ES2587055T3

ES2587055T3 - Una nueva molécula asociada a tumores humanos metastásicos, métodos para detectar tanto el gen activado como la proteína y para interferir con la expresión génica

Info

Publication number: ES2587055T3
Application number: ES09703627.1T
Authority: ES
Inventors: Francesco Lozupone; Stefano Fais
Original assignee: Hansabiomed OU
Current assignee: Hansabiomed OU
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2009-01-26
Publication date: 2016-10-20
Anticipated expiration: 2029-01-26
Also published as: RU2546000C2; JP5752419B2; EP2245465B1; RU2010135525A; US20090191222A1; BRPI0906681A2; EP2245465A1; CN102016587B; CA2713193A1; JP2011511625A; CN102016587A; WO2009092385A1; AU2009207926A1; PL2245465T3; US8097407B2; AU2009207926B2; CA2713193C; MX2010008163A

Abstract

Fragmento de polipéptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15.

Description

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DESCRIPCION

Una nueva molecula asociada a tumores humanos metastasicos, metodos para detectar tanto el gen activado como la protema y para interferir con la expresion genica

Campo tecnico

La presente invencion se refiere generalmente al campo de la investigacion del cancer y mas especfficamente a la identificacion de nuevos genes y protefnas relacionados con tumorigenesis y metastasis. La invencion se refiere a un nuevo marcador de malignidad. La invencion se refiere ademas al campo de terapia genica.

Antecedentes de la tecnica

En 2005, de los 58 millones de muertes en todo el mundo 7,6 millones de personas murieron de cancer. Basandose en proyecciones, las muertes por cancer seguiran aumentando con una estimacion de 9 millones de personas que moriran de cancer en 2015, y 11,4 millones que moriran en 2030 (datos de la OMS). El tratamiento del cancer puede implicar cirugfa, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, o alguna combinacion de las mismas, pero las tasas de supervivencia actuales para la mayorfa de los pacientes con cancer son muy bajas. Segun la Organizacion Mundial de la Salud, un tercio de la carga de cancer podrfa curarse si se detecta pronto y se trata adecuadamente. La investigacion patologica proporciona medios para establecer el diagnostico de la mayorfa de los tumores solidos. Aunque muchos casos pueden clasificarse de manera fiable con los criterios patologicos actuales, existe un subconjunto significativo de casos en los que no puede alcanzarse un consenso incluso entre patologos expertos. La ambiguedad de diagnostico tiene consecuencias adversas significativas para los pacientes. La clasificacion erronea de un tumor como benigno puede ser mortal, y diagnosticar una lesion benigna como maligna puede dar como resultado una morbilidad significativa. Actualmente no existe un metodo para resolver definitivamente estas ambiguedades. Por tanto, existe una necesidad clara de una prueba de diagnostico que pueda reducir estas incertidumbres.

Fagocitosis es el proceso mediante el cual las celulas interiorizan partfculas grandes (normalmente 0,1 mm de diametro), tales como bacteria o restos celulares. La etapa temprana de fagocitosis puede dividirse provisionalmente en etapas distintivas: union de la membrana celular alrededor de la partfcula, formacion del fagosoma e internalizacion del fagosoma. En el proceso de la formacion del fagosoma e internalizacion, se ha propuesto que el citoesqueleto de actina dirige estas etapas para permitir la absorcion.

Se han identificado celulas fagocfticas en tumores malignos desde hace un siglo, y, mas recientemente, se han detectado celulas con comportamiento fagocftico (tambien definido como comportamiento canfbal) en tumores de diferente histologfa, tal como carcinoma de celulas de avena del pulmon, cancer de mama, cancer de vejiga, meduloblastoma, adenocarcinomas gastricos, melanoma y carcinoma de celulas escamosas de la piel.

Recientemente se ha observado que la fagocitosis es un caracter de celulas de melanoma metastasico que pueden fagocitar celulas apoptoticas, levaduras tenidas con perlas de plastico y linfocitos vivos que presentan una maquinaria fagocftica eficaz responsable de una actividad de tipo macrofago, mientras que celulas de melanoma derivadas de lesiones primarias no presentaron ninguna actividad canfbal o fagocftica. Ademas, pueden detectarse celulas canfbales en el 100% de las lesiones de melanoma metastasico (Lugini et al., 2004; Lugini et al., 2006).

Una de las caracterfsticas principales de celulas canfbales es una acidez aumentada de vesfculas de tipo lisosomico y una sobreexpresion de catepsina B, una enzima proteolftica que se notifica que esta implicada en la invasion tumoral y metastasis (Sloane et al., 1981). A diferencia de macrofagos de tipo fagocito profesionales, las celulas tumorales canfbales no utilizan estructuras de tipo pliegue o cualquier movimiento por pseudopodios. En cambio, la materia viva o muerta que toca la membrana externa de la celula tumoral se somete a endocitosis inmediatamente y se digiere a traves de un tipo de mecanismo de arenas movedizas que parece no implicar ningun receptor especffico.

Estos hallazgos han llevado a especular que las celulas canfbales se alimentan de otras celulas, quizas sin una necesidad particular de suministro de nutrientes derivado de la sangre, pero tambien que el canibalismo de linfocitos por celulas tumorales puede representar un mecanismo rudimentario de escape inmunitario tumoral. Ademas, estos hallazgos conducen a una interpretacion novedosa, revolucionaria de que celulas cancerosas, en su habito de usar otras celulas para alimentarse, pueden comportarse como eucariotas unicelulares cuyo unico proposito es sobrevivir en una lucha continua contra otras celulas y el entorno desfavorable. Esta teorfa conduce ademas a especular que amebas y celulas metastasicas pueden compartir el mismo armazon con los mismos elementos reguladores permitiendo su supervivencia en condiciones microambientales adversas. Sin embargo, hasta ahora nunca se han asociado genes especfficamente con el comportamiento canfbal de celulas cancerosas.

El moho mucilaginoso celular Dictyostelium discoideum se ha usado previamente como organismo modelo para estudiar la fagocitosis. Los mecanismos implicados en la fagocitosis por celulas de Dictyostelium son muy similares a los usados por fagocitos de mamffero, e implican el citoesqueleto de actina y RacF1, un miembro de la familia Rho

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de proteinas de union a GTP. Sin embargo, nunca se han identificado proteinas especificas asociadas con fagocitosis en mamiferos.

Recientemente se ha encontrado que la proteina codificada por el gen PHGlA estaba implicada en adhesion celular y fagocitosis en la ameba Dictyostelium discoideum. Esta proteina pertenece a la superfamilia TM9 y los genes que codifican para proteinas TM9 pueden identificarse inequivocamente en genomas eucariotas. La familia incluye muchos miembros en organismos desde levaduras hasta plantas y seres humanos. Para mencionar algun ejemplo, existen tres miembros de esta familia en Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium amoebae y moscas Drosophila y cuatro en seres humanos y ratones. Todos ellos presentan una estructura global similar, con un dominio luminal potencial bastante variable seguido por un dominio de membrana mas conservado y nueve o diez dominios transmembrana putativos.

