ES2663556T3 - Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente a la secuencia del receptor α del folato (FRα) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.º ID: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.o ID: 27, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.º ID: 28, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.º ID: 30, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.º ID: 31 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.º ID: 32.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos.
CAMPO TÉCNICO
La materia dada a conocer en la presente memoria se refiere a anticuerpos específicos frente al receptor a del folato (FRa). ANTECEDENTES
En los humanos, el receptor del folato de alta afinidad presenta cuatro isoformas: a, p, y y 5. Las formas a, p y 5 normalmente se encuentran unidas a las membranas celulares por medio de anclajes a glicosilfosfatidilinositol (GPI). Estas se reciclan entre compartimentos extracelulares y endocíticos, y pueden transportar folato al interior de la célula. Las formas solubles del receptor del folato se pueden derivar de la acción de proteasas o fosfolipasas en los receptores del folato anclados en la membrana.
El receptor a del folato (también denominado FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se expresa en varios tejidos epiteliales, entre ellos los del plexo coroideo, los pulmones, la tiroides, los riñones, el útero, las mamas, las trompas de Falopio, los epidídimos y las glándulas salivales. Weitman, SD et al., Cáncer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD et al., Cáncer Res 52: 6708-6711 (1992). La sobreexpresión del FRa se ha observado en varios tipos de cáncer, entre ellos el cáncer de pulmón (p. ej., tumores carcinoides y carcinomas de pulmón no microcíticos como adenocarcinomas); mesotelioma; cáncer de ovario; carcinoma renal; cáncer de cerebro (p. ej., ependimoma anaplásico, astrocitoma pilocítico cerebeloso infantil y metástasis al cerebro); cáncer de cuello uterino; carcinoma nasofaríngeo; tumor de origen mesodérmico; carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer endometrial; adenocarcinomas endometrioide y papilar seroso de ovario, cistoadenocarcinomas serosos de ovario, cáncer de mama; cáncer de vejiga; cáncer de páncreas; carcinoma óseo (p. ej., osteosarcoma de gran malignidad); carcinoma hipofisario (p. ej., adenomas hipofisarios); cáncer colorrectal y cáncer medular de tiroides. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.754.698; la publicación de patente de EE. UU. n.° 2005/0232919; Intl. Publ. No. WO 2009/132081; Bueno R et al., J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2): 225233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11,506-519 (2006); Basal et al., PLoS ONE, 4(7):6292 (2009); Fisher RE J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al., Int J Cancer, Suppl 8:89-95 (1994); Hartmann LC et al., Int J Cancer 121:938-942 (2007); Iwakiri S et al., Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899 (2008); Publicación de patente europea EP 2199796, Parker N. et al., Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al., Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba NF et al., Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al., Clin Cancer Res 13:2557- 2567 (2007). En algunos tipos de cáncer (p. ej., carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), un nivel elevado de expresión del FRa se asocia a un pronóstico desfavorable, mientras que en otros tipos de cáncer (p. ej., carcinomas de pulmón no microcíticos), un nivel elevado de expresión del FRa se asocia a un pronóstico más favorable. Véanse, por ejemplo, Iwakiri S et al., Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889- 899; Saba NF et al., Head Neck, 31(4): 475-481 (2009). En el artículo publicado por Smith et al. en Hybridoma, vol. 26, n.o 5, 2007-10, págs. 281-288 se da a conocer un anticuerpo monoclonal que se puede utilizar para detectar el receptor a del folato.
La detección precoz del cáncer mejora las tasas de supervivencia y la calidad de vida. A fin de aumentar las probabilidades de que la detección y el tratamiento sean tempranos, urge desarrollar métodos no invasivos para diagnosticar cánceres con expresión del FRa y para vigilar cánceres con expresión del FRa.
RESUMEN
En la presente memoria se dan a conocer anticuerpos que específicamente se unen al FRa. También se describen polinucleótidos relacionados que pueden codificar los anticuerpos dados a conocer, células que expresan los anticuerpos dados a conocer, así como vectores y marcajes detectables de anticuerpos relacionados. Además, se describen métodos para utilizar los anticuerpos dados a conocer. Por ejemplo, los anticuerpos dados a conocer se pueden utilizar para diagnosticar cáncer; para comprobar si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable; para establecer un pronóstico de cáncer en un sujeto; para determinar si un paciente debe recibir tratamiento contra el cáncer o no, o para determinar si un sujeto padece o no cáncer con expresión del FRa y por lo tanto, si es susceptible de tratamiento con un agente terapéutico anticancerígeno específico para el FRa.
