JPWO2005052156A1 - 肝癌の検出方法及び肝癌診断薬並びに癌治療薬 - Google Patents
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- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
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Abstract
Description
1. 材料と方法
(1) ヒトdlk 全長cDNAの単離と発現ベクターの構築
ヒトDlk(Genbank accession No. U15979)の遺伝子配列情報よりPCRプライマーを設計した。作成したプライマーの配列は以下の通りである。
フォワード側プライマー: 5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3'
リバース側プライマー: 5'-aagcttgatctcctcgtcgccggcc-3'
この時、リバース側プライマーにはHindIIIによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーと胎生10週のヒト肝臓より調整した全RNA (TAKARA)から合成したcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動による展開、目的のバンドの抽出を行い、pCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングした(pCRII-hdlk)。クローニングしたヒトDlkのcDNAはシークエンスにより確認した。
フォワード側プライマー:5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3'
リバース側プライマー:5'-ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3'
この時リバース側プライマーにはXhoIによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーとヒトdlkのcDNAを鋳型としてPCR反応を行い、得られたヒトFA1 cDNAをpCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングした(pCRII-hFA1)。クローニングしたヒトFA1のcDNAはシークエンスにより確認した。
ヒト肝癌由来細胞株は、JHH-6、HLF、JHH-5及びHuh-6であり、いずれも(財)ヒューマンサイエンス振興財団より分譲を受けた。
培養細胞への遺伝子導入は、LipofectAMINE-plus試薬(GIBCO BRL)を用い、添付のプロトコルに従い行った。
ヒト肝癌由来細胞株からTrizol試薬(ニッポンジーン)を用いてRNAを抽出した。First-strand cDNA synthesis kit(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて抽出したRNAからcDNAを合成した後、PCR法によりヒトDlkの発現を解析した。使用したプライマーは以下の通りである。
フォワード側プライマー: 5'-agagctcaacaagaaaacc-3'
リバース側プライマー: 5'-gcgtatagtaagctctgagg-3'
胎児組織全RNA(TAKARA)および細胞からTrizol試薬(ニッポンジーン)を用いて抽出した全RNA、各10μgをホルムアルデヒド変性ゲルにて電気泳動した。ナイロン膜に転写した後、DIGラベルしたcDNAプローブを用いてハイブリダイズした。プローブの検出は、CDP-starを基質とした化学発光により行った。
ヒトdlk遺伝子を組み込んだ、上記レトロウイルスベクター(pMIG-hdlk-Flag)をパッケージング細胞であるBOSC23細胞(Pear, W.S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8392-8396)に導入し、ヒトdlk遺伝子を持つレトロウイルスを産生した。我々が以前、温度感受性SV40 large T antigenのトランスジェニックマウス(Yanai,N. et al. (1991) Exp. Cell Res. 197, 50-56)の胎児肝臓から樹立した細胞株7E2-Cに産生したレトロウイルスを感染させ、恒常的にヒトDlkを発現する細胞株7E2-C(hdlk)を得た。