Sumario de la invencion

La materia de la invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Basandose en la teoria de que celulas cancerosas usan otras celulas para alimentarse y se comportan como eucariotas unicelulares y posiblemente comparten el mismo armazon con los mismos elementos reguladores que las amebas, se comparo el gen PHGlA con el genoma humano. Se han secuenciado completamente tres homologos de phgl en seres humanos (TM9SF4, U81006 y U94831), y se encontro que el homologo mas cercano de phgl de Dictyostelium dicoideum en seres humanos es tm9sf4 (otros nombres: KIAA0255, dJ836N17.2) localizado en el cromosoma 20ql 1.21. Incluso si este gen esta completamente secuenciado, su funcion o producto de expresion del mismo nunca se ha caracterizado.

Por consiguiente, se ha estudiado la funcion y la expresion de la proteina codificada por tm9sf4 en mas detalle. En esta divulgacion, se muestra la funcion de la proteina y se proporcionan varias aplicaciones.

Esta divulgacion muestra que la proteina esta altamente expresada en celulas malignas. Observaciones en varias lineas celulares de melanoma derivadas de pacientes muestran que TM9SF4 es un marcador de malignidad, ya que esta proteina es indetectable en las lineas celulares derivadas de lesiones primarias. Ademas, esta proteina esta implicada en el comportamiento fagocitico de celulas de melanoma metastasico, ya que el silenciamiento del gen que codifica para esta proteina inhibe fuertemente el comportamiento fagocitico de celulas metastasicas. Basandose en estas observaciones se ha nombrado esta proteina como TUCAP-I (Tumor associated cannibal protein 1, proteina canibal asociada a tumores 1). El gen que codifica para esta proteina por consiguiente se nombra gen tucap-1.

Esta invencion aborda la necesidad de una prueba rapida para detectar celulas malignas y diagnosticar melanoma y otros tumores. Por consiguiente, esta divulgacion proporciona anticuerpos, cebadores, oligopeptidos y polipeptidos utiles para la deteccion, el analisis y los efectos terapeuticos potenciales de TUCAP-I.

Tambien se describen polinucleotidos que corresponden o son complementarios a todo o parte del gen tucap-1, y polinucleotidos u oligonucleotidos, que se hibridan con el gen tucap-1, los ARNm, o a polinucleotidos que codifican para TUCAP-1. Se proporcionan moleculas de ADN recombinante que contiene polinucleotidos de TUCAP-1, celulas transformadas o transducidas con tales moleculas y sistemas de huesped-vector para la expresion de productos del gen tucap-1. La divulgacion ademas proporciona proteina TUCAP-1 y fragmentos de polipeptido de la misma.

Ademas se describen anticuerpos que se unen a proteinas TUCAP-1 y fragmentos de polipeptido de las mismas, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamiferos, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable, y anticuerpos conjugados con radionucleotidos, toxinas u otras composiciones terapeuticas. La invencion describe ademas metodos para detectar la presencia de polinucleotidos y proteinas TUCAP-1 en diversas muestras biologicas, asi como metodos para identificar celulas que expresan TUCAP-1.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Estructura molecular de la proteina TM9SF4/TUCAP-1.

(A) Perfil de hidroterapia de la secuencia de proteina TUCAP-1. Las regiones hidrofobas se indican encima de la linea mediante valores positivos. La numeracion de aminoacidos se indica en el eje de abscisas. El tramo hidrofilo en la region N-terminal esta seguido por nueve regiones hidrofobas. El analisis se realizo segun Claros y von Heijneb usando el programa de prediccion TopPred.

(B) Representacion grafica de la estructura secundaria de TUCAP-1 segun el servidor de prediccion TopPred.

Figura 2. Deteccion de transcritos de TM9SF4/TUCAP-1 y caracterizacion de anticuerpos contra TUCAP-1.

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(A) Analisis mediante RT-PCR de TUCAP-1 (panel superior) y GAPDH (panel inferior) en cinco lineas celulares de melanoma metastasico (MM1-5) y cinco de melanoma primario (PM1-5) recientemente establecidas in vitro a partir de lesion metastasica, y celulas de sangre periferica de dos donantes diferentes (PBL1 -2); M marcador de tamano.

(B) Inmunotransferencias de tipo Western de 6-histidina o TUCAP-1 en el peptido TUCAP-1 marcado con seis- histidina usado para inmunizar ratones y en lisados bacterianos sin inducir. Se cargaron cantidades iguales de proteina purificada y lisado bacteriano en geles reductores y se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo contra 6-His o antisueros de ratones contra TUCAP-1. Las proteinas se visualizaron usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se revelaron con el sistema ECL (Pierce).

(C) Inmunotransferencia de tipo Western para GFP-TUCAP-1 y GAPDH sobre fracciones solubles en Triton (carril 1) e insolubles en Triton (carril 2) de celulas MM1 transfectadas con GFP-TUCAP-1 (GFP-Tuc), y fracciones solubles e insolubles en Triton de celulas MM1 no transfectadas (carriles 3-4). M marcador de tamano. Las proteinas se visualizaron usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se revelaron con ECL (Pierce). Como marcadores de peso molecular se usaron patrones pretenidos RainbowTM (Amersham RU).

Figura 3. Analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de TUCAP-1.

Inmunotransferencia de tipo Western para la deteccion de TUCAP-1 sobre celulas MM2 transfectadas con GFP-Tuc, cuatro lineas celulares de melanoma metastasico (MM2-5) y fibroblastos de piel humanos (HSC) CCD-1064SK. La cantidad de carga se controlo mediante la inmunodeteccion de actina. Las proteinas se visualizaron usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y el sistema DAB (DAKO, Dinamarca) como cromogeno. Se usaron patrones pretenidos RainbowTM (AmershamUK) como marcadores de peso molecular.

Figura 4. Analisis inmunocitoquimico e inmunohistoquimico de TUCAP-1. La figura 4A es igual en blanco y negro.

Analisis inmunocitoquimico de suero de ratones preinmunes de (A) celulas MM2; (B) linfocitos de sangre periferica;

(C) macrofagos diferenciados in vitro.

Analisis inmunocitoquimico para TUCAP-1 de: (D) celulas M2; (E) celulas de sangre periferica; (F) macrofagos.

Analisis inmunohistoquimico de tejidos de melanoma maligno tenidos con: (G) suero de raton preinmune; (H) suero inmune frente a TUcAp-1 ; y (I) anti-GP100.

Analisis inmunohistoquimico de piel sana tenida con: (J) suero de raton preinmune, (K) Suero inmune frente a TUCAP-1, y (L) anticuerpo anti-ezrina. Aumento 10X.

Figura 5. Localizacion subcelular de TUCAP-1/ - I. La figura 5A es igual en blanco y negro.

(A) Analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de fracciones subcelulares de inmunprecipitados de TUCAP-1 a partir de lisados de MM2 totales. M marcador de tamano, TE extractos totales.

(B) Analisis de tincion doble mediante inmunofluorescencia (IF) de TUCAP-1 (verde) y Rab5 (rojo).

(C) Analisis de tincion doble mediante IF de TUCAP-1 (verde) y Lamp-1 (rojo).