En un primer aspecto de la presente invención se da a conocer un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 26, una CDR2 de cadena ligera con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 27, una CDR3 de cadena ligera con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.o ID: 28, una CDR1 de cadena pesada con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 30, una CDR2 de cadena pesada con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 31 y una CDR3 de cadena pesada con la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 32.
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En un segundo aspecto de la presente invención se da a conocer un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa), donde la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 26, la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 27, la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo
codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 28, la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo
codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 30, la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo
codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 31 y la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo
codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 32.
En un tercer aspecto de la presente invención se da a conocer un vector que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6.
En un cuarto aspecto de la presente invención se da a conocer una célula recombinante que comprende el vector de la reivindicación 7.
En un quinto aspecto de la presente invención se da a conocer un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por una estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11885.
En un sexto aspecto de la presente invención se da a conocer un método para detectar el receptor a del folato (FRa) o cáncer con expresión del FRa en una muestra biológica; dicho método comprende la exposición de la muestra al anticuerpo de la reivindicación 1 o 10, o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, y la detección del receptor a del folato (FRa).
En un séptimo aspecto de la presente invención se da a conocer un método para diagnosticar cáncer con expresión del receptor a del folato en un sujeto; dicho método comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o a un fragmento de unión al antígeno del mismo;
b. determinar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra;
c. comparar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra con un patrón conocido; y
d. determinar si la concentración de receptor a del folato (FRa) en el sujeto se encuentra dentro del intervalo de concentraciones de receptor a del folato (FRa) asociadas al cáncer.
En un octavo aspecto de la presente invención se da a conocer un método para vigilar el cáncer con expresión del receptor a del folato en un sujeto; dicho método comprende:
a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o a un fragmento de unión al antígeno del mismo;
b. determinar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra que está unido al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo;
c. comparar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra con
i. un patrón conocido; o
ii. una muestra biológica obtenida del sujeto en el pasado; y
d. con base en la concentración de receptor a del folato (FRa) en el sujeto, determinar si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable.
En un noveno aspecto de la presente invención se da a conocer un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica; dicho kit comprende al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
En un décimo aspecto de la presente invención se da a conocer un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica; dicho kit comprende:
al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo; donde el anticuerpo incluido, o fragmento de unión al antígeno del mismo, está fijado a un soporte sólido.
En un undécimo aspecto de la presente invención se da a conocer un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica; dicho kit comprende:
al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo; donde el anticuerpo incluido, o fragmento de unión al antígeno del mismo, está marcado de manera que se puede detectar.
Anticuerpos específicos frente al receptor a del folato (FRa)
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En el presente se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno aislados que específicamente se unen al FRa. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno son IgG murinas o derivados de estas.
En el presente se describen anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno aislados que se unen específicamente al FRa, ya sea en forma nativa, no reducida, o químicamente conservada. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno son IgG murinas o derivados de estas. Aunque los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno ilustrados en el presente son murinos.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29. En algunas realizaciones, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 61 puede codificar esta secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena ligera. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33. En algunas realizaciones, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 65 puede codificar esta secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena pesada. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir dominios variables de cadena ligera y pesada, donde el dominio variable de cadena ligera incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29 y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33. En algunas realizaciones, se dan a conocer el anticuerpo 26B3.F2 (26B3), o fragmentos de unión al antígeno del mismo, los cuales se pueden unir a las formas nativas, no reducidas o químicamente conservadas del FRa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo 26B3 ha sido producido por células productoras de anticuerpos depositadas en la Colección de Cultivos Americana (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo de 2011 y a las que se les ha asignado el número de acceso PTA-11885. En algunas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, poseen la misma afinidad de unión al FRa que los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, comprenden las CDR de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, comprenden las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.
