ES2824498T3 - Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2824498T3
ES2824498T3 ES17196948T ES17196948T ES2824498T3 ES 2824498 T3 ES2824498 T3 ES 2824498T3 ES 17196948 T ES17196948 T ES 17196948T ES 17196948 T ES17196948 T ES 17196948T ES 2824498 T3 ES2824498 T3 ES 2824498T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fra
antibody
cancer
seq
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17196948T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel O'shannessy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai R&D Management Co Ltd
Original Assignee
Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Management Co Ltd filed Critical Eisai R&D Management Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2824498T3 publication Critical patent/ES2824498T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57442—Specifically defined cancers of the uterus and endometrial
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo con union al antigeno, especifico para el receptor alfa de folato (FRα) que comprende a. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 14, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 16; o b. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 23 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 24.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos
Campo técnico
El tema que se proporciona en este documento se refiere a los anticuerpos específicos al receptor alfa de folato (FRa).
Antecedentes
En los seres humanos, el receptor de alta afinidad por el folato se presenta en cuatro isoformas: alfa, beta, gamma y delta. Las formas alfa, beta y delta se unen normalmente a las membranas de las células mediante un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Se reciclan entre los compartimentos extracelulares y endocíticos y son capaces de transportar al folato al interior de la célula. Las formas solubles del receptor de folato pueden derivarse de la acción de proteasas o fosfolipasa en los receptores de folato anclados a la membrana.
El receptor alfa de folato (también conocido como FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, incluidos los del plexo coroideo, pulmón, tiroides, riñón, útero, mama, la trompa de Falopio, epidídimo y glándulas salivales. Weitman, SD y otros, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD y otros, Cancer Res 52: 6708-6711 (1992). Se ha observado una sobreexpresión del FRa en varios cánceres, incluido el cáncer de pulmón (por ejemplo, tumores carcinoides y cánceres de pulmón de células no pequeñas, tales como los adenocarcinomas); mesotelioma; cáncer de ovarios; cáncer de riñón; cáncer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplásico, astrocitoma pilocítico juvenil cerebeloso y metástasis cerebrales); cáncer de cuello uterino; cáncer de nasofaringe; tumor derivado del mesodérmico; carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello; cáncer endometrial; adenocarcinomas papilares serosos y endometrioides del ovario, cistoadenocarcinomas serosos del ovario, cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de páncreas; cáncer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); cáncer de hipófisis (por ejemplo, adenomas de hipófisis); cáncer colorrectal y cáncer de tiroides medular. Véanse, por ejemplo, la patente de los EE. UU. con número 7,754,698; el número de la publicación de la patente de los EE.UU. 2005/0232919; Int1. Número de la publicación WO 2009/132081; Bueno R y otros, J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2): 225-233 (2001); Elkanat H y Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Basal y otros, PLoS ONE, 4(7): 6292 (2009); Fisher RE J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA y otros, Int J Cancer, Supl. 8: 89-95 (1994); Hartmann lC y otros, Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S y otros, Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899 (2008); la publicación de la patente europea EP 2199796, Parker N. y otros, Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD y otros, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba NF y otros, Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R y otros, Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). En algunos tipos de cánceres (por ejemplo, el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), se asocia un alto nivel de expresión del FRa con un mal pronóstico, mientras que en otros tipos de cánceres (por ejemplo, cánceres de pulmón de células no pequeñas), un alto nivel de expresión del FRa se asocia con un pronóstico más favorable. Véase, por ejemplo, Iwakiri S y otros, Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Saba NF y otros, Head Neck, 31(4): 475-481 (2009).
La detección temprana del cáncer mejora las tasas de supervivencia y la calidad de vida. Para mejorar la probabilidad de detección y tratamiento tempranos, existe una necesidad apremiante de métodos no invasivos para diagnosticar los cánceres que expresan el FRa y para dar seguimiento a los cánceres existentes que expresan el FRa.
Mantovani LT y otros " Folate binding protein distribution in normal tissues and biological fluids from ovarian carcinoma patients as detected by the monoclonal antibodies MOv18 and MOv19", 1994, European Journal of Cancer, 30, 3, 1994, 363-369 describe las proteínas con unión a folato (FBP), que se sobreexpresan en los carcinomas de ovario, según lo detectan los anticuerpos monoclonales (MAb) MOv18 y MOv19, que reconocen dos epítopos diferentes de la gp38/FBP. Los análisis inmunohistoquímicos en secciones congeladas de los tejidos normales mostraron la presencia de la gp38/FBP en algunos epitelios. En los fluidos biológicos humanos, la gp38/FBP se detectó en ascitis en el 60 % de las pacientes con carcinoma de ovario y en el 29 % de aquellos con otros carcinomas, pero no en pacientes con tumores no epiteliales o con otras patologías no tumorales.
Eati Basal y otros "Functional Folate Receptor Alpha Is Elevated in the Blood of Ovarian Cancer Pacientes", PLOS ONE, 4, 7, 2009, 6292 describe que los pacientes con cáncer de ovario tienen niveles elevados del FRa en relación con los controles sanos y sugiere que el uso del FRa como un biomarcador para el cáncer de ovario puede ser factible Bueno y otros "The alpha folate receptor is highly activated in malignant pleural mesothelioma", Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121, 2, 2001, 225-233 describe que la mayoría de los mesoteliomas malignos sobreexpresan la proteína del receptor alfa de folato en comparación con los tejidos adyacentes normales, con estos hallazgos confirmados por el análisis Northern y los experimentos inmunohistoquímicos confirmaron estos hallazgos.
Smith y otros "A novel monoclonal antibody for detection of folate receptor alpha in paraffin-embedded tissues", Hybridoma, 26, 5, 2007, 281-288 describe que el análisis inmunohistoquímico del FR-alfa mediante el uso del clon BN3,2 de hibridoma en un panel de tejidos normales demostró la expresión limitada al epitelio ovárico, trofoblastos placentarios y túbulos renales proximales. El documento también describe que el BN3,2 es una herramienta sensible para la detección del FR-alfa en tejidos embebidos en parafina y apoya su uso en los estudios inmunohistoquímicos para determinar el papel del FR-alfa como un marcador de pronóstico de tumores y una posible diana terapéutica.
Konner y otros "Farletuzumab, a humanized monoclonal antibody against folate receptor alpha, in epithelial ovarian cancer: a phase I study ", Clinical Cancer Research, 16, 21, 2010, 5288-5295 describe un estudio del farletuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor de folato y su uso en el tratamiento del cáncer epitelial de ovario.
Coney y otros "Chimeric murine-human antibodies directed against folate binding receptor are efficient mediators of ovarian carcinoma cell killing", Cancer Research, 54, 9, 1994, 2448-2455, describe a los anticuerpos monoclonales (MAb) quiméricos murinos MOv18 (gamma 1, kappa) y MOv19 (gamma 2a, kappa) que reconocen diferentes epítopos en el receptor humano con unión al folato que se sobreexpresa en el 90 % de los tumores ováricos epiteliales no mucinosos.
Ebel y otros "Preclinical evaluation of MORAb-003, a humanized monoclonal antibody antagonizing folate receptoralpha" Cancer Immunity, 7, 2007, 6-13 describe un anticuerpo monoclonal humanizado terapéutico con alta afinidad por el FR-alfa, llamado MORAb-003, que se derivó de la optimización del anticuerpo LK26 con el uso de una plataforma de evolución genética de células completas. MORAb-003 posee nuevas funciones inhibidoras del crecimiento en las células que sobreexpresan el FR-alfa. Además, MORAb-003 provoca una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) robusta y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in vitro e inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores de ovario humanos en los ratones desnudos.
El documento WO 2008/0315277 describe a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, que se une específicamente al receptor alfa de folato (FRa), en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena ligera cuya región variable comprende al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: - RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3), - QASNKDT (SEQ ID NO: 4), - LQSKN- FPPYT (SEQ ID NO: 5) y en donde la región constante de dicha cadena ligera es una región constante kappa.
El documento WO 2006/11592 describe el uso de los anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen específicamente y como alternativa, tienen la capacidad de ser internalizados por las células que expresan el receptor alfa de folato (FRA) e inducir una actividad efectora inmunitaria tal como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos son útiles en la entrega específica de agentes farmacológicos a las células que expresan el FRA, así como para provocar una actividad efectora inmunitaria, particularmente en las células tumorales y precursores. La invención también está relacionada con los nucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, las células que expresan los anticuerpos; los métodos para detectar a las células cancerosas y los métodos para el tratamiento del cáncer con el uso de los anticuerpos.
Resumen
En el presente documento se proporcionan los anticuerpos que se unen específicamente al FRa. También se describen los polinucleótidos relacionados capaces de codificar los anticuerpos proporcionados, las células que expresan los anticuerpos proporcionados, así como los vectores asociados y los marcadores detectables de los anticuerpos. Además, se describen los métodos para usar los anticuerpos proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados se pueden usar para diagnosticar cáncer; seguir la progresión, la regresión o la enfermedad estable del cáncer; desarrollar un pronóstico del cáncer en un sujeto; para determinar si un paciente debe ser tratado o no por un cáncer o para determinar si un sujeto padece o no de un cáncer que expresa el FRa y, por lo tanto, puede ser susceptible al tratamiento con un terapéutico anticanceroso específico al FRa.
Según un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo con unión al antígeno, específico al receptor alfa de folato (FRa) que comprende
a. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; o
b. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
En determinadas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
En ciertas modalidades de a, el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo con unión al antígeno, específico al receptor alfa de folato (FRa) comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En ciertas modalidades de b, el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo con unión al antígeno, específico al receptor alfa de folato (FRa) comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 l y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
En un segundo aspecto se proporciona un anticuerpo aislado específico al receptor alfa de folato (FRa) que se produce por la línea celular depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11884 o PTA-11886.
En un tercer aspecto, se proporciona un método para detectar al receptor alfa de folato (FRa) o al cáncer que expresa el FRa en una muestra biológica, que comprende exposición de la muestra al anticuerpo de cualquiera de los aspectos o modalidades anteriores o al fragmento del mismo con unión al antígeno y detección del receptor alfa de folato (FRa). En determinadas modalidades, la muestra biológica se deriva de un ser humano, roedor, primate no humano, conejo o perro.
En un cuarto aspecto, se proporciona un método para diagnosticar un cáncer que expresa el receptor alfa de folato en un sujeto, que comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo del primer o segundo aspecto o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
b. cuantificar la cantidad del receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra;
c. comparar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra con un estándar conocido; y d. determinar si los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto se encuentran dentro de los niveles del receptor alfa de folato (FRa) asociados con el cáncer.
En determinadas modalidades, un hallazgo de que las células del adenocarcinoma del sujeto expresan el receptor alfa de folato indica que el sujeto tendrá una mayor probabilidad de una tasa de supervivencia a 5 años mejorada que si las células del adenocarcinoma no expresan el receptor alfa de folato.
En un quinto aspecto, se proporciona un método de seguimiento de un cáncer que expresa el receptor alfa de folato en un sujeto, que comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo del primer o segundo aspecto o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
b. cuantificar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra que está unido al anticuerpo o al fragmento del mismo con unión al antígeno;
c. comparar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra con
i. un estándar conocido o
ii. una muestra biológica obtenida del sujeto en un punto anterior en el tiempo; y
d. determinar si los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto son indicativos de progresión, regresión o enfermedad estable del cáncer.
En determinadas modalidades, la muestra biológica se deriva de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido, tejidos, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, muestras de aspiración con aguja fina o preparaciones histológicas.
En determinadas modalidades, el cáncer es un cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de ovario.
En determinadas modalidades, el cáncer es un cáncer de pulmón.
En determinadas modalidades, el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma.
En ciertas modalidades, el estándar conocido comprende
a. niveles del receptor alfa de folato (FRa) derivados de los sujetos identificados como libres de cáncer o una preparación de la proteína del receptor alfa de folato a una concentración conocida;
b. Niveles del FRa derivados de los sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio temprano que expresa el receptor alfa de folato;
c. Niveles del FRa derivados de los sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio intermedio que expresa el receptor alfa de folato; o
d. Niveles del FRa derivados de sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio avanzado que expresa el receptor alfa de folato.
En determinadas modalidades, el cáncer es un cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de ovario o cáncer de pulmón.
En determinadas modalidades, el método se lleva a cabo después del tratamiento del cáncer del sujeto.
En determinadas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está marcado.
En determinadas modalidades, el marcador es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL o una enzima.
En determinadas modalidades, el receptor alfa de folato (FRa) expuesto está unido o no a una célula.
En determinadas modalidades, la presencia de receptor alfa de folato (FRa) en la muestra se detecta con el uso de la transferencia de Western, inmunohistoquímica, citometría de flujo, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o ELISA.
En determinadas modalidades, los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto son indicativos del tipo de cáncer que padece el sujeto.
En determinadas modalidades, el cáncer es un adenocarcinoma de pulmón o carcinoma de pulmón de células escamosas.
En determinadas modalidades del primer o segundo aspecto, en donde el anticuerpo está marcado de forma detectable.
En determinadas modalidades, el marcador detectable es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL o una enzima.
En determinadas modalidades, el marcador es rutenio, 111In-DOTA, 111In-ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa o polihistidina.
En determinadas modalidades de los métodos, el anticuerpo o el fragmento con unión al antígeno se fija a un soporte sólido.
En determinadas modalidades de los métodos, los métodos comprenden además predecir un resultado favorable para un sujeto que tiene un adenocarcinoma que expresa el receptor alfa de folato (FRa), en donde un resultado favorable se define como tener una tasa de supervivencia de 5 años aumentada.
Anticuerpos específicos al Receptor Alfa de Folato (FRa)
En el presente documento se describen los anticuerpos aislados y los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son IgG murina o derivados de la misma.
En el presente documento se describen los anticuerpos aislados y los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente a las formas nativas o no reducidas del FRa. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son IgG murina o derivados de la misma. Si bien los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno ejemplificados en este documento son murinos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12 y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 45 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera. Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 49 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir los dominios variables de las cadenas ligera y pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13 y el dominio variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, se proporciona el anticuerpo 19D4.B7 (19D4) o los fragmentos del mismo con unión al antígeno, capaces de unirse a las formas nativa o no reducida del FRa.
En algunas modalidades, el anticuerpo 19D4 se produce por las células productoras del anticuerpo depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo del 2011 y se les ha asignado el número de acceso PTA-11884. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno tienen la afinidad de unión por el FRa de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden los CDR de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos.
También se describen polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente a las formas nativa o no reducida del FRa. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una secuencia en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, la SEQ ID NO: 44. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 46. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la SEQ ID NO: 48. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, la SEQ ID NO: 44. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ iD NO: 46; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la SEQ ID n O: 47 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la Se Q ID No : 48. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42; una CDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43 y una CDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, SEQ ID NO: 44 y una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 46; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la Se Q ID NO: 47 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la SEQ ID NO: 48. Las disposiciones de los CDR con unión al antígeno también se pueden construir con el uso de proteínas similares a los anticuerpos como andamiaje de los CDR. Tales proteínas construidas con unión al antígeno están dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden codificar los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, la SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45 y un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, la SEQ ID NO: 49. Los polinucleótidos capaces de codificar los segmentos de los dominios variables proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo o en diferentes vectores para producir los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno. Los polinucleótidos descritos en este documento pueden codificar el anticuerpo 19D4 o los fragmentos del mismo con unión al antígeno, capaces de unirse a las formas nativa o no reducida del FRa.
En el presente documento se describen los anticuerpos aislados y los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa, capaces de unirse a las formas nativas o no reducidas del FRa. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son IgG murina o derivados de la misma. Si bien los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno ejemplificados en este documento son murinos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20 y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 53 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 57 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir los dominios variables de las cadenas ligera y pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21 y el dominio variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25. En algunas modalidades, se proporciona el anticuerpo 24F12.B1 (24F12) o los fragmentos del mismo con unión al antígeno, capaces de unirse a las formas nativa o no reducida del FRa.
En algunas modalidades, el anticuerpo 24F12 se produce por las células productoras de anticuerpos depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo del 2011 y se les ha asignado el número de acceso PTA-11886. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno tienen la afinidad de unión por el FRa de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden los CDR de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos.
También se describen polinucleótidos que codifican anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una secuencia en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la SEQ ID NO: 52. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, la SEQ ID NO: 56. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la Se Q iD NO: 52. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, la SEQ ID NO: 56. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50; una CDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51 y una CDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la SEQ ID NO: 52 y una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, SEQ iD NO: 56. Las disposiciones de los CDR con unión al antígeno también se pueden construir con el uso de proteínas similares a los anticuerpos como andamiaje de los CDR. Tales proteínas construidas con unión al antígeno están dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21, por ejemplo, la SEQ ID NO: 53. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, la SEQ ID NO: 57. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21, por ejemplo, la SEQ ID NO: 53 y un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, la SEQ ID NO: 57. Los polinucleótidos capaces de codificar los segmentos de los dominios variables proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo o en diferentes vectores para producir los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno. Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden codificar el anticuerpo 24F12 o los fragmentos del mismo con unión al antígeno, capaces de unirse a las formas nativa o no reducida del FRa.
Se proporcionan los vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican al anticuerpo y al fragmento con unión al antígeno, así como las células que expresan los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. También se proporcionan las células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamífero (tales como las células CHO-K1), células de insectos (tales como las células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (tal como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma, como se describe en el presente documento.
Métodos para diagnosticar el cáncer
En el presente documento se proporcionan los métodos para diagnosticar un cáncer de mama, de tiroides, colorrectal, endometrial, de las trompas de Falopio, de ovario o de pulmón de origen epitelial en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación del nivel del FRa que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel del FRa en la muestra control es una indicación de que el sujeto padece o no de un cáncer que expresa el FRa.
En algunas modalidades, la muestra control puede derivarse de un sujeto que no padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la muestra control puede derivarse de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que no padece de un cáncer que expresa el FRa, un aumento observado en la cantidad del FRa presente en la muestra, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que no padece de un cáncer que expresa el FRa, una disminución o similitud observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que se evalúa no padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa, una similitud observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa, una disminución observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que se está evaluando no padece de un cáncer que expresa el FRa.