(D) Analisis de tincion doble mediante IF de TUCAP-1 (verde) y mitocondria tenida con Mitotracker (rojo). Las areas amarillas/naranjas indican colocalizacion. Los nucleos se tineron con Hoechst 33258. Aumento 100X.

Figura 6. Localizacion subcelular de TUCAP-1 - II. La figura 6A es igual en blanco y negro. Analisis de tincion doble mediante inmunofluorescencia (IF) de TUCAP-1 (verde) y EEA1 (rojo) en celulas MM2. Las areas amarillas/naranjas indican colocalizacion. Los nucleos se tineron con Hoechst 33258. Aumento 100X.

Figura 7. Deteccion de TUCAP-1 en celulas canibales. La figura 7A es igual en blanco y negro.

(A) Deteccion y localizacion de TUCAP-1 en celulas de melanoma metastasico MM1 cocultivadas con linfocitos vivos. Analisis mediante IVM de TUCAP-1 (verde). La imagen resalta que TUCAP-1 es detectable exclusivamente en celulas de melanoma.

(B) Analisis de doble fluorescencia de TUCAP-1 (verde) y EEA-1 (rojo) en celulas de melanoma metastasico MM1 cocultivadas con linfocitos vivos. Las areas amarillas/naranjas indican colocalizacion. Los nucleos se tinen con Hoechst 33258.

Figura 8. Analisis mediante FACS de la expresion de TUCAP-1.

Analisis mediante FACS de la expresion de TUCAP-1 en celulas MM2 no transfectadas, ARNip y ARNip de TUCAP-

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1 (ARNip de TM9SF4) desordenados en celulas MM2 transfectadas 48 horas despues de la transfeccion.

Figura 9. Analisis funcional de TM9SF4/TUCAP-1.

(A) Analisis mediante FACS de la actividad fagocitica de ARNip (SC-ARNip) o ARNip de TUCAP-1 (ARNip de TM9SF4) desordenados en celulas MM2 transfectadas. Gris: celulas control no tenidas; rojo: celulas transfectadas con ARNip desordenado control negativo; verde: celulas transfectadas con ARNip de TM9SF4.

(B) Analisis mediante FACS de la actividad canibal de SC-ARNip o ARNip de TM9SF4 en celulas MM2 transfectadas incubadas 18 horas con linfocitos tenidos con DHR123. Gris: celulas control no tenidas; rojo: celulas transfectadas con SC-ARNip; verde: celulas transfectadas con ARNip de TM9SF4. Para excluir linfocitos tenidos con DHR123 no ingeridos con celulas de melanoma, exclusivamente se evaluo la emision de fluorescencia de celulas de melanoma.

(C) Analisis mediante FACS de tincion LysoTracker DND-26 de celulas MM2 transfectadas con SC-ARNip o ARNip de TM9SF4. Gris: celulas control no tenidas; rojo: celulas transfectadas con SC-ARNip; verde: celulas transfectadas con ARNip de TM9SF4.

Figura. 10. La sobreexpresion de TUCAP-1 potencia la invasion celular a traves de Matrigel. La figura 10A es igual en blanco y negro. Micrografia de fase de celulas de melanoma WM743 que invaden en comparacion con celulas de melanoma TUCAP-1 WM743 (TWM) de longitud completa marcadas con GFP. Las celulas que invaden se fijaron en formaldehido y se tineron con violeta cristal. La imagen muestra claramente que el numero de celulas que invaden era significativamente mayor para TWM, con una media de 25 celulas para no transfectadas frente a una media de 132 celulas para TWM transfectadas con TUCAP-1.

Descripcion de la invencion

TUCAP-1/TM9SF4 (nombre completo oficial segun el comite oficial de nomenclatura HUGO: miembro 4 de la superfamilia de proteinas transmembrana 9) pertenece a la superfamilia de proteinas transmembrana 9 (TM9SF), una familia de proteinas altamente conservada caracterizada por la presencia de un gran dominio N-terminal extracelular variable y de nueve a diez dominios transmembrana supuestos. Sin embargo, nunca se ha descrito la funcion y la localizacion de TM9SF4 en celulas humanas. En esta divulgacion, se localiza la expresion de proteina y se proporcionan aplicaciones utiles y novedosas para esta proteina. Esta divulgacion identifica la proteina como una oncoproteina novedosa y muestra que la proteina se expresa en celulas tumorales malignas mientras que es indetectable en una variedad de celulas y tejidos sanos. Esta divulgacion tambien muestra la estructura de la proteina y por analogia con otras proteinas muestra que la proteina puede estar implicada en la regulacion del pH de vesiculas intracelulares. A lo largo de esta divulgacion se nombra a la proteina TUCAP-1 y el gen que codifica para la proteina por consiguiente se nombra tucap-1.

La tabla 1 a continuacion muestra los parametros fisicoquimicos de la proteina TUCAP-1

Calculo mediante ProtParam de parametros fisicoquimicos de Tucap-1:

Numero de aminoacidos:: 625

Peso molecular:: 72541,3

pI teorico:: 6,22

Coeficientes de extincion:: 132880 Abs al 0,1% (=1 g/l) 1,832, asumiendo que TODOS los residuos de Cys aparecen como medias cistinas

: 132130 Abs al 0,1% (=1 g/l) 1,821, asumiendo que NINGUN residuo de Cys aparece como media cistina

Semivida estimada:: 30 horas (mamiferos)

El analisis de hidroterapia de TUCAP-I a traves del servidor de prediccion TopPred revelo una porcion amino- terminal mayormente hidrofila, que se extiende hasta el aminoacido 262, mientras que la porcion restante de la proteina es extremadamente hidrofoba y contiene nueve dominios transmembrana potenciales (figura IA). Basandose en esta estructura predicha puede plantearse una hipotesis con alta confianza de que TUCAP-I es una proteina de membrana integral tal como se muestra en la figura IB. El hallazgo de que existe una homologia bastante alta entre TUCAP-I y PHG1 (el 45% que aumenta hasta el 63% si se considera la alineacion positiva del programa para proteinas Blast de NCBI) condujo a una hipotesis novedosa de que TUCAP-I puede tener un papel en la actividad canibal de celulas de melanoma metastasico humanas.

Existen polinucleotidos descritos que corresponden o son complementarios a todo o parte del gen tucap-1, los ARNm, y/o secuencias codificantes, preferiblemente en forma aislada, incluyendo polinucleotidos que codifican para proteinas TUCAP-1 y fragmentos de los mismos, ADN, ARN, hibrido de ADN/ARN, y moleculas relacionadas,

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oligonucleotidos complementarios al gen tucap-1 o secuencias de ARNm o partes de los mismos, y polinucleotidos o oligonucleotidos que se hibridan con los genes TUCAP-1, los ARNm, o a polinucleotidos que codifican para TUCAP- 1.

Un “anticuerpo” que es una molecula de anticuerpo completa o fragmento de la misma que reconoce (o puede unirse a) “secuencias especificas” de la proteina TUCAP-1, que es su antigeno se define en las reivindicaciones adjuntas. Anticuerpo puede ser o bien un anticuerpo policlonal o bien un anticuerpo monoclonal. En esta realizacion, la proteina TUCAP-1 es un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 1, y las secuencias especificas son polipeptidos que tienen una secuencia de aminoacidos que contiene delecion, sustitucion o adicion de uno o mas aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma. El anticuerpo abarca mutantes de anticuerpo. Un “mutante de anticuerpo” es un mutante en el que uno o mas residuos de aminoacido en el anticuerpo se han modificado con respecto al original.