También se dan a conocer polinucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a las formas nativas, no reducidas o químicamente conservadas del FRa. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 58. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 59. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 63. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 58; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° iD: 59; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 63; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° iD: 58; y una CDR2 codificada por una secuencia nucleotídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 59; y una CDR3 codificada por una secuencia nucleotídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60; y una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la
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SEC. N.0 ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.0 ID: 63; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.0 ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Las disposiciones de CDR que se unen al antígeno también pueden construirse mediante técnicas de ingeniería genética utilizando como armazón para ellas proteínas similares a los anticuerpos. Tales proteínas que se unen al antígeno construidas mediante técnicas de ingeniería genética se encuentran dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tienen un segmento del dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 61. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tengan un segmento del dominio variable de cadena pesada que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 65. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tengan un segmento del dominio variable de cadena ligera que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 61; y un segmento del dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 65. Los polinucleótidos que pueden codificar los segmentos del dominio variable dados a conocer en el presente se pueden incluir en los mismos, o distintos, vectores para producir anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno. Los polinucleótidos descritos en el presente pueden codificar el anticuerpo 26B3, o fragmentos de unión al antígeno del mismo, los cuales se pueden unir a las formas nativas, no reducidas o químicamente conservadas del FRa.
Se dan a conocer vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno, así como células que expresan los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. También se dan a conocer células que pueden expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamíferos (como células CHO-K1), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células de bacterias (como E. coli). Los anticuerpos descritos también se pueden producir mediante células de hibridoma, como las descritas en el presente.
Métodos para diagnosticar el cáncer
En la presente memoria se dan a conocer métodos para diagnosticar en un sujeto cáncer de origen epitelial, ya sea de mama, de tiroides, colorrectal, endometrial, de trompas de Falopio, de ovario o de pulmón. En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la concentración de FRa presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la concentración de FRa en la muestra de control indica si el sujeto padece o no un cáncer con expresión del FRa.
En algunas realizaciones la muestra de control se puede obtener a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la muestra de control se puede obtener a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa, un aumento observado en la cantidad de FRa presente en la muestra, con respecto a la cantidad observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa, una disminución o similitud observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la cantidad observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado no padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa, una similitud observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la cantidad observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa, una disminución observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la cantidad observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado no padece cáncer con expresión del FRa.
En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. Se pueden utilizar métodos similares para determinar si el sujeto padece un cáncer que no está asociado con una mayor producción de FRa. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede proceder de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
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En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la concentración de FRa asociada a una célula o tejido que está presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la concentración de FRa en la muestra de control indica que el sujeto padece un cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la concentración de FRa no asociada a una célula o tejido que está presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la concentración de FRa en la muestra control indica que el sujeto padece un cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparados histológicos y similares.
En diversas realizaciones de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer con expresión del FRa. En una realización particular, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer endometrial. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de las trompas de Falopio. En otra realización, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de pulmón no microcítico, como un adenocarcinoma. Por otra parte, los métodos descritos se pueden utilizar para identificar un cáncer sin expresión del FRa, como carcinoma de células escamosas. Por ejemplo, los métodos descritos se podrían utilizar para distinguir un cáncer de pulmón con expresión del FRa, como adenocarcinoma, de un cáncer de pulmón sin expresión del FRa, como carcinoma de células escamosas. Los métodos descritos se podrían utilizar para distinguir un cáncer de mama con expresión del FRa, como fibroadenoma, de un cáncer de mama sin expresión del FRa, como sarcoma quístico. Además, los métodos descritos se podrían utilizar para distinguir un cáncer de tiroides con expresión del FRa, como carcinoma papilar, de un cáncer de tiroides sin expresión del FRa, como carcinoma medular. En algunas realizaciones descritas en el presente la detección en un sujeto de células cancerígenas que expresan el FRa se puede utilizar para determinar si el sujeto puede ser tratado con un agente terapéutico específico para el FRa. En algunas realizaciones, el agente terapéutico específico para el FRa puede ser un anticuerpo, como Farletuzumab.
