ES2769831T3 - Método para detectar cáncer - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar un cáncer, que comprende medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica a través de una reacción de antígeno-anticuerpo usando un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para detectar cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para detectar cáncer como CAPRINA-1 como marcador tumoral. Antecedentes de la técnica
El cáncer es la principal causa de muerte. En la actualidad, esta enfermedad se trata principalmente mediante terapia quirúrgica en combinación con radioterapia y/o quimioterapia. Debido a los avances previos en tecnología médica, el cáncer es ahora una enfermedad altamente curable si se detecta de forma temprana, en función de su tipo. Por lo tanto, existe una demanda de un método para detectar un cáncer que no suponga una carga física ni económica para los pacientes con cáncer y que se pueda lograr mediante pruebas cómodas.
Recientemente, los métodos para analizar productos tumorales, tales como marcadores tumorales, han estado ampliamente disponibles. Los productos tumorales se refieren a, por ejemplo, antígenos relacionados con tumores, enzimas, proteínas particulares, metabolitos, oncogenes, productos oncogénicos y genes supresores de tumores. El antígeno carcinoembrionario CEA, la glicoproteína CA19-9, el antígeno específico de la próstata PSA, la calcitonina (hormona peptídica producida en la glándula tiroides) y similares se explotan como marcadores tumorales en el diagnóstico de cáncer para algunos tipos de cáncer. Para muchos tipos de cáncer, sin embargo, aún no se han encontrado marcadores tumorales útiles en el diagnóstico de cáncer. Además, una gran mayoría de los marcadores tumorales conocidos actualmente están presentes solo en cantidades muy pequeñas (del orden de pg/ml) en fluidos corporales y requieren métodos de ensayo altamente sensibles o técnicas especiales para detectar estos marcadores. En estas circunstancias, puede esperarse que las puertas se abran para el uso de diagnóstico para varios tipos de cáncer si se puede proporcionar un nuevo método de prueba de cáncer capaz de detectar con gran sensibilidad varios tipos de cáncer mediante una operación cómoda.
Si bien, a pesar del reciente desarrollo de novedosas técnicas quirúrgicas o el descubrimiento de novedosos agentes anticancerosos, el tratamiento contra el cáncer existente tiene un resultado insuficientemente mejorado. Esto se debe a que no se ha establecido una técnica de diagnóstico de cáncer eficaz para muchos tipos de cáncer, a excepción de para algunos tipos de cáncer. La incapacidad de detectar temprano estos cánceres es en parte responsable de esta situación.
Con los últimos avances en biología molecular o inmunología del cáncer, se han identificado anticuerpos que reaccionan específicamente con el cáncer, fármacos de direccionamiento molecular para antígenos del cáncer relacionados con la transformación maligna o la exacerbación del cáncer, y similares, de modo que se elevan las expectativas sobre la terapia específica contra el cáncer dirigida a antígenos del cáncer.
Entre otros, una serie de fármacos de anticuerpos para el tratamiento del cáncer dirigidos a las proteínas antigénicas en las células cancerosas se han lanzado y utilizado en el tratamiento del cáncer. Estos fármacos de anticuerpos han recibido atención debido a su cierta eficacia como agentes terapéuticos específicos para el cáncer. Una gran mayoría de las proteínas antigénicas utilizadas como diana por los fármacos, sin embargo, también se expresa en células normales. Como resultado de la administración de anticuerpos, las células cancerosas, así como las células normales que expresan los antígenos resultan, por lo tanto, dañadas, lo que da como resultado reacciones adversas no deseadas. Además, los efectos del tratamiento del cáncer difieren en gran medida entre los individuos debido a diversos factores de los pacientes individuales con cáncer. Por ejemplo, cirugía, la quimioterapia o la radioterapia varían en gran medida en el tratamiento y el pronóstico según las etapas de los cánceres. Se sabe que diferentes personas tienen sensibilidades distintivas al mismo fármaco terapéutico para los cánceres. Esto indica que un determinado fármaco es eficaz para algunos pacientes, pero ineficaz para otros debido a la diversidad de individuos. Por lo tanto, en cuanto a algunos fármacos terapéuticos, su administración a pacientes con cáncer se determina midiendo de antemano la expresión de genes o proteínas relacionados con la enfermedad en los pacientes y evaluando si un fármaco en particular es eficaz para un paciente que expresa un gen o proteína en particular. Específicamente, la presencia de un antígeno cancerígeno en una muestra, por ejemplo, suero o tejido, derivado de un paciente con cáncer se analiza en la práctica clínica mediante el uso de un método de detección para evaluar un gen o proteína relacionada con la enfermedad de un cierto tipo de cáncer. A continuación, se determina la administración de un fármaco terapéutico específico para el antígeno del cáncer. Por ejemplo, los tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de intestino grueso se evalúan mediante un método de detección por EGFR con tinción inmunohistoquímica "EGFR pharm (Dako)" para predecir la eficacia de Erbitux(R) (cetuximab) para el cáncer de intestino grueso. A continuación, se determina la administración de erbitux. Adicionalmente, los tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de mama se evalúan mediante un método de detección de Her2 con tinción inmunohistoquímica "Prueba Hercep" para predecir la eficacia de Herceptin(R) (trastuzumab) para el cáncer de mama. A continuación, la aplicación de Herceptin está determinada.
Secundariamente, los animales de compañía se han criado recientemente como miembros de la familia y, a menudo, tienen estilos de vida similares a los de sus dueños. Por este motivo, desde la aparición de cánceres en animales de compañía, según se informa, se puede predecir que sus propietarios tienen un alto riesgo de desarrollar cánceres en el futuro.
Se sabe que los perros, típicos animales de compañía, envejecen 7 veces más rápido que los seres humanos. Según se informa, el número de perros actualmente criados es de aproximadamente 6,7 millones en Japón y aproximadamente 17,64 millones en EE. UU. Generalmente se dispone de vacunas contra la rabia, así como de vacunas combinadas, tales como vacunas de combinación quíntuples, séptuples u óctuples, lo que conduce a tasas reducidas de infecciones altamente letales, incluida la infección por parvovirus canino, infección del moquillo canino, infección del virus de la parainfluenza canina (tos de las perreras), infección por adenovirus canino de tipo 2 (tos de las perreras), hepatitis infecciosa canina, infección por coronavirus canino y leptospirosis. Por lo tanto, se ha aumentado la vida útil promedio de un perro, y los perros de 7 años o más representan el 35,5 % del total de perros. Las causas de muerte, tal como cáncer, hipertensión y cardiopatías están aumentando en los perros, como en los seres humanos. En Estados Unidos, aproximadamente 4 millones de perros son diagnosticados anualmente con cáncer. También en Japón, aproximadamente 1,6 millones de perros presuntamente tienen algún tumor potencial. Una exploración de revisión, sin embargo, no es muy común en animales de compañía, a diferencia de en seres humanos. Esto conduce a la detección tardía de la enfermedad. En la mayoría de los casos, sus dueños notan los síntomas de las mascotas por primera vez cuando los tumores ya se han vuelto grandes y acuden a los veterinarios. Si tales tumores grandes son malignos, incluso la terapia quirúrgica (por ejemplo, la operación quirúrgica) o la medicación con agentes anticancerosos o similares es muy a menudo demasiado tarde para curar los tumores. Los tumores que los veterinarios confirmaron como malignos generalmente se tratan con agentes anticancerosos sin cirugía. Incluso en el caso de realizar cirugía, se requiere asegurar los márgenes quirúrgicos o tomar medidas estrictas para la cirugía, como las medidas contra la propagación de la sangre o las células durante la cirugía. De forma deseable, El tratamiento con agentes anticancerosos se inicia inmediatamente después de la cirugía, y también se realiza un seguimiento a intervalos cortos. Por lo tanto, el fármaco que utiliza fármacos terapéuticos para el cáncer también es esencial para los animales de compañía afectados por cáncer. Un método de detección, si lo hubiera, para analizar un gen o una proteína relacionada con la enfermedad de un cierto tipo de cáncer se permite un tratamiento más eficaz que nunca y es ventajoso tanto para los propietarios como para los veterinarios.
La proteína 1 asociada a la proliferación y el citoplasma (CAPRINA-1) es una proteína intracelular que se sabe que se expresa en la activación o división celular de las células normales en reposo y que forma gránulos de estrés citoplasmático con ARN intracelulares para participar en la regulación del transporte y la traducción de los ARNm. Entretanto, se ha descubierto que: la CAPRINA-1 se expresa altamente en la superficie de la membrana de las células de cáncer de mama; y un anticuerpo contra la CAPRINA-1 ejerce fuertes efectos antitumorales en células de cáncer de mama (Literatura de Patentes 1). Según otro informe, la expresión de CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente puede medirse utilizando una unión de anticuerpo a CAPRINA-1 expresada en la superficie celular para detectar un cáncer y evaluar el grado del cáncer (Patente de Literatura 2). Específicamente, el informe indica que una proteína de membrana plasmática CAPRINA-1 puede servir como un objetivo para el tratamiento del cáncer o similares. Tal como se ha mencionado anteriormente, debido a la diversidad de pacientes con cáncer, se requiere probar la presencia de CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente con cáncer para determinar la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, por ejemplo, un anticuerpo. No obstante, no existe ningún informe sobre un método para detectar CAPRINA-1 para la aplicación de un fármaco terapéutico específico, o no existe ningún reactivo para detectar un cáncer utilizando una muestra derivada de un paciente con cáncer. La literatura de patentes 3, que es la técnica anterior según el Art. 54 (3) EPC, divulga un anticuerpo con secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de las SEQ ID NO: 70 y 71 de la presente solicitud.
Lista de citas
Literatura de patente
Bibliografía de patente 1: documento WO2010/016526
Bibliografía de patente 2: documento WO2010/016527
Bibliografía de patente 3: documento EP2740794
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un enfoque de detección de cáncer útil en el diagnóstico de un cáncer. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para detectar un cáncer que implique determinar la presencia y la cantidad de CAPRINA-1 en una muestra de un paciente con cáncer para determinar la administración de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 al paciente con cáncer, y un fármaco y un kit para el diagnóstico de un cáncer.
Solución al problema
Como resultado de realizar estudios diligentes, los presentes inventores han obtenido ADNc que codifican proteínas que se unen a anticuerpos presentes en el suero derivado del organismo que lleva el cáncer mediante SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivado de testículo de perro y el suero de perros portadores de cáncer, y prepararon CAPRINAs-1 de perro que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14 sobre la base de los ADNc. Los presentes inventores también han preparado CAPRINAs-1 humana que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 2 y 4 sobre la base de genes homólogos humanos de los genes obtenidos. Por consiguiente, los presentes inventores han descubierto que: los genes que codifican estas proteínas se expresan específicamente en perros y testículos humanos, respectivamente, y en células cancerosas malignas (véase el Ejemplo 1 que se menciona más adelante); y los anticuerpos monoclonales preparados utilizando, como antígenos, los polipéptidos recombinantes preparados sobre la base de las secuencias de aminoácidos de estas proteínas pueden unirse a CAPRINA-1 en varios tejidos cancerosos y dañar las células cancerosas que tienen cAp RINA-1 en su superficie. Como resultado, los presentes inventores han obtenido el hallazgo de que CAPRINA-1 puede usarse como un objetivo para el tratamiento del cáncer. Los presentes inventores han encontrado además que la CAPRINA-1 puede detectarse específicamente a partir de muestras derivadas de pacientes con cáncer mediante el uso de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Específicamente, la presente invención proporciona un método para detectar un cáncer, que comprende medir la expresión de CAPRINA-1 utilizando un anticuerpo anti-CAPRINA-1 predeterminado para la aplicación a una muestra separada de un organismo. Además, la presente invención ha establecido un método para detectar CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente con cáncer y evaluar su nivel de expresión mediante un método de ensayo inmunológico utilizando cualquiera de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente, por ejemplo, mediante ELISA para el suero derivado de pacientes con cáncer utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 predeterminado o un método de tinción inmunohistoquímica para tejidos cancerosos. Los presentes inventores también han descubierto que, como resultado de la evaluación de una muestra derivada de cáncer mediante este método, la aplicabilidad de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 a un paciente está indicada si se encuentran en el paciente la expresión de CAPRINA-1 y una alta abundancia de la misma. Sobre la base de estos hallazgos, se ha completado la presente invención.