Los inhibidores de TUCAP-1 pueden ser secuencias de polinucleotido que son sustancialmente complementarias a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o parte de la misma, y secuencias de oligonucleotido sustancialmente complementarias a un fragmento de SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 se dan a conocer por el documento EP 1104771.

Metodos para el tratamiento del cancer en un paciente humano comprenden la etapa de administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un inhibidor de TUCAP-1 seleccionado de un acido nucleico aislado que es sustancialmente complementario a SEQ ID NO: 2 o parte de la misma, o complementario al ARNm de TM9SF4, para la inhibicion del caracter fagocitico de una celula tumoral. Anticuerpos y fragmentos que se unen especificamente a la proteina TUCAP-1 pueden usarse para tratar canceres. La invencion incluye el uso de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que estan fusionados a otros restos que pueden tener un efecto citotoxico sobre el cancer.

Otra realizacion de esta invencion son lineas celulares que producen anticuerpos monoclonales frente a proteina TUCAP-1 o fragmentos de la misma.

Pueden proporcionarse moleculas de ADN o ARN recombinante que contienen secuencia de TUCAP-1 de longitud completa de tipo natural o mutada, o mutantes de delecion de TUCAP-1, incluyendo pero sin limitarse a fagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, YAC, BAC, asi como diversos vectores de expresion virales y no virales bien conocidos en la tecnica, y celulas transformadas o transfectadas con tales moleculas de ADN o ARN recombinantes. Usando estos vectores de expresion, preferiblemente puede expresarse TUCAP-1 en varias lineas celulares de tumor maligno. Se prefieren sistemas de huesped-vector que son utiles para la produccion de una proteina TUCAP-1 o fragmento de la misma. Tales sistemas de huesped-vector pueden emplearse: i) para estudiar las propiedades funcionales de TUCAP-1 y mutaciones de TUCAP-1; ii) como modelo para desarrollar un protocolo de terapia genica basandose en la utilizacion de vectores de silenciamiento de TUCAP-1 y vectores que expresan mutantes de TUCAP-1.

Esta invencion proporciona una herramienta unica para medir, estudiar y detectar TUCAP-1, como marcador de malignidad de muchos tipos de cancer tal como se define por las reivindicaciones adjuntas. Ademas, esta invencion introduce una herramienta nueva para oncologos clinicos en el manejo y el seguimiento de pacientes con cancer. Ademas, peptidos de otras moleculas que pueden interferir en la expresion o actuar como agentes de bloqueo de TUCAP-1 estan dentro del alcance de esta invencion como compuestos antineoplasicos.

Aun otra realizacion preferida de esta invencion es un kit para detectar TUCAP-1 a partir de muestras de tejido y fluidos corporales de pacientes con tumores como una herramienta de diagnostico y/o pronostico tal como un kit de deteccion, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas. Tal kit comprende: a) anticuerpos anti-TUCAP-1; b) un control positivo que consiste en la proteina TUCAP-1 purificada, y los tampones necesarios.

La invencion se describe ahora por medio de ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la invencion. El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo

EJEMPLO 1

Los transcritos de Tucap-1 y proteina TUCAP-1 pueden detectarse en celulas de melanoma maligno humano, pero no en celulas de melanoma primario, en celulas mononucleares de sangre periferica o en celulas cutaneas sanas.

Cultivo celular. Se derivaron lineas celulares humanas de melanoma primario y metastasico, respectivamente, de lesiones de tumor primario o metastasico de pacientes sometidos a reseccion quirurgica en el Istituto Nazionale dei Tumori, Milan, Italia. Todas las celulas empleadas en el estudio actual se denominaron PM (melanoma primario) o MM (melanoma metastasico), seguido por un numero progresivo. Se purificaron celulas mononucleares de sangre

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periferica (PBMC) humanas mediante gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) de capas leucociticas de donantes sanos. Se separaron monocitos de PBMC usando microperlas Miltenyi marcadas con CD14 segun las indicaciones del fabricante y se dejo que se diferenciaran durante 2 semanas a 37°C en RPMI 1640 mas FCS al 15%. Se obtuvieron linfocitos de sangre periferica (PBL) restantes tras la ablacion de monocitos mediada por perlas con CD 14. Se sembraron todas las celulas en RPMI 1640 complementado con penicilina 100 Ul/ml, estreptomicina 100 Ag/ml, FCS al 10% en un entorno de CO2 al 5% a 37°C. (Todos los reactivos se adquirieron de Cambrex).

Analisis mediante PCR. Se evaluo la expresion de transcritos de Tucap-1 mediante rt-PCR en diversas lineas celulares de melanoma primario y metastasico obtenidas de melanomas de pacientes sometidos a reseccion quirurgica en el Instituto Nazionale Tumori, Milan, en comparacion con linfocitos de sangre periferica (PBL). Se obtuvo ARN total de las celulas mediante el metodo RNAzol (Invitrogen) y se usaron moldes de ARN para la amplificacion mediante RT-PCR. Los cebadores para la deteccion de TUCAP-1 fueron:

tgtgtgaaacaagcgccttc (SEQ ID NO: 3), y

atgaggtggacgtagtagt (SEQ ID NO: 4).

Estos cebadores amplifican un fragmento de 349 pares de bases.

Los cebadores usados para dirigir la sintesis del dominio N-terminal marcado con cola de His de TUCAP-1 fueron: gaattcatgtgtgaaacaagcgcctt (SEQ ID NO: 5) y gtcgacagaaaaccagtggatctg (SEQ ID NO: 6).

Los cebadores para detectar GAPDH fueron: ccatggagaaggctgggg (SEQ ID NO: 7) y caaagttgtcatggatgacc (SEQ ID NO: 8).

Clonacion de TUCAP 1 y expresion de proteina de fusion de TUCAP 1 en celulas de melanoma humano:

Se clonaron productos de PCR en un vector pTopo (Invitrogen) y despues se escindieron con el par de enzimas de restriccion apropiado (EcoRI, SalI) para adquirir un unico fragmento que posteriormente se ligo en el vector pTrcHis2 (Invitrogen). Se purifico la proteina recombinante expresada empleando resina de Ni-NTA-agarosa (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se uso para inmunizar ratones.

Los cebadores que se usaron para dirigir TUCAP-1 de longitud completa marcada con GFP fueron: gaattcatgtgtgaaacaagcg (SEQ ID NO: 9), y gtcgatgtctatcttcacagcata (SEQ ID NO: 10)

Se clonaron productos de PCR en un vector pTopo (Invitrogen) y despues se escindieron con el par de enzimas de restriccion apropiado (EcoRI-SalI) y se ligaron para adquirir un unico fragmento que posteriormente se ligo en el vector pEGFPN1 (Clontech) en los sitios de EcoRI y SalI para producir la proteina de fusion GFP-TUCAP-1. Se transfectaron plasmidos que codificaban para la proteina de fusion GFP-TUCAP-1 en celulas MM1 y MM2 usando el kit de transfeccion Lipofectamine 2000 (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante, obteniendo asi GFP- TUCAP-1.