En algunas modalidades, el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. Pueden usarse métodos similares para determinar si un sujeto padece de un cáncer que no está asociado con una mayor producción del FRa. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede derivar de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación del nivel del FRa asociado con una célula o tejido que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel del FRa en la muestra control es una indicación de que el sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede ser células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas, y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación del nivel del FRa que no está asociado con una célula o tejido que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel del FRa en la muestra de control es una indicación de que el sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el nivel del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para determinar la presencia del FRa puede ser la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparaciones histológicas y similares.
En diversas modalidades de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer que expresa el FRa. En una modalidad particular, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de ovario. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de endometrio. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer colorrectal. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de mama. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de tiroides. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de las trompas de Falopio. En otra modalidad, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como un adenocarcinoma. Alternativamente, los métodos descritos pueden usarse para identificar el cáncer que no expresa el FRa, como el carcinoma de células escamosas. Por ejemplo, los métodos descritos podrían usarse para distinguir un cáncer de pulmón que expresa el FRa, como un adenocarcinoma, de un cáncer de pulmón que no expresa el FRa, como un carcinoma de células escamosas. Los métodos descritos podrían usarse para distinguir un cáncer de mama que expresa el FRa, como un fibroadenoma, de un cáncer de mama que no expresa el FRa, como un cistosarcoma. Además, los métodos descritos podrían usarse para distinguir un cáncer de tiroides que expresa el FRa, como un carcinoma papilar, de un cáncer de tiroides que no expresa el FRa, como un carcinoma medular. En algunas modalidades descritas en el presente documento, la detección de las células cancerosas que expresan el FRa en un sujeto puede usarse para determinar que el sujeto puede tratarse con un agente terapéutico dirigido contra el FRa. En algunas modalidades, el agente terapéutico dirigido contra el FRa puede ser un anticuerpo, tal como Farletuzumab.
En varios aspectos, el nivel del FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede entrar en contacto con más de un tipo de anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. Los anticuerpos tales como los descritos en este documento pueden usarse con esta función. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende los CDR de la cadena pesada y ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3
(d) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende el segmento del dominio variable de la cadena pesada y el segmento del dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1 o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo producido por cualquiera de las líneas celulares depositadas en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886 o PTA-11885 o un fragmento del mismo con unión al antígeno.
En determinadas modalidades, el nivel del FRa se determina mediante análisis de la transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FAGS) o ensayo ELISA.
En diversas modalidades de los aspectos anteriores de la invención, la muestra control es un nivel control del FRa estandarizado en un sujeto sano. En otras modalidades, la muestra control puede ser la proteína FRa a una concentración conocida (por ejemplo, una muestra de la proteína FRa recombinante o purificada). En algunas modalidades, los niveles del FRa observados del sujeto analizado pueden compararse con los niveles del FRa observados en las muestras de los sujetos que se sabe que tienen un cáncer que expresa el FRa o concentraciones conocidas del FRa.
Métodos de seguimiento del cáncer
En el presente documento se proporcionan los métodos para dar seguimiento al cáncer que expresa el FRa en un sujeto. Los métodos descritos pueden usarse antes del tratamiento del cáncer, después del tratamiento del cáncer o antes y después del tratamiento del cáncer. En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación del nivel del FRa que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra obtenida del sujeto en un momento punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con un nivel aumentado del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con un nivel disminuido del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en el nivel del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el nivel del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede derivar de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación del nivel del FRa asociado con una célula o tejido que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra obtenida del sujeto, de manera similar, en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con un nivel aumentado del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con un nivel disminuido del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en el nivel del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el nivel del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede ser células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas, y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación del nivel del FRa no asociado con una célula o tejido que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar el nivel observado del FRa con el nivel del FRa en una muestra obtenida del sujeto, de manera similar, en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre el nivel del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con un nivel aumentado del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con un nivel disminuido del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en el nivel del FRa, en relación con los niveles observados para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el nivel del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para determinar la presencia del FRa puede ser la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparaciones histológicas y similares.
En diversas modalidades de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer que expresa el FRa. En una modalidad particular, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de ovario. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de endometrio. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer colorrectal. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de mama. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de tiroides. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de las trompas de Falopio. En otra modalidad, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como un adenocarcinoma.
En varios aspectos, el nivel del FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede entrar en contacto con más de un tipo de anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. Los anticuerpos tales como los descritos en este documento pueden usarse con esta función. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende los CDR de la cadena pesada y ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3.
En determinadas modalidades, el nivel del FRa se determina mediante análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Los ejemplos adicionales del tema resumido se proporcionan con mayor detalle en la descripción detallada y en los ejemplos proporcionados y en las figuras asociadas.
Breve descripción de los dibujos
La invención se define en las reivindicaciones y cualesquiera figuras que quede fuera del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, sino que se proporciona únicamente con fines comparativos.
La Figura 1 muestra los patrones migratorios del FRa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El FRa se evaluó en la forma nativa (carril 2) o reducida y alquilada (carril 3).
La Figura 2 ilustra los residuos de aminoácidos del FRa (SEQ ID NO: 1) que comprenden los epítopos (regiones sombreadas) para los anticuerpos monoclonales 9F3, 24F12 y 26B3, según lo predicho por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio y métodos de acoplamiento.
La Figura 3 muestra cuatro transferencias de Western de recombinante purificado (A) y de lisados de células completas (B) de las células CHO que expresan el FRa o los homólogos de Fr FRp, FRr o FRA que se procesaron en geles de SDS-PAGE. Las proteínas se prepararon en tampón de muestra con o sin agentes reductores. Panel A, carril 1, marcadores de peso molecular, carriles 2-5. 0,5 pg del FRa, FRp, FRr y FRA reducidos respectivamente; carril 6, en blanco; carriles 7-10, 0,5 pg del FRa, FRp, FRr y FRA no reducidos, respectivamente. La banda positiva representa la única especie reactiva en cada carril y corresponde a un peso molecular de ~ 38 kDa. Panel B, carril 1 marcadores de peso molecular, carril 2 lisados de células enteras CHO-FRa, carril 3 lisados de células enteras CHO-FRp, carril 4 lisados de células enteras CHO-FRA preparados en tampón de muestra sin agentes reductores y fraccionados en un gel SDS-PAGE. Cada panel se prueba con el mAb antiFRa designado marcado a la derecha. Los pesos moleculares de FR son: FRa ~ 38 kDa; FRp ~ 30 kDa; FRr ~ 28 kDa; FRA ~ 26 kDa. Los anticuerpos LK26 y BN3,2 que reconocen al FRa en condiciones desnaturalizadas y no reducidas o reducidas, respectivamente, se utilizaron como controles positivos.
La Figura 4 muestra una muestra de tejido de cáncer de ovario seroso papilar embebido en parafina, fijada con formalina y sondada para detectar la presencia del FRa con el anticuerpo monoclonal 26B3.
La Figura 5 muestra la expresión del FRa en tejidos normales. Las muestras normales de pulmón (A) y riñón (B) teñidas con el anticuerpo 26B3 demuestran que la expresión del FRa está muy restringida a las células epiteliales y tiene una distribución predominantemente apical (las imágenes tienen un aumento de 20x).
La Figura 6 proporciona una representación gráfica que compara las puntuaciones M para el adenocarcinoma de pulmón generado con el uso del anticuerpo 26B3 o del anticuerpo BN3,2.
La Figura 7 muestra la tinción del FRa de los subtipos histológicos del carcinoma de pulmón de células no pequeñas: (A) adenocarcinoma de pulmón a 20x, (B) adenocarcinoma de pulmón a 40x, (C) adenoescamoso de pulmón a 20x y (D) carcinoma de células escamosas de pulmón a 40x.
La figura 8 proporciona una representación gráfica que compara las puntuaciones M para las muestras duplicadas (núcleos) del adenocarcinoma de pulmón teñidas con el anticuerpo 26B3.
La Figura 9 ilustra la puntuación M para la distribución del FRa del adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma de células escamosas. Las puntuaciones M medias fueron 19,84 (± 18,64) y 1,39 (± 5,54), respectivamente (p < 0,0001).
La Figura 10 muestra la expresión del FRa en tres muestras de aspiración con aguja fina (FNA) del adenocarcinoma de pulmón (A), (B) y (C). La tinción del material de trozo celular de las f Na de los ganglios linfáticos con el anticuerpo 26B3 demostró una tinción satisfactoria del FRa, con expresión limitada a las células epiteliales con distribución apical.
La Figura 11 ilustra las funciones de supervivencia (muerte o censura) para sujetos con adenocarcinoma de pulmón que se consideraron positivos para el FRa y negativos para el FRa mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido con el uso del anticuerpo 26B3.
La Figura 12 muestra imágenes representativas de micromatrices de tejido (TMA) teñidos con el anticuerpo 26B3 a un aumento de 20x o 40x para (A) carcinoma ductal in situ, (B) -(D) carcinoma ductal invasivo.
La Figura 13 proporciona una representación gráfica de la distribución de la puntuación M, determinada mediante la tinción con 26B3, en relación con el subtipo molecular (her-2 (+) y her-2 (-)) de la muestra de cáncer de mama.
La Figura 14 (AD) muestra muestras histológicas representativas de la etapa IV, cánceres de mama her2 negativos teñidos con el anticuerpo 26B3 con un aumento de 20x o 40x.
La Figura 15 muestra imágenes representativas de las muestras de cáncer de mama metastásico obtenidas por aspiración con aguja fina teñidas con el anticuerpo 26B3.
La Figura 16 muestra la expresión del FRa en el carcinoma seroso de ovario. (A) Con un aumento de 10x son visibles las tinciones de membrana fuerte 3+ (campo derecho) y moderada 2+ (campo superior izquierdo). (B) Muestra la misma área que (A) con un aumento de 20x, lo que confirma una tinción de membrana circunferencial gruesa y fuerte de 3+ (campo derecho). La tinción moderada de la membrana 2+ (campo superior izquierdo) tiene una tinción más débil y fina que la 3+ y es circunferencial o localizada en los bordes luminales. (C) muestra que la tinción débil de la membrana 1+ se limita a los bordes luminales y requiere un aumento de 40x para visualizar. (D) Las células epiteliales de la superficie ovárica y las células estromales corticales subyacentes son completamente negativas (aumento de 20x).
La Figura 17 muestra que la expresión del FRa está limitada a los bordes luminales del endometrio normal con una intensidad débil de 1+ y moderada de 2+ a aumentos de 40x (A). Se puede observar una tinción fuerte de la membrana (3+) en los bordes luminales de la hiperplasia compleja atípica con un aumento de 20x (B).
La Figura 18 muestra una tinción fuerte del FRa de membrana (3+) en los bordes luminales del adenocarcinoma de endometrio de grado 1 (A). Además, muchas células tumorales tienen tinción citoplasmática 2+ o 3+ (aumento de 20x). La tinción del FRa de membrana (2+ y 3+) está presente en los bordes luminales del adenocarcinoma de endometrio de grado 2; la tinción citoplasmática es débil (aumento de 20x) (B). Aproximadamente el 50 % de las células tumorales del adenocarcinoma de endometrio de grado 3 muestran una tinción de membrana circunferencial y fuerte 3+ con tinción citoplasmática débil a un aumento de 40x (C).
La Figura 19 muestra un adenocarcinoma con metaplasia escamosa con aproximadamente el 80 % de células escamosas metaplásicas con tinción del FRa de membrana de 2+ y 3+ y tinción citoplasmática del FRa de 1+ y 2+ a un aumento de 20x (A). El carcinoma de células claras de las células tumorales del endometrio tiene grandes núcleos irregulares, nucléolos prominentes y abundante citoplasma claro. La mayoría de estas células tumorales tienen tinción del FRa de membrana de 2+ o 3+ a un aumento de 40x (B).
La Figura 20 muestra que las células ciliadas y no ciliadas de las trompas de Falopio normales tienen una tinción del FRa de membrana de 3+ en los bordes de las células luminales y laterales (A). La tinción citoplasmática también es evidente (aumento de 20x). (B) Salpingitis crónica con abundantes linfocitos y células plasmáticas en el estroma. Las células de la mucosa retienen la tinción del FRa de 3+ en los bordes luminales (aumento de 20x). (C) Las células tumorales de adenocarcinoma seroso tubárico de grado 2 forman proyecciones papilares complejas y muestran tinción del FRa de membrana de 3+ en los bordes celulares luminales y laterales, con tinción citoplasmática también evidente (aumento de 20x).
La Figura 21 representaciones de los quistes serosos/tubáricos corticales de ovario. Las células de revestimiento revelan una tinción citoplasmática y de membrana fuerte de 3+ (aumento de 20x).
Descripción detallada de las modalidades ilustrativas
La siguiente descripción caracteriza a los anticuerpos y los fragmentos de los mismos con unión al antígeno, que se unen específicamente al FRa. También se describen polinucleótidos relacionados capaces de codificar estos anticuerpos y fragmentos con unión al antígeno, células que expresan los anticuerpos y fragmentos con unión al antígeno, así como vectores asociados y marcadores de anticuerpos detectables. Además, se describen los métodos para el uso de los anticuerpos y de los fragmentos con unión al antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados y los fragmentos con unión al antígeno pueden usarse para diagnosticar cáncer de ovario, mama, tiroides, colorrectal, endometrial, de las trompas de Falopio o de pulmón; dar seguimiento a la progresión, regresión o enfermedad estable del cáncer de ovario, mama, tiroides, colorrectal, endometrio, trompas de Falopio o pulmón; para determinar si un paciente debe ser tratado o no por cáncer o para determinar si un sujeto padece o no de un cáncer que expresa el FRa y, por lo tanto, puede ser susceptible al tratamiento con un terapéutico anticanceroso específico del FRa.
Definiciones
Se utilizan varios términos relacionados con los aspectos de la descripción a lo largo de la especificación y las reivindicaciones. Tales términos se les debe dar su significado corriente en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con las definiciones proporcionadas en el presente documento.
Tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.
El término "aproximadamente" como se usa en este documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de hasta ± 10 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reacción, etc., usados en la especificación y en las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención.
A pesar de que los rangos numéricos y los parámetros que establecen en lo adelante el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene de forma inherente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
"Aislado" significa que un componente biológico (tales como un ácido nucleico, péptido o proteína) que ha sido sustancialmente separado, producido aparte de o purificado de otros componentes biológicos del organismo en donde el componente se encuentra naturalmente, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos y proteínas. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas que se han "aislado" incluyen, por lo tanto, ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación comunes. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas "aislados" que pueden ser parte de una composición y aun así aislarse si dicha composición no es parte del entorno nativo del ácido nucleico, péptido o proteína. El término también incluye los ácidos nucleicos, péptidos y las proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como los ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
"Polinucleótido", denominado como sinónimo a "molécula de ácido nucleico" o "ácidos nucleicos", se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, lo más normal, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como la inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones en el ADN y el ARN; por lo tanto, "polinucleótido" incluye las formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de los polinucleótidos como se encuentran normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas del ADN y ARN características de los virus y de las células. "Polinucleótido" también incluye las cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, a menudo denominadas oligonucleótidos.
El significado de "sustancialmente igual" puede diferir dependiendo del contexto en donde se use el término. Debido a la variación natural de la secuencia que probablemente exista entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican, uno esperaría encontrar algún nivel de variación dentro de las secuencias de aminoácidos o los genes que codifican los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en este documento, con poca o ningún impacto en sus propiedades de unión únicas (por ejemplo, especificidad y afinidad). Tal expectativa se debe en parte a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo de las variaciones conservadas de la secuencia de aminoácidos, que no alteran apreciablemente la naturaleza de la proteína codificada. Por consiguiente, en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos, "sustancialmente igual" significa al menos un 65 % de identidad entre dos o más secuencias. Preferentemente, el término se refiere a al menos 70 % de identidad entre dos o más secuencias, más preferentemente al menos 75 % de identidad, más preferentemente al menos 80 % de identidad, más preferentemente al menos 85 % de identidad, más preferentemente al menos 90 % de identidad, más preferentemente al menos 91 % de identidad, más preferentemente al menos 92 % de identidad, más preferentemente al menos 93 % de identidad, más preferentemente al menos 94 % de identidad, más preferentemente al menos 95 % de identidad, más preferentemente al menos 96 % de identidad, más preferentemente al menos al menos un 97 % de identidad, más preferentemente al menos un 98 % de identidad y más preferentemente al menos un 99 % o más de identidad. Tal identidad se puede determinar con el uso del algoritmo nBLAST (Altschul et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7).
El grado de variación que puede ocurrir dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína sin tener un efecto sustancial sobre la función de la proteína es mucho menor que el de una secuencia de ácido nucleico, ya que los mismos principios de degeneración no se aplican a las secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, en el contexto de un anticuerpo o de un fragmento con unión al antígeno, "sustancialmente igual" significa anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos. Otras modalidades incluyen anticuerpos específicos al FRa o los fragmentos con unión al antígeno, que tienen marco, armazón u otras regiones de no unión que no comparten una identidad significativa con los anticuerpos y con los fragmentos con unión al antígeno descritos en este documento, pero sí incorporan uno o más CDR u otras secuencias necesarias para conferir unión que son 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a tales secuencias descritas en el presente documento.
Un "vector" es un replicón, tal como plásmido, fago, cósmido o virus en donde se puede insertar operativamente otro segmento de ácido nucleico para provocar la replicación o expresión del segmento.
Una célula se ha "transformado" cuando se han introducido ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, tal como el ADN que se ha introducido en el interior de la célula. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable o "célula estable" se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante varias generaciones. En algunos ejemplos proporcionados en el presente documento, las células se transforman mediante la transfección de las células con el ADN.
Los términos "expresar" y "producir" se usan como sinónimos en este documento y se refieren a la biosíntesis de un producto génico. Estos términos abarcan la transcripción de un gen en ARN. Estos términos también abarcan la traducción del ARN en uno o más polipéptidos y además abarcan todas las modificaciones postraduccionales y postraduccionales que ocurren naturalmente. La expresión o producción de un anticuerpo o de un fragmento del mismo con unión al antígeno puede estar dentro del citoplasma de la célula o en el entorno extracelular tal como el medio de crecimiento de un cultivo celular.
Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o mejora de una lesión, patología o afección, incluido cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tales como reducción, remisión, disminución de los síntomas o hacer la enfermedad más tolerable para el paciente, disminuyendo la velocidad de degeneración o declive, haciendo que el punto final de la degeneración sea menos debilitante, mejorando el bienestar físico o mental del sujeto o prolongando la duración de la supervivencia. El tratamiento puede evaluarse mediante parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen físico, examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.
"Anticuerpo" se refiere a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY) que incluyen varias formas monoméricas y poliméricas de cada isotipo, a menos que se especifique lo contrario.
Los fragmentos con unión al antígeno son cualquier estructura proteica que puede exhibir afinidad de unión por un antígeno particular. Algunos fragmentos con unión al antígeno están compuestos por porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo parental. Por ejemplo, los fragmentos con unión al antígeno pueden comprender al menos una región variable (una región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera) o uno o más CDR de un anticuerpo que se sabe que se une a un antígeno particular. Los ejemplos de los fragmentos con unión al antígeno adecuados incluyen, sin limitación, diacuerpos y moléculas de cadena simple, así como moléculas Fab, F (ab')2, Fc, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena simple (Sc), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quiméricas entre las cadenas de los anticuerpos 0 CDR y otras proteínas, armazones de proteínas, monómeros o dímeros de la cadena pesada, monómeros o dímeros de la cadena ligera, dímeros que constan de una cadena pesada y una ligera y similares. Todos los isotipos de los anticuerpos pueden usarse para producir los fragmentos con unión al antígeno. Además, los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir marcos proteicos no derivados de anticuerpos que pueden incorporar con éxito segmentos polipeptídicos en una orientación que confiera afinidad por un antígeno de interés dado, tales como las armazones proteicas. Los fragmentos con unión al antígeno se pueden producir de forma recombinante o mediante escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos. La frase "un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno" puede usarse para indicar que un fragmento con unión al antígeno dado incorpora uno o más segmentos de aminoácidos del anticuerpo al que se hace referencia en la frase.
La "unión específica" cuando se usa en el contexto de los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos, representa la unión a través de dominios codificados por genes de inmunoglobulina o los fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen ni se unen sustancialmente a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas antigénicas. Normalmente, un anticuerpo se une a un antígeno afín con una Kd de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M, según se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión celular.
El término "sujeto" se refiere a animales humanos y no humanos, incluidos todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios y reptiles. En muchas modalidades de los métodos descritos, el sujeto es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, el término "receptor alfa de folato" (también denominado FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se refiere a la isoforma alfa del receptor de alta afinidad por el folato. El FRa unido a la membrana se une a la superficie celular mediante un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Las formas solubles del FRa pueden derivarse de la acción de proteasas o fosfolipasa sobre receptores de folato anclados a la membrana. La secuencia de aminoácidos del FRa humano se expone en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Las variantes, por ejemplo, las variantes alélicas que ocurren naturalmente o las secuencias que contienen al menos una sustitución de aminoácidos, se abarcan en los términos como se usan en este documento. Como apreciarán los expertos en la técnica, las formas asociadas y no asociadas a las células del FRa humano pueden abarcar formas variantes de la SEQ ID NO: 1.
El término "muestra", como se usa en este documento, se refiere a una colección de fluidos, células o tejidos similares (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), aislado de un sujeto, así como fluidos, las células o tejidos presentes dentro de un sujeto. En algunas modalidades, la muestra es un fluido biológico. Los fluidos biológicos son normalmente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos que ocurren de manera natural presentes en, retirado de, expresados o extraídos de otro modo de un sujeto o de una fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos se derivan de los tejidos, órganos o regiones localizadas particulares y ciertos otros fluidos biológicos pueden estar situados de manera más global o sistémica en un sujeto o en una fuente biológica. Ejemplos de los fluidos biológicos incluyen la sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, líquido quístico, gotas de lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosales de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos ascíticos tales como los asociados con los tumores no sólidos, fluidos de las cavidades pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial y similares.
Los fluidos biológicos también pueden incluir soluciones líquidas puestas en contacto con un sujeto o una fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos que incluye medio acondicionado de células u órganos, fluidos de lavado y similares. El término "muestra", como se usa en el presente documento, abarca materiales extraídos de un sujeto o materiales presentes en un sujeto.
El término "progresión", como se utiliza en el contexto de la progresión de un cáncer que expresa el FRa, incluye el cambio de un cáncer de un estado menos grave a uno más grave. Esto podría incluir un aumento en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer crece o se propaga y similares. Por ejemplo, "la progresión del cáncer de ovario" incluye la progresión de dicho cáncer de un estado menos grave a uno más grave, tales como la progresión del estadio I al estadio II, del estadio II al estadio III, etc.
El término "regresión", como se usa en el contexto de regresión de un cáncer que expresa el FRa, incluye el cambio de un cáncer de un estado más severo a uno menos severo. Esto podría incluir una disminución en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer crece o se propaga y similares. Por ejemplo, "la regresión del cáncer de ovario" incluye la regresión de dicho cáncer de un estado más severo a uno menos severo, como la progresión del estadio III al estadio II, del estadio II al estadio I, etc.
El término "estable", como se usa en el contexto de un cáncer estable que expresa el FRa, pretende describir una condición de la enfermedad que no ha cambiado o no ha cambiado lo suficientemente significativamente durante un período de tiempo clínicamente relevante para ser considerado un cáncer que progresa o un cáncer que regresa.
Las modalidades descritas en el presente documento no se limitan a métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, que, por supuesto, pueden variar.
Anticuerpos específicos al FRa y los fragmentos con unión al antígeno
En el presente documento se describen los anticuerpos monoclonales aislados o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. La estructura general de una molécula de anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno, que incluye las cadenas pesada y ligera y el dominio Fc, que cumple una variedad de funciones, incluida la fijación del complemento y la unión a receptores de anticuerpos.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos incluyen todos los isotipos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y multímeros sintéticos de la estructura de inmunoglobulina de cuatro cadenas. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos también incluyen el isotipo IgY que se encuentra generalmente en suero de gallina o pavo y en la yema de huevo de gallina o pavo.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en la sección de ejemplos se derivan de ratones. Pueden derivarse anticuerpos similares de cualquier especie por medios recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden ser quiméricos de rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, pollo, conejo, camélido, burro, humano y similares. Para su uso en la administración a seres humanos, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno no derivados de seres humanos se pueden alterar genética o estructuralmente para que sean menos antigénicos tras la administración a un paciente humano.
En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son quiméricos. Como se usa en este documento, el término "quimérico" se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que tiene al menos una parte de al menos un dominio variable derivado de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de un mamífero no humano, un roedor o un reptil, mientras que las porciones restantes del anticuerpo o del fragmento del mismo con unión al antígeno, se derivan de un ser humano. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender un dominio de unión al antígeno de ratón con un Fc humano u otro dominio estructural similar.
En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o los fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F (ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos con unión al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplaza por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como el ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede incluir al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento pueden presentarse en una variedad de formas, pero incluirán uno o más de los segmentos del dominio variable de anticuerpo o CDR mostrados en la Tabla 1. Los isotipos de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 se muestran entre paréntesis para describir la región constante de cada anticuerpo, que se sabe que tienen secuencias conservadas.
Tabla 1. Segmentos de anticuerpos de los anticuerpos descritos y fragmentos de los mismos con unión al antígeno ("Lc" indica la cadena ligera y "Hc" indica la cadena pesada).
Figure imgf000016_0001
Continuación
Figure imgf000017_0001
Continuación
Figure imgf000018_0001
Continuación
Figure imgf000019_0001
Continuación
Figure imgf000020_0001
Continuación
Figure imgf000021_0001
En el presente documento se describen los anticuerpos aislados y los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son IgG murina o derivados de la misma. Si bien los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno ejemplificados en este documento son murinos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12 y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 14; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 16.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 45 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera. Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 49 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir los dominios variables de las cadenas ligera y pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13 y el dominio variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17.
En algunas modalidades, los anticuerpos se producen por las células productoras de anticuerpos depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo del 2011 y se les ha asignado el número de acceso PTA-11884. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno tienen la afinidad de unión por el FRa de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden los CDR de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos.
También se describen polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una secuencia en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, la SEQ ID NO: 44. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 46. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la SEQ ID NO: 48. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, la SEQ ID NO: 44. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 46; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la SEQ ID NO: 48. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42; una CDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43 y una CDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 12, por ejemplo, SEQ ID NO: 44 y una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 14, por ejemplo, la SEQ ID NO: 46; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 15, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 16, por ejemplo, la SEQ ID NO: 48. Las disposiciones de los CDR con unión al antígeno también se pueden construir con el uso de proteínas similares a los anticuerpos como andamiaje de los CDR. Tales proteínas construidas con unión al antígeno están dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden codificar los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, la SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 13, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45 y un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, la SEQ ID NO: 49. Los polinucleótidos capaces de codificar los segmentos de los dominios variables proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo vector o en diferentes vectores para producir anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno.
En el presente documento se describen los anticuerpos aislados y los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno son IgG murina o derivados de la misma. Si bien los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno ejemplificados en este documento son murinos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una secuencia de aminoácidos en el CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20 y también tiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos en el CDR1 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 22; una secuencia de aminoácidos en el CDR2 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos en el CDR3 sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 24.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 53 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25. En algunas modalidades, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 57 puede codificar esta secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos pueden incluir los dominios variables de las cadenas ligera y pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21 y el dominio variable de la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25.
En algunas modalidades, los anticuerpos son producidos por células productoras de anticuerpos depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo del 2011 y se les ha asignado el número de acceso PTA-11886. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno tienen la afinidad de unión por el FRa de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden los CDR de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos. En algunas modalidades, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con unión al antígeno comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células depositadas productoras de los anticuerpos.
También se describen polinucleótidos que codifican anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una secuencia en el CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la SEQ ID NO: 52. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR2 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55. En algunas modalidades, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR3 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, la SEQ ID NO: 56. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la Se Q iD NO: 52. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, la SEQ ID NO: 56. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que tiene una CDR1 de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, la SEQ ID NO: 50; una CDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 19, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51 y una CDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 20, por ejemplo, la SEQ ID NO: 52 y una CDR1 de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 22, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54; una CDR2 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 23, por ejemplo, la SEQ ID NO: 55 y una CDR3 sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, SEQ iD NO: 56. Las disposiciones de los CDR con unión al antígeno también se pueden construir con el uso de proteínas similares a los anticuerpos como andamiaje de los CDR. Tales proteínas construidas con unión al antígeno están dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21, por ejemplo, la SEQ ID NO: 53. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, la SEQ ID NO: 57. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 21, por ejemplo, la SEQ ID NO: 53 y un segmento del dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, la SEQ iD NO: 57. Los polinucleótidos capaces de codificar los segmentos de los dominios variables proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo vector o en diferentes vectores para producir anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno.
Los polinucleótidos que codifican las proteínas construidas con unión al antígeno también están dentro del alcance de la divulgación. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos (y los péptidos que codifican) incluyen una secuencia líder. Puede emplearse cualquier secuencia líder conocida en la técnica. La secuencia líder puede incluir, pero no se limita a, un sitio de restricción o un sitio de inicio de la traducción.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en este documento incluyen variantes que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos únicos o múltiples que retienen las propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad de unión o actividad efectora inmunitaria) de los anticuerpos o de los fragmentos con unión al antígeno descritos. El experto en la materia puede producir variantes que tengan sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos únicos o múltiples. Estas variantes pueden incluir: (a) variantes en las que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos con aminoácidos conservados o no conservados, (b) variantes en las que uno o más aminoácidos se añaden o se eliminan del polipéptido, (c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente y (d) variantes en las que el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido, tales como un compañero de fusión, una etiqueta de proteína u otra parte química, que pueden conferir propiedades útiles al polipéptido, tales como, por ejemplo, un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un parte de biotina y similares. Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento pueden incluir variantes en las que los residuos de los aminoácidos de una especie se sustituyen por el residuo correspondiente en otra especie, en las posiciones conservadas o no conservadas. En otras modalidades, los residuos de aminoácidos en las posiciones no conservadas se sustituyen por residuos conservados o no conservados. Las técnicas para obtener estas variantes son conocidas por el experto en la materia, que incluyen a las técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento pueden incorporar varios isotipos de anticuerpos, tales como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. La especificidad del anticuerpo o del fragmento del mimo con unión al antígeno está determinada en gran medida por la secuencia de aminoácidos y la disposición de los CDR. Por lo tanto, los CDR de un isotipo se pueden transferir a otro isotipo sin alterar la especificidad al antígeno. Alternativamente, se han establecido técnicas para hacer que las hibridomas pasen de producir un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad al antígeno. En consecuencia, tales isotipos de anticuerpos están dentro del alcance de los anticuerpos descritos o los fragmentos con unión al antígeno.
Los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento tienen afinidades de unión (en M) por el FRa que incluyen una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M. En una modalidad, el anticuerpo 9F3 tiene una afinidad por el FRa de 7,15 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 19D4 tiene una afinidad por el FRa de 5,67 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 24F12 tiene una afinidad por el FRa de 1,02 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 26B3 tiene una afinidad para el FRa de 2,73 x 10-11 M. En una modalidad, el anticuerpo 9F3 tiene una afinidad por el FRa de aproximadamente 6,5 x 10-10 M a aproximadamente 8 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 19D4 tiene una afinidad por el FRa de aproximadamente 5 x 10-10 M a aproximadamente 6,5 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 24F12 tiene una afinidad por el FRa de aproximadamente 0,5 x 10-10 M a aproximadamente 2 x 10-10 M. En una modalidad, el anticuerpo 26B3 tiene una afinidad por el FRa de aproximadamente 1 x 10-11 M hasta aproximadamente 3,5 x 10-11 M.
También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos en este documento. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Los vectores de expresión recombinante que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés se contemplan, por lo tanto, dentro del alcance de esta descripción. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales tales como, pero sin limitarse a ellas, secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador), un marcador de selección y una señal de poliadenilación. Los vectores para transformar una amplia variedad de células huésped se conocen bien e incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (Ba C), cromosomas artificiales de levadura (YAC), así como otros vectores de bacterias, levaduras y virus.
Los vectores de expresión recombinantes dentro del alcance de la descripción incluyen fragmentos de ácido nucleico sintéticos, genómicos o derivados de ADNc que codifican al menos una proteína recombinante que puede estar operativamente unida a elementos reguladores adecuados. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor transcripcional, secuencias que codifican sitios adecuados de unión ribosomal al ARNm y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Los vectores de expresión, especialmente los vectores de expresión de mamíferos, también pueden incluir uno o más elementos no transcribibles tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados ligados al gen que se va a expresar, otras secuencias no transcribibles flanqueantes 5' o 3', secuencias no traducibles 5' o 3' (tales como los sitios necesarios de unión a ribosomas), un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme o secuencias de terminación de la transcripción. También se puede incorporar un origen de replicación que confiera la capacidad de replicarse en un hospedador.
Las secuencias de control de la transcripción y de la traducción en los vectores de expresión que se utilizarán en la transformación de las células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes virales. Pueden construirse vectores de ejemplo como describen Okayama y Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).
En algunas modalidades, la secuencia codificante del anticuerpo o del fragmento con unión al antígeno se coloca bajo el control de un poderoso promotor constitutivo, tales como los promotores de los siguientes genes: hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRt ), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y otros. Además, muchos promotores virales funcionan de manera constitutiva en las células eucariotas y son adecuados para su uso con las modalidades descritas. Dichos promotores virales incluyen, sin limitación, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Maloney, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del sarcoma de Rous (RSV) y otros retrovirus y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. En una modalidad, la secuencia que codifica el anticuerpo o el fragmento del mismo con unión al antígeno se coloca bajo el control de un promotor inducible tales como el promotor de la metalotioneína, el promotor inducible por tetraciclina, el promotor inducible por doxiciclina, los promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE) tales como la proteína quinasa R, 2',5'-oligoadenilato sintetasas, genes Mx, ADAR1 y similares.
Los vectores descritos en el presente documento pueden contener uno o más sitios internos de entrada de ribosomas (IRES). La inclusión de una secuencia IRES en los vectores de fusión puede resultar beneficiosa para potenciar la expresión de algunas proteínas. En algunas modalidades, el sistema de vector incluirá uno o más sitios de poliadenilación (por ejemplo, SV40), que pueden estar corriente arriba o corriente abajo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente. Los componentes del vector pueden estar unidos de forma contigua o dispuestos de una manera que proporcione un espaciado óptimo para expresar los productos génicos (es decir, mediante la introducción de nucleótidos "espaciadores" entre los ORF) o posicionados de otra manera. Los elementos reguladores, como el motivo IRES, también pueden disponerse para proporcionar un espaciado óptimo para la expresión.
Los vectores pueden comprender marcadores de selección, que son bien conocidos en la técnica. Los marcadores de selección incluyen marcadores de selección positivos y negativos, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la kanamicina, un gen de resistencia a la tetraciclina, un gen de resistencia a la penicilina), genes de glutamato sintasa, HSV-TK, derivados de HSV-TK para la selección por ganciclovir o gen de fosforilasa de nucleósido de purina bacteriana para la selección por 6-metilpurina (Gadi y otros, 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o el sitio de clonación puede estar corriente arriba o corriente abajo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés o sitio de clonación.
Los vectores descritos en el presente documento pueden usarse para transformar diversas células con los genes que codifican los anticuerpos descritos o los fragmentos con unión al antígeno. Por ejemplo, los vectores se pueden usar para generar células productoras de anticuerpos o de los fragmentos con unión al antígeno. Por lo tanto, otro aspecto incluye a las células hospedadoras transformadas con los vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno que se une específicamente al FRa, tales como los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos y ejemplificados en el presente documento.
En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes extraños en las células y se pueden usar para construir las células recombinantes con el propósito de llevar a cabo los métodos descritos, de acuerdo con las diversas modalidades descritas y ejemplificadas en el presente documento. La técnica utilizada debe permitir la transferencia estable de la secuencia del gen heterólogo a la célula huésped, de modo que la secuencia del gen heterólogo sea heredable y expresable por la progenie celular y de modo que no se interrumpan el desarrollo y las funciones fisiológicas necesarias de las células receptoras. Las técnicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, transferencia de cromosomas (por ejemplo, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, microtransferencia de genes mediada por células), métodos físicos (por ejemplo, transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, portador de liposomas), transferencia de vectores virales (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). La precipitación con fosfato de calcio y la fusión inducida por polietilenglicol (PEG) de los protoplastos bacterianos con las células de mamífero también pueden usarse para transformar las células.
