不同的结合臂长度以优化活性。一般，每条臂上至少5个左右的碱基能够结合靶RNA，或以其它方式与靶RNA相互作用。

可以将具有锤头或发夹基序的核酶设计成与mRNA信息中的各位点退火，并且可以对其进行化学合成。所用的合成方法同Usman等(1987)和Scaringe等(1990)所述的用于正常RNA合成的程序，并且采用通常的核酸保护和偶联基团，例如5’末端采用二甲氧基三苯甲基，而3’末端采用亚磷酰胺。典型地，平均的逐步偶联产量大于98％。发夹核酶可以分两部分合成，然后退火以重新构建活性核酶(Chowrira和Burke，1992)。可以对核酶进行广泛的修饰，以便通过采用核酸酶抗性基团如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-o-甲基、2’-H增加稳定性(综述参见例如Usman和Cedergren，1992)。核酶可以采用一般方法通过凝胶电泳或通过高压液相层析获得纯化，并重悬在水中。

核酶的活性可以通过改变核酶结合臂的长度、或化学合成修饰的核酶来优化，所述修饰有防止该核酶受到血清核糖核酸酶降解的修饰(见例如国际专利申请公开文本WO 92/07065；Perrault等，1990；Pieken等，1991；Usman和Cedergren，1992；国际专利申请公开文本WO 93/15187；国际专利申请公开文本WO 91/03162；欧洲专利申请公开文本92110298.4；美国专利5,334,711；和国际专利申请公开文本WO 94/13688，它们描述了能够对酶性RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰)，增强核酶在细胞中的效力的修饰、以及为了缩短RNA合成时间和减少化学必要条件而进行的茎区II碱基的清除。

Sullivan等(国际专利申请公开文本WO 94/02595)描述了递送酶性RNA分子的一般方法。核酶可以通过熟悉本领域的人员已知的多种方法施用给细胞。这些方法包括但不限于包装在脂质体内、离子电渗疗法、或掺入其它载体(如水凝胶、环化糊精、生物可降解微型囊(nanocapsule)、和生物粘着微球体)中。对于一些情况，可以在有或没有上述载体的情况下直接将核酶离体递送给细胞或组织。或者，可以通过直接吸入、直接注射、或利用导管、输注泵或支架，进行RNA/载体组合的局部递送。其它递送途径包括，但不限于，血管内、肌肉内、皮下或关节注射，气雾剂吸入，口服(片剂或丸剂形式)，局部的、系统的、眼、腹膜内和/或鞘内递送。关于核酶递送和施用的更为详细的描述参见国际专利申请公开文本WO 94/02595和国际专利申请公开文本WO 93/23569，所有文献均特此并入本文作为参考。

在细胞内积聚高浓度核酶的另一方法是将该核酶编码序列掺入DNA表达载体中。核酶序列的转录由针对真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。从pol II或pol III启动子获得转录本将在所有细胞中以高水平表达；在指定细胞类型中指定的pol II启动子的水平将取决于附近存在的基因调节序列(增加子、沉默子等)的性质。也可以采用原核RNA聚合酶启动子，只要在适当的细胞中有该原核RNA聚合酶表达即可(Elroy-Stein和Moss，1990；Gao和Huang，1993；Lieber等，1993；Zhou等，1990)。从这些启动子表达的核酶可以在哺乳动物细胞中发挥功能(例如Kashani-Saber等，1992；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Yu等，1993；L’Huillier等，1992；Lisziewicz等，1993)。可以将这些转录单位掺入多种用于导入哺乳动物细胞的载体中，这些载体包括，但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录病毒、无名森林病毒、新培斯病毒载体)。

核酶可以用作诊断工具检查患病细胞中的遗传漂变(geneticdrift)和突变。它们还可以用于评价靶RNA分子的水平。核酶活性和靶RNA结构间的紧密关系使得可以在改变了靶RNA碱基配对和三维结构的该分子任何区域中检测到突变。通过采用多种核酶，可以给在体外、以及细胞和组织内对RNA的结构和功能重要的核苷酸改变进行作图。可以采用核酶对靶RNA的切割抑制基因表达和(基本上)确定疾病进程中指定基因产物的作用。以此方式，可以将其它遗传靶标确定为该疾病的重要中介体。这些研究将通过提供综合治疗(例如靶向不同基因的多种核酶、与已知小分子抑制剂偶联的核酶、或联合核酶和/或其它化学或生物分子进行的间歇疗法)的可能性导致对该疾病进程的更好治疗。核酶的其它体外应用是本领域熟知的，包括检测与IL-5相关疾病有关的mRNA的存在。该RNA通过采用标准方法在以核酶进行处理后测定切割产物的存在来检测。

结合剂

本发明还提供特异地与cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质结合的药剂，例如抗体和其抗原结合片段。在本文中，如果抗体或其抗原结合片段与cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质的反应(在例如ELISA中)处于可检测到的水平，而在相似条件下与无关蛋白质的反应不能被检测到时，则被认为与cofilin 1和/或磷酸化cofilin1蛋白质“特异结合”。本文所用“结合”是指两个独立分子之间的非共价联接以致形成复合物。结合能力可以通过例如测定形成该复合物的结合常数来评价。结合常数是当用各成分的浓度乘积除该复合物的浓度时获得的值。一般地，在本发明的上下文中，当形成复合物的结合常数大于约10³L/mol时，两个化合物被认为是“相结合的”。该结合常数可以采用本领域熟知的方法测定。

采用本文提供的代表性测定方法，结合剂还能够区分癌症患者/癌细胞是否具有耐受紫杉醇类紫杉烷类化疗药物的耐受性。换言之，与cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质结合的抗体或其它结合剂将在至少约20％耐药性患者/癌细胞中产生指示耐药性存在的信号，而将在至少约90％敏感患者/癌细胞中产生指示耐药性不存在的信号。为了确定结合剂是否满足此要求，可以按本文所述方法测定在来自(用标准临床检验确定的)耐药和敏感的患者的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检组织)中或在耐药或敏感癌细胞中是否存在与该结合剂结合的多肽。很明显，分析的耐药性和敏感样品的数量应当具有统计学显著性。每个结合剂都应满足以上标准；然而，本领域普通技术人员将知道，可以联合使用多个结合剂以提高灵敏度。

满足以上要求的任何药剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含有或不含有肽成分的核糖体、RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。抗体的制备可以采用本领域普通技术人员已知的多种技术中的任意一种。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。一般地，可以通过细胞培养技术制备抗体，这些技术包括按本文所述制备单克隆抗体，或通过用抗体基因转染适合的细菌或哺乳动物细胞宿主，以便使得可以产生重组抗体。在一项技术中，首先给多种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)中的任一种注射含有本发明多肽的免疫原。在该步骤中，可以将本发明的多肽不经修饰用作免疫原。或者，尤其是对于相对短的多肽，如果将该多肽与载体蛋白质，例如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白，连接在一起，则可以引起极佳的免疫应答。给该动物宿主注射该免疫原，并优选地根据预先确定的时间表掺入一或多次加强免疫，然后定期采取该动物的血液。然后可以从抗血清中，通过例如采用与适合固相支持物偶联的该多肽进行亲和层析，纯化对该多肽具有特异性的多克隆抗体。

对目的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)，及其改良方法来制备。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的永生化细胞系。可以从例如获自按上述方法免疫的动物的脾细胞制备这些细胞系。然后通过例如和骨髓瘤细胞融合伴侣，优选与该免疫动物同基因的骨髓瘤细胞，融合，使该脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将该脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺在支持杂种细胞而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的筛选技术采用了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)筛选。在足够长的时间之后，通常为约1-2周，可观察到杂种集落。选择单集落，并测试其培养物上清液与本发明多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。

可以从培养的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，还可以采用各种技术增加产量，例如将该杂交瘤细胞系注射入适合的脊椎动物宿主例如小鼠的腹腔内。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术例如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提从这些抗体中除去杂质。本发明多肽可以用于纯化方法的例如亲和层析步骤中。

在某些实施方案中，可能优选采用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，它们可以采用标准技术制备。简而言之，可以通过在A蛋白珠柱上通过亲和层析从兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。该Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通过亲和层析分离。

可以将本发明的单克隆抗体与一或多种治疗剂偶联在一起。在此方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。优选的放射性核素包括⁹⁰Y、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At和²¹²Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单孢菌外毒素、志贺氏菌毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。

寡核苷酸适配体

SELEX技术是近年来发展起来的研究核酸结构、功能及进化等的一种新的组合化学技术，它不仅在基础研究、生物筛选等方面有很好的应用，而且在临床诊断方面也显示广阔的前景(Brody EN & Gold L，J.Biotechnol.，2000，75：5-13)。筛选出的寡核苷酸适配子(aptamer)可高亲和力和高特异性地识别不同的分子。它的亲和力和特异性可与抗体相媲美，被认为是“挑战”抗体地位的一种新型试剂，在疾病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。SELEX技术一般需要数轮或数十轮才能得到其相应配基。最近，Santa-Coloma TA等报道了用靶标切换技术制备的高特异性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸适配体)”、“monoclonal oligobody(单克隆寡核苷酸适配体)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸适配体)”(BianchiniMetal，J.Immunol.methods，2001，252：191-197)可特异性地识别相应的蛋白质，应用于蛋白质印迹、免疫组化、免疫共沉淀等分析实验中。

蛋白类抗体的产生与应用存在以下限制：(1)用毒性抗原时，免疫动物承受不了，免疫原性弱的难以产生抗体；(2)杂交瘤产生于鼠，在人体应用受限；异源抗体在诊断中还产生非特异性反应(假阳性)；(3)成本高、费时费力，稀有抗体需大量筛选才能得到；(4)克隆细胞株的有效保存不易，有些杂交瘤难以在体内生长；(5)批间质量不一，诊断时要重新优化；(6)体内与体外的识别特异性有差别；(7)抗体-靶分子相互作用的动力学参数无法依要求改变；(8)寿命有限，对温度敏感，发生不可逆变性。而核酸(适配子或适配体)有以下的优越性：(1)在体外而非体内(动物、细胞)条件下筛选，特性可依要求改变；(2)动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变；(3)无毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；(4)在体外化学合成，可以保证时间、质量和数量；(5)特异性和亲和性不受组织或样品中非靶蛋白的干扰；(6)可以在合成时精确、定点、随意连接其它功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等；(7)比抗体分子小，更适用于体内影像诊断和治疗。如接上硫代磷酸，可用于细胞内诊断和治疗；(8)变性和复性可逆，而且速度快，可反复使用、长期保存和在室温下运输(Jayasena SD，Clin.Chem.，1999，45：1628-1650)。