Celulas MM1 o MM2 (GFP-Tuc). Se evaluo el porcentaje de celulas transfectadas mediante analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia.

Inmunotransferencia de tipo Western e inmunoprecipitacion

Se resuspendieron lisados bacterianos, lisados de celula de melanoma completos y fibroblastos cutaneos sanos CCD-1064SK (SantaCruz) en tampon de muestra de SDS, se desnaturalizaron mediante ebullicion, se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se detectaron proteina marcada con cola de 6xHis, GFP, TUCAP-1 y GAPDH, respectivamente, con AcM anti-6His (Sigma), anticuerpo anti- GFP (clon 1E4 MBL), suero de raton anti-TUCAP-1 y anticuerpo anti-GAPDH (SantaCruz). Se inmunoprecipitaron proteinas TUCAP-1 durante la noche a 4°C en presencia de perlas de proteina A+G-Sepharose (Pierce) a partir de lisados celulares previamente aclarados, usando anticuerpo AcP de conejo anti-TUCAP-1. Se uso suero preinmunitario de conejo como control negativo. Se detecto actina con AcM anti-actina (Sigma).

Con el fin de caracterizar el producto genico de tucap-1, se clono ADNc derivado de celulas MM1 en vectores de

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expresion bacterianos para obtener los primeros 265 aminoacidos de TUCAP-1 fusionados con una cola N-terminal de 6 histidinas (6H-Nt-TUCAP 1) (SEQ ID NO: 11). El analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de proteina recombinante purificada dio como resultado un producto de traduccion de aproximadamente 30 kDa ausente en lisados completos bacterianos de control (control negativo). Por tanto, se empleo peptido recombinante de TUCAP-1 marcado con cola de His como inmunogeno para producir anticuerpos anti-TUCAP-1 en ratones. Se determino la especificidad del antisuero contra TUCAP-1 mediante el analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de 6H-Nt-TUCAP-1 sometido a inmunotransferencia con antisueros de raton anti-6His y TUCAP-1 (figura 2B). Se analizo adicionalmente antisuero de raton contra TUCAP-1 mediante inmunotransferencia de tipo Western con fracciones solubles en Triton e insolubles en Triton de celulas MM1 transfectadas o no transfectadas con una TUCAP-1 de longitud completa marcada con GFP (GFP- TUCAP-1). El anticuerpo anti-GFP revelo un unico producto de traduccion en el intervalo de 100 kDa, mientras que los anticuerpos anti-TUCAP-1 reconocieron TUCAP-1 tanto marcada con GFP como endogena que correspondia a una proteina de 70 kDa detectable en ambas lineas celulares (figura 2C). Resulta interesante que TUCAP-1 estaba mas representada en las fracciones insolubles en Triton (fraccion enriquecida en proteinas del citoesqueleto, negativa para GAPDH), respaldando asi los modelos provisionales que proponen TUCAP-1 como proteina transmembrana. Para respaldar adicionalmente los resultados de PCR, se transfirieron los anticuerpos anti-TUCAP-1 en extractos celulares de cuatro celulas de melanoma metastasico (MM2-MM5), anteriormente analizadas para determinar su comportamiento canibal en comparacion con fibroblastos cutaneos sanos (HSC) y celulas MM2 transfectadas con GFP-TUCAP-1, como control. TUCAP-1 pudo detectarse exclusivamente en celulas de melanoma, mientras que era indetectable en celulas cutaneas (figura 3).

EJEMPLO 2

La inmunohistoquimica muestra TUCAP-1 exclusivamente en celulas de melanoma.

Inmunocitoquimica e inmunohistoquimica. A partir de la inmunocitoquimica, celulas de melanoma y macrofagos, cultivadas sobre portaobjetos de camara de vidrio (Falcon), y PBL, sometidos a citocentrifugacion sobre portaobjetos de vidrio, se fijaron con metanol al 80% durante 10 minutos a 4°C y se tineron para detectar TUCAP-1, suero de raton contra TUCAP-1 o suero de control preinmunitario. Se inmunotineron melanoma maligno y tejido cutaneo normal correspondiente de portaobjetos de matriz de Biomax (Biomax) con suero preinmunitario, para detectar antisuero de raton anti-TUCAP-1. Tambien se tino melanoma para detectar anti-gp100 (Immunotech) mientras que tambien se tino piel normal para detectar anticuerpo anti-ezrina (Sigma). Se visualizaron las proteinas usando el metodo de peroxidasa-antiperoxidasa en una unica tincion (Dako) y se contratineron con hematoxilina de Mayer.

La figura 4 A-C muestra que las lineas celulares MM2 (A), los linfocitos de sangre periferica (B) y los macrofagos diferenciados in vitro (C), eran negativos para suero preinmunitario de raton. De manera que concuerda con los resultados de PCR, las celulas cultivadas con melanoma maligno mostraron una clara tincion positiva para TUCAP-1 (figura 4 D) mientras que PBL (figura 4E) y macrofagos (figura 4 F) fueron negativos para la tincion para TUCAP1. El analisis inmunohistoquimico de tejidos de melanoma maligno en comparacion con piel sana sugirio que TUCAP-1 solo era detectable en tejidos de melanoma (figura 4 H) mientras que era indetectable en piel sana (4K). Como marcadores de control positivo para melanoma y piel normal, se usaron respectivamente GP100 (figura 4I) y ezrina (figura 4L). La tincion con suero de raton preinmunitario siempre fue negativa en ambos tejidos (figura 4G, 4J). Estos resultados proporcionan una clara evidencia de que TUCAP-1 era detectable exclusivamente en celulas de melanoma y por tanto respaldan los resultados del ejemplo 1.

EJEMPLO 3

Ubicacion subcelular de TUCAP-1.

Ademas se realizaron experimentos para analizar la ubicacion intracelular de TUCAP 1.

Fraccionamiento de compartimentos celulares. Se recogieron las celulas y se procesaron segun el protocolo del kit de membrana plasmatica Qproteome (Quiagen) con el fin de obtener fracciones no desnaturalizadas de compartimentos celulares que correspondian a citosol y membranas plasmaticas purificadas. Despues se precipitaron estas ultimas fracciones con acetona y se resuspendieron en tampon de inmunoprecipitacion B (SDS al 0,1%, NP40 al 1%, colato de sodio al 0,5%) con el fin de someterse a inmunoprecipitacion con anticuerpo de conejo anti-TUCAP-1. Se privo sedimento residual del fraccionamiento de compartimentos celulares, que contenia celulas intactas y organulos, de estas primeras mediante centrifugacion y se sometio a extraccion con Triton X-100 con el fin de obtener fracciones solubles e insolubles que se inmunoprecipitaron con anticuerpo de conejo anti-TUCAP-1. Tras la electroforesis de muestras, se sometio la nitrocelulosa a transferencia con anticuerpo de raton anti-TUCAP-1.