ゼラチンでコートした96穴培養プレート(Corning)に上記7E2-C(hdlk)株を7.5x103 細胞/ウェルで播種し、37℃で2日間培養した。氷冷PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒド溶液で固定、0.2% Triton-X-100(商品名)溶液で処理し、cell ELISA用プレートとした。以後、定法に従いELISA法を行った。具体的には、ELISAは次のようにして行なった。まず1%BSA-PBS溶液によるブロッキングを室温で2時間行った。次に、ハイブリドーマ上清を加え、室温で1時間反応させた後、0.1%Tween20(商品名)-PBS溶液で3回洗浄した。二次抗体としてビオチン化抗ラットIgG(Vector社製)を0.1%Tween20-PBS溶液で100倍希釈して使用した。室温で1時間反応させた後、0.1%Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。さらに0.1%Tween20-PBS溶液で1000倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン (Vector社製)を室温で1時間反応させ、0.1%Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン: SIGMA社製)基質溶液を添加し発色反応を行い、1M 硫酸を加え反応を停止させた。Microplate reader Model 550(BIO-RAD)を用い吸光度を測定した。
ヒト正常組織、肝癌組織のパラフィン切片(Bio Chain, Hepatocellular carcinoma; catalog No.:T2235149-4, lot No.:A607070, Cholangiocellular carcinoma; catalog No.:T2235149-2, lot No.:A603549)は、脱パラフィン処理後、10mMクエン酸ナトリウム溶液中で10分間加熱処理し、抗ヒトDlkモノクローナル抗体を用いた染色に使用した。DAB(3,3'-ジアミノベンチジン)を基質とて発色反応を行った後、対比染色としてヘマトキシリンによる核染色を行った。これらの操作はより具体的には次のようにして行なった。4%パラホルムアルデヒドによる固定及びパラフィン包埋された切片を、脱パラフィン処理後、10mMクエン酸ナトリウム溶液中で10分間加熱処理した。次にメタノールに終濃度0.3%となるように過酸化水素水を加えた溶液によって、室温で20分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。PBSで室温5分間の洗いを2回行い、ブロックエース試薬(大日本製薬株式会社)を用いて30分間ブロッキングを行い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に1/10に希釈したブロックエース試薬により希釈した抗ヒトdlkモノクローナル抗体clone 1C1(終濃度0.25μg/ml)を室温で1時間反応させ、PBSで5分の洗いを3回行い、続いて1/10に希釈したブロックエース試薬によって100倍に希釈したビオチン化抗ラットIgG抗体を室温で1時間反応させた。PBSによる5分間の洗いを3回行った後、ABCキットの試薬を説明書通りに混ぜてABCコンプレックスを作り、これを室温で30分反応させた。PBSで5分間3回の洗いの後、ペルオキシダーゼ基質(0.02%DAB、0.03%過酸化水素水、50mM Tris-HCl pH 7.5)によって発色を行った。発色を確認した後、水で10分間洗い、マイヤーヘマトキシリン溶液(和光)によって核を染色し、その後アルコールで脱水し、キシレンで透徹して、エンテランニュー(メルク・ジャパン株式会社)で封入した。
細胞はトリプシン処理によって培養皿より剥がし、細胞懸濁液(細胞密度5x106cells/ml)を調製した。抗ヒトDlkモノクローナル抗体0.5μgと細胞懸濁液100μLを4℃、30分間反応させた。PBSで洗浄後、ビオチン化抗ラットIgG(Vector)(0.5μg)と反応(4℃、30分)させ、再びPBSで洗浄した。ストレプトアビジン-FITC(Pharmingen)またはストレプトアビジン-PE(Pharmingen)(0.5μg)と反応(4℃、30分)させた後、FACSCalibur (BECTON DICKINSON)にて解析した。
ヒトFA1発現ベクターを7E2-C細胞に導入し、3日後の培養上清、又は培養上清からHis Trap HP Kit (Amersham Bioscience)を用いて精製(hFA1濃度:30μg/ml)したhFA1を検出試料とした。検出には、捕獲抗体としてclone 31C4、検出抗体としてビオチン化したclone 4C4を用いたサンドイッチELISA法を用いた。検出抗体のビオチン化はECLTM Protein Biotinylation Module(Amersham Bioscience)を用いて行った。なお、このサンドイッチELISAは具体的に次のようにして行なった。まず捕獲抗体clone31C4をPBSで10μg/mlに希釈し、96穴プレートに100μl/wellで添加した。室温で一晩静置した後、PBSで3回洗浄し、2%スキムミルク-PBS溶液(以降 2%MPBSとする)によるブロッキングを室温で2時間行った。次に、hFA1を含む培養上清または2%MPBSで各濃度に希釈したhFA1を加え室温で1時間静置した。PBSで3回洗浄した後、検出用抗体のビオチン化したclone4C4を2%MPBS で1μg/mlに希釈し添加した。室温で1時間反応させた後、0.1%Tween20(商品名)-PBS溶液で3回洗浄した。二次抗体としてビオチン化抗ラットIgG(Vector社製)を2%MPBS溶液で100倍希釈して使用した。室温で1時間反応させた後、0.1%Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。