KR20050103474A - 갈렉틴 9 함유 의약 - Google Patents

Abstract

갈렉틴 9는 그 국재(局在)에 의해 각각 그 기능이 다른 한편, 여러 가지 생체 기능에의 관여가 예측되고, 그 자세한 생물 활성을 해명하여 의약품 개발을 포함한 갈렉틴 9 관련 기술 개발을 행할 것이 요구되고 있다. 인간 갈렉틴 9는 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성 및 아포토시스 유도 활성을 나타내지만, 정상 세포에는 상해 활성을 나타내지 않고, 또 아포토시스를 유도하지 않는 것 등으로부터 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 아고니스트, 갈렉틴 9 안타고니스트 길항 물질, 항갈렉틴 9 결합 단백질 항체, 항갈렉틴 9 결합 당쇄 항체, 갈렉틴 9 산생·유리 유도 물질 등을, 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제로서 개발할 수 있다.

Description

갈렉틴 9 함유 의약{DRUGS CONTAINING GALECTIN 9}

본 발명은 갈렉틴 9, 특히 인간 갈렉틴 9의 악성 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 악성 종양 세포에 대한 아포토시스 유도 활성, 악성 종양 세포에 대한 항종양 활성(항암 활성), 활성화 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 특히 CD4 양성 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 면역 억제 활성, 항염증 작용, 항알레르기 작용을 이용하는 기술에 관한 것이다. 본 발명은 갈렉틴 9 및 그 관련 기술을 이용한 항종양제(항암제), 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 제제에 관한 것이다.

마우스에 있어서 갈렉틴 9는 흉선 세포의 아포토시스를 야기하는 것과, 또 래트의 비(脾)세포 중 T 세포의 아포토시스를 유도하는 한편, 갈렉틴 9는 CD8 양성 T 세포의 아포토시스를 특이적으로 유도하지만 CD4 양성 T 세포의 아포토시스는 유도하지 않는 것이 보고되어 있다. 또한, 다른 갈렉틴, 예컨대 갈렉틴 1에 대해서도 활성화 T 세포의 아포토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다. 한편, 갈렉틴 3은 그것을 유전자 도입함으로써 아포토시스의 억제가 보여지는 것 등이 알려져 있다(이상, 특허가 아닌 문헌 1∼4).

본 발명자들의 그룹은 인간 T 세포 유래 호산구 유주 인자의 클로닝에 성공하고, 이것에 의해 그것이 Tureci 등이 보고한 인간 갈렉틴 9(특허가 아닌 문헌 5)의 변이연쇄 에칼렉틴인 것을 발견하였다(특허가 아닌 문헌 6). 또한, 본 발명자들의 그룹은 에칼렉틴과 갈렉틴 9는 동일한 물질이라는 것을 밝혀내고, 인간 갈렉틴 9는 그 링크 펩티드 길이의 차이에 의해, 쇼트 타입, 미디엄 타입, 롱 타입의 3 종류가 있다는 것을 명백히 하였다(특허가 아닌 문헌 7).

알레르기 및 자가면역 질환은 CD4 양성 T 림프구의 과잉 면역 반응에 의해 야기된다. 난치성 알레르기 및 자가면역 질환 치료에는 스테로이드 호르몬 및 면역 억제제가 이용된다. 그러나, 스테로이드는 부작용이 강하기 때문에, 문제가 많으며, 또한, 지금까지 알려진 면역 억제제에도 부작용이 강하다는 점에서 문제되는 것이 있다.

[특허가 아닌 문헌 1] Wada J. et al., J Clin Invest., 1997, 99: 2452-61

[특허가 아닌 문헌 2] Tsuchiyama Y. et al., Kidney Int., 2000, 58: 1941-52

[특허가 아닌 문헌 3] Perillo NL et al., Nature, Dec. 14, 1995, 378(6558): 736-9

[특허가 아닌 문헌 4] Matarrese P. et al., Int J Cancer., Feb. 15, 2000, 85(4): 545-54

[특허가 아닌 문헌 5] Tureci 0. et al., J Biol Chem., Mar. 7, 1997, 272(10): 6416-22

[특허가 아닌 문헌 6] Matsumoto R. et al., J Biol Chem., 1998, 273: 16976-84

[특허가 아닌 문헌 7] Matsushita N. et al., J Biol Chem., 2000, 275: 8355-60

생체내의 생리 활성 물질은 지금까지 수 많이 발견되고 있지만, 이들의 대부분은 예컨대 종양 세포 등에 작용하는 것과 마찬가지로 정상적인 세포에도 작용하기 때문에, 반드시 그 일부의 활성이 해명되었다고 하여 그 의약 등에의 이용이 간단히 도모되는 것은 아니다.

갈렉틴 9는 β-갈락토시드 결합 렉틴인 갈렉틴의 종류 중 하나이다. 갈렉틴은 생물의 발생·분화, 세포 증식, 아포토시스, 세포간 접착, 세포와 세포 밖 매트릭스의 접착 및 유주 활성 등 다종 다양한 생물 활성을 나타낸다. 갈렉틴 9는 갈렉틴 중에서도 여러 가지의 자극에 의해 그 산생·유리(遊離)가 유도되는 물질인 한편, 그 산생과 유리는 해리되고 있다. 또한 갈렉틴 9는 그 국재, 즉, 세포질, 세포막 및 세포 밖의 그 존재 장소에 의해 각각 그 기능이 다른 것도 예측된다.

그래서, 갈렉틴 9의 상세한 생물 활성을 해명하는 것, 그리고 그 해명에 기초한 의약품의 개발을 시작으로 한 갈렉틴 9 관련 기술 개발이 요구되고 있다.

도 1은 (A) rGal-9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 PI법으로 플로우 사이토메트리 측정한 결과를 도시한다. (B) rGal-9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 Annexin V법으로 플로우 사이토메트리 측정한 결과를 도시한다. 데이터는 4회의 실험 중 대표예를 도시한다.

도 2는 rGal-9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 락토스 또는 수크로스 존재 혹은 비존재 하에서 측정한 결과를 도시한다. 데이터는 4회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 3은 각종 세포주에 대한 rGal-9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 PI법으로 플로우 사이토메트리 측정한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 4는 말초혈 유래 T 세포에 대한 rGal-9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 PI법으로 플로우 사이토메트리 측정한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 5는 각종 카스파제 저해제 존재 하에 Gal-9 유발 아포토시스에 대한 저해 효과에 대해서 실험한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 6은 농도가 다른 판-카스파제(pan-caspase) 저해제 또는 카스파제-1 저해제의 존재 하에 Gal-9 유발 아포토시스에 대한 저해 효과에 대해서 실험한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 7은 농도가 다른 칼파인 저해제 존재 하에 Gal-9 유발 아포토시스에 대한 저해 효과에 대해서 실험한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 8은 Gal-9 유발 아포토시스를 받은 세포를 사용하여 칼슘 유입에 대한 Gal-9의 영향을 실험한 결과를 도시한다. 데이터는 3회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 9는 DEX, 항Fas 항체 및 에토포시드에 의해 유도되는 아포토시스에 미치는 Gal-9의 작용 효과에 대해서 조사하는 실험을 행한 결과를 도시한다. 데이터는 4회 실험한 것의 평균치 ± SEM이다.

도 10은 악성 흑색종 세포 MM-RU에 대한 갈렉틴 9의 아포토시스 유도 활성에 대해서 PI법으로 플로우 사이토메트리 측정한 결과를 도시한다.

도 11은 인간 흑색종 세포주 중 MM-BP와 MM-RU에서 메신저 RNA를 채취하고, RT-PCR법으로 갈렉틴 DNA 양을 해석한 결과를 나타내는 전기 영동 사진을 도시한다.

도 12는 포소(胞巢) 형성성 세포인 유방암 세포주 MCF-7과 이로부터 새롭게 수립한 명백한 포소 형성성을 나타내지 않는 MCF-7 K-10 주의 세포 형태를 도시하는 사진이다.

도 13은 포소 형성성 세포인 MCF-7 K-4 주와 새롭게 수립된 명백한 포소 형성성을 나타내지 않는 MCF-7 K-10 주에 부착된 갈렉틴 9를 웨스턴블롯법으로 연구한 결과를 나타내는 전기 영동 사진을 도시한다.

도 14는 재조합한 갈렉틴 9를 외부로부터 흑색종 세포주 MM-RU에 첨가하고, 갈렉틴 9의 작용 효과에 대해서 검토를 행한 결과를 도시하는 세포 형태의 사진이다.

도 15는 유방암 세포주로부터 수립된 MCF-7 K-10 주에 갈렉틴 9 유전자를 도입한 경우의 작용 효과에 대해서 검토를 행한 결과를 도시하는 세포 형태의 사진이다.

도 16은 MOLT4 유래의 단백질 중 갈렉틴 9CT 컬럼 흡착 단백질의 전기 영동 사진을 도시한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, 인간 갈렉틴 9가 종양 세포에 대해서는 세포 상해 활성을 나타내지만, 정상 세포에는 상해 활성을 나타내지 않고, 또한, 종양 세포에 대해서 아포토시스를 유도하지만, 정상 세포에는 아포토시스를 유도하지 않는 것을 발견하여 이루어진 것이다. 그러므로, 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 아고니스트, 갈렉틴 9 안타고니스트 길항 물질, 항갈렉틴 9 결합 단백질 항체, 항갈렉틴 9 결합 당쇄 항체, 갈렉틴 9 산생·유리 유도 물질 등을, 정상 세포에는 작용하지 않고, 종양 세포에 상해 활성을 나타내고, 아포토시스를 유도하는 항종양제(항암제)로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명은 인간 갈렉틴 9가 전이성 악성 세포에 대해서 응집 유도적으로 작용하고, 암 등의 악성 종양의 전이 억제 활성을 갖는 것을 이용한 암 전이 억제 기술, 예컨대 갈렉틴 9 단백질 혹은 그 유도체, 또는 갈렉틴 9 유전자 도입 및 갈렉틴 9의 산생 ·유리를 유도함으로써, 암 전이 억제 작용을 얻기 위한 방법, 그것에 사용되는 시약, 혹은 키트, 시스템(검지·측정계를 포함) 등을 제공한다.

본 발명은 인간 갈렉틴 9가 비활성화(휴면) T 세포, 특히 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도를 유도하지 않으며, 휴면 CD8 양성 T 세포(서프레서 T 세포 및 세포 상해성 T 세포)의 아포토시스는 약하게 유도하는 한편, 인간 갈렉틴 9가 CD3에 의해 활성화한 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도를 현저히 유도하며, 활성화 CD8 양성 T 세포(서프레서 T 세포 및 세포 상해성 T 세포)의 아포토시스를 갈렉틴 1 및 갈렉틴 3보다도 강하게 유도하는 것에 기초하여 이루어져 있다.

인간 갈렉틴 3은 외부에서 가한 경우는 활성화된 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포) 및 CD8 양성 T 세포(서프레서 T 세포 및 세포 상해성 T 세포)의 아포토시스를 유도한다. 또한, 갈렉틴 9에 의한 아포토시스 유도는 농도 의존성, 시간 의존성이다. CD4 양성 T 세포는 면역 반응을 야기하는데 매우 중요한 작용을 나타내는 것이 알려져 있으며, CD4 양성 T 세포의 과잉 반응에 의해 여러 가지의 자가면역 질환 및 알레르기가 야기된다고 생각된다.

이상의 것으로부터, 특히, 갈렉틴 9는 활성화된 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)에 대해 보다 현저히 아포토시스를 유도하였기 때문에, 갈렉틴, 특히, 갈렉틴 9 단백질, 또는 갈렉틴 9 유전자 도입 및 갈렉틴 9의 산생 ·유리를 유도함으로써, CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하고, 그 결과, 면역 억제 효과 및 항염증 효과를 나타낼 수 있다고 생각된다. 이들 기술을 이용하여 자가면역 질환 및 알레르기 질환, 나아가서는 항염증 약으로서 이용하는 것이 가능해진다. 또한, 상기 T 세포 등은 면역 세포이기 때문에, 갈렉틴 9는 면역 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 활성을 나타내는 것이다.

〔갈렉틴 9에 의한 아포토시스 유도 경로의 해명〕

아포토시스는 여러 가지의 물질, 예컨대 면역 억제제로서 이용되는 글루코코르티코이드, Fas 리간드 및 항Fas 항체 등에 의해 야기된다. 본 발명에서는 갈렉틴 9에 의한 아포토시스가 어떠한 경로로 유도되는지를 해명하였다. 즉, 우선, 인간 말초혈 T 세포 대신 T 세포주인 Jurkat 세포 및 MOLT4 세포를 이용하며, 프로피듐아이오다이드(PI)법 및 Annexin V법으로 갈렉틴 9가 이들 세포에 아포토시스를 유도하는 것을 확인하였다. 다음에 갈렉틴 9에 의한 아포토시스의 유도는 락토스에 의해 억제되었지만, 수크로스로서는 억제되지 않았기 때문에, 갈렉틴 9의 베타갈락토시드 결합 활성이 아포토시스의 유도에 필요하다는 것이 해명되었다.

또한, 본 발명에 따라서, 갈렉틴 9 유도 아포토시스에 카스파제가 관여되어 있는지 여부를 검토한 결과, 판-카스파제 저헤제는 덱사메타존, 항Fas 항체, TNF-α, C2 세라미드에 의한 아포토시스를 억제함과 동시에, 갈렉틴 9에 의한 아포토시스도 농도 의존성, 시간 의존성으로 억제하였다. 또한, 그 상류에 있는 카스파제 1, 8, 9, 10에 대한 억제제에 대해서 검토하였다. 카스파제 1 억제제, 카스파제 8 억제제, 카스파제 9 억제제, 카스파제 10 억제제가 이용되었다. 그 결과, 갈렉틴 9에 의한 아포토시스는 카스파제 1 특이적 억제제에 의해 억제되었지만, 다른 카스파제 특이적 억제제에 의해서는 억제되지 않았다. 또한, 덱사메타존 유도 아포토시스는 마찬가지로 카스파제 1 억제제로, 한편, 항Fas 항체 및 TNF-α 유도 아포토시스는 카스파제 8 및 10 억제제로, C2 세라미드 유도 아포토시스는 카스파제 9의 억제제로 억제되었다. 이것으로부터 갈렉틴 9는 덱사메타존과 같은 경로로 아포토시스를 유도하고 있다고 생각되었다.

그런데, 카스파제 1의 활성화에는 칼파인의 활성화가 선행되는 것이 알려져 있다. 그래서 칼파인 저해제가 갈렉틴 9 유도 아포토시스에 미치는 영향에 대해서 검토하였다. 그 결과, 칼파인 저해제는 농도 의존성으로 갈렉틴 9 유도 아포토시스를 억제하였다. 또한, 칼파인 활성화 전에 세포내에 칼슘이 유입되기 때문에, 갈렉틴 9 자극에 의해 칼슘 유입이 야기되는지 여부를 검토한 바, 갈렉틴 9는 명백한 칼슘 세포내 유입을 유도한다. 또한, 그 유입은 락토스로 억제되지만, 수크로스로서는 억제되지 않았다. 이들 결과로부터 갈렉틴 9에 의한 칼슘 유입에는 베타 갈락토시드 결합 활성이 필수라는 것이 확인되었다. 지금까지의 결과로부터 갈렉틴 9는 글루코코르티코이드(덱사메타존)와 동일한 경로, 즉, 수용체 → 칼슘 유입 → 칼파인 → 카스파제 1 → 카스파제 3 및 7이라는 경로로 아포토시스를 유도한다고 생각된다.

또한, 덱사메타존, 항Fas 항체, 에토포시드(etoposide)에 의한 아포토시스에 대한 갈렉틴 9의 효과를 검토한 결과, 항Fas 항체 및 에토포시드에 의한 아포토시스에 대하여 갈렉틴 9는 상가(相加)적인 효과를 나타내지만, 한편, 덱사메타존에 의한 아포토시스에서는 갈렉틴 9에 의한 상가 효과는 보이지 않았다. 호산구의 아포토시스에서 갈렉틴 9는 덱사메타존에 의한 아포토시스를 역으로 억제하는 것이 명백해졌다. 이리하여, 갈렉틴 9와 글루코코르티코이드는 같은 경로에 의해 아포토시스를 유도하고 있다는 것이 강하게 시사된다. 이상으로부터, 본 발명에 있어서, 갈렉틴 9가 항염증약, 항알레르기제 및 면역 억제약으로서 사용할 수 있는 가능성이 높은 것이 분명해졌다. 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 유전자 도입 및 갈렉틴 9를 유도함으로써 부작용이 적은 면역 억제제로서 이용하는 것, 또는 그것을 병용함으로써 글루코코르티코이드 등의 용량을 감소시키는 결과, 부작용도 줄일 수 있었다.

현재, 글루코코르티코이드가 항염증약, 항알레르기제 및 면역 억제약으로서 널리 이용되고 있으며, 난치성 알레르기에 FK506 등의 면역 억제제가 이용되고 있다. 결점으로서는 이들 약제는 중독 부작용이 많다는 것이 알려져 있다. 그러나, 지금까지의 결과로부터 갈렉틴 9를, 상기 글루코코르티코이드가 담당하는 생물 활성을 대체하는 것 혹은 그것과 동등 이상의 우수한 생물 활성을 담당하는 것으로서 이용할 수 있는 것이 확인되었다. 갈렉틴 9, 그 유연체 등의 이용, 갈렉틴 9의 생체내 농도 혹은 발현을 조절함으로써, 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제를 제공할 수 있다. 또한, 갈렉틴 9를 이용하여 글루코코르티코이드가 나타내는 약리 작용·생물 활성을 이용한 분야에의 응용이 가능하다.

알레르기 및 자가면역 질환은 CD4 양성 T 림프구의 과잉 면역 반응에 의해 야기되며, 난치성 알레르기 및 자가면역 질환의 치료에는 스테로이드 및 면역 억제제가 이용되기 때문에, 상기로부터 갈렉틴 9는 면역 억제 작용, 항염증 작용, 항 알레르기를 나타내는 것이 명백하며, 스테로이드 및 면역 억제제 대신 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 유전자 도입, 갈렉틴 9 산생 또는 유리 유도 인자, 항갈렉틴 9 수용체 항체, 갈렉틴 9 결합 당쇄에 대한 항체 등을 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제로서 이용할 수 있다.

본 발명에서는 「유전자 재조합 기술」을 이용하여 소정의 핵산을 단리·서열 결정하거나 재조합체를 제작하거나 소정의 펩티드를 얻을 수 있다. 본 명세서 중 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술(재조합 DNA 기술을 포함)로서는 상기 분야에서 알려진 것을 들 수 있으며, 예컨대 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular C1oning: A Laboratory Manual(2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); 일본 생화학회 편저, 「속 생화학 실험 강좌 1, 유전자 연구법 Ⅱ」, 동경 화학 동인(1986); 일본 생화학회 편저, 「신생화학 실험 강좌 2, 핵산 Ⅲ(재조합 DNA 기술)」, 동경 화학 동인(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68(Recombinant DNA), Academic Press, New York(1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 10 O(Recombinant DNA, Part B) & 1O1(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York(1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153(Recombinant DNA, Part D), 154(Recombinant DNA, Part E) & 155(Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York(1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York(1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York(1993); S. Weissman(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York(1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York(1999) 등에 기재한 방법 혹은 여기서 인용된 문헌 기재의 방법 혹은 이들과 실질적으로 동일한 방법 및 개변법에 의해 행할 수 있다(이들 문헌 내의 기재는 그것을 참조함으로써 본 명세서의 개시에 포함됨)〔이하, 이들 모두를 「유전자 재조합 기술」이라고 함).

본 명세서 중 「상동성」이란, 폴리펩티드 서열(혹은 아미노산 서열) 또는 폴리뉴클레오티드 서열(혹은 염기 서열)에 있어서의 2개의 쇄 사이에서 상기 쇄를 구성하고 있는 각 아미노산 잔기끼리 또는 각 염기끼리의 상호 적합 관계에 있어서 동일한 것으로 결정할 수 있는 것의 양(수)을 의미하고, 두 개의 폴리펩티드 서열 또는 두개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 상관성의 정도를 의미하는 것이다. 상동성은 용이하게 산출할 수 있다. 두개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드서열 사이의 상동성을 측정하는 방법은 수 많이 알려져 있으며, 「상동성」(「동일성」이라고도 말함)이라는 용어는 당업자에는 주지되어 있다(예컨대 Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 등). 두개 서열의 상동성을 측정하는데 이용되는 일반적인 방법에는 Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, -D., SIAMJ. Applied Math., 48: 1073(1988) 등에 개시되어 있는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상동성을 측정하기 위한 바람직한 방법으로서는 시험하는 두 개의 서열 사이의 가장 큰 적합 관계 부분을 얻도록 설계한 것을 들 수 있다. 이러한 방법은 컴퓨터 프로그램으로서 조립되어져 있는 것을 들 수 있다. 두개의 서열간의 상동성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램법으로서는 GCG 프로그램 팩키지(Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215: 403(1990)) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니며, 상기 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어 「폴리펩티드」로서는, 이하에 기재하는 바와 같은 어떠한 폴리펩티드를 가리키더라도 좋다. 폴리펩티드의 기본적인 구조는 주지 이며, 상기 기술 분야에 있어서 매우 수 많은 참고서 및 그 밖의 간행물에 기재되어 있다. 이러한 것을 감안하여 본 명세서에서 사용하는 용어 「폴리펩티드」는 펩티드 결합 또는 수식한 펩티드 결합에 의해 서로 결합되어 있는 2개 또는 그 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 또는 임의의 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 「폴리펩티드」로서는 상기 분야에 있어서, 예컨대 펩티드, 올리고펩티드 혹은 펩티드올리고머로도 불리는 단쇄, 및 단백질이라고 일반적으로 불리어지며, 많은 형태의 것이 알려져 있는 장쇄 둘다를 통상 의미하여도 좋다. 폴리펩티드는 종종, 통상, 천연형 아미노산(천연에 존재하고 있는 아미노산: 혹은 유전자로 코딩되는 아미노산)으로 불리는 아미노산 이외의 아미노산을 함유하고 있어도 좋다. 폴리펩티드는 또한 말단 아미노산 잔기를 함유하여, 그 많은 아미노산 잔기가 번역된 후에 프로세싱 및 그 밖의 개변(혹은 수식)된다고 하는 천연 공정에 의할 뿐만 아니라, 당업자에게 주지된 화학적 개변 기술에 의해서도 상기한 폴리펩티드를 개변(수식)할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 폴리펩티드에 가해지는 개변(수식)에 대해서는 많은 형태의 것이 알려져 있으며, 이들은 상기 분야의 기초적인 참고서 및 더욱 상세한 논문 및 다수의 연구 문헌에도 자세히 기재되어 있으며, 당업자에게 주지되어 있다. 몇가지 특별한 일반적인 개변·수식으로서는 예컨대 알킬화, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 글리코실화, 지질 결합, 황산화, 인산화, 글루타민산 잔기의γ-카르복실화, 수산화 및 ADP-리보실화 등을 들 수 있고, 예컨대 T. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, Second Edition, W. H. Freeman and Company, New York, (1993); B. C. Johnson(Ed.), Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York, (1983)(Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspective and Prospects", pp. 1-12); Seifter et al., "Analysis for Protein Modifications and nonprotein cofactors", Methods in Enzymology, 182: 626-646(1990); Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modification and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci., 663: p. 48-62(1992) 등의 기재를 참조할 수 있다.

본 명세서 중, 갈렉틴 9로서는 전형적으로는 천연형 갈렉틴 9를 들 수 있다. 천연형 갈렉틴 9로서는 현재, 롱 타입(L 형) 갈렉틴 9, 미듐 타입(M 형) 갈렉틴 9및 쇼트 타입(S 형) 갈렉틴 9가 보고되어 있지만, L 형 갈렉틴 9는 WO 02/37114 A1에 개시한 서열 번호 4의 추정 링크 펩티드 영역에 의해 N 말단 도메인과 C 말단 도메인이 연결되고, M 형 갈렉틴 9는 상기 WO 02/37114 A1의 서열 번호 5의 추정 링크 펩티드 영역에 의해 N 말단 도메인과 C 말단 도메인이 연결되며, S 형 갈렉틴 9는 상기 W0 02/37114 A1의 서열 번호 6의 추정 링크 펩티드 영역에 의해 N 말단 도메인과 C 말단 도메인이 연결된 것으로 생각되며, M 형 갈렉틴 9로서는 L 형 갈렉틴 9의 상기 링크 펩티드 영역으로부터 상기 O2/37114 A1의 서열 번호 7의 서열인 아미노산 잔기가 결실되어 있는 점에서 L 형 갈렉틴 9와 다르고, S 형 갈렉틴 9에서는 M 형 갈렉틴 9의 상기 링크 펩티드 영역으로부터 상기 WO 02/37114 A1의 서열 번호 8의 서열의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 점에서 M 형 갈렉틴 9와 다르며, 즉, S 형 갈렉틴 9에서는 L 형 갈렉틴 9의 추정 링크 펩티드 영역으로부터 상기 02/37114 A1의 서열 번호 9의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 점에서 L 형 갈렉틴 9와 다르다.

본 명세서에 있어서, 갈렉틴 9에서는 상기 L 형 갈렉틴 9, M 형 갈렉틴 9 및 S 형 갈렉틴 9, 그 밖에, 이들 갈렉틴 9 패밀리의 천연에서 발생하는 변이체, 또한, 이들에 인공적인 변이(즉, 한개 이상의 아미노산 잔기에 있어서, 결실, 부가, 수식, 삽입 등)를 실시한 것 혹은 이들 일부의 도메인 및 일부 펩티드 단편을 포함하는 것을 의미하여도 좋다.

본 발명의 대표적인 갈렉틴 9 단백질로서는 WO 02/37114 A1 서열목록의 서열 번호 1∼3(SEQ ID N0: 1∼3) 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 그것과 실질적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있으며, 예컨대 서열 번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열 중 적어도 5∼311, 5∼323 또는 5∼355개의 연속하는 아미노산 잔기를 가지며, 또한, 동등한 항원성 등의 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 것 혹은 이들 특징을 갖고, 또한, 서열목록 서열 번호 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 각 도메인 중 어느 하나와 적어도 50%보다 높다 상동성 혹은 적어도 60%보다 높은 상동성 혹은 적어도 70%보다 높은 상동성 혹은 적어도 80%보다 높은 상동성 혹은 적어도 90%보다 높은 상동성 혹은 적어도 95% 이상의 상동성 혹은 적어도 98% 이상의 상동성을 갖는 것 등을 들 수 있다.

본 발명의 인간 갈렉틴 9 폴리펩티드로서는 WO 02/37114 A1 서열목록의 SEQ ID N0: 1∼3 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 연속한 아미노산 잔기 혹은 상기 SEQ ID N0: 1, 2 및 3의 아미노산 서열 중 연속한 아미노산 잔기 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 또 바람직하게는 20개 이상, 더 바람직하게는 30개 이상, 보다 바람직하게는 40개 이상, 또한 바람직하게는 50개 이상, 또한 바람직하게는 60개 이상, 가장 바람직하게는 70개 이상, 또한 바람직하게는 80개 이상, 더 바람직하게는 90개 이상, 가장 바람직하게는 100개 이상, 또한 바람직하게는 110개 이상을 갖는 것을 들 수 있다. 본 발명의 인간 갈렉틴 9 관련 폴리펩티드로서는 상기 SEQ ID N0: 1, 2 및 3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 갖고 있어도 좋다(개시 코돈에 대응하는 Met를 갖고 있지 않아도 좋음). 이러한 서열을 갖는 것은 전부 포함되어도 좋다.

갈렉틴 9 혹은 그 구성 도메인, 그 단편을 코딩하는 핵산으로서는, 갈렉틴 9와 동등한 항원성 등의 것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산과 동효인 염기 서열을 함유하는 것이면 어떤 것이라도 좋다.상기 갈렉틴 9를 코딩하는 핵산은 단일쇄 DNA, 이중쇄 DNA, RNA, DNA:RNA 하이브리드, 합성 DNA 등의 핵산이며, 또한 인간 게놈 DNA, 인간 게놈 DNA 라이브러리, 인간 조직·세포 유래의 cDNA, 합성 DNA 중 어느 하나라도 좋다. 상기 갈렉틴 9를 코딩하는 핵산의 염기 서열은 수식(예컨대 부가, 제거, 치환 등)되는 것도 가능하며, 그러한 수식된 것이 포함되어도 좋다. 또한, 천연에서 발생하는 변이체라도 좋다. 이들 핵산은 L 형, M 형 또는 S 형 갈렉틴 9 펩티드 혹은 그 일부를 코딩하는 것이라도 좋으며, 바람직한 것으로서는 DNA를 들 수 있다. 또한 상기 「동효의 염기 서열」이란, 예컨대 엄격한 조건 하에 WO 02/37114 A1에 개시한 서열목록의 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 중 연속한 5개 이상의 염기 서열, 바람직하게는 10개 이상의 염기 서열, 보다 바람직하게는 15개 이상의 염기 서열, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 염기 서열과 하이브리드화하고, 상기 갈렉틴 9와 실질적으로 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 것 혹은 그 상보쇄 등을 들 수 있다.

상기 갈렉틴 9를 코딩하는 핵산은 대표적으로는 WO 02/37114 A1에 개시한 서열목록의 SEQ ID N0: 1∼3 중 어느 하나에 제시되는 펩티드 및 그 일부의 연속한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 함유하는 것(각 특징적인 도메인만을 코딩하는 것도 포함), 코드 서열에 개시 코돈(Met를 코딩하는 코돈) 및 종지 코돈을 부가한 것, 또, 상기 염기 서열이 코딩하는 단백질과 적어도 50%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한, 상기 서열 번호 1∼3의 아미노산 서열 중 적어도 특징적인 연속 아미노산 잔기를 가지며, 그 위에 또 동등한 항원성 등의 그것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 것과 동효인 염기 서열을 함유하는 것이면 어떤 것이라도 좋다.

본 명세서 중 「폴리머라제·연쇄·반응(polymerase chain reaction)」 또는 「PCR」이란, 일반적으로 미국 특허 제4,683,195호 명세서 등에 기재된 방법을 가리키며, 예컨대 원하는 뉴클레오티드 서열을 시험관내에서 효소적으로 증폭시키기 위한 방법을 가리키고 있다. 일반적으로, PCR법은 주형 핵산과 우선적으로 하이브리드화할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드프라이머를 사용하여, 프라이머 신장 합성을 행하는 사이클을 반복하는 것을 포함하는 것이다. 전형적으로는 PCR법에서 이용되는 프라이머는 주형 내부의 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열에 대해서 상보적인 프라이머를 사용할 수 있으며, 예컨대 상기 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열과 그 양단에 있어서 상보적인 것 혹은 상기 증폭되어야 하는 뉴클레오티드 서열에 인접하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 5' 말단측의 프라이머로서는 적어도 개시 코돈을 함유하거나 혹은 상기 개시 코돈을 포함하여 증폭할 수 있도록 선택하고, 또한 3' 말단측의 프라이머로서는 적어도 종지 코돈을 함유하거나 혹은 상기 종지 코돈을 포함하여 증폭할 수 있도록 선택하는 것이 바람직하다. 프라이머는 바람직하게는 5개 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18∼25개의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

PCR 반응은 상기 분야에서 공지된 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법 및 개변법에 따라 행할 수 있지만, 예컨대 R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2 nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, 0xford University Press(1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and app1ications", Academic Press, New York(1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, 0xford(1991); M. A. Frokman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988) 등에 기재된 방법 혹은 그것을 수식하거나, 개변한 방법에 따라서 행할 수 있다. 또한, PCR법은 그것에 적합한 시판되고 있는 키트를 이용할 수 있으며, 키트 제조 업자 혹은 키트 판매 업자가 제시하는 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.

PCR 반응은 대표적인 경우에는 예컨대 주형(예컨대 mRNA를 주형으로 하여 합성된 DNA; 제1 스트랜드 DNA)과 상기 유전자에 기초하여 디자인된 프라이머를 10× 반응 완충액(Taq DNA 폴리머라제에 첨부되어 있음), dNTPs(데옥시뉴클레오티드삼인산 dATP, dGTP, dCTP, dTTP의 혼합물), Taq DNA 폴리머라제 및 탈이온 증류수와 혼합한다. 혼합물을 예컨대 GeneAmp 240O PCR system, Perkin-Elmer/Cetus사 등의 자동 서멀 사이클러를 이용하여 일반적인 PCR 사이클 조건하에서 그 사이클을 25∼60회 반복하지만, 증폭을 위한 사이클 수는 적절하게 목적에 따라 적당한 횟수로 할 수 있다. PCR 사이클 조건으로서는 예컨대 변성 90∼95℃ 5∼100초, 어닐링 40∼60℃ 5∼150초, 신장 65∼75℃ 30∼300초의 사이클, 바람직하게는 변성 94℃ 15초, 어닐링 58℃ 15초, 신장 72℃ 45초의 사이클을 들 수 있지만, 어닐링의 반응 온도 및 시간은 적절하게 실험에 의해 적당한 값을 선택할 수 있으며, 변성 반응 및 신장 반응의 시간도 예상되는 PCR 산물의 쇄 길이에 따라 적당한 값을 선택할 수 있다. 어닐링의 반응 온도는 통상 프라이머와 주형 DNA의 하이브리드의 Tm 값에 따라 바꾸는 것이 바람직하다. 신장 반응의 시간은 통상 100O bp의 쇄 길이당 1분 정도가 대개 표준이지만, 보다 짧은 시간을 선택하는 것도 경우에 따라 가능하다.