Las células adecuadas para usar en la expresión de los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en este documento son preferentemente células eucariotas, más preferentemente células de origen vegetal, roedor o humano, por ejemplo, pero sin limitarse a las células NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293, COS-7, T98G, CV-1/e BnA, L, Cl27, 3T3, HeLa, NS1, células de mieloma Sp2/0 y líneas celulares BHK, entre otras. Además, la expresión de los anticuerpos se puede lograr con el uso de las células de hibridoma. Los métodos para producir las hibridomas están bien establecidos en la técnica.
Las células transformadas con los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden seleccionarse o tamizarse para la expresión recombinante de los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento. Las células recombinantes positivas se expanden y se tamizan en busca de subclones que exhiban un fenotipo deseado, tales como un alto nivel de expresión, propiedades de crecimiento mejoradas o la capacidad de producir proteínas con las características bioquímicas deseadas, por ejemplo, debido a la modificación de proteínas o a las modificaciones postraduccionales alteradas. Estos fenotipos pueden deberse a las propiedades inherentes de un subclón dado o a una mutación. Las mutaciones pueden efectuarse mediante el uso de productos químicos, luz con longitud de onda UV, radiación, virus, mutágenos de inserción, inhibición de la reparación por no complementariedad del ADN o una combinación de tales métodos.
En el presente documento se proporcionan los métodos para detectar el FRa en una muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, descrito en el presente documento. Como se describe en el presente documento, la muestra puede derivar de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunos ejemplos, los métodos descritos incluyen la detección del FRa en una muestra mediante el contacto de la muestra con:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1;
(d) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende el segmento del dominio variable de la cadena pesada y el segmento del dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1 o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo producido por cualquiera de las líneas celulares depositadas en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886 o PTA-11885 o un fragmento del mismo con unión al antígeno.
En algunos ejemplos, la muestra puede ponerse en contacto con más de uno de los anticuerpos o los fragmentos con unión al antígeno descritos en el presente documento. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego ponerse en contacto con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, en donde el primer anticuerpo o el fragmento con unión al antígeno y el segundo anticuerpo o el fragmento con unión al antígeno no es el mismo anticuerpo o fragmento con unión al antígeno. En algunos ejemplos, el primer anticuerpo o el fragmento del mismo con unión al antígeno puede fijarse a una superficie, tales como una placa de pocillos múltiples, un chip o un sustrato similar antes de ponerse en contacto con la muestra. En otros ejemplos, el primer anticuerpo o el fragmento del mismo con unión al antígeno puede no fijarse o unirse a nada en absoluto antes de entrar en contacto con la muestra.
Pueden usarse diversas combinaciones de los anticuerpos o de los fragmentos de los mismos con unión al antígeno para detectar el FRa en una muestra. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los C D R l, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego puesto en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner primero en contacto con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego puesto en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego puesto en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se indica en la Tabla 1). En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se indica en la Tabla 1) y luego en contacto por separado con un segundo anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos del segmento del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se indica en la Tabla 1). En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC. PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC pTa -11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego contactarse por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego contactarse por separado con un segundo anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento con unión al antígeno del mismo y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego ponerse en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se pone en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11885 o con un fragmento con unión al antígeno del mismo y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En una modalidad, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11884 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento con unión al antígeno del mismo y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso ATCC PTA-11885 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno. En un ejemplo, la muestra se puede poner en contacto primero con un anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11886 o con un fragmento con unión al antígeno del mismo y luego se puede poner en contacto por separado con un segundo anticuerpo capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo producido por la línea celular que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11887 o con un fragmento del mismo con unión al antígeno.
Los anticuerpos descritos y los fragmentos con unión al antígeno pueden marcarse de forma detectable. En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos con unión al antígeno marcados pueden facilitar la detección del FRa mediante los métodos descritos en el presente documento. Muchos de estos marcadores son fácilmente conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los marcadores adecuados incluyen, pero no deben considerarse limitados a, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes (tales como DyLight® 649), etiquetas de epítopos, biotina, marcadores cromóforos, marcadores ECL o enzimas. Más específicamente, las marcas descritas incluyen rutenio, 111In-DOTA, 111In-ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y betagalactosidasa, polihistidina (etiqueta HIS), tintes de acridina, tintes de cianina, tintes de fluorona, tintes de oxazina, tintes de fenantridina, tintes de rodamina, tintes Alexafluor® y similares.
Los anticuerpos y los fragmentos con unión al antígeno descritos se pueden usar en una variedad de ensayos para detectar el FRa en una muestra. Algunos ensayos adecuados incluyen, pero no deben considerarse limitados a, análisis de la transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis en equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
En algunas modalidades descritas en el presente documento, la detección de las células cancerosas que expresan el FRa en un sujeto puede usarse para determinar que el sujeto puede tratarse con un agente terapéutico dirigido contra el FRa. En algunas modalidades, el agente terapéutico dirigido contra el FRa puede ser un anticuerpo, tal como Farletuzumab.
Métodos para diagnosticar el cáncer
En el presente documento se proporcionan los métodos para diagnosticar el cáncer de ovario, mama, tiroides, colorrectal, endometrial, de las trompas de Falopio o de pulmón de origen epitelial en un sujeto. En algunas modalidades, como se describió anteriormente, la detección del FRa en una muestra, tales como una muestra histológica, una muestra aspirada con aguja fina, tejido tumoral extirpado, células circulantes, células tumorales circulantes y similares, proporciona la capacidad de diagnosticar el cáncer en el sujeto de quien se obtuvo la muestra. En algunas modalidades, es posible que ya se sepa que el sujeto del que se obtuvo la muestra tiene cáncer, pero es posible que el tipo de cáncer que padece al sujeto aún no se haya diagnosticado o que un diagnóstico preliminar no esté claro, por lo tanto, detectar el FRa en una muestra obtenida del sujeto puede permitir o aclarar el diagnóstico del cáncer.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación de la cantidad del FRa que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto y la cantidad del FRa en la muestra control es una indicación de que el sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. Pueden usarse métodos similares para determinar si un sujeto padece de un cáncer que no está asociado con una mayor producción del FRa. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede derivar de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.
En algunas modalidades, el método para diagnosticar un cáncer que expresa el FRa implicará: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico del FRa o con un fragmento del mismo con unión al antígeno (como los derivados de los anticuerpos y de los fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificar la cantidad del FRa presente en la muestra que está unida por el anticuerpo o por el fragmento del mismo con unión al antígeno, comparar la cantidad del FRa presente en la muestra con un estándar conocido y determinar si los niveles del FRa del sujeto se encuentran dentro de los niveles del FRa asociados con el cáncer. En una modalidad adicional, el método de diagnóstico se puede seguir con una etapa adicional de administrar o prescribir un tratamiento específico del cáncer. En algunas modalidades, el tratamiento específico del cáncer puede dirigirse contra cánceres que expresan el FRa, tal como Farletuzumab.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación de la cantidad del FRa asociado con una célula o tejido que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto y la cantidad del FRa en la muestra control es una indicación de que el sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa.
En algunas modalidades, la muestra control puede derivarse de un sujeto que no padece de un cáncer que exprese el FRa. En algunas modalidades, la muestra control puede derivarse de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que no padece de un cáncer que expresa el FRa, un aumento observado en la cantidad del FRa presente en la muestra, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que no padece de un cáncer que expresa el FRa, una disminución o similitud observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que se evalúa no padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades en las que la muestra control se deriva de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa, una similitud observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades donde la muestra control se deriva de un sujeto que padece de un cáncer que expresa el FRa, una disminución observada en la cantidad del FRa presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra control, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado no padece de un cáncer que expresa el FRa.
En algunas modalidades, la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede ser células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas, y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa mediante la determinación de la cantidad del FRa que no está asociada con una célula o tejido que está presente en una muestra derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra control, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto y la cantidad del FRa en la muestra control es una indicación de que el sujeto padece de un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la cantidad del FRa en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para determinar la presencia del FRa puede ser la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparaciones histológicas y similares.
En diversas modalidades de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer que expresa el FRa. En una modalidad particular, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de ovario. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de endometrio. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer colorrectal. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de mama. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de tiroides. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de las trompas de Falopio. En otra modalidad, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como un adenocarcinoma. Alternativamente, los métodos descritos se pueden usar para diagnosticar un cáncer que no expresa el FRa, tal como el carcinoma de células escamosas.
En varios aspectos, la cantidad del FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede entrar en contacto con más de un tipo de anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunos ejemplos, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo o un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. Los anticuerpos tales como los descritos en este documento pueden usarse con esta función. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1;
(d) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende el segmento del dominio variable de la cadena pesada y el segmento del dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1 o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo producido por cualquiera de las líneas celulares depositadas en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886 o PTA-11885 o un fragmento del mismo con unión al antígeno.
Se pueden utilizar varias combinaciones de los anticuerpos y de los fragmentos con unión al antígeno descritos en (a)-(e), como se detalla anteriormente en la sección general que describe los métodos de detección, se pueden usar para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento con unión de antígeno para realizar los métodos de diagnóstico descritos.
En determinadas modalidades, la cantidad del FRa se determina mediante análisis de la transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
En varias modalidades de los métodos de diagnóstico descritos se usa una muestra control. La muestra control puede ser un control de ensayo positivo o negativo que asegure que el ensayo utilizado funcione correctamente, por ejemplo, un control de ensayo de esta naturaleza podría usarse comúnmente para ensayos de inmunohistoquímica. Alternativamente, la muestra control puede ser una cantidad control estandarizada del FRa en un sujeto sano. En algunas modalidades, los niveles del FRa observados del sujeto analizado pueden compararse con los niveles del FRa observados en las muestras de sujetos de control que se sabe que tienen un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa del sujeto de control es un cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón, tal como adenocarcinoma. En algunas modalidades, se sabe que el sujeto de control tiene un cáncer en estadio temprano que expresa el FRa, tales como un cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma) en el estadio I. En algunas modalidades, se sabe que el sujeto de control tiene un cáncer en estadio intermedio que expresa el FRa, tales como un cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma) en el estadio II. En algunas modalidades, se sabe que el sujeto de control tiene un cáncer en estadio avanzado que expresa el FRa, como un cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma) en el estadio III o en el estadio IV.
Los métodos de diagnóstico proporcionados en este documento también proporcionan una base sobre la cual puede ser posible predecir si un sujeto tiene una probabilidad relativamente mayor o menor de sobrevivir 5 años después del diagnóstico. En algunas modalidades, el método descrito puede usarse para predecir un resultado favorable para un sujeto que tiene un adenocarcinoma, en donde un resultado favorable se define por tener una tasa de supervivencia a 5 años aumentada. Como indican los datos proporcionados en el presente documento, los sujetos que se determina que tienen adenocarcinoma en el estadio I o en el estadio II que no expresa el FRa tienen aproximadamente 2 veces más probabilidades de morir en cinco años que los sujetos que se determina que tienen un adenocarcinoma en el estadio I o en el estadio II que sí expresa el FRa. Por consiguiente, los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento pueden combinarse con este conocimiento para permitir un método de predecir la probabilidad de supervivencia a 5 años para los sujetos que se determina que tienen cáncer. En algunas modalidades, el método se usa para predecir la probabilidad de supervivencia a 5 años para sujetos que se determina que tienen un adenocarcinoma.
En algunas modalidades, el método de pronóstico descrito implicará: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico del FRa o con un fragmento del mismo con unión al antígeno (tales como los derivados de los anticuerpos y de los fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificar la cantidad del FRa presente en la muestra que está unido al anticuerpo o al fragmento del mismo con unión al antígeno, comparar la cantidad del FRa presente en la muestra con un estándar conocido y determinar si los niveles del FRa del sujeto indican la presencia de un cáncer que expresa el FRa, lo que permite hacer una predicción sobre la probabilidad de que el sujeto sobreviva cinco años después de ser diagnosticado con el cáncer. En algunas modalidades, se sabe que el sujeto tiene o se ha determinado que tiene un adenocarcinoma. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.
Métodos de seguimiento del cáncer
En el presente documento se proporcionan los métodos para dar seguimiento al cáncer de origen epitelial en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad del FRa que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra obtenida del sujeto en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con una cantidad aumentada del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la cantidad del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia del FRa puede derivar de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.
En algunas modalidades, el método de seguimiento de un cáncer que expresa el FRa implicará: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico del FRa o con un fragmento del mismo con unión al antígeno (tales como los derivados de los anticuerpos y de los fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificar la cantidad del FRa presente en la muestra que está unida por el anticuerpo o por el fragmento del mismo con unión al antígeno, comparar la cantidad del FRa presente en la muestra con la cantidad del FRa determinada a estar en una muestra del mismo sujeto en un punto anterior en el tiempo y determinar si los niveles del FRa del sujeto han cambiado con el tiempo. Una muestra de prueba con una cantidad aumentada del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de la enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, los niveles del FRa de la muestra pueden compararse con un estándar conocido, solo o además de los niveles del FRa observados para una muestra evaluada en un punto anterior en el tiempo. En algunas modalidades, el estándar conocido puede ser la proteína FRa a una concentración conocida (por ejemplo, una muestra de la proteína FRa recombinante o purificada). En una modalidad adicional, el método de diagnóstico se puede seguir con una etapa adicional de administración de un tratamiento específico del cáncer. En algunas modalidades, el tratamiento específico del cáncer puede dirigirse contra cánceres que expresan el FRa, tal como Farletuzumab.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad del FRa asociada con una célula o tejido que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra obtenida del sujeto, de manera similar, en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con una cantidad aumentada del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de la enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la cantidad del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para la presencia del FRa puede ser células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones y similares.
En algunas modalidades, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa el FRa progresa, regresa o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad del FRa no asociada con una célula o tejido que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto y comparar la cantidad observada del FRa con la cantidad del FRa en una muestra obtenida del sujeto, de manera similar, en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre la cantidad del FRa en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer progresa, regresa o se mantiene estable. En este sentido, una muestra de prueba con una cantidad aumentada del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa el FRa. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa el FRa. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad del FRa, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de la enfermedad estable para un cáncer que expresa el FRa. En algunas modalidades, la cantidad del FRa en una muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para determinar la presencia del FRa puede ser la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparaciones histológicas y similares.
En diversas modalidades de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer que expresa el FRa. En una modalidad particular, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de ovario. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de endometrio. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer colorrectal. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de mama. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de tiroides. En algunas modalidades, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de las trompas de Falopio. En otra modalidad, el cáncer que expresa el FRa es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como un adenocarcinoma.
En varios aspectos, la cantidad del FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo o con un fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunas modalidades, la muestra se puede poner en contacto con más de un tipo de anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. En algunas modalidades, la muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al FRa. Los anticuerpos tales como los descritos en este documento pueden usarse con esta función. Por ejemplo, el anticuerpo puede seleccionarse entre:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1;
(d) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende el segmento del dominio variable de la cadena pesada y el segmento del dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1 o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo producido por cualquiera de las líneas celulares depositadas en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886 o PTA-11885 o un fragmento del mismo con unión al antígeno.
Se pueden utilizar varias combinaciones de los anticuerpos y de los fragmentos con unión al antígeno descritos en (a)-(e), como se detalla anteriormente en la sección general que describe los métodos de detección, para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento con unión al antígeno para realizar los métodos de seguimiento descritos.
En determinadas modalidades, la cantidad del FRa se determina mediante análisis de la transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Se proporcionan ejemplos adicionales del tema resumido con mayor detalle en la descripción detallada y ejemplos proporcionados y figuras asociadas.
Juegos de reactivos para la detección del FRa
También se describen en el presente documento los juegos de reactivos para detectar el FRa en una muestra. Estos juegos de reactivos incluyen uno o más de los anticuerpos específicos al FRa descritos en el presente documento o un fragmento del mismo con unión al antígeno e instrucciones de uso del juego de reactivos. En algunos ejemplos, el anticuerpo o el fragmento con unión al antígeno, proporcionado en los juegos de reactivos descritos puede ser uno o más de:
(a) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3;
(b) cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3 o un fragmento del mismo con unión al antígeno;
(c) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos en el CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1;
(d) un anticuerpo o fragmento del mismo con unión al antígeno, que comprende el segmento del dominio variable de la cadena pesada y el segmento del dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 9F3, anticuerpo 19D4, anticuerpo 24F12 o anticuerpo 26B3, como se describe en la Tabla 1 o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo producido por cualquiera de las líneas celulares depositadas en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11887, PTA-11884, PTA-11886 o PTA-11885 o un fragmento del mismo con unión al antígeno.
El anticuerpo proporcionado o el fragmento con unión al antígeno, puede estar en solución; liofilizado; fijado a un sustrato, soporte o placa o conjugado con un marcador detectable.
Los juegos de reactivos descritos también pueden incluir componentes adicionales útiles para realizar los métodos descritos en este documento. A modo de ejemplo, los juegos de reactivos pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra control, por ejemplo, una muestra de un sujeto que tiene un cáncer de progresión lenta y/o un sujeto que no tiene cáncer, uno o más compartimentos de muestra y/o material instructivo que describe el desempeño de un método de la invención y controles/estándares específicos de tejido.
Los medios para determinar el nivel del FRa pueden incluir, además, por ejemplo, tampones u otros reactivos para usar en un ensayo para determinar el nivel del FRa. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresión del FRa.
Los juegos de reactivos descritos también pueden incluir medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender uno o más productos de equipos o reactivos que pueden usarse para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para obtener una muestra de un sujeto también pueden comprender medios para aislar componentes sanguíneos, tal como el suero de una muestra de sangre. Preferentemente, el juego de reactivos está diseñado para su uso con un sujeto humano.