さらに2%MPBS溶液で1000倍希釈したセイヨウワサビベルオキシダーゼ−ストレプトアビジン (Vector社製)を室温で1時間反応させ、0.1%Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。発色反応はTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン: SIGMA社製)を基質溶液として添加して行い、1M 硫酸を加え反応を停止させた。Microplate reader Model550(BIO-RAD)を用い吸光度を測定した。蛍光反応はQuantaBlu(商品名)Fluorogenic Peroxidase Substrates(PIERCE社製)と測定機器としてフルオロスキャンアセント(Thermo Labsystems社製)を用いて測定した。
(1) ヒト正常肝臓におけるヒトDlkの発現
本願発明者らは、以前、マウスにおいてDlkが胎生肝細胞に高発現しており、成体肝細胞には発現が見られないこと、抗マウスDlkモノクローナル抗体とMACS(Magnetic beads cell sorting)を組み合わせて用いることで、胎児肝臓から肝細胞のみを高純度で回収することができることを見い出している(非特許文献7、特許文献1)。そこで、まずヒトにおいても同様な発現パターンを示すのか検討した。ヒト胎児肝臓全RNAサンプル(TAKARA)を用いてノーザンブロット解析を行った結果、妊娠6週目から12週目の胎児肝臓においてヒトDlkの発現が認められた(図1A)。また妊娠12週目における各臓器でのヒトDlkの発現を調べた結果、肝臓以外に腎臓、骨格筋でも発現していた(図1B)。これに対し成体組織での発現は、以前の報告にあるように、胎盤以外では検出できなかった(図1C)(非特許文献1)。しかしながら最近の報告では、FA1が下垂体(Larsen, J.B. et al. (1996) Lancet. 347, 191)、副腎(Jensen, C.H. et al. (1993) Hum. Reprod. 8, 635-641)などにも発現していることが明らかにされている。このことから、ヒトでもマウスと同様に、肝臓でのDlkの発現は胎児で見られるものの、成体肝臓では発現していないことがわかった。
上記の結果を更に確認するため、本願発明者らはまず、抗ヒトDlkモノクローナル抗体(ラットIgG)を作製した。抗原として2種類のヒトDlk発現細胞を樹立し、これを抗原としてラットを免疫した。ハイブリドーマを定法に従い調整し、その後、抗原として用いた7E2-C(hdlk)株を用いたFACS解析、およびcell ELISA法により陽性クローンを選択した。さらにクローニングを行い、3種類(clone 1C1、4C4、31C4)の安定したクローンを確立した。最終的に確立したクローンの培養上清を用いてFACS解析を行った結果、確かにこれらの培養上清中にヒトDlkと特異的に反応するモノクローナル抗体が産生されていることが確認された。
ヒトDlkの発現は、マウスでの結果と同様、胎児の未熟な肝細胞では見られるが、成体の肝細胞では発現が認められない。本願発明者らは、ヒト肝癌におけるヒトDlkの発現の可能性を検討した。まず4種類のヒト肝癌由来細胞株(JHH-6、HLF、JHH-5、Huh-6)について、FACS解析、免疫染色およびRT-PCR法によって検討した。抗ヒトDlkモノクローナル抗体clone 4C4を用いてFACS解析を行った結果、未分化型の細胞株(JHH-6、HLF)ではシフトは認められなかったが、分化型の細胞株(JHH-5、Huh-6)ではヒトDlkの発現を示すシフトが見られた(図2A)。また免疫染色法の結果も同様に、分化型の細胞株では染色像が確認された(図2B)。
ヒト肝癌由来細胞株におけるヒトDlkの発現解析の結果は、ヒトDlkが肝癌組織においても発現している可能性を示唆している。そこでヒト肝癌組織でのヒトDlkの発現を、抗ヒトDlkモノクローナル抗体clone 1C1を用いて免疫組織染色法により検討した。その結果、肝細胞癌および胆管細胞癌の組織において癌部で強く染色されることが明かとなった(図3)。この時、癌部に隣接する正常組織では全く染色されなかった。このことはDlkが胎生肝細胞のみならず、成体肝細胞の癌化によっても発現することを示しており、肝癌における腫瘍マーカーになりうることが示唆された。
Dlkは、その細胞外領域が切断され、FA1として知られる可溶性分子を産生することが明かとなっている。我々が作出した抗ヒトDlkモノクローナル抗体は、Dlkの細胞外領域を認識することから、この抗体を用いてヒトFA1を認識、検出できる可能性が考えられた。そこで、7E2-C細胞にヒトFA1を一過性に発現させた培養上清を用いてELISA法により検討した。その結果、確かにコントロールベクターを導入した培養上清ではシグナルが検出されないが、ヒトFA1を含む培養上清ではシグナルが検出されることが確認された(図4)。以上のことから我々の作出した抗ヒトDlkモノクローナル抗体は、ヒトFA1を検出できることが明かとなった。