본 명세서 중 「올리고뉴클레오티드」란, 비교적 짧은 단일쇄 또는 이중쇄의 폴리뉴클레오티드이며, 바람직하게는 폴리데옥시뉴클레오티드를 들 수 있고, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734(1989)에 기재되어 있는 바와 같은 기지의 방법, 예컨대 포스포트에스테르법, 포스포디에스테르법, 포스파이트법, 포스포아미다이트법, 포스포네이트법 등의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다. 통상 합성은 수식된 고체 지지체 상에서 합성을 편리하게 행할 수 있는 것이 알려져 있으며, 예컨대 자동화된 합성 장치를 이용하여 행할 수 있고, 상기 장치는 시판되고 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 수식된 염기를 함유하고 있어도 좋고, 예컨대 이노신 등의 천연에 있어서는 보통이 아닌 염기 혹은 트리틸화된 염기 등을 함유하고 있어도 좋으며, 경우에 따라서는 마커가 첨부된 염기를 함유하고 있어어 좋다.

소정의 핵산을 동정하기 위해서는 하이브리드화 기술을 이용할 수 있다. 상기 하이브리드화는 상기 「유전자 재조합 기술」을 개시하는 문헌 기재의 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법 및 개변법에 따라 행할 수 있다. 예컨대 하이브리드화는 DNA 등의 핵산을 함유하고 있는 샘플을 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체에 전사시키고, 필요에 따라 변성 처리, 고정화 처리, 세정 처리 등을 실시한 후, 그 담체(예컨대 막 등)에 전사된 것을, 필요히 따라 변성시킨 표지 프로브 DNA 단편과, 하이브리드화용 완충액 속에서 반응시켜 행해진다.

하이브리드화 처리는 보통 약 35∼약 80℃, 보다 적합하게는 약 50∼약65℃에서, 약 15분간∼약 36시간, 보다 적합하게는 약 1∼약 24시간 행해지지만, 적절하게 최적의 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대 하이브리드화 처리는 약 55℃에서 약 18시간 행해진다. 하이브리드화용 완충액으로서는 상기 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있으며, 예컨대 Rapid hybridization buffer(Amersham사) 등을 이용할 수 있다. 전사한 담체(예컨대 막 등)의 변성 처리로서는 알칼리 변성액을 사용하는 방법을 들 수 있으며, 그 처리 후 중화액 및 완충액으로 처리하는 것이 바람직하다. 또, 담체(예컨대 막 등)의 고정화 처리로서는 보통 약 40∼약 100℃, 보다 적합하게는 약 70∼약 90℃에서 약 15분간∼약 24시간, 보다 적합하게는 약 1∼약 4시간 베이킹함으로써 행해지지만, 적절하게 바람직한 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대 필터 등의 담체를 약 80℃에서 약 2시간 베이킹함으로써 고정화가 행해진다. 전사된 담체(예컨대 막 등)의 세정 처리로서는 상기 분야에서 대개 사용되는 세정액, 예컨대 1 M NaCl, 1 mM EDTA 및 O.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등으로 세정함으로써 행할 수 있다. 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체로서는 상기 분야에서 대개 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있다.

상기 알칼리 변성액, 중화액, 완충액으로서는 상기 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있고, 알칼리 변성액으로서는 예컨대 0.5 M NaOH 및 1.5M NaCl을 함유하는 액 등을 들 수 있으며, 중화액으로서는 예컨대 1.5 M NaCl 함유 0.5M Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등을 들 수 있고, 완충액으로서는 예컨대 2× SSPE(0.36 M NaCl, 20mM NaH₂P0₄ 및 2 mM EDTA) 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리드화 처리에 앞서, 비특이적인 하이브리드화 반응를 막기 위해 필요에 따라 전사한 담체(예컨대 막 등)는 사전 하이브리드화 처리하는 것이 바람직하다. 이 사전 하이브리드화 처리는 예컨대 사전 하이브리드화 용액[50% 포름아미드, 5×덴하르트 용액(0.2% 소혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐 피롤리돈), 5×SSPE, 0.1% SDS, 100 ㎍/㎖ 열변성 연어 정자 DNA] 등에 침지하여 약 35∼약 50℃, 바람직하게는 약 42℃에서 약 4∼약 24시간, 바람직하게는 약 6∼약 8시간 반응시킴으로써 행할 수 있지만, 이러한 조건은 당업자라면 적절하게 실험을 반복하여 보다 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 하이브리드화에 이용하는 표지 프로브 DNA 단편의 변성은 예컨대 약 70∼약 100℃, 바람직하게는 약100℃에서 약 1∼약 60분간, 바람직하게는 약 5분간 가열하는 등으로서 행할 수 있다. 또한, 하이브리드화는 자체 공지된 방법 혹은 그것에 준한 방법으로 행할 수 있지만, 본 명세서에서 엄격한 조건이란, 예컨대 나트륨 농도에 관하여 약 15∼약 50 mM, 바람직하게는 약 19∼약 40 mM, 보다 바람직하게는 약 19∼약 20 mM, 온도에 대해서는 약 35∼약 85℃, 바람직하게는 약 50∼약 70℃, 보다 바람직하게는 약 60∼약 65℃의 조건을 나타낸다.

하이브리드화 완료후, 필터 등의 담체를 충분히 세정 처리하고, 특이적인 하이브리드화 반응을 한 표지 프로브 DNA 단편 이외의 표지 프로브를 제거한 후에 검출 처리를 할 수 있다. 필터 등의 담체의 세정 처리는 상기 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용하여 행할 수 있으며, 예컨대 0.1% SDS 함유 0.5×SSC(O.15M NaCl, 15 mm 시트르산) 용액 등으로 세정함으로써 실시할 수 있다.

하이브리드화한 핵산은 대표적으로는 오토라디오그래피에 의해 검출할 수 있지만, 상기 분야에서 이용되는 방법 중에서 적절하게 선택하여 검출에 이용할 수 있다. 검출한 시그널에 해당하는 핵산 밴드를 적절한 완충액, 예컨대 SM 용액(10O mN NaCl 및 1O mM MgSO₄ 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5) 등에 현탁하고, 이어서 이 현탁액을 적절히 희석하여 소정의 핵산을 단리·정제하고, 추가로 증폭 처리할 수 있다. 본 명세서에서 「높은 상동성」이란 상기 대상 서열의 길이에 따라서, 예컨대 50% 이상, 나아가서는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 그리고 특정한 경우에는 95% 이상, 특히, 바람직하게는 97% 이상인 것이 좋다. 상기 「동효의 염기 서열」이란, 예컨대 엄격한 조건에서 문제의 서열을 갖는 것에 하이브리드화하는 것도 좋고, 예컨대 상기 염기 서열 중 연속한 5개 이상의 염기 서열, 바람직하게는 10개 이상의 염기 서열, 보다 바람직하게는 15개 이상의 염기 서열, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 염기 서열과 하이브리드화하고, 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 것 등을 들 수 있다. 핵산은 화학 합성에 의해 얻을 수도 있다. 그 경우 단편을 화학 합성하고, 이들을 효소에 의해 결합하여도 좋다.

하이브리드화 처리에 의해 유전자 라이브러리 및 cDNA 라이브러리 등을 함유한 핵산 샘플로부터 목적 핵산을 스크리닝하는 처리는 반복하여 행할 수 있다. 클로닝되어 있는 인간 유래의 cDNA 라이브러리, 예컨대 여러 가지 인간 유래의 조직 혹은 배양 세포(특히, 인간의 신장, 뇌, 송과체, 하수체 후엽, 신경 세포, 망막, 망막 혈관 세포, 망막 신경 세포, 흉선, 혈관, 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 혈액 세포, 매크로파지, 림프구, 정소, 난소, 자궁, 장, 심장, 간장, 췌장, 소장, 대장, 치육 관련 세포, 피부 관련 세포, 사구체 세포, 뇨세관 세포, 결합 조직 세포 등의 조직·세포, 또한, 각종 종양 조직, 암 세포 등) cDNA 라이브러리를 이용할 수 있다. 또한, 주형 등으로서 이용되는 cDNA 라이브러리는 시판되고 있는 여러 가지 조직 유래 cDNA 라이브러리를 직접 사용할 수도 있으며, 예컨대 Stratagene 사, Invitrogen 사, Clontech 사 등으로부터 시판된 cDNA 라이브러리를 이용할 수 있다. 전형적인 예로서는 인간 조직·세포로 조제된 유전자 라이브러리, 예컨대 인간 P1 인공 염색체 게놈 라이브러리(Human Genome Mapping Resource Center), 인간 조직 cDNA 라이브러리(예컨대 Clontech 사 등으로부터 구입할 수 있음)를 이용할 수 있다. 여러 가지 인간 조직 혹은 배양 세포 등으로부터 구축된 인간 게놈 DNA 라이브러리 혹은 인간 유래 cDNA 라이브러리를, 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 프로브 등을 방사성 동위체 등에 의해 표지하기 위해서는 시판된 표지 키트, 예컨대 랜덤 프라임 DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim 사) 등을 사용하여 행할 수 있다. 예컨대 random-priming 키트(Pharmacia LKB 사, Uppsala) 등을 사용하고, 프로브용 DNA를 [α-^32P]dCTP (Amersham 사) 등으로 표지하여 방사활성을 가진 프로브를 얻을 수 있다.

소정의 핵산을 보유하는 파지 입자, 재조합 플라스미드, 재조합 벡터 등은 상기 분야에서 대개 사용되는 방법으로 그것을 정제 분리할 수 있으며, 예컨대 글리세롤 구배 초원심 분리법(Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989), 전기 영동법 등에 의해 정제할 수 있다. 파지 입자 등으로부터는 상기 분야에서 대개 사용되는 방법으로 DNA를 정제 분리할 수 있으며, 예컨대 얻어진 파지 등을 TM 용액(1O mM MgS0₄ 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8) 등에 현탁하고, DNase I 및 RNase A 등으로 처리 후, 20 mM EDTA, 50 ㎍/㎖ 프로테인아제 K 및 O.5% SDS 혼합액 등을 첨가하여 약 65℃, 약 1시간 보온한 후, 이것을 페놀 추출 디에틸에테르 추출 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시키고, 다음에 얻어진 DNA를 70% 에탄올로 세정 후 건조하고, TE 용액(1O mM EDTA 함유 10 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0)에 용해하는 등으로 얻을 수 있다. 또한, 목적으로 하고 있는 DNA는 서브 클로닝 등에 의해 대량으로 얻을 수 있으며, 예컨대 서브 클로닝은 숙주로서 대장균을 이용하여 플라스미드 벡터 등을 이용하여 행할 수 있다. 이렇게 한 서브 클로닝에 의해 얻어진 DNA도 상기와 마찬가지로 하여 원심 분리, 페놀 추출, 에탄올 침전 등의 방법에 의해 정제 분리할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 얻어진 PCR 산물 등의 핵산(DNA를 포함)은 통상 1∼2% 아가로스겔 전기 영동에서 특이한 밴드로서 겔로부터 추출하고, 예컨대 gene clean kit(Bio 101) 등의 시판된 추출 키트를 이용하여 추출한다. 추출된 DNA는 적당한 제한 효소로 절단하고, 필요에 따라 정제 처리하거나, 나아가서는 필요에 따라 5' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 등에 의해 인산화한 후, pUC18 등의 pUC계 벡터라는 적당한 플라스미드 벡터에 라이게이션하고, 적당한 컴피턴트 세포를 형질 전환한다. 클로닝된 PCR 산물은 그 염기 서열을 해석한다. PCR 산물의 클로닝에는 예컨대 p-Direct(Clontech 사), pCR-Scrip^TM SK(+)(Stratagene 사), pGEM-T(Promega 사), pAmp^TM(Gibco-BRL 사) 등의 시판된 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 숙주 세포의 형질 전환을 하기 위해서는 예컨대 파지 벡터를 사용하거나 칼슘법, 루비듐/칼슘법, 칼슘/망간법, TFB 고효율법, FSB 동결 컴피턴트 세포법, 신속 콜로니법, 엘렉트로포레이션 등 상기 분야에서 알려진 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있다(D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983 등). 목적으로 하는 DNA를 단리하기 위해서는 역전사 PCR(polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR), RACE(rapid amplification of cDNA ends)를 적용할 수 있다. RACE는 예컨대 M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols"(M. A. Frohman, "a guide to methods and applications", pp. 28-38, Academic Press, New York(1990) 등에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

DNA는 필요에 따라 클로닝 가능하며, 예컨대 플라스미드, λ 파지, 코스미드, P1 파지, F 인자, YAC 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 λ 파지 유래의 벡터를 들 수 있으며, 예컨대 Charon 4A, Charon 21A, λgt10, λgt11, λDASHII, λ FIXII, λEMBL3, λZAPII^TM(Stratagene 사)등을 이용할 수 있다. 또, 얻어진 DNA를 하기에서 자세히 설명하는 적당한 벡터, 예컨대 플라스미드 pEX, pMAMneo, pKG5 등의 벡터에 조립하고, 하기에서 상세히 설명하는 적당한 숙주 세포, 예컨대 대장균, 효모, CHO 세포, COS 세포 등으로 발현시킬 수 있다. 또, 상기 DNA 단편은 그대로 혹은 적당한 제어 서열을 부가한 DNA 단편으로서, 또는 적당한 벡터에 조립하고, 그리고 동물에게 도입하여 소정의 유전자를 발현하는 트랜스게닉 동물을 작성할 수 있다. 동물로서는 포유동물을 들 수 있으며, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 소 등을 들 수 있다. 바람직하게는 마우스 등 동물의 수정란에 상기 DNA 단편을 도입하여, 트랜스게닉 동물을 작성할 수 있다. 소정의 유전자 산물의 동정을 상기 외래 유전자를 형질감염시킨 293T 세포, COS-1 세포 등 그것에 알맞은 동물 세포 등을 이용하여 행할 수 있다.

외래 유전자를 포유동물 등의 동물 세포에 도입하는 방법으로서는 상기 분야에 공지된 방법 혹은 그것과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있으며, 예컨대 인산칼슘법(예컨대 F. L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973 등), DEAE-덱스트란법(예컨대 D. Warden et al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968 등),엘렉트로포레션법(예컨대 E. Neumann et al., EMBO J, 1: 841, 1982 등), 마이크로인젝션법, 리보솜법, 바이러스 감염법, 파지 입자법 등을 들 수 있다. 이렇게 해서 소정의 유전자를 형질감염시킨 동물 세포가 산생하는 유전자 산물을 해석할 수도 있다.

소정의 유전자 등(본 발명에서 얻어진 DNA 등)을 조립하는 플라스미드로서는 유전자 공학적으로 상용되는 숙주 세포(예컨대 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 숙주, 효모, 293T 세포, CHO 세포, COS 세포 등의 진핵 세포 숙주, Sf21 등의 곤충 세포 숙주) 중에서 상기 DNA가 발현되는 플라스미드라면 어떠한 플라스미드라도 좋다. 물론, 시판된 키트 및 시약에 첨부된 것으로부터 선택하여 사용할 수도 있다. 이러한 서열 내에는, 예컨대 선택한 숙주 세포에서 발현하기 적합하게 수식된 코돈이 함유되어 있을 수 있고, 제한 효소 부위가 마련되어 있을 수 있으며, 목적으로 하는 유전자의 발현을 쉽게 하기 위한 제어 서열, 촉진 서열 등, 목적으로 하는 유전자를 결합하는데 도움이 되는 링커, 어댑트 등, 나아가서는 항생 물질 내성 등을 제어하거나 대사를 제어하거나 하여 선별 등에 유용한 서열(하이브리드 단백질 및 단백질을 코딩하는 것도 포함) 등을 포함하고 있을 수 있다. 바람직하게는 적당한 프로모터, 예컨대 대장균을 숙주로 하는 플라스미드로서는, 트립토판 프로모터(trp), 락토스 프로모터(lac), 트립토판·락토스 프로모터(tac), 리포프로테인 프로모터(lpp), λ 파지 P_L 프로모터 등을, 동물 세포를 숙주로 하는 플라스미드로서는 SV40 레이트 프로모터, MMTV LTR 프로모터, RSV LTR 프로모터, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등을, 효모를 숙주로 하는 플라스미드로서는 GAL1, GAL10 프로모터 등을 사용할 수 있다. 또한, CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, U RA3, LEU2, EN0, TP1, AOX1 등의 제어계를 사용할 수도 있다.

원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 촉진하기 위해 인핸서를 벡터에 삽입할 수 있고, 그러한 인핸서로서는 프로모터에 작동하여 전사를 촉진하는 작용을 가지며, 통상, 약 10∼10O bp의 cis 작용을 갖는 성분인 것을 들 수 있다. 대부분의 인핸서가 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인, 안슐린 등의 포유동물 유전자로부터 알려져 있다. 대표적으로는 진핵 세포 감염성바이러스로부터 얻어지는 인핸서를 적합하게 사용할 수 있으며, 예컨대 복제 기점 레이트 영역에 있는 SV40 인핸서(100-270 bp), 사이토메갈로 바이러스의 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마의 복제 기점의 레이트 영역에 있는 인핸서, 아데노 바이러스의 인핸서 등의 예를 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 숙주에 있던 시그널 서열을 부가할 수도 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있다.

대장균을 숙주로 하는 플라스미드로서는, 예컨대 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KS^TM(Stratagene 사) 등을 들 수 있다. 대장균에서의 발현에 적합한 플라스미드 벡터로서는, 예컨대 pAS, pKK223(Pharmacia 사), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B(Invitrogen 사) 등도 들 수 있다. 동물 세포를 숙주로 하는 플라스미드로서는 예컨대 SV40 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터, 왁시니아·바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 pcD, pcD-SRα, CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5(Stratagene 사) 등을 들 수 있다. 효모를 숙주로 하는 플라스미드로서는 YIp형 벡터, YEp형 벡터, YRp형 벡터, YCp형 벡터 등을 들 수 있으며, 예컨대 pGPD-2 등을 들 수 있다. 숙주 세포로서는 숙주 세포가 대장균인 경우, 예컨대 대장균 K12 주에 유래하는 것을 들 수 있고, 예컨대 NM533, XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B834 주 유래로서는 BL21(DE3)pLysS 등을 들 수 있다. 숙주 세포가 효모인 경우, 예컨대 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces 주, Candida, Trichoderma reesia, 그 밖의 효모주 등을 들 수 있다.

숙주 세포가 동물 세포인 경우, 예컨대 아프리카 초록 원숭이 선유아세포 유래의 COS-7 세포, COS-1 세포, CV-1 세포, 인간 신장 세포 유래 293 세포, 인간 표피 세포 유래 A431 세포, 인간 결장 유래 205 세포, 마우스 선유아세포 유래의 COP 세포, MOP 세포, WOP 세포, 차이니즈·햄스터 세포 유래의 CHO 세포, CHO DHFR^-세포, 인간 HeLa 세포, 마우스 세포 유래 C127 세포, 마우스 세포 유래 NIH 3T3 세포, 마우스 L 세포, 9BHK, HL60, U937, HaK, Jurkat 세포, 그 밖의 형질 전환되어 얻어진 세포주, 통상의 2배체세포, 시험관내의 일차 배양 조직으로부터 유도된 세포주 등을 들 수 있다. 곤충 세포로서는 누에핵 다각체병 바이러스(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus), 그것에 유래되는 것 혹은 그 밖의 적절한 것을 벡터로 하고, Spodoptera frugiperda(caterpillar), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster(fruitfly), 누에 유충 혹은 누에 배양 세포, 예컨대 BM-N 세포 등을 이용하는 것을 들 수 있다(예컨대 Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47-55(1988); Setlow, J. K. et al. (eds.), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, Plenum Publishing, 1986; Maeda et al., Nature, 315, pp. 592-594(1985)). Agrobacterium tumefaciens 등을 이용하여 식물 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있으며, 그것에 적합한 벡터와 함께 이들은 상기 분야에서 널리 알려져 있다. 본 발명의 유전자 공학적 수법에 있어서는 상기 분야에서 알려졌거나 혹은 범용되어 있는 제한 효소, 역전사 효소, DNA 단편을 클론화 하는데 적합한 구조로 수식하거나 혹은 변환하기 위한 효소인 DNA 수식·분해 효소, DNA 폴리머라제, 말단 뉴클레오티딜 트랜스페라제, DNA 리가제 등을 이용할 수 있다. 제한 효소로서는 예컨대 R. J. Roberts, Nucleic Acids Res., 13: r165, 1985; S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res. , 19: Supp1. 2077, 1991 등에 기재한 것을 들 수 있다.

본 발명에 따라, 폴리펩티드(또는 단백질)를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현벡터로 형질 전환된 형질 전환체는 필요에 따라서 적당한 선택 마커를 이용하고, 반복 클로닝을 행함으로써, 높은 발현능을 안정적으로 갖는 세포주를 얻을 수 있다. 예컨대 숙주 세포로서 동물 세포를 이용한 형질 전환체에 있어서, dhfr 유전자를 선택 마커로서 이용한 경우, MTX 농도를 서서히 올려 배양하고, 내성주를 선택함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭시켜, 보다 높은 발현을 얻을 수 있는 세포주를 얻을 수 있다. 본 발명의 형질 전환체는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 발현 가능한 조건하에서 배양하여, 목적물을 생성, 축적할 수 있다. 상기 형질 전환체는 상기 분야에서 범용되어 있는 배지 중에서 배양할 수 있다. 예컨대 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 숙주, 효모 등을 숙주로 하고 있는 형질 전환체는 액체 배지를 적합하게 사용할 수 있다. 배지 중에는 상기 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 그 밖의 것이 함유되어 있다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 쇼당 등, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 컨스팁·리커, 펩톤, 카제인, 육류 엑기스, 맥아 엑기스, 대두분, 감자 추출액 등의 무기 또는 유기 물질, 무기물로서는 예컨대 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 효모, 비타민류, 카사미노산, 성장 촉진 인자 등을 첨가하여도 좋다. 또, 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해, 예컨대 3β-인돌릴 아크릴산와 같은 약제를 첨가할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼약 8이 바람직하다.

배양은 예컨대 대장균에서는 통상 약 15∼약 45℃에서 약 3∼약 75시간 행하고, 필요에 따라, 통기 및 교반을 가할 수도 있다. 숙주가 동물 세포인 형질 전환체를 배양할 때, 배지로서는, 예컨대 약 5∼약 20%의 태아 소혈청을 함유하는 MEM 배지, PRMI1640 배지, DMEM 배지 등이 이용된다. pH는 약 6∼약 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30∼약 40℃에서 약 15∼약 72시간 행하며, 필요에 따라 통기나 교반을 가한다. 소정의 유전자 산물을 발현하고 있는 형질 전환체는 그대로 이용 가능하지만, 그 세포 균질물도 이용할 수 있지만, 소정의 유전자 산물을 단리하여 이용할 수도 있다. 상기 배양 세포로부터 추출할 때에는 배양 후, 공지한 방법으로 균체 혹은 세포를 모아, 이것을 적당한 완충액에 현탁하여, 초음파, 리조침 및/또는 동결 융해 등에 의해 균체 혹은 세포를 파괴한 후, 원심 분리및 여과에 의해 조추출액을 얻는 방법 등을 적절하게 이용할 수 있다. 완충액 속에는 요소 및 염산 구아니딘 등의 단백질 변성제 및 트리톤 X-100(상품명), 트윈-20(상품명) 등의 계면 활성제를 첨가하여도 좋다. 배양액 속에 목적 생성물이 분비되는 경우에는 배양 종료 후, 이것 자체 공지한 방법으로 균체 혹은 세포와 상청을 분리하여 상청을 모은다.

이와 같이 하여 얻어진 배양 상청, 혹은 추출액 속에 함유되는 목적 생성물은 자체 공지한 분리·정제법을 적절히 조합하여 그 정제를 행하는 수 있으며, 예컨대 황산암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스 등에 의한 겔 여과법, 예컨대 디에틸아미노에틸기 혹은 카르복시메틸기 등을 갖는 담체 등을 이용한 이온 교환 크로마토그래피법, 예컨대 부틸기, 옥틸기, 페닐기 등 소수성기를 갖는 담체 등을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 색소 겔 크로마토그래피법, 전기 영동법, 투석, 한외여과법, 친화도·크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 리간드 등을 고정화한 친화도·크로마토그래피 등으로 처리하고, 정제 분리 처리할 수 있다. 예컨대 젤라틴-아가로오스·친화도·크로마토그래피, 헤파린-아가로오스·크로마토그래피 등을 들 수 있다.

또한, 얻어진 본 발명의 폴리펩티드(또는 단백질)는 화학적인 수법으로 그 함유되는 아미노산 잔기를 수식할 수도 있고, 펩티다아제, 예컨대 펩신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라인, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제 등의 효소를 이용하여 수식하거나 부분 분해하거나 하여 그 유도체 등으로 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기(-C00H) 또는 카르복시레이트(-C00^-)이지만, C 말단이 아미드(-C0NH₂) 또는 에스테르(-COOR)라도 좋다. 여기서 에스테르에 있어서의 R로서는 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 혹은 n-부틸 등의 C_1-6 알킬기, 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8 시클로알킬기, 예컨대 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12 아릴기, 예컨대 벤질, 페네틸 등의 페닐-C_1-2 알킬기 혹은 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2 알킬기 등의 C_7-14 아랄킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등이 이용된다. 본 발명의 단백질이 C 말단 이외에 카르복실기(또는 카르복시레이트)를 구비한 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 폴리펩티드에 함유된다. 이 경우의 에스테르로서는 예컨대 상기한 C 말단의 에스테르 등이 이용된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드(또는 단백질)에는 상기한 폴리펩티드에 있어서, N 말단의 메치오닌 잔기의 아미노기가 보호기(예컨대 포르밀기, 아세틸 등의 C_1-5 알킬-카르보닐기 등의 C_1-6 아실기 등)로 보호되어 있는 것, N 말단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타밀기가 피로글루타밀화 된 것, 분자내 아미노산의 측쇄 상의 치환기(예컨대 -OH, -COOH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등)가 적당한 보호기(예컨대 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6 아실기 등)로 보호되어 있는 것 혹은 당쇄가 결합한 소위 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

또한, 본 발명에 관계되는 유전자 염기 서열을 기초로 유전자 공학적으로 상용되는 방법을 이용함으로써, 소정 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 적절하게, 1개 내지 복수개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 전이 혹은 부가한 변이를 도입한 해당하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 변이·변환·수식법으로서는 예컨대 일본 생화학회 지음, 「속생화학 실험 강좌 1, 유전자 연구법 II」, p105(코우세진), 동경 화학 동인(1986); 일본 생화학회 지음, 「신생화학 실험 강좌 2, 핵산 III(재조합 DNA 기술)」, p233(코우세진), 동경 화학 동인(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York(1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York(1983); J. A. Wells et al., Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York(1987); A. R. 0liphant et al., Gene, 44: 177, 1986 등에 기재한 방법을 들 수 있다. 예컨대 합성 올리고뉴클레오티드 등을 이용하는 위치 지정 변이 도입법(부위 특이적 변이 도입법)(Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), 카세트 변이 도입법(cassette mutagenesis: Wel1s et al., Gene, 34: 315, 1985), 제한 부위 선택 변이 도입법(restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), 알라닌·스캐닝법(Cunningham & Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR 변이 도입법, Kunkel법, dNTP[αS]법 (Eckstein), 아황산 및 아질산 등을 이용하는 영역 지정 변이 도입법 등의 방법을 들 수 있다.

또, 유전자 재조합법으로 제조할 때에 융합 폴리펩티드(융합 단백질)로서 발현시키고, 생체내 혹은 생체 밖에서 원하는 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것에 변환·가공하여도 좋다. 유전자 공학적으로 상용되는 융합 산생법을 이용할 수 있지만, 이러한 융합 폴리펩티드는 그 융합부를 이용하여 친화도크로마토그래피 등으로 정제할 수도 있다. 이러한 융합 폴리펩티드로서는 히스티딘 태그에 융합시킨 것 혹은 β-갈락토시다제(β-gal), 말토스 결합 단백(MBP), 글루타치온-S-트랜스페라제(GST), 티오레독신(TRX) 또는 Cre Recombinase의 아미노산 서열에 융합시킨 것 등을 들 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 이종 에피토프의 태그가 부가되어, 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 면역친화도·크로마토그래피에 의한 정제를 할 수도 있다. 보다 적합한 실시 형태에 있어서는 폴리히스티딘(poly-His) 또는 폴리히스티딘-글리신(poly-His-Gly) 태그, 또한 상기 에피토프 태그로서는 예컨대 AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha. 11, KT3, FLAG(등록상표, Sigma-Aldrich), 0mni-프로브, S-프로브, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-G 등을 들 수 있다(Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp. 2159-2165(1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp. 3610-3616(1985); Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): pp. 547-553(1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp. 1204-1210(1988); Martin et al., Science, 255: pp. 192-194(1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp. 15163-15166(1991); Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp. 6393-6397(1990) 등). 효모를 이용한 two-hybrid법도 이용할 수 있다.

또한, 융합 폴리펩티드로서는 검출 가능한 단백질이 되는 마커가 첨부된 것도 가능하다. 보다 적합한 실시 형태에 있어서는 상기 검출 가능한 마커는 비오틴/스트렙트아비딘계의 Biotin Avi Tag, 형광을 발하는 물질 등이라도 좋다. 상기 형광을 발하는 물질로서는 오안클라게(Aequorea victorea) 등의 발광 해파리 유래의 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 그것을 개변한 변이체(GFP 변형체), 예컨대 EGFP(Enhanced-humanized GFP), rsGFP(red-shift GFP), 황색 형광 단백질(yel1ow fluorescentn protein: YFP), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein: BFP), 바다 버섯(Renilla reniformis) 유래의 GFP 등을 들 수 있다(미야와키아쯔시 지음, 실험 의학 별책 포스트게놈 시대의 실험 강좌 3-GFP와 바이오 이메징, 양토사(2000년)). 또한, 상기 융합 태그를 특이적으로 인식하는 항체(모노클로날 항체 및 그 단편을 포함)를 사용하여 검출할 수도 있다. 이러한 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제는 그것에 적합한 시판되고 있는 키트를 이용하여 행할 수 있고, 키트 제조업자 혹은 키트 판매업자에 의해 명백해진 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.

얻어진 단백질(펩티드 혹은 폴리펩티드를 포함하고 있어도 좋음)은 그것을 효소 면역 측정법 등 알려진 수법으로 적당한 담체 혹은 고상에 결합시켜 고상화할 수 있다. 고상화 단백질, 고상화 펩티드는 편리하게 결합 분석 및 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

폴리펩티드 및 단백질 구조의 수식·개변 등은 예컨대 일본 생화학회 지음, 「신생화학 실험 강좌 1, 단백질 VII, 단백질 공학」, 동경 화학 동인(1993)을 참고로 하고, 거기에 기재한 방법 혹은 거기에 인용된 문헌 기재의 방법, 나아가서는 이들과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있다. 또한, 하기하는 바와 같이 그 생물학적 활성 중에는 면역적으로 활성, 예컨대 항원성을 갖는 것도 포함되어도 좋다. 상기 수식·개변 중에는 탈아미노화, 히드록실화, 카르복실화, 인산화, 황산화, 메틸화 등의 알킬화, 아세틸화 등의 아실화, 에스테르화, 아미드화, 개환, 폐환, 글리코실화, 함유 당쇄의 종류가 다른 것으로 바꾸는 것, 함유 당쇄의 수를 증감하는 것, 지질 결합, D-체 아미노산 잔기로의 치환 등이라도 좋다. 이들의 방법은 상기 분야에서 알려져 있다(예컨대 T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, pp. 79-86 W. H. Freeman & Co., San Francisco, USA(1983)등).