Los juegos de reactivos descritos también pueden incluir un reactivo de bloqueo que se puede aplicar a una muestra para disminuir la unión no específica de un anticuerpo primario o secundario. Un ejemplo de reactivo de bloqueo es la albúmina de suero bovino (BSA), que puede diluirse en un tampón antes de su uso. Se conocen en la técnica otros reactivos de bloqueo comerciales, tales como Block Ace y ELISA Synblock (AbD serotec), Background Punisher (BIOCARE MEDICAL) y StartingBlock (Thermo Fisher Scientific). Los juegos de reactivos descritos también pueden incluir un anticuerpo primario de control negativo que no se une al FRa lo suficiente como para producir un resultado positivo en un ensayo de detección basado en anticuerpos. Además, los juegos de reactivos descritos pueden incluir un anticuerpo secundario capaz de unirse a un anticuerpo primario antiFRa, como el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3. En algunos ejemplos, el anticuerpo secundario puede conjugarse con un marcador detectable, tal como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o un fluoróforo, para permitir la detección del anticuerpo primario unido a una muestra. Los juegos de reactivos descritos también pueden incluir un sustrato colorimétrico o quimioluminiscente que permite detectar la presencia de un anticuerpo secundario unido en una muestra. En algunos ejemplos, el sustrato colorimétrico o quimioluminiscente puede ser el ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS); 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB); 3,3'-diaminobencidina (DAB); SuperSignal (Thermo Fisher Scientific); reactivo ECL (Thermo Fisher Scientific) u otros reactivos conocidos por los expertos en la técnica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para complementar la descripción anterior y para proporcionar una mejor comprensión del tema descrito en este documento. No se debe considerar que estos ejemplos limitan el tema descrito. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en este documento tienen únicamente fines ilustrativos.
La invención se define en las reivindicaciones y cualquier ejemplo que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, sino que se proporciona únicamente con fines comparativos.
Ejemplo 1 - Expresión y purificación del FRa humano recombinante
Para realizar los experimentos asociados con los estudios descritos en el presente documento, se crearon varios sistemas o líneas celulares que expresan el receptor alfa de folato (FRa) para generar sustratos celulares que expresan FRa o para generar la proteína FRa humana recombinante purificada. Un sistema de expresión utilizado fue una línea celular de insecto Sf9 que expresaba el FRa humano recombinante a través de baculovirus. Este sistema se preparó con el uso de la secuencia del FRa humano, que contiene una secuencia líder optimizada para la expresión en las células de insectos, una etiqueta N-terminal de epítopo de histidina 6x (6xhis) y el sitio intacto de unión de GPI nativo. A continuación, las células se incubaron en un matraz de agitación de 1 L y las células de insecto Sf9 se infectaron cuando los cultivos estaban en fase logarítmica con el baculovirus recombinante con una multiplicidad de infección (MOI) de < 1. Se recolectaron células de 30 L de cultivo, se lisaron y se extrajeron 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X que contenía 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) a 10 mM. La concentración de NaCl se ajustó a 300 mM y se filtró a través de una membrana de 0,2 |_im. El sobrenadante clarificado se purificó mediante cromatografía de afinidad, con el uso de PBS 1X con NaCl 2 M, CHAPS 1 mM, pH 7,4 como tampón de lavado, seguido de elución con el ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 10 mM, MgCl23 M, CHAPS 1 mM, pH 6,8. Las fracciones de los picos se dializaron extensamente frente a PBS 1X, pH 7,4, se analizaron para determinar su pureza mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA), se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 grados Celsius.
Se produjo una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa y secreta de manera estable el FRa humano con el uso de una secuencia del receptor alfa de folato humano (FRa), que contiene una secuencia líder kappa de inmunoglobulina humana y una etiqueta C-terminal de epítopo 6xhis que reemplaza el sitio de unión de GPI. Una vez producidas, las células CHO que expresan el FRa se cultivaron a escala de 25 L en bolsas de ondas. Para purificar la proteína FRa secretada, el sobrenadante celular se eliminó de los restos celulares mediante filtración profunda y luego se concentró 10 veces mediante filtración de flujo tangencial y se diafiltró en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 1 mM, pH 8,0. Esto se cargó en una columna Talon® IMAC preempaquetada con el uso de un FPLC. El material no unido se lavó con el uso de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH 8,0 y la proteína unida se eluyó con el uso de un gradiente lineal de imidazol 5 mM -100 mM en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0. Las fracciones de los picos se dializaron extensamente frente a PBS 1X, pH 7,4, se analizaron para determinar su pureza mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante un ensayo de BCA, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 grados Celsius.
También se produjo un sistema celular similar para el receptor beta de folato humano (FRP), el receptor gamma de folato humano (FRy) y el receptor delta de folato humano (FR5). Brevemente, se usaron construcciones de FRp, FRy o FR5 que contienen una secuencia líder kappa de inmunoglobulina humana y una etiqueta C-terminal de epítopo 6xhis que reemplaza el sitio de unión de GPI, para transfectar transitoriamente los cultivos de 1 L de las células 293F. Las proteínas FR recombinantes se purificaron como se describió anteriormente para el FRa humano.
También se preparó una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa y secreta de manera estable una secuencia de mesotelina humana, que contiene una secuencia líder kappa de inmunoglobulina humana y una etiqueta C-terminal de epítopo 6xhis que reemplaza el sitio de unión de GPI, ya que la mesotelina sirvió como control negativo para muchos estudios. Se cultivaron las células CHO que expresan la mesotelina humana a una escala de 25 L en bolsas de ondas. Para purificar la proteína de mesotelina secretada, el sobrenadante celular se eliminó de los restos celulares mediante filtración de fibra hueca y el sobrenadante clarificado se concentró 10 veces mediante filtración de flujo tangencial. La concentración de NaCl en el sobrenadante se ajustó a NaCl 300 mM e imidazol 0,5 mM. Esto se cargó en una columna Talon® IMAC preempaquetada con el uso de un FPLC. El material no unido se lavó con el uso de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 3 mM, pH 8,0 y la proteína unida se eluyó con el uso de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM, pH 8,0. Las fracciones pico se dializaron extensamente frente a fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5. Se añadió sulfato de amonio a una concentración final de 1 M y luego se realizó la purificación final en una columna de fenil-sefarosa preempaquetada con el uso de un gradiente escalonado de sulfato de amonio 1 M - 0 M en fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5. Las fracciones de los picos se dializaron extensamente frente a PBS 1X, pH 7,4, se analizaron para determinar su pureza mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante un ensayo de BCA, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 grados Celsius.
Ejemplo 2 - Producción del FRa alquilado, reducido y purificado
Se realizaron esfuerzos para producir una forma antigénica alquilada y reducida del FRa. Para reducir la proteína, el FRa purificado se concentró a 2 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con el uso de filtros de centrifugación (Amicon Ultra, límite de peso molecular de 3 kDa). La concentración de proteína se determinó con el uso de un ensayo BCA (Thermo Scientific). El FRa resultante se diluyó 1:1 en urea 8 M/PBS para generar una concentración final del FRa de 1 mg/mL en PBS que contiene urea 4 M. Se añadió solución de ditiotreitol (500 mM en PBS) hasta una concentración final de 10 mM. La solución se incubó a 65 grados Celsius durante una hora y se enfrió a temperatura ambiente.
A continuación, se añadió 1 M de solución de yodoacetamida en solución salina tamponada con fosfatos a la solución del receptor de folato reducido hasta una concentración final de 10 mM y la reacción se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La proteína permaneció soluble en estas condiciones. El FRa reducido final que se va a usar para la inmunización se almacenó en solución salina tamponada con fosfatos que contiene urea 4 M, 10 mM de DTT y 10 mM de yodoacetamida.
La Figura 1 muestra la migración diferencial de la proteína FRa nativa y de una forma reducida y alquilada de la proteína analizada por SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
Ejemplo 3 - Producción de las hibridomas con el uso del FRa
Se inmunizaron ratones Balb/c hembra de ocho semanas de edad con la proteína FRa etiquetada con hexahistidina (n = 5) o con la proteína FRa reducida y alquilada (n = 5). Las inmunizaciones intraperitoneales iniciales administradas al día 0 comprendían 50 mg del inmunógeno respectivo mezclado 1:1 (v:v) con el adyuvante completo de Freund (Rockland, Cat # D614-0050). A continuación, los ratones se reforzaron con 50 mg del inmunógeno mezclado 1:1 (v:v) con el adyuvante incompleto de Freund (Rockland, Cat # D615-0050) administrado por vía intraperitoneal 14 días después y cada 21 días a partir de entonces. Se recogieron muestras de sangre de ratones inmunizados 24 días después de la inmunización inicial y cada 21 días a partir de entonces.
Las muestras de sangre recolectadas se analizaron mediante inmunoensayo directo ligado a enzima (EIA) contra el FRa. Las placas se recubrieron con la proteína FRa (100 mL de una solución a 1 mg/mL en PBS, fosfato de potasio 0,02 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 7,2) y se incubaron durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBS que contenía Tween®-20 al 0,2 % (PBST; Rockland, Cat # MB-075-1000) y se bloqueó con un gel de pescado al 3 % (Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se permitió que se unieran una serie de diluciones de 3 veces de las muestras de suero de los ratones individuales durante 1 hora a temperatura ambiente, luego las placas se lavaron 3 veces con PBST y posteriormente se sondaron con un anticuerpo antirratón de conejo conjugado con HRP (Rockland, Cat # 610­ 4320) a 1:2500 durante 30 minutos a 37 °C. Se añadió el sustrato TMB (Rockland, Cat # TMBE-100) y la reacción se detuvo después de 30 minutos mediante la adición de 100 mL de HCl 1 M antes de la lectura de la absorbancia a 450 nm (Microplate Reader "Benchmark"; Biorad). Todas las muestras se contratamizaron contra la proteína de mesotelina recombinante etiquetada con hexahistidina (mesotelina-His6) como control negativo.
Se recolectaron los bazos de los ratones que mostraban los títulos más altos específicos por el antígeno y se prepararon las hibridomas por electrofusión (Generador de forma de onda Hybrimune™ Modelo CEEF-50B; Cellectis, Romainville, Francia) de los esplenocitos con las células de mieloma Sp2/0 Ag14 (ATTC CRL1581). Posteriormente, los sobrenadantes de las hibridomas se tamizaron mediante ELISA contra el FRa y la Mesotelina-His6 recombinante como se describió anteriormente para seleccionar líneas celulares positivas de fusión parentales.
Las líneas celulares parentales seleccionadas determinadas para producir los anticuerpos reactivos al FRa humano recombinante (rhFRa) se subclonaron luego mediante dilución limitante. Los anticuerpos producidos por estas células se volvieron a analizar para determinar la unión al FRa y se isotiparon con el uso del sistema Clonetyping™ (SouthernBiotech, Birmingham, AL). Los sobrenadantes de estos clones se tamizaron adicionalmente mediante ELISA directo contra tres isoformas adicionales del receptor de folato humano (FRp, FRy y FR5) para determinar la especificidad al receptor. Las placas se recubrieron durante la noche con 100 pL de una solución a 1 pg/mL de la respectiva isoforma FRa a 4 °C, se lavaron con PBS que contenía Tween®-20 al 0,2 % (Rockland, Cat # MB-075-1000) y se bloquearon con gel de pescado al 3 %. (Sigma). Se dejó que se uniera una serie de diluciones de 3 veces de los sobrenadantes de cultivo durante 1 hora a temperatura ambiente, antes de lavar las placas y probarlas con un anticuerpo antirratón conjugado con HRP como se describió anteriormente. Los clones que producen los anticuerpos reactivos al FRp, FRy y FR5 no se seleccionaron para los análisis adicionales.
Cuatro clones de hibridoma seleccionados, 19D4.B7, 26B3.F2, 24F12.B1 y 9F3.H9.H3.H3.B5.G2, se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 19 de mayo del 2011 y se les asignaron los números de acceso de ATCC PTA-11884, PTA-11885, PTA-11886 y PTA-11887, respectivamente.
Ejemplo 4 - Producción de los anticuerpos monoclonales purificados contra el FRa
Las líneas celulares seleccionadas se evaluaron para detectar micoplasma con el uso de un juego de reactivos de prueba de micoplasma (Rockland, Cat # MAB-012) antes de sembrar en frascos rotativos de 1 L que contenían medio libre de suero (Invitrogen, Cat # 12045-076) y 5 % de FBS con bajo IgG (0,1 pg/mL) (Gibco, Cat# 16250-078) a 0,5 x 105 células/mL. Se permitió que los cultivos crecieran a 37 °C durante 14 o 21 días, después de lo cual se recolectó el sobrenadante y se concentró aproximadamente 10 veces a través de una membrana de filtración de 50 kDa (Spectrum Labs, Rancho Dominguez CA) y luego se purificó mediante cromatografía de proteína A (Rockland, Cat # PA50-00-0025). El anticuerpo unido se eluyó con citrato de sodio 0,1 M, pH 3,5/4,5 dependiendo del isotipo del anticuerpo y el tampón se intercambió contra PBS mediante diálisis con el uso de un tubo membranoso de 12-14 kDa (Spectrum Labs, Rancho Dominguez CA). El anticuerpo purificado se esterilizó por filtración con el uso de un Express™PLUS Stericups de 0,22 pm (Millipore, Billerica mA) y se almacenó a 4 °C para pruebas adicionales.
Se realizaron esfuerzos para secuenciar las cadenas pesada y ligera de cuatro clones de hibridomas seleccionados (9F3-H9, 19D4-B7, 24F12-B1 y 26B3-F2). En primer lugar, se aisló el ARN total de cada línea celular de hibridoma (sedimentos celulares de 1 x 103 a 1 x 105 células cada uno) con el uso del juego de reactivos RNAqueous® (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó con el uso de un espectrofotómetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific).
A continuación, se amplificó el ARN aislado mediante RT-PCR multiplex, realizada por triplicado para cada hibridoma en un termociclador Mastercycler® EP Gradient Thermocycler (Eppendorf). En primer lugar, se realizaron dos amplificaciones separadas del ADNc específicas del gen para cada hibridoma (< 1ug de ARN/reacción) para determinar cuáles genes de Ig de la cadena pesada y ligera se usaron durante el reordenamiento de Ig. Cada cóctel constaba de cebadores únicos específicos de familia diseñados para hibridarse con cualquiera de las posibles familias de genes V de Ig murina (IgHv, IgKv) y genes de la región constante de Ig (IgHcGamma, IgKc). La generación y amplificación del ADNc se realizó con el uso del sistema de RT-PCR de un solo paso SuperScript® III con Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) en las siguientes condiciones: 55 °C durante 30 minutos y 95 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, 68 °C durante 1 minuto y una etapa final de 68 °C durante 10 minutos. Los productos de ADN se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. Se cortaron las bandas apropiadas y se purificaron de gel con el uso del juego de reactivos de extracción en gel QIAquick® (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN purificado se sometió a secuenciación (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ) para determinar los segmentos génicos de la línea germinal expresados por cada hibridoma.
A continuación, se realizó un análisis de RT-PCR adicional adecuado para los genes particulares identificados para cada hibridoma con el uso de la misma fuente de ARN que se usó anteriormente y los cebadores específicos de genes (en contraste con los cebadores específicos de la familia usados en la mezcla de RT-PCR multiplex). Para facilitar la clonación, los ADNc de Ig amplificados se colocaron en un vector de expresión In-Fusion (IF), cada cebador específico de gen también contenía secuencias enlazadoras compatibles con el vector que permitirían el cruzamiento homólogo. Todos los demás reactivos y las condiciones del termociclador son los mismos que los utilizados para los experimentos de RT-PCR multiplex, descritos anteriormente.
Ejemplo 5: Caracterización de la unión de los anticuerpos al FRa
Las características de unión al FRa de los anticuerpos monoclonales purificados se determinaron mediante experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C con el uso de un BIAcore T100 con chips CM5 de grado de investigación (GE Healthcare), según lo especificado por el fabricante. Inicialmente, la IgG antirratón proporcionada en el juego de reactivos de captura de anticuerpos de ratón (GE Healthcare) se inmovilizó mediante acoplamiento de amida a los chips sensores CM5. Se capturaron los anticuerpos monoclonales antiFRa de ratón (26B3, 24F12, 19D4 o 9F3) en celdas individuales de flujo por ciclo de unión, mientras que la cuarta celda de flujo se usó como referencia. Los experimentos de unión se realizaron con HBS P (GE Healthcare) como tampón de funcionamiento y con una tasa de flujo de 30 pL/min. Cada muestra de anticuerpo monoclonal (0,5 pg/mL) se inyectó durante 3 minutos para capturar el anticuerpo. A continuación, se inyectaron varias concentraciones del FRa humano recombinante purificado (rh-FRa) (1 nM-30 nM) sobre las superficies específicas al FRa y de referencia durante 3 minutos para registrar los sensogramas de unión con el uso de un método de cinética de ciclo único. El perfil de disociación se controló durante 25 minutos. Entre las uniones, la superficie se regeneró con una inyección de 30 pL de glicina 10 mM (pH 1,7). Los sensogramas se procesaron y ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1 con el uso del software de evaluación BIAcore T100 (versión 2.0.1). Algunas de las características de unión de los anticuerpos 26B3, 24F12, 19D4 y 9F3 se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2: Características de unión de los anticuerpos específicos al FRa.
Nombre del clon abreviado ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Chi.Cuad.
26B3 5,24 x 105 1,43 x 10-5 2,73 x 10-11 2,48
24F12 3,93 x 105 3,99 x 10-5 1,02 x 10-10) 1,08
19D4 4,27 x 105 2,42 x 10-4 5,67 x 10-10 0,656
9F3 4,34 x 105 3,10 x 10-4 7,15 x 10-10 1,89
Ejemplo 6: Mapeo de epítopos de los anticuerpos específicos al FRa seleccionados
Los anticuerpos específicos al FRa 26B3, 24F12 y 9F3 se evaluaron adicionalmente en estudios de unión de epítopos con el uso de Octet QK. Los resultados mostraron que 26B3 y 24F12, que tienen altas afinidades por el FRa humano purificado, compiten entre sí por unirse al FRa. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden compartir un epítopo común o tener epítopos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los resultados también indican que el anticuerpo 9F3 tiene un epítopo único, ya que no compitió con otros anticuerpos específicos al FRa por unirse al FRa.