En diversos aspectos, la concentración de FRa se determina mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa y a continuación, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. Cuando se utilizan dos anticuerpos, uno de los anticuerpos es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
(b) el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos;
(c) un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende las CDR de cadena ligera y pesada del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
(d) un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1; o
(e) un anticuerpo que tiene la secuencia aminoacídica del anticuerpo producido por cualquiera de las estirpes celulares depositadas en la ATCC con número de acceso PTA-11887, PtA-11884, pTa-11886, o PTA-11885, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
En determinadas realizaciones, la concentración de FRa se determina mediante análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorometría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de
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electroquimioluminiscencia (EQL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ELISA.
En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invención, la muestra de control es una concentración de FRa de referencia estándar en un sujeto sano. En otras realizaciones la muestra de control puede ser proteína FRa a una concentración conocida (p. ej., muestra de proteína FRa purificada o recombinante). En algunas realizaciones, la concentración de FRa observada en el sujeto evaluado se puede comparar con las concentraciones de FRa observadas en muestras obtenidas a partir de sujetos de los cuales se sabe que presentan cáncer con expresión del FRa o cuyas concentraciones de FRa se conocen.
Métodos para vigilar el cáncer
En la presente memoria se dan a conocer métodos para vigilar un cáncer con expresión del FRa en un sujeto. Los métodos descritos se pueden utilizar antes del tratamiento anticancerígeno, después del tratamiento anticancerígeno, o tanto antes como después del tratamiento anticancerígeno. En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la concentración de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra obtenida a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable. A este respecto, una muestra problema con una concentración de FRa más elevada con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una concentración de FRa más baja con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una concentración de FRa cuya diferencia con la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa se puede derivar de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la concentración de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra obtenida de manera similar a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable. A este respecto, una muestra problema con una concentración de FRa más elevada con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una concentración de FRa más baja con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una concentración de FRa cuya diferencia con la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la concentración de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la concentración de FRa observada con la concentración de FRa en una muestra obtenida de manera similar a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la concentración de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable. A este respecto, una muestra problema con una concentración de FRa más elevada con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una concentración de FRa más baja con respecto a la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una concentración de FRa cuya diferencia con la concentración observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto
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de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, tales como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparados histológicos y similares.
En diversas realizaciones de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer con expresión del FRa. En una realización particular, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer endometrial. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de las trompas de Falopio. En otra realización, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de pulmón no microcítico, como un adenocarcinoma.
En diversos aspectos, la concentración de FRa se determina mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa y a continuación, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. Cuando se utilizan dos anticuerpos, uno de los anticuerpos es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
(b) el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos;
(c) un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende las CDR de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3.
En determinadas realizaciones, la concentración de FRa se determina mediante análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorometría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (EQL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ELISA.
Otros aspectos de la materia expuesta se dan a conocer en mayor detalle en la descripción detallada, los ejemplos aportados y las figuras correspondientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Todas las figuras que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones se aportan solamente como referencia y no forman parte de la invención.
En la Figura 1 se representan las características de migración del FRa mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El FRa se evaluó en su forma nativa (carril 2) o reducida y alquilada (carril 3).
En la Figura 2 se ilustran los residuos aminoacídicos del FRa (SEC. N.° ID: 1) que comprenden los epítopos (regiones sombreadas) para los anticuerpos monoclonales 9F3, 24F12 y 26B3, según se predijo mediante espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio y métodos de acoplamiento simulado.
En la Figura 3 se muestran cuatro transferencias de Western correspondientes a células CHO que expresan FRa u homólogos del FR, FRp, FRr o FRA: (A) células recombinantes purificadas y (B) lisados de células enteras. La separación se realizó en geles de SDS-PAGE. Las proteínas se prepararon en tampón de carga con o sin agentes reductores. Panel A: carril 1, marcadores de peso molecular; carriles 2-5, 0,5 pg de FRa, FRp, FRr y FRA reducidos, respectivamente; carril 6, blanco; carriles 7-10, 0,5 pg de FRa, FRp, FRr y FRA no reducidos, respectivamente. La banda positiva representa la única especie reactiva en cada carril y corresponde a un peso molecular de ~38kDa. Panel B: carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, CHO-FRa; carril 3, CHO-FRP; carril 4, CHO-FRA. Los lisados de células enteras se prepararon en tampón de carga sin agentes reductores y se separaron en gel de SDS-PAGE. Cada panel se rastreó con el AcM anti-FRa marcado correspondiente como sonda situado en la derecha. Los pesos moleculares de los FR son: FRa ~38kDa; FRp ~30kDa; FRr ~28kDa; FRA ~26kDa. Los anticuerpos LK26 y BN3.2 que reconocen al FRa en condiciones desnaturalizadas y no reducidas o reducidas, respectivamente, se utilizaron como controles positivos.
