ES2345493T3 - Metodo de deteccion de cancer de higado, diagnostico de cancer de higado y remedio para el cancer. - Google Patents
Metodo de deteccion de cancer de higado, diagnostico de cancer de higado y remedio para el cancer. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un anticuerpo que experimenta una reacción antígeno-anticuerpo con la Dlk que se expresa en las superficies de células de cáncer de hígado y que ejerce una acción anticancerosa contra dichas células de cáncer de hígado, para la producción de un fármaco terapéutico para el tratamiento del cáncer de hígado.
Description
Método de detección de cáncer de hígado,
diagnóstico de cáncer de hígado y remedio para el cáncer.
La presente invención se refiere a un método
para detectar el cáncer de hígado, al diagnóstico del cáncer de
hígado y a un fármaco terapéutico para el cáncer.
El carcinoma hepatocelular es uno de los
carcinomas más populares en el mundo y la aparición del mismo es
especialmente frecuente en el sudeste de Asia, China y el África
Subsahariana. No menos de 30.000 personas mueren por cáncer de
hígado en Japón al año, y el número de muertes está aumentando
todavía. La mayoría del cáncer de hígado es carcinoma hepatocelular
causado por la infección con el virus de la hepatitis. Sin embargo,
todavía no está claro el mecanismo de transformación cancerosa de la
hepatitis vírica en carcinoma hepatocelular por medio de cirrosis.
Por lo tanto, los métodos de diagnóstico usados en la actualidad
(ultrasonografía, diagnóstico por imagen mediante TC,
hemodiagnóstico usando un marcador tumoral tal como
\alpha-fetoproteína) son los que se dirigen a
tejidos cancerosos ya formados. Por lo tanto, aunque pueden detectar
cánceres que han progresado en cierta medida, no pueden detectar
células cancerosas en una etapa muy temprana o células
precancerosas. Aunque el hemodiagnóstico usando AFP como marcador
tumoral es sencillo, la especificidad para el cáncer de hígado no
es elevada, y se sabe que el nivel de AFP también es elevado en la
cirrosis y la hepatitis.
La tasa de mortalidad del cáncer en Japón ha
aumentado desde aproximadamente 1980, y el cáncer es ahora la causa
principal de muerte. Entre los cánceres, el número de muertes por
cáncer de hígado es de 35.000 al año, que ocupa la tercera posición
entre las muertes totales por cáncer. Se cree que el número de
pacientes de cáncer de hígado aumentará adicionalmente a menos que
se desarrolle un fármaco terapéutico y de diagnóstico que haga
época. Las terapias actuales del cáncer de hígado incluyen
tratamientos locales tales como la hepatectomía quirúrgica, terapia
de infusión de etanol percutánea y embolización arterial hepática, y
tratamientos sistémicos tales como administración sistémica de
agentes anticancerosos e inmunoterapias. Las terapias principales
son los tratamientos locales, y la hepatectomía es mejor que la
terapia de infusión de etanol percutánea y la embolización arterial
hepática en vista del índice de curación. Sin embargo, dependiendo
del grado de disfunción del hígado y del área ocupada por el tumor,
con frecuencia no puede practicarse la cirugía. Como para los
tratamientos sistémicos, no se ha establecido una quimioterapia
convencional. El cisplatino es el único fármaco que presentaba un
índice de respuesta de no menos del 10% cuando se administraba en
solitario, y no se ha establecido un tratamiento polifarmacológico
(Bibliografía no de patente 1). Como para la inmunoterapia, se ha
descrito que el "Picibanilo (OK-432)" (CHUGAI
PHARMACEUTICAL), que es un inmunoestimulante, es eficaz para el
cáncer de hígado. Incluso si se aplica dicha terapia, la cura
completa del cáncer de hígado es difícil debido a su carcinogénesis
multicéntrica y a su naturaleza recurrente. Se cree que es
importante el desarrollo de un fármaco molecularmente dirigido
(anticuerpo terapéutico) que ataque específicamente al cáncer de
hígado.
En los últimos años, la comercialización y el
desarrollo de fármacos molecularmente dirigidos que ataquen
específicamente células cancerosas son cada vez más activos. Puesto
que estos fármacos se dirigen a un gen diana que se expresa
específicamente en un cáncer específico, tienen ventajas en el
sentido de que son más eficaces que los agentes anticancerosos
convencionales y tienen menos efectos secundarios. Por lo tanto, se
cree que los fármacos molecularmente dirigidos se convertirán en la
corriente principal del desarrollo de agentes anticancerosos. Los
anticuerpos terapéuticos comercializados para cánceres incluyen
"Herceptina (preparación de anticuerpo monoclonal humanizado
anti-Her2)" (CHUGAI PHARMACEUTICAL), que es un
fármaco terapéutico para el cáncer de mama metastásico, en el cual
se confirma un exceso de expresión de Her2, y ``Rituxán (preparación
de anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20)
(CHUGAI PHARMACEUTICAL y ZENYAKU KOGYO), que es un fármaco
terapéutico para linfoma no Hodgkin de tipo celular B positivo a
CD20. Estos anticuerpos terapéuticos destruyen células cancerosas
por un mecanismo inmune tal como citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC). Aunque el número de fármacos molecularmente
dirigidos específicos de cáncer es pequeño, se espera que el índice
de curación de cánceres incluyendo el cáncer de hígado aumente si
se desarrollan productos farmacológicos que tengan alta
especificidad para un cáncer.
Por otro lado, la Dlk1/Pref-1 es
una proteína de membrana cuyo dominio extracelular tiene homología
con la familia de Notch/Delta/Serrate. Se clonó la
Dlk1/Pref-1 como una molécula que se expresaba en
una línea celular derivada de carcinoma pulmonar microcítico
sensible a GRP (péptido liberador de gastrina) (Bibliografía no de
patente 1) o como un factor que inhibe la diferenciación de
preadipocitos (Bibliografía no de patente 2). Su expresión se
observa en una pluralidad de tejidos y órganos durante el periodo
fetal, pero no se observa en la mayoría de los tejidos después del
nacimiento (Bibliografía no de patente 2 y 3). Además, su expresión
se observa en algunos tejidos cancerosos tales como el carcinoma
pulmonar microcítico y la neurofibromatosis tipo 1 (Bibliografía no
de patente 4 y 5). En lo que se refiere a la función de
Dlk1/Pref-1, además de la inhibición de la
diferenciación de preadipocitos, recientemente se sugirió su
participación en la hematopoyesis (Bibliografía no de patente 6).
Sin embargo, basándose en el patrón de expresión y similar, se ha
sugerido la posibilidad de su participación en el mantenimiento de
un estado indiferenciado en células no diferenciadas.
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Se había identificado anteriormente el gen de
dlk, que estaba altamente expresado en el hígado de ratón a día
embrionario 14,5, por el método de inmovilización de señal que aísla
selectivamente genes que codifican moléculas que tienen una
secuencia señal, es decir, los que codifican antígenos de superficie
celular y proteínas secretoras. La expresión de Dlk en el proceso
de desarrollo del hígado de ratón se observa antes del día
embrionario 10, y se expresa claramente hasta aproximadamente el
día embrionario 16. Sin embargo, la expresión se disminuye
espectacularmente alrededor del nacimiento y no se expresa en el
hígado maduro (Bibliografía no de patente 7 y 13).
Además, se descubrió que las células madre
hepáticas pueden purificarse hasta una alta pureza en una etapa a
partir de hígado fetal usando un anticuerpo monoclonal
anti-Dlk (Bibliografía no de patente 7, Bibliografía
de Patente 1).
Bibliografía no de patente 1: Laborda,
J., et al (1993) J. Biol. Chem. 268(6):
3817-20.
Bibliografía no de patente 2: Smas, C.
M., et al (1993) Cell. 73(4):
725-34.
Bibliografía no de patente 3: Floridon,
C., et al (2000) Differentiation 66(1):
49-59.
Bibliografía no de patente 4: Harken, J.
C., et al (1999) Tumour Biol. 20(5):
256-62.
Bibliografía no de patente 5: Jensen, C.
H., et al (1999) Br. J. Dermatol.
140(6): 1054-9.
Bibliografía no de patente 6: Ohno, N.,
et al (2001) Stem Cells 19(1):
71-9.
Bibliografía no de patente 7: Tanimizu,
N., et al (2003) J. Cell Sci. 116(Pt 9):
1775-86.
Bibliografía no de patente 8: Onishi, M.,
et al (1996) Exp. Hematol. 24;
324-329.
Bibliografía no de patente 9: Sell, S.
(1993) Int. J. Dev. Biol. 37:
189-201.
Bibliografía no de patente 10: Jensen, C.
H. et al (1994) Eur. J. Biochem. 225:
83-92.
Bibliografía no de patente 11: Kaneta, M.
et al. (2000) J. Immunol. 164:
256-264.
Bibliografía no de patente 12: Okada, S.,
et al (1993) Oncology. 50 (1):
22-26.
Bibliografía no de patente 13: Kitajima,
T., et al (1999) Nat. Biotechnol. 17 (5):
487-490.
Bibliografía no de patente 14: Jensen, C.
H., et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6):
1054-1059.
Bibliografía no de patente 15: Russell,
W. C., et al (1977) J. Gen. Virol. 36:
59-72.
Bibliografía no de patente 16: Kipps, T.
J., et al (1985) J. Exp. Med. 161:
1-17.
Bibliografía de Patente 1: Publicación de
Patente Internacional WO 02/103033
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para detectar el cáncer de hígado, por el que
pueda detectarse el cáncer de hígado con gran especificidad y
proporcionar un diagnóstico para el mismo. Otro objeto de la
presente invención es proporcionar un nuevo fármaco terapéutico para
el cáncer, que tenga un efecto anticanceroso excelente.
Los presentes inventores realizaron estudios en
profundidad para descubrir que dlk se expresa en la superficie de
células de cáncer de hígado de adultos, y confirmaron
experimentalmente que pueden detectarse células de cáncer de hígado
usando la dlk como marcador tumoral. Además, los presentes
inventores tuvieron éxito en la preparación de anticuerpos
monoclonales anti-dlk humana, experimentando cada
uno de ellos una reacción de antígeno-anticuerpo
con el dominio extracelular de la dlk que se expresa en superficies
celulares, y confirmaron que cada uno de estos anticuerpos
monoclonales anti-dlk humana experimenta también una
reacción de antígeno-anticuerpo con FA1, que es el
dominio extracelular de la dlk liberada a la sangre.