调节紫杉醇化疗药物耐药性的药剂的筛选

本发明此筛选方法中将获得的或鉴定的化合物可以是能结合本发明任何核酸、肽或蛋白质的化合物。将鉴定的其它目的化合物是调节基因或本发明蛋白质表达的化合物，这样通过所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白质的表达。做为替代方案，该化合物可以通过增加或降低任何本发明蛋白质的活性发挥它的作用。

例如在样品，例如来源于动物的细胞提取物中可以包含所述一种化合物或所述多种化合物。而且，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今为止不知道其具有抑制或激活cofilin1/磷酸化相互作用蛋白质的能力。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞或组织培养物。用于本发明方法的适合设备是本领域技术人员已知的，并且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特别是17章中进行了描述。多种化合物可以，例如添加到反应混合物、细胞培养基中或者注射进入细胞中。

如果在本发明方法中鉴定了含有化合物或多种化合物的样品，那么可以从鉴定含有能起拮抗剂/激动剂作用的化合物的原始样品分离化合物，或者如果，例如原始样品由多种不同化合物组成，人们可以进一步细分原始样品，以降低每个样品的不同物质的数量，并且利用原始样品的细分部分重复该方法。根据样品的复杂性，可以进行上述步骤几次，优选地，直到根据本发明方法鉴定的样品仅仅含有有限数量或仅仅含有一种物质为止。优选地，所述样品含有具有类似化学和/或物理特性的物质，最优选所述物质相同。优选地，根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物被进一步制成适于给动物给药的形式。

作为本发明方法的候选药剂，可以利用适合的计算机程序可以进行本发明蛋白质结构基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)或者可以通过化合物组合文库筛选获得。蛋白质折叠的计算机模拟可以用于详细肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特别地，通过计算机辅助检索互补肽序列，适合的程序可以用于cofilin1和/或磷酸化cofilin1、其配体或其它相互作用蛋白质的相互作用位点的鉴定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技术中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于蛋白质和肽设计的适合的计算机系统。从上述计算机分析获得的结果可以用于例如本发明蛋白质或其片段的肽模拟物的制备。这种蛋白质天然氨基酸序列的假肽类似物可以非常有效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，在蛋白质或其片段中容易得到的非手性Ω-氨基酸残基的掺入将引起脂肪族链聚亚甲基单元对氨基键的置换，因此提供了构建肽模拟物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在现有技术中还描述了其它系统中的小肽激素的超活性肽模拟类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通过连续胺烷基化合成肽模拟物组合文库，和检测由此得到化合物，例如它们的结合，激酶抑制和/或免疫特性鉴定本发明蛋白质适合的肽模拟物。在现有技术，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模拟物组合文库产生的方法和用途。而且，可以利用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构设计生物活性肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。

本发明相应地也提供调节本发明耐药性的药剂、以及包含所述药剂的药物组合物和所述药剂在制备调节本发明所述耐药性中的用途。

耐药性的检测和诊断

一般地，可以基于癌细胞株或从患者获得的肿瘤活检组织中cofilin1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质的含量和/或编码这些蛋白质的多核苷酸的含量，检测所述癌细胞和患者是否具有紫杉醇类紫杉烷类化疗药物耐药性。一般本文提供的结合剂可以检测生物样品中与该药剂结合的抗原的水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白质的mRNA的水平，该水平也指示了耐药性的存在与否。

对于采用结合剂检测样品中的多肽标志而言，有多种本领域普通技术人员已知的测定形式可以使用。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，癌细胞株和癌症患者的紫杉醇化疗药物耐药性可以通过以下步骤确定：(a)用结合剂接触癌细胞株或从患者获得的肿瘤样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的水平；和(c)将该多肽水平与预先确定的截断值进行比较。

在一个优选的实施方案中，该测定涉及采用固定在固相支持物上的结合剂结合该多肽，并从样品剩余物中分离该多肽。然后采用含有报道基团并特异与该结合剂/多肽复合物结合的检测试剂检测该结合的多肽。这些检测试剂可以含有例如，与该多肽特异结合的结合剂、或与该结合剂特异结合的抗体或其它药剂，例如抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可以利用竞争测定法，在该方法中用报道基团标记多肽，并在固定化结合剂与样品一起孵育后，允许该多肽和该结合剂结合。该样品中的成分对该标记多肽与该结合剂结合的抑制程度指示了该样品与该固定化结合剂的反应性。适合用于这些测定方法的多肽包括以上所述的全长cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质和其与该结合剂结合的部分。

正如以上指出的，还可以，或者作为替代方案可以，基于癌细胞样品中编码cofilin蛋白质的mRNA的水平检测耐药性。例如，可以在基于聚合酶链式反应的测定中采用至少两个寡核苷酸引物扩增来源于样品的肿瘤cDNA的部分，其中该寡核苷酸引物中的至少一个对编码该cofilin1蛋白质的多核苷酸是特异的(即可以与之杂交)。然后采用本领域熟知的技术，例如凝胶电泳，分离并检测该扩增的cDNA。相似地，可以在杂交测定(hybridization assay)中采用特异与编码cofilin1蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针，检测生物样品中是否存在编码该肿瘤蛋白质的多核苷酸。

本发明还提供用于任一种以上检测和诊断方法的试剂盒。这些试剂盒典型地含有进行诊断测定所必需的两种或多种成分。这些成分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒中的一个容器可含有特异与cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质结合的单克隆抗体或其片段，或者该试剂盒中的一个容器可含有特异于cofilin1编码序列的核酸探针或引物。

癌症治疗

在本发明的其它方面，涉及基于本发明人首次发现的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1与癌症的紫杉醇化疗药物耐药性的相关性，治疗癌症。在这些方法中，典型地通过本发明的诊断方法鉴定患者的耐药性，然后根据耐药性结果确定患者的紫杉醇类紫杉烷类化疗药物施用方案。在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括对确定为具备耐药性的患者通过本发明的调节耐药性的方法降低其耐药性后，再施用紫杉醇类紫杉烷类化疗药物。另一实施方案中，本发明的治疗方法包括根据确定的耐药性结果，调整紫杉醇类紫杉烷类化疗药物的给药量、给药频率等。再一实施方案中，本发明治疗方法包括根据确定的耐药性结果，替代紫杉烷类化疗药物用于该患者的治疗中。本文所用“患者”是指任何恒温动物，如哺乳动物，优选人类。

药物组合物

在其它实施方案中，本发明涉及本文所公开的一或多种多核苷酸、多肽、反义寡核苷酸、核酶、寡核苷酸适配体和/或抗体在可药用载体或者赋形剂中的制剂，用于单独或联合一或多种其它形式的诊断/治疗方法施用给细胞或动物。一个实施方案中，本发明药物组合物可以用于诊断本发明患者的紫杉醇化疗药物耐药性并预测/预后所述化疗药物的治疗效果。另一实施方案中，本发明药物组合物可以用于调整本发明患者的紫杉醇化疗药物耐药性，在此情况下，优选地，本发明药物组合物以靶向患者肿瘤细胞并导致肿瘤细胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达改变(优选下调)的方式实现对患者耐药性的调整。

可药用赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的。同样，对于在各种治疗方案中使用本文所述具体组合物的适合给药和治疗方案(包括例如口服、非肠道途径、静脉内、鼻内、和肌内给药和药物配制)的研制也是本领域技术人员熟知的。

本文所述治疗组合物的施用途径和频率及剂量将因人而异，而且可以由临床医师确定。一般地，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻腔途径(例如通过吸入)或口服，施用这些药物组合物。一般地，适当的剂量和治疗方案提供足以获得治疗益处的活性成分量，其可以通过确定与未治疗患者相比经治疗的患者出现改善的临床效果来监测或确定。

以下通过实施例进一步对本发明进行举例说明。但是应当理解，这些实施例不以任何方式对本发明的范围构成限制。

实施例

一、卵巢癌耐紫杉醇细胞株的建立及相关耐药机制检测的研究

(一)方法

1.耐药细胞株的建立

采用小剂量浓度递增间歇诱导和大剂量冲击诱导法诱导人浆液性卵巢癌细胞SKOV3(中国医学科学院基础医学细胞中心)细胞耐药性的产生。

(1)小剂量浓度递增间歇诱导方法：

SKOV3细胞常规培养条件(37℃、5％CO₂)至对数生长期(密度至70％-80％)时，加入紫杉醇泰索(Taxol)(美国百时美施贵宝公司)10nM，37℃、5％CO₂培养24h，更换培养液，次日会有约50％的细胞死亡；待细胞渐渐恢复，达到密度约70％～80％时，重复这样的刺激10次，细胞在同样药物浓度下已经基本上无死亡时，提高药物浓度，递增10nM，重复诱导10次，最终的药物诱导浓度为紫杉醇30nM。耐药细胞培养在含紫杉醇30nM培养液(含10％小牛血清的HG-DMEM(美国Gibco公司))中，见图1。

(2)大剂量冲击诱导方法：

SKOV3细胞常规培养条件(含10％小牛血清的HG-DMEM)(37℃、5％CO₂)，对数生长期时，加入紫杉醇2.5uM，37℃、>5％CO₂培养1h，更换培养液。次日会有约50％的细胞死亡；待细胞渐渐恢复，达到密度约70％～80％时，重复同样的刺激共计21次。最终药物诱导浓度为：紫杉醇2.5uM。耐药细胞常规培养时，每12周用2.5uM紫杉醇冲击一次，见图2。