Estudios de mapeo de epítopos adicionales se realizaron por ExSAR™ con el uso de la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio y métodos de acoplamiento. Los resultados de estos estudios para los anticuerpos 9F3, 24F12 y 26B3 se ilustran en la Figura 2. Con respecto al epítopo del anticuerpo 26B3, estos datos sugieren que es accesible en la estructura nativa y anclada a la membrana, dada la capacidad de 26B3 para reconocer el FRa nativo mediante citometría de flujo. Además, estos datos sugieren además que las limitaciones conformacionales del epítopo reconocido por el MAb 26B3, como lo demuestra su incapacidad para detectar la proteína en las transferencias de Western reducida, están relacionadas con la cisteína en la posición 185 en la proteína FRa que forma un puente disulfuro con la cisteína 111.
Ejemplo 7: Reconocimiento de las formas desnaturalizadas y conservadas químicamente del FRa
Se realizaron experimentos para determinar si alguno de los anticuerpos específicos al FRa, descritos anteriormente, podría reconocer las formas desnaturalizadas del FRa. Para estos análisis, se lisaron células CHOK1 que expresaban de forma estable el FRa, p o A humano ligado a GPI en tampón OBG al 1,1 % (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, OBG al 1,1 %) complementado con un mini cóctel completo inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) y PMSF (100 nM) y se colocaron en hielo durante 15 minutos. Los lisados se aclararon previamente mediante centrifugación a 13 000 rpm durante 15 minutos para eliminar los restos celulares. Para las muestras reducidas y desnaturalizadas, se hirvieron cantidades iguales de la proteína (20 pg) durante 10 minutos en tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía p-mercaptoetanol al 5 % DTT 40 mM. Las proteínas se separaron con el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) en un gel de bis-tris al 4-12 % (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó en PBST leche desnatada al 5 % durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual, la membrana se lavó dos veces con PBST. La inmunotransferencia se realizó con el uso de los anticuerpos monoclonales de ratón purificados 9F3, 19D4, 24F12 o 26B3 (1 pg/mL) específicos al FRa, que se detectaron con un anticuerpo conjugado con HRP de cabra antirratón y se visualizaron con el uso del sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). La luminiscencia se visualizó con el uso del sistema de imagen molecular Omega 12iC (Ultra-Lum, Claremont, CA) con análisis de imagen realizado con el uso del software UltraQuant™ 6,0 (Ultra-Lum).
También se realizaron análisis de la transferencia Western con el uso de las preparaciones de receptor de folato purificado. Para estos experimentos, se incubaron 0,5 pg del FRa, p, r o A humano purificados, producidos como se describe en el Ejemplo 1, en tampón de carga de muestras SDS-PAGE 1X (Invitrogen) con o sin DTT 20 mM, hervidos durante 10 min y sometidos a electroforesis en geles de SDS-PAGE en gradiente al 4-12 %. La proteína se transfirió a una membrana de PVDF y las transferencias se sondaron como se describió anteriormente. Los geles se procesaron con el uso de la escalera de proteínas preteñidas Benchmark™ (Novex®). Los geles que usaban las proteínas FR recombinantes purificadas también se visualizaron mediante tinción con plata para asegurar que se cargaran cantidades iguales de la proteína.
Los análisis de la transferencia de Western indican que los anticuerpos 19D4, 9F3, 24F12 y 26B3 reconocen al FRa no reducido; sin embargo, no se detectó unión a las muestras reducidas y desnaturalizadas para ninguno de estos anticuerpos (Figura 3(A) y (B)).
También se realizaron estudios de inmunohistoquímica (IHC) para determinar si alguno de estos anticuerpos podría unirse a las muestras de tejido de cáncer de ovario seroso papilar embebido en parafina y fijadas con formalina. El ensayo de IHC indirecta se realizó para el FRa con el uso de un juego de reactivos de detección universal de polímero HRP MACH4™ (Biocare Medical). Las muestras embebidas en parafina y fijadas con formalina se seccionaron a 5 micras en portaobjetos de vidrio cargados positivamente y se calentaron durante aproximadamente 60 minutos a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinaron en 3 baños secuenciales de xileno durante 3 minutos cada uno, se transfirieron a tres baños secuenciales de alcohol al 100 % durante 3 minutos cada uno, seguidos de tres baños secuenciales de alcohol al 95 % durante 3 minutos cada uno y luego se enjuagaron durante 5 minutos en agua desionizada (DI). A continuación, las muestras preparadas se pretrataron con una solución de recuperación de epítopos inducida por calor Diva (Biocare Medical) diluida a 1:10 en agua DI y se colocaron dentro de una cámara de desenmascaramiento presurizada ya llena con 500 mL de agua DI. Las muestras se incubaron durante 15 minutos dentro de la cámara de desenmascaramiento, donde la incubación presurizada alcanzó un máximo de 125 °C a 16 PSI durante 30 segundos y luego se enfrió durante 15 minutos hasta 95 °C. Luego se enfriaron los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de enfriar, los portaobjetos se lavaron en 3 baños secuenciales de tampón de lavado de solución salina tamponada con Tris/Tween-20® al 0,1 % (TBST) durante 3 minutos cada uno. Todos los lavados posteriores con tampón también se realizaron de esta manera. A continuación, los portaobjetos se bloquearon en solución de bloqueo de Peroxidasa-1 (Biocare Medical) durante 5 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con TBST y luego se aplicó el reactivo de bloqueo universal sin suero Background Sniper (Biocare Medical) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez bloqueadas las muestras, los portaobjetos se incubaron con 2,5 pg/mL del anticuerpo 26B3 diluido en diluyente de anticuerpos (Dako) o con el anticuerpo de ratón de control negativo listo para usar, control negativo universal (Dako, para tejido de isotipo negativo) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después, los portaobjetos se lavaron con TBST y se incubaron con MACH4™ Mouse Probe Primary Antibody Enhancer (proporcionado en el juego de reactivos Biocare Medical MACH4™) durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se lavaron de nuevo con TBST y se incubaron con un reactivo Polymer-IIRP (proporcionado en el juego de reactivos Biocare Medical MACH4) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron con TBST y se incubaron con una solución de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Dako) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, los portaobjetos se enjuagaron a fondo con agua desionizada 3 veces durante 30-60 segundos cada uno y se contratiñeron con hematoxilina (Dako) durante 2 minutos, se lavaron con TBST, se deshidrataron en 3 baños secuenciales cada uno de 95 % y 100 % de alcohol durante 30 segundos cada uno y se aclararon en 3 baños secuenciales de xileno durante 30 segundos cada uno. Finalmente, se aplicaron cubreobjetos a los portaobjetos antes del análisis.
Se piensa comúnmente que un anticuerpo debe ser capaz de reconocer un epítopo lineal del antígeno de interés para ser eficaz para la inmunohistoquímica de un tejido embebido en parafina y fijado con formalina porque el antígeno carece de estructura terciaria debido a la naturaleza destructiva de la fijación del tejido. Por lo tanto, fue sorprendente que el anticuerpo 26B3 fuera capaz de reconocer al FRa en este ensayo (Fig. 4), ya que no reconoce el FRa reducido y desnaturalizado por la transferencia Western. Además, el patrón de tinción del FRa con el anticuerpo 26B3 observado para los tejidos normales fue consistente con la literatura publicada previamente con el uso de una variedad de otros anticuerpos y técnicas, con páncreas, tiroides, pulmón, glándula salival, riñón, hipófisis, cuello uterino y mama que muestran expresión a varios grados (Tabla 3). Como se muestra en la Figura 5, el patrón de tinción en los tejidos normales, ejemplificado en secciones de pulmón normal (A) y riñón normal (B), está muy restringido a las células epiteliales y típicamente de naturaleza apical.
Tabla 3. Expresión del FRa en tejidos humanos normales
Tipo de tejido Tinción (número/intensidad) Comentarios
Cerebro 0/3
Cerebelo 0/3
Suprarrenal 0/3
Ovario 0/3
Páncreas 3/3; 2+ Limitado a los bordes luminales de las células ductales y acinares
Tiroides 2/5; 1+ (escaso) Tinción citoplasmática en células foliculares.
Hipófisis 3/3; 1 Predominantemente citoplasmático
Testículo 0/3
Mama 3/3; 1+/2+ Células ductales con tinción luminal y de membrana Continuación
Tipo de tejido Tinción (número/intensidad) Comentarios
Bazo 0/3
Amígdala 0/3
Timo 0/3
Médula ósea 0/3
Pulmón 3/3; 2+ Tinción en células bronquiales y alveolares Corazón 0/3
Esófago 0/3
Estómago 0/2
Intestino delgado 0/3
Colon 0/3
Hígado 0/3
Glándula salival 3/3; 3+ Células ductales y acinares
Riñón 3/3; 3+ Tinción luminal de células tubulares proximales Próstata 0/3
Endometrio 0/3
Cuello uterino 1/3; 1 Células endocervicales
Músculo esquelético 0/3
Piel 0/3
Nervio 0/3
Mesotelio (pleura y pulmón) 3/3; 2+ Células alveolares
Ejemplo 8: Reconocimiento de las formas nativas del FRa
Se llevaron a cabo estudios de citometría de flujo para evaluar la capacidad de los anticuerpos seleccionados específicos al FRa para unirse a la proteína nativa. Para estos estudios, se recolectaron células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban el FRa, se lavaron y se resuspendieron en medio de crecimiento helado (RPMI suplementado con FBS al 10 %). Las células se incubaron durante 1 hora en hielo con 9F3, 19D4, 24F12 o 26B3 (1 |jg/mL), se lavaron y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con FITC [dilución 1:100] (Southern Biotech, Birmingham, AL). Antes del análisis, las células se marcaron con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) para la exclusión de las células no viables. Las células CHO que no expresan el FRa también se sometieron a los mismos procedimientos experimentales, como control negativo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo EasyCyte ™ (Guava® Technologies, Hayward, CA). Los datos proporcionados en la Tabla 4 indican que los cuatro anticuerpos son capaces de unirse al FRa nativo.
Tabla 4: Los anticuerpos específicos al FRa reconocen el FRa expresado en la superficie celular
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 9: Detección del FRa en el suero de sujetos que se sabe que tienen cáncer de ovario
Se llevaron a cabo estudios de electroquimioluminiscencia para determinar si los anticuerpos específicos al FRa descritos en este documento podrían detectar el FRa en el suero de los pacientes que se sabe que tienen cáncer de ovario. Para estos experimentos, se usó el MAb 26B3 como el MAb de captura y se añadió a placas ECL a una concentración de 75 jg/mL. Las placas se lavaron y se añadieron 50 jL de la muestra de suero a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Se obtuvieron las muestras de suero de mujeres sanas normales (control negativo) y de las pacientes con cáncer de ovario. Las muestras se diluyeron 1:4 en PBST (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, que contenía Tween®20 al 0,01 %). Después de la incubación, las muestras se lavaron con PBST y se añadieron a cada pocillo 25 jL/pocillo del MAb 19D4 (1 jg/mL), marcado con Ru en una proporción de aproximadamente l3 marcadores/molécula de IgG, para detectar la muestra unida. Después de un período de incubación de 2 horas, las placas se lavaron con PBST y se leyeron con tampón T 2X MSD. Los resultados de la Tabla 5 muestran que el FRa en el suero puede capturarse y detectarse con el uso de los anticuerpos monoclonales 26B3 y 19D4.
Tabla 5: Niveles séricos relativos del FRa
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 10: Detección del FRa en el suero y en la orina de los sujetos que se sabe que tienen cáncer de ovario
A continuación, se realizaron estudios de electroquimioluminiscencia para determinar si los anticuerpos específicos al FRa descritos en el presente documento podrían detectar el FRa en el suero y en la orina de los pacientes que se sabe que tienen cáncer de ovario. Para estos experimentos, se usó el MAb 26B3 como el MAb de captura y se añadió a placas ECL a una concentración de 75 jg/mL. Las placas se lavaron y se añadieron 50 mL de la muestra de suero a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Se obtuvieron muestras de suero y orina emparejadas de mujeres sanas normales (control negativo) y de pacientes con cáncer de ovario. Las muestras (suero u orina) se diluyeron 1:4 en PBST (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, que contenía Tween®20 al 0,01 %). Después de la incubación, las muestras se lavaron con PBST y se añadieron a cada pocillo 25 jL/pocillo del MAb 19D4 (1 jg/mL), marcado con Ru en una proporción de aproximadamente 13 marcadores/molécula de IgG, para detectar la muestra unida. Después de un período de incubación de 2 horas, las placas se lavaron con PBST y se leyeron con el tampón T 2X MSD. Los resultados de la Tabla 6 muestran que el FRa en suero y orina puede capturarse y detectarse con el uso de los anticuerpos monoclonales 26B3 y 19D4.
Tabla 6: Niveles relativos del FRa en suero y orina
Figure imgf000042_0002
Ejemplo 11: Puntuación M como métrica para los resultados de la inmunohistoquímica
Se desarrolló una métrica para la tinción (puntuación M) de cada muestra y se puede definir de la siguiente manera:
M Y ) = í w j - X i j Y ) = í w j - x i j
" 6
En la ecuación, Xj es el porcentaje del tumor teñido a la intensidad j para el paciente i y w¡ es el valor absoluto de la intensidad (que varía de 0 a 3+). La métrica tiene un rango teórico de cero (sin tinción positiva) a cincuenta (100 % de las células que se tiñen a una intensidad de 3+). Como tal, la puntuación M es una puntuación ponderada para la tinción por IHC del FRa de la membrana de las células tumorales que captura tanto la proporción de las células positivas al FRa como la intensidad de la tinción. Las puntuaciones M para cada paciente se promediaron sobre múltiples muestras de micromatrices de tejido (TMA), cuando fue apropiado. Si una muestra carecía de resultados, es decir, no había presencia de tumor o tejido necrótico, se asignó la puntuación M a las determinaciones no nulas.
A continuación, se presenta una aplicación práctica de la ecuación anterior:
Figure imgf000043_0001
Aquí, x = % del tumor teñido con intensidad 3+ y = % del tumor teñido con intensidad 2+; z = % del tumor teñido con intensidad 1+.
La tasa de positividad para la expresión del FRa dentro de una histología determinada se calculó como la proporción de las muestras que se tiñeron positivas según la definición de un resultado positivo (> 5 % de la tinción total de las células tumorales). Los intervalos de confianza binomiales exactos se determinaron con el uso de los métodos establecidos (Clopper CJ y Pearson RC, Biometrika. 26:404-13 (1934)). En el presente documento se presentan estadísticas resumidas para todas las variables demográficas y para la puntuación M. Las diferencias para los valores medios se determinaron mediante ANOVA de una vía con pruebas post-hoc que controlan el error de tipo I general. Las diferencias en los valores medios fueron estadísticamente diferentes si el valor de p asociado con la prueba era menor que el error tipo I ajustado de Bonferroni para esa prueba (error máximo tipo I = 0,05).
Ejemplo 12: Tinción comparativa de las células de carcinoma de pulmón con el anticuerpo 26B3 y con el anticuerpo BN3,2
Existe una variación significativa en la bibliografía con respecto al porcentaje de varios carcinomas que expresan el FRa según lo determinado por IHC, en parte debido al uso de una variedad de anticuerpos, la mayoría de los cuales no están disponibles comercialmente. Un MAb específico al FRa que está disponible comercialmente y se ha demostrado que detecta el FRa en secciones de FFpE por IHC es el anticuerpo b N3,2 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Por lo tanto, se realizaron estudios para comparar el anticuerpo BN3,2 con el anticuerpo 26B3 en cuanto a especificidad y sensibilidad para la detección del FRa con el uso de un TMA comercial que contiene varios tipos histológicos de cáncer de pulmón. Ambos anticuerpos fueron altamente específicos para el adenocarcinoma en comparación con otros subtipos histológicos, particularmente el carcinoma de células escamosas. Sin embargo, el anticuerpo 26B3 fue significativamente más sensible que el BN3,2, al identificar 26/36 (72 %; media de la puntuación M ± DE = 19,84 ± 18,64) y 22/36 (61 %; media de la puntuación M ± DE = 11,38 ± 14,25) muestras de adenocarcinoma, respectivamente (p < 0,0001). Estos datos demuestran que el anticuerpo BN3,2 es significativamente menos sensible que el anticuerpo 26B3 para detectar la expresión del FRa en muestras de tejido de FFPE y, como se muestra en la Figura 6, la relación en las puntuaciones M observadas en las muestras de adenocarcinoma de pulmón para estos dos anticuerpos no es lineal.
Ejemplo 13: Detección del FRa en sujetos que se sabe que tienen adenocarcinoma de pulmón
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la presencia de histología positiva para el FRa, detectada por el anticuerpo 26B3, estaba asociada con formas particulares del cáncer de pulmón. Se evaluó una micromatriz de tejido que tenía muestras duplicadas de muestras de tejido pulmonar normal y canceroso en estadio I, estadio II, estadio III y estadio IV, para determinar la expresión del FRa mediante tinción por IHC con el uso del anticuerpo 26B3, como se describe en el Ejemplo 7. Como puede verse de los datos de la Tabla 6, el FRa se asocia con adenocarcinomas en relación con los carcinomas de células escamosas, que exhibieron una tinción positiva limitada.
Tabla 7: Evaluación histológica de las muestras de tejido canceroso
Figure imgf000044_0002
Se realizaron análisis adicionales en 89 de las muestras histológicas en la micromatriz de tejido, donde 36 (40 %) eran adenocarcinoma, 32 (36 %) eran carcinoma de células escamosas, 2 (2 %) eran carcinomas adenoescamosos y los 19 restantes (21 %) representó una variedad de histologías (Tabla 8). Las tasas generales de positividad del FRa variaron sustancialmente para cada uno de los subtipos histológicos. Una proporción significativamente mayor de tumores de adenocarcinoma fueron positivos para el FRa en comparación con los carcinomas de células escamosas (72 % frente a 13 %, p < 0,0001). De las 4 muestras positivas de carcinoma de células escamosas, solo 1 mostró tinción 3+ en ambas muestras; 1 tenía tinción intermedia (2+) en ambas muestras y las otras 2 eran muy débilmente positivas en una sola muestra (5-10 % de las células tumorales en 1+). Además, las dos muestras de carcinoma adenoescamoso también mostraron ser positivas para el FRa, con la tinción restringida a la porción de adenocarcinoma de estas muestras (Figura 7).