본 발명의 인간 유래의 펩티드 혹은 폴리펩티드(또는 단백질)는 1개 이상의 아미노산 잔기가 동일성인 점에서 천연의 것과 다른 것, 1개 이상의 아미노산 잔기의 위치가 천연의 것과 다른 것이라도 좋다. 본 발명의 인간 유래의 펩티드는 인간 갈렉틴 9(L, M 및 S 형을 포함) 단백질에 특유한 아미노산 잔기가 1개 이상(예컨대 1∼80개, 바람직하게는 1∼60개, 더욱 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 특히, 1∼10개 등) 결여되어 있는 결실 유연체, 특유의 아미노산 잔기의 1개 이상(예컨대 1∼80개, 바람직하게는 1∼60개, 더욱 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 특히, 1∼10개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예컨대 1∼80개, 바람직하게는 1∼60개, 더욱 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 특히, 1∼10개 등)의 아미노산 잔기가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함된다.

천연 인간 갈렉틴 9 단백질의 특징인 도메인 구조 혹은 당결합능이 유지되어 있으면, 상기한 바와 같은 변이체는 전부 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 펩티드 혹은 폴리펩티드는 천연 인간 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 일차구조를 갖고 있는 것이 포함되어도 좋다고 생각되고, 또한, 천연인 것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것이 포함되어 좋다고도 생각된다. 또한 천연에 발생하는 변이체 중 하나인 것도 가능하다. 본 발명의 인간 유래의 단백질(또는 펩티드 혹은 폴리펩티드)은 예컨대 WO 02/37114 A1의 서열목록 서열 번호 1∼3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여, 60%, 경우에 따라서는 70%보다 높은 상동성을 갖고 있는 것을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 그것에 대하여, 80% 혹은 90% 이상의 상동 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 본 발명의 인간 유래의 단백질의 일부인 것은 상기 인간 유래의 단백질 일부의 펩티드(즉, 상기 단백질의 부분 펩티드)로서, 본 발명의 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 것이면 어느 것이라도 좋다. 예컨대 상기 본 발명의 단백질의 부분 펩티드는 상기 인간 갈렉틴 9의 구성 아미노산 서열 중 적어도 5개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상, 보다 바람직하게는 70개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상, 어떤 경우에는 200개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 들 수 있으며, 바람직하게는 이들은 연속한 아미노산 잔기에 대응하는지 혹은 예컨대 상기 W0 02/37114 A1 서열목록의 서열 번호 1∼3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 중 대응하는 영역에 대한 상동성에 대해서, 상기와 동일한 상동성을 갖는 것을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「실질적으로 동등」이란 단백질의 활성, 예컨대 소정의 세포 상해 활성, 아포토시스 유발 활성, 항염증 활성, 항알레르기 활성, 면역 억제 활성, 당쇄 결합 활성, 생리적인 활성, 생물학적인 활성이 실질적으로 같은 것을 의미한다. 또한, 그 용어의 의미 중에는 실질적으로 동질의 활성을 갖는 경우를 포함하고 있어도 좋고, 상기 실질적으로 동질의 활성으로서는 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유발 활성 등을 들 수 있다. 상기 실질적으로 동질 활성이란, 이들의 활성이 성질적으로 동질인 것을 나타내며, 예컨대 생리적으로, 약리학적으로 혹은 생물학적으로 동질인 것을 나타낸다. 예컨대 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유발 활성 등의 활성이 동등(예컨대 약 0.001∼약 1000배, 바람직하게는 약 0.01∼약 100배, 보다 바람직하게는 약 0.1∼약 20배, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼약 2배)한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도, 단백질 분자량 등의 양적인 요소는 다르더라도 좋다. 다음에, 아미노산의 치환, 결실 혹은 삽입은 가끔 폴리펩티드의 생리적인 특성 및 화학적인 특성에 큰 변화를 일으키지 않으며, 어떤 경우에는 바람직한 변화를 부여한다. 이러한 경우, 그 치환, 결실 혹은 삽입이 실시된 폴리펩티드는 그러한 치환, 결실 혹은 삽입이 되어 있지 않은 것과 실질적으로 동일하게 될 것이다. 상기 아미노산 서열 중 아미노산이 실질적으로 동일한 치환체로서는, 그 아미노산이 속하는 클래스 중 다른 아미노산류로부터 선택할 수 있을 수 있다. 예컨대 비극성(소수성) 아미노산으로서는 알라닌, 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 트립토판, 메치오닌 등을 들 수 있으며, 극성(중성)으로서는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있고, 양전하를 갖는 아미노산(염기성 아미노산)으로서는 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있으며, 음전하를 갖는 아미노산(산성 아미노산)으로서는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.

본 발명의 단백질 및 그 일부인 펩티드의 합성에는 상기 펩티드 합성 분야에서 알려진 방법, 예컨대 액상 합성법, 고상 합성법 등의 화학 합성법을 사용할 수 있다. 이러한 방법에서는 예컨대 단백질 혹은 펩티드 합성용 수지를 이용하여, 적당히 보호한 아미노산을 그 자체 공지된 각종 축합 방법에 의해 원하는 아미노산 서열에 차례로 상기 수지 상에서 결합시켜 간다. 축합 반응에는 바람직하게는 그 자체 공지된 각종 활성화 시약을 이용하지만, 그러한 시약으로서는 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 등 카르보디이미드류를 바람직하게 사용할 수 있다. 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 적절하게 보호기를 제거함으로써 원하는 것을 얻을 수 있다.

본 발명의 펩티드(또는 폴리펩티드)는 그것이 유리형인 것으로서 얻어진 경우에는 그 자체 공지된 방법 혹은 그것에 준한 방법에 의해 염으로 변환될 수 있으며, 또한 이들은 염으로서 얻어진 경우에는 그 자체 공지된 방법 혹은 그것에 준한 방법으로 유리형인 것 혹은 다른 염으로 변환될 수 있다.

본 발명의 펩티드(또는 폴리펩티드)의 염으로서는 생리적으로 허용되는 것 혹은 의약으로서 허용되는 것이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 염으로서는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산과의 염, 예컨대 초산, 포름산, 말레산, 푸마르산, 호박산, 시트르산, 타르타르산, 사과산, 안식향산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 벤젠술폰산 등의 유기산과의 염 등을 들 수 있다. 또한, 상기 염으로서는 암모늄염, 예컨대 에틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 히드록시에틸아민 등의 유기 염기와의 염 등도 들 수 있다.

갈렉틴 9 발현 유전자(cDNA 등의 DNA 및 mRNA 등의 RNA를 포함)를 상기한 「유전자 재조합 기술」에 따라, 상기 분야에서 특정한 유전자의 발현을 검지 측정하기 위해 알려진 수법, 예컨대 in situ 하이브리드화, 노던 블로팅, 도트블로팅, RNase 프로텍션 어세이, RT-PCR, Real-Time PCR(Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000) 및 여기서 인용되어 있는 문헌), DNA 어레이 해석법[Mark Shena 지음, "Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing(2000년 3월)] 등에 의해 검지·측정하여 본 명세서 개시의 갈렉틴 9가 나타내는 생물 활성에 관련된 현상 등을 검지할 수 있다. 이러한 기술을 이용한 갈렉틴 9 발현 유전자 측정계, 그것에 이용되는 시약, 방법, 프로세스 등은 전부 본 발명의 기술 및 그것에 이용하는 시스템에 포함된다. 상기 in situ 하이브리드화에는 예컨대 논 RI in situ 하이브리드화가 포함되어도 좋으며, 여기에는 예컨대 직접법 및 간접법이 포함되어도 좋다. 상기 직접법은 예컨대 핵산 프로브에 검출 가능한 분자(리포터)가 직접 결합되어 있는 것을 사용하고, 상기 간접법은 예컨대 리포터 분자에 대한 항체 등을 사용하여 시그널을 증폭시키는 것이다. 핵산 프로브 중 올리고뉴클레오티드에는 작용기(예컨대 제1급 지방족 아미노기, SH기 등)가 도입되어 있으며, 이러한 작용기에 합텐, 형광 색소, 효소 등이 결합되어 있어도 좋다. 핵산 프로브의 표지로서는 대표적으로는 디곡시게닌(DIG), 비오틴, 플루오레세인 등을 들 수 있지만, 상기한 바와 같이 항체에서 설명한 표지로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있고, 또한 다중 라벨링도 이용할 수 있으며, 또한, 표지 항체도 이용할 수 있다. 핵산 프로브의 표지법으로서는 상기 분야에서 알려진 방법으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있지만, 예컨대 랜덤 프라임법, 닉·트랜스레이션법, PCR에 의한 DNA의 증폭, 라벨링/테일링법, 시험관내 전사법 등을 들 수 있다. 처리된 시료의 관찰에는 상기 분야에서 알려진 방법으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있지만, 예컨대 암시야 현미경, 위상차 현미경, 반사 콘트라스트 현미경, 형광 현미경, 디지털 이미징 현미경, 전자 현미경 등도 사용할 수 있으며, 또한, 플로우 사이토메트리 등에 따를 수도 있다.

본 명세서 중 악성 세포란, 전이를 하는 종양 세포를 포함하고 있어도 좋다. 전이를 행하는 종양은 악성 종양으로, 일반적으로 그 악성 종양은 상피성과 비상피성이 있으며, 어떤 경우에는 암, 육종, 백혈병 등으로 구분하여 생각되는 경우도 있지만, 간단히 「암」이라고 부른 경우, 일반인은 악성 종양을 가리키는 경우가 많다. 본 명세서에서 「암」이란, 넓은 의미로 해석하면 좋으며, 단순히 상피성 악성 종양으로 해석해서는 안된다. 본 명세서에 있어서 「암」이란, 상피성 악성 종양 및 비상피성 악성 종양(종양 형성성인 것도 비형성성인 것도 포함)을 포함하고 있어도 좋고, 피부암(흑색종을 포함하여도 좋음), 유방암, 난소암, 자궁암, 고환 악성 종양, 전립선암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 인두·후두암, 설암, 상악암, 식도암, 위암, 결장·직장암, 폐·기관지암, 간암(간 세포암, 간내 담관암을 포함), 간외담관·담낭암, 췌장암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 선유육종, 악성혈관종, 악성혈관내피종, 뇌종양(메닌기오머, 글리오머, 어스트로사이트머 등을 포함) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 갈렉틴 9가 갖는 활성을 이용하는 본 발명 소정의 목적 대상으로 되는 것은 모두 포함되며, 특히, 한정되지 않는 것은 이해되어야 한다.

본 발명에서 해명된 갈렉틴 9가 발휘하는 기능을 이용하여, 상기 갈렉틴 9 소정의 생물학적 활성 등의 기능(예컨대 세포 상해 활성, 아포토시스 유도 활성, 글루코코르티코이드와 유연한 활성, 악성 세포의 전이를 억제하는 활성 등)을 촉진하는 화합물(아고니스트) 및 저해하는 화합물(안타고니스트) 또는 이들 염을 스크리닝할 수 있다. 이것은 상기 스크리닝 시약의 제공도 의미한다. 이리하여, 본 발명에서 해명한 상기 갈렉틴 9 단백질 등의 폴리펩티드, 그 일부의 펩티드 또는 이들의 염이 나타내는 활성을 이용한 여러 가지 물질에 관하여, 본 발명의 상기 갈렉틴 9 단백질, 그 일부의 펩티드 또는 이들 염 등이 나타내는 생물학적 활성 등의 소정 기능을 촉진하는 화합물(아고니스트) 및 저해하는 화합물(안타고니스트) 또는 이들 염의 스크리닝 방법도 제공된다.

상기 스크리닝에서는 예컨대 (i) 갈렉틴 9 단백질, 그 일부의 펩티드 또는 이들의 염(상기 단백질을 발현하는 형질 전환체를 포함하고 있어도 좋다, 이하, 마찬가지) 등에 적당한 시험 시료를 접촉시킨 경우와, (ii) 본 발명의 단백질, 그 일부의 펩티드 또는 이들 염 등에 문제의 시험 시료가 존재하지 않는 경우와 비교를 행한다. 구체적으로는, 상기 스크리닝에서는 상기 생물학적 활성(예컨대 각 갈렉틴 9 단백질과 생체 성분 사이의 상호 작용에 관련된 활성 등)을 측정하여 비교한다.

상기 스크리닝계에는 측정하기 편리하도록 적당한 검지용 기질을 존재하게 하여도 좋다. 상기 기질로서는 측정에 유효하게 이용할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예컨대 공지된 기질로서 알려져 있는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있지만, 바람직하게는 합성된 화합물 등을 사용할 수 있다. 기질은 그 상태로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 플루오레세인 등의 형광, 효소 및 방사성 물질로 표지한 것을 사용할 수 있다.

시험 시료로서는 예컨대 단백질, 펩티드, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 식물 추출물, 동물 등의 조직 유출물, 세포 추출물 등을 들 수 있다. 시험 시료에 사용되는 시험 화합물의 예로는 바람직하게는 항갈렉틴 항체, 효소 저해제, 사이트카인, 각종 저해 활성을 갖는 화합물, 특히, 합성 화함물 등을 함유하고 있어도 좋다. 이들 화합물은 신규 화합물이어도 좋고, 공지된 화합물이어도 좋다. 상기 스크리닝은 통상의 결합 활성 혹은 효소 활성의 측정법에 준하여 실시할 수 있으며, 예컨대 상기 분야에서 공지된 방법 등을 참고하여 행할 수 있다. 또, 각종 표지, 완충액계 그 외에 적당한 시약 등을 사용하거나, 여기서 설명한 조작 등에 준하여 행할 수 있다. 사용 펩티드 등은 활성화제로 처리하거나, 그 전구체 혹은 잠재형인 것을 활성형인 것으로 미리 변형시켜 둘 수도 있다. 측정은 통상 Tris-HCl 완충액, 인산염 완충액 등의 반응에 악영향을 부여하지 않는 완충액 등 중에서, 예컨대 pH 약 4∼약 10(바람직하게는 pH 약 6∼약8)에서 행할 수 있다. 이들 개개의 스크리닝에 있어서는 각각의 방법에 있어서의 통상 조건, 조작법에 당업자의 통상 기술적 배려를 덧붙여, 본 발명의 상기 갈렉틴 9 단백질 혹은 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드 혹은 펩티드에 관련된 측정계를 구축하면 좋다. 이들의 일반적인 기술 수단의 상세에 대해서는 총설, 성서 등을 참조할 수 있다[예컨대 Methods in Enzymology, Academic Press 사(USA) 발행) 등 참조〕. 또한, 아포토시스 유도 활성 측정법 등은 타누마세이이치 감수, 「세포 공학 별책: 실험 프로토콜 시리즈, 아포토시스 실험 프로토콜」 가부시키 가이샤 슈쥰샤, 1995년 1월 20일(제1 판 제2 쇄) 등을 참고로 할 수 있고, 시판된 측정 키트 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 이용하여 얻어지는 화합물 또는 그 염은 상기한 시험 화합물, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 등으로부터 선택된 화합물이며, 본 발명의 단백질 등의 기능을 촉진 혹은 저해하는 화합물이다. 상기 화합물의 염으로서는 예컨대 약학적으로 허용되는 염 등을 들 수 있다. 예컨대 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 무기 염기와의 염의 적합한 예로서는 예컨대 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염 및 알루미늄염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기 염기와의 염의 적합한 예로서는 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염의 적합한 예로서는, 예컨대 포름산, 초산, 프로피온산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 호박산, 사과산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 안식향산 등의 염을 들 수 있다. 염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴 등의 염을 들 수 있으며, 산성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대 아스파라긴산, 글루타민산 등의 염을 들 수 있다.

본 명세서 중, 항갈렉틴 9 항체는 공지된 수단을 이용하여 플리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다.

본 명세서 중 「항체」라는 용어는 넓은 의미로 사용되는 것이 좋고, 원하는 갈렉틴 9 폴리펩티드 및 관련 펩티드 단편에 대한 모노클로날 항체의 단일인 것이나 각종 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체 조성물이어도 좋고, 또는, 1가 항체 또는 다가 항체 및 플리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함하는 것이며, 또한 천연형(intact) 분자 및 이들의 단편 및 유도체도 나타내는 것이며, F(ab')₂, Fab' 및 Fab라는 단편을 포함하고, 또한, 적어도 두개의 항원 또는 에피토프(epitope) 결합 부위를 갖는 키메라 항체 혹은 잡종 항체, 또는, 예컨대 쿼드롬(quadrome), 트리옴(triome) 등의 이중 특이성 재조합 항체, 종간 잡종 항체, 항이디오타입 항체, 나아가서는 화학적으로 수식 혹은 가공 등이 되어 이들 유도체라고 생각되는 것, 공지된 세포 융합 또는 하이브리도마 기술 및 항체 공학을 적용하거나, 합성 혹은 반합성 기술을 사용하여 얻어진 항체, 항체 생성의 관점으로부터 공지된 종래 기술을 적용하거나, DNA 재조합 기술을 이용하여 조제되는 항체, 본 명세서에서 기재하고 또한, 정의하는 표적 항원 물질 혹은 표적 에피토프에 관하여 중화 특성을 갖거나 하는 항체 또는 결합 특성을 갖는 항체를 포함하고 있어도 좋다. 특히 바람직한 본 발명의 항체는 천연형의 M 형 갈렉틴 9(galectin-9 medium isoform 또는 medium type galectin-9) 폴리펩티드 또는 천연형의 L 형 갈렉틴 9(galectin-9 long isoform 또는 long type galectin-9) 폴리펩티드를 특이적으로 식별할 수 있는 것이며, 예컨대 L 형 갈렉틴 9 폴리펩티드 및 M 형 갈렉틴 9 폴리펩티드와 S 형 갈렉틴 9(galectin-9 short isoform 또는 short type galectin-9) 폴리펩티드를 구별하여 인식할 수 있는 것이다.

항갈렉틴 9 항체를 플리클로날 항체로서 얻기 위해서는 면역원인 갈렉틴 9 혹은 그 단편, 갈렉틴 9 서열 일부의 펩티드로 포유동물, 조류 등을 면역시키고, 상기 포유동물, 조류 등으로부터 항혈청을 채취한다. 그리고, 이 항혈청에 포함되는 플리클로날 항체를 사용할 수 있다.

이 갈렉틴 9를 감작 항원으로 면역시킨 포유동물로서는 특별히 한정되는 것은아니지만, 일반적으로는 설치류의 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 등, 또한, 토끼, 양, 염소, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 등의 영장류, 닭 등의 조류 등이 사용된다. 나아가서는 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직한 경우도 있다.

감작 항원을 동물에게 면역하기 위해서는 공지된 방법에 따라서 행해진다. 예컨대 일반적 방법으로서 감작 항원을 표유동물 등의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 또한, 감작 항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

플리클로날 항체를 함유하는 항혈청은 면역된 동물을 소정 기간 사육한 후, 상기 동물에서 채혈한 혈액으로부터 조제할 수 있다. 얻어진 항혈청은 갈렉틴 9를 특이적으로 인식하는 것을 동정한 후, 본 발명 소정의 활성 성분으로서 제공된다.

우선, 항체 취득한 감작 항원으로서 사용되는 갈렉틴 9는 공지된 갈렉틴 9 유전자/아미노산 서열을 발현함으로써 얻을 수 있다(또한, 갈렉틴 9의 아미노산 서열은 WO 02/37114 A1에 개시되어 있음). 즉, 갈렉틴 9 혹은 그 일부의 도메인, 갈렉틴 9의 일부인 단백질 혹은 폴리펩티드 단편, 갈렉틴 9의 아미노산 서열에 해당하는 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 공지된 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주 세포를 형질 전환시킨 후, 그 숙주 세포 중 또는 배양 상청 중에서 원하는 갈렉틴 9 단백질 혹은 그 일부의 도메인 단백질, 갈렉틴 9 일부의 단백질 혹은 폴리펩티드 단편, 갈렉틴 9의 아미노산 서열에 해당하는 일부 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 공지된 방법으로 정제한다.

또한, 본 발명에 있어서, 항갈렉틴 9 항체로서는 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서 얻어진 것을 사용할 수도 있다.

항원 물질에 대하여 제작되는 모노클로날 항체는 배양중인 일련의 세포주에 의해 항체 분자의 산생을 제공할 수 있는 임의의 방법을 이용하여 산생된다. 수식어 「모노클로날」이란, 실질상 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지고 있다는 그 항체의 성격을 나타내는 것으로서, 어떠한 특정한 방법에 의해 그 항체가 산생될 필요가 있다고 간주해서는 안된다. 개개의 모노클로날 항체는 자연히 생길지도 모르는 변이체가 극소량만 존재하고 있을지도 모른다는 것 이외는 동일한 항체 집단을 포함하고 있는 것이다. 모노클로날 항체는 높은 특이성을 가지며, 그것은 단일의 항원성을 갖는 사이트에 대한 것이다. 다른 항원 결정기(에피토프)에 대한 여러 가지의 항체를 전형적으로는 포함하고 있는 통상의(플리클로날) 항체 조제물과 대비하면, 각각의 모노클로날 항체는 상기 항원상의 단일 항원 결정기에 대한 것이다. 그 특이성에 덧붙여, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고, 다른 면역 글로불린류의 협잡이 없거나 혹은 적은 점에서도 우수하다. 모노클로날 항체는 하이브리드 항체 및 리콤비난트 항체를 포함하는 것이다. 이들은 원하는 생물 활성을 나타내는 한, 그 유래 및 면역 글로불린클래스 및 서브클래스의 종별에 관계없이 가변 영역 도메인을 정상 영역 도메인으로 치환하거나(예컨대 인간화 항체) 혹은 경쇄를 중쇄로 치환하거나, 어떤 종류의 쇄를 다른 종류의 쇄로 치환하거나 혹은 이질적인 단백질와 융합시키거나 하여 얻을 수 있다(예컨대 미국 특허 제4816567호; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 등).

모노클로날 항체를 제조하는 적합한 방법의 예에는 하이브리도마법(G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497(1975)); 인간 B 세포 하이브리도마법(Kozbor et al., Immunology Today, 4, pp. 72-79(1983); Kozbor, J. Immunol., 133, pp. 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York(1987); 트리오머법; EBV-하이브리도마법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985))(인간 모노클로날 항체를 산생하기 위한 방법); 미국 특허 제4946778호(단쇄 항체의 산생을 위한 기술)를 들 수 있는 것 이외에, 항체에 관해서 이하의 문헌을 들 수 있다: S. Biocca et al., EMBO J, 9, pp. 101-108(1990); R. E. Bird et al., Science, 242, pp. 423-426(1988); M. A. Boss et al., Nucl. Acids Res., 12, pp. 3791-3806(1984); J. Bukovsky et al., Hybridoma, 6, pp. 219-228(1987); M. DAINO et al., Anal. Biochem., 166, pp. 223-229(1987); J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883(1988); P. T. Jones et al., Nature, 321, pp. 522-525(1986); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York(1986); S. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855(1984); V. T. 0i et al., BioTechniques, 4, pp. 214-221(1986); L. Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323-327(1988); A. Tramontano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6736-6740(1986); C. Wood et al., Nature, 314, pp. 446-449(1985); Nature, 314, pp. 452-454(1985) 혹은 여기에서 인용된 문헌(이 안에 있는 기재는 그것을 참조함으로써 본 명세서의 개시에 포함됨).

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 이들이 원하는 생물 활성을 나타내는 한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유도되거나 특정한 항체 클래스 혹은 서브 클래스에 속하는 항체의 대응 서열과 동일 또는 상동성이지만, 한편, 쇄의 잔부는 별도의 종으로부터 유도되거나 또는 별도의 항체 클래스 혹은 서브 클래스에 속하는 항체의 대응 서열과 동일 또는 상동성인 「키메라」 항체(면역글로불린)를 특별히 포함한다(미국 특허 제4816567호 명세서; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855(1984)).

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 포유동물 유래의 하이브리도마에 의해 산생되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 숙주에 의해 산생되는 것을 들 수 있다.

항갈렉틴 9 항체를 산생하는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는 이하와 같이 마이엘로마 세포를 이용한 세포 융합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.

즉, 갈렉틴 9 혹은 그 단편을 감작 항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역하여 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지된 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 산생 세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다. 갈렉틴 9 혹은 그 단편의 조제 방법 및 포유동물에 대한 면역 방법 등에 관해서는 전술한 플리클로날 항체를 포함하는 항혈청을 조제하는 수법에 준하여 행할 수 있다. 이 경우, 특히, 포유동물에 대하여 면역한 후, 혈청 중에 원하는 항체 레벨이 상승하는 것을 동정한 포유동물로부터 면역 세포를 채취하여 세포 융합에 첨부하지만, 바람직한 면역 세포로서는 특히, 비세포를 들 수 있다.

상기 면역 세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서, 포유동물의 마이엘로마 세포를 이용한다. 이 마이엘로마 세포로서는 공지된 여러 가지의 세포주를 사용할 수 있다. 면역 세포와 마이엘로마 세포와의 세포 융합 등은 기본적으로 공지된 방법, 예컨대 쾰러 및 밀슈타인 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.

이하, 모노클로날 항체를 예로 들어, 항체의 제작에 관해 상세히 설명한다.

본 발명의 항체는 마이엘로마 세포를 이용한 세포 융합 기술을 이용하여 얻어진 모노클로날 항체로서도 좋으며, 예컨대 다음과 같은 공정으로 제작할 수 있다.

(1) 면역원성 항원의 조제, (2) 면역원성 항원에 의한 동물의 면역, (3) 마이엘로마 세포(골수종 세포)의 조제, (4) 항체 산생 세포와 마이엘로마 세포와의 세포 융합, (5) 하이브리도마(융합 세포)의 선택 및 모노클론화 및 (6) 모노클로날 항체의 제조

(1) 면역원성 항원의 조제는 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 항원으로서는 상기에 기재되어 있는 바와 같이 천연형의 갈렉틴 9 폴리펩티드 또는 그것으로부터 유도된 단편(일부의 도메인 폴리펩티드, 링크 폴리펩티드, 단편, 일부 펩티드, 합성 폴리펩티드를 포함하여도 좋음)을 단리한 것을 이용할 수도 있지만, 결정된 갈렉틴 9의 아미노산 서열 정보를 기초로 적당한 올리고 펩티드를 화학 합성하여 그것을 항원으로서 이용할 수 있다. 대표적으로는 (1) WO 02/37114 A1에 개시한 서열목록의 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 혹은 그 일부의 도메인 아미노산 서열; (2) 서열 번호 3의 일부의 도메인 아미노산 서열; (3) 서열목록의 서열번호 4, 5, 7, 8 및 9의 아미노산 서열; (4) 서열목록의 서열 번호 1 중 서열 번호 4에 해당하는 아미노산 서열에 연속하고 있는 C 말단 측 도메인을 구성하는 아미노산 서열 혹은 그 일부의 단편; (5) 서열목록의 서열 번호 1 중 서열 번호 4에 해당하는 아미노산 서열에 선행하는 N 말단 측 도메인을 구성하는 아미노산 서열 혹은 그 일부의 단편 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된 영역에 존재하는 아미노산 잔기 중 연속한 적어도 5개의 아미노산을 갖는 펩티드를 들 수 있다.

항원은 그 상태로 적당한 아주번트와 혼합하여 동물을 면역하는데 사용할 수 있지만, 면역원성 컨쥬게이트 등으로 하여도 좋다. 예컨대 면역원로서 이용하는 항원은 갈렉틴 9를 단편화한 것 혹은 그 아미노산 서열에 기초하는 특징적인 서열 영역을 선택하고, 폴리펩티드를 디자인하여 화학 합성하여 얻어진 합성 폴리펩티드 단편이라도 좋다. 또한, 그 단편을 적당한 축합제를 통해 여러 가지의 담체 단백질류와 결합시켜 합텐 단백질과 같은 면역원성 컨쥬게이트로 하고, 이것을 이용하여 특정한 서열만을 반응시킬 수 있은(혹은 특정한 서열만을 인식할 수 있는) 모노클로날 항체를 디자인하는데 이용할 수도 있다. 디자인되는 폴리펩티드에는 미리 시스테인 잔기 등을 부가하여, 면역원성 컨쥬게이트의 조제를 용이하게 해둘 수 있다. 담체 단백질류와 결합시키는데 있어서 담체 단백질류는 우선 활성화될 수 있다. 이러한 활성화에 대하여 활성화 결합기를 도입하는 것을 들 수 있다.

활성화 결합기로서는 (1) 활성화 에스테르 혹은 활성화 카르복실기, 예컨대 니트로페닐에스테르기, 펜타플루오루페닐에스테르기, 1-벤조트리아졸에스테르기, N-호박산이미드에스테르기 등, (2) 활성화디티오기, 예컨대 2-피리딜디티오기 등을 들 수 있다. 담체 단백질류로서는 키홀·림펫·헤모시아닌(KLH), 소혈청알부민(BSA), 난백알부민, 글로불린, 폴리리신 등의 폴리펩타이드, 세균 균체 성분, 예컨대 BCG 등을 들 수 있다.

(2) 면역원성 항원에 의한 동물의 면역은 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 면역은 당업자에 알려진 방법에 의해 행할 수 있으며, 예컨대 무라마쯔시게 외 지음, 실험 생물학 강좌 14, 면역 생물학, 마루센 가부시키가이샤, 1985년, 일본 생화학회 지음, 속생화학 실험 강좌 5, 면역 생화학 연구법, 동경 화학 동인, 1986년, 일본 생화학회 지음, 신생화학 실험 강좌 12, 분자면역학 Ⅲ, 항원·항체·보체, 동경 화학 동인, 1992년 등에 기재한 방법에 준하여 행할 수 있다. 면역화제를(필요에 따라 아주번트와 함께) 일회 또는 그 이상의 횟수로 포유동물에게 주사함으로써 면역화된다. 대표적으로는 상기 면역화제 및/또는 아주번트를 포유동물에게 복수 피하 주사 혹은 복강내 주사함으로써 이루어진다. 면역화제는 상기 항원 펩티드 혹은 그 관련 펩티드 단편을 포함하는 것을 들 수 있다. 면역화제는 면역 처리되는 포유동물에 있어서 면역원성인 것이 알려져 있는 단백질(예컨대 상기 담체 단백질류 등)과 컨쥬게이트를 형성하여 사용하여도 좋다. 아주번트로서는 예컨대 프로인트 완전 아주번트, 리비(Ribi) 어주번트, 백일해 백신, BCG, 리피드 A, 리포솜, 수산화알루미늄, 실리카 등을 들 수 있다. 면역은 예컨대 BALB/c 등의 마우스, 햄스터, 그 밖의 적당한 동물을 사용하여 행해진다. 항원의 투여량은 예컨대 마우스에 대하여 약 1∼400 ㎍/동물로, 일반적으로는 숙주 동물의 복강내 및 피하에 주사하고, 이후 1∼4주간 간격으로, 바람직하게는 1∼2주간마다 복강내, 피하, 정맥내 혹은 근육내에 추가 면역을 2∼10회 정도 반복하여 행한다. 면역용 마우스로서는 BALB/c계 마우스 이외, BALB/c계 마우스와 다른계 마우스와의 F1 마우스 등을 이용할 수도 있다. 필요에 따라 항체가 측정계를 조제하여 항체가를 측정하고 동물면역의 정도를 동정할 수 있다. 본 발명의 항체는 이렇게 해서 얻어져 면역된 동물로부터 얻어진 것이어도 좋으며, 예컨대 항혈청, 플리클로날 항체 등을 포함한다.

(3) 마이엘로마 세포(골수종 세포)의 조제는 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 세포 융합에 사용되는 무한 증식 가능주(종양 세포주)로서는 면역 글로불린을 산생하지 않는 세포주로부터 선택할 수 있으며, 예컨대 P3-NS-1-Ag4-1(NS-1, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976), SP-2/0-Ag14(SP-2, Nature, 276: 269∼270, 1978), 마우스 마이엘로마 MOPC-21 세포주 유래의 P3-X63-Ag8-U1(P3U1, Curr. topics MicroBiol. Immunol., 81: 1-7, 1978), P3-X63-Ag8(X63, Nature, 256: 495-497, 1975), P3-X63-Ag8-653(653, J. Immunol., 123: 1548-1550, 1979) 등을 이용할 수 있다. 8-아자구아닌 내성의 마우스 마이엘로마 세포주는 둘베코 MEM 배지(DMEM 배지), RPMI-1640 배지 등의 세포 배지에, 예컨대 페니실린, 아미카신 등의 항생 물질, 소태아 혈청(FCS) 등을 첨가하고, 또한, 8-아자구아닌(예컨대 5∼45 ㎍/㎖)을 첨가한 배지로 계대되지만, 세포 융합 2∼5일 전에 정상 배지로 계대하여 소요수의 세포주를 준비할 수 있다. 또한 사용 세포주는 동결 보존주를 약 37℃로 완전히 해동한 후 RPMI-1640 배지 등의 정상 배지로 3회 이상 세정 후, 정상 배지로 배양하여 소요수의 세포주를 준비한 것이라도 좋다.