La presente invención proporciona un método como se define en las reivindicaciones para la detección un cáncer, que se aplica a una muestra separada de un organismo, comprendiendo el método detectar CAPRINA-1 en la muestra y medir la cantidad de la misma. La presente invención también proporciona un método de diagnóstico como se define en las reivindicaciones, que comprende medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en un tejido antes de la administración de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 a un paciente, para predecir de ese modo la eficacia del mismo y revelar la aplicabilidad de un fármaco terapéutico contra CAPRINA-1 (por ejemplo, si un fármaco dirigido a CAPRINA-1, por ejemplo, un anticuerpo, puede aplicarse al paciente con cáncer). La presente invención proporciona además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en el diagnóstico de un cáncer mediante administración al cuerpo, y usos relacionados de tales anticuerpos o fragmentos, también como se define en las reivindicaciones
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención proporciona un nuevo método para detectar un cáncer, que comprende medir la expresión de CAPRINA-1 en una muestra separada de un paciente con cáncer. Como se muestra específicamente en los ejemplos mencionados más adelante, los anticuerpos preparados utilizando, como antígenos, los polipéptidos recombinantes preparados sobre la base de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 (también denominada Caprina-1 o proteína CAPRINA-1) reaccionan específicamente con CAPRINA-1 en los fluidos corporales (por ejemplo, suero) o tejidos de pacientes con cáncer. Como también se describe más adelante en los Ejemplos, la propia CAPRINA-1 se expresa específicamente en niveles altos en diversos tejidos cancerosos. La presencia y la cantidad de CAPRINA-1 en una muestra separada de un paciente con cáncer se pueden medir para detectar un cáncer. Además, la presencia o ausencia de sensibilidad a un fármaco dirigido a CAPRINA-1, tal como un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, por ejemplo, un fármaco de anticuerpos puede determinarse de antemano para seleccionar de ese modo un paciente al que se aplica este fármaco. Específicamente, la expresión y la cantidad de CAPRINA-1 pueden medirse de antemano mediante la aplicación de la presente invención a un paciente con cáncer, para proporcionar así un tratamiento más eficaz usando un anticuerpo contra CAPRINA-1.
Descripción breve del dibujo
[Figura 1] La figura 1 es un diagrama que muestra los patrones de expresión de un gen que codifica CAPRINA-1 en tejidos normales y líneas de células tumorales. El número de referencia 1 representa los patrones de expresión del gen que codifica la proteína CAPRINA-1. El número de referencia 2 representa los patrones de expresión del gen GAPDH. El panel superior muestra los resultados para tejidos normales del perro. El panel central izquierdo muestra los resultados para tejidos de cáncer de mama de perro. El panel central derecho muestra los resultados para líneas celulares de cáncer de mama humano. El panel inferior muestra los resultados para varias líneas celulares de cáncer humano.
Descripción de las realizaciones
El método para detectar un cáncer de acuerdo con la presente invención comprende medir la cantidad (nivel de expresión) de CAPRINA-1 (proteína CAPRINA-1) en una muestra separada de un organismo (muestra biológica). La medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra de un paciente con cáncer se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un método de ensayo inmunológico que implica detectar CAPRINA-1 usando un anticuerpo contra CAPRINA-1 (anticuerpo anti-CAPRINA-1). Se conocen bien en la técnica varios métodos de análisis inmunológico aplicables a la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1. Los ejemplos de los mismos incluyen análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia de Western, inmunoprecipitación, ensayo de unión molecular, ELISA y ensayo bioquímico de actividad enzimática. Los resultados de medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 mediante tal método de ensayo también pueden indicar, por ejemplo, la presencia de CAPRINA-1 en la muestra, la proporción de células que expresan CAPRINA-1, la distribución de los sitios de expresión en los tejidos y la intensidad de expresión basada en el sitio. En este contexto, el "nivel de expresión" usado en el presente documento incluye el nivel de acumulación intracelular y la abundancia de la proteína.
Los resultados de medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en la muestra se pueden clasificar en las puntuaciones que se muestran en los Ejemplos. Una puntuación más alta indica que la CAPRINA-1 está contenida en una mayor cantidad en la muestra biológica (por ejemplo, el tejido canceroso o suero de cáncer) de un paciente con cáncer. En la presente invención, el término "medición" o "ensayo" abarca todos los aspectos de detección y abordajes cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos.
La secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14 es la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 de perro. La CAPRINA-1 de perro que tiene esta secuencia de aminoácidos ha sido descubierta por SEREX usando una biblioteca de ADNc derivado de testículo de perro y suero derivado de perros portadores de cáncer, y se ha identificado a partir de la biblioteca de ADNc como un polipéptido que se une a un anticuerpo presente específicamente en el suero derivado de perros portadores de cáncer. (véase el Ejemplo 1). La propia CAPRINA-1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14 puede también analizarse como un antígeno en tejidos de perros mediante el método mencionado anteriormente para diagnosticar la presencia o ausencia de sensibilidad a un fármaco dirigido a CAPRINA-1 (véanse los Ejemplos).
En este contexto, la frase "que tiene una (la) secuencia de aminoácidos" utilizada en el presente documento significa que los residuos de aminoácidos se disponen en el orden presentado en la información predeterminada de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, por ejemplo, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2" significa un polipéptido de 709 residuos de aminoácidos de tamaño en el que los residuos de aminoácidos están unidos de acuerdo con la secuencia de aminoácidos Met Pro Ser Ala ... (snip) ... Gln Gln Val Asn como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Además, por ejemplo, el "polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2" se abrevia como "polipéptido de la SEQ ID NO: 2". Lo mismo se aplica a la frase "que tiene una (la) secuencia de nucleótidos". La expresión "que tiene" en la frase "que tiene una (la) secuencia de aminoácidos" y "que tiene una (la) secuencia de nucleótidos" puede reemplazarse por el término "que consiste en". El "polipéptido" utilizado en el presente documento se refiere a una molécula que se forma a través de los enlaces peptídicos de una pluralidad de aminoácidos, y abarca no solo una molécula polipeptídica constituida por un gran número de aminoácidos sino una molécula de bajo peso molecular que tiene un pequeño número de aminoácidos (oligopéptido o péptido) y una proteína de longitud completa. El polipéptido de acuerdo con la presente invención también abarca las proteínas de longitud completa de CAPRINA-1 que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO con número par mostradas en las SEQ ID NO: 2 a 30.
En el método de la presente invención, también se puede medir una CAPRINA-1 de mamífero adicional, distinta de la CAPRINA-1 de perro de la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, o 14. En la presente memoria descriptiva, tal CAPRINA-1 de mamífero no perro también se conoce como un "homólogo" de la CAPRINA-1 de perro. El término "CAPRINA-1" abarca CAPRINA-1 derivada no solo de los perros, sino de otros mamíferos. Los ejemplos de CAPRINA-1 de mamífero adicional que se puede medir en el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, CAPRINA-1 humana y CAPRINA-1 de gato.
Como se describe específicamente a continuación en los ejemplos, el ARNm que codifica CAPRINA-1 humano se expresa significativamente en niveles altos en testículos humanos y células cancerosas, como con la CAPRINA-1 de perro de la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14. Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana, sin embargo, no se detecta en los cuerpos de seres humanos sanos. Un anticuerpo anti- CAPRINA-1 de gato no se detecta en los cuerpos de gatos sanos, pero se detecta solo en gatos con cáncer. Por lo tanto, la aplicabilidad de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 a un mamífero distinto de perro también se puede determinar mediante la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 derivada del mamífero distinto de perro.
La secuencia de nucleótidos que codifica la CAPRINA-1 humana y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestran en la SEQ ID NO: 1 o 3 y la SEQ ID NO: 2 o 4, respectivamente, en el Listado de Secuencias. La identidad de la secuencia de CAPRINA-1 humana frente a la de CAPRINA-1 de perro es del 94 % para la secuencia de nucleótidos y del 98 % para la secuencia de aminoácidos. Dado que la identidad de secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 es tan alta como del 98 %, incluso entre perros y seres humanos, que son mamíferos relacionados genéticamente distantes entre si, muchas proteínas CAPRINA-1 no humanas y de mamífero distinto de perro tienen una identidad de secuencia alta (aproximadamente el 85 % o más alta) con la CAPRINA-1 humana o de perro. La CAPRINA-1, cuyo nivel de expresión se va a medir en el método de la presente invención puede ser, pero no está particularmente limitada a, una proteína que tiene preferentemente un 85 % o más, más preferentemente, un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 de perro o humana mostrada en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, or14.
Una sustancia antigénica, tal como una proteína, que tiene una estructura complicada con un gran peso molecular, por lo general contiene una pluralidad de epítopos que difieren en estructura en su molécula. Por lo tanto, se producen in vivo diversos tipos de anticuerpos que reconocen y se unen respectivamente a una pluralidad de epítopos en dicha sustancia antigénica. En otras palabras, los anticuerpos producidos in vivo contra la sustancia antigénica (por ejemplo, proteína) son anticuerpos policlonales, que son mezclas de tipos plurales de anticuerpos. Los anticuerpos descubiertos por los presentes inventores que están presentes específicamente en el suero derivado de organismos afectados por cáncer y que se unen específicamente a CAPRINA-1 recombinante a través de la reacción antígeno-anticuerpo también son anticuerpos policlonales. El término "anticuerpo policlonal" usado en la presente invención se refiere a un anticuerpo que se encuentra en el suero derivado de un organismo que contiene una sustancia antigénica en el cuerpo y se ha inducido en el organismo contra la sustancia antigénica.
Los ejemplos específicos de un polipéptido preferido para su uso como antígeno para obtener un anticuerpo anti-CAPRINA-1 incluyen polipéptidos de las SeQ ID NO de número par de las SEQ ID NO: 2 a 28 y fragmentos de los mismos. Particularmente, un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se obtiene usando, como antígeno, el polipéptido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 o 28 o un fragmento del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 que contiene un epítopo preferido y se une específicamente a (es decir, tiene reactividad inmunológica con) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 se utilizará preferiblemente en el método de la presente invención.
Las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO de números pares de las de las SEQ ID NO: 2 a 30 (es decir, las SEQ ID NO: 2, 4, 6, ... 28 y 30) se muestran en las SEQ ID NO con números impares de las SEQ ID NO: 1 a 29 (es decir, las SEQ ID NO: 1, 3, 5,... 27 y 29), respectivamente.
Es ampliamente conocido por los expertos en la técnica que incluso una proteína derivada de un antígeno proteico por la sustitución, deleción, adición, o inserción de un pequeño número de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína generalmente puede tener casi la misma antigenicidad que la de la proteína original. Por lo tanto, un polipéptido que tiene una secuencia derivada de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 mediante sustitución, deleción, adición y/o inserción de un pequeño número de (preferentemente 1 o varios) residuos de aminoácidos también se puede usar en la producción de un anticuerpo anti-CAPRINA, al igual que con los polipéptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO de números pares de las SEQ ID NO: 2 a 30, siempre que el polipéptido tenga un 80 % o más o un 85 % o más, preferentemente del 90 % o mayor, más preferentemente un 95 % o más, además, preferentemente un 98 % o más de identidad de secuencia de la secuencia original y se une específicamente a un anticuerpo policlonal contra CAPRINA-1 a través de la reacción antígeno-anticuerpo (de en el presente documento en adelante, este polipéptido también se conocerá como un "polipéptido modificado específicamente reactivo" por comodidad). Preferentemente, el polipéptido modificado específicamente reactivo tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 mediante la sustitución, deleción, adición, y/o inserción de 1 o varios residuos de aminoácidos. El término "varios" utilizado en el presente documento se refiere a un número entero de 2 a 10, preferentemente un número entero de 2 a 6, más preferentemente un número entero de 2 a 4. La "identidad de secuencia" utilizada en el presente documento para la secuencia de aminoácidos se refiere al porcentaje de un valor determinado dividiendo el número de residuos de aminoácidos coincidentes por el número total de residuos de aminoácidos en las alineaciones de mejor coincidencia de los residuos de aminoácidos en dos secuencias de aminoácidos a comparar. Para las alineaciones, si es necesario, una o ambas de estas dos secuencias a comparar pueden estar separadas. Dichas alineaciones de secuencia pueden llevarse a cabo utilizando un programa bien conocido, por ejemplo, BLAST, FASTA, o CLUSTAL W (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; y Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).