さらに、上記の「1.材料と方法」の「(10) 抗ヒトdlkモノクローナル抗体によるヒトFA1の検出」に記載したように、精製ヒトFA1タンパク質を用いて、ELISA法の感度検定を行った結果、発光基質(QuantaBlu(商品名)Fluorogenic Peroxidase Substrates:PIERCE)と測定機器としてフルオロスキャンアセント(Thermo Labsystems)を用いることで、1ng/mlのヒトFA1が検出可能であった(図4B、表2)。
1. 材料及び方法
「(1) ヒトdlk 全長cDNAの単離と発現ベクターの構築」、「(2) ヒト肝癌由来細胞株」、「(3) 培養細胞への遺伝子導入」、「(4) RT-PCR」、「(5) ノーザンブロット解析」は実施例1記載の通りに行った。
2種類のDlk発現細胞株7E2-C(hdlk)とHEK293(hdlk)の樹立までは実施例1記載の通りに行った。
健常人静脈血をヘパリン採血し、PBSで2倍に希釈後、Lymphoprep (第一化学薬品)上に重層し20℃で800g、20分間遠心した。遠心後、中間層分画にある単核細胞を回収し、PBSで3回洗浄後、10% FCSを加えたDMEM培地に浮遊させエフェクター細胞として用いた。
健常人静脈血は抗凝固剤を加えずに採血し、15mlチューブに移して37℃の孵卵器内に60分間放置した。さらに室温に60分間放置し、血餅をチューブの壁から剥がした後に20℃で2500rpm、15分間遠心した。遠心後、上清の血清を回収し、補体血清として用いた。56℃、30分間の加温により補体を不活性化(非働化)した血清は、コントロールとして使用した。
96穴プレートで培養した細胞にテトラカラーワン(生化学工業)を、添付のプロトコールに従い、各培養ウエルに添加し、5% CO2インキュベーターで3-4時間反応させた。反応後96穴プレートをそのままマイクロプレートリーダーを用いて490nm(対照波長:655nm)の吸光度を測定した。
HEK293とHEK293(hdlk)細胞はトリプシン処理によってプレートから剥離し、10% FCSを加えたDMEM培地に1x105/mlの濃度で浮遊させターゲット細胞として用いた。ゼラチンコートした96穴平底プレートに1x104/wellで播き、抗ヒトDlk抗体4C4、31C4およびラットIgG(それぞれ0.2、1.0、5μg/ml)の存在下で30分培養した。さらに補体として使用するヒト血清を培養液の25%になるように加え、72時間培養した。培養後、MTT法により吸光度を測定した。CDC活性における生細胞数を示す吸光度の値は、対照として作製した、培地に補体血清を添加したウエルの平均値を差し引いて算出した。有意差検定はStudent's t testにより行った。
HEK293とHEK293(hdlk)細胞はトリプシン処理によってプレートから剥離し、10% FCSを加えたDMEM培地に2x105/mlの濃度で浮遊させ、ターゲット細胞として用いた。ゼラチンコートした96穴平底プレートに1x104/wellで播き、抗ヒトDlk抗体1C1、4C4、31C4およびラットIgG (5μg/ml)の存在下で30分培養した。さらにエフェクター細胞は、エフェクター:ターゲット比(20:1、10:1、 5:1)でターゲット細胞に加え5% CO2インキュベーターで72時間培養した。培養後MTT法により吸光度を測定した。ADCC活性における生細胞数を示す吸光度の値は、対照として作製した培地だけのウエルの平均値を差し引いて算出した。
実施例1の「1.材料と方法 (1) ヒトdlk 全長cDNAの単離と発現ベクターの構築」に記載したヒトDlkの全長cDNAを組み込んだ発現ベクター(pcDNA-hdlk-Flag)をヒト肝癌由来細胞株Huh-7(入手先:東京大学分子細胞生物学研究所機能形成)に遺伝子導入し、G418(geneticin, GIBCO BRL)による選択後、ヒトDlkを安定に発現している2種の細胞株Huh-7(hDlk)(クローンPC14, PC16)を樹立した。また、コントロール細胞としてEGFPの全長cDNAを組み込んだ発現ベクター(PEGFP)をHuh-7細胞に導入し、G418による選択後、EGFPを安定に発現している細胞株Huh-7 EGFPを樹立した。
Std: Wister/STラット、8週齢、雄の静脈血を抗凝固剤を加えずに採血し、実施例2の「1.材料と方法(11) ヒト補体血清の分離」記載の方法で、補体血清を分離した。
ヒトDlkを安定に発現している2種の細胞株Huh-7(hDlk)(クローンPC14, PC16)およびコントロール細胞(EGFPを安定に発現している細胞株Huh-7 EGFP)を3X106 cell / 100 μL (PBS: EHS-gel=1:1)ずつ、6週齢のヌードマウス(Balb/c; nu/nu、雌、日本エスエルシー)の皮下に移植した。ヒトDlk遺伝子の腫瘍形成に与える影響を検討する為に、ヌードマウス同一個体において、背中の左側皮下と右側皮下において、片方にコントロール細胞を、もう一方にクローンPC14, あるいはPC16細胞を移植し、移植後3週間にわたり、それぞれの移植肝癌細胞の腫瘍形成を観察した。腫瘍体積の測定はノギスを用いて、常法に従い、
腫瘍体積 (mm3)=π/6 X 長径 X (短径)2
の計算式で算出した。
「(1) ヒト正常肝臓におけるヒトDlkの発現」、「(2) 抗ヒトDlkモノクローナル抗体」、「(3) ヒト肝癌由来細胞株におけるヒトDlkの発現」、「(4) ヒト肝癌組織におけるヒトDlkの発現」の結果は実施例1に記載したとおりである。