(4) 항체 산생 세포와 마이엘로마 세포와의 세포 융합은 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 상기 (2)의 공정에 따라 면역된 동물, 예컨대 마우스는 최종 면역 후, 2∼5일 후에 그 비장이 적출되고, 그런 후 비세포 현탁액을 얻는다. 비세포 이외, 생체각처의 림프절 세포를 얻어, 그것을 세포 융합에 사용할 수도 있다. 보다 구체적으로는, 세포 융합은 예컨대 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 속에서 실시된다. 상기 세포 융합에 이용되는 배양액으로서는 예컨대 상기 마이엘로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이러한 종류의 세포 배양에 이용되는 통상의 배양액을 사용할 수 있으며, 또한, 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다. 이리하여, 이렇게 얻어진 비세포 현탁액과 상기 (3)의 공정에 따라서 얻어진 마이엘로마 세포주를, 예컨대 최소 필수 배지(MEM 배지), DMEM 배지, RPMI-1640 배지 등의 세포 배지 중에 놓고, 세포 융합 촉진제, 예컨대 폴리에틸렌글리콜을 첨가한다. 세포 융합 촉진제로서는 이 밖에 각종 상기 분야에서 알려진 것을 이용할 수 있으며, 이와 같은 것으로서는 불활성화된 센더 바이러스(HVJ: Hemagglutinating Virus of Japan) 등도 들 수 있다. 바람직하게는, 예컨대 30∼60%의 폴리에틸렌글리콜을 0.5∼2 ㎖ 첨가할 수 있고, 분자량이 1,000∼8,000인 폴리에틸렌글리콜을 이용할 수 있으며, 또한, 분자량이 1,000∼4,000인 폴리에틸렌글리콜을 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 융합 배지 중에서의 폴리에틸렌글리콜의 농도는 예컨대 30∼60%가 되도록하는 것이 바람직하다. 필요에 따라 예컨대 디메틸설폭시드 등의 보조제를 소량 첨가하여 융합 효율을 높일 수도 있다. 면역 세포와 마이엘로마 세포와의 사용 비율, 즉 융합에 사용하는 비세포(림프구): 마이엘로마 세포주의 비율은 임의로 설정할 수 있으며, 예컨대 1:1∼20:1로 하는 것을 들 수 있지만, 보다 바람직하게는 4:1∼10:1로 할 수 있다.

세포 융합은 면역 세포와 마이엘로마 세포와의 소정량을 배양액 속에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예컨대 평균 분자량 1000-6000 정도)을 통상 30-60%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써 목적으로 하는 융합 세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순차 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 못한 세포 융합제 등을 제거한다.

융합 반응을 1∼10분간 행하고, 다음에 RPMI-1640 배지 등의 세포 배지를 첨가한다. 융합 반응 처리는 복수 회 행할 수도 있다. 융합 반응 처리 후, 원심 등에 의해 세포를 분리한 후 선택용 배지에 옮긴다.

(5) 하이브리도마(융합 세포)의 선택 및 모노클론화는 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 선택용 배지로서는 통상의 선택 배양액, 예컨대 히폭산틴, 아미놉테린 및 티미딘을 포함하는, FCS 함유 MEM 배지, RPMI-1640 배지 등의 배지, 소위 HAT 배지를 들 수 있다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상, 수일∼수주간) 계속한다. 선택 배지 교환의 방법은 일반적으로는 배양 플레이트에 분사한 용량과 같은 용량을 다음날 첨가하고, 그 후 1∼3일마다 HAT 배지로 반씩 교환하도록 처리할 수 있지만, 적절하게 이것에 변경을 덧붙여 행할 수도 있다. 또한 융합 후 8∼16일째에는 아미놉테린을 제외한 소위 HT 배지로 1∼4일마다 배지 교환을 할 수 있다. 피더로서, 예컨대 마우스 흉선 세포를 사용할 수도 있으며, 그것이 바람직한 경우가 있다.

하이브리도마의 증식이 번성한 배양 바이러스의 배양 상청을 예컨대 방사 면역 분석(RIA), 효소 면역 분석(ELISA), 형광 면역 분석(FIA), 발광 면역 분석(LIA), 웨스턴블로팅 등의 측정계 혹은 형광 야기 세포 분리 장치(FACS)등으로 소정의 단편 펩티드를 항원으로서 이용하거나, 혹은 표지 항마우스 항체를 이용하여 목적 항체를 측정하는 등으로, 스크리닝하거나 한다. 목적 항체를 산생하고 있는 하이브리도마를 클로닝한다. 클로닝은 한천 배지 속에서 콜로니를 픽업하거나 혹은 한계 희석법에 의해 이루어진다. 한계 희석법으로 보다 바람직하게 행할 수 있다. 클로닝은 복수 회 행하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 제작되는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하며, 또한, 액체 질소 중에서 장기 보존할 수 있다.

(6) 모노클로날 항체의 제조는 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 상기 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 취득하기 위해서는 상기 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상청으로서 얻는 방법, 혹은 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에게 투여하여 증식시키고, 그 복수로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합한 한편, 후자의 방법은 항체의 대량 생산에 적합하다.

이리 하여, 얻어진 하이브리도마 주는 FCS 함유 MEM 배지, RPMI-1640배지 등의 적당한 증식용 배지 속에서 배양하여, 그 배지 상청으로부터 원하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 대량의 항체를 얻기 위해서는, 하이브리도마를 복수화하는 것을 예로 들 수 있다. 이 경우 마이엘로마 세포 유래의 동물과 동계의 조직적 합성 동물의 복강 내에 각 하이브리도마를 이식하여 증식시키거나 혹은 예컨대 누드·마우스 등에 각 하이브리도마를 이식하고 증식시켜 이 동물의 복수 중에 산생된 모노클로날 항체를 회수하여 얻을 수 있다. 동물은 하이브리도마의 이식에 앞서서 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸) 등의 광물유를 복강 내 투여해 둘 수 있어, 그 처리 후, 하이브리도마를 증식시켜 복수를 채취할 수도 있다. 복수액은 그대로, 혹은 종래 공지의 방법, 예컨대 황산암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스 등에 의한 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 전기 영동법, 투석, 초여과법, 친화도·크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제하여 모노클로날 항체로서 이용할 수 있다. 바람직하게는, 모노클로날 항체를 함유하는 복수는 유안 분획한 후 DEAE-세파로스와 같은 음이온 교환 겔 및 프로테인 A 컬럼와 같은 친화도·컬럼 등으로 처리하여 정제 분리 처리할 수 있다. 특히 바람직하게는 항원 또는 항원 단편(예컨대 합성 펩티드, 재조합 항원 단백질 혹은 펩티드, 항체가 특이적으로 인식하는 부위 등)을 고정화한 친화도·크로마토그래피, 프로테인 A를 고정화한 친화도·크로마토그래피, 히드록시 아파타이트·크로마토그래피 등을 들 수 있다.

또한, 트랜스게닉 마우스 또는 그 밖의 생물, 예컨대, 그 밖의 포유 동물은 본 발명의 면역원 폴리펩티드 산물에 대한 인간화 항체 등의 항체를 발현하는 데 이용할 수 있다.

또한 이렇게 해서 대량으로 얻어진 항체의 서열을 결정하거나, 하이브리도마주로부터 얻어진 항체를 코딩하는 핵산 서열을 이용하여, 유전자 재조합 기술에 의해 항체를 제작할 수 있다. 이 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산은 예컨대 마우스 항체의 중쇄나 경쇄를 코딩하고 있는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드프로브를 사용하는 등의 관용의 수법으로 단리하여 서열 결정할 수 있다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 넣어, CHO, COS 등의 숙주 세포에 넣을 수 있다. 이 DNA는 예컨대 동종 마우스의 서열 대신에, 인간의 중쇄나 경쇄의 정상 영역 도메인을 코딩하는 서열로 치환하는 등으로 수식할 수 있다(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984). 이리 하여 원하는 결합 특이성을 갖는 키메라 항체나 하이브리드 항체도 조제할 수 있다. 또한, 항체는 하기하는 바와 같은 축합제를 이용하는 것을 포함한 화학적인 단백질 합성 기술을 적용하여, 키메라 항체나 하이브리드 항체를 조제하는 등의 수식을 할 수도 있다.

인간화 항체는 그 분야에서 알려진 기술에 의해 행할 수 있다(예컨대, Jones et al., Nature, 321: pp.522-525(1986); Rieckmann et al., Nature, 332: pp.323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239: pp.1534-1536(1988)). 인간 모노클로날 항체도 그 분야에서 알려진 기술에 의해 행할 수 있고, 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 인간 마이엘로마 세포나 인간·마우스 헤테로 마이엘로마 세포는 그 분야에서 알려져 있다(Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York(1987)). 이중특이적 항체를 제조하는 방법도 그 분야에서 알려져 있다(Millstein et al., Nature, 305: pp.537-539(1983); W093/08829; Traunecker et al., EMBO J., 10: pp.3655-3659(1991); Suresh et al., "Methods in Enzymology", Vol. 121, pp.210(1986)).

또한 이들 항체를 트립신, 파파인, 펩신 등의 효소에 의해 처리하고 경우에 따라 환원하여 얻어지는 Fab, Fab', F(ab')₂라는 항체 단편로서 사용하여도 좋다.

대표적인 항갈렉틴 9 항체로서는, L, M 및 S 형 갈렉틴 9 전부에 결합하는 항체, L 및 M 형 갈렉틴 9 모두에 결합하지만 S 형 갈렉틴 9와는 반응하지 않는 항체, L 형 갈렉틴 9에 결합하지만 M 및 S 형 갈렉틴 9와는 반응하지 않는 항체, L, M 및 S 형 갈렉틴 9 각각에 특이적인 항체, 갈렉틴 9의 C-말단측 CRD 혹은 그 단편 펩티드에 특이적인 항체, 갈렉틴 9의 N-말단측 CRD 혹은 그 단편 펩티드에 특이적인 항체, 각 링크 펩티드 혹은 그 단편 펩티드에 특이적인 항체 등을 들 수 있다.

항체는 기지의 임의 검정법, 예컨대 경합적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역 침강 검정에 사용할 수 있다(Zola, Monoc1onal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158(CRC Press, Inc., 1987).

항체를 검출할 수 있는 원자단에 각각 컨쥬게이트(conjugated)하기 위해서는, 그 분야에서 알려지는 임의의 방법을 사용할 수 있고, 예컨대, David et al., Biochemistry, 13권, 1014-1021 페이지(1974); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp.219-231(1981); 및 "Methods in Enzymology", Vo1. 184, pp.138-163(1990)에 의해 기재되는 방법을 들 수 있다. 표지물을 부여하는 항체로서는, IgG 분획, 또 펩신 소화 후 환원하여 얻어지는 특이적 결합부 Fab'를 이용할 수 있다. 이들 경우의 표지물의 예로서는, 하기하는 것과 같이 효소(퍼옥시다제, 알카리 포스파타제 혹은 β-D-갈락토시다제 등), 화학 물질, 형광 물질 혹은 방사성 동위 원소 등이 있다.

본 발명에서의 검지·측정은 면역 염색, 예컨대 조직 혹은 세포 염색, 면역 전자 현미경, 면역분석, 예컨대 경합형 면역분석 또는 비경합형 면역분석로 행할 수 있고, 방사 면역 측정법(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA 등을 이용할 수 있으며, B-F 분리를 행하여도 좋고, 혹은 행하지 않은 채 그 측정을 행할 수 있다. 바람직하게는 RIA, EIA, FIA, LIA이며, 또한 샌드위치형 분석을 들 수 있다. 예컨대 샌드위치형 분석으로서는, 한 쪽을 본 발명의 L 형 갈렉틴 9 폴리펩티드에 대하는 항체 혹은 L 형 갈렉틴 9의 관련 펩티드 단편에 대하는 항체로 하고 다른 쪽을 갈렉틴 9의 C 말단측 잔기에 대하는 항체로 하여, 그리고 한 쪽을 검출 가능하게 표지화한다(물론, 그 밖의 조합도 가능하고 목적에 따라서 적절하게 디자인할 수 있음). 동일한 항원을 인식할 수 있는 다른 항체를 고상에 고정화한다. 검체와 표지화 항체 및 고상화 항체를 필요에 따라 순차 반응시키기 위해서 인큐베이션 처리하여, 여기서 비결합 항체를 분리 후, 표지물을 측정한다. 측정된 표지의 양은 항원, 즉 갈렉틴 9 폴리펩티드 항원의 양과 비례한다. 이 분석에서는 불용화 항체나, 표지화 항체의 첨가 순서에 따라서 동시 샌드위치형 분석, 포워드(forward) 샌드위치형 분석 혹은 역샌드위치형 분석 등으로 불린다. 예컨대 세정, 교반, 진탕, 여과 혹은 항원의 예비 추출 등은 특정한 상황을 기초로 이들 측정 공정 중에서 적절하게 채용된다. 특정한 시약, 완충액 등의 농도, 온도 혹은 인큐베이션 처리 시간 등의 그 밖의 측정 조건은 검체 중 항원의 농도, 검체 시료의 성질 등의 요소에 따라서 바꿀 수 있다. 당업자는 통상의 실험법을 이용하면서 각 측정에 대하여 유효한 최적의 조건을 적절하게 선정하여 측정을 행할 수 있다.

항원 혹은 항체를 고상화할 수 있는 많은 담체가 알려져 있으며, 본 발명에서는 이들로부터 적절하게 선택하여 이용할 수 있다. 담체로서는, 항원 항체 반응 등에 사용되는 것이 여러가지 알려지고 있고, 본 발명에 있어서도 물론 이들 공지의 것 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 특히 적합하게 사용되는 것으로서는, 예컨대 유리, 예컨대 아미노알킬실릴유리 등의 활성화 유리, 다공질 유리, 실리카 겔, 실리카-알루미나, 알루미나, 자화철, 자화 합금 등의 무기 재료, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 폴리비닐, 폴리아세트산비닐, 폴리카보네이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 폴리아크릴아미드, 가교 폴리아크릴아미드, 스티렌-메타크릴레이트 공중합체, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 아크롤레인-에틸렌글리콜디메타크릴레이트 공중합체 등, 가교화 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 덱스트란, 아가로오스, 가교 아가로오스, 셀룰로오스, 징결정 셀룰로오스, 카르복실메틸셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트 등의 천연 또는 변성 셀룰로오스, 가교 덱스트란, 나일론 등의 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에폭시 수지 등의 유기 고분자 물질, 또한 이들을 유화 중합하여 얻어진 것, 실리콘 껌 등, 세포, 적혈구 등에서 필요에 따라, 실란 커플링제 등으로 작용성기를 도입하고 있는 것을 들 수 있다.

또한, 여과지, 비드, 튜브, 큐벳, 시험 용기의 내벽, 예컨대 시험관, 타이터 플레이트, 타이터 웰, 마이크로 플레이트, 유리셀, 합성 수지로 만든 셀 등의 합성 재료로 이루어지는 셀, 유리 막대, 합성 재료로 이루어지는 막대, 말단을 굵게 하거나 혹은 가늘게 한 막대, 말단에 둥근 돌기를 붙이거나 혹은 편평한 돌기를 붙인 막대, 박판형으로 한 막대 등의 고체 물질(물체)의 표면 등을 들 수 있다.

이들 담체에는 항체를 결합시킬 수 있고, 바람직하게는 본 발명으로 얻어지는 항원에 대하여 특이적으로 반응하는 항갈렉틴 9 항체(항혈청이나 정제 항체를 포함) 및 항갈렉틴 9 모노클로날 항체를 결합시킬 수 있다. 담체와 이들 항원 항체 반응에 관여하는 것의 결합은 흡착 등의 물리적인 수법, 혹은 축합제 등을 이용하거나, 활성화된 것 등을 이용하는 화학적인 방법, 또한 서로의 화학적인 결합 반응을 이용한 수법 등에 의해 행할 수 있다. 표지로서는, 효소, 효소 기질, 효소 저해제, 보결 분자류, 조효소, 효소 전구체, 아포 효소, 형광 물질, 색소 물질, 화학 루미네센스 화합물, 발광 물질, 발색 물질, 자기 물질, 금속 입자, 예컨대 금 콜로이드 등, 비금속 원소 입자, 예컨대 셀레늄 콜로이드 등, 방사성 물질 등을 예로 들 수 있다. 효소로서는, 탈수소 효소, 환원 효소, 산화 효소 등의 산화 환원 효소, 예컨대 아미노기, 카르복실기, 메틸기, 아실기, 인산기 등을 전이하는 것을 촉매하는 전이 효소, 예컨대 에스테르 결합, 글리코시드 결합, 에테르 결합, 펩티드 결합 등을 가수 분해하는 가수 분해 효소, 리아제, 이소메라제, 리가제 등을 예로 들 수 있다. 효소는 복수의 효소를 복합적으로 이용하여 검지에 이용할 수도 있다. 예컨대, 효소적 사이클링을 이용할 수도 있다. 대표적인 방사성 물질의 표지용 동위체 원소로서는, [³²P], [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C], [³⁵S] 등을 들 수 있다. 대표적인 효소 표지로서는, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 등의 퍼옥시다제, 대장균 β-D-갈락토시다제 등의 갈락토시다제, 말레이에이트·디히드로게나제, 글루코오스-6-포스페이트·디히드로게나제, 글루코오스옥시다제, 글루코아밀라아제, 아세틸콜린에스테라제, 카타라제, 소 소장 알칼리 포스파타제, 대장균 알칼리 포스파타제 등의 알칼리 포스파타제 등을 들 수 있다. 알칼리 포스파타제를 이용한 경우, 4-메틸운베리페릴포스페이트 등의 운베리페론 유도체, 니트로페닐포스페이트 등의 인산화 페놀 유도체, NADP를 이용한 효소적 사이클링계, 루시페린 유도체, 디옥세탄 유도체 등의 기질을 사용해서 발생하는 형광, 발광 등에 의해 측정할 수 있다. 루시페린, 루시페라제계를 이용할 수도 있다. 카타라제를 이용한 경우, 과산화수소와 반응하여 산소를 생성하기 때문에, 그 산소를 전극 등으로 검지할 수도 있다. 전극으로서는 유리 전극, 난용성 염막을 이용하는 이온 전극, 액막형 전극, 고분자막 전극 등인 것도 할 수 있다.

효소 표지는 비오틴 표지체와 효소 표지 아비딘(스트렙트 아비딘)으로 대체할 수도 있다. 이와 같이, 비오틴-아비딘계를 사용하거나, 항갈렉틴 항체에 대하는 항체 등의 2차적인 항체를 사용하는 등, 그 분야에서 공지된 감도 증강법을 적절하게 채용할 수 있다. 표지는 복수의 다른 종류의 표지를 사용할 수도 있다. 이러한 경우, 복수의 측정을 연속적으로, 혹은 비연속적으로, 그리고 동시에 혹은 별개로 행하는 것을 가능하게 할 수도 있다.

본 발명에 있어서는, 신호의 형성에 4-히드록시페닐아세트산, o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸벤지딘(TMB), 5-아미노살리실산, 3,3-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드(DAB), 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC), 티라민, 루미놀, 루시게닌 루시페린 및 그 유도체, Pholad luciferin 등과 서양 고추냉이·퍼옥시다제 등의 퍼옥시다제, 루미젠 PPD, (4-메틸)운베리페릴-인산, p-니트로페놀-인산, 페놀-인산, 브로모클로로인돌릴인산(BCIP), AMPAK^TM(DAKO), AmpliQ^TM(DAKO) 등과 알카리포스파타제, 4-메틸운베리페릴-β-D-갈락토시드인 운베리페릴갈락토시드, o-니트로페놀-β-D-갈락토시드인 니트로페닐갈락토시드 등과 β-D-갈락토시다제, 글루코오스-6-인산·디히드로게나제, ABTS 등과 글루코스옥시다제 등의 효소 시약의 조합도 이용할 수 있고, 히드록퀴논, 히드록시벤조퀴논, 히드록시안트라퀴논 등의 키놀 화합물, 리포산, 글루타치온 등의 티올 화합물, 페놀 유도체, 페로센 유도체 등을 효소 등의 활동으로 형성할 수 있는 것을 사용할 수 있다.

형광 물질 혹은 화학 루미네센스 화합물로서는, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 예컨대 로다민 B 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 이성체-R(TRITC) 등의 로다민 유도체, 7-아미노-4-쿠마린-3-아세트산, 단실클로라이드, 단실플루오라이드, 플루오레스카민, 피코비리프로테인, 아크리디늄염, 루미페린, 루시페라제, 에커린 등의 루미놀, 이미다졸, 옥살산 에스테르, 희토류 킬레이트 화합물, 쿠마린 유도체 등을 들 수 있다. 발색, 형광 등을 포함한 생성하는 신호 등을 검지하기 위해서는 시각에 의한 것도 되지만 공지의 장치를 사용할 수도 있고, 예컨대, 형광 광도계, 플레이트 리더 등도 사용할 수 있다. 또한, 방사성 동위체(아이소토프) 등이 내는 신호를 검지하기 위해서는 공지의 장치를 사용할 수도 있어, 예컨대, 감마 카운터, 신틸레이션 등도 사용할 수 있다.

표지하기 위해서는 티올기와 말레이미드기의 반응, 피리딜디술피드기와 티올기의 반응, 아미노기와 알데히드기의 반응 등을 이용하여 행할 수 있고, 공지의 방법 혹은 그 분야의 당업자가 용이하게 할 수 있는 방법, 그위에 이들을 수식한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. 또한 상기 면역원성 복합체 제작에 사용될 수 있는 축합제, 담체 결합에 사용될 수 있는 축합제 등을 이용할 수 있다. 축합제로서는, 예컨대 포름알데히드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소티오시아네이트, N,N'-폴리메틸렌비스요오드아세트아미드, N,N'-에틸렌비스말레이미드, 에틸렌글리콜비스숙시니미딜숙시네이트, 비스디아조벤지딘, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 숙신이미딜3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(SPDP), N-숙신이미딜4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), N-술포숙신이미딜4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, N-호박산이미딜(4-요오드아세틸)아미노벤조에이트, N-호박산이미딜4-(1-말레이미드페닐)부틸레이트, N-(ε-말레이미드카프로일옥시)호박산이미드(EMCS), 이미노티오란, S-아세틸머캅토호박산 무수물, 메틸-3-(4'-디티오피리딜)프로피온이미데이트, 메틸-4-머캅토부티릴이미데이트, 메틸-3-머캅토프로피온이미데이트, N-호박산이미딜-S-아세틸머캅토아세테이트 등을 들 수 있다.

본 발명의 측정법에 따르면, 측정하여야 할 물질을 효소 등으로 표지한 항혈청, 정제 항체 혹은 모노클로날 항체 등의 표지 항체 시약과, 담체에 결합된 항체를 순차 반응시킬 수 있고, 동시에 반응시킬 수도 있다. 시약을 첨가하는 순서는 선택된 담체계의 형에 따라 다르다. 위조된 플라스틱 등의 비드를 이용한 경우에는, 표지한 항혈청, 정제 항체 혹은 모노클로날 항체 등의 표지 항체 시약을 측정하여야 할 물질을 포함하는 검체 시료와 같이 최초 적절한 시험관 중에 함께 넣고, 그 후 그 위조된 플라스틱 등의 비드를 첨가함으로써 측정을 행할 수 있다.

본 발명의 측정법에 있어서는, 면역학적 측정법이 이용되지만, 그 때의 고상 담체로서는, 항체 등 단백질을 양호하게 흡착하는 폴리스티렌제, 폴리카보네이트제, 폴리프로필렌제 혹은 폴리비닐제의 볼, 마이크로 플레이트, 스틱, 미립자 혹은 시험관 등의 여러가지 재료 및 형태를 임의로 선택하여 사용할 수 있다.

측정에 있어서는 지적 pH, 예컨대 pH 약 4∼약 9에 유지하도록 적당한 완충액계 속에서 행할 수 있다. 특히 적절한 완충제로서는, 예컨대 아세테이트 완충제, 시트르산염 완충제, 포스페이트 완충제, 트리스 완충제, 트리에탄올아민 완충제, 보레이트 완충제, 글리신 완충제, 탄산염 완충제, 트리스-염산 완충제, 베로날 완충제 등을 들 수 있다. 완충제는 서로 임의의 비율로 혼합하여 이용할 수 있다. 항원 항체 반응은 약 0℃∼약 60℃ 사이의 온도로 행하는 것이 바람직하다.

효소 등으로 표지된 항혈청, 정제 항체, 혹은 모노클로날 항체 등의 항체 시약 및 담체에 결합시킨 항체 시약, 그 위에 측정하여야 할 물질의 인큐베이션 처리는 평형에 달할 때까지 행할 수 있지만, 항원 항체 반응의 평형이 달성되는 것보다도 훨씬 이른 시점에서 고상과 액상을 분리하여 한정된 인큐베이션 처리 후에 반응을 멈출 수 있어, 액상 또는 고상 중 어느 하나에 있어서의 효소 등의 표지의 존재 정도를 측정할 수 있다. 측정 조작은 자동화된 측정 장치를 이용하여 행할 수 있고, 발광·검출기, 포토·검출기 등을 사용하여 기질이 효소의 작용으로 변환되어 생기는 표시 시그널을 검지하여 측정할 수도 있다. 항원 항체 반응에 있어서는, 각각 이용되는 시약, 측정하여야 할 물질, 그 위에 효소 등의 표지를 안정화하거나, 항원 항체 반응 자체를 안정화하도록 적절한 수단을 꾀할 수 있다. 또한, 비특이적인 반응을 제거하여, 저해적으로 작동하는 영향을 줄이거나, 혹은 측정 반응을 활성화하기 위해서 단백질, 안정화제, 하기한 것과 같은 계면활성제, 킬레이트화제 등을 인큐베이션 용액 중에 첨가할 수도 있다. 킬레이트화제로서는, 에틸렌디아민사아세트산염(EDTA)이 보다 바람직하다. 이 분야에서 대개 채용되어 있거나 혹은 당업자에게 알려진 비특이적 결합 반응을 막기 위한 블로킹 처리를 실시하여도 좋으며, 예컨대, 포유 동물 등의 정상 혈청이나 혈청 단백질, 알부민, 헤모글로빈, 오브알부민(OVA), 스킴 밀크, 젖발효 물질, 콜라겐, 젤라틴 등으로 처리할 수 있다. 비특이적 결합 반응을 막을 목적인 한, 이들 방법은 특별히 한정되지 않고 이용할 수 있다. 또한, 시료나 고상 등의 세정에는 상기한 완충액계나 식염액으로부터 적절한 액을 선택하여 그것을 사용할 수 있고, 또한 거기에 Tween 20(상품명), Tween 80(상품명), NP-40(상품명), Triton X100(상품명), Briji(상품명) 등의 비이온성 계면활성제, CHAPS 등의 양이온성 계면활성제 외, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 측정 방법으로 측정되는 시료로서는, 모든 형태의 용액이나 콜로이드 용액, 비유체 시료 등을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 생물 유래의 시료, 예컨대, 흉선, 고환, 장, 신장, 뇌, 유방 조직, 난소, 자궁, 전립선, 결장·직장, 위, 폐, 기관지, 췌장암, 간장 등의 모든 장기 및 조직, 또한 이들 장기·조직의 악성 종양, 백혈병 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 관절액, 뇌척수액, 췌액, 담즙액, 타액, 양수, 뇨, 그 밖의 체액, 세포 배양액, 조직 배양액, 조직 균질물, 생검시료, 조직, 세포 등을 들 수 있다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 포함한 각종의 분석·정량법을 본 발명의 측정 방법에 적용하는데 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 덧붙여, 본 발명의 그 대상 물질 혹은 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 물질에 관련된 측정계를 구축하면 좋다.

갈렉틴 9의 측정계로서는, 예컨대 조직에 대해서는 면역 염색(METHODS, 24, 289-296(2001); J Immunol Methods, 47(2), 129-144(1981); ibid., 150(1-2), 5-21, 23-32 & 151-158(1992); Cancer J, 7(1), 24-31(2001) 등), 면역 전자 현미경(Mol Biotechnol, 7(2), 145-151(1997); J Electron Microsc Tech., 19(1), 57-63 & 64-79(1991); ibid., 19(3), 305-315(1991) 등)이라고 하는 단백질 측정계, in situ hybridization이라고 하는 발현 유전자 측정계가, 조직 추출물에 대해서는 EIA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅(J Electron Microsc(Tokyo), 45(2), 119-127(1996); Methods Biochem Anal., 33, 1-58(1988); Methods Enzymo1., 271, 177-203(1996); ibid., 305, 333-345(2000); J Immunol Methods, 152(2), 227-236(1992); ibid., 170(2), 177-184(1994); ibid., 195(1-2), 149-152(1996); 큐치노요시유키, 「유전자·단백질, 실험 조작 블로팅법」, 가부시키 가이샤 소프트 사이언스사, 1987년 11월 10일 발행 등)이라고 하는 단백질 측정계, 노던 블로팅, 도트 블로트, RNase 방지 분석, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), Real-Time PCR(Clinical Chemistry, 46:11, 1738-1743(2000))이라고 하는 발현 유전자 측정계, 그리고 혈 중, 체액 등에 대해서는 ElA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅이라고 하는 단백질 측정계를 유리하게 이용할 수 있다. 또한 항갈렉틴 9 항체의 측정계로서는, 예컨대 혈 중, 체액 등에 대해서는 EIA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅이라고 하는 단백질 측정계를 유리하게 이용할 수 있다.

EIA 측정계에 있어서, 예컨대 경합법에서는, 항갈렉틴 9 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 표지 항원 및 비표지 항원(항원으로서는, 갈렉틴 9 혹은 그 단편 펩티드 등을 들 수 있다)를 사용하고, 또한 비경합법으로, 예컨대 샌드위치법으로는 고상화 항갈렉틴 9 항체 및 표지 항갈렉틴 9 항체를 이용할 수 있는 것 외, 항갈렉틴 9 항체를 직접 표지하거나 고상화하지 않고, 항갈렉틴 9 항체에 대한 항체를 표지하거나 고상화하여 행할 수도 있다. 감도 증폭법으로서는, 예컨대 비효소 표지 일차 항체와의 조합에서는 고분자 폴리머와 효소와 일차 항체를 이용하는 것[Envision 시약을 응용한 것; Enhanced polymer one-step staining(EPOS)]을 들 수 있고, 비효소 표지 이차 항체와의 조합으로는, 예컨대 PAP(peroxidase-antiperoxidase)법 등의 효소와 항효소 항체 복합체의 조합, SABC(avidin-biotinylated peroxidase complex)법 등의 비오틴 표지 이차 항체와 비오틴 표지 효소-아비딘 복합체의 조합, ABC(streptavidin-biotin complex)법, LSAB(labeled streptavidin-biotin)법 등의 비오틴 표지 이차 항체와 비오틴 표지 효소-스트렙트아비딘 복합체의 조합, CSA(catalyzed signal amplification)법 등의 SABC와 비오틴 표지 티라마이드와 효소 표지 스트렙트아비딘의 조합, 고분자 폴리머로 이차 항체와 효소가 표지되어 있는 것 등을 들 수 있다.

이것들의 일반적인 기술 수단의 상세한 내용에 관해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다〔예컨대 이리에 히로시 지음, 「라디오면역분석」, 코단샤, 1974년 발행; 이리에 히로시 지음, 「속 라디오면역분석」, 코단샤, 1979년 발행; 이시카와 에이지 외 지음, 「효소 면역 측정법」, 이가꾸쇼잉, 1978년 발행; 이시카와 에이지 외 지음, 「효소 면역 측정법」(제2판), 이가꾸쇼잉, 1982년 발행; 이시카와 에이지 외 지음, 「효소 면역 측정법」(제3판), 이가꾸쇼잉, 1987년 발행; H. V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 70(Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York(1980); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73(Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York(1981); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74(Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York(1981); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84(Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York(1982); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92(Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York(1983); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York(1986); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology" Vol. 178(Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York(1989); M. Wilchek et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184(Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York(1990); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol.203(Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York(1991) 등 혹은 위에 인용된 문헌(이들 중에 소정의 기재는 그것을 참조함으로써 본 명세서의 개시에 포함된다)〕.

본 발명의 활성 성분〔예컨대 (a) 해당 갈렉틴 9 폴리펩티드, 그 일부의 펩티드 또는 이들의 염, 그것에 관련되는 펩티드 등, (b) 해당 갈렉틴 9 혹은 그 관련 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 등의 핵산 등, (c) 본 발명 소정의 항체, 그 일부 단편(모노클로날 항체를 함유한다) 또는 그 유도체, (d) 해당 갈렉틴 9 단백질의 문제의 활성을 제어하는 화합물(상기 갈렉틴 9 단백질의 세포 상해 활성, 아포토시스 유도 활성, 정상 세포에는 악영향을 부여하지 않고 소정의 효능을 다하는 활성 등을 촉진하거나 혹은 억제·저해하는 등의 현상, 혹은 조직 혹은 단백질의 변질·과잉 생산 혹은 분해 현상이라고 하는 생물학적 활성을 촉진 혹은 억제 및/또는 저해하는 화합물) 또는 그 염, 상기 단백질 생산을 제어하는 화합물 또는 그 염, (e) 본 발명을 사용하여 발견된 활성 물질 등〕을 의약으로서 이용하는 경우, 통상 단독 혹은 약리적으로 허용되는 각종 제제 보조제와 혼합하여, 의학 조성물 또는 의약 조제물 등으로서 투여할 수 있다. 바람직하게는 경구 투여, 국소 투여, 또는 비경구 투여 등의 사용에 알맞은 제제 조제물의 형태로 투여되고, 목적에 따라서 모든 투여 형태(흡입법, 혹은 직장 투여도 포함된다)에 의한 것도 좋다.