Los presentes inventores han deducido además que
existía una posibilidad de que el anticuerpo monoclonal
anti-dlk humana pudiera usarse como anticuerpo
terapéutico que se dirija a células cancerosas que expresen Dlk. Por
lo tanto, los presentes inventores estudiaron las actividades
antitumorales para destruir específicamente las células de líneas
celulares cancerosas que expresan Dlk de los tres anticuerpos
monoclonales anti-Dlk humana preparados, usando un
sistema experimental in vitro para confirmar la actividad
anticancerosa de los anticuerpos monoclonales
anti-Dlk, humana completando de este modo la
presente invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Es decir, la presente invención proporciona el
uso de un anticuerpo que experimenta una reacción de
antígeno-anticuerpo con la Dlk que se expresa en
las superficies de células de cáncer de hígado, y que ejerce una
acción anticancerosa contra dichas células de cáncer de hígado,
para la producción de un fármaco terapéutico para el cáncer de
hígado.
También se describe un método para detectar el
cáncer de hígado que utiliza un nuevo marcador de cáncer de hígado.
Puesto que la dlk no se detecta en órganos distintos de placenta en
adultos, y puesto que la dlk tampoco se detecta en modelos de
lesión hepática aguda de ratón, el cáncer de hígado puede detectarse
con gran especificidad. Además, puesto que la dlk se expresa en las
células de hígado altamente proliferativas durante el periodo fetal
y en células ovales que surgen en la regeneración del hígado en
adultos, se cree que la dlk se expresa en las células de cáncer de
hígado en crecimiento, de modo que se cree que el cáncer de hígado
puede detectarse en una fase temprana. Además, puesto que el FA1,
que es el dominio extracelular de dlk liberado a la sangre u orina,
puede detectarse usando el anticuerpo monoclonal
anti-dlk, puede detectarse el cáncer de hígado
simplemente mediante ensayo de sangre o ensayo de orina que utilice
el dominio extracelular de dlk como marcador tumoral. Aún más, se
describe un nuevo fármaco terapéutico para el cáncer que tiene una
alta actividad anticancerosa. El fármaco terapéutico para el cáncer
es especialmente eficaz para la terapia del cáncer de hígado.
La Figura 1 son fotografías que muestran los
resultados de la transferencia de Northern que indican la expresión
de gen de Dlk en tejidos adultos y fetales humanos. (A) Expresión de
gen de Dlk en hígado fetal durante la 6ª a 12ª semana de gestación;
(B) Expresión de gen de Dlk en tejidos fetales; (C) Expresión de gen
de Dlk en tejidos de adulto.
La Figura 2 muestra los resultados del análisis
para la expresión de Dlk en las células de líneas celulares
derivadas de cáncer de hígado humano. (A) Resultados del análisis de
FACS; (b) Resultados de la tinción inmunofluorescente; (C)
Resultados del análisis de RT-PCR.
La Figura 3 son fotografías que muestran la
expresión de Dlk en cánceres de hígado humano. (A) Carcinoma
hepatocelular; (B) Carcinoma colangiocelular.
La Figura 4 (A) es una gráfica que muestra la
detección de FA1 humano usando anticuerpos monoclonales
anti-Dlk humana y que muestra los resultados de la
detección y confirmación por ELISA. (B) es una gráfica que muestra
la detección de FA1 humano purificado usando anticuerpos
monoclonales anti-Dlk humana, y que muestra los
resultados de la detección y confirmación por ELISA usando un
sustrato quimioluminiscente (Sustratos de Peroxidasa Fluorogénicos
QuantaBlu (marca comercial): PIERCE).
La Figura 5 muestra los resultados de la
inmunotinción de Dlk humana en un tejido (64 años de edad) basándose
en la tinción convencional de Dlk. La fecha indica el área positiva
a Dlk usada como patrón.
La Figura 6 muestra una imagen teñida de
carcinoma hepatocelular. Izquierda: tinción con hematoxilina eosina
(HE); Centro: inmunotinción de positivo a Dlk humana; Derecha:
inmunotinción de humano; Grado I: HE, positivo a Dlk (48 años de
edad, hombre), negativo a Dlk (39 años de edad, hombre); Grado II:
HE, positivo a Dlk (63 años de edad, hombre, negativo a Dlk (36
años de edad, hombre); Grado III: HE, positivo a Dlk (63 años de
edad, hombre), negativo a Dlk (43 años de edad, hombre).
La Figura 7 muestra la expresión de Dlk de
células HEK293 y células HEK293(hdlk) mediante análisis de
FACS. Línea de puntos: anticuerpo de IgG de control; Línea
continua: anticuerpo monoclonal anti-Dlk humana.
La Figura 8 muestra las actividades de CDC por
anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana. (A)
A células HEK293 y células HEK293(hdlk)
se añadieron respectivamente los anticuerpos a 5 \mug/ml y se
añadió suero humano normal al 25%, y las células se cultivaron
durante tres días. Se midieron las actividades de CDC por ensayo de
MTT y las actividades medidas se indican como media \pm error
típico. Los valores de absorbancia eran significativos con respecto
a los del sistema en el cual no se añadió anticuerpo (*: p <
0,01, n = 3, prueba t de Student); (B) A células
HEK293(hdlk) se añadieron respectivamente los anticuerpos y
se añadió suero humano normal al 25%, y las células se cultivaron
durante tres días. Se midieron las actividades de CDC por ensayo de
MTT y las actividades medidas se indican como media \pm error
típico. Los valores de absorbancia eran significativos con respecto
a los del sistema en el cual no se añadió anticuerpo (*: p <
0,01, n = 3, prueba t de Student).
La Figura 9 muestra las actividades de ADCC por
anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana.
A células HEK293 y células HEK293(hdlk)
se añadieron respectivamente los anticuerpos a 5 \mug/ml y se
añadieron células mononucleares de sangre periférica de un
individuo sano al 25%, y las células se cultivaron durante tres
días. Se midieron las actividades de ADCC mediante ensayo de MTT y
las actividades medidas se indican como media \pm error típico.
La proporción de efector:diana era de 10:1.
La Figura 10 muestra la expresión de Dlk de
células Huh-7 EGFP y células
Huh-7(hdlk) por análisis de FACS. Línea de
puntos: anticuerpo de IgG de control; Línea continua: anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana.
La Figura 11 muestra las actividades de CDC por
anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana. (A) A
células Huh-7 EGFP y células
Huh-7(hdlk) (clones PC14 y PC16) se añadieron
respectivamente los anticuerpos a 5 \mug/ml y se añadió suero que
contenía complemento de rata normal al 25% y las células se
cultivaron durante tres días. Se midieron las actividades de CDC
por ensayo de MTT y las actividades medidas se indican como media
\pm error típico. Los valores de absorbancia eran significativos
con respecto a los del sistema en el cual no se añadió anticuerpo
(*: p < 0,01, n = 3, prueba t de Student); (B) A células
Huh-7(hdlk) (clones PC14 y PC16), se añadió
el anticuerpo a un nivel de 0, 0,3, 1, 3, 5 ó 10 \mug/ml y se
añadió suero que contenía complemento de rata normal al 25%, y las
células se cultivaron durante tres días. Se midieron las actividades
de CDC por ensayo de MTT y las actividades medidas se indican como
media \pm error típico.
La Figura 12 es una gráfica que muestra el
efecto potenciador de la capacidad formadora de tumores por
expresión de gen de Dlk humana. (A) Formación de tumores por
células Huh-7 EGFP o por células
Huh-7(hdlk) (clon PC14) en áreas subcutáneas
de ratones atímicos. Se muestran los volúmenes tumorales (mm^{3})
a los 19 días desde el transplante; (B) Formación de tumores por
células Huh-7 EGFP o por células
Huh-7 (hdlk) (clon PC16) en áreas subcutáneas de
ratones atímicos. Se muestran los volúmenes tumorales (mm^{3}) a
los 21 días desde el transplante.
Como se describirá concretamente en los Ejemplos
a continuación, los presentes inventores descubrieron que la dlk se
expresa en adultos en las superficies de células de cáncer de hígado
con gran especificidad, y que la detección de células de cáncer de
hígado puede lograrse usando el antígeno dlk en las superficies
celulares como marcador tumoral o midiendo el ARNm del gen de dlk.
La presente invención se basa en este descubrimiento. En la
presente descripción y reivindicaciones, el término "medición"
incluye la detección, cuantificación y semicuantificación.
Se conoce la Dlk de por sí y se ha clonado el
ADNc que codifica la dlk. También se conoce la secuencia de
nucleótidos de la misma y la secuencia de aminoácidos codificada por
la misma. Por ejemplo, la secuencia de la dlk humana se describe en
los Nº de Acceso de GenBank U15979 y NM_003836 y etc. La secuencia
de la dlk de rata se describe en los Nº de Acceso de GenBank
AB046763 y D84336. La secuencia de la dlk bovina se describe en el
Nº de Acceso de GenBank AB009278. La secuencia de ADNc de la dlk
humana, así como la secuencia de aminoácidos codificada por la
misma, se muestran en las SEC ID Nº: 1 y 2 de la LISTA DE
SECUENCIAS. Además, como se describe en el Nº de Acceso de GenBank
NM_003836, se conocen una pluralidad de variantes que tienen un SNP,
y no es necesario decir que estas variantes se incluyen en la dlk.
En los aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, el dominio extracelular es
la región desde el aminoácido 24 hasta el aminoácido 304.
Puesto que la dlk se expresa en las superficies
de células de cáncer de hígado, las células de cáncer de hígado
pueden detectarse utilizándola como antígeno marcador tumoral. Las
células de cáncer de hígado incluyen células de carcinoma
hepatocelular y células de carcinoma colangiocelular, y como se
describirá concretamente en los Ejemplos a continuación, se
confirmó que la dlk se expresa en las superficies celulares de estas
dos células de carcinoma. El método de por sí para medir el
antígeno marcador tumoral en las superficies celulares es bien
conocido, y puede lograrse por diversos métodos que utilizan la
reacción de antígeno-anticuerpo entre el antígeno
marcador tumoral y un anticuerpo que experimenta la reacción de
antígeno-anticuerpo con el mismo. Como el
anticuerpo a usar, se prefiere un anticuerpo monoclonal que tenga
una especificidad elevada y uniforme. Se conoce un anticuerpo
monoclonal anti-dlk de ratón (Bibliografía no de
patente 11). Además, como se describirá concretamente, los
presentes inventores tuvieron éxito en la preparación de anticuerpos
monoclonales anti-dlk humana. Es decir, puede
establecerse un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal
anti-dlk humana por inserción de un ADNc de dlk
humana en un vector de expresión para células de mamífero,
preparación de una línea celular que exprese dlk en superficies
celulares por introducción del vector recombinante obtenido en
células de una línea celular, y establecimiento de un hibridoma
usando las células de la línea celular como inmunógeno por el
método bien conocido de Kohler y Milstein. Como alternativa, como se
ha descrito anteriormente, puesto que se conoce la secuencia de
aminoácidos del dominio extracelular de dlk y la secuencia de
nucleótidos del ADNc que la codifica, el dominio extracelular de
dlk o una parte del mismo puede prepararse fácilmente mediante un
método de ingeniería genética o mediante un método de síntesis de
péptidos. También puede prepararse un anticuerpo monoclonal
anti-dlk por el método bien conocido, usando como
inmunógeno el domino extracelular preparado de dlk o parte del
mismo como tal, o después de conjugarlo con un vehículo tal como
hemocianina de lapa californiana (KLH) o albúmina de suero bovino
(BSA). También puede usarse un fragmento de anticuerpo que tenga
propiedades de unión a antígeno, tal como un fragmento Fab o
fragmento F(ab')_{2} del
anticuerpo.
anticuerpo.