2.耐紫杉醇耐药细胞生物学特性的研究

(1)耐药指数(resistant index，RI)的测定——MTT法

1)对数生长期细胞，0.25％胰酶消化离心，用HG-DMEM培养液制成1×10⁶/ml细胞悬液；

2)接种到96孔板中，每孔加入100ul培养液，约含2×10³个细胞，37℃、

5％CO₂过夜；

3)第2日加入不同浓度梯度的化疗药物溶液(用HG-DMEM配制梯度浓度的化疗药物溶液)，为紫杉醇20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002、0.0002ng/ml，每个浓度设3孔，每孔加100ul药液，并留3孔加100ul培养液做空白对照，37℃、5％CO₂培养；

4)72h后、弃去培养液，在滤纸上轻拍令干。PBS洗涤1次。

5)每孔加入100ul无药培养液，1mg/ml MTT(四甲基偶氮唑盐)20ul，37℃、5％CO₂培养4-6h

6)每孔加二甲基亚砜100ul，37℃、5％CO₂培养过夜。

7)酶标仪检测各孔于波长540nm处OD值。最终OD值为各孔OD值与空白对照孔平均值的差值。

按下面公式计算抑制率，以抑制率为纵轴、药物浓度为横轴绘制抑制率曲线。抑制率为50％时的药物浓度即为半数抑制率(IC50)。耐药株细胞的IC50与敏感株的IC50的比值为耐药指数RI。各耐药株冻存3个月后复苏仍维持相似的耐药性时，即视为诱导成功。

(2)细胞染色(姬姆萨-瑞氏染色)

1)对数期生长的细胞，胰酶消化后稀释到约2×10⁴/ml细胞悬液；

2)接种到Φ3cm培养皿，待细胞生长至50％；

3)吸尽培养基，PBS漂洗2次；

4)甲醇2ml/孔固定30分钟，加入去离子水；

5)配染色液

Na₂HPO₄                    6ml

KH₂PO₄                     4ml

瑞氏染色剂(美国Sigma公司)  160ul

梅格-葛氏染色剂(Sigma)     120ul

姬姆萨染色剂(Sigma)        0.5ml

6)倒掉培养皿中的去离子水，晾干后，加入染色液1.5ml/孔，4℃过夜；

7)显微镜下照相。

(3)细胞生长曲线的检测(7天法)

1)对数期生长的细胞，0.25％胰酶消化离心，HG-DMEM培养基稀释成约5×10³/ml细胞悬液；

2)接种24孔板，加1ml/孔，即5×10³细胞/孔。37℃、5％CO₂培养；

3)每天取3孔细胞胰酶消化，分别计数，取其均值；如此连续7天。

取所得细胞数的对数值，绘制细胞生长曲线。根据Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间(Td)：Td＝T1g2/lg(N/N₀)。

(4)细胞生长周期的检测

对数期生长的细胞(细胞总数≥1×10⁶)

1)固定

(a)0.25％胰酶消化成细胞悬液，1500g离心10分钟，弃上清；

(b)PBS洗涤一次，1500g离心10分钟，弃上清；

(c)加入0.3mlPBS(含10％小牛血清30ul)重悬；

(d)悬液加至放有0.7ml无水乙醇的EP管内，-20℃保存。

2)PI(碘化丙啶，Sigma)染色

(a)-20℃固定的细胞3000g离心1分钟；

(b)PBS洗涤2次，每次1500g离心10分钟，弃上清；

(c)加入0.2ml RNaseA(1mg/ml)；

(d)37℃水浴30分钟；

(e)加入0.3ml PI(100ug/ml)，暗处染色20分钟；

(f)流式细胞仪分析DNA含量分布、multicycle软件分析G1、G2、S各期细胞比例。

(5)细胞内超微结构观察

1)对数期生长的细胞(细胞总数≥1×10⁶)，离心弃培养基，PBS洗涤2次；

2)加入PBS10ml，送至军事医学科学院(北京海淀区太平路27号)仪器检测中心电镜室进行细胞切片；

3)细胞长至对数生长期，PBS洗两遍，用细胞刷将细胞刮下，1000g离心10分钟，3％戊二醛(1/15M PBS pH7.4)，4℃下固定2小时，4℃下1/15M PBS+0.19M蔗糖缓冲液漂洗15分钟。乙醇4℃下梯度脱水(50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇+90％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各10分钟)，100％丙酮在室温下脱水10分钟。100％丙酮：包埋剂(1∶1)室温浸透30分钟，纯包埋剂浸透过夜。进行包埋：聚合时间为35℃，12小时：45℃，12小时；60℃，24小时。ULTRACUT E/S型切片机(美国RMC公司)进行超薄切片，醋酸铀染液避光染色10分钟，柠檬酸铅染色10分钟。

3)电压75kV，EM400T电镜(荷兰Philips公司)观察，选择×8000、×22000电镜照相。

3.已知耐药相关基因表达的测定

(1)mRNA水平测定已知耐药相关基因

1)细胞总RNA的提取

a)培养细胞至对数生长期，0.25％胰酶消化离心收集，PBS洗涤2次。

b)加1m1 Trizol(Sigma)，吹打均匀，静置5min。

c)加0.5m1氯仿，静置10min。

d)4℃ 12000g，10min。

e)取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟。

f)4℃ 12000g，10min。

g)弃上清，沉淀用DEPC水配制的75％乙醇漂洗，9000g5min。

h)弃上清，静置干燥10min。

i)沉淀用DEPC水50～100ml溶解，经电泳、紫外分光光度计鉴定，-70℃保存。

2)逆转录合成cDNA(日本TaKaRa公司逆转录试剂盒)

2×RNA selective PCR buffer      25ul

Mgcl₂                            10ul

dNTP                             5ul

AMV RTase                        1ul

Rnase抑制剂                        1ul

Oligo dt                           1ul

RNA样品                            7ul

总体积50ul，42℃孵育60min。

3)PCR

以β2M为内参，引物见表1，反应体系(总体积20u1)：

Taq MasterMix buffer(美国         10ul

Invitrogen公司)

上游引物                          0.5ul

下游引物                          0.5ul

逆转录产物                        1ul

H₂O                               8ul

对于MDR-1、MRP-1、LRP-1、GST-pi的扩增程序：95℃ 5min；95℃ 30s；60℃ 60s；72℃ 60s×30 cycles；72℃ 10min。

对β-微管蛋白亚型的扩增程序：94℃ 10min；94℃ 30s；55℃ 60s；72℃ 90s×30 cycles；72℃ 10min。

4)电泳

a)配制50×TAE：242g Tris、57.1ml冰乙酸、100ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)、

加水至总体积1000ml。取10ml、加水至总体积达500ml，即1×TAE，备用。

b)制取1.5％琼脂糖凝胶：称取agarose 1.5g，加1×TAE 100ml，微波炉加热至沸，加入3～5ul溴化乙啶，混匀，倒入电泳槽中，放凉后取出电泳梳。

c)点样(10ul/孔)后，120V/cm电泳10min，紫外灯下观察结果。

5)结果扫描和分析：

电泳结束后、把琼脂糖凝胶置入JS-380自动凝胶图像分析仪(上海培清科技有限公司)的暗箱中，用gel scan系统扫描。使用QCapturePro软件分析扫描结果。

(2)蛋白水平测定已知耐药基因相关蛋白表达(Western Blot免疫印迹方法)

所用试剂：

10×TBS(1L)          Tris碱    24.2g

                     NaCl      80g

                     盐酸调PH值至 7.6

5×Tris-甘氨酸电泳缓 Tris碱    15.1g

冲液

                    甘氨酸    94g

                    10％SDS   50ml

                    补充水至1000ml

转移缓冲液(终浓度)  Tris碱         25mM

                    甘氨酸(PH 8.5) 0.2M

                    甲醇           20％

洗涤缓冲液          1×TBS、0.1％Tween-20(TBST)

封闭缓冲液          1×TBS、0.1％Tween-20

                    5％(w/v)脱脂牛奶

1)抗原蛋白的提取

a)培养细胞至对数生长期(约80％)，0.25％胰酶消化离心收集，PBS洗

涤2次。

b)冰水浴中加入laemmli裂解液(美国Bio-Rad公司)(100ul/10⁶个细胞)。

c)99℃，煮沸10min。

d)4℃，10000g 10min。样品放入冰水浴中。

e)加入2-巯基乙醇(5％(v/v))，4℃ 4000g 10min，-20℃保存。

f)按照BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)操作规程进行样品浓度测定。

2)电泳

a)SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制：先灌分离胶，待分离胶完全聚合后(20-30min)，再灌注积层胶。

Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶配方

b)加样。上样量为40～60ug/泳道，分子量Marker 3ul。

c)电泳。电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到10V/cm，

直至溴酚兰到达分离胶底部，关闭电源。

3)蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜上。

a)转移缓冲液洗涤凝胶和PVDF膜，将PVDF膜铺在凝胶上，排尽气泡。

b)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿)，将凝胶夹在中间、保持湿润和没有气泡。

c)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

d)将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

e)接通电源开始电泳转移，100V 16℃ 2h。

f)转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

4)PVDF膜的封闭和抗体孵育

a)取下PVDF膜，做好标记，1×TBST洗涤，5min×1次。

b)放入5％脱脂牛奶(1×TBST，0.5％TWEEN-20)封闭1h。

c)1×TBST洗涤，5min×3次。

d)PVDF膜放入塑料袋内，加入封闭液和适量的一抗(0.1/ml)，封袋口。

e)PVDF膜，平置于摇床，4℃过夜，或室温孵育1h。

f)1×TBST洗涤，5min×3次。

g)加入二抗，室温孵育1h。

h)1×TBST洗涤，5min×3次。

5)检测蛋白表达

a)加入化学荧光剂ECL(Pierce)，室温孵育5min。

b)暗室里，胶片曝光显象。

(二)结果：

1.建立了具有高耐药指数的SKOV3耐紫杉醇耐药细胞系，SK-TR30和SK-TR2500。

采用小剂量浓度递增间歇诱导和大剂量冲击诱导法对SKOV3细胞进行体外诱导，分别历时12个月和18个月获得2种耐药细胞系，分别为：SK-TR30、SKOV3-TR2500，见表2，图3。