또한, 본 발명의 활성 성분은 각종 의약, 예컨대 항종양제(항암제), 종양 이전 저해제, 혈전 형성 저해제, 관절 파괴 치료제, 진통제, 소염제 및/또는 면역 억제제와 배합하여 사용할 수도 있고, 이들은 유리한 기능을 갖는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며 예컨대 상기 분야에서 알려진 것 중에서 선택할 수 있다.

그리고, 비경구적인 투여 형태로서는 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 혹은 복강내 투여를 포함할 수 있지만, 환부에의 직접 투여도 가능하고, 또한 어떤 경우에는 적합하기도 하다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에게 경구적으로, 혹은 비경구적(예, 세포내, 조직내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 복강내, 흉강내, 척수강내, 점적법, 주장, 경직장, 점이, 점안이나 점비, 치아, 피부나 점막에의 도포 등)으로 투여할 수 있다. 구체적인 제제 조제물의 형태로서는, 용액 제제, 분산 제제, 반고형 제제, 분립체 제제, 성형 제제, 침출 제제 등을 들 수 있고, 예컨대 정제, 피복 정제, 당의를 입힌 제제, 환제, 트로키제, 경캡슐제, 연캡슐제, 마이크로 캡슐제, 매립제, 분말제, 산제, 과립제, 세립제, 주사제, 액제, 에릭시르제, 에멀젼제, 관주제, 시럽제, 수제, 유제, 현탁제, 리니멘트제, 로션제, 에어졸제, 스프레이제, 흡입제, 분무제, 연고 제제, 경고 제제, 첩부제, 페이스트제, 파프제, 크림제, 오일제, 좌제(예컨대 직장 좌제), 팅크제, 피부용 수제, 점안제, 점비제, 점이제, 도포제, 수액제, 주사용 액제 등을 위한 분말제, 동결 건조 제제, 겔 조제품 등을 들 수 있다.

의약용 조성물은 통상의 방법에 따라서 제제화할 수 있다. 예컨대 적절히 필요에 따라서, 생리학적으로 인정되는 담체, 의약으로서 허용되는 담체, 아주번트제, 부형제, 보형제, 희석제, 향미제, 향료, 감미제, 비히클, 방부제, 안정화제, 결합제, pH 조절제, 완충제, 계면 활성제, 기제, 용제, 충전제, 증량제, 용해 보조제, 가용화제, 등장화제, 유화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 겔화제, 경화제, 흡수제, 점착제, 탄성제, 가소제, 붕괴제, 분사제, 보존제, 항산화제, 차광제, 보습제, 완화제, 대전 방지제, 무통화제 등을 단독 혹은 조합하여 이용하는 것이고, 함께 본 발명의 단백질 등을 혼화함으로써, 일반적으로 인정받은 제제 실시에 요구되는 단위 용량 형태로써 제조할 수 있다.

비경구적 사용에 알맞은 제제로서는, 활성 성분과, 물 혹은 그것 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 매체의 무균성 용액, 또는 현탁 액제 등, 예컨대 주사제 등을 들 수 있다. 일반적으로는 물, 식염수, 덱스트로즈 수용액, 그 외 관련된 당의 용액, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등의 글리콜류를 바람직한 주사제 용액체 담체로서 들 수 있다. 주사제를 조제할 때는 증류수, 링거액, 생리 식염액 같은 담체, 적당한 분산화제 또는 습화제 및 현탁화제 등을 사용하여 해당 분야에서 알려진 방법으로 용액, 현탁액, 에멀젼과 같은 주사할 수 있는 형태로 조제한다.

주사용 수성액으로서는, 예컨대 생리 식염액, 포도당 및 그 밖의 보조약(예컨대 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등)을 함유하는 등장액 등을 들 수 있고, 약리적으로 허용되는 적당한 용해 보조제, 예컨대 알콜(예컨대 에탄올 등), 폴리알콜(예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 비이온성 계면 활성제(예컨대 폴리솔베이트80^TM, HCO-50 등) 등으로 병용하여도 좋다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질 알콜 등으로 병용하여도 좋다. 또한, 완충제(예컨대 인산염 완충액, 초산 나트륨 완충액 등) 또는 침투압 조절을 위한 시약, 무통화제(예컨대 염화 벤잘코니움, 염산 프로카인 등), 안정제(예컨대 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 보존제(예컨대 벤질 알콜, 페놀 등), 아스코르브산 등의 산화 방지제, 흡수 촉진제 등으로 배합하여도 좋다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전된다.

비경구 투여에는 계면 활성제 및 그 외의 약학적으로 허용되는 조제를 추가하거나, 혹은 추가하지 않고, 물, 에탄올 또는 기름과 같은 무균의 약학적으로 허용되는 액체중의 용액 혹은 현탁액의 형태로 제제화된다. 제제에 사용되는 유성 비히클 혹은 용제로서는, 천연 혹은 합성 혹은 반합성의 모노 혹은 디 혹은 트리글리세이드류, 천연 혹은 합성 혹은 반합성의 유지류 혹은 지방산류를 들 수 있고, 예컨대 땅콩 기름, 옥수수 기름, 콩기름, 참기름 등의 식물유를 들 수 있다. 예컨대 이 주사제는 통상 본 발명 화합물을 0.1 내지 10 중량% 정도 함유하도록 조제될 수 있다.

국소적, 예컨대 구강, 또는 직장적 사용에 알맞은 제제로서는, 예컨대 구강세척제, 양치제, 구강 분무제, 흡입제, 연고제, 치과 충전제, 치과 코팅제, 치과 페이스트제, 좌제 등을 들 수 있다. 구강세척제, 그 외 치과용제로서는 약리적으로 허용되는 담체를 이용하여 관용의 방법에 의해 조제된다. 구강 분무제, 흡입제로서는, 본 발명 화합물 자체 또는 약리적으로 허용되는 불활성 담체와 함께 에어졸 또는 네불라이저용 용액을 용해시키거나 혹은, 흡입용 미세 분말로서 치아 등에 투여할 수 있다. 연고제는 통상 사용되는 기제, 예컨대 연고 기제[백색 바셀린, 파라핀, 올리브유, 매크로골(400), 매크로골 연고 등] 등을 첨가하여 관용의 방법에 의해 조제된다.

치아, 피부에 대한 국소 도포용 약품은, 적절히 살균한 물 또는 비수부형제의 용액 또는 현탁액으로 조제할 수 있다. 첨가제로서는, 예컨대 아황산 수소 나트륨 또는 에데트산 2 나트륨 같은 완충제; 초산 또는 질산 페닐 수은, 염화 벤즈알코늄 또는 클로르헥시딘과 같은 살균 및 항진균제를 함유하는 방부제 및 히프로멜로오즈와 같은 농후제를 들 수 있다.

좌제는 상기 분야에서 주지의 담체, 바람직하게는 비자극성의 적당한 보형제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜류, 라놀린, 카카오 버터, 지방산 트리글리세이드 등의, 바람직하게는 상온에서는 고체이지만 장관(腸管)의 온도에서는 액체로 직장내에서 융해하여 약품을 방출하는 것 등을 사용하여 관용의 방법에 의해 조제되지만, 통상 본 발명 화합물을 0.1 내지 95 중량% 정도 함유하도록 조제된다. 사용하는 부형제 및 농도에 의해 약품은 부형제로 현탁시키거나 또는 용해시킬 수 있다. 국부 마취제, 방부제 및 완충제 같은 보조약은 부형제에 용해 가능하다.

경구적 사용에 알맞은 제제로서는, 예컨대 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 트로키와 같은 고체형 조성물 및 액제, 시럽제, 현탁제와 같은 액체형 조성물 등을 들 수 있다. 제제를 조제할 때는 해당 분야에서 알려진 제제 보조제 등을 이용한다. 정제 및 환제는 또한 장용 코팅되어 제조될 수도 있다. 조제 단위 형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 지방 같은 액형 담체를 더 함유할 수 있다.

또한, 활성 성분이 단백질 및 폴리펩티드인 경우, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 포유 동물중에서 독성이 매우 낮기 때문에, 그것을 결합시키는 것은 특히 유용하다. 또한, PEG을 결합시키게 하면, 이종성 화합물의 면역원성 및 항원성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 경우가 있다. 상기 화합물은 마이크로 캡슐 장치 속에 넣어 부여하여도 좋다. PEG같은 폴리머는 아미노 말단의 아미노산의 α-아미노기, 리신측쇄의 ε-아미노기, 아스파라긴산 또는 글루타민산 측쇄의 카르복실기, 카르복시 말단의 아미노산의 α-카르복실기, 또는 어떤 종의 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착된 글리코실쇄의 활성화된 유도체에 간편히 부착시킬 수 있다.

단백질과의 직접적인 반응에 적합한 많은 활성화된 형태의 PEG가 알려져 있다. 단백질의 아미노기와 반응시키는데 유용한 PEG 시약으로서는 카르복실산, 카르보네이트 유도체의 활성 에스테르, 특히, 이탈기가 N-히드록시 호박산 이미드, p-니트로페놀, 이미다졸, 또는 1-히드록시 2-니트로 벤젠-4-술포네이트인 것을 들 수 있다. 마찬가지로 아미노 히드라진 또는 히드라지드기를 함유하는 PEG 시약은 단백질 중 과요오드산 산화에 따라서 생성한 알데히드와의 반응에 유용하다.

또한, 본 발명의 DNA 등의 핵산을 상기한 바와 같은 치료 및/또는 예방제로서 이용하는 경우, 상기 핵산은 그것을 단독으로 이용할 수도 있고, 혹은 상기한 바와 같은 유전자 재조합 기술로 사용되는 적당한 벡터, 예컨대 레트로 바이러스 유래 벡터 등 바이러스 유래의 벡터 등에 결합시키는 등으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 DNA 등의 핵산은 통상의 알려진 방법으로 투여할 수 있고, 그 자체로, 혹은 예컨대 세포내의 섭취가 촉진되도록 적당한 보조제 혹은 생리적으로 허용되는 담체 등과 함께, 제제화되어 이용할 수 있고, 상기 한 바와 같은 의약 조성물 또는 의약 조제물 등으로서 투여할 수 있다. 또한 유전자 치료로서 알려진 방법을 적용할 수도 있다.

본 발명의 활성 성분은 그 투여량을 광범위하게 선택하여 투여할 수 있지만, 그 투여량 및 투여 횟수 등은 처치 환자의 성별, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 식사, 투여 시간, 투여 방법, 배설 속도, 약품의 조합, 환자의 당시 치료를 행하고 있는 병 상태의 정도에 따라, 이것 혹은 그 밖의 요인을 고려하여 결정할 수 있다.

의약품 제조에 있어서는, 그 첨가제 등이나 조제법 등은 예컨대 일본 약방 해설서 편집 위원회 지음, 제14 개정 일본 약방 해설서, 2001년 6월 27일 발행, 가부시키 가이샤 코우가와 서점; 이치반가세 나오 외 지음 의약품의 개발 12권(제제 소제〔I〕), 1990년 10월 15일 발행, 가부시키 가이샤 코우가와 서점; 동, 의약품의 개발 12권(제제 소재〔II〕) 1990년 10월 28일 발행, 가부시키 가이샤 코우가와 서점 등의 기재를 참고하고 이들 중에서 필요에 따라서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.

본 발명의 활성 성분은 본 명세서에서 설명하고 있다, (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체, (b) 갈렉틴 9 및 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (c) 갈렉틴 9 생산 및 유리 유도 인자, (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체 등을 들 수 있고, 이들은 인간 갈렉틴 9가 정상 세포로는 상해 활성을 나타내지 않고, 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성을 나타낸다고 하는 성질, 종양 세포에 대하여 아포토시스를 유도하지만, 정상 세포로는 아포토시스를 유도하지 않는다고 하는 성질, 악성 세포의 전이성을 억제한다고 하는 성질, 활성화된 면역세포, 특히 활성화된 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하는 활성[이것에 대하여 휴면 T 세포, 특히 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도는 그것을 유도하지 않는다고 하는 성질] 등을 이용하는데에 있어서 유용하며, 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제, 부신피질 스테로이드 호르몬과 유사한 활성을 이용하는 약제로서 유망하다.

〔갈렉틴 9 결합 단백질의 탐색〕

갈렉틴 9에 의해 상기 명세서 중에서 개시한 신규 기능을 발휘하는데 관여하고 있는 갈렉틴 9 결합 분자, 특히 아포토시스 관련 갈렉틴 9 결합 단백질을 탐색· 동정하는 것을 행할 수 있다. 탐색 대상으로서는, 특별히 한정되지 않고 여러 가지의 생물 유래 재료를 사용할 수 있지만, 대표적으로는 인간 T 세포 유래주 M0LT-4와 같은 갈렉틴 9 첨가에 의해 세포사가 유도되는 세포주를 출발 재료로 선정하여 그것을 행할 수 있고, 어떤 경우에는 바람직하다. 상호 작용 분자 탐색법으로서는, 상기 분야에서 알려진 여러 가지 방법을 단독 혹은 임의로 조합하여 행할 수 있다. 예컨대 후보 단백질로부터 갈렉틴 9와 상호 작용하는 단백질을 동정하기 위해서는 예컨대 이하의 방법으로부터 선택하여 그것을 적용할 수 있다. 상호 작용하는 단백질을 암으로써, 표적 단백질의 신규 기능 및 조절 기구, 예컨대 갈렉틴 9를 매개로 한 것을 알 수 있다.

이용할 수 있는 방법으로서는, (1) 면역 침강법, (2) 웨스트웨스턴법(West Western법, 또는 파웨스턴법: Far Western 법, 리간드·블로팅법을 포함한다), (3) 분자간 가교 법, (4) 발현 클로닝법, (5) 투·하이브리드·시스템(Two-Hybrid system), (6) 퍼지 디스플레이법, (7) 표면 플라즈몬 공명법, (8) 형광 편광법 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 상기 분야에서 알려진 방법 및 그 개변법을 적용할 수 있다.

면역 침강법이란 시료인 여러 가지 단백질 용액에, 목적한 단백질에 특이한 항체를 추가하여 목적한 단백질과 상호 작용하고 있는 단백질을 면역 복합체 자체로 면역 침강물로서 격리하고, SDS-PAGE나, 또한 웨스턴 블로팅 등으로 동정하는 방법으로, 목적한 단백질과 상호 작용하는 단백질의 존재를 검토하는데 유효하다. 여기서는 목적한 단백질에 대한 특이한 항체 혹은 기지의 단백질에 대한 특이한 항체, 프로테인 A 또는 프로테인 G 세파로오스 등의 항체를 트랩하는 수지 등을 사용 할 수 있는 것 외에, 바람직하게는 RI 등으로 표지한 단백질 용액을 준비할 수 있는 것이 바람직하다. 시판의 키트를 이용하는 것도 가능하고, 예컨대 Affi-Prep 1O, Affi-Gel Hz(BIO-RAD 사), NHS Sepharose HP(Pharmacia 사) 등을 들 수 있다.

측정 대상 단백질로서는 융합 단백질로서 제작·정제한 것을 이용할 수 있고, 이 경우, Tag에 대한 항체를 유효하게 이용할 수 있어 편리하다, 재조합 단백질로서는 대장균, 효모, 포유동물 세포 등의 숙주 발현계를 이용할 수 있는 것 외에 망상 적혈구의 무세포 번역계를 이용하는 것도 가능하다. 또한, 단백질 용액에 목적한 융합 단백질을 지나치게 추가하는 등을 하여 융합 단백질을 간편히 정제할 때에 co-purification하는 것도 이용할 수 있다. 이들의 방법은, 예컨대 Rudner, D.Z. et al., Mol. Cell Biol., 116, 1765-1773, 1998(His-tag 이용), Cleveland, d.w. et al., J. Mol. Biol., 116, 207-225, 1977[tau(microtubule-associated protein)이용] 등을 참조할 수 있다.

웨스트웨스턴법 또는 파웨스턴법이란, 웨스턴법의 변법으로, 항체 대신 표지한 목적 단백질 등이나 기지의 단백질 등의 프로브·단백질을 이용하여 막에 트랜스퍼한 단백질과의 결합을 보는 것에 의해, 검지·측정을 행하는 것이다. 목적 단백질을 프로브로서, 결합하는 단백질의 분포, 국재, 분자량 등을 알 수 있는 것이 가능한 방법이다. 이 방법은 발현 라이브러리의 스크리닝에 응용하여 cDNA 클로닝으로 이용하는 것이 가능하다[노무라 테루야키, 외, 「면역 92」(단백질 프로브를 이용한 cDNA 클로닝), 나카야마 서점, pp 169-175(1992)]. 프로브로서의 단백질이 프로테인 키나아제로 인산화 표지할 수 있는 것은 유효하게 이것을 이용할 수 있다. 리간드·블로팅법이란, 리간드와 결합하는 단백질의 해석 방법으로서, 파웨스턴 블롯의 일종을 가리킨 방법으로 RI에서 표지한 리간드를 이용하여 그 RI에서 검출, 비오틴-리간드를 이용하여 스트렙트 아비딘·컨쥬게이트(conjugated) 항체로 검출, 미표지 리간드를 이용하여 특이한 항체와 표지 이차 항체를 이용하여 검출하는 등의 방법이다. 표지로서는 비 RI 표지를 이용하는 것도 가능하다. 본 법은 예컨대 Soutar, A. K. & Wade. D. P., Protein function: a practical approach(Creighton, T.E. eds.), IRL press, pp 55-76, 1989 등을 참조할 수 있다.

분자간 가교법은 화학 가교제를 이용하여 단백질-단백질간을 가교시키고, SDS-PAGE로 분리, 웨스턴 블롯법이나 면역 침강법 등을 더불어 행하여 검출하는 것으로, 목적한 단백질의 올리고머 구조의 해석이나 상호 작용하고 있는 단백질 혹은 근방에 존재하는 단백질(혹은 도메인)의 검토 및 리셉터 등의 서브 유닛 구조의 해석에 유효한 방법이다. 화학 가교제 등의 정보는, PIERCE 사의 웹사이트(http://www.piercenet.com/)를 참조할 수 있다. 본 법은 예컨대 Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996 등을 참조할 수 있다.

발현 클로닝법은 cDNA 풀 가운데의 임의의 것을 세포로 발현시키고, 목적한 단백질 혹은 태그(Tag)가 붙어있는 단백질을 프로브로서 이용하여 상호 작용이 인정된 세포에 관련되고, 이용한 cDNA 군으로부터 특정 cDNA를 클로닝하는 것이며, 수용체, 리간드 등의 클로닝을 통해 해석하는 것이다. 발현 클로닝에는 대장균 등의 원핵 세포를 이용한 발현계, 포유동물 세포 등의 배양 세포를 이용한 발현계, 아프리카 발톱 개구리 난세포를 이용한 발현계 등, 해당 분야에서 알려진 발현계를 이용할 수 있다. 본 법은, 예컨대 사사끼 히로끼 지음, 「무적의 바이오테크니컬 시리즈 특별편·바이오 실험의 진행시키는 방법」, 제6장, 요우토샤, 1997 등을 참조할 수 있다. 대장균 등에서의 발현 클로닝으로는 λgt11, λZAPII 등의 cDNA 라이브러리를 대장균 등으로 트랜스포메이션하여 스크리닝할 수 있고, 기본적으로는 파웨스턴법으로 그것을 행할 수 있다. 또한 배양 세포에서의 발현 클로닝으로는 특정한 cDNA를 갖은 발현 벡터를 배양 세포로 형질감염시켜, 발현이 동정되는 세포 속에서부터 목적한 단백질과 결합하는 것을 선별하고, 클로닝함으로써 스크리닝할 수 있다. 선별에는, 그것에 한정되지 않지만, ELISA법이나 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)법 등을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 특정한 cDNA로부터 in vitro로 mRNA를 합성하여 아프리카 발톱 개구리의 알에 마이크로 인젝션하여 발현한 단백질이 목적한 단백질과 상호 작용하는 것과 그 결과 야기되는 세포의 반응을 이용하여 선별하고 클로닝하는 것도 가능하다.

투·하이브리드·시스템은, 목적한 단백질 혹은 그 단백질의 도메인 구조 부분이 독립된 단백질 도메인과 상호 작용하면 리포터 유전자가 발현되도록 구축한 전사 활성 인자의 기능 회복이라는 현상을 이용하여 상호 작용하는 단백질을 탐색하는 수단으로서, 클로닝 시스템이다. 본 방법에는 시판된 프리메이드 라이브러리를 이용하는 것도 가능하며, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 MATCHMAKER GAL4 cDNA LIBRARY, MATCHMAKER LexA cDNA LIBRARY(Clontech 사) 등을 들 수 있다. 또한 자작의 라이브러리 제작용으로서는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 HybriZAP Two-hybrid vector system(Stratagene 사) 등을 들 수 있다. 본 법은 예컨대 야마모토미야비 지음, 바이오메뉴얼 시리즈 1. 유전자 공학의 기초 기술, 요도샤, 1993, Downward, J., FEBL Lett., 338, 113-117, 1994 등을 참조할 수 있다.

파지 디스플레이법이란, 5∼7 잔기의 랜덤인 아미노산 서열을 파지의 표면에 갖는 라이브러리를 이용하여, 원하는 단백질과 결합한 파지를 모아, 파지를 증식시키고, 조작을 반복함으로써, 특이성이 높은 아미노산 서열을 검색하는 수법이다. 또한, 얻어진 결과로부터 단백질 데이터 베이스를 검색하여 기지된 단백질 중에서 대응하는 것을 선택하는 것도 가능하다. 본 법은 예컨대 Smith, G. P. & Scott, J. K., Methods in Enzymology, Vol. 217, pp 228-257, 1993 등을 참조할 수 있다.

표면 플라즈몬 공명법은 전형적으로는 BIACORE^TM 시스템을 이용하여 센서 칩 상에서의 생체 분자간의 상호 작용을 리얼 타임으로 모니터하는 목적으로 개발된 수법이다. 상기 BIACORE^TM에서는 생체 분자의 고정화되어 있지 않은 측의 센서 칩(금박 막)에 광을 전반사하도록 대면, 반사광의 일부에 반사광 강도가 저하된 부분이 관찰된다(SPR 시그널 발생). 이 광의 어두운 부분이 나타내는 각도(＝굴절율의 변화)는 센서 칩 상에서의 질량에 의존하는 것을 이용하는 것이다. 상기 센서 칩으로서는 센서 칩 CM5: 카르복시메틸덱스트란 표면을 갖는 것, 센서 칩 SA: 스트렙트아비딘이 미리 고정화되어 있는 것, 센서 칩 NTA: NTA를 고정화한 것으로 니켈로 킬레이트하고, poly-His 융합 단백질을 고정화할 수 있는 것 등을 들 수 있다. 본 법은 예컨대 하시모토세츠코, 지음 5, 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 생체 분자 상호 작용의 분석, pp 362-368, 1997, 나쓰메테츠, 바이오 메뉴얼 UP 시리즈, 단백질의 분자간 상호 작용 실험법, pp 211-230, 요도샤, 1996 등을 들 수 있다.

형광 편광법은 평면 편광으로 여기된 형광 라벨을 갖은 분자가 여기 상태 중에 회전 등의 운동을 행한 경우, 방사된 형광은 여기광과는 다른 평면이 된다고 하는 현상을 이용하는 것으로, 분자의 순도우는 그 크기에 영향을 받기 때문에 복합체 형성 등으로 고분자가 되면 편광을 유지하고, 저분자로 운동성이 높은 경우에는 편광은 해소된다. 여기서 이 편광도를 측정하여 그 상호 작용을 알 수 있는 것이다. 형광 표지에는 다양한 것을 이용할 수 있지만, 예컨대 FS, FITC, FXS 등을 사용할 수 있다. 측정은 예컨대 FBEACON^TM 등을 사용하여 행할 수 있다.

또한, 아포토시스 관련 갈렉틴 9 결합 단백질을 탐색·동정하는 것은 친화도 컬럼을 이용하여 적합하게 행할 수 있다. 친화도 컬럼의 리간드로서는 합성 펩티드, 융합 단백질, 항체 등을 사용할 수 있다. 대표적인 단리예로서, MOLT-4의 세포 파쇄액을 출발 원료로서 갈렉틴 9 결합 단백질의 취득에 대해서 설명하면, MOLT-4의 세포 파쇄액을 갈렉틴 9 CT(C 말단 영역) 컬럼에 통과시켜, 갈렉틴 9 결합분자를 회수한다. 다음에 회수한 세포 유래 단백질을 겔 상에서 전기 영동하여, 분자량에 따라 분리하고, 분리되어 얻어진 겔 편에 대해서 단백질 내부의 아미노산 서열을 해석하여 갈렉틴 9 결합 단백질을 동정할 수 있다. 후보 갈렉틴 9 결합 단백질은 상기한 후보 단백질로부터 갈렉틴 9와 상호 작용하는 단백질을 동정하는 방법에 의해 확정할 수 있다.

이렇게 하여, 갈렉틴 9 결합 단백질로서, 이하의 인간 유래의 단백질, 즉 4F2 중쇄 항원 (177216); ATPase, Na^＋/K⁺ 수송, 알파 1 폴리펩티드 (21361181); 나트륨-의존성 중성 아미노산 수송자 타입 2 절두형 동형체(truncated isoform) (15004317); 간질(stromal) 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 a (9257240); 간질 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 b; 열 충격 90 kDa 단백질 1, 베타 (20149594); 열 충격 90 kDa 단백질 1, 알파; 열 충격 70 kDa 단백질 5 (글루코스 조절된 단백질, 78 kDa) (16507237); 열 충격 70 kDa 단백질 8 동형체 2 (24234686); 열 충격 70 kDa 단백질 9B 전구체 (24234688); 지방산 조효소 A 리가제, 장쇄 3 (27469830); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 1, 75 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4826856); S-아데노실호모시스테인 히드롤라제-유사 1(21361647); 계획된 세포사 8 동형체 1 (4757732); 60 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아 전구체(129379); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛, 동형체 1, 심근 (4757810); 리보포린(ribophorin) II 전구체 (88567); 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1 (4758350); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 2, 미토콘드리아 전구체 (21903482); 돌리킬-디포스포올리고사카라이드-단백질 글리코실트랜스퍼라제 (21104416); 칼슘-결합 수송자 (6841066); NADH 탈수소효소-유비퀴논 Fe-S 단백질 2 전구체 (3540239); 액틴, 베타 (14250401); 번역 신장 인자 EF-Tu-유사 단백질 P43 전구체, 미토콘드리아 (7443384); 메탁신 1 (4505281); 시데로플렉신(sideroflexin) 1 (23618867); TCR 베타 쇄 (2982508); Hnrnp A1 (2194069); 포스페이트 캐리어 전구체 동형체 1b(4505775); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 감마 폴리펩티드 1 (4885079); 전압 의존성 음이온 채널 1 (4507879); 히알루로난-결합 단백질 전구체 (8699626); 안드로겐-조절된 단쇄 탈수소효소/리덕타제 1 (20070798); 용질 캐리어 패밀리 25 (미토콘드리아 캐리어; 옥소글루타레이트 캐리어), 구성원 11 (21361114); 3-히드록시 부티레이트 탈수소효소 전구체 (17738292); B-세포 수용체 회합 단백질 (1673514); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 0 서브유닛 (4502303); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F0 복합체, 서브유닛 d (5453559); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 FO 복합체, 서브유닛 b, 동형체 1 (21361565); 작은 GTP-결합 단백질 (13569962); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 8, 23 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4505371); 소낭 수송 단백질 sec22b (4759086); 미토콘드리아 유입(import) 수용체 Tom22 (9910382); 신호 서열 수용체, 델타 (5454090); ATP 신타제, 알파 쇄 (114517 또는 P25705); ATP 신타제, 베타쇄 (114549 또는 P06576); 나트륨/칼륨-수송 ATPase 베타-3 쇄 (1703470 또는 P54709); ADP, ATP 캐리어 단백질 (113463, P12236, 113459, P05141, 113455 또는 P12235); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 1 (731047 또는 P31930) 및 시토크롬 c 옥시다제 폴리펩티드 II (117020 또는 P00403)를 들 수 있다. 특히, 갈렉틴 9 결합 단백질로서, 이하의 인간 유래의 단백질, 즉, 4F2 중쇄 항원 (177216); ATPase, Na⁺/K⁺ 수송, 알파 1 폴리펩티드 (21361181); 나트륨-의존성 중성 아미노산 수송자 타입 2 절두형 동형체(truncated isoform) (15004317); 간질(stromal) 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 a (9257240); 간질 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 b; 열 충격 90 kDa 단백질 1, 베타 (20149594); 열 충격 90 kDa 단백질 1, 알파; 열 충격 70 kDa 단백질 5 (글루코스 조절된 단백질, 78 kDa) (16507237); 열 충격 70 kDa 단백질 8 동형체 2 (24234686); 열 충격 70 kDa 단백질 9B 전구체 (24234688); S-아데노실호모시스테인 히드롤라제-유사 1(21361647); 계획된 세포사 8 동형체 1 (4757732); 60 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아 전구체(129379); 리보포린(ribophorin) II 전구체 (88567); 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1 (4758350); 돌리킬-디포스포올리고사카라이드-단백질 글리코실트랜스퍼라제 (21104416); 칼슘-결합 수송자 (6841066); TCR 베타 쇄 (2982508); 히알루로난-결합 단백질 전구체 (8699626); 안드로겐-조절된 단쇄 탈수소효소/리덕타제 1 (20070798); B-세포 수용체 회합 단백질 (1673514) 및 나트륨/칼륨-수송 ATPase 베타-3 쇄(1703470 또는 P54709)에 대해서 상기 (1) 면역 침강법, (2) 웨스트웨스턴법(West Western법, 또는 파웨스턴법: Far Western법, 리간드·블로팅법을 포함), (3) 분자간 가교법, (4) 발현 클로닝법, (5) 투·하이브리드·시스템(Two-Hybride·system), (6) 파지디스플레이법, (7) 표면 플라즈몬 공명법, (8) 형광 편광법 등을 적용하여, 갈렉틴 9와 상호 작용하는 단백질로서의 성상을 자세히 조사할 수 있다.

또한, 상기에서 괄호()안의 숫자는 NCBI의 홈페이지(http://www ncbi.nlm.nih.gov/)에서 그 숫자를 입력함으로써, 단백질 정보 및 그것을 코딩하는 DNA 등의 핵산 서열 정보를 얻을 수 있다. 따라서, 상기 아미노산 서열 정보 및 DNA 등의 핵산 서열 정보를 이용하는 것, 즉, 본 명세서에서 갈렉틴 9를 예를 들어 설명한 기술·수법을 마찬가지로 상기 단백질 및 코드 유전자 서열에 대하여 적용할 수 있다. 이러한 적용 가능 기술·수법 중에는, 모노클로날 항체의 제작 및 이용을 포함한 항체 제작 및 이용 기술이 당연 포함된다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 갈렉틴 9 대신에 상기 갈렉틴 9 결합 분자로 치환하여 그 기재를 읽고 이해해야 하며, 이렇게 다시 읽어진 얻어진 내용은 전부 본 명세서 안에 포함된다.