Veinte tipos de aminoácidos que constituyen una proteína natural se pueden dividir de acuerdo con propiedades similares en los siguientes grupos: aminoácidos neutros que tienen una cadena lateral polar baja (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met y Pro); aminoácidos neutros que tienen una cadena lateral hidrofílica (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr y Cys); aminoácidos ácidos (Asp y Glu); aminoácidos básicos (Arg, Lys e His); y aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp e His). Se sabe que la sustitución dentro de cada uno de estos grupos, es decir, sustitución conservadora, no cambia las propiedades del polipéptido en la mayoría de los casos. Por lo tanto, en el caso de la sustitución de los residuos de aminoácidos de CAPRINA-1, un miembro de cada uno de estos grupos puede estar sustituido por otro miembro del mismo grupo, de modo que la actividad de unión contra el anticuerpo apropiado es probable que se mantenga. En la presente invención, sin embargo, la forma modificada puede tener una sustitución no conservadora siempre que la forma modificada tenga una actividad inductora de inmunidad equivalente o sustancialmente equivalente a la de la forma no modificada.
El polipéptido utilizado en la presente invención se puede sintetizar de acuerdo con métodos de síntesis química, por ejemplo, los métodos de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentaron Course en inglés) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japón), 1981). Asimismo, el polipéptido se puede sintetizar por métodos de rutina usando varios sintetizadores de péptidos disponibles comercialmente. Como alternativa, el polipéptido se puede preparar fácilmente utilizando métodos de ingeniería genética conocidos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.). Por ejemplo, el ARN se extrae de un tejido que expresa un gen que codifica la CAPRINA-1 humana de la SEQ ID NO:2 o un homólogo de la misma. A partir de este ARN, el ADNc del gen se prepara mediante RT-PCR. El ADNc de longitud completa o un fragmento parcial deseado del mismo se incorpora en los vectores de expresión, que después puede transferirse a las células huésped para obtener el polipéptido de interés. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc que codifican las proteínas cAp RINA-1 de perro de las Se Q ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14 se muestran en las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 y 13, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc que codifican las proteínas CAPRINA-1 humanas de las SEQ ID NO: 2 y 4 como homólogos humanos de los mismos se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente. Por lo tanto, los cebadores para su uso en la RT-PCR se pueden diseñar fácilmente con referencia a estas secuencias de nucleótidos. Tal como se menciona más adelante, un gen que codifica la CAPRINA-1 de mamífero no humano se puede amplificar con cebadores diseñados con referencia a la secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NO: con números impares de las SEQ ID NO: 5 a 29. Por lo tanto, el ADNc que codifica, por ejemplo, la CAPRINA-1 de gato, también se puede preparar fácilmente con el mismo enfoque que el anterior. La extracción de ARN, RT-PCR, la incorporación del ADNc en vectores, y la transferencia de los vectores a las células huésped puede llevarse a cabo, por ejemplo, por métodos conocidos como se describe a continuación. Asimismo, los vectores o células huésped utilizados son bien conocidos, y varios productos están disponibles comercialmente.
Las células huésped pueden ser cualquier célula capaz de expresar el polipéptido anterior. Los ejemplos de células procariotas incluyen E. coli. Los ejemplos de células eucariotas incluyen: células de mamíferos cultivadas, tales como células de riñón de mono COS1, células de ovario de hámster chino CHO, una línea celular de riñón embrionario humano HEK293 y una línea celular de piel embrionaria de ratón NIH3T3; y levadura en germinación, células de levadura de fisión, células de gusano de seda y células de huevo de Xenopus.
En caso de usar células procariotas como células huésped, los vectores de expresión usados tienen un origen que permita la replicación en las células procariotas, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonación múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxótrofo, etc. Los ejemplos de vectores de expresión para E. coli pueden incluir la serie pUC, pBluescript II, sistemas de expresión pET y sistemas de expresión pGEX. El ADN que codifica el polipéptido anterior puede incorporarse en dichos vectores de expresión, con los que posteriormente se transforman las células huésped procariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped procariotas. A este respecto, El polipéptido puede expresarse como una proteína de fusión con una proteína adicional. En este contexto, se puede obtener el ADN que codifica el polipéptido anterior, por ejemplo, mediante la preparación de ADNc mediante RT-PCR como se ha mencionado anteriormente. Como alternativa, el ADN se puede sintetizar mediante métodos de rutina utilizando sintetizadores de ácido nucleico disponibles en el mercado como se menciona más adelante. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc de los genes que codifican las proteínas CAPRINA-1 de las SEQ ID NO: 2 y 4 se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente, en el Listado de Secuencias.
En caso de usar células eucariotas como células huésped, se pueden usar vectores de expresión para células eucarióticas que tengan un promotor, una región de cote y empalme, un sitio de adición de poli (A), etc. se utilizan como vectores de expresión. Ejemplos de tales vectores de expresión pueden incluir los vectores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMv, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De la misma manera que anteriormente, el ADN que codifica el polipéptido anterior utilizado en la presente invención puede incorporarse en dichos vectores de expresión, con los que posteriormente se transforman las células huésped eucariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped eucariotas. En el caso de utilizar vectores de expresión tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl o pEGFP-Cl, el polipéptido puede expresarse como varias proteínas de fusión marcadas con el marcador His (por ejemplo, (His)6 a (His)-io), el marcador FLAG, el marcador myc, el marcador HA, GFP o similares.
Los vectores de expresión se pueden transferir a las células huésped mediante métodos bien conocidos, tales como electroporación, un procedimiento de fosfato de calcio, un procedimiento de liposomas, un procedimiento de DEAE dextrano, microinyección, infección viral, lipofección y unión con péptidos que penetran en las células.
El polipéptido de interés puede aislarse y purificarse a partir de las células hospedadoras mediante una combinación de operación de separación conocidos en la materia. Sus ejemplos incluyen el tratamiento con un desnaturalizante (por ejemplo, urea) o un tensioactivo, ultrasonidos, digestión enzimática, extracción por saturación de sal, fraccionamiento y precipitación de disolventes, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de isoelectroenfoque, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía de fase inversa.
Los polipéptidos obtenidos mediante estos métodos también incluyen sus formas de proteínas de fusión con otras proteínas arbitrarias. Sus ejemplos pueden incluir proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST) o marcador His. Dichos polipéptidos en forma de proteínas de fusión también están abarcados por el polipéptido añadido específicamente reactivo mencionado anteriormente. Los polipéptidos expresados en células transformadas pueden sufrir varias modificaciones intracelulares después de la traducción. Dichos polipéptidos modificados postraduccionalmente pueden usarse siempre que estos polipéptidos tengan actividad de unión contra el anticuerpo policlonal contra CAPRINA-1. Los ejemplos de dichas modificaciones postraduccionales pueden incluir la eliminación de la metionina N-terminal, acetilación N-terminal, glicosilación, degradación limitada mediada por proteasa intracelular, miristoilación, isoprenilación y fosforilación.
La CAPRINA-1 como se mencionó anteriormente o un fragmento de la misma puede usarse como un antígeno para preparar un anticuerpo anti-CAPRINA-1. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 usado en la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o puede ser un anticuerpo monoclonal. Se prefiere más un anticuerpo monoclonal.
En el método de la presente invención, un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se une específicamente a (que tiene reactividad inmunológica con) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 66, entre los anticuerpos anti-CAPRINA-1 obtenidos como se menciona anteriormente, puede usarse preferiblemente en análisis tales como la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1. Dicho anticuerpo anti-CAPRINA-1 puede unirse a CAPRINA-1 humana o de perro (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquier SEQ ID NO de número par de las s Eq ID NO: 2 a 28) o una homóloga de la misma (por ejemplo, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o mayor con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NO de número par de las SEQ ID NO: 2 a 30) como diana.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 66 se puede obtener como un anticuerpo policlonal: inmunizando un animal con la CAPRINA-1 anterior o un fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 y explorando los anticuerpos policlonales producidos en cuanto a la reactividad inmunológica con el polipéptido de la SEQ ID NO: 66. Alternativamente, el anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 66 también se puede obtener como un anticuerpo monoclonal: inmunizando un animal con la CAPRINA-1 anterior o el fragmento de la misma; preparando hibridomas productores de anticuerpos monoclonales usando sus inmunocitos, tales como células de bazo; y explorando adicionalmente en cuanto a un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con el polipéptido de la SeQ ID NO: 66.
El animal a inmunizar puede ser cualquier animal no humano que tenga células de bazo o similares, que permitan la preparación de células de hibridoma. Los ejemplos de los mismos incluyen ratones, ratas, hámsteres, conejos y pollos. Más preferiblemente se puede usar un ratón.
El método de inmunización implica inmunizar al animal con, por ejemplo, CAPRINA-1 o un fragmento de la misma conjugada con una proteína portadora, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH, forma siglada de keyhole limpet hemocyanin), caseína o seroalbúmina como inmunógeno, junto con un adyuvante para inducir de este modo un anticuerpo contra CAPRINA-1. Más específicamente, la CAPRINA-1 anterior o un fragmento de la misma se administra por vía subcutánea o intraperitoneal varias veces junto con un adyuvante a, por ejemplo, un ratón de 4 a 10 semanas de edad. Después de la confirmación de un título elevado de anticuerpos en sangre, solo se administra al ratón para un refuerzo CAPRINA-1 o un fragmento de la misma por vía intravenosa o intraperitoneal. En los días 3 a 10, se pueden recoger sangre, ascitis o células de bazo. En este caso, el suero obtenido de la sangre recogida, o la ascitis, contiene anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos anti-CAPRINA-1. Los anticuerpos policlonales obtenidos pueden explorarse mediante métodos de rutina tales como cromatografía de afinidad en cuanto a la unión al polipéptido de la SEQ ID NO: 66, para seleccionar un anticuerpo que tenga reactividad inmunológica con el polipéptido de la SEQ ID NO: 66.
Los ejemplos del adyuvante pueden incluir los adyuvantes completos de Freund, adyuvantes incompletos de Freund, mezclas de gel de hidróxido de aluminio y vacuna contra la tos ferina, adyuvante MPF TDM (Sigma-Aldrich Corp.), Titer Max Gold (Vaxel Inc.) y adyuvante Ge RBU (GERBU Biotechnik GmbH).
El título de anticuerpos en la sangre se puede medir: recogiendo sangre del plexo venoso ocular o la vena de la cola del animal inmunizado y examinando la presencia o ausencia del anticuerpo reactivo con CAPRINA-1 en la sangre obtenida mediante un método de ensayo inmunológico.
Las células de bazo se pueden recoger de 3 a 10 días después del refuerzo del animal inmunizado que se ha encontrado que tiene un título elevado de anticuerpos en sangre y luego se refuerza, y se fusiona con células de mieloma para preparar células de hibridoma capaces de crecer de forma autónoma. Estos hibridomas pueden explorarse en cuanto a células de hibridoma que produzcan anticuerpos que tengan la especificidad de interés para preparar anticuerpos monoclonales en grandes cantidades.
Para la fusión celular, por ejemplo, pueden usarse SP2/0, P3-X63Ag8-Ul (P3-U1), P3-X63-Ag8653 (653), P3-X63-Ag8 (X63) o P3/NSl/l-Ag4-l (NS1) como las células de mieloma. Estas líneas celulares están disponibles en, por ejemplo, la ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures) o Riken BioResource Center.
La fusión celular de las células de bazo con las células de mieloma se puede llevar a cabo: lavando las células de ambas líneas; luego mezclando las células de mieloma y las células de bazo en una proporción de 1:1 a 10 y añadiendo a las mismas polietilenglicol o alcohol polivinílico, que tiene un peso molecular promedio de 1000 a 6000 como un promotor de la fusión, o usando un aparato de fusión celular disponible en el mercado basado en estimulación eléctrica (por ejemplo, electroporación).
Después de completar el tratamiento para la fusión celular, las células fusionadas se lavan mediante suspensión en un medio y se clonan mediante un método de dilución limitante o mediante un método de formación de colonias en un medio con metilcelulosa. En este contexto, los ejemplos del método de dilución limitante pueden incluir un método que implica, por ejemplo, diluir las células a 103 a 107 células/ml y luego inocular la dilución a 102 a 106 células/pocillo en una microplaca de 96 pocillos para cultivo de células, seguido por el cultivo de las células.