2.SKOV3及其耐药细胞生物学特性比较

(1)细胞形态观察

SKOV3细胞及其耐药细胞均贴壁生长。光镜下SKOV3细胞成短梭形、上皮样生长、边界清楚、折光性好。SKOV3细胞在诱导过程中可见明显的形态学改变：细胞体膨胀、伸出许多不规则树突状分支、整体呈蜘蛛状或星状、胞浆内出现空泡状颗粒；给药24～72h内最明显，96h～120h后逐渐恢复原状。耐药细胞的形态与原株细胞之间无明显差异，见图4。

(2)细胞生长曲线和细胞群体倍增时间

耐药株细胞生长速度明显延迟，细胞群体倍增时间随诱导药物浓度的增加而增加。耐药细胞株群体倍增时间Td约为原代细胞株的1.2～3.4倍，经t检验，差异有显著性意义(p<0.05)见表3以及图5所示。

(3)细胞生长周期

耐药株细胞各期细胞比例与母细胞株相比，G0/G1期延长(p<0.01)、S期缩短(p<0.01)；SK-TR2500的G2/M期缩短(p<0.05)，见表4，图6。

(4)细胞超微结构

SKOV3、SK-TR30和SK-TR2500细胞在光镜下观察到耐药细胞的胞浆较原代细胞丰富。此外SK-TR30细胞形态改变较明显：细胞呈多形性、边界模糊。通过电镜观察进一步了解耐药细胞内部结构的变化。

低倍(×8000)电镜：SKOV3细胞细胞间隙窄、细胞膜光滑、染色质呈团块聚集。耐药细胞细胞内外间隙增宽、有空泡样改变、细胞壁皱褶、染色质均匀分散。

高倍(×22000)电镜：同SKOV3细胞相比，耐药细胞的线粒体数量增多、体积增大、并伴有嵴的缺失。耐药细胞最显著的差异是在细胞表面附近出现很多囊泡样结构，它们有类似细胞膜的双层膜样结构，有些是空的，有些内有细胞质样组织。而原株细胞中基本观察不到类似结构。电镜还观察到耐药细胞膜以及核膜的双层结构粗糙或中断、出现胞膜内陷形成瓶颈样改变，见图7-12。

3.卵巢癌化疗敏感细胞SKOV3、A2780(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科李力教授提供)和耐紫杉醇耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科李力教授提供)的耐药相关基因的检测：

RT-PCR产物的电泳结果见图13-14。经凝胶成像分析，所获结果见表5.

1)MDR-1在SKOV3、A2780中不表达或表达量很低，在SK-TR30、A2780-TR中表达显著增高，在SK-TR2500中表达量低；

2)MRP-1在SKOV3、A2780、A2780-TR中不表达，在SK-TR30，SK-TR2500中低表达；

3)LRP-1、GST-pi在所有实验细胞中表达，并且表达量无明显改变；

4)微管蛋白-βI在SK-TR2500、A2780-TR中表达量提高1倍；

5)微管蛋白-βII在所有实验细胞中表达量无明显改变；

6)微管蛋白-βIII在A2780-TR中表达量提高1.77倍；

7)微管蛋白-βIVa在SK-TR2500、A2780-TR中表达提高约1倍；

8)微管蛋白-βIVb在SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中表达提高约1倍；

4.卵巢癌化疗敏感细胞SKOV3、A2780和耐紫杉醇耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2789-TR的耐药相关蛋白的检测

因为无法获得β-微管蛋白亚型对应的抗体，只进行了MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi的蛋白表达检测。

Western结果总结：

1)蛋白MDR-1在SKOV3中不表达，在SK-TR2500中表达量低，在SK-TR30中表达显著增高；在A2780胞中表达量低，在A2780-TR中表达显著增高，见图15。

2)MRP-1的蛋白表达在各细胞中未检测到。LRP-1、GST-pi蛋白在各实验细胞中表达无差异。

(三)结论

采用小剂量浓度递增间歇诱导建立的紫杉醇耐药细胞株SK-TR30，耐药指数为622.76±71.37；采用大剂量冲击诱导建立的紫杉醇耐药细胞株SK-TR2500，耐药指数为261.98±32.89；获购的紫杉醇耐药细胞株A2780-TR，耐药指数为7.97±0.95。有关耐药基因的检测结果表明，SK-TR30、A2780-TR有MDR-1的高表达，但SK-TR2500的MDR-1呈低表达；MRP-1、LRP-1、GST-pi在耐药细胞株表达无明显差异；I、III、IVb、IVa四种β-微管蛋白亚型在耐药细胞中表达增高。采用大剂量冲击诱导法建立的紫杉醇耐药细胞株SK-TR2500的耐药指数低于小剂量诱导法建立的紫杉醇耐药细胞株SK-TR30，但其耐药诱导过程与临床化疗过程接近，从而为研究紫杉醇耐药机制建立了一种良好的体外模型。

二、卵巢癌紫杉醇化疗敏感与化疗耐药细胞株的比较蛋白质组分析研究

(一)实验方法

1.细胞总蛋白的制备

细胞裂解液配方

Tris(40mM)                  48.4mg

尿素(urea)(7M)              4.204g

硫脲(thiourea)(2M)          1.522g

4％CHAPS                    0.4g

1％二硫苏糖醇(DTT)(20mM)    0.1g

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(1mM) 3.72mg

加蒸馏水至                  10ml

(1)细胞总蛋白的提取

1)培养细胞至对数生长期(约80％)，0.25％胰酶消化离心收集。

2)冰PBS洗涤，1000g，2×10min，弃上清。

(以下均在冰水浴中操作)

3)加入细胞裂解液(150ul/10⁷)，冰水浴30min。

4)液氮反复冻融3次。

5)超声至透明，加入适量cocktail蛋白酶抑制剂(德国Roche公司)，5ul DNA酶、RNA酶(Sigma)，冰水浴30min。

6)离心4℃，12000-14000g，20-25分钟。

7)收集上清，-80℃保存至进行2-DE(双向凝胶电泳)。

(2)蛋白定量

采用Bradford蛋白定量试剂(美国Bio-Rad公司)进行蛋白定量。

1)按照下表配置标准蛋白浓度。标准蛋白为BSA 2mg/ml，

2)取不同浓度的标准蛋白溶液以及各待测样品和空白对照(裂解液)溶液各2ul加入装有998u l双蒸水的EP管中，混匀后，各取800ul溶液加入新的EP管内。

3)每个EP管内加入200ul工作液(dye reagent concentrate)溶液，混匀，上机测定。

4)设定波长：595nm，分别设定空白对照，同时测定标准蛋白和样品的吸收值。

5)以吸收值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线，计算样品中的蛋白质含量。

2.双向凝胶电泳(2-DE)

2-DE各种溶液配方

(1)平衡液

Tris(1.5mol/L PH8.8)     3.35ml

尿素(urea)               36.04g

87％甘油(glycerol)       30ml

十二烷基硫酸钠(SDS)      2g

溴酚兰                   微量

加蒸馏水至               100ml

试管D1，D2，E1，E2分别取上述溶液8ml

平衡液A：D1，D2中加入二硫苏糖醇(DTT)160ul(使用前加)。

平衡液B：E1，E2中加入碘乙酰胺(iodacetamide)2.5％u/v 0.18g(使用前加)。

(2)水化液

尿素(urea)              2.4g

CHAPS                   0.1g

溴酚兰                  微量

加蒸馏水至              5ml

(3)T＝13％凝胶溶液

溶液                    体积

超纯水                  11.85ml

30％丙烯酰胺/0.8％甲叉      17.34ml

Tris(1.5mol/L PH8.8)        10ml

10％SDS                     400ul

10％APSw/v(用前加)          400ul

TEMED(用前加)               16ul

总体积                      40ml

(4)0.5％琼脂糖封胶溶液

电泳缓冲液                  100ul

琼脂糖                      0.5g

溴酚兰                      微量

(5)5×电泳缓冲液(Tris-甘氨酸-SDS)

Tris base                   3.25g

甘氨酸                      18g

SDS                         1.25g

加水至                      250ml

(6)固定液

乙醇                        100ml

冰醋酸                      25ml

加水至                      250ml

(7)考染固定液

乙醇                        100ml

冰醋酸                      25ml

加水至                      250ml

0.05％考马斯兰R-350(w/v)

(8)考染脱色液

乙酸                        8ml

乙醇                        25ml

加水至                      100ml

(9)考马斯兰染色液

0.05％考马斯兰R-350(w/v)

考马斯兰R-350(Amersham Pharmacia)1片加入1600ml双蒸水，待完全溶解后过滤。

(1)第一向固相PH梯度等电聚焦电泳

1)细胞总蛋白提取物(1mg)与重泡胀液(8mol/L urea+4％ CHAPS+20mmol/L DTT+0.5％ IPG buffer Ph3-10NL+痕量溴酚蓝)充分混合，总体积350ul。

2)将样品加入IPGstrip持胶槽。

3)从酸性端小心揭去IPG干胶条(英国Amersham Biosciences公司)保护膜，胶面向下置于胶槽内，前后移动胶条排除气泡并使胶条与两极接触。

4)取1ml覆盖油(mineral oil)覆盖胶条，盖好持胶槽盖子。

5)数个胶槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪(AmershamBiosciences)的电板上；重泡胀和聚焦在20℃自动进行，总电压是60000-80000Vh。