예컨대 피험자의 생체 시료에 있어서의 갈렉틴 9 결합 분자의 폴리뉴클레오티드의 존재량을 시험하고, 폴리뉴클레오티드의 존재량이 건강한 정상인의 것과 비교하여 많은 피험자를 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성을 기대할 수 있는 것이라고 판정하는 것을 특징으로 하는 진단 방법을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 피험자의 생체 시료에 있어서의 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 존재량을 시험하고, 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 존재량이 건강한 정상인의 것과 비교하여 많은 피험자를 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성을 기대할 수 있는 것이라고 판정하는 것을 특징으로 하는 진단 방법을 제공할 수 있다. 또한, 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 상기 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 올리고큐클레오티드 또는 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드를 구비한 DNA 마이크로어레이, 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드를 PCR 증폭하기 위한 프라이머 세트, 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체, 상기 항체와는 다른 에피토프과 결합하는 항체 등도 제공된다. 또한, 적어도 이하의 요소: (a) 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체; 및 (b) 상기 (a)의 항체와는 다른 에피토프과 결합하는 항체이며, 또한, 표지화된 항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 측정 방법 및 측정 키트, 적어도 이하의 요소: (a) 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체를 고정화한 플레이트 또는 멤브레인; 및 (b) 상기 (a)의 항체와는 다른 에피토프과 결합하는 항체이며, 또한, 표지화된 항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 측정 또는 검지 방법 혹은 측정 또는 검지 키트, 적어도 이하의 공정: (a) 피험자의 생체 시료를 상기 항체를 고정화한 담체와 접촉하는 공정; (b) 상기 생체 시료와 접촉시킨 고상 담체를 세척하는 공정; (c) 상기 생체 시료와 접촉시킨 고상 담체를 표지화한 상기 항체와 접촉하는 공정; (d) 고상화된 표지 혹은 유리되어 있는 표지를 측정하는 공정; (e) 공정 (d)에서 측정된 표지량을 갈렉틴 9 결합 분자량의 지표로 하고, 대조 생체 시료의 결과와 비교하는 공정; 및 (f) 대조 생체 시료와 비교하여 유의적으로 높은 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 존재량을 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도를 나타내는 지표로서 사용하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 적어도 이하의 공정: (a) 피험자의 생체 시료로부터 RNA를 조제하는 공정; (b) 공정 (a)에서 조제된 RNA를 전기 영동 분리하는 공정; (c) 공정 (b)에서 분리된 RNA를 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 표지 뉴클레오티드프로브와 하이브리드화하는 공정; (d) 공정 (e)에서 하이브리드화하고 있는 표지량을 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량의 지표로 하고, 대조 생체 시료의 결과와 비교하는 공정; 및 (e) 대조 생체 시료와 비교하여 유의적으로 높은 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량을, 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도를 나타내는 지표로서 사용하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 적어도 이하의 공정: (a) 피험자의 생체 시료로부터 RNA를 조제하는 공정; (b) 공정 (a)에서 조제된 RNA를 주형으로 dT 프라이머를 사용하여 제1 쇄 cDNA를 조제하는 공정; (c) 공정 (b)에서 조제된 cDNA를 주형으로 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드를 PCR 증폭하기 위한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증가하는 공정; (d) 공정 (c)에서 얻어진 PCR 산물을 전기 영동 분리하는 공정; (e) 공정 (d)에서 분리된 PCR 산물을 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 표지 뉴클레오티드프로브와 하이브리드화하는 공정; (f) 공정 (e)에서 하이브리드화하고 있는 표지량을 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량의 지표로 하고, 대조 생체 시료의 결과와 비교하는 공정; 및 (g) 정상적인 생체 시료와 비교하여 유의적으로 높은 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량을 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도를 나타내는 지표로서 사용하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 적어도 이하의 공정: (a) 피험자의 생체 시료를 조직 고정화 처리하는 공정; (b) 공정 (a)에서 조제된 조직 고정화 표본을 절편으로 하는 공정; (c) 절편화된 조직을 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체에 의한 면역 조직 염색에 부치는 공정; (d) 피험자의 생체 시료에 있어서의 면역 조직 염색의 정도를 대조 시료의 그들과 비교하는 공정; 및 (e) 대조 생체 시료와 비교하여 유의적으로 높은 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 존재량을 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도를 나타내는 지표로서 사용하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 이하의 공정: (a) 피험자의 생체 시료를, 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드를 PCR 증폭하기 위한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭하는 공정; (b) 피험자의 생체 시료로부터 분리한 핵산 분획을 상기 DNA 마이크로어레이를 사용한 분석에 관한 공정; (c) 피험자의 생체 시료로부터 분리한 핵산 분획을 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 공정으로 이루어지는 군으로부터 선택된 공정 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 피험자의 생체 시료에 있어서의 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드의 존재량을 시험하여 폴리뉴클레오티드의 존재량이 건강한 정상인의 것과 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 정량적으로 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 존재량 또는 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 중 어느 하나에 기재한 상기 기재의 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법, 상기 중 어느 하나에 기재한 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정하는 방법에 있어서 사용하는 상기 중 어느 하나에 기재한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 시약, 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체를 사용하고, 검체 시료 중 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 양 또는 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도 혹은 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정 또는 진단하는 방법, 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체를 함유하고, 검체 시료 중 갈렉틴 9 결합 분자 단백질량 또는 갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드 발현량을 측정하여, 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도 혹은 갈렉틴 9 관련 생리 반응의 정도를 측정 또는 진단하는 시약도 제공할 수 있다. 진단, 측정 등에 있어서의 구체적인 판정 기준으로서는 피험자의 폴리뉴클레오티드의 존재량이 예컨대 대조한 것과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상인 경우이다.

마이크로어레이의 제작 방법으로서는 고상 담체 표면에서 직접 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법(온·칩법)과, 미리 조제한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 고상 담체 표면에 고정하는 방법이 알려져 있다. 본 발명에서 사용하는 마이크로어레이는 이 중 어느 하나의 방법으로도 제작할 수 있다. 온·칩법으로서는, 광조사로 선택적으로 제거되는 보호기의 사용과, 반도체 제조에 이용되는 포토리소그래피 기술 및 고상 합성 기술을 조합하여, 미소한 매트릭스의 소정 영역에서의 선택적 합성을 행하는 방법(마스킹 기술: 예컨대 Fodor, S. P. A. Science 251: 767, 1991) 등에 의해 행할 수 있다. 한편, 미리 조제한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 고상 담체 표면에 고정하는 경우에는 작용기를 도입한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 표면 처리한 고상 담체 표면에 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 점착하여 공유 결합시킨다(예컨대 Lamture, J. B. et al. Nucl. Acids Res. 22: 2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res.22: 5456-5465, 1994).

올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로는, 표면 처리한 고상 담체에 스페이서 및 크로스 링커를 통해 공유 결합시킨다. 유리 표면에 폴리아크릴아미드겔의 미소편을 정렬시키고, 거기에 합성 올리고뉴클레오티드를 공유 결합시키는 방법도 알려져 있다(Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4913, 1996). 또한, 실리카 마이크로어레이 상에 미소 전극의 어레이를 제작하고, 전극 상에는 스트렙트아비딘을 함유하는 아가로스의 침투층을 마련하여 반응 부위로 하고, 이 부위를 플러스에 하전시킴으로써 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 고정하고, 부위의 하전을 제어함으로써, 고속이며 엄밀한 하이브리드화를 가능하게 하는 방법도 알려져 있다(Sosnowski, R. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1119-1123, 1997).

이 마이크로어레이를 사용하여 진단 또는 측정하는 경우에는, 예컨대 피험자의 세포로부터 단리한 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하고, PCR 증폭한다. 그 때에 표지 dNTP를 받아들여 표지 cDNA로 한다. 이 표지 cDNA를 거시적 어레이에 접촉시키고, 마이크로 어레이의 캡쳐 프로브(올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드)에 하이브리드화한 cDNA를 검출한다. 하이브리드화는 96 구멍 혹은 384 구멍 플라스틱 플레이트에 분주하여 표지 cDNA 수성액을 마이크로어레이 상에 점착함으로써 실시할 수 있다. 점착량은 1∼100 nl 정도로 할 수 있다. 하이브리드화는 실온∼70℃의 온도 범위에서, 6∼20 시간의 범위에서 실시하는 것이 바람직하다. 하이브리드화 종료 후, 계면활성제와 완충액과의 혼합 용액을 이용하여 세정을 행하고 미반응 표지 cDNA를 제거한다. 계면활성제로서는 도데실황산나트륨(SDS)을 이용하는 것이 바람직하다. 완충액으로서는 시트르산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액, 트리스 완충액, 구드 완충액 등을 이용할 수 있지만, 시트르산 완충액을 이용하는 것이 바람직하다.

갈렉틴 9 결합 분자 폴리뉴클레오티드의 측정은 프라이머 세트를 이용하여, 상기 폴리뉴클레오티드(구체적으로는 mRNA)의 발현량을 측정할 수도 있다. 이 수법에서는 RT-PCT법을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 경합 PCT법을 사용하여 정량적인 측정을 행하는 것도 바람직하다. 이 프라이머 세트는 공지된 염기 서열에 기초하여 설계하고, 합성·정제의 각 공정을 거쳐 조제할 수 있다. 마찬가지로, 경합용 프라이머도 갈렉틴 9 결합 분자 유전자의 염기 서열을 기초로 그것을 설계하여 합성할 수 있다. 또한, 프라이머 설계의 유의점으로서, 예컨대 이하를 들 수 있다. 프라이머 사이즈(염기수)는 주형 DNA 사이가 특이적인 어닐링을 만족시키는 것을 고려하여 15-40 염기, 바람직하게는 15-30 염기이다. 단, LA(long accurate) PCR 을 행하는 경우에는 적어도 30 염기가 효과적이다. 센스 쇄(5' 말단측)와 안티센스 쇄(3' 말단측)로 이루어지는 1 그룹당 한쌍(2개)의 프라이머가 서로 어닐링되지 않 도록 양 프라이머간의 상보적 서열을 피하는 동시에, 프라이머 내의 헤어핀 구조의 형성을 방지하기 위해 자기 상보 서열을 피하도록 한다. 또한, 주형 DNA와의 안정적인 결합을 확보하기 위해 GC 함량을 약 50%로 하고, 프라이머 내에서 GC-rich 혹은 AT-rich가 편재되지 않도록 한다. 어닐링 온도는 Tm(melting temperature)에 의존하기 때문에 특이성이 높은 PCR 산물을 얻기 위해서, Tm 값이 55-65℃에서 서로 근사한 프라이머를 선정한다. 또, PCR에 있어서 프라이머 사용의 최종 농도가 약 O.1∼약 1 μM이 되도록 조정하는 등을 유의하는 것도 필요하다. 또, 프라이머 설계용 시판의 소프트웨어, 예컨대 Oligo TM[National Bioscience Inc. (미국) 제조], GENETYX[소프트웨어 개발 가부시키가이샤(일본) 제조] 등을 이용할 수도 있다.

갈렉틴 9 결합 분자 발현 유전자(cDNA 등의 DNA 및 nRNA 등의 RNA를 포함)를 상기 「유전자 재조합 기술」에 따라, 상기 분야에서 특정한 유전자 발현을 검지 측정하기 위해 알려진 수법, 예컨대 in situ 하이브리드화, 노던 블로팅, 도트 블로팅, RNase 프로텍션 어세이, RT-PCR, Real-Time PCR(Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000) 및 여기에서 인용되어 있는 문헌), DNA 어레이해석법[Mark Shena편, "Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing(2000년 3월)] 등에 의해 검지·측정하여, 본 명세서 개시의 갈렉틴 9 관련 생리 현상과 갈렉틴 9 결합 분자를 나타내는 생물 활성에 관련된 현상 등을 검지할 수 있다. 이러한 기술을 이용한 갈렉틴 9 결합 분자 발현 유전자 측정계, 아포토시스 검출계, 항종양성 검출계, 그것에 이용되는 시약, 방법, 프로세스, 해석 프로그램 등은 모두 본 발명의 기술 및 그것에 이용되는 시스템에 포함된다. 상기 in situ 하이브리드화에는 예컨대 논 RI in situ 하이브리드화가 포함되어도 좋으며, 거기에는 예컨대 직접법 및 간접법이 포함되어도 좋다. 상기 직접법은 예컨대 핵산 프로브에 검출 가능한 분자(리포터)가 직접 결합되어 있는 것을 사용하고, 상기 간접법은 예컨대 리포터 분자에 대한 항체 등을 사용하여 시그널을 증폭시키고 있는 것이다. 핵산 프로브 중 올리고뉴클레오티드에는 작용기(예컨대 제1 급 지방족 아미노기, SH기 등)가 도입되어 있으며, 이러한 작용기에 합텐, 형광 색소, 효소 등이 결합되어져 있어도 좋다. 핵산 프로브의 표지로서는 대표적으로는 디곡시게닌(DIG), 비오틴, 플루오레세인 등을 들 수 있지만, 하기 항체의 지점에서 설명하는 표지로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있고, 또한 다중 라벨링도 이용할 수 있으며, 또한, 표지 항체도 이용할 수 있다.

핵산 프로브의 표지법으로서는, 상기 분야에서 알려진 방법으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있지만, 예컨대 랜덤프라임법, 닉·트랜스레이션법, PCR에 의한 DNA의 증폭, 라벨링/테일링법, in vitro transcription법 등을 들 수 있다. 처리된 시료의 관찰에는 상기 분야에서 알려진 방법으로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있지만, 예컨대 암시야 현미경, 위상차 현미경, 반사 콘트라스트 현미경, 형광 현미경, 디지털 이미징 현미경, 전자 현미경 등도 사용할 수 있으며, 또한, 플로우 사이토 메트리 등에 따를 수도 있다. 본 발명에서는 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 또는 그 관련 폴리펩티드 혹은 올리고펩티드 및 갈렉틴 9 결합 분자 발현 유전자를 여러 가지 마커 혹은 항종양 마커 또는 발암 혹은 암 악화의 마커로서 사용할 수 있고, 이것에 의해, 여러 가지 형태의 증상의 검출제 혹은 리스크의 검출 및/또는 측정제, 갈렉틴 9 관련 생리 현상의 검출법 혹은 리스크 검출 및/또는 측정법, 나아가서는 이러한 검출 혹은 리스크 검출 및/또는 측정 시약 세트 혹은 시스템을 작성할 수 있고, 본 명세서에서 개시하여 설명하고 있는 여러 가지 질환·증상의 진단, 예방, 치료에 있어서 도움이 될 뿐만 아니라, 우수하다. 또한, 이들은 질환을 치료한 후, 즉, 예후에 대해서도 그것을 대상으로 한 재발 검출제 혹은 예후 검출 및/또는 측정제, 이들 검출법 혹은 위험성 검출 및/또는 측정법, 또한, 이들을 위한 검출 및/또는 측정 시약 세트 혹은 시스템으로 할 수 있으며, 예후의 것으로서도 우수한 기능, 작용 효과를 기대할 수 있다.

피험자의 생체 시료에 있어서 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 존재량을 시험하여 갈렉틴 9 결합 분자 단백질 존재량이 대조와 비교하여 많은 경우를 갈렉틴 9 감수성 또는 갈렉틴 9에 의해 유발되는 생리 활성 기대도의 정도 혹은 갈렉틴 9 관련생리 반응의 정도가 높다고 판정하는 방법이 제공된다. 구체적인 판정 기준으로서는, 피험자의 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 존재량이 대조한 것에 비하여, 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상인 경우이다. 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 존재량은 갈렉틴 9 결합 분자를 인식하는 항체 혹은 갈렉틴 9 결합 분자와 특이적으로 결합하는 항체(항갈렉틴 9 결합 분자 항체)를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 항체는 플리클로날 항체 또는 모노클로날 항체라도 좋고, 갈렉틴 9 결합 분자 단백질의 에피토프에 결합할 수 있는 전체 분자 및 Fab, F(ab')₂, Fv 단편 등이 전부 포함된다.

측정계로서는, 예컨대 조직에 대해서는 면역 염색, 면역 전자 현미경 등의 단백질 측정계, in situ hybridization 등의 발현 유전자 측정계가, 조직 추출물에 대해서는 EIA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅 등의 단백질 측정계, 노던 블로팅, 서던 블로팅, 도트 블로팅, RNase 프로텍션 어세이, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), Real-Time PCR, 경합 PCR 등의 발현 유전자 측정계, 그리고 혈중, 체액 등에 대해서는 EIA, RIA, FIA, LIA, 웨스턴 블로팅이라는 단백질 측정계를 유리하게 이용할 수 있다.

EIA의 측정계에 있어서 예컨대 경합법에서는 항갈렉틴 9 결합 분자 항체를 고상화 담체로서 사용하고, 표지 항원 및 비표지 항원(항원으로서는, 갈렉틴 9 결합분자 혹은 그 단편 펩티드 등을 들 수 있음)을 사용하며, 또한, 비경합법으로, 예컨대 샌드위치법에서는 고상화 항갈렉틴 9 결합 분자 항체 및 표지 항갈렉틴 9 결합 분자 항체를 이용할 수 있는 것 이외에, 항갈렉틴 9 결합 분자 항체를 직접 표지하거나 고상화하지 않고, 항갈렉틴 9 결합 분자 항체에 대한 항체를 표지하거나, 고상화하여 행할 수도 있다. 감도 증폭법으로서는 예컨대 비효소 표지 일차 항체와의 조합에서는 고분자 폴리머와 효소와 일차 항체를 이용하는 것(Envision 시약을 응용한 것; Enhanced polymer one-step staining(EPOS))을 들 수 있으며, 비효소 표지 이차 항체와의 조합에서는 예컨대 PAP(peroxidase-antiperoxidase)법 등의 효소와 항효소 항체 복합체 조합, SABC(avidin-biotinylated peroxidase complex)법 등의 비오틴 표지 이차 항체와 비오틴 표지 효소-아비딘 복합체의 조합, ABC(streptavidin-biotin complex)법, LSAB(labeled streptavidin-biotin)법 등의 비오틴 표지 이차 항체와 비오틴 표지효소-스트렙트 아비딘 복합체의 조합, CSA(catalyzed signal amplification)법 등의 SABC와 비오틴 표지 테라마이드와 효소 표지 스트렙트 아비딘의 조합, 고분자 폴리머로 2차 항체와 효소를 표지한 것 등을 들 수 있다.

갈렉틴 9는 활성화 T 림프구의 아포토시스를 유도한다. 또한, 갈렉틴 9는 활성화 CD4 및 CD8 양성 T 림프구의 아포토시스를 유도한다. 그러나, 갈렉틴 9는 활성화되어 있지 않은 T 림프구의 아포토시스를 유도하지는 않는다. 이 갈렉틴 9에 의한 아포토시스에 대해서는 CD4 양성 림프구가 보다 감수성이 높다. 또, 갈렉틴 9에 의한 아포토시스는 칼슘, 칼파인, 카스파제 1, 카스파제 3 또는 카스파제 7의 경로에 의해 유도되는 것을 발견하는 것에 성공하였다. 항염증제, 항알레르기제, 면역 억제제로서 널리 사용되고 있는 부신피질 스테로이드 호르몬(글루코코르티코이드)과 동일한 경로로 아포토시스를 유발하기 때문에, 갈렉틴 9 활성 발현은 부신피질 스테로이드 호르몬과 동일한 생물 활성을 기대할 수 있다는 인식에 이르러 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 본 발명자들은 갈렉틴 9가 종양 세포에 대하여 세포 장해 활성을 나타내지만, 정상 세포에 대해서는 세포 장해 활성을 나타내지 않고, 종양 세포, 특히, 악성 종양 세포 혹은 전이성 종양 세포에 대해서 특징적인 작용(예컨대 전이 억제 활성)을 나타내어 보다 바람직한 결과를 유도하거나, 혹은 종양 세포에 대해서 아포토시스를 유도하지만 정상 세포에 대해서는 아포토시스를 유도하지 않는다는 현상을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은,

〔1〕(i)(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체(類緣體),

(b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

(c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

(d) 항갈렉틴 9 수용체 항체 및

(e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는,

(ii) 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제로 이루어지는 군으로부터 선택된 의약 또는 동물약;

〔2〕갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항종양제;

〔3〕갈렉틴 9 또는 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제;

〔4〕갈렉틴 9 또는 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제;

〔5〕갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환용 제제;

〔6〕갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증제;

〔7〕갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제;

〔8〕(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체와 (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 악성 세포 상해제; 및

〔9〕(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체와 (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제제;

〔10〕(i)(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

(b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

(c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

(d) 항갈렉틴 9 수용체 항체 및

(e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성을 나타내는 약제;

〔11〕(i)(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

(b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

(c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

(d) 항갈렉틴 9 수용체 항체 및

(e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 약제;

〔12〕(i)(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

(b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

(c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

(d) 항갈렉틴 9 수용체 항체 및

(e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 세포, 예컨대 활성화 T 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 약제;

〔13〕(i)(a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

(b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

(c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

(d) 항갈렉틴 9 수용체 항체 및

(e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 활성화 T 세포에 기인하는 질환 혹은 병적 증상의 예방 및/또는 치료제;

〔14〕활성화 T 세포에 기인하는 질환이 알레르기, 자가면역 질환, 이식편에 대한 거부 반응 및 염증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 상기〔13〕에 기재한 예방 및/또는 치료제;

〔15〕4F2 중쇄 항원 (177216); ATPase, Na^＋/K⁺ 수송, 알파 1 폴리펩티드(21361181); 나트륨-의존성 중성 아미노산 수송자 타입 2 절두형 동형체(truncated isoform) (15004317); 간질(stromal) 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 a (9257240); 간질 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 b; 열 충격 90 kDa 단백질 1, 베타 (20149594); 열 충격 90 kDa 단백질 1, 알파; 열 충격 70 kDa 단백질 5 (글루코스 조절된 단백질, 78 kDa) (16507237); 열 충격 70 kDa 단백질 8 동형체 2 (24234686); 열 충격 70 kDa 단백질 9B 전구체 (24234688); 지방산 조효소 A 리가제, 장쇄 3 (27469830); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 1, 75 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4826856); S-아데노실호모시스테인 히드롤라제-유사 1(21361647); 계획된 세포사 8 동형체 1 (4757732); 60 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아 전구체(129379); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛, 동형체 1, 심근 (4757810); 리보포린(ribophorin) II 전구체 (88567); 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1 (4758350); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 2, 미토콘드리아 전구체 (21903482); 돌리킬-디포스포올리고사카라이드-단백질 글리코실 트랜스퍼라제 (21104416); 칼슘-결합 수송자 (6841066); NADH 탈수소효소-유비퀴논 Fe-S 단백질 2 전구체 (3540239); 액틴, 베타 (14250401); 번역 신장 인자 EF-Tu-유사 단백질 P43 전구체, 미토콘드리아 (7443384); 메탁신 1 (4505281); 시데로플렉신(sideroflexin) 1 (23618867); TCR 베타 쇄 (2982508); Hnrnp A1 (2194069); 포스페이트 캐리어 전구체 동형체 1b(4505775); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 감마 폴리펩티드 1 (4885079); 전압 의존성 음이온 채널 1 (4507879); 히알루로난-결합 단백질 전구체 (8699626); 안드로겐-조절된 단쇄 탈수소효소/리덕타제 1 (20070798); 용질 캐리어 패밀리 25 (미토콘드리아 캐리어; 옥소글루타레이트 캐리어), 구성원 11 (21361114); 3-히드록시 부티레이트 탈수소효소 전구체 (17738292); B-세포 수용체 회합 단백질 (1673514); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 0 서브유닛 (4502303); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F0 복합체, 서브유닛 d (5453559); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 FO 복합체, 서브유닛 b, 동형체 1 (21361565); 작은 GTP-결합 단백질 (13569962); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 8, 23 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4505371); 소낭 수송(vesicle trafficking) 단백질 sec22b (4759086); 미토콘드리아 유입(import) 수용체 Tom22 (9910382); 신호 서열 수용체, 델타 (5454090); ATP 신타제, 알파 쇄 (114517 또는 P25705); ATP 신타제, 베타쇄 (114549 또는 P06576); 나트륨/칼륨-수송 ATPase 베타-3 쇄 (1703470 또는 P54709); ADP, ATP 캐리어 단백질 (113463, P12236, 113459, P05141, 113455 또는 P12235); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 1 (731047 또는 P31930) 및 시토크롬 c 옥시다제 폴리펩티드 II (117020 또는 P00403)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 결합 인자〔괄호내의 숫자는 NCBI의 인터넷 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 그 숫자를 입력함으로써, 단백질 정보 및 그것을 코딩하는 DNA 등의 핵산 서열 정보를 얻을 수 있는 데이터 베이스상의 동정 번호를 나타냄〕; 및

〔16〕 상기 〔15〕에 기재한 갈렉틴 9 결합 인자와 갈렉틴 9 사이의 상호 작용을 이용한 갈렉틴 9 활성 제어 기술을 제공한다.

본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 그것이 갖는 관점은 이하의 기재로부터 당업자에 있어서는 명백할 것이다. 그러나, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본 건 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 형태를 나타내는 것이며, 설명을 위해서만 나타내는 것임을 이해했으면 한다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위 내에서 여러 가지의 변화 및/또는 개변(혹은 수식)을 행하는 것은 이하의 기재 및 본 명세서 그 외의 부분으로부터의 지식에 의해 당업자에는 쉽게 명백해질 것이다. 본 명세서에서 인용되어 있는 모든 특허 문헌 및 참고 문헌은 설명의 목적으로 인용되어 있는 것으로, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 여기에 포함되어 해석되어야 하는 것이다.

이하에 실시예를 통해, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 본 발명의 설명을 위한 그 구체적인 형태의 참고를 위해 제공되어 있는 것이다. 이들의 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 형태를 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나 혹은 제한하는 것을 나타내는 것이 아니다. 본 발명에서는 본 명세서의 사상에 기초하는 여러 가지 실시형태가 가능한 것은 이해되어야 한다.

모든 실시예는 그 외에 상세히 기재하는 것 이외는 표준 기술을 이용하여 실시한 것, 또는 실시할 수 있는 것이며, 이것은 당업자에게 있어 공지된 관용적인 것이다.

실시예 1

(1) 재료 및 방법

(a) 세포 배양물

MOLT-4(T 세포), Jurkat(T 세포), BALL-1(B 세포), THP-1(acute monocytic leukemia 유래 세포) 및 HL 60(acute promyelotic leukemia 유래 세포)은 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 입수하였다. 모든 세포주는 10% FCS를 첨가한 RPMI-1640 배지(Sigma, 센트루이스, 미국) 중에서 5% CO₂의 조건하 37℃로 유지하였다. Gal-9의 활성을 저해하기 위해 배양용 배지에는 30 mM의 락토스를 첨가하였다. 대조군으로서 동일한 농도의 수크로스를 이용하였다.

(b) 재조합 Gal-9(rGal-9)의 발현과 정제

공지된 방법[예컨대 Matsushita, N. et al., J. Biol. Chem., 275: 8355(2000); 및 Nishi, N. et al., Endocrinology, 141: 3194(2000)]과 같이 하여 rGal-9를 (His)₆-갈렉틴 9(쇼트 타입)〔(His)₆-Gal-9(S)〕로서 발현시켜 정제하였다. 즉, Gal-9 발현 플라스미드를 보유하는 대장균 BL-21 주를 1OO ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지(Gibco BRL, 록빌, 메릴랜드주, 미국) 중에서 생육시켰다.

융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG(이소프로필β-D-(-)-티오갈락토피라노시드, 와코준야쿠, 오사카, 일본)를 첨가하였다. 대장균 추출물을 락토스아가로오스(생화학 공업, 도우쿄, 일본)의 친화도크로마토그래피에 부쳤다. 흡착된 단백질을 200 mM 락토스로 용출하였다. 용출 분획을 모아, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의해 쿠마시 브릴리언트블루 R250으로 염색하여 해석하였다. rGal-9를 함유하는 분획을 풀로 하고, 0.1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol(DTT))을 함유하고 있는 PBS에 대해 투석을 행하였다.

또한, 야생형 갈렉틴 9(galectin-9S, galectin-9M 및 galectin-9L)의 발현 벡터의 구축, 재조합 단백의 발현 및 정제에 대해서는 M. Sato et al., Glycobiology, Vol. 12, No. 3, pp. 191-197(2002)과 같이 하여 행하였다.

(c) 아포토시스 어세이

(1) PI에 의한 세포 주기(apoptosis) 해석(PI법)

아포토시스 유도 처리된 세포를 4℃에서 5분간 1000 rpm에서 원심 처리한 후, 세포 펠릿을 PBS(300 ㎕)에 재부유시키고, 볼텍스하면서 세포 부유액에 100% 냉 에탄올(700 ㎕)을 서서히 첨가하여, 최종농도 70% 에탄올이 되도록 한다. 4℃에서 30분간 인큐베이트 처리하여 세포를 고정하고, 다음에 PBS(1 ㎖)를 첨가하여 4℃에서 5분간 100O rpm에서 원심 처리한 후, 세포 펠릿을 PBS(440 ㎕)에 재부유시킨다. 세포를 2.5 mg/㎖의 리보뉴클레아제 A(10 ㎕; 최종농도 50 ㎍/㎖, Sigma, 센트루이스, 미즈리주, 미국)와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션 처리하고, 계속해서 2.5 mg/㎖의 요오드화 프로피듐(4 ㎕; PI, 최종농도 20 ㎍/㎖, Sigma)과 함께 4℃에서 10분간 어둠 속에서 인큐베이션 처리를 하였다. 나일론 메쉬를 통하여 집괴된 세포를 제외한 후, 세포를 PBS에서 메스업하여 염색 세포를 플로우 사이트메트리(Sandstrom, k et al., J Immunol Methods, 240: 55(2000) 및 Zhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129(1999))에 의해 해석하였다.

(2) TUNEL(TdT-mediated 표지 dUTP nick end labeling)법

DNA의 단편화에 의해 발생된 말단에, DNA 말단에 뉴클레오티드를 부가하는 효소(TdL; 터미널·디옥시뉴클레오티딜·트랜스퍼라제)를 갖고,

라벨한 뉴클레오티드(dUTP-biotin 혹은 FITC-dUTP 등)를 내장하고, 아포토시스가 현저한 것이 특징인 세포핵 DNA의 단편화를 검출한다.

실험에는 MEBSTAIN Apoptosis kit Direct(MBL, 나고야, 일본)를 사용하였다. 키트 업자에 의한 지시에 따라, 실험을 다음과 같이 행하였다. 즉, 아포토시스 유도를 행한 세포(약 2×10⁵ 개/샘플)를 0.2% FSA 함유 PBS로 세정하고, 다음에 4% 파라포름알데히드(0.1 M NaH₂PO₄, pH 7.4 중)를 첨가하여 4℃에서 30분간 고정화한 후, 0.2% FSA 함유 PBS로 세정하였다. 세포 펠릿에 70% 냉 에탄올을 첨가하여 -20℃로 30분간 인큐베이션 처리하여, 투과성을 항진하였다. 0.2% FSA 함유 PBS로 세정한 후, 세포 펠릿에 TdT 반응액(TdT, FITC-dUTP 및 TdT 버퍼의 혼합물)을 첨가하고, 교반 후 37℃에서 1시간 인큐베이션 처리하고, 0.2% FSA 함유 PBS로 세정한 후 0.2% FSA 함유 PBS에 재부유한 후, 염색 세포를 플로우 사이트메트리에 의해 해석하였다.

(3) 배양한 세포주를 rGal-9와 같이 적절한 시간, 예컨대 24시간 인큐베이션하였다. 다음에 상기 (1)의 PI법에 의해 아포토시스 해석을 행하였다.

또한, 아넥신(Annexin) V-PI에 의한 아포토시스 해석을 위해서는 MEBCYTO(등록상표) 아포토시스 키트(MBL, 나고야, 일본)를 사용하였다. 키트 업자에 의한 지시에 따라, 실험을 다음과 같이 행하였다. 즉, 아포토시스 유도를 한 세포(2×1O⁵개/샘플)를 PBS로 세정하고, 다음에 결합용 버퍼에 재현탁하였다. 키트의 Annexin V-FITC 및 5 ㎕의 PI(최종농도 5 ㎍/㎖)를 세포 현탁액 속에 첨가한 후, 세포를 어두운 곳에서 15분간 실온에서 인큐베이션 처리하였다. 플로우 사이토메터(EPICS XL-MCL, CouHer, Miami, FL, 미국)를 사용하여 해석을 하였다.

세포는 Gal-9와 함께, 10 μM의 Z-VAD-FMK(판-카스파제 저해제), Z-YVAD-FMK(카스파제-1 저해제), Z-IETD-FMK(카스파제-8 저해제), Z-LEHD-FMK(카스파제-9 저해제), Z-AEVD-FMK(카스파제-10 저해제) 혹은 Z-LLY-FMK(칼파인 저해제)(이상, BioVision, CA, 미국)의 존재하에 인큐베이션 처리하여, 카스파제 또는 칼파인이 Gal-9에 의해 유도되는 아포토시스에 관여하는지 여부를 조사하였다. Z-FA-FMK(BioVision, CA, 미국)을 대조군으로서 사용하였다(Vu C. C. et al., J. Biol. Chem., 276: 37602(2001) 및 Sweeney E. A. et al., FEBS Lett., 425: 61(1998)). 각 저해제는 Gal-9 자극 1시간 전에 첨가하였다.

다음 시약은 각각 이하에 표시된 공급 업자로부터 구입하였다:

DEX(BioVision, CA, 미국), 항Fas 항체(클론 CH-11, MBL), TNFα(Genzyme, Cambridge, MA, 미국), C₂ 세라미드(SIGMA) 및 에토포시드(BioVision).

(d) T 세포 해석

24 웰 플레이트를 각 웰당 3 ㎍/㎖의 항CD3 항체(Immunotech, Marseille, 프랑스)의 TBS액(pH 8.0)으로 4℃에서 밤새 인큐베이션 처리한 후, 항CD3 항체액을 제외하고, 웰을 PBS로 세척하여 항CD3 항체로 코트된 웰 플레이트를 얻었다.