El medio de cultivo para la clonación de células de hibridoma se complementa preferiblemente con un complemento de HAT, para obtener selectivamente solo las células fusionadas de interés. Más específicamente, las células de hibridoma de interés se pueden obtener y clonar de acuerdo con los métodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) o Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman y Company, 1980).
La exploración de las células de hibridoma que producen el anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 se puede realizar de la siguiente manera: por ejemplo, CAPRINA-1 o un fragmento de la misma se inmoviliza en un portador, a lo que luego se añade el sobrenadante del cultivo (que contiene anticuerpos anti-CAPRINA-1 producidos por las células de hibridoma) de cada línea celular de hibridoma. Después de la reacción en condiciones de 4 a 37 °C durante un tiempo suficiente para formar un complejo de anticuerpo/antígeno, un anticuerpo secundario marcado con, por ejemplo, una enzima, un colorante o un radioisótopo se pone en contacto con el complejo de anticuerpo/antígeno formado y se hace reaccionar en condiciones de 4 a 37 °C durante un tiempo lo suficientemente largo como para formar un complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo secundario. La presencia o ausencia del complejo anticuerpo/antígeno/anticuerpo secundario formado se detecta adicionalmente usando una señal procedente de la enzima, colorante o marcador de radioisótopo en el anticuerpo secundario como indicador. Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se confirma que forma el complejo puede seleccionarse como el anticuerpo de interés, de forma que se seleccionan las células de hibridoma que producen este anticuerpo de interés.
Las células de hibridoma así seleccionadas se usan para condicionar un medio sin suero y se pueden preparar anticuerpos monoclonales a partir del sobrenadante de cultivo resultante. Para la preparación a gran escala de anticuerpos monoclonales se administra, por ejemplo, 0,5 ml de pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) por vía intraperitoneal a un ratón desnudo o ratón SCID de 6 a 8 semanas de edad. Después de su crianza durante 2 semanas, se administran por vía intraperitoneal las células de hibridoma a una dosis de 5 x 106 a 2 x 107 células/ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a partir de ascitis generada por crianza durante 10 a 21 días.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 así obtenido, que tiene reactividad inmunológica con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede usarse en la presente invención. El fragmento de unión a antígeno del anticuerpo significa cualquier fragmento de anticuerpo que conserva la capacidad de unirse al antígeno. Los ejemplos de los mismos incluyen Fv, scFv, Fab, Fab' y F(ab)2. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 o el fragmento de unión a antígeno puede conjugarse con un metal tal como manganeso o hierro.
En el método de la presente invención, se analiza la CAPRINA-1 que puede estar contenida en la muestra obtenida de un organismo (muestra biológica). Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha descubierto que las células cancerosas tienen un nivel de expresión (nivel de acumulación) significativamente alto de CAPRINA-1 como antígeno. La propia CAPRINA-1 puede analizarse en células cancerosas o en tejidos cancerosos para determinar así la aplicabilidad de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 en pacientes con un alto nivel de expresión de CAPRINA-1. Esto es como se describe específicamente a continuación en los Ejemplos.
El polipéptido en la muestra biológica puede analizarse fácilmente, como se menciona anteriormente, mediante un método de ensayo inmunológico bien conocido basado en una reacción antígeno-anticuerpo utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo. Como se menciona anteriormente, no solo la CAPRINA-1 de perro de la SEQ ID NO:6, sino sus homólogos en otros mamíferos, por ejemplo, CAPRINA-1 de un mamífero distinto de perro (por ejemplo, la CAPRINA-1 humana de la SEQ ID NO: 2 o 4, o la CAPRINA-1 de gato), pueden analizarse utilizando un anticuerpo con capacidad de una reacción antígeno-anticuerpo con, por ejemplo, la CAPRINA-1 de la SEQ ID NO: 6, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, debido a la reactividad cruzada de los anticuerpos.
El organismo del que deriva la muestra biológica o al que se aplica el método de la presente invención es un mamífero y es preferiblemente un ser humano, un perro o un gato.
Los ejemplos de la muestra biológica que se somete al método de la presente invención normalmente incluyen, aunque sin limitación, a fluidos corporales, tejidos y células. El "fluido corporal" usado en el presente documento se refiere a una muestra biológica en estado líquido. Los ejemplos de los mismos incluyen sangre (incluyendo suero, plasma y líquido intersticial), linfa, ascitis, derrame pleural, líquido cefalorraquídeo, esputo, fluido lagrimal, secreción nasal, saliva, orina, fluido vaginal y semen. Adicionalmente, el fluido corporal puede incluir, por ejemplo, lavados peritoneales con solución salina. El fluido corporal utilizado como muestra biológica en la presente invención es, preferiblemente, suero, plasma, ascitis o derrame pleural.
Por ejemplo, el nivel de expresión de CAPRINA-1 en la muestra biológica se mide usando el anticuerpo anti-CAPRINA-1. Si el nivel de expresión es más alto (preferiblemente, desde el punto de vista estadístico, significativamente más alto) que el de un individuo sano, esta muestra biológica está indicada para contener células cancerosas o tejidos cancerosos. En la presente invención, el "individuo sano" se refiere a un individuo normal no afectado por cáncer de la misma especie de organismo que el sujeto de análisis.
De acuerdo con una realización, el anticuerpo anti-CAPRINA-1 puede analizarse inmunohistoquímicamente para determinar su reactividad con CAPRINA-1 en una muestra de tejido, mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, usando una sección congelada fijada en paraformaldehído o acetona o una sección de tejido incrustada en parafina fijada en paraformaldehído, tal como un tejido obtenido de un paciente durante una operación quirúrgica o de un animal que porta un tejido de xenoinjerto inoculado con una línea celular que expresa CAPRINA-1 de forma espontánea o después de la transfección.
El nivel de expresión (nivel de acumulación o abundancia) de CAPRINA-1 en la muestra teñida inmunohistoquímicamente, de este modo, puede determinarse cuantitativamente por puntuación numérica basada en patrones de tinción. Dos o más puntuaciones se establecen preferentemente. En el aspecto más preferido, los patrones de tinción se clasifican en 4 puntuaciones. Por ejemplo, la CAPRINA-1 expresada en la superficie de las células cancerosas se tiñe mediante un método de tinción inmunohistoquímica habitual, y se le asigna cualquiera de las 4 puntuaciones que reflejan su patrón de tinción. En dicho caso, cada puntuación se establece de la siguiente manera.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.
Este sistema de puntuación está especificado por la Sociedad Americana de Oncología Clínica (EE. UU.) y aprobado por la Sociedad Japonesa de Patología (Japón). Un sistema de puntuación similar también se explota en "HercepTest" para determinar cuantitativamente la abundancia de un antígeno del cáncer Her2 en muestras de pacientes. La cuantificación de Her2 se especifica mediante las pautas de prueba de ASCO/CAP Her2. En Japón, el comité patológico para trastuzumab también especifica una guía para las pruebas de Her2 que incluye este sistema de puntuación.
La proporción de células cancerosas teñidas después de la tinción inmunohistoquímica como se indica en cada puntuación puede determinarse mediante: recuento de al menos 500 células en el campo de visión usando un microscopio de luz con sensibilidad aumentada a 4 veces, 10 veces o 20 veces; medición de células que muestran imágenes de tinción de sus membranas celulares como se describe en cada puntuación; y cálculo de prueba según la siguiente expresión.
El número de células positivas/El número total de células (aproximadamente 500 células) x 100
En estos criterios de puntuación, se puede determinar que las muestras biológicas con puntajes 2 y 3 contienen tejidos cancerosos que expresan CAPRINA-1.
Para la tinción inmunohistoquímica, la reacción antígeno-anticuerpo del anticuerpo anti-CAPRINA-1 se puede visualizar por varios métodos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CAPRINA-1 se hace reaccionar con un anticuerpo secundario marcado con una enzima, tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina, y puede inducirse la reacción (por ejemplo, reacción de color, quimioluminiscencia o fluorescencia química) de la enzima para de ese modo visualizar la unión del anticuerpo anti-CAPRINA-1 a CAPRINA-1. En el marcaje del anticuerpo secundario se puede usar un marcador fluorescente, un marcador de radioisótopo, un marcador de biotina o similar.
Se ha encontrado que CAPRINA-1 es una proteína de membrana plasmática que se expresa en la superficie de las células cancerosas. Dado que los organismos contienen muchas enzimas proteolíticas, la región extracelular de CAPRINA-1 que se expresa en las células cancerosas en el cuerpo de un paciente con cáncer se separa de las células cancerosas tras la degradación. La región extracelular separada de este modo está, por lo tanto, presente en cantidades más grandes en el exterior de las células, en comparación con la región intracelular de la CAPRINA-1. En consecuencia, la CAPRINA-1 presente no solo en tejidos cancerosos sino también en fluidos corporales o poblaciones celulares derivadas de individuos aquejados de cáncer (por ejemplo, tejidos cancerosos fijados en portaobjetos de vidrio o en el suero de pacientes con cáncer) puede detectarse mediante la detección de CAPRINA-1 usando un anticuerpo anti-CAPRINA-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unirse más fuertemente a la región extracelular de CAPRINA-1 presente en la superficie de las células cancerosas. Por lo tanto, en la presente invención, se usa preferiblemente un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se une a una porción de la proteína CAPRINA-1 que se expresa en la superficie de las células cancerosas (región extracelular de CAPRINA-1). Los ejemplos del péptido parcial de CAPRINA-1 reconocido por tal anticuerpo incluyen péptidos parciales que consisten en una secuencia en regiones extracelulares en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO de números pares de las SEQ ID NO: 2 a 30 en el Listado de secuencias, excepto para las SEQ ID NO: 6 y 18. Dicha secuencia en estas regiones extracelulares corresponde a una secuencia de 7 o más aminoácidos consecutivos en la región de restos de aminoácidos (aa) 50 a 98 o restos de aminoácidos (aa) 233 a 344 basándose en la SEQ ID NO: 2 como referencia. Específicamente, tal anticuerpo anti-CAPRINA-1 preferido se une a un péptido parcial de CAPRINA-1 que comprende, por ejemplo, una secuencia en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 61 y 62, ubicadas en la región extracelular de CAPRIN -1 expresada en células cancerosas. Además, un anticuerpo anti-CAPRINA-1 particularmente usado de forma preferida se une a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 80 % o más, preferiblemente 85 % o más, más preferiblemente el 90% o más, más preferiblemente el 95 % o más de identidad de secuencia con cualquier de estas secuencias de aminoácidos. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en el método de la presente invención, que se une específicamente a (tiene reactividad inmunológica con) el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, puede unirse a la región extracelular de Ca Pr INA-11. Por lo tanto, CAPRINA-1 puede detectarse con alta sensibilidad mediante el uso del método de la presente invención. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se une específicamente a (que tiene reactividad inmunológica con) el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 es además, preferiblemente, un anticuerpo (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71, o un fragmento de unión a antígeno de las mismas.
El cáncer que se detectará mediante el método de la presente invención es un cáncer que sobreexpresa CAPRINA-1 y los ejemplos del mismo incluyen, aunque sin limitación, cáncer de mama, tumor cerebral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de bazo, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de piel, cáncer de ovarios, cáncer de útero (cáncer del cuello uterino y cáncer del cuerpo uterino), cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de testículo y osteosarcoma. Otros ejemplos de los mismos pueden incluir, aunque sin limitación, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, diversos tipos de adenocarcinomas, cáncer hepatocelular, cáncer de células basales, tumor gingival parecido a acantoma, masa tumoral en la cavidad oral, cáncer de glándula perianal, masa tumoral del saco anal, adenocarcinoma apocrino del saco anal, carcinoma de células de Sertoli, cáncer de vestíbulo vaginal, cáncer sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, cáncer de glándula sudorípara, adenocarcinoma en la cavidad nasal, adenocarcinoma de la nariz, adenocarcinoma bronquial, cáncer ducal, cáncer de glándula mamaria, carcinoma complejo mamario, tumor maligno mixto de la glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, condrosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma histiocítico, mixosarcoma, sarcoma primitivo, cáncer del pulmón, mastocitoma, leiomioma cutáneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma del órgano digestivo, linfoma de células pequeñas/medianas, tumor medular suprarrenal, tumor de células granulosas y feocromocitoma.