等电聚焦参数如下步骤进行：

(2)平衡

1)将IPG胶条放入加有平衡液A(10ml/strip)的试管中，封管口，平放摇床，轻微振荡15min。

2)将IPG胶条放入加有平衡液B(10ml/strip)的试管中，封管口，平放摇床，轻微振荡15min。

(3)第二向垂直平板SDS-PAGE电泳

1)安装好灌胶装置，配置13％聚丙烯酰胺凝胶溶液，灌制1.5mm厚的线性梯度胶。灌后立即依次用无水乙醇，去离子水封压。

2)室温放置4小时，除去表面水并用滤纸吸干水分。

3)将平衡好的IPG胶条置于PAGE凝胶顶端，轻轻挤压胶条使其紧贴胶面。

4)标准蛋白Mark上于碱性端，3-5ul/块胶。

5)排净气泡后用含溴酚兰的0.5％琼脂糖封固。

6)接通电源，16℃循环水恒温冷却。电流设置：初始恒流为20mA/2块胶，40min后换用40mA/2块胶，直至溴酚兰前沿抵玻璃板下缘时停止电泳。

(4)考马斯兰染色

1)小心取下凝胶板放入考染固定液(350ml/盒)中，水平摇床上轻微振荡30min。

2)双蒸水洗涤3次，每次5min。

3)凝胶板放入加热的考马斯兰染液(勿煮沸)中，完全没入，轻微振荡染色10min。

4)倾去染色液，放入脱色液，完全覆盖凝胶。

5)水平摇床上脱色，室温过夜，直至蛋白质点清晰为止，期间可以多次更换脱色液。

6)双蒸水洗涤3次，每次5min。

3.凝胶扫描和图像分析

经过染色的凝胶应用Labscan5扫描仪(Amersham Biosciences)进行图像扫描。参数设置：分辨率300dpi，8位灰度值，以TIF文件格式储存。使用ImageMaster 2-DElite 3.0 software(Aersham Biosciences)专用软件进行分析步骤参照厂商说明书进行。主要步骤为：

1)图像修饰

2)点的识别

3)点的编辑

4)背景扣除

5)斑点匹配

6)标准化

7)图形化分析

蛋白质的量被定义为构成这个斑点的所有像素值的总和。为了较准确反映蛋白质斑点量的变化，将每个点的含量表示为相对百分含量(％Vol)，也就是一个蛋白质斑点的像素值占整个凝胶内所有蛋白质斑点像素值的百分数。斑点位置的重复性按Corbett[Corbett JM，et al.Electrophoresis.1994；15：1205-1211.]等的方法进行计算。所有数据的统计分析在SPSS for Windows 11.5软件上进行。

4.考染胶内蛋白点酶切和质谱样品的制备

(1)脱色

切割考染凝胶中的蛋白点，放入盛有200ul超纯水的EP管中。用超纯水清洗几次后，加入含50％乙腈的100mM NH₄HCO₃脱色液50-100ul浸泡胶粒。振荡20分钟，弃去溶液。重复2-3次至胶中的蓝色褪尽

(2)酶解

脱色后的胶粒真空干燥30min使其完全脱水，体积缩小。加入3-10ul酶液，4℃，20-30min。吸出多余的酶液。加入5-10ul25mM NH₄HCO₃，密封样品管超声1-2min，置于37℃水浴>12h.

(3)肽提取和干燥

将步骤2)的样品，离心吸出上清液置于新的EP管中。胶中加入5ul的5％TFA。密封管口后超声1-2分钟。37℃保温1hr。离心后吸出上清液。加入适量ACN，室温放置，待胶粒脱水变白，吸取，合并上清液，冰冻干燥。

5.质谱分析

制备好的样品置于ProFlex^TMIII MALDI-TOF-MS质谱仪上进行分析。采用线性模式，正离子谱测定，离子源加速电压20kV，N₂激光波长为337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取500ns，真空度4×10^-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰，获得肽质量指纹图。

6.数据库查询

通过Mascot软件(http://www.matrixcience.com)查询Swiss-prot或NCBInr数据库资料。查询条件：

查询类型                肽质量指纹图谱

酶                      胰酶

固定修饰                无

可变修饰                脲甲基化和氧化作用

质量值                  单一同位素的

蛋白质分子量            不限

肽质量误差              ±100ppm

肽电荷状态              阳离子

不完全裂解位点          1

肽质指纹图中的肽片段质量控制在<100ppm，酶解片段不完全选择为1个。物种来源选择人类。最少匹配片段数规定为5。蛋氨酸氧化和半胱氨酸脲甲基的修饰均被考虑到。

7.差异蛋白质点的鉴定(Western Blot)

方法详见实验一部分。

(二)、结果

1人卵巢癌化疗敏感细胞系SKOV3，A2780和耐紫杉醇耐药细胞系SK-TR2500，SK-TR30，A2780-TR细胞总蛋白的双向凝胶电泳图谱分析。为了保证双向电泳的可比性，分别以SKOV3和SK-TR30，SKOV3和SK-TR2500，A2780和A2780-TR分组进行平行实验，并在相同条件下对各组的总蛋白样品重复试验3次以上。结果表明：

(1)同一样品双向电泳图谱重复性较好，平均匹配率是80-85％；

从肉眼观察发现同一样品的3次双向电泳图谱非常相似，以pI 4-8和Mr 15-70kD范围的蛋白斑点分布最多。因为选用PH3-10NL固相IPG干胶条，使PH4-7之间的蛋白点得以充分分离，有利于以后的图谱分析和鉴定(见图18，19)。每张图谱检测到斑点数量约为1003±111.5个。同一细胞样品选择3块胶的图谱，以其中一块胶为参考进行3块胶间的斑点匹配，平均匹配的点数为892，平均匹配率为80-85％，而且同一蛋白质点的浓度无显著差别。

(2).卵巢癌化疗敏感细胞与耐药细胞蛋白表达的差异

将实验细胞按化疗敏感细胞与紫杉醇耐药细胞分为2-3组，分别为SKOV3与SK-TR2500和/或SK-TR30，A2780与A2780-TR。在双向凝胶电泳的重复性得到保障下，分别比较了几组细胞的双向电泳图谱。应用ImageMaster 2-D Elite 3.0 software专用分析软件对3组2-DE图谱的蛋白质点表达量化，通过比较，选取浓度升高或降低>2倍的蛋白质点22个，进行质谱分析。

2.MALDI-TOF-MS质谱分析结果

将22个2-DE差异蛋白质点经切割，脱色，还原，烷基化，胰酶酶解，萃取，脱盐后，用MALDI-TOF-MS并以基质峰，酶自动降解片段进行校正，测定各自的肽质指纹图谱(PMF)，如图22为SK-TR30双向电泳图谱中69号蛋白质点(cofilin1)的肽质指纹图。22个点中获得了21张肽质指纹图谱，其中部分质谱图的质量较高(峰信号较强，以1000-2500间的片段峰较多，酶自动降解峰很明显)；部分PMF的肽片段峰信号较弱，且1000-2500间的片段峰较少；另有1个蛋白点未获得肽质量指纹图谱。通过MASCOT查询软件应用MALDI-TOF-MS-PMF数据在限制相应的查询条件下搜索SWISS-PORT，将查询结果结合双向凝胶电泳相应点的表观等电点，分子量，匹配肽段的多少(5个片段以上)和覆盖率(>15％)等综合分析，在获得的21张肽质指纹图数据中的搜索结果有3种：①没有匹配数据库中任何记录，有2个；②匹配到数据库中蛋白质，蛋白只有其部分序列被测定，尚需进一步鉴定，该种情况有2个；③在数据库中匹配到符合结果要求的已知蛋白质有16个(另有1蛋白点为角蛋白，未列入本表)，见图16-21，表6-7。这些蛋白分别与细胞骨架，氧化反应，调节代谢，细胞调亡和蛋白酶的合成代谢相关。

3.差异蛋白质点的鉴定

用Western免疫印迹方法对3种耐药细胞中共同上调蛋白cofilin1进行了检测。因为蛋白cofilin1在细胞内是以去磷酸化的形式被活化并发挥作用，所以我们同时检测了磷酸化cofilin(phospho-cofilin)表达以反映细胞内去磷酸化cofilin。见图23，结果发现蛋白总cofilin1在敏感和耐药细胞中表达无差异，但是磷酸化cofilin在耐药细胞中表达明显上调。

(三)、结论：

应用双向电泳技术，成功制备了卵巢癌化疗敏感细胞株SKOV3、A2780和卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR蛋白质表达图谱。经比较蛋白质组分析，共发现16个差异表达2倍以上的蛋白点，其中蛋白质cofilin1，destrin，prohibitin，hsp27，proteasome、Lasp-1、TCP-1、stathmin、SOD2等上调，Annexin家族蛋白、peroxiredoxin 6蛋白下调。质谱鉴定的结果表明它们分别与细胞骨架，氧化反应，调节代谢，细胞调亡和蛋白酶的合成代谢相关。其中cofilin1和destrin的表达上调为所有耐药细胞株共有，提示cofilin1和destrin可能为卵巢癌紫杉醇耐药标记候选蛋白

三、卵巢癌紫杉醇化疗耐药相关候选蛋白cofilin1的功能研究

(一)实验方法

LB培养基

细菌培养用胰化蛋白胨    10g

细菌培养用酵母提取物    5g

NaCL                   10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用5M NaOH调节PH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在151bf/in²(1.034×10⁵Pa)，高压下蒸气灭菌20min。高压完，置于4℃冰箱保存。

LB琼脂糖培养基(1.5％)

LB培养基           200ml

琼脂糖             3g

上述配方放入500ml锥形瓶，用铝箔纸封口，在151bf/in²(1.034×10⁵Pa)，高压下蒸气灭菌20min，从高压灭菌器中取出培养基轻轻旋动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布

一)构建含cofilin1(COF1)目的基因正义序列的质粒(pcDNA-cof)

1.提取cofilin 1(COF1)目的基因

(1)细胞总RNA的提取

所用细胞：SK-TR30细胞

详细步骤见实验2部分

(2)RT-PCR提取目的基因

1)从GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中查询cofilin 1编码区(500bp)(gil49472823)，设计并合成引物(上海搏亚生物技术有限公司)：5’端引物：5’aacta gctagc atg gcc tcc ggt gtg gct gtc 3’，3’引物：5’g gaat tca caa agg ctt gcc ctc cag 3’，并分别在5’，3’端加入NheI，EcoRI酶切位点。

2)以Titan One Tube RT-PCR Kit试剂盒(Roche)进行逆转录合成cDNA和PCR反应。反应条件：50℃逆转录30分钟，94℃变性2分钟后进入循环，前10个循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，68℃延伸45秒；后25个循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸45秒；35个循环后68℃延伸7分钟。