作製した抗ヒトDlkモノクローナル抗体(クローン4C4)を用いて、HEK293細胞とHEK293 (hdlk)細胞のFACS解析を行った。ヒトDlkはHEK293細胞では全く発現していなかったが、HEK293 (hdlk)細胞では強く発現していることが確認された(図7)。
Dlkがヒト癌細胞株や癌組織で発現していることは、Dlkが腫瘍マーカーになり、抗ヒトDlkモノクローナル抗体が、Dlkを発現している癌細胞を標的とした治療抗体になる可能性を示唆している。そこで、まず、抗体と補体による細胞傷害、すなわちCDC活性を測定した(図8、表3.1,3.2)。96穴プレートにターゲット細胞として、HEK293またはHEK293(hdlk)細胞を播き、抗ヒトDlk抗体(クローン4C4, 31C4を5μg/mlで添加)と補体血清を加えて培養した。培養3日後、MTTアッセイによりターゲット細胞の傷害を測定した。Dlk抗体を5μg/mlで添加したときのHEK293(hdlk)細胞の傷害は、抗体非添加やコントロールIgG抗体を添加した系に比較し、抗ヒトDlk抗体(クローン4C4, 31C4)と補体血清を添加した系で吸光度の値が低下し、生細胞数が70-90%減少していた。また、非働化した補体血清を添加して培養した場合、5μg/mlの抗ヒトDlk抗体(クローン31C4)を添加した系は、抗体非添加およびコントロール抗体を添加した系と吸光度に違いはみられず、生細胞数は同等であった(図8A、表3.1)。また、Dlkを発現していないHEK293細胞に対しては、いずれの抗体も細胞傷害活性を示さなかった。
次に、ヒトDlkを発現しているHEK293(hdlk)をターゲット細胞、健常人末梢血単核球をエフェクター細胞として、作製した抗ヒトDlkモノクローナル抗体のADCC活性を測定した。
実施例1の「1.材料と方法(9)FACS解析」に示した方法で、作製した抗ヒトDlkモノクローナル抗体を用いて、Huh-7EGFP細胞とHuh-7(hdlk)細胞(クローンPC14, PC16)のFACS解析を行った。ヒトDlkはHuh-7EGFP細胞では全く発現していなかったが、Huh-7(hdlk)細胞では強く発現していることが確認された(図10)。
Dlkは、ヒト肝癌細胞株や肝癌組織で発現していることが明らかとなったが、Dlkの肝癌腫瘍形成における機能については不明であった。樹立したヒトDlkを安定に発現しているヒト肝癌由来細胞株Huh-7(hDlk)クローンPC14細胞のヌードマウス皮下における腫瘍形成をコントロール細胞(Huh-7 EGFP)と比較したところ、移植した5匹全ての個体において、クローンPC14細胞の著しい腫瘍の成長が観察された(図12A)。移植19日目のコントロール細胞由来の癌組織の体積は1271 + 427.5 (mm3) に対して、クローンPC14細胞由来の癌組織の体積は4319.4 + 378.5 (mm3) であった。クローンPC16細胞細胞についても同様に実験を行ったところ、やはりコントロール細胞と比較して、著しい腫瘍の成長が再現された(図12B)。以上の結果は、Dlkが肝癌の腫瘍形成を著しく促進させる機能を持っていることを示唆しており、Dlkが肝癌治療の標的として優れていることを示している。
Claims (43)
- dlk遺伝子の発現を指標とする、試料中の肝癌細胞の検出方法。
- 細胞表面上に発現するdlkを測定することを含む請求項1記載の方法。
- 細胞表面上に発現するdlkと、抗dlk抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用する請求項2記載の方法。
- 前記抗dlk抗体が、モノクローナル抗体である請求項3記載の方法。
- FACS又はMACSにより行なう請求項2ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- dlk遺伝子のmRNAを測定することにより行なう請求項1記載の方法。
- mRNA又はそれに由来するcDNAを核酸増幅法により増幅することを含む請求項6記載の方法。
- RT-PCRを行なうことを含む請求項7記載の方法。
- 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記肝癌細胞がヒト肝癌細胞である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記肝癌細胞がヒト肝癌細胞であり、前記モノクローナル抗体が抗ヒトdlkモノクローナル抗体である請求項4記載の方法。
- 生体から採取された血液中又は尿中に存在する、dlkの細胞外領域を測定することを含む肝癌の検出方法。
- 血液中に存在するdlkの細胞外領域と、抗dlk抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用する請求項12記載の方法。
- 前記抗dlk抗体が、モノクローナル抗体である請求項13記載の方法。
- 前記血液又は尿がヒト血液又はヒト尿であり、前記モノクローナル抗体が抗ヒトdlkモノクローナル抗体である請求項14記載の方法。
- dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、肝癌診断薬。