헤파린 가혈액으로부터 단핵 백혈구 세포 분획을 HISTOPAQUE(등록상표, SIG MA)를 단리하였다. 다음에, CD4 양성 단리 키트(CD4-positive isolation kit; DYNAL, 0slo, 노르웨이) 및 Dynabeads(등록상표) M-450 CD8(DYNAL, 0slo, 노르웨이)을 사용하여, 키트 제조업자가 기재하고 있는 바와 같이, CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포를 각각 단리하였다.

T 세포를 활성화하기 위해서는 CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 T 세포를 10% FCS 함유 RPMI-1640에 1×10⁶ 개/㎖로 한 세포를 20∼24시간 37℃에서 항CD3 항체로 코트된 플레이트 상에서 5% CO₂ 인큐베이터 중 인큐베이션 처리하고, 다음에 rGal-9〔(His)₆-Gal-9(S)〕와 함께 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이션 중 인큐베이션 처리를 하였다. 다음에, 상기 (c)와 마찬가지로 아포토시스·어세이를 행하였다. 즉, 세포를 37℃에서 50 ㎍/㎖의 PI(Sigma)와 함께 어두운 곳에서 10분간 인큐베이션 처리를 하였다. 염색 세포를 플로우 사이트메트리(Sandstrom, K. et al., J Immunol Methods, 240: 55(2000) 및 Zhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129(1999))에 의해 해석하였다.

비활성화(휴면) T 세포에 대해서도 rGal-9〔(His)₆-Gal-9(S)〕와 함께 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이션 중 인큐베이션 처리를 한 후, 상기와 같이 하여 아포토시스·어세이를 행하였다.

비교로서, 갈렉틴 1 및 갈렉틴 3으로 처리한 경우도 시험하였다.

(e) Ca²⁺ 유입

배양 배지(10% FCS, 10 mM HEPES 함유 RPMI-1640, pH 7.2) 중의 세포(대략 1O ⁶∼1O⁷ 개/㎖)를 세포내 칼슘 인티케이터인 fluo-3 AM(최종 농도 10 μM, DoJindo, Kumamoto, 일본)과 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션 처리를 하였다(Sharp, B. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8294(1996)). 다음에 세포를 세정한 후, 배양 배지에 재차 현탁하였다(최종 농도, 대략 2×1O⁵ 개/m·샘플). 플로우 사이토메터로 세포내 칼슘을 측정하였다. 휴지세포의 형광 강도를 측정한 후 1분 지나서 그 세포에 자극을 가하였다.

다음에, 별도의 자극을 가할 때까지 연속하여 기록하는 것을 재차 시작하였다. 락톨 저해 어세이에 대해서는 30 mM의 락토스 존재하에서 세포를 자극하였다. 대조군으로서는 30 mM의 수크로스를 사용하였다(Sano, H. et al., J. Immunol., 165: 2156(2000)). 양성 대조군으로서는 A23187(칼슘 이오노포어, 최종농도 5 ng/㎖, Wako, 0saka, 일본)을 사용하였다.

〔결과〕

(1) Gal-9에 의한 아포토시스의 유도

각종 세포주에 대한 Gal-9의 아포토시스 유도 활성을 조사하였다. 그 결과, rGal-9와 함께 인큐베이션 처리한 MOLT-4 세포는 PI에 의해 염색되었다. 이 염색된 세포를 아포토시스를 일으킨 세포로서 세었다. 도 1A에 도시하는 바와 같이 rGal-9(1 μM)는 MOLT-4 세포의 아포토시스를 유도한(대조군 PBS에서는 14.8%의 세포가 PI 염색된 세포로 아포토시스를 일으킨 세포인 것에 대하여, Gal-9로 처리된 군에서는 34.5%의 세포가 PI 염색된 세포로 아포토시스를 일으키고 있었다). 그러한 아포토시스의 유도를 Gal-9는 시간 의존적이면서 용량 의존적으로 행하고 있었다. PI법으로 검지되는 아포토시스는 rGal-9의 농도를 크게 하면 증가하고, 인큐베이션 시간을 길게 하여도 증가하였다(예컨대 0.3 μM의 rGal-9로 인큐베이션 시간 24시간 또는 1 μM의 rGal-9로 인큐베이션 시간 6시간).

아포토시스 사이에 포스파티딜세린이 발생하고, 그것은 염색법으로 검출할 수 있기 때문에, Annexin V 염색법을 사용하여 Gal-9의 프로 아포토시스 활성을 조사하였다. Annexin V법으로 검출되는 아포토시스를 발생시킨 세포는 대조군의 13.2%부터, 1 μM의 Gal-9에서는 69.1%로 증대하고 있었다(도 1B). 이것에 의해 Gal-9는 MOLT-4 세포에 대하여 프로 아포토시스 활성을 갖는 것이 확인되었다.

다음에, Gal-9의 아포토시스 유도 활성에 미치게 하는 락토스의 작용을 조사한 바, 도 2에 도시하는 바와 같이, Gal-9의 프로 아포토시스 활성은 30 mM의 락토스에 의해 거의 완전히 저해되었지만, 수크로스에서는 저해되지 않았다. 이것으로부터 Gal-9 유발 아포토시스에는 β-갈락토시드 결합 활성이 필요하다는 것이 시사되었다.

(2) Gal-9에 의한 여러 가지 세포의 아포토시스 발생

Gal-9의 프로 아포토시스 활성이 다른 세포주에 대해서도 보여지는지 여부를 조사하였다. 즉, 1 μM의 rGal-9의 존재하 혹은 비존재하에서 세포를 24시간 배양하여 아포토시스가 발생하는지 여부를 조사하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, 아포토시스는 Jurkat 세포 및 MOLT-4 세포 등의 T 세포뿐만 아니라, B 세포(BALL-1), 단핵구성 세포(THP-1) 및 골수성 세포(HL60)에 있어서도 Gal-9로 유도되었다. 또한, 도 3 중 검게 칠해진 막대는 Gal-9 존재하 처리군을 나타내고, 흰 막대는 대조군을 나타낸다. 또한, 그 Gal-9의 프로 아포토시스 활성은 락토스로 억제되었지만, 수크로스로서는 억제되지 않았다.

다음에, 인간의 말초혈 T 세포에 대한 Gal-9 유발 아포토시스를 조사하였다. T 세포를 CD4＋T 세포 및 CD8＋T 세포로 분리하고, 항CD3 항체의 존재하 및 비존재 하에 인큐베이션하였다. 다음에 비활성화(휴면) T 세포와 항 CD3 항체로 활성화된 T 세포를 1 μM의 rGal-9의 존재 하에 인큐베이션 처리하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

표 1 중, CD3(＋)은 항CD3 항체로 코트된 플레이트 상에서 처리되고, 활성화되어 있는 것을 나타내고, CD3(-)는 항CD3 항체로 코트된 플레이트에 의한 처리는 되어 있지 않기 때문에, 비활성화(휴면) 세포인 것을 나타낸다. 각 갈렉틴 아래의 (＋)는 그 존재하에서의 처리, (-)는 비존재하에서의 처리를, 그리고 CD4는 CD4양성 T 세포를, CD8은 CD8 양성 T 세포를 나타낸다.

도 4로부터, Gal-9는 휴면 CD4＋T 세포 및 휴면 CD8＋T 세포와 비교하여, CD3- 활성화 CD4＋T 세포 및 CD3- 활성화 CD8＋T 세포 양쪽보다 아포토시스시키는 것이 분명하였다. 또한, 도 4 중 검게 칠한 막대는 Gal-9 존재하 처리군을 나타내고, 흰 막대는 대조군을 나타낸다. 또한, CD8＋T 세포와 비교하여, CD4＋T 세포가 보다 Gal-9에 감수성이 동정되었다(도 4).

(3) 카스파제 저해

Gal-9 유발 아포토시스에 카스파제 활성화 경로가 관여되어 있는지 여부에 대해서 조사하였다. 우선, 처음에 판-카스파제 저해제인 Z-VAD-FMK와 함께 MOLT-4 세포를 인큐베이션처리하고, 계속해서 rGal-9와 같이 인큐베이션하였다. Gal-9 유발 아포토시스는 이 판-카스파제 저해제로 거의 완전히 억제되었다(도 5 및 6). 예컨대 덱사메타존(DEX), 항Fas 항체, TNF-α, C2 세라미드 등의 그 밖의 자극에 의해 유도되는 아포토시스도 상기 판-카스파제 저해제로 억제되는 것이 관찰되었다.

각종 카스파제에 대한 카스파제 저해제, 즉, 카스파제에 대한 Z-WAD-FMK, 카스파제-8에 대한 Z-IETD-FMK, 카스파제-9에 대한 Z-LEHD-FMK 및 카스파제-1O에 대한 Z-AEVD-FMK를 사용하여 실험을 행하였다.

그 결과를 도 5에 도시한다. 유일 Z-YVAD-FMK(카스파제-1 저해제)가 Gal-9 유발 아포토시스를 억제하였지만, 그 외의 저해제는 모두 Gal-9 유발 아포토시스를 억제하지 않았다. 동시에, 상기 카스파제-1 저해제는 DEX 유발 아포토시스를 억제하고, 카스파제-8 저해제 및 카스파제-10 저해제는 항Fas 항체 유발 아포토시스 및 TNF-α 유발 아포토시스를 억제하며, 카스파제-9 저해제는 C2 세라미드 유발 아포토시스를 억제하는 것을 발견하였다. 또한, 도 6에 도시되어 있는 바와 같이, 판-카스파제 저해제와 카스파제 저해제 양쪽이 Gal-9 유발 아포토시스를 용량 의존적으로 억제하였다. 이러한 억제 현상은 다른 세포주를 사용한 실험에서도 얻을 수 있다. 이러한 결과로부터, Gal-9는 카스파제-1을 통해 아포토시스를 유도하고 있는 것으로서, 다른 카스파제를 통한 경로에서 그것을 행하고 있지는 않을 것으로 생각된다.

(4) 칼슘-칼파인 경로

카스파제-1의 활성화에는 칼슘 의존성인 칼파인이 필요하기 때문에 MOLT-4 세포의 Gal-9 유발 아포토시스에 칼파인·카스파제-1 활성화계가 관여되어 있는 지 여부를 조사하였다. 도 7에 도시하는 바와 같이, 칼파인 저해제인 Z-LLY-FMK는 Gal-9 유발 아포토시스를 용량 의존적으로 저해하였다.

또한, MOLT-4 세포에 있어서 칼슘의 유입을 Gal-9가 발생시키는지 여부를 조사하기 위해 Fluo-3 분석을 행하였다. 도 8에 도시하는 바와 같이 Gal-9를 첨가하면 10∼20초로 MOLT-4 세포에 있어서 칼슘의 유입이 상승하였지만, 락토스에 의해 Gal-9 유발 칼슘의 유입은 억제되었다. 한편, 수크로스에서는 Gal-9 유발 칼슘의 유입은 억제되지 않았다. 대조군으로서 이용한 A23187(최종농도 5 ng/㎖)에서는 명백히MOLT-4 세포에 있어서 칼슘의 유입을 유도하였다(도 8).

또한, 그 밖의 세포에 있어서도 Gal-9 유발 아포토시스에 있어서 칼파인 및 칼슘의 유입이 관여되어 있는지 여부를 동정할 수 있다.

(5) DEX, 항Fas 항체 및 에토포시드에 의해 유발되는 아포토시스에 미치는 Gal-9의 효과

다른 자극(예컨대 DEX, 항Fas 항체, 에토포시드 등)에 의해 유도되는 아포토시스에 미치는 Gal-9의 작용 효과에 대해서 조사하였다.

rGal-9, DEX, 항Fas 항체, 그리고 에토포시드의 전부가 MOLT-4 세포의 아포토시스를 명백히 유도하였다(도 9).

MOLT-4 세포를 rGal-9 및 DEX와 함께 인큐베이션 처리한 경우, 아포토시스를 발생시킨 세포의 비율(%)에는 대략 약간의 차이가 있거나 혹은 차이가 없었다. 한편, rGal-9는 항Fas 항체 유발 아포토시스 및 에토포시드 유발 아포토시스에 부가적인 작용을 도시하였다(도 9). 이들의 결과는 Gal-9에 의한 아포토시스화 경로는 DEX 이외의 다른 자극에 의한 것과는 다르다는 것을 시사한 것이었다.

이리하여, Gal-9는 여러 가지 세포, 특히, 시험된 면역 세포의 전부에 있어서 아포토시스를 유도하는 것이 발견되었다(도 3 및 4). 이것은 Gal-9가 많은 타입의 세포에 대한 프로 아포토시스 활성을 갖는 인자로서 기능하고 있는 것을 도시하였다.

예컨대 글루코코르티코이드(GC), 항Fas 항체, 산화성 스트레스 등 그 밖의 자극에 관해서, 아포토시스화 경로를 각각 해석하였다. 예컨대 항Fas 항체는 Fas 리간드에 결합되어 카스파제-8 활성화를 통해 아포토시스를 유도하고, 에토포시드는 DNA을 장해하고, 미토콘드리아의 시토크롬 c를 유리시켜, 카스파제-9를 활성화하고, 최종적으로 아포토시스를 유도한다(Sun X . M. et al., J. Biol. Chem., 274: 5053(1999)). DEX는 칼슘 의존성 엔도뉴클레아제 및 카스파제-1을 활성화하여 세포사를 초래한다(Cheneval, D. et al., J. Biol. Chem., 273: 17846(1998); McConkey, D. J., J. Biol. Chem., 271: 22398(1996) 및 Cohen, J. J. et al., J Immunol., 132: 38(1984)). GC는 많은 타입의 세포에 있어서 아포토시스를 유도하고, 물론, T 세포에 있어서도 아포토시스를 유도한다(Dobashi H. et al., FASEB, 15: 1861(2001) 및 Nittoh, T. et al., Eur. J. Pharmaco1., 354: 73(1998)). 그 메카니즘은 해석되어 있으며, GC 및 카스파제-1이 흉선 세포에 있어서 칼슘 의존성 아포토시스를 유도하는 것이 표시되어 있다(McConkey, D. J., J. Biol. Chem., 271: 22398(1996) 및 Cohen, J. J. et al., J Immunol., 132: 38(1984)).

본 발명에 있어서, Gal-9가 아포토시스를 유도하는 것, 그것은 Ca²⁺ 유입(도 8), 칼파인 관여(도 7), 그리고 카스파제-1의 활성화(도 5 및 6)에 이어 발생하는 것을 발견하였지만, 이것은 Gal-9는 칼슘-칼파인-카스파제-1 경로를 사용하여, GC와 같이 아포토시스를 유도하고 있는 것을 나타내는 것이다.

칼슘은 칼슘-칼파인 경로와 미토콘드리아 경로와의 양방을 통해 U937 세포의 아포토시스를 유도하고 있는 것이 발견되어 있다(Li M. et al., J. Biol. Chem., 275: 39702(2000)). 또한, Gal-9는 또한 항Fas 항체 및 에토포시드에 의해 유도되는 아포토시스를 증가시킨다.

GC 유도에 의한 세포사 사이에는 Gal-1 유전자가 과잉 발현되어 있다(Goldstone S. D. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 178: 746(1991)). 덧붙여, Gal-1은 Jurkat 세포에 있어서의 Ca²⁺ 유입 및 아포토시스를 유도하고 있다 (Walzel, H. et al., Glycobiology, 10: 131(2000)). 이것은 칼슘-칼파인-카스파제-1 경로는 적어도 부분적으로는 Gal-1 중개 아포토시스에 관여하는 것을 시사하는 것이다. 사실, Gal-1 유도 아포토시스에는 세포내 칼슘의 상승은 필요하지 않다(Pace, K. E. et al., J Immunol., 165: 2331(2000)). 한편, Gal-7은 JNK 활성화 및 시토크롬 c의 유리의 상류 세포 내에서 기능하는 프로 아포토시스 활성을 갖는 갈렉틴이다(Kuwabara, I. et al., J. Biol. Chem., 277: 3487(2002) 및 Bernerd, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11329(1999)). 이것은 Gal-7의 프로 아포토시스 활성 경로는 Gal-1 및 Gal-9와는 다른 것을 시사하고 있는 것이다.

본 발명자들은 지금까지 Gal-9는 시험한 세포의 세포 표면에 결합하는 것을 발견하고 있다. GC는 세포질 내의 리셉터에 결합하면, 상기 리셉터는 결합 후 핵으로 이동해 간다(Galigniana, M. D. et al., J. Biol. Chem., 274: 16222(1999) 및 Guiochon-Mantel, A. et al., EMBO J., 10: 3851(1991)). 한편, Gal-9는 세포 표면의 결합 분자에 결합하고, 그 후, Ca²⁺ 유입, 칼파인·카스파제-1 활성화를 유도하여 세포를 아포토시스에 이르게 한다고 생각된다. Gal-9의 리셉터 및 그 존재 장소는 DEX와는 다르지만, Gal-9는 GC의 경우와 비슷한 아포토시스화 경로를 통해 아포토시스를 유도하고 있다고 생각된다. 사실, Gal-9는 항Fas 항체-중개의 아포토시스 및 에토포시드-중개의 아포토시스의 양쪽에 부가하는 작용을 나타내지만, DEX-중개의 아포토시스에 아무런 부가하는 작용도 갖지 않거나 혹은 그저 얼마 안 되는 부가하는 작용을 가질 뿐이다(도 9). 또한, 본 발명자들은 Gal-9가 항Fas 항체에 의한 아포토시스를 강화하지만, Gal-9는 DEX-유발 호산구 아포토시스를 억제하는 것을 발견하고 있다.

DEX는 래트에 있어서 CD4＋T 세포 및 CD8＋T 세포의 양쪽에서 아포토시스를 유도하는 것(Tsuchiyama, Y. et al., kidney Int., 58: 1941(2000)) 및 인간 T 세포로 아포토시스를 유도하는 것(Dobashi H. et al., FASEB, 15: 1861(2001))이 발견되어 있다. 또한, Gal-9는 신장염 래트에 있어서 활성화된 비장의 CD8＋T 세포에 있어서 선택적인 아포토시스를 유도한다(Tsuchiyama, Y. et al., Kidney Int., 58: 1941(2000)).

본 발명에 있어서, Gal-9는 인간 말초혈 유래 세포 중에서는 활성화된 CD8＋ T 세포(서프레서-T 세포 및 세포 상해성 T 세포)보다도 활성화된 CD4＋T 세포(헬퍼 T 세포)에 있어서 보다 아포토시스를 유도하는 것(도 4)이 발견되었다. 이 것은 Gal-9가 면역 억제성 인자(immunosuppressive factor)로서 작동하고 있을 가능성을 나타내는 것이다. 그러므로, Gal-9는 호산구 활성화의 활성과 함께 CD4＋T 세포 등의 여러 가지 면역 세포의 아포토시스를 유도함으로써, 면역의 제어 조정에 중요한 기능을 하고 있는 것으로 생각된다.

실시예 2

(1) 갈렉틴 9에 의한 세포 상해 활성

Jurkat T 세포주, K-562 백혈병 세포, 정상 림프구에 대하여, PI를 이용한 플로우 사이토메트리 해석법으로 세포 상해성을 측정하였다. 즉, 표적 세포와 1 mM의 갈렉틴 9를 16시간 인큐베이션 처리한 후, 최후의 15분간 PI를 가하면 상해를 입은 표적 세포에서는 PI가 세포내에 진입한다. 이 PI에서 발생하는 형광을 FACS에서 측정한다. 음성 대조군으로서 아무것도 가하지 않는 세포를 100% 사세포로서는 포르말린으로 고정한 세포를 이용하여, 양성 대조군으로서 H₂O₂(과산화수소수)를 이용하였다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 갈렉틴 9는 Jurkat 세포주, K-562 세포에 대하여 명백한 세포 상해 활성을 나타내지만, 정상 림프구에는 상해 활성은 나타내지 않았다.

(2) 갈렉틴 9에 의한 암세포 아포토시스

PI법으로 아포토시스의 측정을 행하였다. 갈렉틴 9와 함께 배양된 세포를 세정 후, 알콜로 고정하면, 단편화된 DNA가 세포 밖으로 유출된다. 그 후 PI와 함께 인큐베이션 처리를 하면 아포토시스 세포는 형광 강도가 낮아진다. 그 세포의 비율로 아포토시스를 검토하였다. 도 10에 도시하는 바와 같이, 72시간 갈렉틴 9와 함께 배양된 악성 흑색종 세포 MM-RU에 의해 아포토시스가 강하게 유도되고 있기 때문에, 갈렉틴 9는 암세포 아포토시스를 유도하는 것이 표시되었다. 이 유도는 양성 대조군으로서 사용한 H₂O₂(과산화수소수)와 동등하였다. 또한, 다른 아포토시스 측정법인 TUNEL법에서도 동일한 결과가 얻어졌다. 다음에, 다른 악성 종양 세포에도 갈렉틴 9에 의한 아포토시스 유도가 보여지는지 여부의 검토를 행한 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3 중 Jurkat 및 MOLT-4는 T 세포 유래 악성 세포, BALL-1은 B 세포 유래 악성 세포, THP-1은 acute monocytic leukemia 유래 세포, HL60은 acute promyelotic leukemia 유래 세포, MM-RU는 악성 흑색종 세포, MCF-7은 유방암 세포, KATO-III는 위암 세포이다. 갈렉틴 9 존재하에서의 인큐베이션 처리는 적어도 48시간 이상 행하였다. 표 3으로부터 갈렉틴 9에 의한 아포토시스 유도는 비상피성 악성 세포, 상피성 악성 세포 중 어디에서도 보여지는 것을 알 수 있다. Daudi 세포(B 세포) 및 HMC-1(마스트 세포)에서는 전혀 아포토시스의 유도를 볼 수 없다. 이러하기 때문에, 세포 표면에는 아포토시스의 시그널과 관계가 있는 결합 인자이며, 또한 갈렉틴 9 결합 인자와 관계가 없지만 존재하고 있다는 것을 나타내고 있다. 이것을 이용하여, 아포토시스 관련 갈렉틴 9 결합 분자의 동정 및 그것을 이용한 종양 증식 억제 기술의 개발이 가능하다.

갈렉틴 9는 상피성 악성 종양(암)과 비상피성 악성 종양(육종 및 백혈병 등) 전부에 있어서 항 종양 활성을 나타낸다. 한편, 활성화되어 있지 않는 정상 T 세포에는 아포토시스 유도 활성을 거의 나타내지 않는다. 예컨대 1 μM의 갈렉틴 9의 존재하에서 아포토시스 유도 활성을 측정한 결과는 다음 표 4에 나타낸 바와 같다. (표 4 중 갈렉틴 3도 1 μM).

이러한 것으로부터, 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 아고니스트, 갈렉틴 9 안타고니스트 길항 물질, 항갈렉틴 9 결합 단백질 항체, 항갈렉틴 9 결합 당쇄 항체, 갈렉틴 9 산생 ·유리 유도 물질 등을, 정상 세포에는 작용하지 않는 종양 세표에 상해 활성을 나타내고, 아포토시스를 유도하는 항종양제(항암제)로서 사용할 수 있다.

실시예 3

(1) 갈렉틴 9에 의한 암 전이 억제 활성

인간 흑색종 세포주 중 MM-BP와 MM-RU에서는 그 세포주를 배양하면, 전자는 응집되고, 포소 형성성에 증식을 나타내지만, 후자는 프리 형태로 증식한다. 인간 흑색종 세포주의 MM-BP와 MM-RU로부터 메신저 RNA를 채취하여 RT-PCR법으로 갈렉틴의 DNA 양을 해석한 결과, MM-BP와 MM-RU에서는 갈렉틴 1 및 갈렉틴 3의 양은 차이가 없지만, 갈렉틴 9에서는 포소 형성성의 MM-BP에만 명백히 보였지만, 프리 형태로 증식하는 MM-RU에서는 매우 약하였다(도 11).

유방암 세포주 MCF-7은 포소 형성성 세포이지만, 한계 희석법으로써 서브 클론을 제작하여, 명백한 포소 형성성을 나타내지 않는 MCF-7K-10 주를 수립하였다(도 12). MCF-7은 웨스턴 블로팅법으로 갈렉틴 9를 갖고 있었지만, MCF-7K-10 주에서는 갈렉틴 9가 검출되지 않았다(도 13). 또한, 면역 염색법으로 MCF-7의 갈렉틴 9는 주로 세포질로 보였다.

RT-PCR은 T. Kageshita et al., Int. J. Cancer, 99: 809-816(2002)에 기재한 방법에 따라서 행해졌다.

MCF-7의 세포 배양은 글루타메이트, 10% 태아 소 혈청(fetal bovine serum) 및 페니실린과 스트렙토마이신(ICN biomedicals, Aurora, OH, 미국)을 첨가한 Dulbecco 수식 Eagle's 배지 속에서 행하고, 인큐베이터는 5% CO₂/37℃인 것을 사용하였다.

웨스턴 블로팅 해석은 다음과 같이 하여 행하였다. 대략 1O⁶ 개의 세포를 취득하고, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5% Nonidet P-40(Boehringer-Mannheim, GmbH, 독일), 1 mM PMSF(ICN biomedicals), 50 TIU aprotinin(Wako, 오사카, 일본) 및 50 mg/㎖ Leupeptin(Calbiochem, San Diego, CA, 미국)을 함유하고 있는 리스버퍼로 저리하여 세포막을 파괴하였다. 얻어진 상청액을 2x sample 버퍼(125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 0.02% Bromophenol Blue)와 함께 5분간 끓임 처리하고, 5-15% 그래디언트의 겔에 의해 미니 겔 장치(Bio-Rad, Rickmond, CA, 미국)에서의 SDS/PAGE에 의해 분리 처리에 부쳤다. 분리된 단백은 PVDF 막(Millipore, Bedford, MA, 미국)에 전사하고, 0.05% Tween 20(Sigma, St. Louis, M0, 미국) 함유의 5% 스킴 밀크액으로 1시간 블로킹 처리한 후, 2 μg/㎖의 항갈렉틴 9 항체(α-galectin-9 CT) 액(5 ㎖)과 함께 인큐베이션 처리하였다. 다음에 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 컨쥬게이트화 된 염소의 항 토끼 IgG 항체(Amarsham, Buckinghamshire, UK)로 처리하여 ECL 시스템(Amarsham)에 의해 밴드를 가시화 하였다.

면역 염색은 다음과 같이 하여 행하였다. 포르말린 고정 파라핀 포리 조직 절편을 항갈렉틴-9 플리클로날 항체(α-galectin-9 CT)로 면역 조직 화학 염색하는데에는 DAKO EnVision ＋^TM, Peroxidase, Rabbit System을 사용하고, 키트 제조업자의 지시서에 따라 조작하였다. 4 μm의 포르말린 고정 파라핀 포리 조직 절편을 탈 파라핀화 및 재하이드레이션화 전에 16분간 항원 재생용 시트르산염 버퍼(10 mm)속에서 끓임 처리하였다. 0.3% 퍼옥사이드로 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 소실시키면서, 상기 절편을 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 처리하여 실온에서 2시간 비특이적인 염색을 블록하였다. 상기 조직 절편을 제1 항체와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션 처리하고, 다음에 실온에서 1시간 항 토끼 IgG 및 서양 고추냉이 퍼옥시다제(양쪽과 함께 폴리머에 결합시켜 둔다)를 함유하는 EnVision＋^TM 액와 함께 인큐베이션 처리하였다. 3,3'-디아미노벤지딘·테트라히드로클로라이드를 발색제로서 사용하였다. 음성 대조군으로서는 면역 전 토끼로부터 얻어진 혈청에서의 면역 글로불린 분획(DAKO)을 사용하였다. 모든 세그먼트는 Giemsa 액으로 대비염색을 행하고, 각 절편에 관한 두명의 관찰자가 따로 따로 염색된 종양 세포의 비율을 구하여 50%보다도 큰 값을 양성 염색으로 하였다.

(2) 갈렉틴 9에 의한 세포 응집 유도

대장균에 유전자 도입하여 제작된 재조합 갈렉틴 9를 외부에서 MM-RU에 첨가하여 갈렉틴 9의 작용 효과에 대해서 검토를 행한 결과, 갈렉틴 9에서는 0.1 μM의 농도로부터 MM-RU의 응집을 유도하였다. 또한, 그 정도는 농도 의존적이며, 0.3∼1.0 μM에서 현저히 명백하였다. 또한, 응집은 갈렉틴 9 첨가 후 2시간만에 보였으며, 12시간 후에 강한 응집이 보였다(도 14). 대조로서 이용한 갈렉틴 1 및 갈렉틴 3에서는 적어도 1 μM의 농도에서는 명백한 응집은 유도하지 않았다.

유방암 세포주로부터 수립된 MCF-7 K-10 주에 갈렉틴 9 유전자를 도입하면, 그 세포는 세포질에 갈렉틴 9를 보유함과 동시에, 배양할 때에 명백한 포소 형성성을 나타내면서 증식하였다(도 15).

인간 갈렉틴 9의 3가지 서브 타입, 즉 갈렉틴-9S, 갈렉틴-9M 및, 갈렉틴-9L의 발현 벡터의 구축은 각 갈렉틴 코드 영역 전부를 가지며, 또한, 개시 코돈의 상류에 7개의 뉴클레오티드를 부가해 둔 cDNA를 pBK-CMV(Stratagene)의 EcoRI-XhoI 사이트에 삽입하여 행하였다. 세포에의 갈렉틴 9 유전자의 도입은 Fugene 6 형질감염 시약(Roche Molecular Medicals)을 사용하여, 시약 제조업자의 프로토콜에 따라 그것을 행하였다. MCF-7K-10 주세포는 pBK-CMV 플라스미드 단독으로 형질감염된 것에 관하여 시험되었다. 세포는 2주간 800 ㎍/㎖의 G418로 선택 처리되었다.

이리하여, 갈렉틴 9는 전이성 악성 세포에 대하여 응집 유도적으로 작용하고, 암 등의 악성 종양의 전이 억제 활성을 갖는 것이 명백하며, 암 전이 억제제로서 유용하다. 이러한 사실로부터, 갈렉틴 9 단백질 혹은 그 유도체, 또는 갈렉틴 9 유전자 도입 및 갈렉틴 9의 산생·유리를 유도함으로써, 암 전이 억제 작용을 얻는 것, 나아가서는 암 전이 억제제를 제공할 수 있다.

인간 갈렉틴 9는 종양 세포에 대하여 세포 장해 활성을 나타내는 한편, 정상세포에 대해서는 세포 장해 활성을 나타내지 않는 것이 주목된다. 또한, 인간 갈렉틴 9는 종양 세포에 대하여 아포토시스를 유도하지만, 정상 세포에 대해서는 아포토시스를 유도하지 않는다. 그리고, 또한, 인간 갈렉틴 9는 비활성화 T 세포의 아포토시스를 유도하지 않는데 대하여, 활성화한 T 세포의 아포토시스를 유도한다. 이것에 의해 인간 갈렉틴 9는 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및/또는 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 제제로서 유용한 것이 분명하다. 본 발명에서는 DEX, 항Fas 항체 및 에토포시드에 의해 유발되는 아포토시스에 미치게 하는 인간 갈렉틴 9의 작용·효과가 동정되며 이것에 의해 인간 갈렉틴 9가 상기 용도에 매우 유용한 것이 동정되고 있다.

실시예 4

M0LT-4(인간 T 세포)(대략 7.25×10⁹ 개의 세포, 습중량 약 18 g)를 동결 융해를 반복하여 세포 파쇄 처리를 행하였다. 얻어진 세포 파쇄 처리물을 세척 처리(200 mM 락토스(lac) 함유액)하고, 균질 처리하여 세포 파쇄액을 균일화하였다. 원심 처리하여 침전물(펠릿)을 회수하였다. 계면활성제를 사용하여 침전물의 가용화를 행하였다. 대표적으로는 계면활성제로서, Triton(상품명)을 사용하여 침전물의 가용화를 행하였다. 원심 처리 후 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 다음에 GST-컬럼(비특이적 흡착 컬럼)에 취하였다. 컬럼을 통과하는 분획을 모았다. 다음에 GST-컬럼 통과액을 GST-gal9CT 컬럼에 첨가하여 갈렉틴 9 특이적 흡착을 하였다. 컬럼을 세척한 후, 200 mM 락토스(lac) 함유액을 컬럼에 떨어뜨려 갈렉틴 9 CT(galecting 9CT)와 세포 함유 단백과의 결합을 떼었다. gal9CT 컬럼에 흡착한 세포(MOLT-4) 유래 단백의 SDS-PAGE의 결과를 도 16에 도시한다.