3)PCR产物COF1经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，将凝胶放入JS-380自动凝胶图像分析仪，使用QCapturePro软件进行PCR条带光密度扫描，参照DNA marker：DL2000(TaKaRa)，在500bp位置检测到产物片断。

2.PCR产物回收

1)用DNA Fragment Purification Kit 2.0(20次量)试剂盒(TaKaRa)进行PCR产物回收。

2)回收产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，将凝胶放入JS-380自动凝胶图像分析仪，使用QCapturePro软件进行PCR条带光密度扫描，参照DNA marker:DL2000，在500bp位置检测到产物片断。

3.COF1基因片断和载体(pcDNA3.1(+))的双酶切

1)选用EcoRI，NheI(Roche公司)分别将COF1的PCR扩增产物和载体pcDNA3.1(+)(图24)(Invitrogen)进行双酶切。

反应体系25μl

DNA              <1μg

10×M buffer     2.5μl

EcoRI(TaKaRa)    1μl

NheI(TaKaRa)     1μl

去离子水         补足25μl

37℃水浴，3小时

2)全部酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶回收试剂盒(Invitrogen)分别进行凝胶回收。

3)分别测定回收后产物的浓度

4.COF1和pcDNA3.1(+)的连接

反应体系10μl

T₄连接酶(TaKaRa)    1μl

10×buffer          1μl

pcDNA3.1(+)         0.2-1.2μl

COF1 DNA            补足10μl

16℃水浴，过夜

5.制备感受态细胞(氯化钙重悬法)

1)取大肠杆菌DH5α原菌液(-80℃保存)100μl加入5ml LB，200g，37℃温育12-16h。

2)取上述菌液100μl加入5ml LB中，250g，37℃温育3小时，每隔20-30s，监测OD600。

3)将菌液转移至一无菌，用冰预冷的离心管中，冰浴10min。

4)4℃，4000g，离心10min。

5)弃净上清，用预冷的0.1moL CaCl₂5ml重悬细菌，冰浴30min。

6)4℃，4000g，10min。

7)按每50mL初始培养液用2mL预冷的0.1mol CaCl₂重悬细菌，将细菌分装成小份，加入15％甘油，-70℃保存。

6.质粒转化和收获

1)50-200μl感受态细胞加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。

2)EP管放入预加温到42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动EP管

3)取出EP管迅速放入冰浴中冷却1-2min。加入150μlLB/管培养基，转移至37℃摇床上，100g，温育45分钟使细菌复苏。

4)将适当体积(每个90mm平板上200μl)已转化的感受态细胞分别加到到含氨苄100μg/mL的LB琼脂培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻将转化的细胞涂匀。

5)将平板置于室温直至液体完全吸收。

6)倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后出现菌落。

7)每块平板分别挑取6个单菌落，分别接入5mL含100μg/ml氨苄的LB加入10ml。通气良好的试管中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。

8)将1.5ml培养物导入微量离心管中，4℃，12000g，30s，剩余的培养物储存4℃。

9)吸去培养液，使细菌尽可能干燥。

7.质粒提取

选用Qiagen质粒小提取试剂盒

1)将3-5ml菌液离心，弃净上清，加入0.3ml PI溶液(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(PH 8.0)，10mmol/L EDTA(PH 8.0)，RNA酶)，充分混匀2)加入0.3ml PII溶液(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，温和混匀，室温放置5min，期间上下翻转4-6次。

3)加入冰预冷的PIII溶液(5mol/L乙酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，水28.5mL)，立即混匀，冰浴5min，期间上下翻转4-6次。

4)4℃，13000rpm离心10min。

5)取上清，再次4℃，13000rpm离心10min。

6)吸取上清加入预先用1mL QBT平衡过的Qiagen-tip20中，注意不要将沉淀吸入。

7)用QC 1mL洗涤Qiagen-tip20 4次。

8)0.8mLQF加入Qiagen-tip20，其下用干净的EP管接收流出的液体。

9)向EP管中加入0.56mL异丙醇(0.7终体积)，13000rpm/min，离心30min。10)小心吸尽上清，加入1mL75％酒精，9000rpm/min，离心10min吸尽上清，室温干燥5min。

11)加入10μl TE完全溶解核酸沉淀。得到含cofilin1(COF1)目的基因正义序列的质粒pcDNA-cof。

12)测定质粒的浓度。

8.质粒鉴定

1)电泳鉴定

所有提取质粒各取3μl，以空载体pcDNA3.1(+)为对照，经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将凝胶放入JS-380自动凝胶图像分析仪，使用QCapturePro软件进行PCR条带光密度扫描，参照DNA marker：DL15000，选取电泳速度慢于对照的质粒进行下一步的双酶切

2)EcoRI，NheI(TaKaRa公司)双酶切鉴定

反应体系：20μl，同前述。

酶切产物全部经经1％琼脂糖凝胶电泳分离，将凝胶放入JS-380自动凝胶图像分析仪，使用QCapturePro软件进行PCR条带光密度扫描，参照DNA marker：DL15000，选取分别在500bp，4000bp出现片段的质粒，各取100ul菌液进行测序。测序公司：华大中生科技发展有限公司。

二)构建含cofilin1(COF1)目的基因反义序列的质粒(pcDNA-antisense-cof)

1.PCR扩增cofilin 1目的基因

1)质粒pRKcof的转化，收获和提取(实验步骤见前)。

2)测定质粒浓度。

3)高保真酶PCR扩增cofilin 1目的基因。

引物如前述，以质粒pRKcof(由德国马普学会精神病学研究所TheoRein教授馈赠)为DNA模板

50μl反应体系

Pfu DNA Polymerase(美国5μl

Promega公司)

Pfu DNA Polumerase 10×1.25μ/50μl

buffer

dNTPmix(200μM终浓度)       1μl

上游引物                   1μl

下游引物                   1μl

DNA模板                    <0.5μg/50μl

去离子水                   补足到50μl

2.PCR产物回收

实验步骤与前相同

3.COF1基因片断和载体(pcDNA3.1(+))的双酶切

选用BamHI，XhoI(TaKaRa公司)进行双酶切；其余步骤，包括连接，质粒转化，收获，提取和鉴定均同前实验。

测序公司：华大中生科技发展有限公司。

三)细胞转染

1.取前述实验中得到的测序结果完全符合的质粒(pcDNA-cof，pcDNA-antisense-cof)和pEGFP-cof(英国爱丁堡大学Sutherland K.Maciver教授馈赠)进行质粒转化，收获和提取，实验方法见前。

2.转染细胞

质粒：pcDNA3.1(+)，pcDNA-cof，PRK-cof，pEGFP-cof

细胞：SKOV3，A2780，SK-TR30，SK-TR2500，A-TS细胞

1)培养细胞至对数生长期(约80％)，0.25％胰酶消化离心收集。

2)转染前一天，在不包含抗生素的适量DMEM(HG)或1640培养基中接种细胞(0.5-2×105cell/500μl)到24孔板，转染时细胞的汇合度要达到90-95％。

3)每一个转染样品都要按照如下的方法准备DNA-Lipofectamine2000复合物：

a.50u10pti-

 I(Invitrogen)低血清培养基稀释质粒，轻轻混匀。

b.使用前轻轻混合Lipofectamine 2000(Invitrogen)，然后加入50u10pti-

 I低血

清培养基中稀释，轻轻混匀后在室温下孵育5min。

c.孵育5min后，混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000，轻轻混合，

在室温下孵育20min。

4)将DNA-Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔

中，轻轻地前后摇动培养板混合。

5)37℃，CO₂培养箱孵育18-48小时，直到收获细胞进行实验。在转染后6

小时改换培养基。

6)瞬时转染检测转染效率。

a.荧光显微镜下观察细胞转染情况，摄像，计算转染效率。

b.收获瞬时转染48h后的细胞，提取细胞蛋白，Western免疫印迹方法检测转染效率，调整DNA和Lipofectamine 2000用量。

四)筛选稳定表达目的基因的单细胞克隆

1.按前述实验方法进行细胞转染。

2.G418筛选稳定表达目的基因的细胞克隆。

1)细胞转染24h后，0.25％胰酶消化，收集细胞，按照1∶6-10的比例重新

接种在新的6孔板内。次日，换成不同浓度的G418培养基，常规培养(37℃，5％CO₂)培养10-14天。下表给出不同细胞对应的G418浓度：

2)当光镜下观察到单个细胞长成细胞克隆时，显微镜下挑取细胞克隆(条件：单个，孤立，约有500-1000个细胞，细胞形态均一)约20-40个，分别接种到24孔板孔内，以后的培养均用含G418(200ug/ml)的培养基培养。

3)待细胞在24孔板内生长至对数生长期(约80％)时，0.25％胰酶消化细胞接种到6孔板内继续培养。

4)待细胞在6孔板内生长至对数生长期(约80％)时，0.25％胰酶消化，收集，冻存细胞；并留少量细胞继续培养进行实验。

5)细胞至对数生长期时，0.25％胰酶消化，收获细胞。

3.检测细胞内cofilin1蛋白的表达。

鉴定方法：Western印迹法。(具体实验步骤见实验一部分)

五)转染后细胞的耐药指数的测定

分别选取cofilin1蛋白表达量最高的SKOV3和A2780转染细胞亚群，cofilin1蛋白表达量最低的SK-TR30，SK-TR2500，A-TS转染细胞亚群各2-3个，常规细胞培养。待细胞生长至对数生长期(约80％)时，消化收集细胞。分别以转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为参照，测定相应细胞的耐药指数(resistant index，RI)-MTT法(具体实验步骤见实验一部分)。

(二)结果

1.RT-PCR扩增产物鉴定

SK-TR30细胞总RNA经逆转录以及PCR扩增，反应产物有琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示在分子量为500bp左右有单一清晰的DNA条带，与原设计产物分子量大小相符。