Puesto que se conocen bien métodos para medir
las células que expresan un antígeno en sus superficies celulares
usando un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo
contra el antígeno (en el caso de la presente invención, dlk) que
se expresa en las superficies celulares, pueden medirse las células
de cáncer de hígado en una muestra mediante métodos bien conocidos
usando un anticuerpo anti-dlk. Los métodos de
medición incluyen inmunotinción, métodos tipo sándwich tales como
ELISA, métodos de aglutinación tales como método de aglutinación
con látex y métodos competitivos. Cualquiera de estos métodos es
bien conocido y puede realizarse fácilmente de acuerdo con un
método convencional si se obtiene el anticuerpo a usar. Los métodos
preferidos mediante los que puede realizarse eficazmente la
detección de células de cáncer de hígado de acuerdo con la presente
invención incluyen los métodos que utilizan un separador de células
activadas por magnetismo (MACS) o citómetro de flujo, especialmente
un separador de células activadas por fluorescencia (FACS). El MACS
es un sistema para separar las células deseadas marcando las
células con partículas ultrafinas sobre las que se inmoviliza un
anticuerpo contra el antígeno de superficie celular y pasando las
células resultantes a través de una preparación de columna en un
campo magnético intenso. Mediante MACS, puesto que pueden obtenerse
células altamente puras con un alto índice de recuperación, y
puesto que pueden separarse eficazmente un gran número de células
manteniendo las funciones y la capacidad de crecimiento de las
células, se prefiere el MACS cuando las propiedades de las células
de cáncer de hígado detectadas se investigan adicionalmente. El FACS
es un aparato para separar las células marcando las células con un
anticuerpo marcado con fluorescencia, irradiando el flujo de células
emitido desde una boquilla con un haz de láser, analizando la luz
dispersada y la fluorescencia generada, cargando eléctricamente
gotas que contienen cada una una célula en la misma, y separando las
gotas en un alto campo eléctrico. Por la misma razón que el MACS,
también se prefiere usar FACS en el método de la presente
invención. Tanto el MACS como el FACS son bien conocidos en la
técnica y están disponibles en el mercado aparatos para los mismos,
de modo que pueden realizarse fácilmente si se obtiene el anticuerpo
a
usar.
usar.
La muestra que se someterá al método para
detectar antígeno dlk en superficies celulares es una muestra que
puede contener células de cáncer de hígado y, habitualmente, es una
muestra de biopsia del hígado. La muestra de biopsia puede ser una
sección tisular (en el caso de inmunotinción) o puede ser una
suspensión celular obtenida por tratamiento del tejido hepático con
una proteasa tal como colagenasa o tripsina.
Por otro lado, se ha demostrado que el domino
extracelular de Dlk, que es una proteína de membrana, se elimina
por escisión para dar una molécula soluble conocida como FA1
(Bibliografía no de patente 10). Como se describe en los Ejemplos a
continuación, los anticuerpos monoclonales anti-dlk
humana preparados por los presentes inventores experimentan una
reacción de antígeno-anticuerpo también con FA1. Por
lo tanto, por inmunoensayo de FA1 en la sangre usando un anticuerpo
anti-dlk, especialmente anticuerpo monoclonal
anti-dlk, puede lograrse el diagnóstico de cáncer
de hígado usando una muestra de sangre (suero, plasma, sangre
completa y similares) o muestra de orina. El inmunoensayo de por sí
puede realizarse fácilmente mediante los métodos convencionales
descritos anteriormente. Por ejemplo, en los casos en los que se
realiza el inmunoensayo de acuerdo con ELISA tipo sándwich, se
inmoviliza un anticuerpo anti-Dlk o un fragmento de
unión a antígeno del mismo como anticuerpo primario en una fase
sólida; el anticuerpo primario inmovilizado se hace reaccionar con
una muestra; el resultante se hace reaccionar, después del lavado,
con un anticuerpo secundario que experimenta una reacción
antígeno-anticuerpo con Dlk; y después del lavado,
se mide el anticuerpo secundario unido a la fase sólida. Marcando el
anticuerpo secundario con una enzima, sustancia fluorescente,
sustancia radiactiva, biotina o similar, el anticuerpo secundario
unido a la fase sólida puede medirse. El FA1 en una muestra de
ensayo puede cuantificarse sometiendo una pluralidad de muestras
que contiene cada una un nivel conocido de FA1 al inmunoensayo
descrito anteriormente; preparando una curva de calibración
basándose en la relación entre cada una de las cantidades medidas
del marcador y cada una de las cantidades de FA1 en muestras
patrón; y aplicando el resultado de la medición de una muestra de
ensayo que contiene una cantidad desconocida de FA1 a la curva de
calibración. Como se describirá concretamente en los Ejemplos a
continuación, puede lograrse una sensibilidad de detección tan alta
como de 1 ng/ml o menos mediante el uso de una sustancia
luminiscente (sustrato de peroxidasa fluorogénico: PIERCE). En el
método de aglutinación, se inmoviliza un anticuerpo
anti-Dlk o un fragmento de unión a antígeno del
mismo sobre partículas tales como de látex, las partículas
resultantes se hacen reaccionar con una muestra y se mide la
absorbancia. La absorbancia se mide mediante el método descrito
anteriormente para cada una de una pluralidad de muestras patrón
que contienen cada una un nivel conocido de FA1, y se prepara una
curva de calibración basándose en los resultados de medición. El
FA1 en una muestra de ensayo que contiene un nivel desconocido de
FA1 puede cuantificarse aplicando el resultado de la medición de la
muestra a la curva de
calibración.
calibración.
En el método descrito anteriormente para medir
el antígeno dlk en superficies celulares que utiliza la reacción de
antígeno-anticuerpo, en los casos en los que debe
medirse el antígeno dlk en células humanas, se prefiere, ni qué
decir tiene, el uso de un anticuerpo monoclonal
anti-dlk humana o un fragmento de unión a antígeno
del mismo.
Como se ha descrito anteriormente, puesto que
pueden usarse anticuerpos anti-dlk, preferiblemente
anticuerpos monoclonales anti-dlk, para la
detección de cáncer de hígado, tienen utilidad como agente de
diagnóstico para el cáncer de hígado.
La expresión de gen de dlk también puede
determinarse midiendo el ARNm de dlk en las células. La medición de
ARNm en las células puede realizarse por métodos convencionales. Es
decir, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos a
continuación, puede realizarse por transferencia de Northern; o por
realización de PCR con transcripción inversa
(RT-PCR), sometiendo a electroforesis el producto de
PCR y sometiendo las bandas electroforéticas resultantes a
transferencia de Southern. Como alternativa, puede medirse
amplificando directamente el ARNm por NASBA o similar, sometiendo a
electroforesis el producto amplificado y sometiendo lo resultante a
transferencia de Northern. Todos estos métodos son de por sí
métodos convencionales y los kits de reactivos y aparatos necesarios
están disponibles en el mercado. Además, puesto que se conoce la
secuencia de ADNc de Dlk, pueden diseñarse fácilmente las sondas y
cebadores requeridos en estos métodos, y también se describen
ejemplos de estos concretamente en los Ejemplos a continuación. Por
lo tanto, la medición de ARNm que codifica proteína Dlk puede
realizarse fácilmente por los expertos en la materia. Aunque cada
una de las sondas y cebadores usados en la detección o
amplificación del ARNm (o del ADNc obtenido usando el ARNm como
molde) de Dlk tiene preferiblemente una secuencia complementaria a
cualquier cadena de la ARNm o ADNc de Dlk, es posible usar una sonda
o cebador que tenga uno o más emparejamientos erróneos en un número
no superior al 10%, preferiblemente no superior al 5% de su tamaño.
Mediante el uso de un cebador que tiene dicho o dichos
emparejamientos erróneos, puede proporcionarse un sitio de
restricción deseado en el producto de amplificación. Dicho sitio de
restricción puede ser conveniente para insertar el producto de
amplificación en un vector. El tamaño de la sonda o cebador (el
tamaño de la región que hibrida con el ARNm o ADNc de Dlk) no está
limitado y no es inferior a 15 bases, preferiblemente no es
inferior a 20 bases como en los métodos convencionales. El límite
superior del tamaño no está limitado y habitualmente el tamaño no
es superior a 50 bases, preferiblemente no superior a 40 bases. En
el caso de una sonda, es apropiada una que tenga un tamaño de la
longitud completa o menos. Siempre que un fragmento de ácido
nucleico contenga una región que hibride con una región en el ARNm o
ADNc de Dlk a medir y pueda usarse como cebador o sonda, puede
unirse una secuencia no complementaria a un extremo del fragmento
de ácido nucleico. Dicha secuencia adicional puede usarse para la
unión con un marcador u otro ácido nucleico. También se describe en
la presente memoria un ácido nucleico para detectar el cáncer de
hígado que hibrida con el ARNm o ADNc de Dlk, tal como estas sondas
y cebadores.
Como se ha descrito anteriormente, el fármaco
terapéutico para el cáncer contiene como ingrediente eficaz un
anticuerpo que experimenta una reacción de
antígeno-anticuerpo con la Dlk que se expresa en
superficies de células cancerosas. Entre los anticuerpos
anti-Dlk descritos anteriormente, pueden usarse
anticuerpos anti-Dlk, cada uno de los cuales ejerce
una actividad anticancerosa contra las células cancerosas que
expresan Dlk en superficies celulares, como el anticuerpo que
experimenta una reacción de antígeno-anticuerpo con
Dlk, y se prefieren anticuerpos monoclonales que tienen una
especificidad elevada y uniforme. El anticuerpo monoclonal
anti-Dlk que ejerce una actividad anticancerosa
contra las células cancerosas que expresan Dlk en sus superficies
puede explorarse mediante el ensayo de MTT usando las células de una
línea celular que expresa Dlk, describiéndose dicho ensayo
concretamente en los Ejemplos a continuación. Puesto que dos tipos
de anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana entre
los tres tipos obtenidos de anticuerpos monoclonales
anti-Dlk humana ejercían una actividad
anticancerosa en el ensayo de MTT, puede obtenerse con
reproducibilidad un anticuerpo monoclonal anti-Dlk
que ejerza como agente anticanceroso contra las células cancerosas
que expresan Dlk en sus superficies mediante la exploración por
ensayo de MTT.