도 16에 도시한 각 분획 1∼12 및 A, B, C, D에 대해서 그것에 함유된 단백질을 해석하였다. 해석은 가부시키가이샤 어프로사이언스(APRO Life Science Institute, 도쿠시마켄 나루토시 세토쵸)에 위탁하여 행하였다. 밴드 A, B, C, D에 대해서는 단백질 내부 서열 해석을 행하고, 밴드 1∼12에 대해서는 질량 분석(LC-MS/MS)을 행하여 후보를 동정하였다. 우선, 단백질 내부 서열 해석에 있어서는 상기 SDS-PAGE로 분리된 밴드로부터 얻어진 시료를 프로테아제에 의한 한정 분해(예컨대 겔 내 소화)하여 얻어진 프로테아제 한정 분해 시료가 ＞ 1 pmol의 경우는 역상 HPLC에 의한 펩티드의 분리 처리(펩티드맵 작성)를 한 후, 시퀀싱 장치를 사용하여 아미노산 서열 분석을 행하여 얻어진 프로테아제 한정 분해 시료가 〉0.1 pmol의 경우는 질량 분석 장치(LC-MS/MS)로 해석하여 데이터 베이스 서치를 행하였다. Mascot search에 의한 해당하는 단백의 스코어화를 행하여, 스코어가 높은 것(임계치 이상의 것)을 후보로서 픽업하였다. Mascot search에 대해서는 Matrix Science Ltd.로부터 자세한 정보를 입수할 수 있다 (http://www.matrixscience.com/). Mascot는 Mowse 알고리즘(D. J. C. Pappin, et al., Curr. Biol., 3, 327-332(1993))이 베이스로 제품화된 것이다.

아미노산 서열 분석 장치로서는 Procise 494HT(Applied Biosystems), Hewlett-Packard G1005A, 시마쯔 PSQ-1(그래디언트 시스템), Procise 494 cLC(Applied Biosystems) 등을 사용할 수 있다. 데이터 베이스는 NCBInr(Protein), dbEST(DNA) 등을 사용할 수 있다. LC-MS/MS 장치로서는 Q-TOF2 & 캐필러리 HPLC 등을 들 수 있다. 경우에 따라서는, MALDI-TOF MS 분석을 행할 수도 있으며 MS-Fit 서치를 이용할 수도 있다. MALDI-TOF MS 분석은 Voyager-DE STR 등을 이용할 수 있다.

<결과>

질량 분석(LC-MS/MS)에 대해서는 모든 프리커서 이온에 대해서 얻어진 프로덕트 이온의 수치를 Mascot에 의해 모든 생물종(all entries)을 대상으로 데이터 베이스(NCBInr) 검색하였다. NCBInr 데이터 베이스로서 소화 효소 및 인간 케라틴 이외에 유의 스코어로 히트하지 않은 경우는 dbEST 데이터 베이스(인간, 마우스, 기타의 것을 대상)로써 검색을 행하였다.

유의 스코어로 히트한 단백질에 대해서, Mascot Search Results의 히트 번호에 기초하여 이하에 나타낸다. 동일한 히트 번호로 복수개의 단백질이 히트되어 있는 경우, 대표적인 단백질(주로 샘플과 동일한 생물종을 선택)을 기재하고 있다. 또한, 사용한 소화 효소 및 인간 케라틴(조작상의 컨터미네이션 유래)이 히트된 경우는 데이터로부터 제외하였다.

또한, NCBI의 홈 페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로써 "gi｜" 다음의 숫자를 입력함으로써, 단백질 정보 및 코드 유전자 정보를 얻을 수 있다.

밴드 1

〔NCBInr(전체 엔트리)〕점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 4F2 중쇄 항원

공급원 : 인간

총 합계 : 153

정합 펩티드 : 5

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜177216

서열 적용범위(coverage) : 12%

(2) 단백질 명: ATPase, Na⁺/K⁺ 수송, 알파 1 폴리펩티드

공급원 : 인간

총 합계 : 150

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호: gi｜21361181

서열 적용범위 : 5%

(3) 단백질 명: 나트륨-의존성 중성 아미노산 수송자 타입 2 절두형 동형체

공급원 : 인간

총 합계 : 134

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜15004317

서열 적용범위 : 8%

(5) 단백질 명: 간질 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 a

공급원 : 인간

총 합계 : 57

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜9257240

서열 적용범위 : 3%

(6) 단백질 명: 열 충격 90 kDa 단백질 1, 베타

공급원 : 인간

총 합계 : 46

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜20149594

서열 적용범위 : 3%

밴드 2

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 열 충격 90kDa 단백질 5(글루코스-조절된 단백질, 78kDa)

공급원 : 인간

총 합계 : 227

정합 펩티드 : 8

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜16507237

서열 적용범위 : 21%

(3) 단백질 명: 열 충격 70kDa 단백질 8 동형체 2

공급원 : 인간

총 합계 : 192

정합 펩티드 : 5

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜24234686

서열 적용범위 : 20%

(4) 단백질 명: 열 충격 70kDa 단백질 9B 전구체

공급원 : 인간

총 합계 : 182

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜24234688

서열 적용범위 : 6%

(16) 단백질 명: 지방산-조효소 A 리가제, 장쇄 3

공급원 : 인간

총 합계 : 64

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜27469830

서열 적용범위 : 6%

(21) 단백질 명: NADH 탈수소효소(유비퀴논) Fe-S 단백질 1,75 kDa(NADH-조효소 Q 리덕타제)

공급원 : 인간

총 합계 : 55

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4826856

서열 적용범위 : 3%

밴드 3

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(4) 단백질 명: S-아데노실호모시스테인 히드롤라제-유사 1

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 100

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜21361647

서열 적용범위 : 11%

(5) 단백질 명: 카페로닌(chaperonin) GroEL

공급원(유기체) : 에스케리치아 콜리 O157

총 합계 : 91

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜15834378

서열 적용범위 : 11%

(6) 단백질 명: 계획된 세포사 8 동형체 1

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 78

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4757732

서열 적용범위 : 5%

(8) 단백질 명: 60 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아 전구체

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 66

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜129379

서열 적용범위 : 3%

(9) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛, 동형체 1, 심근

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 61

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4757810

서열 적용범위 : 2%

(10) 단백질 명: 리보포린 II 전구체

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 55

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜88567

서열 적용범위 : 10%

밴드 5

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1

공급원 : 인간

총 합계 : 345

정합 펩티드 : 6

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4758350

서열 적용범위 : 18%

(2) 단백질 명: 유비퀴놀-시토크름 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 2, 미토콘드리아 전구체

공급원 : 인간

총 합계 : 222

정합 펩티드 : 6

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜21903482

서열 적용범위 : 17%

(3) 단백질 명: 돌리킬-디포스포올리고사카라이드-단백질 글리코실트랜스퍼라제

공급원 : 인간

총 합계 : 158

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜21104416

서열 적용범위 : 19%

(4) 단백질 명 : 칼슘-결합 수송자

공급원 : 인간

총 합계 : 83

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜6841066

서열 적용범위 : 6%

(5) 단백질 명: NADH 탈수소효소-유비퀴논 Fe-S 단백질 2 전구체

공급원 : 인간

총 합계 : 71

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜3540239

서열 적용범위 : 8%

(6) 단백질 명: 액틴, 베타

공급원 : 인간

총 합계 : 57

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜14250401

서열 적용범위 : 18%

(10) 단백질 명: 번역 신장 인자 EF-Tu-유사 단백질 P43 전구체, 미토콘드리아

공급원 : 인간

총 합계 : 47

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜7443384

서열 적용범위 : 3%

밴드 6

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 액틴, 베타

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 306

정합 펩티드 : 12

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜14250401

서열 적용범위 : 45%

(4) 단백질 명: 갈렉틴 9, 쇼트 동형체

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 245

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4504982

서열 적용범위 : 15%

(16) 단백질 명: GSTmFra2/2-327

공급원(유기체) : 발현 벡터 pGH/F2.2-327

총 합계 : 139

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜3002516

서열 적용범위 : 13%

(24) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛, 동형체 1, 심근

공급원(유기체) : 인간

총 합계 : 103

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4757810

서열 적용범위 : 2%

밴드 7

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 메탁신 1

공급원 : 인간

총 합계 : 63

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4505281

서열 적용범위 : 4%

(2) 단백질 명: 시데로플렉신 1

공급원 : 인간

총 합계 : 62

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜23618867

서열 적용범위 : 9%

(3) 단백질 명: TCR 베타쇄

공급원 : 인간

총 합계 : 60

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜2982508

서열 적용범위 : 5%

(4) 단백질 명: HnrnpAl

공급원 : 인간

총 합계 : 55

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜2194069

서열 적용범위 : 8%

밴드 8

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 포스페이트 캐리어 전구체 동형체 1b

공급원 : 인간

총 합계 : 222

정합 펩티드 : 8

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4505775

서열 적용범위 : 31%

(2) 단백질 명: 시데로플렉신 1

공급원 : 인간

총 합계 : 204

정합 펩티드 : 5

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜23618867

서열 적용범위 : 24%

(3) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 감마 폴리펩티드 1

공급원 : 인간

총 합계 : 112

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4885079

서열 적용범위 : 8%

(4) 단백질 명: 전압 의존성 음이옴 채널 1

공급원 : 인간

총 합계 : 65

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4507879

서열 적용범위 : 10%

(5) 단백질 명: 히알루로난-결합 단백질 전구체

공급원 : 인간

총 합계 : 62

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜8699626

서열 적용범위 : 19%

(6) 단백질 명: 안드로겐 조절된 단쇄 탈수소효소/리덕타제 1

공급원 : 인간

총 합계 : 58

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜20070798

서열 적용범위 : 4%

(7) 단백질 명: 용질 캐리어 패밀리 25(미토콘드리아 캐리어; 옥소글루타레이트 담체), 구성원 11

공급원 : 인간

총 합계 : 55

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜21361114

서열 적용범위 : 11%

(8) 단백질 명: 3-히드록시부티레이트 탈수소효소 전구체

공급원 : 인간

총 합계 : 52

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜17738292

서열 적용범위 : 4%

(9) 단백질 명: B-세포 수용체 회합 단백질

공급원 : 인간

총 합계 : 49

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜1673514

서열 적용범위 : 8%

밴드 9

〔NCBInr(모든 엔트리)〕 점수 47을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 0 서브유닛

공급원 : 인간

총 합계 : 255

정합 펩티드 : 7

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4502303

서열 적용범위 : 39%

(2) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F0 복합체, 0 서브유닛 d

공급원 : 인간

총 합계 : 217

정합 펩티드 : 8

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜5453559

서열 적용범위 : 55%

(3) 단백질 명: ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F0 복합체, 서브유닛 b, 동형체 1

공급원 : 인간

총 합계 : 139

정합 펩티드 : 4

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜21361565

서열 적용범위 : 24%

(4) 단백질 명: 작은 GTP-결합 단백질

공급원 : 인간

총 합계 : 111

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜13569962

서열 적용범위 : 15%

(6) 단백질 명: NADH 탈수소효소(유비퀴논) Fe-S 단백질 8, 23 kDa(NADH-조효소 Q 리덕타제)

공급원 : 인간

총 합계 : 79

정합 펩티드 : 2

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4505371

서열 적용범위 : 28%

(7) 단백질 명: 소낭 수송 단백질 sec22b

공급원 : 인간

총 합계 : 76

정합 펩티드 : 1

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜4759086

서열 적용범위 : 6%

밴드 11

〔NCBInr(모든 엔트리)〕점수 46을 넘는 것은 유의

(1) 단백질 명: 미토콘드리아 유입 수용체 Tom 22

공급원 : 인간

총 합계 : 223

정합 펩티드 : 7

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜9910382

서열 적용범위 : 51%

(2) 단백질 명: 신호 서열 수용체, 델타

공급원 : 인간

총 합계 : 159

정합 펩티드 : 3

데이터 베이스 상의 동정 번호 : gi｜5454090

서열 적용범위 : 19%

내부 서열 해석 결과

밴드

A＋B 단백질 명 ATP 신타제, 알파쇄

정합 펩티드 5

첨부 데이터 gi｜114517 또는 P25705

서열 적용범위 10.13%

C 단백질 명 ATP 신타제, 베타쇄

정합 펩티드 4

첨부 데이터 gi｜114549 또는 P06576

서열 적용범위 8.13%

단백질 명 나트륨/칼륨-수송 ATPase 베타-3 쇄

정합 펩티드 1

첨부 데이터 gi｜703470 또는 P54709

서열 적용범위 3.23%

D 단백질 명 ADP, ATP 캐리어 단백질

정합 펩티드 4

첨부 데이터 gi｜113463 또는 P12236

gi｜113459 또는 P05141

gi｜113455 또는 P12235

서열 적용범위 14.43%

4 단백질 명 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 1

정합 펩티드 1

첨부 데이터 gi｜731047 또는 P31930

서열 적용범위 2.29%

10 단백질 명 시토크롬 c 옥시다제 폴리펩티드 II

정합 펩티드 1

첨부 데이터 gi｜117020 또는 P00403

서열 적용범위 2.64%

상기에서 동정된 후보 갈렉틴 9 결합 분자는 또한, 이하와 같이 갈렉틴 9와의 상호 작용에 관해 해석하여, 가장 갈렉틴 9 결합 분자로서 적절한 것을 동정할 수 있으며, 또한, 그 기능에 대해서도 해석하여 분명히 할 수 있다.

(1) 면역 침강법

갈렉틴 9를 첨가하여 세포와 반응시킨 후, 세포를 용해 처리하여 세포 추출액을 조제한다. 세포내에 갈렉틴 9와 결합하는 물질이 존재하면, 갈렉틴 9와 결합한 상태로 세포 추출액 중에 존재하는 것이 된다. 얻어진 세포 추출액에 겔 등을 붙인 항갈렉틴 9 항체를 반응시켜, 항갈렉틴 9 항체를 결합시킨다. 혹은 항갈렉틴 9 항체에 프로팅 A 등을 결합시켜 두어, 원심 분리 처리하여 항체와 함께 갈렉틴 9를 침강시킨다. 이 때, 갈렉틴 9에 결합하는 단백질이 존재하면, 항체와 함께 침강되기 때문에 동정할 수 있다. 침강물은 적절한 세척 처리되거나 경우에 따라 변성되어, 예컨대 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해, 필요에 따라서 막에 전사하는 등 한 후, 웨스턴 블로팅에 의해 검지할 수 있다.

(2) 웨스트 웨스턴법 또는 퍼웨스턴법(리간드 블로팅법을 포함)

1. 세포 단백질 추출액을 전기 영동하여 막(PVDF 등)에 트랜스퍼한다.

2. 갈렉틴 9를 표지하여, 막상의 단백질과 특이적으로 결합시킨다.

3. 표지를 검출함으로써 갈렉틴 9의 결합하는 단백질의 분포를 알 수 있으며(임의의 조직에 연유되는 세포를 이용함으로써, 어떤 조직에 결합 단백질이 존재하는지 여부를 알 수 있음), 국재(세포질, 세포 막 등의 분획을 이용함), 분자량을 알 수 있다.

또한, 갈렉틴 9의 표지에는, 공지된 수법이 제한 없이 사용할 수 있지만, 예컨대 이하의 방법이 있다.

A. ¹²⁵I 및 ³H 등의 RI로 검출한다.

B. 비오틴으로 표지하고, 스트렙타비딘 결합 항체로 검출한다.

C. 형광 물질로 표지하고, 그 여기광 또는 발색광을 검출한다.

D. 갈렉틴 9를 인산화 표지하고, 항인산화 항체로 검출한다.

E. 갈렉틴 9에 Tag(Flag, His, GST 등)을 융합시켜, Tag에 대한 항체로 검출한다.

(3) 분자간 가교법

1. 갈렉틴 9를 배양 세포에 첨가한 후, 화학 가교제를 첨가하여 갈렉틴 9와 표지 단백질과의 결합을 보강한다.

2. 세포를 용해하여, 얻어진 단백질 추출액보다 SDS-PAGE에 의해 갈렉틴 9 결합 단백질을 분리한다.

3. 표적 단백질의 검출은 항갈렉틴 9 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 및 면역 침강법 등으로 행한다.

(4) 발현 클로닝법

1. 대장균에서의 발현 클로닝법

a. 대장균을 이용하여 후보가 되는 단백질을 발현시킨다.

b. 후보 단백질을 발현하는 대장균 재조합체를 용해하여, 단백질 추출액을 조제한다.

c. 대장균의 세포 추출액을 전기 영동하여, 웨스트 웨스턴법 또는 항갈렉틴 9 항체에 의해 검출한다. 검출을 위한 표지 방법은 상기 웨스트 웨스턴법와 동일한 것을 사용할 수 있다.

2. 대장균과 파지를 이용한 발현 클로닝법

a. 대장균에 임의의 단백질을 발현하는 파지(파지 라이브러리)를 감염시킨다.

b. 파지 재조합체를 니트로셀룰로오스 막에 옮겨 단백질을 발현시킨다.

c. 표지한 갈렉틴 9를 니트로셀룰로오스 막 상에 첨가하여, 결합하는 단백질을 발현된 파지 재조합체를 동정한다.

d 파지 재조합체로부터 갈렉틴 9와 결합하는 단백질의 cDNA를 알 수 있다.

3. 배양 세포에서의 발현 클로닝법

a 배양 세포에 후보가 되는 단백질 cDNA를 도입하고, 후보 단백질을 발현시킨다.

b. 갈렉틴 9를 배양 세포에 첨가하여 배양 후, 비특이적으로 결합하는 갈렉틴 9를 제외하기 위해 세포를 세정한다.

c. 형광 물질 또는 발색제로 표지한 갈렉틴 9를 반응시키고, 갈렉틴 9가 발현시킨 단백질과 결합하고 있는지를 ELISA, 또는 FACS(형광 및 발광 물질을 판독하는 방법 및 기계·장치)로 검출한다.

(5) Two-Hybrid system

본 시스템은 리포터 유전자의 전사 활성을 지표에 2개의 단백질간의 상호 작용을 효모 내에서 검출하는 것이다. 본 법의 특징은 효모 생체 내(in vivo)로 단백질간의 상호 작용의 검출을 행할 수 있고, 약한 일시적인 상호 작용도 검출할 수 있는 고감도 분석을 행할 수 있는 점이다. 또한, 상호 작용을 검출하는 단계에서는 단백질의 정제 및 항체를 필요로 하지 않는다는 이점이 있다.

조작 순서로서는,

1. 갈렉틴 9 유전자(bait)를 DNA 결합 단백질(DNA-BD)과 융합한 것으로, 그 유전자와 상호 작용한다고 생각되는 후보 단백질을 코딩하는 유전자(prey)를 전사활성화 유전자(DNA-AD)와 융합시켰지만 쌍방을 효모 내에서 발현시킨다.

2. 전사 활성을 검출하는 리포터 유전자는 효모의 염색체 중에 내장되어 있으며, 여러 가지 것이 개발되어 이용되어 있지만, 그러한 것은 제한 없이 그것을 이용할 수 있다. 상기 리포터 유전자는 통상 영양성 기능 유전자 및 1acZ 유전자을 이용할 수 있다.

3. 효모 세포 내에서 갈렉틴 9(bait)와 후보 단백질(prey)이 상호 작용을 한 경우만, 융합시킨 전사 활성화 유전자가 기능하고, 리포터 유전자 상류의 전사가 활성화되어 표적 유전자를 발현시킨다.

4. 실제로는 배지 플레이트 상에서의 영양 요구성의 회복 및 β 갈락토시다아제 활성의 측정에 따라 상호 작용을 검출한다. 즉, 상호 작용한 경우에 효모 세포가 증식하고, 그것 이외에서는 효모가 증가하지 않는 배지 조건으로 하거나 β 갈락토시다아제에 의해 발색함으로써 검출한다.

또한, 2개의 단백질간의 상호 작용을, 효모 내에서 검출하는 시스템 이외에, 포유류 세포를 이용하는 시스템이 있다. 이러한 시스템도 그것을 제한 없이 사용할 수 있다.

(6) 파지 디스플레이법

파지 디스플레이는 다른 분자와 상호 작용이 있는 단백질 및 펩티드를 동정하기 위해서 이용된다.

순서로서는,

1. 박테리오파지 게놈에 DNA를 삽입하고, 파지의 캡시드 단백질(파지 DNA를 덮는 표면 단백질)에 융합된 상태로 후보가 되는 단백질을 파지 분자의 표면에 제시시킨다.

2. 파지를 플레이트의 표면에 코트한 갈렉틴 9와 반응시킨다. 갈렉틴 9와 비 특이적으로 결합하는 파지 재조합체(단백질을 발현한 파지)를 씻어 버린다.

3. 상기 조작을 반복하고, 임의의 파지 재조합체의 후보 중에서 갈렉틴 9와 특이적 상호 작용을 갖는 후보의 분자가 발현되는 파지만을 선택하여 농축한다.

4. 선발된 파지로부터 발현하고 있는 단백질의 cDNA를 조제할 수 있기 때문에, 유전자, 단백질과 함께 동정할 수 있다.

5. 선발시, 또한, 갈렉틴 9를 코트한 96 구멍 플레이트와 상호 작용하는 파지를 이용하여 ELISA를 행하고, 보다 강하게 결합하는 단백질을 발현한 파지를 발색의 세기로부터 선택할 수 있다.

(7) 표면 플라즈몬 공명법에 대해서(BIAcore를 이용한 방법)

본 Biacore의 검출계는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance＝SPR)의 광학 현상을 채용한 수법이다. 이리하여, 2 분자간의 결합과 해리에 따라 센서 칩 표면에서 발생하는 미량의 질량 변화를 SPR 시그널로서 검출한다.

본 방법의 원리는 생체 분자의 고정화되어 있지 않은 측의 센서 칩(금박막)에 광을 전반사 하도록 하면, 반사광의 일부에 반사광 강도가 저하한 부분이 관찰된다(SPR 시그널 발생). 이 광이 어두운 부분이 나타나는 각도(＝굴절율의 변화)는 센서 칩 상에서의 질량에 의존한다.

센서 칩 표면의 갈렉틴 9(리간드)에 후보 단백질(아날라이트)을 첨가하여 결합 반응이 일어나면, 질량 변화(＝질량 증가)가 생겨, 광이 어두운 부분이 I에서 II로 시프트한다. 1 ㎟당 1 ng의 물질이 결합하면 I→II에 O.1도 시프트하는 것이 알려져 있다. 반대로, 해리에 의해 질량이 감소하면, II→I에 그 만큼만 되돌아가게 된다.

Biacore에서는 I에서 II에 시프트하는 양, 즉, 센서 칩 표면에서의 질량 변화를 종축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 종축의 단위는 Resonance Unit(＝RU 공명 유닛)으로 나타내며, 1 RU＝1 pg/㎟에 해당한다.

생체 분자 표지하지 않고, 상호 작용을 리얼 타임으로 볼 수 있다.

순서로서는,

1. 갈렉틴 9(리간드라고 부름)를 센서 칩에 고정화한다.

2. 작용한다고 생각되는 후보 단백질(아날라이트라고 부름)을 함유하는 용액을 센서 칩 상에 일정한 유속으로 송액한다.

3. 갈렉틴 9와 후보 단백질의 결합과 해리가 발생하면, 그 시그널이 표면플라즈몬 공명으로서 검출된다.

4. 결합의 세기가 시그널의 강약에 의해 정량되기 때문에, 갈렉틴 9와 보다 강한 상호 작용이 있는 단백질을 동정할 수 있다.

(8) 형광 편광법

형광 편광법은 용액 중에 있어서의 당쇄-단백질, 항원 일항체 혹은 단백질간 상호 작용을 고정화 및 트레이서 분자의 분리 작업을 하지 않고, 그 상호 작용을 직접 분석할 수 있다.

본 형광 편광법의 원리는 액체 중 형광 표지한 갈렉틴 9 분자가 평면 편광에 의해 여기되면, 동일 평면에 편광 형광을 발한다. 그러나 여기 상태 중에 브라운 운동에 의해 회전하면 여기 평면과 다른 평면으로 형광을 발하여 형광 편광이 해소된다. 즉, 형광 편광도와는 여기되고 난 후 형광을 발하는 도중에 형광성 분자가 회전하는 정도를 나타내는 것이 된다. 일반적으로 형광성 프로브에 의해 표지된 작은 분자는 용액 속에서 브라운 운동에 의해 격심하게 회전하기 때문에 낮은 편광도를 나타낸다. 한편, 다른 단백질 분자가 결합하면 용액 중에 있어서의 브라운 운동은 감소하며, 편광도는 상승한다. 따라서 형광 편광법에서는 편광도의 변화를 지표로서 용액 중에 있어서의 단백질간 상호 작용을 해석하는 것이 가능해진다.

순서로서는,

1. 형광 표지한 갈렉틴 9의 형광 편광도를 측정한다.

2.다른 단백질 용액을 첨가하고, 결합에 의해 형광 표지한 갈렉틴 9가 발하는 형광 편광도가 변화하는지 여부를 검출한다.

3. 보다 크게 편광도가 변화되는 경우에, 후보가 되는 단백질의 결합이 발생한 것으로서, 상호 작용하는 단백질의 동정을 행하는 것.

이상과 같이하여, 동정된 갈렉틴 9 결합 분자는 그것을 이용하여 본 명세서에 개시한 기술에 따라, 그것을 제어하는 물질의 검색에 이용할 수 있다.

본 발명에 의해, 인간 갈렉틴 9가 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성 및 아포토시스 유도 활성을 나타내지만, 정상 세포에는 상해 활성을 나타내지 않으며, 나아가서는 아포토시스를 유도하지 않기 때문에 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 작용 물질, 갈렉틴 9 안타고니스트 길항 물질, 항갈렉틴 9 결합 단백질 항체, 항 갈렉틴 9 결합 당쇄 항체, 갈렉틴 9 산생·유리 유도 물질 등을 정상 세포에는 작용하지 않는 종양 세포에 상해 활성을 나타내고, 아포토시스를 유도하는 항종양제(항암제)로서 이용하는 기술의 개발이 가능해졌다.

또한, 인간 갈렉틴 9는 비활성화(휴면), T 세포, 특히 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도는 하지 않는 것에 대하여 활성화한 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도를 현저히 유도하고, 활성화 CD8 앙성 T 세포(서프레서 T 세포 및 세포 상해성 T 세포)의 아포토시스도 갈렉틴 1 및 갈렉틴 3보다도 강하게 유도하는 것, 및 글루코코르티코이드(덱사메타존)와 마찬가지로 수용체 → 칼슘 유입 → 칼파인 → 카스파제 1 → 카스파제 3 및 7이라는 경로로 아포토시스를 유도한다고 생각되고, 갈렉틴 9가 항염증약, 항알레르기제 및 면역 억제약로서 사용할 수 있으며, 갈렉틴 9 단백질, 갈렉틴 9 유전자 도입 및 갈렉틴 9를 유도함으로써 부작용이 적은 면역 억제제로서 이용하는 것, 또는 그것을 병용함으로써 글루코코르티코이드 등의 용량을 감소시키는 결과, 부작용을 적게 할 수 있다. 이리하여 갈렉틴 9, 그 유연체 등의 이용, 갈렉틴 9의 생체내 농도 혹은 발현을 조절함으로써, 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제를 제공할 수 있다. 또한, 갈렉틴 9를 이용하여, 글루코코르티코이드가 나타내는 약리 작용·생물 활성을 이용한 분야에의 응용이 가능하다.

본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 특히 기재한 것 외에도 실행할 수 있는 것은 분명하다. 전술한 교시를 감안하여 본 발명의 많은 개변 및 변형이 가능하며, 따라서 이들도 본 건 첨부한 청구 범위의 범위 내이다.

Claims (15)

1. (i) (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체(類緣體),

   (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

   (c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

   (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, 및

   (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는,

   (ii) 항종양제, 항알레르기제, 면역 억제제, 자가면역 질환용 제제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 활성 성분제로 이루어지는 군으로부터 선택된 의약 또는 동물약.
2. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항종양제.
3. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
4. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
5. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환용 제제.
6. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증제.
7. 갈렉틴 9 또는 그 유연체 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 부신피질 스테로이드 호르몬 대체제.
8. (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체, 및 (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 악성 세포 상해제.
9. (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체, 및 (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제제.
10. (i) (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

    (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

    (c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

    (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, 및

    (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

    로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성을 나타내는 약제.
11. (i) (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

    (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

    (c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

    (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, 및

    (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

    로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 세포에 대하여 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 약제.
12. (i) (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

    (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

    (c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

    (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, 및

    (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

    로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 세포, 예컨대 활성화 T 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 약제.
13. (i) (a) 갈렉틴 9 및 그 유연체,

    (b) 갈렉틴 9 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드,

    (c) 갈렉틴 9 산생 및 유리 유도 인자,

    (d) 항갈렉틴 9 수용체 항체, 및

    (e) 갈렉틴 9 결합성 당쇄에 대한 항체

    로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 활성화 T 세포에 기인하는 질환 혹은 병적 증상의 예방 및/또는 치료제.
14. 4F2 중쇄 항원 (177216); ATPase, Na^＋/K⁺ 수송, 알파 1 폴리펩티드(21361181); 나트륨-의존성 중성 아미노산 수송자 타입 2 절두형 동형체(truncated isoform) (15004317); 간질(stromal) 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 a (9257240); 간질 세포 유도된 인자 수용체 1 동형체 b; 열 충격 90 kDa 단백질 1, 베타 (20149594); 열 충격 90 kDa 단백질 1, 알파; 열 충격 70 kDa 단백질 5 (글루코스-조절된 단백질, 78 kDa) (16507237); 열 충격 70 kDa 단백질 8 동형체 2 (24234686); 열 충격 70 kDa 단백질 9B 전구체 (24234688); 지방산 조효소 A 리가제, 장쇄 3 (27469830); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 1, 75 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4826856); S-아데노실호모시스테인 히드롤라제-유사 1 (21361647); 계획된 세포사 8 동형체 1 (4757732); 60 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아 전구체(129379); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛, 동형체 1, 심근 (4757810); 리보포린(ribophorin) II 전구체 (88567); 파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1 (4758350); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 2, 미토콘드리아 전구체 (21903482); 돌리킬(dolichyl)-디포스포올리고사카라이드-단백질 글리코실 트랜스퍼라제 (21104416); 칼슘-결합 수송자 (6841066); NADH 탈수소효소-유비퀴논 Fe-S 단백질 2 전구체 (3540239); 액틴, 베타 (14250401); 번역 신장 인자 EF-Tu-유사 단백질 P43 전구체, 미토콘드리아 (7443384); 메탁신(metaxin) 1 (4505281); 시데로플렉신(sideroflexin) 1 (23618867); TCR 베타 쇄 (2982508); Hnrnp A1 (2194069); 포스페이트 캐리어 전구체 동형체 1b (4505775); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 감마 폴리펩티드 1 (4885079); 전압 의존성 음이온 채널 1 (4507879); 히알루로난-결합 단백질 전구체 (8699626); 안드로겐-조절된 단쇄 탈수소효소/리덕타제 1 (20070798); 용질 캐리어(solute carrier) 패밀리 25 (미토콘드리아 캐리어; 옥소글루타레이트 캐리어), 구성원 11 (21361114); 3-히드록시부티레이트 탈수소효소 전구체 (17738292); B-세포 수용체 회합 단백질 (1673514); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 0 서브유닛 (4502303); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 F0 복합체, 서브유닛 d (5453559); ATP 신타제, H⁺ 수송, 미토콘드리아 FO 복합체, 서브유닛 b, 동형체 1 (21361565); 작은 GTP-결합 단백질 (13569962); NADH 탈수소효소 (유비퀴논) Fe-S 단백질 8, 23 kDa (NADH-조효소 Q 리덕타제) (4505371); 소낭 수송(vesicle trafficking) 단백질 sec22b (4759086); 미토콘드리아 유입(import) 수용체 Tom22 (9910382); 신호 서열 수용체, 델타 (5454090); ATP 신타제, 알파쇄 (114517 또는 P25705); ATP 신타제, 베타쇄 (114549 또는 P06576); 나트륨/칼륨-수송 ATPase 베타-3 쇄 (1703470 또는 P54709); ADP, ATP 캐리어 단백질 (113463, P12236, 113459, P05141, 113455 또는 P12235); 유비퀴놀-시토크롬 C 리덕타제 복합체 코어 단백질 1 (731047 또는 P31930) 및 시토크롬 c 옥시다제 폴리펩티드 II (117020 또는 P00403)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 것을 특징으로 하는 갈렉틴 9 결합 인자[괄호내의 숫자는 NCBI의 인터넷 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 그 숫자를 입력함으로써, 단백질 정보 및 그것을 코딩하는 DNA 등의 핵산 서열 정보를 얻을 수 있는 데이터 베이스상의 동정 번호를 나타냄].
15. 제14항에 기재한 갈렉틴 9 결합 인자와 갈렉틴 9 사이의 상호 작용을 이용한 갈렉틴 9 활성 제어 기술.