2.正、反义载体pcDNA-cof，pcDNA-antisense-cof的构建、筛选和鉴定

(1)正义载体pcDNA-cof的构建

逆转录PCR扩增产物500bp的cofilin1片段和载体pc-DNA3.1(+)经NheI，EcoRI位点酶切后，在T4连接酶作用下粘端连接(图25)，cofilin1 cDNA正向插入序列载体pc-DNA3.1(+)中(见图25，26)；转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB琼脂糖培养皿中，获重组质粒产生的菌落，将菌落扩增并提取质粒，样品经NheI和EcoRI完全酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定显示出两条特异DNA条带：一条分子量与pc-DNA3.1(+)质粒大小相符，另一条则与PCR扩增片段大小完全一致(见图25)。结果表明：PCR扩增产物带有原设计引物中的酶切位点，此片段被克隆在pc-DNA3.1(+)的NheI和EcoRI位点上。

(2)反义载体pcDNA-antisense-cof的构建

质粒PRKcof中cofilin1的PCR扩增产物和序列载体pc-DNA3.1(+)经BamHI，XhoI位点酶切后，cofilin1序列反向克隆入序列载体pc-DNA3.1(+)中。将通过转

化和扩增的质粒经BamHI，XhoI双酶切后电泳鉴定显示出两条特异DNA条带：一条分子量与pc-DNA3.1(+)质粒大小相符，另一条则与PCR扩增片段大小完全一致(见图27)。

(3)PCR扩增片段的DNA序列的测定

1)pcDNA-cof：被测片段全长498bp，包括了编码cofilin1蛋白的全部核苷酸以及两侧的酶切位点，与原设计相符。证实了逆转录PCR扩增产物为cofilin1。下面是cofilin1的核苷酸序列：

ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGATGGTGTCATCAAGGTGTTCAACGACATGAAGGTGCGTAAGTCTTCAACGCCAGAGGAGGTGAAGAAGCGCAAGAAGGCGGTGCTCTTCTGCCTGAGTGAGGACAAGAAGAACATCATCCTGGAGGAGGGCAAGGAGATCCTGGTGGGCGATGTGGGCCAGACTGTCGACGACCCCTACGCCACCTTTGTCAAGATGCTGCCAGATAAGGACTGCCGCTATGCCCTCTATGATGCAACCTATGAGACCAAGGAGAGCAAGAAGGAGGATCTGGTGTTTATCTTCTGGGCCCCCGAGTCTGCGCCCCTTAAGAGCAAAATGATTTATGCCAGCTCCAAGGACGCCATCAAGAAGAAGCTGACAGGGATCAAGCATGAATTGCAAGCAAACTGCTACGAGGAGGTCAAGGACCGCTGCACCCTGGCAGAGAAGCTGGGGGGCAGTGCCGTCATCTCCCTGGAGGGCAAGCCTTTGTGA(SEQ ID NO：1)

其氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

2)pcDNA-antisense-cof：被测片段全长502bp，包括了反序列的cofilin1蛋白的全部核苷酸以及两侧的酶切位点，与原设计相符。证实了cofilin1被反向插入载体。

(4)PCR扩增片段的DNA序列的测定

1)pcDNA-cof重组载体经NheI和EcoRI双酶切后电泳鉴定得到500bp条带，与目的片段大小相符(图28)。

2)pcDNA-antisense-cof重组载体经BamHI和XhoI双酶切后电泳鉴定得到500bp条带，与目的片段大小相符(图29)。

3.转染结果以及cofilin表达效率

1)在Lipofectamine 2000介导下，通过瞬时转染pEGFP-cof评价转染效果，见图30。SKOV3转染效率为60％，A2780转染效率为20％。

2).通过不同浓度的G418培养基筛选稳定转染的卵巢癌化疗敏感和耐药细胞克隆，并通过western blot检测cofilin1蛋白表达差异，见图31。

4.转染后细胞耐药性的改变

1)卵巢癌化疗敏感细胞SKOV3，A2780细胞，选取cofilin1蛋白表达量增高最明显的克隆细胞以各自的原代细胞和转染空载体的原代细胞为参照用MTT法进行耐药指数测定。结果见表8，当cofilin1表达量增高时，细胞对紫杉醇的耐药性增加；

2)卵巢癌耐紫杉醇耐药细胞SK-TR30，SK-TR2500，A2780-TR细胞，因为考虑转染过程以及筛选过程可能会影响细胞的耐药性，仅以转染空载体的原代细胞为参照，参考原代细胞，选取cofilin1蛋白表达量降低最明显的克隆细胞用MTT法进行耐药指数测定。结果见表8，当cofilin1表达受抑制时，细胞对紫杉醇耐药性减弱。

(三)、结论

利用基因工程技术转染正义质粒pcDNA-cof后，卵巢癌敏感细胞SKOV3、A2780的cofilin1表达量上调，对紫杉醇耐药性增加6-7倍(表8)；转染反义质粒pcDNA-antisense-cof后，卵巢癌耐药细胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR的cofilin1表达量下调，对紫杉醇耐药性下降3-4倍(表8)。结果表明cofilin1可能为卵巢癌细胞紫杉醇耐药相关候选蛋白，提示actin骨架蛋白可能参与卵巢癌紫杉醇耐药机制。

四、耐药相关候选蛋白cofilin在卵巢上皮癌组织中表达的研究

(一)实验方法

1.卵巢癌标本收集：收集2002年11月至2005年1月期间，在中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术后病理证实为卵巢癌的患者46例。实验分组，卵巢癌化疗敏感组和卵巢癌化疗耐药组。入组标准：

1)病理诊断的原发性卵巢上皮癌。

2)卵巢癌化疗敏感组：经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到临床完全缓解(CR)，持续时间>6个月。

3)卵巢癌化疗耐药组：经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到完全缓解(CR)，持续时间<6个月；化疗期间肿瘤的最好疗效为PR、SD或PD者。

共收集卵巢癌化疗敏感组织标本24例和耐药组织标本22例，石蜡包埋形式保存，由北京协和医院病理科协助提供。相应患者的临床资料见表9，10。

协和医院病案室查阅化疗敏感和耐药共46例患者的病历，按病理号找出全部的术中标本切片，经病理科大夫阅片后，挑选卵巢癌组织较大，无坏死及出血，以肿瘤实质为主的切片，并寻找相应的癌组织蜡块用于免疫组化。

2.免疫组织化学染色

1)将石蜡包埋肿瘤组织进行连续切片，厚度约4um。切下石蜡薄片后，顺次经30％酒精，50℃水浸泡片刻，使其充分展开。转移至载玻片上，75℃烤片45min。

2)顺次二甲苯脱石蜡(15min×3)。系列浓度乙醇(100％，95％，80％)顺次浸泡片刻，蒸馏水冲洗2遍，PBS浸泡15-30min。

3)事先对组织抗原进行各种方法的修复，选择效果最好的抗原修复方法。经试验后Cofilin1采用微波修复，磷酸化cofilin采用胰酶修复。

4)3％过氧化氢封闭10min。

5)加入一抗，将切片放入湿盒中，室温下孵育75min，PBS冲洗5min×3次。

6)全自动免疫组化染色仪加入二抗，将切片放入湿盒中，室温下孵育45min，PBS洗5min×3次。

7)DAB显色1-5min，光镜控制。PBS，蒸馏水冲洗。

8)苏木素复染：苏木苏中浸泡1min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精消化片刻，淡氨水中浸泡1min，蒸馏水冲洗。

9)系列浓度乙醇(80％，95％，100％)顺次浸泡片刻，二甲苯顺次浸泡片刻(×2)。

10)中性树脂胶封片。

3.阅片，判定标准及阴阳性对照

所有切片均由病理科专科医生在不知道任何临床资料的情况下进行阅片。

判定标准：cofilin1和磷酸化cofilin均以细胞浆棕色为染色阳性。根据着色肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的百分比，<5％为(-)，5-25％为(+)，25-50％为(++)，50％-75％为(+++)，>75％为(++++)，随机选取10个视野，平均值作为最终结果。

阳性对照：两者的阳性对照均为扁桃体生发中心。二者的阳性部位均为细胞浆。

阴性对照：用PBS取代一抗。

4.统计学分析

使用SPSS11.5软件进行如下统计分析：

采用等级资料的秩和检验评价化疗敏感及耐药患者的cofilin1和磷酸化cofilin1表达量是否存在显著性差异。

(二)、结果

卵巢癌化疗敏感组平均年龄51.13岁，化疗耐药组平均年龄54.32岁，两组间年龄无统计学差异(U值＝213.0，P＝0.261)。两组间卵巢癌期别无统计学差异(U值＝261.5，P＝0.948)。

一)化疗敏感和耐药组的cofilin1表达的差异比较

采用等级资料的秩和检验比较化疗敏感组和耐药组患者的总cofilin1表达量无显著性差异，结果显示统计量U值＝263.6，P值＝0.991>0.05，说明化疗敏感组与耐药组的总cofilin1表达量之间无显著性差异，见图32，表11，13。

二)化疗敏感和耐药组的磷酸化cofilin1表达的差异比较

采用等级资料的秩和检验比较化疗敏感组和耐药组患者的磷酸化cofilin1表达量有无显著性差异，结果显示统计量U值＝157.5，P值＝0.014<0.05，说明化疗敏感组与耐药组的磷酸化cofilin1表达量之间存在显著性差异，化疗耐药组的磷酸化cofilin1表达量高于敏感组，见图33，表12，14。

(三)结论：

通过对24例化疗敏感患者与22例耐药患者的卵巢癌组织免疫组化染色研究，结果显示，两组的总cofi1in1表达无显著性差异(P＝0.991)，提示耐药性与总cofilin1无关；而磷酸化cofilin1的表达存在显著性差异(P＝0.014)，提示cofilin1在卵巢癌组织内可能通过以磷酸化的形式发挥耐药作用。

表1 引物序列、目的片段长度及退火温度。

表2 SKOV3和紫杉醇耐药细胞IC50浓度。

 

细胞	IC50(uM)	耐药指数(RI)
			SKOV3	1.02±0.35	1
SKOV3/TR2500	328.83±58.60	261.98±32.89
			SKOV3/TR30	757.46±80.85	622.76±71.37