En la Figura 4 se observa una muestra de tejido de cáncer de ovario seroso papilar fijada en formol e incluida en parafina, la cual se rastreó para detectar la presencia de FRa con el anticuerpo monoclonal 26B3 como sonda.
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En la Figura 5 se muestra la expresión del FRa en tejidos normales. Las muestras de pulmón (A) y riñón (B) normales teñidas con el anticuerpo 26B3 demuestran que la expresión del FRa está altamente restringida a las células epiteliales y presenta una distribución predominantemente apical (las imágenes están aumentadas 20 veces).
En la Figura 6 se aporta una representación gráfica en la que se comparan las puntuaciones M correspondientes a adenocarcinoma de pulmón obtenidas con el anticuerpo 26B3 o anticuerpo BN3.2.
En la Figura 7 se muestra la tinción del FRa en subtipos histológicos de carcinoma de pulmón no microcítico: (A) adenocarcinoma de pulmón a 20x, (B) adenocarcinoma de pulmón a 40x, (C) carcinoma de pulmón adenoescamoso a 20x y (D) carcinoma de pulmón de células escamosas a 40x.
En la Figura 8 se aporta una representación gráfica en la que se comparan las puntuaciones M correspondientes a muestras (partes centrales) duplicadas de adenocarcinoma de pulmón teñidas con el anticuerpo 26B3.
En la Figura 9 se ilustran las puntuaciones M para la distribución del FRa en adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón de células escamosas. Las puntuaciones M medias fueron 19,84 (±18,64) y 1,39 (±5,54), respectivamente
(p<0,0001).
La Figura 10 muestra la expresión del FRa en tres muestras de aspirados con aguja fina (FNA) de adenocarcinoma de pulmón, muestras (A), (B), y (C). La tinción con el anticuerpo 26B3 del material de bloques celulares procedente de FNA de ganglios linfáticos demostró que la tinción del FRa se produjo con éxito, y la expresión de este se limita a las células epiteliales con una distribución apical.
En la Figura 11 se ilustran las funciones de supervivencia (muerte o censura) para sujetos con adenocarcinoma de pulmón que se consideraron que presentaban positividad para el FRa y para los que la detección del FRa con el anticuerpo 26B3 mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejidos fue negativa.
En la Figura 12 se muestra una micromatriz de tejidos (TMA) representativa teñida con el anticuerpo 26B3 a un aumento de 20x o 40x para (A) carcinoma canalicular localizado, (B)-(D) carcinoma canalicular infiltrante.
En la Figura 13 se aporta una representación gráfica de la distribución de las puntuaciones M, determinadas mediante tinción con 26B3, correspondientes al subtipo molecular (her-2 (+) y her-2 (-)) de la muestra de cáncer de mama.
En la Figura 14 (A-D) se pueden observar muestras histológicas representativas de cánceres de mama her2 negativo en estadio IV teñidas con el anticuerpo 26B3 a un aumento de 20x o 40x.
En la Figura 15 se muestran imágenes representativas de muestras de cáncer de mama metastásico obtenidas mediante aspirado con aguja fina y teñidas con el anticuerpo 26B3.
En la Figura 16 se muestra la expresión del FRa en el carcinoma seroso de ovario. A) A un aumento de 10x, se puede apreciar una tinción de membrana intensa (3+) en la región derecha, y moderada (2+) en la región izquierda superior. B) Muestra la misma área de A) a un aumento de 20x, lo que confirma una tinción periférica, gruesa e intensa (3+) de la membrana (región derecha). La tinción moderada (2+) de la membrana (región izquierda superior) es más débil y fina que la tinción con una puntuación de 3+, y es periférica o está localizada en los bordes luminales. C) Muestra que la tinción débil (1 +) de la membrana se limita a los bordes luminales y requiere un aumento de 40x para poder ser visualizada. D) Las células epiteliales de ovario y las células estromales corticales subyacentes son completamente negativas (aumento de 20x).