Aunque el anticuerpo puede ser uno procedente de
una especie animal diferente de la especie animal a la que se va a
administrar el fármaco terapéutico, el anticuerpo es preferiblemente
uno cuya región constante al menos es la misma región constante
(Fc) del anticuerpo de la misma especie animal a la que se va a
administrar el fármaco. Por ejemplo, en el caso de un fármaco
terapéutico a administrar a un ser humano, puede emplearse
preferiblemente un anticuerpo quimérico o un anticuerpo o un
anticuerpo humanizado cuya región constante al menos proceda de ser
humano. Mediante el uso de un anticuerpo quimérico o anticuerpo
humanizado, puede disminuirse la antigenicidad del anticuerpo y se
disminuye la aparición de una reacción de
antígeno-anticuerpo cuando se administra el
anticuerpo. Además, en los casos en los que el anticuerpo se
administra a seres humanos, mediante el empleo de un anticuerpo
cuya región constante procede de ser humano se cree que se aumenta
la actividad de ADCC. Esto es porque es necesario que la Fc del
anticuerpo se una al receptor de Fc de las células efectoras para
que pueda producirse la ADCC y, por lo tanto, es ventajoso que la Fc
encaje en el receptor de Fc en las células efectoras de la especie
animal. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo obtenido por
inmunización de un ratón con un antígeno, separación de la región
del gen del anticuerpo monoclonal obtenido, codificando dicha
región la región variable (región V) del anticuerpo que se une al
antígeno, ligación de la región separada al gen que codifica la
región constante (región C) de un anticuerpo procedente de una
célula de mieloma humana para preparar un gen quimérico, y
expresión del gen quimérico obtenido en una célula hospedadora. El
método de preparación del mismo es bien conocido y están disponibles
en el mercado varios anticuerpos quiméricos. Un anticuerpo
humanizado es un anticuerpo codificado por un gen cuya región que
codifica el sitio de unión a antígeno (CDR, región determinante de
la complementariedad) en solitario se transplanta a un gen de
anticuerpo humano, y es un anticuerpo en el que la región
procedente de ratón es aún más pequeña que en anticuerpos
quiméricos. Son bien conocidos anticuerpos humanizados y sus
métodos de preparación y en los últimos años están disponibles en
el mercado varios anticuerpos humanizados.
Como se describirá concretamente en los Ejemplos
a continuación, un anticuerpo anti-Dlk ejerce una
actividad anticancerosa al menos en presencia del complemento.
Puesto que el complemento está contenido en la sangre de un
paciente, el anticuerpo anti-Dlk funciona como
fármaco terapéutico para el cáncer como tal. En los Ejemplos a
continuación, aunque no se observó actividad de ADCC del anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana contra las células de la
línea celular de cáncer de hígado humano, presumiblemente esto se
debe a que las regiones Fc de los anticuerpos procedían de rata.
Puesto que se observa actividad de CDC, se cree que también se
ejercerá la ADCC si la región Fc se sustituye con la de ser humano.
Aunque el anticuerpo anti-Dlk puede usarse como
tal, por conjugación del anticuerpo con una toxina tal como ricina u
otro agente anticanceroso también puede lograrse la denominada
terapia con misiles biológicos.
Los cánceres curados por el fármaco terapéutico
para el cáncer son los cánceres en los que se expresa Dlk en la
superficie de las células cancerosas.
Los Ejemplos de los cánceres incluyen cáncer de
hígado tal como carcinoma hepatocelular y carcinoma colangiocelular;
carcinoma pulmonar microcítico; y neurofibromatosis tipo 1. Entres
estos cánceres, es más preferido el cáncer de hígado, tal como
carcinoma hepatocelular y carcinoma colangiocelular.
El fármaco terapéutico para el cáncer se
administra preferiblemente por medio de una vía parenteral tal como
inyección en la parte afectada, inyección intravenosa, inyección
intramuscular o similar. La dosificación al día por adulto es
habitualmente de aproximadamente 0,001 a 100 mg, preferiblemente de
aproximadamente 0,01 a 50 mg, aún más preferiblemente de
aproximadamente 0,1 a 5 mg en términos del peso del anticuerpo por 1
kg de peso corporal. La formulación puede ser una que contenga el
anticuerpo disuelto en tampón fisiológico, y puede añadirse uno o
más aditivos usados en general en el campo de la formulación de
productos farmacéuticos.
La presente invención se describirá ahora más
concretamente a modo de Ejemplos. Debe señalarse sin embargo que la
presente invención no se limita a los Ejemplos a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron cebadores de PCR basándose en la
información de la secuencia génica de la Dlk humana (Nº de acceso
de GenBank U15979). Las secuencias de los cebadores preparados eran
las siguientes:
| Cebador Directo: | 5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3' |
| Cebador Inverso: | 5'-aagcttgatctcctcgtcgccggcc-3' |
Al cebador inverso se le añadió un sitio de
restricción de Hind III. Se realizó PCR usando estos
cebadores y ADNc sintetizados a partir del ARN total (TAKAR)
preparado a partir del hígado humano de semana embrionaria 10.
Después, el producto de PCR se reveló en electroforesis en gel de
agarosa y se extrajo la banda deseada, seguido de clonación del
producto de amplificación en vector pCRII (Invitrogen)
(pCRII-hdlk). Se confirmó la existencia del ADNc
clonado de la Dlk humana por secuenciación.
En la construcción del vector de expresión, para
unir un marcador Flag al C-terminal de la Dlk
humana, en primer lugar, se insertaron oligonucleótidos que
codifican la secuencia marcadora Flag en el sitio
HindIII/SalI del vector pBluescript II SK(+)
(STRATAGENE) (Secuencias: lado directo:
5'-agcttgactacaaggacgacgatgacaagtgag-3',
lado inverso:
5'-tcgactcacttgtcatcgtcgtccttgtagtca-3')
(pBS-Flag). Después, se eliminó por escisión un
fragmento EcoRI/HindIII del
pCRII-hdlk y se insertó en el sitio
EcoRI/HindIII del vector pBS-Flag
(pBS-hdlk-Flag). Se eliminó por
escisión un fragmento EcoRI/SalI de
pBS-hdlk-Flag y se insertó en los
sitios EcoRI/XhoI del vector pcDNA3.1 (Invitrogen) y
del vector pMIG, respectivamente
(pcDNA-hdlk-Flag y
pMIG-hdlk-Flag,
respectivamente).
Para construir un vector de expresión que
expresa FA1 humano, se diseñaron y sintetizaron los cebadores
siguientes:
| Cebador Directo: | 5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3' |
| Cebador Inverso: | 5'-ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3' |
En este caso, se añadió el sitio de restricción
de XhoI al cebador inverso. Se realizó una PCR usando estos
cebadores y ADNc de dlk humana como molde, y el ADNc de FA1 humano
obtenido se clonó en el vector pCRII (Invitrogen)
(pCRII-hFA1). Se confirmó la existencia del ADNc de
FA1 humano clonado por secuenciación.
El fragmento EcoRI/XhoI que
contenía el ADNc de FA1 humano se sacó por escisión del
pCRII-hFA1 y se insertó en el sitio
EcoRI/XhoI del vector pcDNA4/Myc-His
(Invitrogen) (pcDNA4-hFA1). Este vector de
expresión contiene secuencias de marcador Myc y de marcador His en
el C-terminal y el FA1 humano se expresa en forma
de una proteína de fusión con marcador Myc y marcador His.
Las líneas celulares derivadas de cáncer de
hígado humano eran JHH-6, HLF, JHH-5
y Huh-6, y todas ellas se facilitaron por la Japan
Health Sciences Foundation.
Se realizó la introducción del gen en células
cultivadas usando reactivo LipofectAMINE-plus (GIBCO
BRL) de acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones
adjuntas.
\newpage
Se extrajo el ARN de las células de las líneas
celulares derivadas de cáncer de hígado humano usando reactivo
Trizol (Nippon Gene). Se sintetizaron los ADNc del ARN extraído
usando un kit de síntesis de primera cadena de ADNc (Amersham
Pharmacia Biotech) y la expresión de Dlk humana se analizó por PCR.
Los cebadores humanos eran los siguientes:
| Cebador Directo: | 5'-agagctcaacaagaaaacc-3' |
| Cebador Inverso: | 5'-gcgtatagtaagctctgagg-3' |
Se sometió a electroforesis en un gel
desnaturalizado con formaldehído el ARN total de tejido fetal
(TAKARA) y el ARN total extraído de las células usando reactivo
Trizol (Nippon Gene) en una cantidad de 10 \mug cada uno. Después
de transferir las bandas a una membrana de Nylon, se realizó la
hibridación con una sonda de ADNc marcada con DIG. La detección de
la sonda se realizó por quimioluminiscencia usando
CDP-star como sustrato.
El vector retroviral descrito anteriormente
(pMIG-hdlk-Flag) en el que se
incorporó el gen de dlk humana se introdujo en células BOSC23
(Pear, W. S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
8392-8396), que son células de empaquetamiento,
para preparar un retrovirus que tenga el gen de dlk humano. Se
infectaron células de la línea celular 7E2-C, que
se habían establecido previamente a partir de hígado fetal de un
ratón transgénico, que producen antígeno T grande de SV40 sensible
a temperatura (Yanai, N. et al. (1991) Exp. Cell Res. 197,
50-56) con el retrovirus producido para obtener una
línea celular 7E2-C(hdlk) que exprese
uniformemente Dlk humana.
El vector de expresión descrito anteriormente
pcDNA-hdlk-Flag se introdujo en
células HEK293 (obtenidas del Laboratory of Cell Growth and
Differentiation, Institute of Molecular and Cellular Biosciences,
Universidad de Tokio) y después de la selección con un antibiótico
G418 (geneticina, GIBCO BRL), se estableció una línea celular
HEK293(hdlk) que expresaba de forma estable Dlk humana.
Se inmunizaron ratas con células de los dos
tipos de líneas celulares descritas anteriormente como antígenos,
respectivamente, y se prepararon clones de hibridoma, cada uno de
los cuales produce un anticuerpo monoclonal
anti-Dlk humana, mediante un método convencional.