表3 7天(d)细胞生长情况(表内数值为细胞数×10³/ml)，Td为细胞株群体倍增时间(小时)。

 

天数	d0	d1	d2	d3	d4	d5	d6	Td(h)
									SKOV3	1.75	2.38	5.58	7.5	13.3	23.16	34.54	27.49±4.21
SK-TR30	0.50	1.58	2.83	5.83	12	15	17	32.98±4.05
									SK-TR2500	0.56	0.5	0.58	1.02	1.29	1.46	1.74	93.23±14.01

表4 SKOV3及耐药细胞的细胞周期分布。

 

参数	SKOV3	SKOV3/TR2500	SKOV3/TR25
				G0/G1(％)	46.15±3.26	65.04±4.01**	59.03±2.52**
S(％)	40.30±2.68	23.31±1.85**	26.44±2.52**
				G2/M(％)	13.55±0.59	11.65±0.70*	14.53±1.26

(*P<0.05，**P<0.01与SKOV3相比)

表5 耐药相关基因在耐药与敏感细胞之间的表达比。

(*：p<0.05，**p<0.01)

表6 经MALDI-TOF-MS鉴定在耐药细胞中表达上调的蛋白质。

 

序号	名称	蛋白序列号	分子量	等电	覆盖率	评分	功能	细胞系
									69	Cofilin 1	gi|5031635	18491	8.26	51％	132	细胞骨架	SK-TR30SK-TR2500A2780-TR
67	Destrin	gi|5802966	18493	8.51	32％	65	细胞骨架	SK-TR30SK-TR2500A2780-TR
									80	Villin2	gi|21614499	69199	5.94	43％	115	细胞骨架	A2780-TR
81	T-复合物蛋白1，γ亚基(TCP-1)	gi|20455521	60364	6.46	49％	127	细胞骨架	A2780-TR
									28	热休克蛋白27	gi|54696638	22768	5.98	89％	204	侣伴蛋白	SK-TR30SK-TR2500
27	Prohibitin	gi|46360168	29802	5.57	67％	140	侣伴蛋白	SK-TR30SK-TR2500
									79	Lasp-1	gi|5453710	29786	6.11	73％	195	侣伴蛋白	A2780-TR
26	蛋白酶体亚基，α型，1	gi|30582133	29579	6.15	42％	101	催化性蛋白	SK-TR30SK-TR2500
									16	ATP合成酶D链，线粒体	gi|23273230	18348	5.22	59％	143	催化性蛋白	SK-TR2500
71	超氧化物歧化酶2，线粒体(SOD2)	gi|10835187	24735	8.35	68％	133	氧化还原调节	SK-TR30SK-TR2500
									18	Stathmin1	gi|15680064	17161	5.77	42％	101	信号传导	SK-TR2500
22	蛋白质二硫化物异构酶(EC5.3.4.1)ER60前体	gi|2245365	56748	5.91	53％	140	代谢酶	SK-TR30

表7 经MALDI-TOF-MS鉴定在耐药细胞中表达下调的蛋白质。

 

序号	名称	蛋白序列号	分子量	等电	覆盖率	评分	功能	细胞系
									25	Annexin III	gi|1421662	36222	5.63	57％	157	蛋白质转运	SK-TR30SK-TR2500
12	Annexin IV	gi|1703319	35729	5.85	58％	86	蛋白质转运	SK-TR30SK-TR2500
									9	Annexin I	gi|404271	38559	6.64	63％	199	蛋白转运	SK-TR30
55	peroxiredoxin 6	gi|4758638	24888	6.02	52％	131	氧化还原调节	SK-TR30SK-TR2500

表8 pcDNA-cof和pcDNA-antisense-cof转染细胞后紫杉醇耐药性的改变。SKPC、A-PC、SKTR30-PC、SKTR2500-PC、ATR-PC为转染pcDNA3.1(+)的对照细胞；SK-COF、A-COF分别为转染pcDNA-cof的SKOV3和A2780细胞；SKTR30-ACOF、SKTR2500-ACOF、ATR-ACOF分别为转染pcDNA-antisense-cof的SK-TR30，SK-TR2500，A2780-TR细胞。

(*p<0.05，**p<0.01)

表9：24例卵巢癌化疗敏感组织标本的相应患者临床资料。

 

编号	年龄	组织类型	分期
				S1	54	内膜样癌	Ic
S2	48	内膜样癌	Ic
				S3	62	内膜样癌	Ic
S4	39	内膜样癌	IIc
				S5	49	内膜样癌	IIc
S6	40	浆乳癌	IIIc
				S7	63	浆乳癌	IIIc
S8	49	浆乳癌	IIIc
				S9	63	浆乳癌	IIIc
S10	43	浆乳癌	IIIc
				S11	61	浆乳癌	IIIc
S12	51	浆乳癌	IIIc
				S13	53	浆乳癌	IIIc
S14	46	浆乳癌	IIIc
				S15	47	浆乳癌	IIIc
S16	45	浆乳癌	IIIc
				S17	57	浆乳癌	IIIc
S18	52	内膜样癌	IIIc
				S19	54	内膜样癌	IIIc
S20	41	腺癌	IIIc
				S21	50	移行细胞癌	IIIc
S22	57	透明细胞癌	IIIc
				S23	52	透明细胞癌	IIIc
S24	51	透明细胞癌	IV

表10：22例卵巢癌化疗耐药组织标本的相应患者临床资料。

 

编号	年龄	组织类型	分期
				R1	48	浆乳癌	IIa
R2	57	浆乳癌	IIc
				R3	57	浆乳癌	IIc
R4	52	浆乳癌	IIc
				R5	50	浆乳癌	IIc
R6	46	浆乳癌	IIc
				R7	65	浆乳癌	IIc
R8	40	腺癌	IIIb
				R9	67	浆乳癌	IIIb
R10	75	浆乳癌	IIIc
				R11	48	浆乳癌	IIIc
R12	68	浆乳癌	IIIc
				R13	48	浆乳癌	IIIc
R14	52	子宫内膜癌	IIIc
				R15	53	子宫内膜癌	IIIc
R16	59	透明细胞癌	IIIc
				R17	52	腺癌	IIIc
R18	52	移行细胞癌	IIIc
				R19	56	移行细胞癌	IIIc
R20	49	浆乳癌	IV
				R21	51	浆乳癌	IV
R22	50	浆乳癌	IV

表11：卵巢癌化疗敏感组标本的cofilin1和磷酸化cofilin1免疫组化染色结果。

 

编号	Cofilin1	磷酸化cofilin1
			S1	0	1+
S2	0	1+
			S3	0	1+
S4	2+	1+
			S5	2+	1+
S6	2+	2+
			S7	2+	2+
S8	2+	2+
			S9	2+	2+
S10	2+	2+
			S11	2+	2+

 

S12	2+	2+
			S13	2+	2+
S14	3+	2+
			S15	3+	3+
S16	3+	3+
			S17	3+	3+
S18	3+	3+
			S19	3+	4+
S20	3+	4+
			S21	4+	4+
S22	4+	4+
			S23	4+	4+
S24	4+	4+

表12：卵巢癌化疗耐药组标本的cofilin1和磷酸化cofilin1免疫组化染色结果。

 

编号	Cofilin1	磷酸化cofilin1
			R1	1+	1+
R2	1+	2+
			R3	2+	2+
R4	2+	2+
			R5	2+	2+
R6	2+	3+
			R7	2+	3+
R8	2+	3+
			R9	2+	3+
R10	2+	3+
			R11	2+	3+
R12	2+	3+
			R13	2+	4+
R14	3+	4+
			R15	3+	4+
R16	3+	4+
			R17	3+	4+
R18	3+	4+
			R19	4+	4+
R20	4+	4+
			R21	4+	4+
R22	4+	4+

表13：化疗敏感组与耐药组标本的cofi1in1表达结果比较。

 

Cofilin1表达量	敏感(例)	耐药(例)
			—	3	0
1+	0	2
			2+	10	11
3+	7	5
			4+	4	4
总计	24	22

表14：化疗敏感组与耐药组标本的磷酸化cofilin1表达结果比较。

 

磷酸化cofilin1表达	敏感(例)	耐药(例)
			—	0	0
1+	5	1
			2+	9	4
3+	4	7
			4+	6	10
总计	24	22

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>Cofilin 1与癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性

<130>IDC060072

<160>22

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<213>人

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<221>CDS

<222>(1)..(501)

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<213>人

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Claims (8)

1.能够降低癌细胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达的药剂在制备用于降低癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性的药物中的用途，其中所述药物用于体外降低癌细胞的耐药性或者用于体内降低癌症患者的耐药性，其中所述癌症是卵巢癌。

2.权利要求1的用途，其中所述药剂选自：抑制cofilin 1表达的反义核苷酸或者能够特异切割cofilin1 mRNA的核酶。

3.一种筛选能够降低癌症对紫杉烷类化疗药物的耐药性的药剂的方法，其中所述癌症是卵巢癌，所述方法包括步骤：提供候选药剂；使所述候选药剂与癌细胞接触；检测所述癌细胞中的cofilin1或磷酸化cofilin 1的表达；将所检测到的表达量与预定阈值比较。

4.能够检测癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达量的药剂在制备用于预测或预后紫杉烷类化疗药物在癌症患者中的治疗效果的检测或诊断试剂盒中的用途，其中所述癌症是卵巢癌。

5.能够检测癌细胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表达量的药剂在制备用于检测或诊断癌细胞或癌症患者的紫杉烷类化疗药物耐药性的检测或诊断试剂盒中的用途，其中所述癌症是卵巢癌。

6.权利要求4或5的用途，其中所述药剂为：特异结合cofilin1和/或磷酸化cofilin 1蛋白质的抗体或者抗体片断、或者特异于cofilin 1基因的杂交探针或引物。

7.权利要求1的用途、权利要求3的方法、权利要求4的用途、或权利要求5的用途，其中所述癌症是上皮样卵巢癌。

8.权利要求1的用途、权利要求3的方法、权利要求4的用途、或权利要求5的用途，其中所述紫杉烷类化疗药物是紫杉醇。

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