En el método de la presente invención, si el nivel de expresión de CAPRINA-1 medido es más alto (preferentemente, desde el punto de vista estadístico, significativamente más alto) que el de un individuo sano, se indica la presencia de un cáncer que puede unirse específicamente por el anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en la medición (es decir, un cáncer al que se puede dirigir el anticuerpo como fármaco terapéutico para el cáncer) en el organismo (individuo) del cual se deriva la muestra biológica. Basándose en esto, el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica derivada de un paciente con cáncer puede medirse mediante el método de la presente invención y compararlo con el de un individuo sano para determinar si un fármaco dirigido a CAPRINA-1 es aplicable al cáncer en el paciente (por ejemplo, si el anticuerpo puede atacar el cáncer en el paciente como un fármaco terapéutico para el cáncer).
Por lo tanto, la presente invención permite una identificación de un paciente con cáncer que puede esperarse que obtenga efectos terapéuticos mediante la administración de un fármaco dirigido a CAPRINA-1 que incluye un anticuerpo dirigido contra CAPRINA-1 y, por lo tanto, la provisión un tratamiento más eficaz contra el cáncer.
De acuerdo con una realización, la presente invención se refiere a un método para seleccionar un fármaco terapéutico específico individual para un cáncer, que comprende: medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica utilizando un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:66; y, si el nivel de expresión es más alto (preferentemente, desde el punto de vista estadístico, significativamente más alto) que el de un individuo sano, seleccionar un fármaco dirigido a CAPRINA-1, preferentemente un anticuerpo que tenga reactividad inmunológica con CAPRINA-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como un fármaco terapéutico para un cáncer adecuado para la administración al individuo del cual se deriva la muestra biológica. Esta selección del fármaco terapéutico específico para un cáncer se realiza mediante el llamado fármaco hecho a medida, que ofrece una terapia contra el cáncer optimizada para un paciente individual.
El término "estadísticamente significativo" usado en el presente documento significa que la diferencia cuantitativa tratada estadísticamente entre los dos es una diferencia significativa. Específicamente, sus ejemplos incluyen el caso en el que un nivel de significación es inferior al 5%, 1 % o 0,1 %. El método de verificación no está particularmente limitado siempre que el método sea conocido en la técnica y sea capaz de determinar la presencia o ausencia de importancia. Por ejemplo, se puede utilizar una prueba t de Student o un método de prueba de comparación múltiple.
La presente invención también proporciona un fármaco o kit para el diagnóstico de un cáncer, que comprende, como reactivo, un anticuerpo anti-CAPRINA-1 (particularmente, un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para uso en la medición de la expresión de CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención. En este caso, el fármaco o kit para el diagnóstico de un cáncer puede comprender, además, por ejemplo, diversos aditivos útiles en la estabilización, o similares, del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 o el fragmento de unión a antígeno puede conjugarse con un metal, tal como manganeso o hierro. Dicho anticuerpo conjugado con metal o fragmento de unión a antígeno, cuando se administra al cuerpo, se acumula en un sitio que contiene una mayor cantidad de la proteína antigénica. Por consiguiente, la presencia de células cancerosas que producen la proteína antigénica puede detectarse mediante la medición del metal por RMN, o similar.
Ejemplos
A partir de ahora en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por estos ejemplos. Ejemplo 1: Análisis de la expresión de CAPRINA-1 en cada tejido
La expresión del gen de CAPRINA-1 en tejidos normales humanos y de perro, y diversos tejidos cancerosos, y líneas celulares de cáncer se examinó mediante RT-PCR de acuerdo con el Ejemplo 1 (4) del documento WO2010/016526. Como resultado, su fuerte expresión se observó en el testículo entre los tejidos normales del perro sano. Asimismo, la expresión se observó en tejidos de cáncer de mama de perro (Figura 1) y de adenocarcinoma. Adicionalmente, la expresión del gen también se confirmó en tejidos humanos. Como resultado, la expresión se confirmó solo en el testículo entre los tejidos normales, al igual que con el gen de CAPRINA-1 de perro, pero se detectó en muchos tipos de líneas celulares de cáncer, entre ellas 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK-nu-1), así como una línea celular de tumor cerebral, una línea celular derivada de leucemia, una línea celular de cáncer de pulmón y una línea celular de cáncer de esófago (Figura 1). Estos resultados demostraron que CAPRINA-1 no se expresa en tejidos normales, excepto en el testículo, pero se expresa en muchas células cancerosas, incluidas las células de cáncer de mama. Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo contra CAPRINA-1
(1) Preparación de anticuerpo monoclonal anti- CAPRINA-1 humana de ratón
Se mezclaron 100 pg de CAPRINA-1 humana con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 como se prepara en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de adyuvante MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por ratón. Esta solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC, Inc.). A continuación, se realizaron 3 refuerzos cada 1 semana. Tres días después de la inmunización final, se extrajo el bazo de cada ratón y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la eliminación del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener células de bazo. Los esplenocitos obtenidos se mezclaron con células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas de la ATCC) en una proporción de 10:1. 200 |jl de un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % se calentaron a 37 °C y se mezclaron con 800 j l de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de este modo se añadió a la mezcla de células, que luego se dejó reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Después de la eliminación del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 150 ml de un medio RPMI1640 que contenía 15% de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solución HAT (Life Technologies, Inc./Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspensión se inoculó en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 jl/pocillo. Las células de bazo y las células de mieloma se fusionaron mediante cultivo en condiciones de a 37 °C durante 7 días en 5 % de CO2 para obtener hibridomas.
Los hibridomas preparados se exploraron en cuanto a la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra CAPRINA-1 como indicador. La solución de proteína CAPRINA-1 de 1 jg/ml se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 jl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina al 0,5% (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) a 400 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo tres veces con 400 j l de PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadieron anticuerpos IgG (H L) anti-ratón marcados con HRP (Life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 jl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar una reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción se finalizó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que tienen alta absorbancia como líneas candidatas del hibridoma de interés.
Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron hibridomas que formaban colonias individuales en los pocillos. Las células de estos pocillos se cultivaron adicionalmente, y los hibridomas clonados se exploraron en cuanto a la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra CAPRINA-1 como indicador. Se añadió a una placa de 96 pocillos la solución de proteína CAPRINA-1 de 1 pg/ml a 100 pl/pocillo y se dejó en reposo a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de BSA al 0,5 % a 400 pl/pocillo, y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de cada pocillo se desechó y cada pocillo se lavó tres veces con 400 pl de PBS-T. Después, el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a ello a 100 pl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadieron a ellos anticuerpos anti-IgG (H+L) de ratón marcados con HRP (Life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 jl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 jl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron una pluralidad de líneas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con CAPRINA-1. Los sobrenadantes de cultivo de estos hibridomas se purificaron usando un portador de proteína G y se obtuvieron 150 tipos de anticuerpos monoclonales que se unen a CAPRINA-1.
A continuación, estos anticuerpos monoclonales se exploraron en cuanto a la reactividad con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 106 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. Se añadieron 100 j l del sobrenadante de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG anti-ratón de cabra marcados con FITC (Life Technologies, Inc.) diluidos 500 veces con PBS que contenía suero fetal bovino al 0,1 % y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, la misma operación que la anterior se realizó con la adición de un medio en lugar de los anticuerpos como control. Como resultado, se seleccionaron 10 anticuerpos monoclonales (n.° 1 a n.° 10) que tienen una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, reactivos con la superficie de células de cáncer de mama. Las respectivas secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera de estos anticuerpos monoclonales se muestran en las SEQ ID NO: 44 a 60. El anticuerpo monoclonal n.° 1 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 45; el anticuerpo monoclonal n.° 2 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 46; el anticuerpo monoclonal n.° 3 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 47; el anticuerpo monoclonal n.° 4 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 48; el anticuerpo monoclonal n.° 5 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 49 y la región variable de cadena ligera de la s Eq ID NO: 50; el anticuerpo monoclonal n.° 6 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; el anticuerpo monoclonal n.° 7 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 54; el anticuerpo monoclonal n.° 8 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 55 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 56; el anticuerpo monoclonal n.° 9 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 57 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 58; y el anticuerpo monoclonal n.° 10 comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 59 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 60.
(2) Identificación del péptido en CAPRINA-1 al que se une el anticuerpo de ratón anti-CAPRINA-1 reactivo con la superficie de la célula cancerosa
Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CAPRINA-1 reactivos en la superficie de células cancerosas n.° 1 a n.° 10 obtenidos anteriormente se usaron para identificar secuencias parciales en CAPRINA-1 reconocidas de este modo.
En primer lugar, se añadió DTT (Fluka) a una concentración final de 10 mM a 100 pl de una solución de proteína de 1 pg/pl de CAPRINA-1 recombinante disuelta en PBS, y se hizo reaccionar a 95 °C durante 5 minutos para reducir los enlaces disulfuro en las proteínas CAPRINA-1. A continuación, se añadió yodoacetamida 20 mM (concentración final) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd ), seguido de la reacción de alquilación de los grupos tiol a 37 °C durante 30 minutos en condiciones de sombra. Se añadieron 50 pg de cada uno de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CAPRINA-1 n.° 1 a n.° 10 a 40 pg de las proteínas cAp RINA-1 alquiladas reducidas obtenidas. La cantidad total de cada mezcla se ajustó a 1 ml con tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0). La mezcla resultante se hizo reaccionar durante la noche a 4°C mientras se mezclaba agitando.
A continuación, se añadió tripsina (Promega K.K.) a una concentración final de 0,2 pg a cada mezcla de reacción y se hizo reaccionar a 37 ° C durante 1 hora, 2 horas, 4 horas o 12 horas. A continuación, la mezcla de reacción se mezcló con perlas de vidrio de proteína A (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) bloqueadas con PBS que contenían BSA al 1 % (Sigma-Aldrich Corp.) y se lavaron con PBS por adelantado, carbonato de calcio 1 mM y tampón NP-40 (tampón fosfato 20 mM (pH 7,4), EDtA 5 mM, NaCl 150 mM, 1 % de NP-40) y reaccionó durante 30 minutos.
Cada solución de reacción se lavó con un tampón de carbonato de amonio 25 mM (pH 8,0), seguido de la elución de los complejos antígeno-anticuerpo usando 100 pl de ácido fórmico al 0,1 %. El eluato se analizó mediante LC-MS utilizando Q-TOF Premier (Waters-MicroMass). Este análisis siguió el protocolo adjunto al instrumento.
Como resultado, el polipéptido de la SEQ ID NO: 61 se identificó como la secuencia parcial de CAPRINA-1 reconocida por todos los anticuerpos monoclonales N.° 1 a 10 anti-CAPRINA-1 humana de ratón. En el polipéptido de la SEQ ID NO:61, el péptido de la SEQ ID NO: 62 se identificó además como una secuencia parcial reconocida por los anticuerpos monoclonales N.° 1 a N.° 4, N.° 5 a N.° 7, y N.° 9. Como un péptido de secuencia parcial, se descubrió además que el péptido de la SEQ ID NO: 63 era reconocido por el anticuerpo monoclonal N.° 10.
(3) Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo
Se mezclaron 300 pg de CAPRINA-1 humana con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 como se prepara en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de adyuvante completo de Freund. Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por pollo. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a pollos de 7 semanas de edad. A continuación, se realizaron 7 refuerzos cada 4 semanas para completar la inmunización. Cuatro días después de la última inyección, el bazo de cada pollo se escindió y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la eliminación del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener células de bazo. Los esplenocitos obtenidas se mezclaron con células de mieloma de pollo deficientes en cadena ligera establecidas a partir de pollos mediante transformación utilizando virus de la reticuloendoteliosis aviar, en una proporción de 5:1. se calentaron 200 pl de un medio IMDM que contenía FBS al 10 % a 37 °C y se mezclaron con 800 pl de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de este modo se añadió a la mezcla de células, que luego se dejó reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Después de la eliminación del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 300 ml de un medio IMDM que contenía 10 % de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solución HAT (Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspensión se inoculó en treinta placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 pl/pocillo. Las células de bazo y las células de mieloma de pollo se fusionaron mediante cultivo a 37 °C durante 7 días en CO2 al 5 % para obtener hibridomas.