Las células de cada uno de estos clones se administraron por vía
intraperitoneal a ratones atímicos BALB/c a una dosis de 3 x
10^{6} células, respectivamente, recibiendo dichos ratones
atímicos de forma preliminar (7 días antes)
2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano), y dos
semanas después se recuperó líquido ascítico de los ratones. Los
anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana, cada uno
de los cuales se producía por cada hibridoma, se obtuvieron
sometiendo el líquido ascítico a precipitación con ácido caprílico
y a purificación con una columna de proteína G.
Las células de la línea celular
7E2-C(hdlk) descrita anteriormente se
pusieron en una placa de cultivo de 96 pocillos recubierta con
gelatina (Coming) en una cantidad de 7,5 x 10^{3} células/pocillo
y se cultivaron a 37ºC durante 2 días. Después de lavar la placa
con PBS enfriado en hielo, las células se fijaron con solución de
paraformaldehído al 4% y se trataron con solución de
Tritón-X-100 al 0,2% (marca
comercial) para preparar una placa para ELISA de células. Después
de eso, se realizó el ELISA de acuerdo con un método convencional.
Más particularmente, el ELISA se realizó de la forma siguiente. En
primer lugar, se realizó un bloqueo con solución de PBS con BSA al
1% a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, el sobrenadante
de hibridoma se añadió a la placa y la mezcla resultante se dejó
reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, seguida de lavado
de la placa 3 veces con solución de PBS-Tween 20
(marca comercial) al 0,1%. Como anticuerpo secundario, se usó
anti-IgG de rata biotinilado (producido por VECTOR)
diluido 100 veces con solución de PBS-Tween 20 al
0,1%. Después de dejar la reacción a temperatura ambiente durante 1
hora, la placa se lavó 3 veces con solución de
PBS-Tween 20 al 0,1%. Después, lo resultante se hizo
reaccionar con estreptavidina-peroxidasa de rábano
picante (producido por VECTOR) diluida 100 veces con solución de
PBS-Tween 20 al 0,1% a temperatura ambiente durante
1 hora, y después la placa se lavó 3 veces con solución de
PBS-Tween 20 al 0,1%. Se añadió una solución de TMB
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, producido por SIGMA)
como sustrato para permitir la reacción colorante y se añadió ácido
sulfúrico 1 M para detener la reacción. La absorbancia se midió con
lector de Microplacas Modelo
550(BIO-RAD).
Se desparafinaron secciones de parafina de
tejido humano normal y tejido de cáncer de hígado (Bio Chain,
carcinoma hepatocelular; Nº catálogo: T2235149-4,
Nº lote: A607070, carcinoma colangiocelular; Nº catálogo:
T2235149-2, Nº lote: A603549) y se trataron
térmicamente en solución de citrato sódico 10 mM durante 10 minutos.
Las secciones resultantes se usaron para su tinción usando los
anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana. Después de
realizar la reacción colorante con DAB
(3,3'-diaminobenzidina) como sustrato, se realizó
una tinción nuclear con hematoxilina como contratinción. Más
concretamente, estas operaciones se realizaron de la forma
siguiente. Las secciones fijadas con paraformaldehído al 4% y
embebidas en parafina se desparafinaron y se trataron térmicamente
en solución de citrato sódico 10 mM durante 10 minutos. Las
secciones resultantes se trataron con metanol al que se añadió una
solución acuosa de peróxido de hidrógeno a una concentración final
del 0,3% a temperatura ambiente durante 20 minutos para eliminar la
actividad peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones
resultantes dos veces con PBS a temperatura ambiente durante 5
minutos/lavado, se realizó el bloqueo con Block Ace (DAINIPPON
PHARMACEUTICAL) durante 30 minutos para bloquear los sitios de unión
inespecífica en los tejidos. Después, las secciones resultantes se
hicieron reaccionar con una solución del clon de anticuerpo
monoclonal anti-dlk humana 1C1 (concentración final
de 0,25 \mug/ml) diluido con Block Ace diluido 10 veces a
temperatura ambiente durante 1 hora, y después de lavar 3 veces con
PBS durante 5 minutos/lavado, las secciones resultantes se hicieron
reaccionar con anticuerpo anti-IgG de rata
biotinilado diluido 100 veces con Block Ace diluido 10 veces a
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con
PBS durante 5 minutos/lavado, se hizo reaccionar el complejo ABC
preparado por mezcla de los reactivos contenidos en el kit de ABC de
acuerdo con las instrucciones con las secciones resultantes a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar tres
veces con PBS durante 5 minutos/lavado, se realizó la coloración con
sustrato de peroxidasa (DAB al 0,02%, solución acuosa de peróxido
de hidrógeno al 0,03%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5).
Después de confirmar la coloración, las secciones se lavaron con
agua durante 10 minutos y los núcleos se tiñeron con solución de
hematoxilina Mayer (WAKO). Después de eso, las secciones se
deshidrataron con alcohol, se aclararon con xileno y se embebieron
en Entellan New (MERK JAPAN).
Por otro lado, se desparafinaron secciones de
parafina de carcinoma hepatocelular humano (CYBRDI, carcinoma
hepatocelular; Nº catálogo: CS03-01, Nº lote:
CS03-01-001-012 (23
pacientes, 63 secciones),
CS03-01-002 (63 pacientes, 63
secciones)), se hidrofilizaron y se trataron con tampón citrato 10
mM (pH 6,0) en un autoclave (121ºC, 5 minutos). Las secciones
resultantes se trataron con metanol al que se añadió una solución
acuosa de peróxido de hidrógeno a una concentración final del 0,3%
a temperatura ambiente durante 20 minutos para eliminar la
actividad peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones
resultantes 3 veces con PBS a temperatura ambiente durante 5
minutos/lavado, se realizó el bloqueo con suero de cabra al 1,5% en
PBS durante 30 minutos para bloquear los sitios de unión
inespecífica en los tejidos. Después, las secciones resultantes se
hicieron reaccionar con una solución de clon de anticuerpo
monoclonal anti-dlk humana 1C1 (concentración final
de 0,25 \mug/ml) diluida con suero de cabra al 1,5% en PBS a 4ºC
durante una noche, y después de lavar 3 veces con PBS durante 5
minutos/lavado, las secciones resultantes se hicieron reaccionar con
anticuerpo anti-IgG de rata biotinilado (VECTOR)
diluido 100 veces con suero de cabra al 1,5% en PBS a temperatura
ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBS
durante 5 minutos/lavado, se hizo reaccionar complejo ABC con las
secciones resultantes a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos/lavado, se
realizó la coloración con sustrato de peroxidasa (DAB al 0,02%,
solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 0,03%,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5). Después de confirmar la
coloración, las secciones se lavaron con agua purificada durante 10
minutos y los núcleos se tiñeron con solución de hematoxilina Mayer
(WAKO). Después de eso, las secciones se deshidrataron con alcohol,
se aclararon con xileno y se embebieron en Entellan New (MERK
JAPAN).
Se desprendieron las células de la placa de
cultivo por tratamiento con tripsina y se preparó una suspensión
celular (densidad de población celular: 5 x 10^{6} células/ml).
Después, se hicieron reaccionar 0,5 \mug de cada anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana y 100 \mul de la
suspensión celular a 4ºC durante 30 minutos. Después de lavar las
células con PBS, las células se hicieron reaccionar con
anti-IgG de rata biotinilado (VECTOR) (0,5 \mug)
y después se lavaron de nuevo con PBS. Después de hacer reaccionar
(4ºC, 30 minutos) las células resultantes con
estreptavidina-FITC (Pharmingen) o
estreptavidina-PE (Pharmingen) (0,5 \mug), las
células se analizaron con un FACSCalibur (BECTON DICKINSON).
Se introdujo un vector de expresión de FA1
Humano en células 7E2-C y el sobrenadante de cultivo
3 días después de la introducción o el hFA1 purificado del
sobrenadante de cultivo mediante el Kit His Trap HP (Amersham
Bioscience) (concentración de hFA1: 30 \mug/ml) se usó como la
muestra de detección. Se empleó ELISA tipo sándwich usando el clon
31C4 como anticuerpo de captura y el clon biotinilado 4C4 como
anticuerpo de detección para la detección. La biotinilación del
anticuerpo de detección se realizó usando el módulo de biotinilación
de proteínas ECL^{TM} (Amersham Bioscience). Más concretamente,
este ELISA tipo sándwich se realizó de la forma siguiente. En
primer lugar, el clon de anticuerpo de captura 31C4 se diluyó con
PBS a 10 \mug/ml y se añadió a una placa de 96 pocillos en una
cantidad de 100 \mul/pocillo. Después de dejar la placa reposar a
temperatura ambiente durante una noche, la placa se lavó 3 veces con
PBS y el bloqueo con leche desnatada al 2% en PBS (en lo sucesivo
denominado "MPBS al 2%") se realizó a temperatura ambiente
durante 2 horas. Después se añadió el sobrenadante de cultivo que
contenía hFA1 o hFA1 diluido con MPBS al 2% a la concentración
respectiva y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente
durante 1 hora. Después de lavar la placa 3 veces con PBS, se
añadió el clon biotinilado 4C4 como anticuerpo de detección, y se
diluyó con MPBS al 2% hasta 1 \mug/ml. Después de permitir la
reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, la placa se lavó 3
veces con solución de PBS-Tween 20 (marca
comercial) al 0,1%. Como anticuerpo secundario, se usó
anti-IgG de rata biotinilado (VECTOR) diluido 100
veces con MPBS al 2%. Después de dejar la reacción a temperatura
ambiente durante 1 hora, la placa se lavó tres veces con solución
de PBS-Tween 20 al 0,1%. Después de dejar la
reacción con estreptavidina-peroxidasa de rábano
picante (producida por VECTOR) diluida 100 veces con MPBS al 2% a
temperatura ambiente durante 1 hora, la placa se lavó 3 veces con
solución de PBS-Tween 20 al 0,1%. La reacción de
coloración se realizó añadiendo TMB
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, producido por SIGMA)
y la reacción se detuvo por adición de ácido sulfúrico 1 M. Se
midió la absorbancia con un lector de Microplacas Modelo 550
(BIO-RAD). Se midió la reacción de fluorescencia
usando Sustratos de Peroxidasa Fluorogénicos QuantaBlu (marca
comercial) (producido por PIERCE) y un Fluoroscan Ascent (producido
por THERMO LABSYSTEMS) como aparato de medición.