Tabla 8: Distribución de la expresión del FRa en el tipo NSCLC #
Variable negativo N (%) FRa positivo N (%) Total Valor de p*
Histología tum
Normal 1 (10 %) 9 (90 %) 10 Carcinoma de células 28 (87 %) 4 (14 %) 32 < 0,0001 Carcinoma de célula 3 (60 %) 2 (40 %) 5
Histología tum
Carcinoma de células 7 (87 %) 1 (13 %) 8
Carcinoma neuroen 4 (67 %) 2 (33 %) 6 Adenocarcinom 10 (16 %) 28 (74 %) 38
Grado del tu
Grado 1 1 (20 %) 4 (80 %) 5
Grado 2 5 (22 %) 18 (78%) 23 Grado 3
Figure imgf000044_0001
4 (40 %) 6 (60 %) 10 0,517 Continuación
Tabla 8: Distribución de la expresión del FRa en el tipo NSCLC #
Variable egativo N (%) FRa positivo N (%) Total Valor de p*
Estadio del tumor
Etapa I 4 (29 %) 11 (71 %) 15
Estadio II 2 (17 %) 10 (83%) 12
Estadio III IV*** 4 (36) 7 (64) 11 0,563
Género
Hembra 3 (18 %) 14 (82 %) 17
Masculino
Figure imgf000045_0001
7 (33 %) 14 (67 %) 21 0,46
US Biomax Lung Cancer TMA (catálogo # BC041114; 90 casos, muestras de punción duplicadas)
* Valores de p determinados con el uso de la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi-cuadrado: carcinoma de células escamosas frente a adenocarcinoma p < 0,0001; hombres frente a mujeres, p = 0,46; estadio, p = 0,563; grado, p = 0,517
** Incluye 2 casos adenoescamosos, ambos positivos para el FRa solo en la porción del adenocarcinoma *** Solo 1 caso de etapa IV
Los análisis de la puntuación M de las muestras de histología de adenocarcinoma duplicadas mostraron poca variación en la tinción por el anticuerpo 26B3 (Figura 8), un reflejo de la robustez de la tinción del anticuerpo 26B3. Además, un examen de las puntuaciones M por estadio y grado dentro del subtipo histológico de adenocarcinoma indicó que ni el estadio ni el grado de la enfermedad se asociaron con el grado de la tinción definido por las puntuaciones M (datos no mostrados).
La distribución de la puntuación M para la tinción del FRa de las muestras de adenocarcinoma de pulmón y de carcinoma de células escamosas se muestra en la Figura 9. Las puntuaciones M medias (± DE) para las muestras de adenocarcinoma y de carcinoma de células escamosas teñidas con el anticuerpo 26B3 fueron 19,84 (± 18,64) y 1,39 (± 5,54), respectivamente (p < 0,0001). La puntuación M para el adenocarcinoma también fue significativamente mayor en comparación con todos los demás tipos histológicos de cáncer de pulmón. Además, se realizó un análisis de árbol para determinar las probabilidades de que la histología del cáncer sea un adenocarcinoma. Una puntuación M > 21,7 dio como resultado una razón de probabilidades (OR) de 16, lo que demuestra además que el FRa se expresa predominantemente en la histología del adenocarcinoma (no se muestra el análisis).
Los bloques de tejido fijados con formalina y embebidos en parafina (FFPE) rara vez están disponibles en los pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón en estadio avanzado, ya que normalmente no se realizan extirpaciones quirúrgicas. Por lo tanto, se realizaron estudios para determinar la idoneidad de las muestras de aspirado con aguja fina (FNA) para la IHC del FRa con el uso del MAb 26B3, ya que el cáncer de pulmón en estadio avanzado se diagnostica con mayor frecuencia mediante una pequeña biopsia o material de citología. Para estos estudios, se obtuvieron las muestras de nueve pacientes con adenocarcinoma en estadio avanzado diagnosticados mediante evaluación citológica de un aspirado de ganglio linfático torácico (Figura 10) y se demostró que la tasa de positividad del FRa (63 %) era comparable a la observada en las muestras histológicas evaluadas sobre TMA de cáncer de pulmón. Aunque solo es un tamaño de muestra pequeño, estos datos sugieren que las muestras citológicas pueden ser una fuente de tejido adecuada para determinar la expresión del FRa en los pacientes con adenocarcinoma en estadio avanzado.
Ejemplo 14 - EL FRa se expresa por las células CK+/CD45, pero no por células CK-/CD45+, aisladas de la sangre de los pacientes que se sabe que tienen carcinoma de pulmón de células no pequeñas
Se realizaron estudios para determinar el perfil de expresión del FRa en las células tumorales circulantes (CTC) de los pacientes que se sabe que tienen carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Para estos estudios, se obtuvieron muestras de sangre de 15 donantes sanos y de 5 pacientes con cáncer de pulmón en estadio IV y luego se enriquecieron para CTC con el uso del sistema ApoSteam™ de ApoCell. Después del enriquecimiento, cada muestra se tiñó para citoqueratina (CK), CD45 (proteína tirosina fosfatasa de receptor tipo C), núcleos y FRa. La tinción del FRa se realizó con el uso del anticuerpo 26B3 como anticuerpo primario, que luego se detectó con el uso de un anticuerpo secundario específico de ratón conjugado con DyLight® 649. Como se muestra en la Tabla 9, la expresión del FRa se observó por las CTC CK+/CD45-, pero no por las CTC CK-/CD45+.
Tabla 9 - Expresión del FRa por las células tumorales circulantes de los pacientes que se sabe que tienen carcinoma de pulmón de células no pequeñas
Figure imgf000046_0001
Ejemplo 15: Supervivencia a 5 años de sujetos con y sin adenocarcinoma de pulmón que expresa el FRa
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la presencia de histología positiva del FRa, detectada por el anticuerpo 26B3, podría asociarse con una supervivencia a 5 años mejorada o disminuida. Se sometieron muestras de tejido pulmonar normal y canceroso de adenocarcinoma en estadio I o estadio II a la tinción por IHC, como se describe en el Ejemplo 7 y luego se leyeron. Se registró el porcentaje de intensidad 3+, 2+, 1+ y 0 de la tinción en el tumor. Había 177 diapositivas que se podían interpretar como duplicado o triplicado de un paciente. Cuando se combinan con los datos clínicos e histológicos evaluables, se identificaron 53 casos evaluables. Los análisis se realizaron teniendo en cuenta los datos relacionados con el estado demográfico, clínico y de supervivencia 5 años después del diagnóstico de adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas.
Para determinar un punto de corte óptimo para la puntuación M, se realizó un análisis de características operativas del receptor (ROC). La precisión diagnóstica no tuvo importancia en este análisis; sin embargo, la razón entre la razón de probabilidad de diagnóstico de la prueba positiva y la razón de probabilidad de diagnóstico de la prueba negativa fue importante. Estas razones se definen como se describe en Pepe MS, The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction, Nueva York: Oxford University Press (2003). En un punto de corte de 10, la razón de probabilidades alcanzó un máximo de 6,62. Este valor de M se eligió para determinar la positividad de un portaobjetos teñido.
Las funciones de supervivencia de Kaplan-Maier se produjeron con la asociación del FRa como el factor pronóstico. Una prueba de rango logarítmico indicó que ser positivo para el FRa fue beneficioso para los eventos no fatales (Chicuadrado = 7.34, df = 1, p = 0.007). La Figura 11 ilustra las funciones de supervivencia para los grupos de adenocarcinoma en estadio I y estadio II considerados FRa positivos y FRa negativos mediante la detección con 26B3. A los 5 años, el índice de riesgo es 2,42. Esto indica que los sujetos que tienen tumores negativos (M < 10) para el FRa tienen 2,5 veces más probabilidades de morir dentro de los cinco años posteriores al diagnóstico que los sujetos con tumores FRa positivos (M > 10).
Ejemplo 16: La expresión del receptor alfa de folato está asociada con las formas triple negativas del cáncer de mama
Se realizaron estudios para evaluar la expresión del FRa en muestras de tejido de cáncer de mama. Los análisis se realizaron con el uso de las muestras de micromatriz de tejido (TMA) teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7 y las muestras de histología FFPE preparadas y teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7.
La distribución de histologías presentes en el TMA de cáncer de mama (catálogo de BioMAX de EE. UU. # BR1503a; 72 casos, muestras de punción duplicadas) se muestra en la Tabla 10, la mayoría de los casos representados identificados como carcinoma ductal invasivo (IDC). El TMA incluyó 2 muestras de mama normal, que fueron positivas para la expresión del FRa según lo determinado por el MAb 26B3. La tinción en la mama normal se restringió a las células ductales con tinción luminal y de membrana. Dos de los tres casos de fibroadenoma (67 %), 0/2 casos de cistosarcoma (0 %) y 1/6 casos de carcinoma ductal in situ (17 %) fueron positivos para el FRa. El carcinoma lobulillar invasivo único (ILC) fue negativo para la tinción del FRa. De las 59 muestras de IDC, 18 (31 %) fueron positivas para el FRa (Figura 12). Dado el pequeño número de casos positivos en este TMA, no fue posible un análisis válido de la expresión del FRa en relación con el estadio o grado; sin embargo, cabe señalar que la mayoría de las muestras fueron T1 o T2. Se demostró que la expresión del FRa se asocia con tumores e R/PR negativos en relación con tumores ER/PR positivos (p = 0,012) y con cánceres de mama triple negativos (TNBC) (ER/PR+ o Her2+ frente a ER/PR/Her2-, p < 0,0001).
De los 18 casos IDC positivos para el FRa, solo 2 (11 %) fueron positivos para Her2, lo que significa que la gran mayoría (89 %) fueron negativos para Her2. Estos datos sugieren que la positividad del FRa sigue más de cerca con la negatividad de Her2. Además, de los 18 casos IDC positivos para el FRa, 3 fueron positivos para el receptor de estrógeno (ER) y 4 fueron positivos para el receptor de progesterona (PR), pero todos los casos positivos para ER/PR/FRa positivos fueron negativos para Her2. De los casos IDC positivos para el FRa, 12/18 (67 %) fueron cánceres de mama triple negativos (TNBC), lo que sugiere que el FRa puede ser un marcador y un objetivo para el subtipo molecular de TNBC de muy mal pronóstico. Al mirar el TMA en su conjunto, solo 2/13 (15 %) de todos los casos positivos para Her2 también fueron positivos para el FRa, mientras que 16/46 (35 %) de los casos negativos para Her2 también fueron positivos para FRa, lo que respalda la sugerencia de que la expresión del FRa se correlaciona negativamente con la expresión de Her2. En la Figura 13 se muestra una representación de la distribución de las puntuaciones M para este TMA en relación con el subtipo molecular (her-2 (+) y her-2 (-)).
El TMA descrito anteriormente estaba compuesto principalmente por cánceres de mama en etapa temprana: etapa I, 6/60 (10 %); estadio II, 44/60 (73 %); estadio III, 10/60 (17 %). Por lo tanto, para confirmar y ampliar los resultados obtenidos en el TMA, se evaluaron 61 bloques de tejido FFPE de cánceres de mama en estadio IV (T4) Her2 negativos con expresión ER/PR conocida que variaba la positividad de 0-100 % (los bloques de tejido FFPE se obtuvieron de los archivos de Genzyme Genetics). Las 61 de estas muestras procedían de metástasis, no del tumor primario. Los resultados de este estudio se resumen en la Tabla 11.
Tabla 10: Distribución de la positividad del FRa entre los datos de TMA en los tipos de histología
Figure imgf000047_0001
Continuación
FR a positivo N FR a negativo N
Histo logía tum oral Total Va lor de p *
(%) (%)
T1 3 (43 %) 4 (57 %) 7
T2 10 (26 %) 29 (74 %) 39
T3 5 (63 %) 3 (37 %) 8
T4 0 (0 %) 5 (100 %) 5
NO 18 (35 %) 33 (65 %) 51 -I
N1/N2** 0 (0 %) 8 (100 %) 8 -J 0,092
Grado 1 1 (14 %) 6 (86 %) 7 ' 1 n
Grado 2
Figure imgf000048_0001
12 (36 %) 21 (64 %) 33 -J 0,393
Grado 3 5 (26 %) 14 (74 %) 19 J 0,6465 * Valores de P calculados mediante análisis de tabla de contingencia 2 X 2 con el uso de la prueba exacta de Fisher.
** 4/8 (50 %) de las muestras N1/N2 fueron Her2+__________________________________________________
La expresión del FRa (Figura 14) se encontró en 22/61 (36 %) de estos pacientes, lo que demuestra que el porcentaje de muestras/tumores FRa positivos determinados en la enfermedad en etapa temprana se retiene en la enfermedad metastásica en estadio avanzado en una población negativa para Her2 (positividad para TMA = 35 %; enfermedad metastásica en estadio IV = 36 %). De los 22 pacientes metastásicos en estadio IV positivos para el FRa, solo 3 (14 %) mostraron alguna positividad para ER/PR con tal tendencia de positividad en el rango bajo (hasta el 30 %). Como tal, 19/22 pacientes FRa positivos (86 %) eran del subtipo molecular triple negativo. Nuevamente, estos datos se comparan favorablemente con los datos obtenidos en la etapa temprana de la enfermedad en el TMA, donde el 67 % de todos los pacientes positivos para el FRa eran del subtipo triple negativo.
Tabla 11: Distribución de la positividad del FRa en los subtipos moleculares de las muestras de cáncer de mama metastásico
S
Figure imgf000048_0002
* Valores de p calculados mediante análisis de tabla de contingencia 2 X 2 con el uso de la prueba exacta de Fisher.
Además, se obtuvieron las muestras de la enfermedad metastásica en estadio IV de varios sitios metastásicos que incluyen ganglios linfáticos, huesos, piel e hígado, así como muestras de líquido y aspirado con aguja fina (FNA) obtenidas principalmente de la pleura y la paracentesis. Varias de estas "biopsias fluidas" se tiñeron positivas para el FRa (Figura 15), lo que sugiere la aplicabilidad general de la metodología IHC descrita para múltiples tipos de muestras.
Ejemplo 17: Evaluación de las muestras histológicas de cáncer ginecológico para la expresión del receptor alfa de folato
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en neoplasias ginecológicas que implican el ovario, endometrio y las trompas de Falopio. Los análisis se realizaron con el uso de las muestras de micromatriz de tejido (TMA) teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7 y las muestras de histología FFPE preparadas y teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7. Se obtuvieron micromatrices de tejidos comerciales de US Biomax, Inc. (Rockville, MD) para carcinomas de ovario (catálogo # OV1921; 96 casos, muestras de punción duplicadas); carcinomas de endometrio (catálogo # EMC1021; 102 casos, muestras de punción únicas) y carcinomas de las trompas de Falopio (catálogo # UTE601; 30 casos, muestras de punción duplicadas).
Una muestra se consideró positiva para la expresión del FRa si el porcentaje de las células tumorales positivas para la tinción membranosa era mayor o igual al 5 % a cualquier intensidad. Se rechazó una muestra y, por lo tanto, no se incluyó en los análisis si el patólogo ginecológico determinó que faltaba por completo o estaba compuesta de tejido necrótico con un número insuficiente de células viables para la evaluación. De las muestras de endometrio, seis contenían solo hiperplasia compleja atípica sin adenocarcinoma. La clasificación histológica del tipo de células y grado se basó en la Clasificación de la OMS de los órganos genitales femeninos y de mama (Tavassoli y Devilee). El fabricante del TMA (US Biomax) proporcionó la etapa clínica basada en el sistema FIGO y TNM.
La tasa de positividad para la expresión del FRa dentro de un tipo de tumor dado se calculó como la proporción de tumores que se tiñeron positivamente de acuerdo con la definición de un resultado positivo (± 5 % de la tinción de membrana de la célula tumoral). Las diferencias en la positividad del FRa entre los grupos, por ejemplo, histologías, estadio o grado, se evaluaron con el uso de tablas de contingencia 2 x 2 y la prueba exacta de Fisher. Las diferencias en los valores medios fueron estadísticamente diferentes si el valor de p asociado con la prueba era menor que el error tipo I ajustado de Bonferroni para esa prueba (error máximo tipo I = 0,05).
La intensidad de la tinción citoplasmática y de membrana se puntuó como 0, sin tinción; 1+, débil; 2+, moderado y 3+, fuerte. También se determinó el porcentaje de células para cada intensidad en la muestra. El tejido se analizó con los objetivos 4x, 10x, 20x y 40x. La tinción fuerte de membrana (3+) se visualizó fácilmente a 4x y se confirmó a 10x. La tinción moderada de la membrana (2+) fue visible a 10x y se confirmó a 20x. La tinción débil (1+) requirió 20x o 40x (Figura 16). En presencia de la tinción 3+, la membrana era gruesa y al ocurrir en los bordes celulares apicales y laterales. En las secciones tangenciales, se evidenció un patrón circunferencial completo (Figura 16 (A) y (B)). La tinción de membrana 2+ fue más débil en intensidad y más delgada que la 3+, generalmente localizada en los bordes luminales apicales y ocasionalmente en los bordes celulares laterales. La tinción de membrana débil 1 generalmente se limitaba a los bordes luminales. La tinción citoplasmática acompañante fue variable, dependiendo del tipo de los tumores.
De las 94 muestras evaluables en el TMA del tumor de ovario, 70 (74 %) eran del tipo seroso, 10 (11%) eran mucinosas, 4 (4 %) endometrioides, 3 (3 %) del tipo de células claras y los 7 restantes (8 %) fueron diversos tumores raros. De las 87 muestras de carcinomas de ovario, la tasa positiva del FRa para cada tipo de célula fue la siguiente: 100 % (70/70) en tipo seroso, 80 % (8/10) tipo mucinoso, 75 % (3/4) tipo endometrioide y 67 % (2/3) del tipo de células claras. La diferencia entre el tipo seroso y mucinoso es significativa con un valor de p de 0,014 según la prueba exacta de Fisher (Tabla 12). El estado del FRa no fue significativo para el grado histológico o el estadio clínico. La tinción citoplasmática coexistente fue generalmente 2+ o 3+ en el tipo seroso y más débil y menos frecuente en los otros tipos de tumores.