Los hibridomas preparados se seleccionaron en cuanto a la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra proteínas CAPRINA-1 como indicador. La solución de proteína CAPRINA-1 de 1 pg/ml se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina al 0,5% (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) a 400 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo tres veces con 400 pl de PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, Se añadieron anticuerpos anti-IgY de pollo marcados con HRP (Sigma-Aldrich Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas productores de anticuerpos con alta absorbancia como líneas candidatas del hibridoma de interés.
Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron los hibridomas que forman colonias únicas en los pocillos. Las células de estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se exploraron en cuanto a la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a la proteína CAPRINA-1 como indicador. La solución de proteína CAPRINA-11 de 1 pg/ml se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se dejó en reposo a 4 ° C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de BSA al 0,5% a 400 pl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de cada pocillo se desechó y cada pocillo se lavó tres veces con 400 pl de PBS-T. Después, el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a ello a 100 pl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadieron a los mismos anticuerpos anti-IgY de pollo marcados con HRP (Sigma-Aldrich Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó en reposo durante 15 a 30 minutos para provocar una reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción se finalizó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvo una pluralidad de líneas de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales reactivos con proteínas CAPRINA-1 como líneas candidatas del hibridoma de interés.
A continuación, se exploraron estos anticuerpos monoclonales respecto a la reactividad con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan cAp RINA-1. Específicamente, se centrifugaron 5 x 105 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. se añadieron 100A del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron los anticuerpos IgG (H+L) de cabra anti-pollo marcados con FITC (Southern Biotech) diluidos 30 veces con PBS que contenía f Bs al 0,1 % y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, se realizó la misma operación que la anterior utilizando un medio para cultivo de hibridomas para preparar una muestra de control. Como resultado, se seleccionó 1 anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11)) que tienen una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, reactivo con la superficie de células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1.
(4) Preparación de anticuerpo recombinante quimérico de ratón-pollo
El fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 64) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido en el párrafo (3) anterior se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA4/myc-His (life Technologies, Inc.) en el que se habían insertado una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo y una región constante de la cadena IgGl H de ratón. Asimismo, el fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 65) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, luego se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA3.1/myc-His (life Technologies, Inc.) en el que se habían insertado una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo y una región constante de la cadena IgGl L de ratón.
A continuación, el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de pollo n°11 y el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo N.° 11 se introdujo en células CHO-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank). Específicamente, se cultivaron 2 x 105 células CHO-K1 en 1 ml de medio F12 de Ham (life Technologies, Inc.) que contenía un 10 % de FBS por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadió 1 ml de medio F12 de Ham fresco que contenía FBS al 10 % por pocillo. Los vectores (250 ng de cada uno) disueltos en 30 pl de OptiMEM (life Technologies, Inc.) se mezclaron con 30 pl de reactivo de transfección Polyfect (Qiagen N.V.), y esta mezcla se añadió a cada pocillo. Las células CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 pg/ml de ceocina (life Technologies, Inc.) y 200 pg/ml de geneticina (Roche Diagnostics KK) y luego se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular que produce de forma estable un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12 que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal de pollo anti-CAPRINA-1 humana n.° 11 y las regiones constantes de IgG1 de ratón. La línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO libre de suero (life Technologies, Inc.) para obtener un sobrenadante de cultivo que contenía n.° 12.
(5) Identificación del epítopo de CAPRINA-1 reconocido por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12
El anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérica de ratón-pollo reactivo a la superficie de células cancerosas n.° 12 obtenido en el párrafo (4) se usó para identificar una región de epítopo de CAPRINA-1 reconocida por el mismo. Se disolvieron 100 |jg de proteínas CAPRINA-1 recombinantes en un tampón de disolución sin inhibidor de proteínas y se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal quimérico de ratón-pollo anti-CAPRINA-1 humana n.° 12. A esta solución, se añadió una enzima digestiva tripsina o quimotripsina, seguido de una reacción de digestión a una temperatura adecuada. Después de la reacción, se añadió un portador de proteína G Sepharose, luego reaccionó, y precipitó por operación de centrifugación. Después de la retirada del sobrenadante, el vehículo se lavó con un tampón de disolución y PBS y se disolvió en ácido fórmico al 0,1 %, y se recuperó el sobrenadante. La muestra de sobrenadante recuperada se aplicó a una columna de fase inversa (cartucho de extracción HLB (Waters-OASIS)) para obtener una solución de muestra libre de anticuerpos. La muestra obtenida se sometió a cromatografía de líquidos de fase inversa (Chromatography Nanosystem (KYA Tech Corp.)) para recuperar una solución que solo contenía péptidos. La solución se introdujo en un espectrómetro de masas de tándem espectrómetro de masas cuadrupolo-TOF (Waters-MicroMass) y se analizó por MS/MS para detectar los péptidos contenidos en la muestra. Como resultado, se identificó un péptido que consistía en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 como una secuencia parcial de CAPRINA-1 reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12. El anticuerpo monoclonal de pollo anti-CAPRINA-1 n.° 11 tiene las mismas regiones variables de la cadena pesada y ligera que las del anticuerpo monoclonal quimérico de pollo-ratón anti-CAPRINA-1 humano n.° 12 y como tal, reconoce este péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 como una secuencia parcial de CAPRINA-1.
(6) Preparación de anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana quimérico
El fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 64) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido en el párrafo (3) anterior se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA4/myc-His (life Technologies, Inc.) en el que se habían insertado una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo que comprende la SEQ ID NO:67 y una región constante de la cadena H de la IgGI humana que comprende la SEQ ID NO: 68. Asimismo, el fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 65) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA3.1/myc-His (life Technologies, Inc.) en el que se habían insertado una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo que comprende la SEQ ID NO:68 y una región constante de la cadena L de la IgGI humana que comprende la SEQ ID NO: 69.
A continuación, el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de pollo N.° 11 y el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de pollo N.° 11 se introdujeron en las células CHO-K1 (obtenidas del Banco de células de Riken). Específicamente, se cultivaron 2 x 105 células CHO-K1 en 1 ml de medio F12 de Ham (life Technologies, Inc.) que contenía un 10 % de FBS por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadió 1 ml de medio F12 de Ham fresco que contenía FBS al 10 % por pocillo. Los vectores (250 ng de cada uno) disueltos en 30 j l de OptiMEM (life Technologies, Inc.) se mezclaron con 30 j l de reactivo de transfección Polyfect (Qiagen N.V.), y esta mezcla se añadió a cada pocillo. Las células CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 jg/ml de ceocina (life Technologies, Inc.) y 200 jg/ml de geneticina (Roche Diagnostics KK) y luego se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular que produce de manera estable un anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana quimérico de humano-pollo n.° 13 que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 y las regiones constantes de la IgG1 humana. La línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO libre de suero (life Technologies, Inc.) para obtener un sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo n.° 13.
(7) Preparación de anticuerpo monoclonal anti- CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14
Del mismo modo que en el párrafo (1) se mezcló una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66 identificada en el párrafo (5) y una proteína vehículo KLH (hemocianina de lapa californiana) como un inmunógeno con una cantidad igual de un adyuvante TiterMax Gold(R) (CytRx Corp.) y esta mezcla se administró por vía subcutánea a una dosis de 20 jg/inyección a cada ratón a intervalos de 7 días. Después de la administración con cuatro inyecciones en total, se obtuvieron esplenocitos del ratón 3 días después de la inmunización final y se fusionaron con células de mieloma de ratón de la misma manera que en el párrafo (1) para producir hibridomas. A continuación, los anticuerpos se seleccionaron utilizando, como indicador, la reactividad de cada anticuerpo contenido en los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas preparados con soluciones de proteína CAPRINA-1 de 1 |jg/ml preparadas en el ejemplo 3 del documento WO2010/016526 o una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 usada como inmunógeno y una proteína portadora de KLH. La solución de proteína CAPRINA-1 de 1 jg/ml preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y la proteína de fusión (30 jg/ml) de la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 66 y una proteína transportadora de KLH se añadieron por separado a placas de 96 pocillos a 100 jg/pocillo y se dejaron reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, se añadió una solución Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) a 400 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo con PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, Se añadieron anticuerpos IgG (H L) anti-ratón marcados con HRP (life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 jl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 jl/pocillo y se dejó reposar durante 5 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 jl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron los hibridomas que producían anticuerpos que tenían una alta absorbancia.
Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,3 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron los hibridomas que forman colonias únicas en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se seleccionaron de la misma manera que antes con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 como una secuencia parcial de CAPRINA-1 como indicador para obtener hibridomas que producen anticuerpos contra el aminoácido de la SEQ ID NO: 66.
Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas obtenidos se exploraron en cuanto a la reactividad con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 106 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. se añadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG anti-ratón de cabra marcados con FITC (Life Technologies, Inc.) diluidos 500 veces con PBS que contenían 0,1 % de FBS y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, la misma operación que la anterior se realizó utilizando, en lugar de los anticuerpos, una muestra de suero de cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad sin tratar, diluido 500 veces con un medio para el cultivo de hibridomas o usando anticuerpos secundarios solos para la reacción como control negativo. Como resultado, se obtuvo un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 que tenían una intensidad de fluorescencia mayor que la del control, es decir, reactivo con la superficie de las células de cáncer de mama. El anticuerpo monoclonal n.° 14 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 70 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71.
El anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 obtenido se examinó para determinar su reacción específica con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66, que es una secuencia parcial de CAPRINA-1 usada como inmunógeno. Se añadieron por separado 30 pg/ml de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 en una solución acuosa de carbonato de sodio 0,1 M y 30 pg/ml de un polipéptido que consiste en una secuencia parcial de CAPRINA-1 sin la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 en una solución acuosa de carbonato de sodio 0,1 M a placas de 96 pocillos Immobilizer Amino for ELISA (Nunc) a una concentración de 100 jg/ml y se hicieron reaccionar toda la noche y todo el día a 4 °C para unir los péptidos a los pocillos. Se añadió una solución acuosa de carbonato de sodio 0,1 M que contenía etanolamina 10 mM a los pocillos unidos a péptido resultantes y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó la solución en cada pocillo y después se lavó cada pocillo con p Bs-T. A continuación, Se añadió una solución Block Ace a 400 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo con p Bs-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo monoclonal n.° 14 de ratón a los mismos a 50 jl/pocillo y se hizo reaccionar temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, cada pocillo se lavó con PBS-T y se añadieron anticuerpos IgG (H L) marcados con HRP (life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con una solución Block Ace a 50 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó completamente con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 jl/pocillo y se dejó reposar durante 5 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 jl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, el anticuerpo monoclonal de ratón N.° 14 no reaccionó con la secuencia parcial de CAPRINA-1 libre de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66, pero reaccionó específicamente solo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66. Por lo tanto, se confirmó que el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 contenía una región de epítopo reconocida por el anticuerpo de ratón anti-CAPRINA-1 humana n.° 14.
Ejemplo 3: Análisis de la expresión de la proteína CAPRINA-1 en células cancerosas
A continuación, 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK-nu-1) confirmaron tener una alta tasa de expresión del gen de CAPRINA-1 se examinaron en cuanto a su expresión de proteínas CAPRINA-1 en la superficie celular. Se centrifugaron 5 x 105 células de cada línea celular de cáncer de mama humano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron al mismo 2 |jg (5 jl) del anticuerpo monoclonal de ratón-pollo anti-CAPRINA-1 humana (n.° 12) preparado en el Ejemplo 2(4), mezclado adicionalmente mediante la adición de 95 j l de PBS que contenía suero fetal bovino al 0,1 %, y se dejó reposar durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, las células se mezclaron mediante la adición de 2 pl de anticuerpos IgG anti-ratón de cabra marcados con Alexa 488 (Life Technologies, Inc.) y 98 pl de PBS que contenía suero fetal bovino (FBS) al 0,1% y se dejaron reposar durante 30 horas en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, se realizó la misma operación anterior usando IgG1 de ratón en lugar del anticuerpo monoclonal de ratón-pollo anti-CAPRINA-1 humana (n.° 12), como control. Como resultado, todas las líneas celulares de cáncer complementadas con el anticuerpo monoclonal de ratón-pollo anti-CAPRINA-1 humana (n.° 12) presentaron una intensidad de fluorescencia al menos el 35% más fuerte que la del control. Esto demostró que las proteínas CAPRINA-1 se expresan en la superficie de la membrana celular de las líneas celulares de cáncer humano. La tasa de potenciación anterior en la intensidad de fluorescencia estaba indicada por la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (IFM) en cada línea celular y se calculó de acuerdo con la siguiente expresión.
Tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (Tasa de potenciación en la intensidad de fluorescencia) (%) = ((IFM de células que reaccionaron con el anticuerpo anti-CAPRINA-1) - (IFM del control)) / (IFM de control) x 100
Además, se midió la intensidad de fluorescencia para 3 líneas celulares de cáncer de riñón (Caki-1, Caki-2 y A498), una línea celular de cáncer de vejiga (T24), una línea celular de cáncer de ovario (SKOV3), una línea celular de cáncer de pulmón (QG56), una línea celular de cáncer de próstata (PC3), una línea celular de cáncer de cuello uterino (Hela), una línea celular de fibrosarcoma (HT1080), 2 líneas celulares de tumor cerebral (T98G y U87MG), una línea celular de cáncer gástrico (MNK28), una línea celular de cáncer de intestino grueso (Lovo) y líneas celulares de cáncer de páncreas (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 y BxPC-3), utilizando el mismo enfoque anterior. Como resultado, todas las líneas celulares de cáncer tenían una intensidad de fluorescencia al menos el 35 % más fuerte que la del control.
Al igual que con los resultados obtenidos anteriormente, la expresión de CAPRINA-1 en la superficie de la célula cancerosa también se confirmó usando el anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo anti-CAPRINA-1 (n.° 13) obtenido en el Ejemplo 2(6) o el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CAPRINA-1 (n.° 14) obtenido en el Ejemplo 2(7).
Ejemplo 4: Selección del anticuerpo óptimo para la detección de CAPRINA-1
(1) Selección de anticuerpo usando tejido de cáncer de mama humano
31 muestras de tejido de cáncer de mama de una matriz de tejido de cáncer de mama humano incrustadas en parafina (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) se utilizaron en tinción inmunohistoquímica. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se trató a 60 °C durante 3 horas y luego se colocó en un frasco de tinción lleno con xileno y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo del xileno por uno nuevo cada 5 minutos. Posteriormente, la misma operación que en el xileno se realizó utilizando etanol y PBS-T. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se colocó en un frasco de tinción lleno con una solución amortiguadora de citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,05 %, se trató a 125 °C durante 5 minutos y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con una Kimwipe. La sección de un portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicaron 10jg/m l del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS - T que contenía 5 % de FBS. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. Después de enjuagar con agua destilada, el portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se retiró y la sección se incrustó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción de CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se localizaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante de este modo y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.
Un tejido canceroso se determinó como positivo para CAPRINA-1, si sus resultados obtenían una puntuación de 2 o 3.
Como resultado, la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama se confirmó con éxito utilizando cualquiera de los anticuerpos. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 8 mostraron una puntuación de 2 para 14 muestras y una puntuación de 3 para 1 muestra, y por lo tanto el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 15 muestras. El resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 18 muestras y una puntuación de 3 para 8 muestras, y por lo tanto el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 26 muestras. Por lo tanto, el anticuerpo n.° 14 se seleccionó para la detección de CAPRINA-1 usando tejidos de cáncer humano.
(2) Detección de CAPRINA-1 en varios tejidos normales humanos mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 14
Se usó una matriz de tejidos humanos normales (US Biomax, Inc.) (incluidos tejidos de cerebro, glándula tiroides, pulmón, bazo, riñón, esófago, estómago, intestino grueso, páncreas, músculo, piel, glándulas salivales, ovario, útero, glándula mamaria, placenta, médula ósea, testículos y próstata) en la tinción inmunohistoquímica. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con una Kimwipe. La sección de un portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicó 10 |jg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS-T que contenía 5 % de FBS. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. Después de enjuagar con agua destilada, el portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se incluyó la sección en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación.
El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se emplazaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron de este modo y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas. Se determinó que un tejido canceroso con puntuación 2 o 3 era positivo CAPRINA-1.
El útero y los tejidos de la próstata recibieron puntuación 1, mientras que los otros tejidos recibieron una puntuación de 0. Por lo tanto, la expresión de CAPRINA-1 no se observó en los tejidos normales humanos.
(3) Detección de proteína CAPRINA-1 en varios tejidos cancerosos humanos mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana n.° 14
Se usaron diversos tejidos de cáncer de una matriz de tejido de cáncer humano incluido en parafina (US Biomax, Inc.) en tinción inmunohistoquímica. La matriz de tejido de cáncer humano se trató a 60 °C durante 3 horas y luego se colocó en un frasco de tinción lleno de xileno y los procedimientos de reemplazo del xileno por uno nuevo cada 5 minutos se realizaron tres veces. Posteriormente, la misma operación que en el xileno se realizó utilizando etanol y PBS-T. La matriz de tejido de cáncer humano se colocó en un frasco de tinción lleno con una solución amortiguadora de citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,05 %, se trató a 125 °C durante 5 minutos y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con una Kimwipe. La sección en un portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10% como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicó al mismo 10|jg/ml del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CAPRINA-1 n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS-T que contenía 5 % de FBS. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con p BS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada y se colocó en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación.
El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción de proteína CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se emplazaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron de este modo y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.
Se determinó que un tejido canceroso era positivo para CAPRINA-1, si los resultados de su ensayo obtenían una puntuación de 2 o 3.
Como resultado, CAPRINA-1 mostró ser positiva en 16 de 22 muestras de tejido de tumor cerebral (64 %), 19 de 32 muestras de tejido de cáncer de pulmón (59 %), 18 de 21 muestras de tejido de cáncer de útero (86 %), 10 de 16 muestras de tejido de cáncer de esófago (63 %), 27 de 30 muestras de tejido de cáncer de riñón (90 %), 14 de 17 muestras de tejido de cáncer de hígado (82%), 11 de 15 muestras de tejido canceroso de la glándula tiroides (73%), 10 de 14 muestras de tejido de cáncer de estómago (71 %), 17 de 19 muestras de tejido de cáncer de páncreas (89 %), 13 de 13 muestras de tejido de cáncer de próstata (100 %), 12 de 14 muestras de tejido de cáncer de vejiga (86 %), 11 de 14 muestras de tejido de cáncer de intestino grueso (79 %), 24 de 30 muestras de tejido de cáncer de piel (80 %) y 16 de 21 muestras de tejido de cáncer de mama (76 %).
(4) Detección de la proteína CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama de perro mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana n.° 14
Se usaron 100 muestras de tejido de cáncer de mama congelado de perros diagnosticados patológicamente como cáncer de mama maligno en la tinción inmunohistoquímica. Cada tejido de cáncer de mama de perro congelado se cortó en secciones de 10 a 20 pm usando Cryostat (Leica Biosystems), se montó en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido montada sobre el mismo. A continuación, el portaobjetos de vidrio se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T (solución salina que contenía 0,05 % de Tween 20) y los procedimientos de sustitución de PBS-T por uno recién preparado cada 5 minutos se llevaron a cabo tres veces. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con una Kimwipe. La sección del portaobjetos de vidrio estaba rodeada por una pluma Dako (Dako). A continuación, se aplicó una solución de PBS-T que contenía suero bovino fetal al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de bloqueo y se aplicó esta solución. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicaron anticuerpos anti-IgG marcados con biotina MOM (Vectastain) diluidos 250 veces con una solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó el reactivo avidinabiotina ABC (Vectastain) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción de DAB (10 mg de DAB 10 pl de 30 % de H2O2/50 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 7,6)) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara de humedad. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada. Se aplicó un reactivo de hematoxilina (Dako) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se enjuagó con agua destilada. El portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se la sección se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se emplazaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron de este modo y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.
Se determinó que un tejido de perro portador de cáncer es positivo para CAPRINA-1 y se espera que obtuviera efectos terapéuticos eficaces mediante la administración de un fármaco dirigido a CAPRINA-1, si los resultados de su ensayo obtenían una puntuación de 2 o 3.
Como resultado, se mostró con éxito la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama de perro utilizando cualquiera de los anticuerpos. Específicamente, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 8 mostró una puntuación de 2 para 69 muestras y una puntuación de 3 para 11 muestras y, así, el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 80 muestras (80 %). El resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 46 muestras y una puntuación de 3 para 36 muestras y, así, el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 82 muestras (82 %).
(5) Detección de CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama de gato mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14
Se usaron 30 muestras de tejido de cáncer de mama congelado de gatos diagnosticados patológicamente como cáncer de mama maligno en la tinción inmunohistoquímica. Cada tejido de cáncer de gato congelado se cortó en secciones de 10 a 20 pm usando Cryostat (Leica Biosystems), se montaron en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido mantada sobre el mismo. A continuación, el portaobjetos de vidrio se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T (solución salina que contenía 0,05 % de Tween 20) y los procedimientos de sustitución de PBS-T por uno recién preparado cada 5 minutos se llevaron a cabo tres veces. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con una Kimwipe. La sección del portaobjetos de vidrio estaba rodeada por una pluma Dako (Dako). A continuación, se aplicó una solución de PBS-T que contenía suero bovino fetal al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicó al mismo l0 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de bloqueo. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicaron anticuerpos anti-IgG marcados con biotina MOM (Vectastain) diluidos 250 veces con una solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó el reactivo avidinabiotina ABC (Vectastain) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción de DAB (10 mg de DAB 10 pl de 30 % de H2O2/50 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 7,6)) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara de humedad. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada. Se aplicó un reactivo de hematoxilina (Dako) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se enjuagó con agua destilada. El portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y la sección se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se emplazaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron de este modo y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes.
- Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.
- Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.
- Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas. - Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.
Se determinó que un tejido de gato portador de cáncer era positivo para CAPRINA-1 y que se esperaba que obtuviera efectos terapéuticos eficaces mediante la administración de un fármaco dirigido a CAPRINA-1, si sus resultados del ensayo obtenían una puntuación de 2 o 3.
Como resultado, se mostró con éxito la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama de gato utilizando cualquiera de los anticuerpos. Específicamente, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 8 mostró una puntuación de 2 para 20 muestras y una puntuación de 3 para 4 muestras y, así, el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 24 muestras (80 %). El resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 18 muestras y una puntuación de 3 para 9 muestras y, así, el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 27 muestras (90 %).
Ejemplo 5: Correlación de la expresión de CAPRINA-1 evaluada utilizando una muestra de cáncer con efecto antitumoral del anticuerpo contra CAPRINA-1 - 1
(1) Detección de CAPRINA-1 mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando tejido de cáncer derivado de ratón portador de cáncer en el que se transplantaron células cancerosas de ratón
Dos líneas celulares de cáncer derivadas de ratón (B16F10 y EMT-6) se trasplantaron por vía subcutánea (cada una para 5 ratones) en las regiones dorsales de 26 ratones Balb/c (Japan SLC, Inc.) y se cultivaron hasta que el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 7 mm de diámetro. Se seleccionaron tres sujetos de cada uno de estos dos grupos de ratones que tenían respectivamente los 2 tipos de células cancerosas transplantadas. Se extrajo una masa tumoral de cada ratón, se abrieron en PBS y se fijaron por perfusión durante la noche en una solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contiene un 4 % de paraformaldehído (PFA). El perfundido se desechó. La superficie tisular de cada órgano se aclaró con PBS. Se añadió una solución de PBS que contenía un 10 % de sacarosa a un tubo de centrífuga de 50 ml, se colocó en él cada tejido canceroso y agitó a 4 °C durante 2 horas usando un rotor. La solución se reemplazó con una solución de PBS que contenía un 20 % de sacarosa y, la muestra se dejó en reposo a 4 °C hasta que el tejido canceroso se precipitó. A continuación, la solución se sustituyó con una solución de PBS que contenía un 30 % de sacarosa y la muestra se dejó en reposo a 4 °C hasta que el tejido de cáncer se precipitó. El tejido canceroso se extrajo y las porciones deseadas se escindieron con un escalpelo. A continuación, se aplicó un compuesto OCT (Tissue Teck) y se esparció por toda la superficie. A continuación, el tejido se colocó en Cryomold. El Cryomold se colocó en hielo seco para congelar rápidamente el tejido, a continuación, se cortó en secciones de 10 a 20 pm usando Cryostat (Leica Biosystems), se montó en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido montada sobre el mismo. Al día siguiente, el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS (-) tres veces. Se aplicó p Bs (-) que contenía suero de cabra al 5 % como solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicó a los mismos 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana n.° 8 o n.° 14 de ratón preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS (-). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS (-) durante 5 minutos cinco veces, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS-T durante 5 minutos seis veces, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se desechó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS (-) durante 5 minutos tres veces. A continuación, la sección del portaobjetos de vidrio se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación. Como resultado de la puntuación como se describe en el Ejemplo 4, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 8 mostraron una puntuación de 1 tanto para las células derivadas de melanoma B16F10 como para las células derivadas de cáncer de mama EMT-6. Por lo tanto, no se detectó expresión CAPRINA-1. Por otro lado, los resultados de la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 14 mostraron una puntuación de 1 para las células cancerosas B16F10, pero exhibió una puntuación de 3 para las células cancerosas EMT-6.