Analisis de inmunofluorescencia. Se sembraron celulas MM2 sobre cubreobjetos de vidrio colocados en placas Petri de 60 mm. Se fijaron las celulas con paraformaldehido al 2% y se permeabilizaron (Triton X-100 (al 0,1%)) durante 24 horas. Para la tincion doble de TUCAP 1 y Rab5, se marcaron las celulas con suero de raton anti-TUCAP-1 y anticuerpo de conejo anti-Rab5 (SantaCruz) y se revelaron respectivamente con IgG anti-raton conjugada con Alexa Fluor 488 e IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). Para la deteccion de TUCAP-1 y Lamp-1, se marcaron las celulas con AcP de conejo anti-TUCAP-1 y AcM de raton anti-Lamp-1, (BD Pharmingen)

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respectivamente, se tineron con IgG anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 594 e IgG anti-raton conjugada con Alexa Fluor 488. Se detectaron TUCAP-1 y mitocondrias mediante tincion de TUCAP-1 con AcP de raton anti- TUCAP-1 y se marcaron con IgG anti-raton conjugada con Alexa Fluor 488, mientras que las mitocondrias se marcaron con rojo de Mitotracker (Invitrogen). Despues de los lavados, se montaron todas las muestras con glicerol:PBS (2:1) y se observaron con un microscopio de fluorescencia Leica DM 2500. Se grabaron las imagenes con una camara digital Spot Insight (Delta Sistemi) equipada con sistema de analisis de imagenes IAS 8.2 (Delta Sistemi).

Se inmunoprecipitaron lisados de celulas completas MM2 con anticuerpos anti-TUCAP-1 y se separaron diversas fracciones subcelulares y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. Los resultados revelaron que TUCAP-1 se recuperaba principalmente en fracciones enriquecidas con organulos celulares, mientras que era indetectable en fracciones sistolicas y de membrana plasmatica (figura 5A). Con el fin de identificar la ubicacion subcelular de TUCAP-1, se sometieron celulas MM2 a tincion doble para detectar TUCAP-1, y o bien para detectar los marcadores endosomicos tempranos Rab5, o bien para detectar el componente de endosomas tardios y lisosomas Lamp-1, o bien el marcador mitocondriano Mitotracker . El analisis mediante microscopia de fluorescencia mostro que TUCAP-1 se ubicaba conjuntamente tanto con Rab5 (figura 5B) como con EEA-1 (figura 6 y figura 7B), mientras que no se ubico conjuntamente con Lamp-1 (figura 5C), Mitotracker (figura 5D) ni nucleos tenidos con Hoechst.

Ademas, la figura 7 muestra la fluorescencia de tincion doble con las mismas celulas cocultivadas con linfocitos vivos. TUCAP-1 es detectable exclusivamente sobre la superficie de celulas de melanoma, mientras que los linfocitos quedan completamente sin tenir (figura 7A). De nuevo, TUCAP-1 se ubica conjuntamente con el marcador de endosoma primario EEA-1 (figura 7B) confirmando la expresion de esta proteina en endosomas tempranos.

EJEMPLO 4

Analisis funcional de TUCAP-1.

El silenciamiento de Tucap-1 inhibe el comportamiento fagocitario.

Se evaluo el papel de la proteina TUCAP-1 en celulas de melanoma metastasico humano inhibiendo su expresion mediante silenciamiento de Tucap-1.

Se usaron los siguientes duplex de iARN StealthR (Invitrogen) para el silenciamiento de tucap-1: gagugacguccagauccacugguuu (SEq ID NO: 13), y

aaaccaguggaucuggacgucacuc (SEQ ID NO: 14), y se aparearon segun las instrucciones del fabricante. Como control negativo se usaron duplex GC en medio de control negativo de iARN Stealth (Invitrogen). Se transfectaron celulas de melanoma usando reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. En resumen, el dia antes de la transfeccion, se sembraron celulas de melanoma en placas de seis pocillos (1X105 por pocillo) y, despues de 24 horas, se transfectaron las celulas con 30 pmol de ARNip por pocillo. 48 horas despues de la transfeccion, se analizaron las celulas para determinar la expresion de TUCAP-1 mediante analisis mediante FACS.

Se transfectaron tres lineas celulares metastasicas fagociticas diferentes con ARN de interferencia pequeno frente a Tucap-1 (ARNip de Tucap-1) o se transfectaron con un oligomero de ARNip no relevante (SC-ARNip). La figura 8 muestra el analisis mediante FACS de la expresion de TUCAP-1 con celulas MM2 sin transfectar y celulas MM2 transfectadas con ARNip desordenado o ARNip de TUCAP-1 48 horas despues de la transfeccion. Se obtuvieron resultados similares en celulas MM3 desordenadas y silenciadas con respecto a TUCAP-1 (no mostrado). Esto confirmo un silenciamiento eficaz de TUCAP-1.

Para evaluar la actividad fagocitica de estas celulas, en primer lugar se midio la capacidad de lineas celulares de melanoma sin transfectar, transfectadas con SC-ARNip o silenciadas con respecto a Tucap-1 para ingerir celulas de levadura tenidas o linfocitos vivos. 48 horas despues de la transfeccion, se incubaron celulas de melanoma MM2 y MM3 transfectadas con SC-ARNip o ARNip de TUCAP-1 a 37°C con levaduras de Saccharomyces tenidas con FITC, FITC (1:60), o linfocitos vivos tenidos con dihidrorrodamina 123 (DHR123) 10 uMol (Molecular Probes) (1:10). Se midio la fagocitosis/canibalismo despues de 4 horas eliminando mediante lavado el exceso de linfocitos o celulas de levadura con PBS y anadiendo una disolucion de PBS que contenia tripsina (1,5 g/l), EDTA (0,44 g/l). Despues de los lavados, se recogieron las celulas de melanoma y se analizaron con un citometro equipado con un laser de argon a 488 nm. Se adquirieron al menos 10.000 acontecimientos y se analizaron mediante un ordenador Macintosh usando el software CellQuest (Becton Dickinson). Se considero que las celulas de melanoma que aparecian con fluorescencia verde eran fagocfticas/canfbales. Los resultados mostraron que el silenciamiento de TUCAP-1 inhibio notablemente la actividad tanto fagocitica como canibal de celulas de melanoma (figura 9A, 9B, tabla 1), demostrando que TUCAP-1 desempena un papel fundamental en el comportamiento canibal de melanomas metastasicos humanos y por tanto la proteina puede usarse como marcador de malignidad.

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Tabla 2. Papel de TUCAP-1 en fagocitosis/canibalismo._____________________________________________

Actividad fagocftica/cambal de celulas de melanoma metastasico MM2 y MM3 transfectadas con ARNip desordenado (SC-ARNip) y silenciadas con respecto a Tucap-1 (ARNip de Tucap-1) frente a levaduras tenidas con FITC y linfocitos vivos tenidos con DHR123. La actividad fagocftica se expreso como % de celulas fagocfticas. Los numeros son la media ± d.e. de 5 experimentos diferentes.

: Levaduras Linfocitos vivos

: SC-ARNip ARNip de Tucap-1 SC-ARNip ARNip de Tucap-1

MM2: 37±1 4±2 45±5 17±9

MM3: 43±14 14±12 40±9 9±7

EJEMPLO 5

TUCAP-1 tiene un papel en la regulacion de la acidificacion de vesfculas endosomicas.