- 前記抗体が抗ヒトdlkモノクローナル抗体である請求項16記載の診断薬。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAとハイブリダイズし、dlk遺伝子のmRNA又はcDNAを測定するためのプライマー又はプローブとして利用できる核酸から成る、肝癌検出用核酸。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAの一部領域と相補的な塩基配列又は該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列であって15塩基以上のサイズの領域を含む請求項18記載の核酸。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAの一部領域と相補的な塩基配列であって15塩基以上のサイズの領域を含む請求項19記載の核酸。
- dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片の、肝癌診断薬の製造のための使用。
- 前記抗体が抗ヒトdlkモノクローナル抗体である請求項21記載の使用。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAとハイブリダイズし、dlk遺伝子のmRNA又はcDNAを測定するためのプライマー又はプローブとして利用できる核酸の、肝癌検出用試薬の製造のための使用。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAの一部領域と相補的な塩基配列又は該塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列であって15塩基以上のサイズの領域を含む請求項23記載の使用。
- dlk遺伝子のmRNA又はcDNAの一部領域と相補的な塩基配列であって15塩基以上のサイズの領域を含む請求項24記載の使用。
- 癌細胞表面上に発現しているDlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体を有効成分として含有する癌治療薬。
- 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項26記載の癌治療薬。
- 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項26又は27記載の癌治療薬。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項26ないし28のいずれか1項に記載の癌治療薬。
- 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒトDlk抗体である請求項26ないし29のいずれか1項に記載の癌治療薬。
- 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項26ないし30のいずれか1項に記載の癌治療薬。
- 癌細胞表面上に発現しているDlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体の有効量を癌患者に投与することを含む、癌の治療方法。
- 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項32記載の方法。
- 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項32又は33記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項32ないし34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒトDlk抗体である請求項32ないし35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項32ないし36のいずれか1項に記載の方法。
- 癌細胞表面上に発現しているDlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体の、癌治療薬の製造のための使用。
- 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項38記載の使用。
- 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項38又は39記載の使用。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項38ないし40のいずれか1項に記載の使用。
- 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒトDlk抗体である請求項38ないし41のいずれか1項に記載の使用。
- 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項38ないし42のいずれか1項に記載の使用。
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