En la Figura 17 se muestra que la expresión del FRa se limita a los bordes luminales en el endometrio normal, con una intensidad débil (1 +) y moderada (2+) a un aumento de 40x (A). Se puede observar una tinción intensa (+3) de la membrana en los bordes luminales en la hiperplasia atípica compleja a un aumento de 20x (B).
En la Figura 18 se observa una tinción intensa (+3) del FRa en la membrana en los bordes luminales para el adenocarcinoma de endometrio de grado 1 (A). Además, muchas células tumorales presentan una tinción citoplasmática con una intensidad de 2+ o 3+ (aumento de 20x). Se aprecia una tinción de intensidad 2+ y 3+ del FRa en la membrana en los bordes luminales para el adenocarcinoma de endometrio de grado 2; la tinción citoplasmática es débil (aumento de 20x, B). Aproximadamente el 50 % de las células tumorales de adenocarcinoma de endometrio de grado 3 presentan una tinción intensa (3+) periférica de la membrana con una tinción citoplasmática débil a un aumento de 40x (C).
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En la Figura 19 se muestra un adenocarcinoma con metaplasia escamosa en el que aproximadamente un 80 % de las células escamosas metaplásicas, a un aumento de 20x, presentan una tinción del FRa en la membrana con una intensidad de 2+ y 3+, y una tinción del FRa en el citoplasma con una intensidad de 1+ y 2+ (A). Las células tumorales de carcinoma de endometrio de células claras presentan un núcleo irregular, nucléolos prominentes y un citoplasma claro y abundante. La mayoría de estas células tumorales presentan una tinción del FRa en la membrana con una intensidad de 2+ o 3+ a un aumento de 40x (B).
En la Figura 20 se muestra que tanto las células ciliadas como las no ciliadas de trompas de Falopio normales presentan una tinción del FRa en la membrana con una intensidad de 3+ en los bordes luminales y laterales de las células (A). La tinción citoplasmática también es obvia (aumento de 20x). B) Salpingitis crónica con abundantes linfocitos y células plasmáticas en el estroma. Las células de la mucosa retienen una tinción del FRa en los bordes luminales con una intensidad de 3+ (aumento de 20x). C) Células tumorales de adenocarcinoma seroso tubárico de grado 2 que forman proyecciones papilares complejas y que presentan una tinción del FRa en la membrana con una intensidad de 3+ en los bordes luminales y laterales de las células; la tinción citoplasmática también es obvia (aumento de 20x).
En la Figura 21 se representan quistes serosos/tubáricos corticales de ovario. Las células de revestimiento presentan una tinción intensa (3+) de la membrana y el citoplasma (aumento de 20x).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES A MODO DE ILUSTRACIÓN
En la siguiente descripción se caracterizan anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno del mismo, que se unen específicamente al FRa. También se describen polinucleótidos relacionados que pueden codificar estos anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno, células que expresan los anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno, así como vectores y marcajes detectables de anticuerpos relacionados. Además, se describen métodos para utilizar los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos dados a conocer y fragmentos de unión al antígeno se pueden utilizar para diagnosticar cáncer de ovario, de mama, de tiroides, colorrectal, endometrial, de las trompas de Falopio o de pulmón; para comprobar si el cáncer de ovario, de mama, de tiroides, colorrectal, endometrial, de las trompas de Falopio o de pulmón evoluciona, remite o se mantiene estable; para determinar si un paciente debe recibir tratamiento contra el cáncer o no, o para determinar si un sujeto padece o no cáncer con expresión del FRa y por lo tanto, si es susceptible de tratamiento con un agente terapéutico anticancerígeno específico para el FRa.
Definiciones
A lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones se utilizan diversos términos relacionados con aspectos de la descripción. A tales términos se les da su significado habitual en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos de manera específica se han de interpretar de una manera coherente con las definiciones aportadas en la presente memoria.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas en singular «un», «una», «el» y «la» incluyen las formas en plural, a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a «una célula» incluye una combinación de dos o más células y similares.