Se tineron celulas MM2 y MM3 transfectadas con ARNip desordenado y silenciadas con respecto a TUCAP-1 con sonda LysoTracker 1 ^M (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37°C y se analizaron inmediatamente mediante un citometro. Se llevaron a cabo comparaciones entre diferentes lfneas celulares de melanoma mediante software CellQuest usando la mediana de los valores de histogramas de intensidad de fluorescencia.

Basandose en el resultado de que TUCAP-1 se ubica en endosomas que portan Rab5 (vease el ejemplo 3), se sometio a prueba la hipotesis de que la protefna TUCAP-1 puede tener un papel en la regulacion del pH de compartimentos fago/endosomicos de celulas tumorales malignas. Para verificar esta hipotesis, se tineron celulas transfectadas con SC-iARN de control y ARNip de TUCAP-1 con la sonda acidotropica LysoTracker verde y se analizaron mediante simetrfa de flujo. El silenciamiento del gen tucap-1 indujo la aparicion de vesfculas menos acidas dentro de celulas de melanoma, en comparacion con celulas control transfectadas con SC-ARN (figura 9C). Estos experimentos respaldan la hipotesis de que TUCAP-1 tiene un papel en la regulacion de la acidificacion de vesfculas internas, tales como endosomas tempranos.

EJEMPLO 6

Implicacion de TUCAP-1 en fases tempranas del proceso metastatico.

Experimentos en curso basados en el uso de celulas que sobreexpresan TUCAP-1 sugieren que esta protefna esta implicada en la capacidad de invasion de celulas tumorales durante fases tempranas del proceso metastasico. Se somete a ensayo la capacidad de invasion celular de estas celulas usando camaras de invasion Matrigel (Becton- Dickenson, Bedford, MA, EE.UU.). En resumen, se resuspendieron celulas de melanoma WM743 sin transfectar o WW743 transfectadas con TUCAP-1 de longitud completa marcada con GFP (TWM) en medio libre de suero y se cargaron en la camara superior, mientras que en la camara inferior se coloco medio con adicion de FCS al 10% como agente quimiotactico. Se incubaron las celulas a 37°C en una atmosfera humidificada y se dejo que migraran a traves de la camara de quimiotaxis durante 48 horas. Despues de la incubacion, se retiraron completamente las celulas que quedaban en la superficie superior usando un portador de algodon. Se tineron las celulas que migraron a la parte inferior de la camara de quimiotaxis con violeta cristal. Se contaron las celulas invasoras microscopicamente (40) en cuatro campos diferentes por filtro. La figura 10 muestra el lado inferior de la membrana T ranswell, indicando claramente que el numero de celulas invasoras era significativamente superior para TWM, con una media de 25 celulas para celulas sin transfectar frente a una media de 132 celulas para celulas TWM transfectadas con TUCAP 1.

EJEMPLO 7

Implicacion de TUCAP-1 en la resistencia a cisplatino de celulas de melanoma.

Diversas publicaciones muestran el papel de protefnas implicadas en el trafico de iones y el papel del compartimento endo-lisosomico en el secuestro, inactivacion y extrusion de farmacos como mecanismos de resistencia a farmacos. La expresion de TUCAP 1 en endosomas tempranos y su implicacion en la regulacion del pH de vesfculas endosomicas (tal como se mostro en los ejemplos anteriores) condujo a plantear la hipotesis de un papel para esta protefna en la resistencia a farmacos de celulas cancerosas. Para demostrarlo, se trataron previamente celulas de melanoma MM2, que expresaban TUCAP-1 en altas cantidades, con ARNip desordenado (SC-ARNip) o frente a Tucap-1 durante 48 horas (tal como se mostro en los ejemplos anteriores), y despues de la transfeccion se trataron las celulas con cisplatino 2 uM. 48 horas despues se evaluo la citotoxicidad inducida por cisplatino mediante analisis mediante FACS de apoptosis temprana (positivo individual para anexina V) y tardfa (positivo doble para Pl/anexina V). El silenciamiento de Tucap-1 aumento notablemente los efectos citotoxicos de cisplatino en comparacion con celulas WM743 tratadas con ARNip desordenado que se comportaron como las celulas control sin transfectar. Con una media del 63% de celulas vivas en las celulas transfectadas control frente a una media del 37% en celulas

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silenciadas con respecto a TUCAP-1.

Este conjunto de experimentos demuestra que TUCAP-1 esta implicada en la resistencia a farmacos de celulas que sobreexpresan TUCAP-1 y que el silenciamiento de tucap-1 es un metodo prometedor de inhibicion del caracter fagocitario de celulas tumorales.

Basandose en los resultados mostrados en los ejemplos anteriores, la presente divulgacion tambien proporciona metodos altamente sensibles y especificos para la deteccion de melanoma y varios otros tumores caracterizados por un comportamiento fagocitario descrito, es decir, cancer de mama, carcinoma de pulmon, cancer de vejiga, meduloblastoma y adenocarcinoma gastrico. Ademas, esta divulgacion proporciona medios para distinguir lesiones cancerosas malignas de benignas mostrando que TUCAP-1 se expresa exclusivamente en tumores malignos. Los metodos para la deteccion de cancer comprenden la evaluacion de una muestra biologica de una supuesta lesion cancerosa, normalmente mediante hibridacion in situ, rt-PC, o metodos inmunoenzimaticos.

EJEMPLO 8

Anticuerpos policlonales y monoclonales frente a TUCAP-1.

Basandose en los ejemplos anteriores, los anticuerpos policlonales (AcP) y monoclonales (AcM) especificos para TUCAP-1 seran utiles para diversos fines, incluyendo por ejemplo el diagnostico para determinar la malignidad de un tumor, y el tratamiento de cancer.

Con el fin de producir anticuerpos policlonales, se clono ADNc de celulas MM1 en vectores de expresion bacterianos para obtener los aminoacidos 18-282 de TUCAP-1 fusionados con una cola N-terminal de 6 histidinas (SEQ ID NO: 11). Se uso peptido recombinante purificado para producir anticuerpos anti-TUCAP-1 en ratones. Los anticuerpos anti-TUCAP-1 reconocieron el inmunogeno, proteina de longitud completa marcada con GFP como control positivo asi como proteina TUCAP-1 endogena.

Tambien se generaron anticuerpos policlonales mediante inmunizacion de conejos, cabras y burros con un fragmento peptidico purificado que tenia una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos generados podian reconocer proteina TUCAP-1 humana mediante union a un fragmento peptidico que consistia en los aminoacidos 221-235 de SEQ ID NO: 1. Tambien se obtienen anticuerpos policlonales mediante inmunizacion de cabras y burros.