Los presentes inventores habían descubierto
previamente que la Dlk se expresa mucho en células hepáticas
fetales, que no se observa expresión en células hepáticas adultas y
que pueden recuperarse células madre en solitario de hígado fetal
con alta pureza usando un anticuerpo monoclonal
anti-Dlk de ratón en combinación con MACS
(separación de células con perlas magnéticas) (Bibliografía no de
patente 7, Bibliografía de patente 1). Por lo tanto, se investigó
primero si la Dlk muestra o no un patrón de expresión similar en ser
humano. Mediante análisis de transferencia de Northern de muestra
de ARN total (TAKARA) de hígado fetal humano, se observó la
expresión de Dlk humana en hígado fetal durante la 6ª a 12ª semana
de gestación (Figura 1A). También se investigó la expresión de Dlk
humana en diversos órganos fetales a la 12ª semana de gestación.
Como resultado, también se expresaba Dlk en el riñón y músculo
esquelético, además de en el hígado (Figura 1B). Por el contrario,
en tejidos adultos, no se detectó expresión de Dlk excepto para
placenta (Figura 1C), como se ha descrito anteriormente
(Bibliografía no de patente 1). Sin embargo, se ha descrito
recientemente que también se expresa FA1 en la hipófisis (Larsen,
J. B. et al. (1996) Lancet. 347, 191) y en la glándula
suprarrenal (Jensen, C. H. et al. (1993) Hum. Reprod. 8,
635-641). Por lo tanto, se demostró que en seres
humanos, aunque se observaba expresión de Dlk en el hígado en feto,
no se expresa en hígado adulto como en ratón.
Para confirmar adicionalmente los resultados
descritos anteriormente, los presentes inventores prepararon
primero anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana
(IgG de rata). Se establecieron dos tipos de células que expresaban
Dlk humana como antígenos y se inmunizaron ratas con estas células
como antígenos. Se prepararon hibridomas de acuerdo con método
convencional y se seleccionaron clones positivos por análisis de
FACS usando las células 7E2-C(hdlk) como el
antígeno y mediante ELISA de células. Se realizó además la clonación
y se establecieron tres clones estables (clones 1C1, 4C4 y 31C4).
Mediante análisis de FACS usando cada sobrenadante de cultivo de
los clones finalmente establecidos, se confirmó que cada
sobrenadante de cultivo contenía un anticuerpo monoclonal que
reacciona específicamente con Dlk humana.
Las células de cada uno de estos clones se
administraron por vía intraperitoneal a ratones atímicos BALB/c a
una dosis de 3 x 10^{6} células, respectivamente, recibiendo
dichos ratones atímicos de forma preliminar (7 días antes)
2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) y, dos
semanas después, se recuperó el líquido ascítico de los ratones.
Los anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana, cada
uno de los cuales se produjo por cada hibridoma, se obtuvieron
sometiendo los líquidos ascíticos a precipitación con ácido
caprílico y a purificación con una columna de proteína G. Cada uno
de los anticuerpos monoclonales purificados obtenidos mostraba una
actividad comparable a la observada para cada sobrenadante de
cultivo en el análisis de FACS.
Usando el clon de anticuerpo monoclonal
anti-Dlk humana obtenido 1C1, se realizó una tinción
inmunohistoquímica de tejidos fetales humanos. De acuerdo con los
resultados de transferencia de Northern, se observaron áreas
teñidas en el hígado, riñón y músculo esquelético. También se tiñó
el tejido de placenta de la misma forma, y se observó una tinción
fuerte en sincitiotrofoblastos en vellosidades.
De forma similar a los resultados en ratón,
aunque se observa expresión de Dlk humana en células de hígado
fetal inmaduro, no se observa en células de hígado adulto. Los
presentes inventores estudiaron la posibilidad de la expresión de
Dlk humana en cáncer de hígado humano. En primer lugar, se
examinaron 4 tipos de líneas celulares (JHH-6, HLF,
JHH-5 y Huh-6) derivadas de cáncer
de hígado humano mediante análisis de FACS, inmunotinción y
RT-PCR. Se realizó el análisis de FACS usando el
clon de anticuerpo monoclonal anti-Dlk humano 4C4.
Como resultado, con las líneas celulares de tipo indiferenciado
(JHH-6 y HLF), no se observó el cambio que indicaba
la expresión de Dlk humana, pero con las líneas celulares de tipo
diferenciado (JH-5 y Huh-6) se
observó el cambio (Figura 2A). como resultado de la inmunotinción,
de forma similar, se observaron áreas teñidas en las líneas
celulares diferenciadas (Figura 2B).
Después se realizó un análisis por
RT-PCR. A partir del ARN total extraído de cada una
de las líneas celulares, se sintetizaron ADNc y se realizó una PCR
usando los ADNc obtenidos como moldes. Como resultado, de forma
similar a los resultados del análisis de FACS y de la inmunotinción,
se observó expresión de Dlk humana en las líneas celulares de tipo
diferenciado. Sin embargo, mediante la RT-PCR,
también se observó una expresión de Dlk humana en las líneas
celulares de tipo indiferenciado aún cuando era débil (Figura 2C),
que no se observó en el análisis de FACS y la inmunotinción. Se
cree que la diferencia entre los resultados con las líneas celulares
de tipo diferenciado es el resultado de la diferencia en las
sensibilidades de detección.
Los resultados de los análisis de expresión de
dlk humana en líneas celulares derivadas de cáncer de hígado humano
sugieren la posibilidad de que pueda expresarse Dlk humana en tejido
de cáncer de hígado. Por lo tanto, se examinó la expresión de Dlk
humana en tejido de cáncer de hígado humano por tinción
inmunohistoquímica usando el clon de anticuerpo monoclonal
anti-Dlk humana 1C1. Como resultado, se demostró que
las partes cancerosas en el tejido de carcinoma hepatocelular y
tejido de carcinoma colangiocelular estaban intensamente teñidas
(Figura 3). En estos casos, el tejido normal adyacente a la parte
cancerosa no se teñía en absoluto. Esto indica que la Dlk no sólo
se expresa en células de hígado fetal, sino que también se expresa
por la transformación cancerosa de células de hígado adulto. Por lo
tanto, se sugirió que puede usarse la Dlk como marcador tumoral
para el cáncer de hígado.
Para determinar con precisión el índice
positividad a Dlk en el carcinoma hepatocelular, se examinaron
secciones patológicas obtenidas de varios pacientes con carcinoma
hepatocelular mediante inmunotinción usando los anticuerpos
anti-Dlk. La expresión de Dlk humana en carcinoma
hepatocelular usando una matriz de tejidos humanos se evaluó
basándose en la sección Nº 51 del Nº lote:
CS03-01-001-012 como
patrón, y los que mostraban una tinción con una intensidad
comparable a o superior al área positiva a Dlk en el patrón se
evaluaron como positivos a Dlk y los que mostraban una tinción con
menor intensidad que el patrón se evaluaron como negativos a Dlk
(Figura 5). Se examinaron tejidos de carcinoma hepatocelular de 80
pacientes o 118 secciones. En las 118 secciones patológicas
totales, 65 secciones (55%) serán positivas a Dlk. Se estudió
adicionalmente el índice de positividad para cada Grado. Como
resultado, el índice de positivos a Dlk en el carcinoma
hepatocelular de Grado I era del 82% (9/11), el del Grado
I-II era del 100% (3/3), el del Grado II era del 61%
(33/54) y el del Grado III era del 40% (20/50) (Tabla 1). Por lo
tanto, se demostró que todos los carcinomas hepatocelulares, del
tipo escasamente diferenciado al tipo altamente diferenciado, eran
ampliamente positivos a Dlk. Puesto que se observó una mayor
expresión de Dlk en carcinomas hepatocelulares escasamente
diferenciados de Grados I y II, y puesto que la Dlk surge en
hepatocitos fetales altamente proliferativos y en células ovales en
el hígado en regeneración en adultos, para las que se ha señalado
la posibilidad de que sean células precancerosas, el alto índice de
positividad a Dlk sugiere la posibilidad de que la Dlk pueda ser un
marcador tumoral de carcinoma hepatocelular en una fase temprana.
Se muestran en la Figura 6 ejemplos de las imágenes observadas de
los tejidos por tinción con hematoxilina eosina (HE) y de los
tejidos positivos a Dlk y negativos a Dlk por tinción de Dlk,
perteneciendo dichos tejidos a Grados diferentes,
respectivamente.
Debería señalarse que las fotografías originales
de las Figuras 2B, 3, 4, 5 y 6 son fotografías en color. Aunque los
resultados pueden no estar claros por los dibujos adjuntos (escala
de grises de blanco y negro), los resultados descritos
anteriormente se muestran claramente en las fotografías
originales.
Se ha demostrado que el dominio extracelular de
Dlk se escinde para producir una molécula soluble conocida como
FA1. Puesto que los anticuerpos monoclonales
anti-Dlk humana que se produjeron reconocen el
domino extracelular de Dlk, se creía que el FA1 humano podía
posiblemente ser reconocido y detectado usando el anticuerpo. Por
lo tanto, el estudio se realizó mediante ELISA usando sobrenadante
de cultivo de las células 7E2-C que expresan de
forma transitoria FA1 humano. Como resultado, se confirmó que se
detectaban señales para el sobrenadante de cultivo que contenía FA1
humano, mientras que no se detectaron señales para el sobrenadante
de cultivo de las células en las que se introdujo un vector de
control (Figura 4). Estos resultados demostraron que el anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana que se preparó puede
detectar FA1 humano.
Además, como se ha descrito anteriormente en la
sección "(10) Detección de FA1 Humano por Anticuerpos Monoclonales
Anti-Dlk humana" en "1. Materiales y
Métodos", se determinó la sensibilidad del ELISA usando proteína
FA1 humana purificada. Como resultado, mediante el uso de un
sustrato quimioluminiscente (Sustratos de Peroxidasa Fluorogénicos
QuantaBlu (macar comercial), producidos por PIERCE) y un Fluoroscan
Ascent (producido por THERMO LABSYSTEMS) como aparato de medición,
se podía detectar FA1 humano a un nivel de 1 ng/ml (Figura 4B, Tabla
2).
El "(1) Aislamiento de ADNc de dlk Humana de
Longitud Completa y Construcción de un Vector de Expresión",
"(2) Línea Celular Derivada de Cáncer de Hígado Humano", "(3)
Introducción de un Gen en Células Cultivadas", "(4)
RT-PCR" y "(5) Análisis de Transferencia de
Northern" se realizaron como en el Ejemplo 1.
Los procedimientos hasta el establecimiento de
los dos tipos de líneas celulares que expresan Dlk
7E2-C(hdlk) y HEK293(hdlk) se
realizaron como en el Ejemplo 1.