Tabla 12: Distribución de la positividad del FRa en relación con el tipo histológico, el estadio clínico y el grado histológico en los carcinomas de ovario
Histología tumoral* FRa negativo N (%) FRa positivo N (%) Total Valor de p** Carcinoma seroso 0 (0 %) 70 (100 %) 70
Carcinoma mucinos 2 (20 %) 8 (80 %) 10 0,014
Carcinoma endometr 1 (25 %) 3 (75 %) 4
Carcinoma de célula 1 (33 %) 2 (67 %) 3
Total 4 (5 %) 83 (95 %) 87
Estadio II 4 (9 %) 41 (91 %) 45
Estadio III 0 (0 %) 29 (100 %) 29 0,15
Estadio IV 0 (0 %) 13 (100 %) 13
Grado 1 2 (15 %) 11 (85 %) 13 NS***
Grado 2
Figure imgf000049_0001
1 (3 %) 31 (97 %) 32 NS
Grado 3 1 (3 %) 39 (97 %) 40 NS * 1 carcinoma de células de transición, 1 carcinoma escamoso, 1 carcinoma embrionario, 2 tumores del saco vitelino y 2 tumores de células de la granulosa no incluidos en el análisis
** Valores de p determinados mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi-cuadrado: carcinoma seroso frente a carcinoma mucinoso p = 0,014
*** NS = No significativo
En las muestras de endometrio, el FRa se expresó en el 80 % (4/5) de lo normal (Figura 17(A)), 100 % (6/6) de la hiperplasia compleja atípica (Figura 17(B)) y 89 % (80/90) de los adenocarcinomas, incluidos 88 de tipo endometrioide y 1 de tipo de células claras (Figuras 18 y 19). Lucha contra los adenocarcinomas endometrioides contenían áreas de metaplasia escamosa. En el endometrio normal, la tinción de membrana fue débil y se limitó a los bordes luminales apicales (Figura 17(A)). En la hiperplasia compleja atípica y en los carcinomas, la tinción fue predominantemente luminal con tinción adicional en los bordes laterales de las células en algunos casos (Figura 17(B)). En presencia de la tinción de membrana 3+, la tinción citoplasmática varió en intensidad de fuerte (Figura 18(A)) a débil (Figuras 18(B) y (C)). Las células tumorales con la tinción de membrana 1+ o 2+ rara vez expresaban tinción citoplasmática. La mayoría de las células escamosas metaplásicas y de las células claras mostraron una tinción de membrana de moderada a fuerte. (Figuras 19(A) y (B)).
La expresión del FRa fue positiva en el 100 % de los tumores de grado 1, 96 % de los de grado 2 y 74 % de los de grado 3 (grado 1 frente a grado 3, valor de p = 0,0029; grado 2 frente a grado 3, p = 0,034). El estado del FRa no fue significativo en relación con T1 frente a T2/3; N0 frente a N1 y estadio I frente a estadio II/NI.
Diecisiete muestras de punción de las trompas de Falopio normales, 16 muestras de salpingitis crónica y 20 carcinomas serosos de las trompas fueron todos muy positivos para la tinción citoplasmática y de membrana (Figuras 20(A) a (C)).
Ejemplo 18: Evaluación de muestras histológicas colorrectales para la expresión del receptor alfa de folato
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en muestras de tejido colorrectal. Los análisis se realizaron con el uso de muestras de micromatrices de tejido (TMA) obtenidas de US Biomax (catálogo # BC051111). El TMA contenía 90 muestras duplicadas de los tejidos obtenidos de sujetos que se sabe que tienen cáncer colorrectal y 10 muestras colorrectales normales. Las muestras se tiñeron con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7. De las 90 muestras obtenidas de sujetos que se sabe que tienen cáncer colorrectal, 18 (20 %) fueron positivas para la expresión del FRa, mientras que ninguna de las muestras normales fue positiva. Además, el estado positivo fue generalmente de medio a débil y no se pudo discernir una relación aparente con el estadio de la enfermedad.
Ejemplo 19: Evaluación de muestras histológicas de tiroides para la expresión del receptor alfa de folato
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en las muestras de tejido tiroideo. Los análisis se realizaron con el uso de muestras de micromatrices de tejido (TMA) obtenidas de US Biomax (catálogo # TII802a). Las muestras se tiñeron con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 3. El carcinoma papilar de tiroides fue fuertemente positivo para la expresión de membrana del FRa (26/28, 93 %) y fue distinguible del carcinoma medular, donde las 5 muestras fueron negativas para la tinción del FRa, de acuerdo con informes anteriores. Curiosamente, los adenomas foliculares fueron separables en tipo macrofolicular y tipo microfolicular con 3/13 (23 %) y 18/22 (82 %) mostrando positividad para la expresión del FRa, respectivamente. También se observó algo de positividad en el pequeño número de muestras de los tumores de las células de Hürthle (2/3, 63 %) y carcinoma folicular (3/3, 43 %) en este TMA. Estos resultados se resumen en la Tabla 13.
Tabla 13 - Expresión del FRa en muestras de tejido tiroideo
Figure imgf000050_0001

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo con unión al antígeno, específico para el receptor alfa de folato (FRa) que comprende
a. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; o
b. una CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, una CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y una CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
2. El anticuerpo aislado o el fragmento con unión al antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1a que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1b que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
5. Un anticuerpo aislado específico para el receptor alfa de folato (FRa) producido por la línea celular depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-11884 o PTA-11886.
6. Un método para detectar el receptor alfa de folato (FRa) o un cáncer que expresa el FRa en una muestra biológica, que comprende exponer la muestra al anticuerpo de la reivindicación 1 o 5, o a un fragmento del mismo con unión al antígeno y detectar el receptor alfa de folato (FRa).
7. El método de la reivindicación 6, en donde la muestra biológica se deriva de un ser humano, roedor, primate no humano, conejo o perro.
8. Un método para diagnosticar un cáncer que expresa el receptor alfa de folato en un sujeto, que comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5 o un fragmento de los mismos con unión al antígeno;
b. cuantificar la cantidad del receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra;
c. comparar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra con un estándar conocido; y
d. determinar si los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto se encuentran dentro de los niveles del receptor alfa de folato (FRa) asociados con el cáncer.
9. El método de la reivindicación 8, en donde un hallazgo de que las células de adenocarcinoma del sujeto expresan el receptor alfa de folato indica que el sujeto tendrá una mayor probabilidad de una tasa de supervivencia mejorada a 5 años que si las células de adenocarcinoma no expresan el receptor alfa de folato.
10. Un método de seguimiento de un cáncer que expresa el receptor alfa de folato en un sujeto, que comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5 o a un fragmento de los mismos con unión al antígeno;
b. cuantificar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra que está unido al anticuerpo o al fragmento del mismo con unión al antígeno;
c. comparar la cantidad de receptor alfa de folato (FRa) presente en la muestra con
i. un estándar conocido o
ii. una muestra biológica obtenida del sujeto en un punto anterior en el tiempo; y
d. determinar si los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto son indicativos de progresión, regresión o enfermedad estable del cáncer.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde la muestra biológica se deriva de la orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido, tejidos, tejido tumoral extirpado quirúrgicamente, biopsias, muestras por aspiración con aguja fina o preparaciones histológicas.
12. El método de la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de ovario.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el cáncer es un cáncer de pulmón.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma.
15. El método de la reivindicación 8 o 10, en donde el estándar conocido comprende
a. niveles del receptor alfa de folato (FRa) derivados de los sujetos identificados como libres de cáncer o una preparación de la proteína del receptor alfa de folato a una concentración conocida;
b. Niveles del FRa derivados de los sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio temprano que expresa el receptor alfa de folato;
c. Niveles del FRa derivados de los sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio intermedio que expresa el receptor alfa de folato; o
d. Niveles del FRa derivados de sujetos identificados como portadores de un cáncer en estadio avanzado que expresa el receptor alfa de folato.
16. El método de la reivindicación 15, en donde el cáncer es un cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de ovario o cáncer de pulmón.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en donde el método se realiza después del tratamiento del sujeto para el cáncer.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está marcado.
19. El método de la reivindicación 18, en donde el marcador es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL o una enzima.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 19, en donde el receptor alfa de folato (FRa) expuesto está unido o no a una célula.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 20, en donde la presencia del receptor alfa de folato (FRa) en la muestra se detecta con el uso de la transferencia Western, inmunohistoquímica, citometría de flujo, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) o ELISA.
22. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde los niveles del receptor alfa de folato (FRa) del sujeto son indicativos del tipo de cáncer que afecta al sujeto.
23. El método de la reivindicación 22, en donde el cáncer es un adenocarcinoma de pulmón o carcinoma de pulmón de células escamosas.
24. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo está marcado de forma detectable.
25. El anticuerpo de la reivindicación 24, en donde el marcador detectable es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL o una enzima.
26. El anticuerpo de la reivindicación 25, en donde el marcador es rutenio, 111In-DOTA, 111In-ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa o polihistidina.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, en donde el anticuerpo o el fragmento con unión al antígeno, se fija a un soporte sólido.
28. El método de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que comprende además predecir un resultado favorable para un sujeto que tiene un adenocarcinoma que expresa el receptor alfa de folato (FRa), en donde un resultado favorable se define como tener una tasa de supervivencia aumentada a 5 años.
ES17196948T 2011-07-15 2012-07-13 Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos Active ES2824498T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508444P 2011-07-15 2011-07-15
US201261604412P 2012-02-28 2012-02-28
US201261604954P 2012-02-29 2012-02-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2824498T3 true ES2824498T3 (es) 2021-05-12

Family

ID=46516898

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17196948T Active ES2824498T3 (es) 2011-07-15 2012-07-13 Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos
ES12736054.3T Active ES2663556T3 (es) 2011-07-15 2012-07-13 Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12736054.3T Active ES2663556T3 (es) 2011-07-15 2012-07-13 Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos

Country Status (20)

Country Link
US (4) US8475795B2 (es)
EP (2) EP2731972B1 (es)
JP (2) JP6220333B2 (es)
CN (2) CN103998467B (es)
AU (3) AU2012284321C1 (es)
BR (1) BR112014001030A2 (es)
CA (1) CA2841725C (es)
CY (1) CY1120600T1 (es)
DK (1) DK2731972T3 (es)
ES (2) ES2824498T3 (es)
HR (1) HRP20180353T1 (es)
HU (1) HUE036929T2 (es)
LT (1) LT2731972T (es)
PL (1) PL2731972T3 (es)
PT (1) PT2731972T (es)
RS (1) RS56985B1 (es)
SG (1) SG10201605278PA (es)
SI (1) SI2731972T1 (es)
TR (1) TR201802838T4 (es)
WO (1) WO2013012722A1 (es)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY171234A (en) 2010-02-24 2019-10-04 Immunogen Inc Folate receptor 1 antibodies and immunoconjugates and uses thereof
IL303208A (en) 2011-04-01 2023-07-01 Immunogen Inc Methods for increasing the effectiveness of FOLR1 cancer therapy
CA2841725C (en) * 2011-07-15 2021-03-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
NZ726258A (en) 2012-08-31 2019-07-26 Immunogen Inc Antibodies and uses thereof to detect folate receptor 1
AU2014284212B2 (en) 2013-06-20 2019-09-12 Eisai, Inc. Methods for treatment of ovarian cancer
KR20230145514A (ko) 2013-08-30 2023-10-17 이뮤노젠 아이엔씨 엽산 수용체 1의 검출을 위한 항체 및 분석
EP3140653B1 (en) * 2014-05-08 2022-05-11 Novodiax, Inc. Direct immunohistochemistry assay
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
MX2017013390A (es) 2015-04-17 2018-06-13 Morphotek Inc Método para el tratamiento de cáncer pulmonar.
RU2749865C2 (ru) 2015-09-17 2021-06-17 Иммьюноджен, Инк. Терапевтические комбинации, содержащие анти-folr1 иммуноконъюгаты
JP7227123B2 (ja) 2016-08-12 2023-02-21 エル．イー．エー．エフ． ホールディングス グループ エルエルシー αおよびγ－Ｄポリグルタミン酸化抗葉酸剤およびその使用
EP3544999A1 (en) * 2016-11-23 2019-10-02 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
CN107353325B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽1及其应用
CN107446021B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽5及其应用
CN107793471B (zh) * 2017-07-26 2020-08-11 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽4及其应用
CN107446020B (zh) * 2017-07-28 2019-10-01 中国药科大学 叶酸受体α特异性结合肽2及其应用
AU2018328187A1 (en) * 2017-09-05 2020-03-26 Immunogen, Inc. Methods for detection of folate receptor 1 in a patient sample
EP3749316A4 (en) 2018-02-07 2021-10-27 L.E.A.F Holdings Group LLC PRALATREXATE ALPHA-POLYGLUTAMATE AND ASSOCIATED USES
CN111954531A (zh) 2018-02-07 2020-11-17 L.E.A.F.控股集团公司 α聚谷氨酸化培美曲塞及其用途
US11771700B2 (en) 2018-02-14 2023-10-03 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated lometrexol and uses thereof
JP7433236B2 (ja) 2018-03-13 2024-02-19 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗葉酸受容体１抗体及びその使用
KR102275930B1 (ko) * 2018-03-14 2021-07-12 (주)알테오젠 Folr1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
TW202019472A (zh) * 2018-07-09 2020-06-01 大陸商艾比瑪特生物醫藥（上海）有限公司 葉酸受體阿法特異性抗體
CN111393528B (zh) * 2020-01-19 2023-01-31 中国药科大学 一种靶向叶酸受体α的单链抗体及其应用
WO2021247821A1 (en) * 2020-06-03 2021-12-09 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Monoclonal antibodies against human siglec-9 and use thereof for immunotherapy
AU2022284860A1 (en) * 2021-06-04 2023-12-14 Immunogen, Inc. Treatment of cancer in patients with soluble fr-alpha
CN117700556B (zh) * 2024-02-05 2024-04-12 苏州百道医疗科技有限公司 一种抗FRα小鼠单克隆抗体及其应用
CN117700557B (zh) * 2024-02-05 2024-04-30 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5646253A (en) 1994-03-08 1997-07-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Recombinant human anti-LK26 antibodies
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US7270960B2 (en) 2001-08-29 2007-09-18 Pacific Northwest Research Institute Diagnosis of ovarian carcinomas
US20080131366A1 (en) 2003-03-17 2008-06-05 Manohar Ratnam Folate Receptor Gene Modulation For Cancer Diagnosis And Therapy
US20040235108A1 (en) 2003-05-23 2004-11-25 Luigi Grasso Monoclonal antibodies that specifically bind a tumor antigen
EP2316857A1 (en) 2004-02-12 2011-05-04 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
CA2602585A1 (en) 2005-03-30 2006-10-05 Purdue Research Foundation Method for cancer prognosis using cellular folate vitamin receptor quantification
JP2009521206A (ja) * 2005-04-22 2009-06-04 モルフォテック、インク． 免疫エフェクター活性を有する葉酸受容体アルファ陽性細胞に内部移行する抗体
EP1900752A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
US7754698B2 (en) 2007-01-09 2010-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of FR-alpha expression
FR2918994B1 (fr) 2007-07-20 2012-10-19 Rhodia Operations Formulations de diesters d'acide carboxylique et leur utilisation pour le traitement de materiaux.
WO2009132081A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 The Research Foundation Of State University Of New York Monoclonal antibody-based targeting of folate receptors
US20110177525A1 (en) 2010-01-19 2011-07-21 Predictive Biosciences, Inc. Antibodies and methods of diagnosing diseases
MX343607B (es) * 2010-11-05 2016-11-11 Morphotek Inc Receptor alfa de folato como marcador de diagnóstico y pronóstico para cánceres que expresan receptor alfa de folato.
JP2014508165A (ja) 2011-03-02 2014-04-03 モルフォテック、インク． 乳癌の治療のためのエリブリンおよびファーレツズマブの共投与
CA2841725C (en) * 2011-07-15 2021-03-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP6526143B2 (ja) 2019-06-05
PL2731972T3 (pl) 2018-06-29
US9599621B2 (en) 2017-03-21
US20170168078A1 (en) 2017-06-15
EP3330291B1 (en) 2020-09-02
CN103998467B (zh) 2016-12-14
SG10201605278PA (en) 2016-08-30
WO2013012722A1 (en) 2013-01-24
HUE036929T2 (hu) 2018-08-28
SI2731972T1 (en) 2018-04-30
AU2018236755B2 (en) 2019-11-14
JP2014524744A (ja) 2014-09-25
AU2017202365B2 (en) 2018-06-28
US8834877B2 (en) 2014-09-16
CA2841725C (en) 2021-03-09
DK2731972T3 (en) 2018-03-12
EP2731972A1 (en) 2014-05-21
RS56985B1 (sr) 2018-05-31
EP3330291A1 (en) 2018-06-06
US20130017195A1 (en) 2013-01-17
US20140341897A1 (en) 2014-11-20
US8475795B2 (en) 2013-07-02
US20130183299A1 (en) 2013-07-18
AU2017202365A1 (en) 2017-04-27
AU2018236755A1 (en) 2018-10-18
CA2841725A1 (en) 2013-01-24
EP2731972B1 (en) 2017-12-20
BR112014001030A2 (pt) 2017-07-04
JP6220333B2 (ja) 2017-10-25
PT2731972T (pt) 2018-03-09
US10101343B2 (en) 2018-10-16
JP2018029605A (ja) 2018-03-01
CY1120600T1 (el) 2019-12-11
CN107011439B (zh) 2020-11-10
ES2663556T3 (es) 2018-04-13
CN107011439A (zh) 2017-08-04
TR201802838T4 (tr) 2018-03-21
AU2012284321C1 (en) 2017-07-13
AU2012284321A1 (en) 2014-02-06
LT2731972T (lt) 2018-03-26
CN103998467A (zh) 2014-08-20
AU2012284321B2 (en) 2017-03-09
HRP20180353T1 (hr) 2018-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2824498T3 (es) Anticuerpos antirreceptor alfa de folato y usos de los mismos
US10822410B2 (en) Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
KR102197478B1 (ko) 식도암을 검출 및 치료하기 위한 조성물 및 방법
US9809653B2 (en) Anti-LAMP1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
KR102507685B1 (ko) 난소암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2019045086A1 (ja) 活性型もしくは潜在型ＴＧＦ−β１特異的抗体の用途
JP2008518629A (ja) Ｍｄｌ−１の腫瘍との関連およびその方法
TWI782000B (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用