Con el fin de producir anticuerpos monoclonales, se inmunizaron ratones con un fragmento peptidico que tenia la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento de las mismas. Alternativamente se inmunizan ratones con fragmento peptidico que tiene la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 15. Se generaron clones de hibridomas seleccionados usando celulas del bazo de ratones seleccionados. En resumen, se fusionaron celulas B derivadas del bazo de ratones inmunizados con una linea de celulas tumorales de mieloma especificamente seleccionada para la produccion de hibridomas. Las celulas fusionadas derivadas (hibrido) que pueden crecer de manera indefinida en cultivo con la consecuente produccion de grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Se realizo la produccion de hibridomas segun protocolos convencionales. Despues de examinar los hibridomas seleccionados, se clonan los hibridomas y se hacen crecer a gran escala para la produccion de anticuerpos. Se seleccionan diversos hibridomas positivos para diferentes usos, por ejemplo: a) usos experimentales de laboratorio (inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitacion, analisis mediante FACS, inmunofluorescencia y analisis inmunohisto- e inmunocitoquimico de tejidos humanos y celulas cultivadas); b) estudios preclinicos y clinicos, c) herramientas de diagnostico y pronostico de tumores, tal como kit de deteccion. Los anticuerpos monoclonales producidos se unen a epitopos conformacionales o lineales de los aminoacidos 18282 de la proteina TUCAP-1 de SEQ ID NO: 1 o fragmento peptidico que consiste en los aminoacidos 221-235 o que consiste en los aminoacidos 303-352 de SEQ ID NO: 1. Los anticuerpos tambien se unen a la proteina TUCAP- 1 de origen de raton, rata, gato, perro y oveja.

Los ejemplos anteriores dan a conocer en detalle realizaciones particulares de la invencion. Sin embargo, esto se ha hecho solo a modo de ejemplo y con fines de ilustracion. No se pretende que los ejemplos limiten el alcance de las reivindicaciones adjuntas, que definen la invencion.

Referencias

Bukrinskaya A, Brichacek B, Mann A, Stevenson M. Establishment of a functional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription complex involves the cytoskeleton. J Exp Med. 1998; 188:2113-2125. Caruso RA, Muda AO, Bersiga A, Rigoli L, Inferrera C. Morphological evidence of neutrophil-tumor cell phagocytosis (cannibalism) in human gastric adenocarcinomas. Ultrastruct Pathol 2002; 26:315-21.

Chou, K.C. (2005). “Using amphiphilic pseudo amino acid composition to predict enzyme subfamily classes”. Bioinformatics, 21, 10-19.

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REIVINDICACIONES

1. Fragmento de polipeptido, que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15.
2. Uso de una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO: 1 como marcador en el diagnostico de malignidad tumoral.
3. Anticuerpo aislado, generado mediante inmunizacion de ratones, conejos, cabras o burros con un fragmento peptidico que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, en el que el anticuerpo puede reconocer proteina TM9SF4 humana mediante union a un fragmento peptidico seleccionado del grupo que consiste en los aminoacidos 18-282, 221-235 y 303-352 de SEQ ID NO: 1.
4. Anticuerpo segun la reivindicacion 3, o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y pertenece a IgG isotipo IgG2A, o IgG isotipo IgG1.
5. Anticuerpo aislado segun la reivindicacion 3, que es un anticuerpo monoclonal frente a proteina TM9SF4 humana, teniendo dicho anticuerpo una actividad de bloqueo de crecimiento tumoral o actividad de bloqueo de metastasis, generandose dicho anticuerpo mediante inmunizacion de ratones con dicho fragmento peptidico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, y reconociendo dicho anticuerpo proteina TM9SF4 humana mediante union a epitopos conformacionales o lineales ubicados entre los aa 18 y 282 o 221 -235 o 303-352 de SEQ ID NO: 1.
6. Hibridomas seleccionados obtenidos usando celulas del bazo de ratones seleccionados inmunizados con un fragmento peptidico que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, sEq ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, y produciendo anticuerpos monoclonales que pueden unirse a epitopos conformacionales o lineales de TM9SF4 humana, estando dichos epitopos ubicados entre los aminoacidos 18-282 o 221-235 o 303-352 de SEQ ID NO: 1.
7. Kit para detectar tumores malignos in vitro, comprendiendo dicho kit anticuerpos monoclonales segun la reivindicacion 5 y un control positivo titulado que comprende un fragmento peptidico que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, sEq ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, en el que el anticuerpo se usa para detectar una proteina oncogenica segun SEQ ID NO: 1 a partir de tejidos y liquidos corporales de pacientes con tumores.
8. Kit segun la reivindicacion 7, en el que el tumor es un tumor de melanoma.
9. Metodo para diagnosticar tumores malignos in vitro, comprendiendo dicho metodo una etapa de definir la presencia o ausencia de la expresion de SEQ ID NO: 1 en celulas tumorales, en el que la presencia de la expresion indica malignidad.
10. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que la presencia o ausencia de SEQ ID NO: 1 incluye el reconocimiento de la proteina TM9SF4 mediante un anticuerpo monoclonal que puede obtenerse mediante inmunizacion de ratones con un fragmento peptidico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, reconociendo dichos anticuerpos proteina TM9SF4 humana mediante la union a unos epitopos conformacionales o lineales ubicados entre los a.a. 188-282 o 221-235 o 303-352 de SEQ ID NO: 1.
11. Metodo para realizar el seguimiento del desarrollo de malignidad de un tumor in vitro, comprendiendo dicho metodo una etapa de definir la presencia o ausencia de expresion de SEQ ID NO: 1 en celulas tumorales, en el que la presencia de la expresion indica malignidad.
12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que la presencia o ausencia de SEQ ID NO: 1 incluye el reconocimiento de la proteina TM9SF4 mediante un anticuerpo monoclonal que puede obtenerse mediante inmunizacion de ratones con un fragmento peptidico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 15, reconociendo dichos anticuerpos la proteina TM9SF4 humana mediante union a epitopos conformacionales o lineales ubicados entre los a.a. 188-282 o 221 -235 o 303-352 de SEQ ID NO: 1.
13. Metodo segun la reivindicacion 9 o segun la reivindicacion 11, en el que el tumor es tumor de melanoma.
14. Acido nucleico aislado que es sustancialmente complementario a SEQ ID NO: 2, o complementario al ARNm de TM9SF4 para su uso en la inhibicion del caracter fagocitario de una celula tumoral.
15. Acido nucleico aislado para su uso segun la reivindicacion 14, en el que el caracter fagocitario de la celula tumoral se inhibe mediante silenciamiento de la expresion del gen de TM9SF4.

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verde

imagen13

imagen14

O

i i

i

pSpl|t®SSl4«

Citosol

V^* V/1^-

Membrana

W'-W-

Organulos

Isotipo de control

imagen15

imagen16

imagen17

Figura 6

imagen18

Figura 6A

imagen19

imagen20

Figura 7A

GO

-P-

Figura 8

imagen21

Recuento

imagen22

>

73

~o

CL.

CD

C/5

O

—i

Q.

CD

Z3

CD

Q.

O

Recuento

imagen23

>

73

~o

Q.

CD

imagen24

T3

I

CO

cn

imagen25

CD

C

fi>

CO

imagen26

linfocitos'DHR123

Recuento

-0 10 20 30 40 50 60 TO 80'

imagen27

■ ;0........

■faSpT^'

Misers-

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

WM743

TWM

Figura 10

Las flechas indican ejemplos de celulas tenidas

imagen32

WM743

TWM

Figura 10A