Para preparar un anticuerpo monoclonal
anti-Dlk humana, cada suspensión celular de los dos
tipos de líneas celulares que expresan Dlk
7E2-C(hdlk) y HEK293(hdlk) se mezcló
con un adyuvante de inmunización (adyuvante completo de Freund:
WAKO PURE CHEMICALS) a una proporción de 1:1, y la emulsión obtenida
se inyectó en ambas patas de una rata Wister de 6 semanas de edad
en una cantidad de 1 x 10^{7} células/pata, inmunizando de este
modo al animal. Después de dos inyecciones de refuerzo, se
recuperaron los ganglios linfáticos de ambas patas, se prepararon
los linfocitos a partir de los mismos y se realizó una fusión
celular con una línea celular de mieloma de ratón (P3X) mediante el
método de polietilenglicol. Las células fusionadas se incubaron en
un medio que contenía HAT (aminopterina, hipoxantina, timidina) en
una placa de fondo plano de 96 pocillos con CO_{2} al 5% en una
incubadora. Después del cultivo, los sobrenadantes de cultivo de los
hibridomas cultivados se sometieron a exploración mediante análisis
de FACS y ELISA de células usando líneas celulares
7E2-C(hdlk), seleccionando de ese modo los
clones positivos. Estos clones se clonaron adicionalmente para
establecer 3 tipos de hibridoma (clones 1C1, 4C4 y 31C4). Estos
hibridomas se suspendieron por separado en medio RPMI hasta una
densidad de población de 1,5 x 10^{7} células/ml. Cada una de las
suspensiones celulares se administró por vía intraperitoneal a
ratones atímicos BALB/c (Balb/c-nu/nuSlc) en una
cantidad de 200 \mul (3 x 10^{6} células), habiendo recibido
los ratones atímicos de forma preliminar
2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) 7 días
antes, y se recuperó el líquido ascítico de los ratones dos semanas
después. Los anticuerpos monoclonales anti-Dlk
humana, cada uno de los cuales se produjo por cada hibridoma, se
obtuvieron sometiendo los líquidos ascíticos a precipitación con
ácido caprílico y a purificación con una columna de proteína G. Cada
uno de los anticuerpos monoclonales purificados obtenidos mostraba
una actividad comparable a la observada para cada sobrenadante de
cultivo en el análisis de FACS.
El "(7) ELISA de Células", "(8) Tinción
inmunohistoquímica" y "(9) Análisis de FACS" se realizaron
como en el Ejemplo 1.
Se extrajo sangre venosa en presencia de
heparina de un individuo sano y, después de diluirla 2 veces con
PBS, se echó sobre Lymphoprep (DAIICHI PURE CHEMICALS), seguido de
centrifugación a 20ºC a 800 x g durante 20 minutos. Después de la
centrifugación, se recogieron células mononucleares en la fracción
intermedia y se lavaron tres veces con PBS, seguido de suspensión
en medio DMEM complementado con FCS al 10%, usándose dichas células
mononucleares como células efectoras.
Se extrajo sangre venosa de un individuo sano en
ausencia de un anticoagulante y se transfirió a un tubo de 15 ml.
La sangre se incubó en una incubadora a 37ºC durante 60 minutos y
después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos,
seguido de centrifugación a 20ºC, a 2500 rpm durante 15 minutos,
después de desprender el coágulo de la pared del tubo. Después de
la centrifugación, el suero sobrenadante se recuperó y se usó como
suero que contiene complemento. El suero calentado a 56ºC durante 30
minutos para inactivar el complemento se usó como control.
A las células cultivadas en cada pocillo de una
placa de 96 pocillos, se les añadió TetraColor ONE (SEIKAGAKU
CORPORATION) de acuerdo con el protocolo descrito en las
instrucciones adjuntas, y se dejó que se produjera la reacción en
CO_{2} al 5% en una incubadora durante 3 a 4 horas. Después de la
reacción, la placa de 96 pocillos se puso en un lector de
microplacas como estaba y se midió la absorbancia a 490 nm (longitud
de onda de control: 655 nm).
Se desprendieron células HEK293 y
HEK293(hdlk) de la placa por tratamiento con tripsina y las
células se suspendieron a una densidad de población de 1 x 10^{5}
células/ml en medio DMEM complementado con FCS al 10%, que se
usaron como células diana. Las células se inocularon en una placa de
fondo plano de 96 pocillos recubierta con gelatina a una densidad
de 1 x 10^{4} células/pocillo, y se cultivaron en presencia de
anticuerpo anti-Dlk humana 4C4 o 31C4 e IgG de rata
(0,2, 1,0 y 5,0 \mug/ml), respectivamente, durante 30 minutos.
Después, el suero usado como complemento se
añadió en una cantidad del 25% del medio de cultivo y las células
se cultivaron durante 72 horas. Después del cultivo, se midió la
absorbancia mediante el ensayo de MTT. Se calculó la absorbancia
que indicaba el número de células vivas con actividad de CDC
restando el valor medio de las células vivas en el pocillo al que
se añadió suero que contenía complemento al medio de cultivo. Se
realizó un ensayo de significación estadística mediante la prueba
t de Student.
Se desprendieron células
Huh-7EGFP y Huh-7(hdlk) de la
placa por tratamiento con tripsina y las células se suspendieron
hasta una densidad de población de 2 x 10^{5} células/ml en medio
DMEM complementado con FCS al 10%, que se usaron como células
diana. Las células se inocularon en una placa de fondo plano de 96
pocillos a una densidad de 1 x 10^{4} células/pocillo y se
cultivaron en presencia de anticuerpo anti-Dlk
humana 4C4 o 31C4 e IgG de rata (0,3, 1, 3, 5 y 10 \mug/ml),
respectivamente, durante 30 minutos. Después, el suero humano usado
como complemento se añadió en una cantidad del 25% del medio de
cultivo y las células se cultivaron durante 72 horas. Después del
cultivo, se midió la absorbancia mediante el ensayo de MTT. La
absorbancia que indicaba el número de células vivas con actividad
de CDC se calculó restando el valor medio de las células vivas en
el pocillo al que se añadió el suero que contenía complemento al
medio de cultivo. Se realizó un ensayo de la significación
estadística mediante la prueba t de Student.
Se desprendieron células HEK293 y
HEK293(hdlk) de la placa por tratamiento con tripsina y las
células se suspendieron a una densidad de población de 2 x 10^{5}
células/ml en medio DMEM complementado con FCS al 10%, que se
usaron como células diana. Las células se inocularon en una placa de
fondo plano de 96 pocillos recubierta con gelatina a una cantidad
de 1 x 10^{4} células/pocillo y se cultivaron en presencia de
anticuerpo anti-Dlk humana 1C1, 4C4 o 31C4 e IgG de
rata (5 \mug/ml) durante 30 minutos. Las células efectoras se
añadieron a las células diana a una proporción de efector:diana de
20:1, 10:1 y 5:1, respectivamente, y las células se cultivaron en
CO_{2} al 5% en una incubadora durante 72 horas. Después del
cultivo, se midió la absorbancia mediante el ensayo de MTT. La
absorbancia que indicaba el número de células vivas con actividad de
CDC se calculó restando el valor medio de las células vivas en el
pocillo en que se añadió el medio de cultivo solo como control. Se
realizó un ensayo significativo mediante la prueba t de
Student.
El vector de expresión
(pcDNA-hdlk-Flag) descrito en "1.
Materiales y Métodos, (1) Aislamiento de ADNc dlk humana de
Longitud Completa y Construcción de un Vector de Expresión" en el
Ejemplo 1, en el que se insertó el ADNc de longitud completa de dlk
humana, se introdujo en células de la línea celular
Huh-7 derivadas de cáncer de hígado humano
(obtenidas del Laboratory of Cell Growth and Differentiation,
Institute of Molecular and Cellular Biosciences, Universidad de
Tokio), y después de la selección con G418 (geneticina, GIBCO BRL),
se establecieron dos tipos de líneas celulares
Huh-7(hDlk) (clones PC14 y PC16) que
expresaban de forma estable Dlk humana. Como control, se estableció
una línea celular Huh-7 EGFP que expresa de forma
estable EGFP por introducción de un vector de expresión (PEGFP) en
el que se incorporó el ADNc de longitud completa de EGFP en células
Huh-7 y por selección con G418.
Se recogió sangre venosa de un rata macho
Std:Wister/ST de 8 semanas de edad en ausencia de un anticoagulante,
y se separó el suero que contenía complemento por el método
descrito en "1. Materiales y Métodos, (11) Separación de Suero
que Contiene Complemento Humano" en el Ejemplo 2.
Las células de los dos tipos de líneas celulares
Huh-7(hDlk) (clones PC14 y PC16) que
expresaban de forma estable Dlk humana, respectivamente, y células
de control (línea celular Huh-7 EGFP que expresa de
forma estable EGFP) se transplantaron por vía subcutánea a ratones
atímicos de 6 semanas de edad (Balb/c; nu/nu, hembra, JAPAN SLC),
en una cantidad de 3 x 10^{6} células/100 \mul
(PBS:EHS-gel = 1:1), respectivamente. Para
investigar la influencia por el gen de Dlk humana sobre la
oncogenicidad, se transplantaron por vía subcutánea células de
control en una de las regiones laterales izquierda y derecha en el
lomo del mismo individuo de ratón atímico, y las células de clon
PC14 o PC16 se transplantaron por vía subcutánea en la otra región.
Durante 3 semanas desde el transplante, se observó la formación de
tumor de las células de cáncer de hígado transplantadas
respectivas. El volumen de un tumor se midió de acuerdo con un
método convencional usando un calibrador y se calcula de acuerdo
con la ecuación:
Volumen tumoral
(mm^{3}) = \pi/6 * diámetro más largo* (diámetro más
corto)^{3}
Los resultados de "(1) Expresión de Dlk humana
en Hígado Normal Humano", "(2) Anticuerpo Monoclonal
Anti-Dlk", "(3) Expresión de Dlk Humana en una
Línea Celular derivada de Cáncer de Hígado Humano" y "(4)
Expresión de Dlk Humana en Tejido de Cáncer de Hígado Humano"
eran como se describe en el Ejemplo 1.
Usando el anticuerpo monoclonal
anti-humano preparado (clon 4C4), se realizó un
análisis de FACS en las células HEK293 y las células
HEK293(hdlk). Se confirmó que la Dlk no se expresaba en
células HEK293 en absoluto, pero se expresaba intensamente en
células HEK293(hdlk) (Figura 7).