(2) Efecto antitumoral del anticuerpo contra CAPRINA-1
El anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de humano-pollo n.° 13 se estudió por su efecto antitumoral utilizando ratones con cáncer preparados en el párrafo anterior (1). De los ratones portadores cáncer en los que se transplantó cada línea celular de cáncer (B16F10 o EMT-6), 5 ratones con cáncer en cada grupo se sometieron a la administración intraperitoneal del anticuerpo n.° 13 a una dosis de 200 pg (200 pl) por ratón. A continuación, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a la misma dosis que la anterior a cada ratón portador de cáncer un total de 3 veces durante 2 días. El tamaño del tumor se midió todos los días y se observó el efecto antitumoral del anticuerpo n.° 13 (grupo de estudio). Por otro lado, se administró PBS (-) en lugar del anticuerpo a los 5 ratones con cáncer restantes, que a su vez se usaron como un grupo de control.
Como resultado de observar el efecto antitumoral, los volúmenes tumorales de los ratones trasplantados con células cancerosas B16F10 en el grupo de estudio que recibió el anticuerpo n.° 13 aumentaron a aproximadamente el 150%, 200%, 370% y 630 % los días 4, 6, 8 y 11, respectivamente, con el volumen del tumor al inicio de la administración del anticuerpo definido como 100%. Por otro lado, los volúmenes tumorales de los ratones trasplantados con células cancerosas EMT-6 en el grupo de estudio se redujeron al 51 % el día 4, aproximadamente el 31 % el día 6 y el 9 % el día 8, con el volumen del tumor al inicio de la administración del anticuerpo definido como el 100%, y sus tumores remitieron casi completamente los días 10 a 14. Los volúmenes tumorales de ambos ratones trasplantados con tumor en el grupo control que recibió PBS (-) aumentaron a aproximadamente el 230 %, 290 %, 470 % y 800 % los días 4, 6, 8 y 11, respectivamente.
De los resultados mencionados anteriormente, los resultados de la medición de la expresión de CAPRINA-1 utilizando el anticuerpo n.° 8 no mostraron que se correlacionaran con los efectos terapéuticos del cáncer basados en la actividad antitumoral del anticuerpo, mientras que los resultados de la medición de la expresión de CAPRINA-1 utilizando el anticuerpo n.° 14 mostraron que correlacionaban con los efectos terapéuticos del cáncer basados en la actividad antitumoral del anticuerpo. Específicamente, los resultados de la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 utilizando el anticuerpo n.° 14 mostraron una puntuación de 3 para los tejidos de cáncer derivados de trasplante de EMT-6, lo que indica la sobreexpresión de CAPRINA-1 y se demostraron los efectos farmacológicos basados en la actividad antitumoral del anticuerpo administrado. Por otro lado, los resultados de la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 utilizando el anticuerpo n.° 14 mostraron una puntuación de 1 para los tejidos cancerosos derivados de B16F10 trasplantadas, lo que indica que no se observó la expresión de CAPRINA-1. Además, el anticuerpo n.° 13 que tiene actividad antitumoral no produjo efectos farmacológicos cuando se administró a los ratones portadores de cáncer en los que se trasplantaron células cancerosas B16F10.
Estos resultados indicaron que un cáncer o un individuo que se determinó que tiene un alto nivel de expresión de CAPRINA-1 en un tejido canceroso mediante la detección de CAPRINA-1 en el tejido canceroso, usando el anticuerpo n.° 14 de la presente invención que se une específicamente a CAPRINA-1, puede obtener altos efectos terapéuticos mediante la administración del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención, basado en el efecto antitumoral del anticuerpo.
Ejemplo 6: Correlación de la expresión de CAPRINA-1 evaluada usando una muestra de cáncer con el efecto antitumoral de anticuerpo contra CAPRINA-1 - II
(1) Detección de CAPRINA-1 por el método de tinción inmunohistoquímica utilizando tejido canceroso derivado de un ratón portador de cáncer en el que se trasplantaron células cancerosas de ratón
Dos líneas celulares de cáncer derivadas de ratón (B16 y CT26) se trasplantaron por vía subcutánea (cada una en 5 ratones) en las regiones dorsales de 26 ratones Balb/c (Japan SLC, Inc.) y se dejaron desarrollarse hasta que el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 7 mm. diámetro. Se seleccionaron tres sujetos de cada uno de estos dos grupos de ratones que tenían respectivamente los 2 tipos de células cancerosas trasplantadas. Se extirpó masa tumoral de cada ratón, se cortó en PBS y se fijó por perfusión durante una noche en una solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contenía paraformaldehído (PFA) al 4%. El perfundido se descartó. La superficie del tejido de cada órgano se aclaró con PBS. Se añadió una solución de PBS que contenía sacarosa al 10% a un tubo de centrífuga de 50 ml, después se colocó allí cada tejido canceroso y se agitó a 4 °C durante 2 horas usando un rotor. La solución se reemplazó por una solución de PBS que contenía sacarosa al 20 %, y la muestra se dejó en reposo a 4 °C hasta que precipitó el tejido canceroso. Después, la solución se reemplazó por una solución de PBS que contenía sacarosa al 30 %, y la muestra se dejó en reposo a 4 °C hasta que precipitó el tejido canceroso. Se extrajo el tejido canceroso y se cortaron las porciones deseadas con un cuchillo quirúrgico. A continuación, se vertió compuesto OCT (Tissue Tek) sobre la superficie del tejido y se extendió sobre la superficie. Después, el tejido se colocó en Cryomold. El Cryomold se colocó en hielo seco para congelar rápidamente el tejido, luego se cortó en secciones de 10 a 20 pm utilizando Cryostat (Leica Biosystems), se montó en un portaobjetos de vidrio y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos usando un secador de pelo para preparar un portaobjetos de vidrio con un corte de tejido montada sobre el mismo. Al día siguiente, el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS (-) tres veces. Se aplicó PBS (-) que contenía suero de cabra al 5 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicaron 10pg/ml del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CAPRINA-1 humana n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS (-). El portaobjetos de vidrio se dejó en reposo durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar cinco veces con PBS (-) durante 5 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de polímero conjugado marcado con peroxidasa (Dako), y el portaobjetos de vidrio se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar seis veces con PBS-T durante 5 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako) al mismo, y el portaobjetos de vidrio se dejó en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Después, la solución de tinción se desechó y el portaobjetos de vidrio se lavó tres veces con PBS (-) durante 5 minutos. Después, la sección del portaobjetos de vidrio se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako), seguido de observación. Como resultado de la puntuación como se describe en el Ejemplo 4, los resultados de la tinción inmunohistoquímica usando el anticuerpo n.° 8 presentaron una puntuación de 0 para las células de melanoma B16 y una puntuación de 1 para las células de cáncer de intestino grueso CT26. Por lo tanto, no se detectó la expresión de CAPRINA-1. Por otro lado, los resultados de la tinción inmunohistoquímica usando el anticuerpo n.° 14 presentaron una puntuación de 0 para las células cancerosas B16, pero presentaron una puntuación de 2 y, por lo tanto, fueron positivos, para las células cancerosas CT26.
(2) Efecto antitumoral del anticuerpo contra CAPRINA-1
El anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo anti-CAPRINA-1 humana n.° 13 se estudió en cuanto a su efecto antitumoral usando los ratones portadores de cáncer preparados en el párrafo (1) anterior. De los ratones portadores de cáncer en los que se trasplantó cada línea celular de cáncer (B16 o CT26), 5 ratones portadores de cáncer en cada grupo se sometieron a la administración intraperitoneal del anticuerpo n.° 13 a una dosis de 200 pg (200 pl) por ratón. Después, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a la misma dosis que antes a cada ratón portador de cáncer, un total de 3 veces durante 2 días. El tamaño del tumor se midió todos los días y se observó el efecto antitumoral del anticuerpo n.° 13 (grupo de estudio). Por otro lado, se administró PBS (-) en lugar del anticuerpo a los 5 ratones restantes con cáncer, que a su vez se usaron como grupo de control.
Como resultado de observar el efecto antitumoral, los volúmenes tumorales de los ratones trasplantados con células cancerosas B16 en el grupo de estudio que recibió el anticuerpo n.° 13 aumentaron hasta aproximadamente el 170%, 220%, 390% y 680% en los días 4, 6, 8 y 11, respectivamente, con el volumen tumoral al inicio de la administración de anticuerpo definido como el 100%. Por otro lado, los volúmenes tumorales de los ratones trasplantados con células cancerosas CT26 en el grupo de estudio se redujeron al 65 % en el día 4, aproximadamente 41 % en el día 6 y 17 % en el día 8, con el volumen tumoral al comienzo de la administración de anticuerpo definido como el 100 %, y sus tumores remitieron casi por completo en los días 10 a 14. Los volúmenes tumorales de ambos ratones trasplantados con tumor en el grupo de control que recibió PBS (-) aumentaron hasta aproximadamente el 230 %, 290 %, 470 % y 800 % en los días 4, 6, 8 y 11, respectivamente.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar un cáncer, que comprende medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica a través de una reacción de antígeno-anticuerpo usando un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66.
2. El método para detectar un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la CAPRINA-1 que se va a medir es:
(a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NO con número par de las SEQ iD NO: 2 a 28 en el Listado de Secuencias, o
(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más alta con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NO de número par de las s Eq ID NO: 2 a 28 en el Listado de Secuencias.
3. El método para detectar un cáncer de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra biológica deriva de un ser humano, un perro o un gato.
4. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica deriva de un perro, y la CAPRINA-1 que se va a medir tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14.
5. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica deriva de un ser humano, y la CAPRINA-1 que se va a medir tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 2 o 4.
6. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que un nivel de expresión de CAPRINA-1 medido que es más alto que el de un individuo sano, indica la presencia del cáncer al que va dirigido el anticuerpo como un fármaco terapéutico para el cáncer.
7. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 se lleva a cabo utilizando un método de ensayo inmunológico.
8. El método para detectar un cáncer de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el método de ensayo inmunológico es ELISA y/o un método de tinción inmunohistoquímica.
9. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica es un fluido corporal, un tejido o una célula.
10. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1a 9, en el que el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, tumor cerebral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de bazo, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de piel, cáncer de ovarios, cáncer de útero, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de testículo, osteosarcoma y fibrosarcoma.
11. El método para detectar un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71.
12. Uso de un fármaco que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, para diagnóstico del cáncer, en donde el uso no constituye un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.
13. Uso de un kit que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, para diagnóstico del cáncer, en donde el uso no constituye un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.
14. Un fármaco que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, para su uso en el diagnóstico de un cáncer mediante administración al cuerpo.
15. Un kit que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66, para su uso en el diagnóstico de un cáncer mediante administración al cuerpo.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 70, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 71.
17. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el diagnóstico de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 70 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71.
18. Un método para seleccionar un fármaco terapéutico específico del individuo para un cáncer, que comprende: medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica utilizando un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y, si el nivel de expresión es, desde el punto de vista estadístico, significativamente más alto que el de un individuo sano, seleccionar un fármaco dirigido a CAPRINA-1 como un fármaco terapéutico para un cáncer adecuado para la administración al individuo del cual deriva la muestra biológica.
19. El método para seleccionar un fármaco terapéutico específico del individuo para un cáncer de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el fármaco dirigido a CAPRINA-1 es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRINA-1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
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