El hecho de que la Dlk se expresa en líneas
celulares de cáncer humano y tejidos cancerosos sugiere la
posibilidad de que pueda usarse Dlk como marcador tumoral y pueda
usarse un anticuerpo monoclonal anti-Dlk humana como
anticuerpo terapéutico que se dirige a células cancerosas que
expresan Dlk. Por lo tanto, en primer lugar, se midió la
citotoxicidad por el anticuerpo y el complemento, es decir, la
actividad de CDC (Figura 8, Tablas 3.1 y 3.2). Se inocularon
células HEK293 o células HEK293(hdlk) como células diana en
una placa de 96 pocillos, y se añadió el anticuerpo
anti-Dlk humana (clon 4C4 o 31C4 se añadió a un
nivel de 5 \mug/ml) y el suero que contenía complemento, seguido
de cultivo de las células. Tres días después del comienzo del
cultivo, se ensayó la lesión de las células diana mediante el
ensayo de MTT. Como para la lesión de las células
HEK293(hdlk), se disminuyó la absorbancia y se observó una
disminución del 70 al 90% en el número de células vivas en el
sistema en el que se añadió el anticuerpo anti-Dlk a
un nivel de 5 \mug/ml, en comparación con el sistema en el que no
se añadió anticuerpo o en el que se añadió el anticuerpo de IgG de
control. En los casos en los que el cultivo se realizó en el medio
complementado con el suero que contenía complemento inactivado, la
absorbancia del sistema al que se añadió el anticuerpo
anti-Dlk humano (clon 31C4) a un nivel de 5
\mug/ml era la misma que la del sistema al que no se añadió
anticuerpo o al que se añadió el anticuerpo de control, y el número
de células vivas era aproximadamente el mismo (Figura 8A, Tabla
3.1). Además, ningún anticuerpo mostraba actividad de citotoxicidad
contra las células HEK293 que no expresaban Dlk.
La observación de células HEK293(hdlk)
bajo un microscopio puso de manifiesto que con el sistema en el que
se añadió el anticuerpo de IgG de control al suero que contenía
complemento, o en el que se añadió el anticuerpo de
anti-D1k humana (clon 31C4) al suero que contenía
complemento inactivado, las células formaron colonias y crecieron.
Por el contrario, en el sistema en el que se añadió el anticuerpo
anti-Dlk humana (clon 31C4) al suero que contenía
complemento, la mayoría de las células se dispersaron y parecían
estar muertas. Por otro lado, como para las células HEK293 que no
expresan Dlk, no se observaron células lesionadas ni siquiera en el
sistema en el que se añadió anticuerpo anti-Dlk
humana y el suero que contenía complemento.
Además, la actividad de CDC en las células
HEK293(hdlk) cuando se añadía el anticuerpo
anti-Dlk humana (clon 4C4 o 31C4) se examinó a un
nivel de 0,2, 1,0 ó 5 \mug/ml) (Figura 8B, Tabla 3.2). Por
medición de la actividad de CDC tres días después del comienzo del
cultivo por ensayo de MTT, se confirmó que el número de células
HEK293(hdlk) vivas disminuía de una forma dependiente de la
dosis de anticuerpo anti-Dlk humana, y que la
actividad del 31C4 era superior que la del 4C4. Estos resultados
indican que los anticuerpos anti-Dlk humana
preparados tienen una actividad de CDC contra las células que
expresan antígeno Dlk.
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Después, se midieron las actividades de ADCC de
los anticuerpos monoclonales anti-Dlk humana
preparados usando las células HEK293(hdlk) que expresaban
Dlk humana como células diana, y usando células mononucleares en la
sangre periférica de un individuo sano como células efectoras.
En una placa de 96 pocillos, se cultivaron
células HEK293 o HEK293(hdlk) junto con el anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana (clon 1C1, 4C4 o 31C4) y
células mononucleares de sangre periférica humana y, tres días
después, se midieron las lesiones de las células diana en cada
pocillo mediante ensayo de MTT. La proporción de efector:diana era
de 20:1, 10:1 o 5:1. Cuando la proporción de efector:diana era de
10:1, la actividad sobre células HEK293(hdlk), en las que se
añadió cualquiera de los anticuerpos anti-Dlk
humana, era similar a los casos en los que no se añadió anticuerpo
o en los que se añadió el anticuerpo de control, y la actividad
sobre células HEK293 también era similar (Figura 9, Tabla 4). En
los casos en los que la proporción de efector:diana era de 20:1 ó
5:1, las células diana no se destruyeron en el sistema en el que se
añadió el anticuerpo anti-Dlk humana. La
citotoxicidad sobre células HEK293(hdlk) por las células
efectoras por medio de cualquiera de los anticuerpos monoclonales
anti-Dlk humana no se observó.
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\newpage
La citotoxicidad por el anticuerpo y el
complemento, es decir, la actividad de CDC, se midió usando células
Huh-7EGFP y células
Huh-7(hdlk) (clones PC14 y PC16) (Figura 11,
Tabla 5). Las células se inocularon en una placa de 96 pocillos y
se añadió el anticuerpo anti-Dlk humana (se añadió
el clon 4C4 o 31C4 a un nivel de 5 \mug/ml) y el suero que
contenía complemento seguido de cultivo de las células. Tres días
después del comienzo del cultivo, se ensayó la lesión de las
células diana mediante el ensayo de MTT. Como para la lesión de las
células Huh-7(hdlk), se disminuyó la
absorbancia y se observó una disminución del 24 al 94% en el número
de células vivas en el sistema en el que se añadió el anticuerpo
anti-Dlk (clon 4C4 o 31C4) en comparación con el
sistema en el que no se añadió anticuerpo o en el que se añadió el
anticuerpo de IgG de control. Ningún anticuerpo mostraba actividad
citotóxica contra las células Huh-7 EGFP que no
expresaban Dlk (Figura 11A, Tabla 5A).
Además, se examinaron las actividades de CDC
sobre células Huh-7(hdlk) en las que se
añadió el anticuerpo anti-Dlk humana (clon 4C4 o
31C4) a un nivel de 0,3, 1, 3, 5 ó 10 \mug/ml (Figura 11B, Tabla
5B). La medición de las actividades de CDC por ensayo de MTT a los
tres días después del comienzo del cultivo puso de manifiesto que
los dos anticuerpos 4C4 y 31C4 destruían células
Huh-7(hdlk) de forma dependiente de la
dosis.
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Los anticuerpos monoclonales
anti-Dlk humana mostraban citotoxicidad dependiente
del complemento contra las células de la línea celular
Huh-7 derivada de cáncer de hígado humano, por lo
que se destruyeron las células. Puesto que la expresión de Dlk se
observa en las partes cancerosas de células de cáncer de hígado
humano, los anticuerpos monoclonales preparados son eficaces como
anticuerpos terapéuticos que destruyen las células de cáncer de
hígado que expresan Dlk. Como para el clon de anticuerpo monoclonal
anti-Dlk humano 1C1, aunque no se ha observado
actividad de CDC ni actividad de ADCC, puesto que reconoce
intensamente el antígeno Dlk en las células de las líneas celulares
de cáncer de hígado humano y en las secciones patológicas de cáncer
de hígado como se describe en "2. Resultados (4) Expresión de Dlk
Humana en Tejido de Cáncer de Hígado Humano", y puesto que la
actividad de ADCC o la actividad de CDC depende de la región
constante (Fc) del anticuerpo, puede prepararse un anticuerpo
monoclonal anti-dlk que ejerza una acción
anticancerosa por formación de un anticuerpo quimérico o anticuerpo
humanizado en el que al menos la región constante proceda de Fc
humana.
Usando el anticuerpo monoclonal
anti-humano preparado, se realizó un análisis de
FACS sobre las células Huh-7EGFP y células
Huh-7(hdlk) mediante el método descrito en
"1. Materiales y Métodos, (9) Análisis de FACS" en el Ejemplo
1. Se confirmó que la Dlk humana no se expresaba en células
Huh-7EGFP en absoluto, pero se expresaba
intensamente en células Huh-7(hdlk) (Figura
10).
Aunque se demostró que la Dlk se expresa en
líneas celulares de cáncer de hígado humano y tejidos de cáncer de
hígado, la función de Dlk en la formación de un tumor canceroso de
hígado no estaba clara. Se transplantaron por vía subcutánea
células del clon PC14 de la línea celular
Huh-7(hDlk) derivada de cáncer de hígado
humano que expresaba de forma estable Dlk humana a ratones
atímicos, y la formación de tumores se comparó con el caso en el
que se transplantaron células de control (Huh-7
EGFP). Como resultado, en los 5 individuos que recibieron
transplante, se observó un crecimiento notorio de tumor por células
del clon PC14 (Figura 12A). A los 19 días desde el transplante, el
volumen del tejido canceroso en aquellos a los que se les
transplantaron células de control era de 1271 \pm 427,5
(mm^{3}), mientras que el del tejido canceroso en aquellos a los
que se les transplantaron células de clon PC14 era de 4319,4 \pm
378,5 (mm^{3}). Se realizaron experimentos similares para células
PC16 y se observó un crecimiento notorio del tumor de nuevo en
comparación con las células de control (Figura 12B). Estos
resultados sugieren que la Dlk tiene la función de potenciar
drásticamente la formación de tumores del cáncer de hígado e
indican que la Dlk es adecuada como diana en la terapia del cáncer
de hígado.
El método para detectar el cáncer de hígado y el
fármaco de diagnóstico para el cáncer de hígado son útiles para el
diagnóstico del cáncer del hígado. El fármaco terapéutico para el
cáncer es útil para terapias de cánceres tales como el cáncer de
hígado.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido
gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a
este respecto.
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<170> PatentIn versión 3.1
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (174)..(1322)
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<212> PRT
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<212> ADN
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<223> cebador de oligoADN sintético usado
para la amplificación de ADNc de dlk humana
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<223> cebador de oligoADN sintético usado
para la amplificación de ADNc de dlk humana
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para la amplificación de ADNc de dlk humana
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtatagta agctctgagg
\hfill20
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Claims (5)
1. Uso de un anticuerpo que experimenta una
reacción antígeno-anticuerpo con la Dlk que se
expresa en las superficies de células de cáncer de hígado y que
ejerce una acción anticancerosa contra dichas células de cáncer de
hígado, para la producción de un fármaco terapéutico para el
tratamiento del cáncer de hígado.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
cual dichas células de cáncer de hígado son células de carcinoma
hepatocelular y/o células de carcinoma colangiocelular.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el cual dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el cual dichas células cancerosas son
células humanas y dicho anticuerpo es un anticuerpo Dlk
anti-humano.
5. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual dicho anticuerpo ejerce una
acción anticancerosa en presencia del complemento.
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