Con el término «aproximadamente», tal y como se utiliza en el presente al hacer referencia a un valor mensurable como una cantidad, una duración de tiempo, y similares, se pretende abarcar variaciones de hasta ±10 % con respecto al valor especificado, ya que dichas variaciones son adecuadas para llevar a cabo los métodos dados a conocer. A menos que se indique lo contrario, se debe entender que, en todos los casos, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades como el peso molecular, condiciones de reacción, etc., en la memoria descriptiva y reivindicaciones están modificados por el término «aproximadamente». Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas constituyen aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se quieran obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y sin la intención de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se debería interpretar al menos teniendo en cuenta el número de cifras significativas aportadas y aplicando técnicas de redondeo convencionales.
A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que establecen el alcance amplio de la invención constituyen aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se facilitan de la manera lo más precisa posible. Sin embargo, todo valor numérico de manera inherente contiene un cierto error que inevitablemente resulta de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de ensayo.
«Aislado» significa que un componente biológico (como un ácido nucleico, péptido o proteína) ha sido sustancialmente separado, producido aparte, o purificado a partir de otros componentes biológicos del organismo en los que el componente
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se encuentra de manera natural, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, y proteínas. Por lo tanto, los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas que se han «aislado» comprenden ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación convencionales. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas «aislados» que pueden ser parte de una composición y también pueden ser aislados si dicha composición no forma parte del entorno natural del ácido nucleico, péptido o proteína. El término también abarca a ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula hospedadora, así como ácidos nucleicos sintetizados mediante procedimientos químicos.
«Polinucleótido», que de manera sinónima también se denomina «molécula de ácido nucleico» o «ácidos nucleicos», hace referencia a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar, así como ARN o ADN modificado. Los «polinucleótidos» incluyen, entre otros, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario o, más comúnmente, bicatenario o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, «polinucleótido» hace referencia a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. El término “polinucleótido” también incluye a ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas, así como ADN o ARN con cadenas principales modificadas por razones de estabilidad u otras razones. Las bases «modificadas» comprenden, por ejemplo, bases tritiladas y bases atípicas como inosina. Al ADN y ARN se le pueden realizar varias modificaciones. Por lo tanto, «polinucleótido» abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, como las comúnmente encontradas en la naturaleza, así como formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. «Polinucleótido» también abarca cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, a menudo denominadas oligonucleótidos.
El significado de «sustancialmente el mismo» puede diferir dependiendo del contexto en el que el término se utilice. Debido a la variación natural en la secuencia que probablemente existe entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican, cabe esperar cierto grado de variación en las secuencias aminoacídicas o en los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente, con un efecto mínimo o nulo en sus particulares propiedades de unión (p. ej., especificidad y afinidad). Tal expectativa se debe en parte a la redundancia del código genético, así como al éxito evolutivo de las variaciones conservativas en la secuencia aminoacídica, que no alteran de manera apreciable la naturaleza de la proteína codificada. Por lo tanto, en el contexto de secuencias de ácido nucleico, «sustancialmente el mismo» significa una identidad de al menos el 65 % entre dos o más secuencias. Preferiblemente, el término hace referencia a una identidad de al menos un 70 % entre dos o más secuencias, más preferiblemente una identidad de al menos un 75 %, más preferiblemente una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente una identidad de al menos un 85%, más preferiblemente una identidad de al menos un 90%, más preferiblemente una identidad de al menos un 91%, más preferiblemente una identidad de al menos un 92 %, más preferiblemente una identidad de al menos un 93%, más preferiblemente una identidad de al menos un 94%, más preferiblemente una identidad de al menos un 95%, más preferiblemente una identidad de al menos un 96%, más preferiblemente una identidad de al menos un 97%, más preferiblemente una identidad de al menos un 98%, y más preferiblemente una identidad de al menos un 99% o superior. Tal identidad se puede determinar mediante el algoritmo nBLAST (Altschul et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin and Altschul (1993) Pioc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).
El grado de variación que puede haber en la secuencia aminoacídica de una proteína sin que ello tenga un efecto considerable en la función de la proteína es mucho menor que el que puede haber en la secuencia de ácido nucleico, ya que los principios de redundancia que se aplican a las secuencias aminoacídicas son otros. Por lo tanto, en el contexto de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, «sustancialmente el mismo» significa anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tienen una identidad de un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos. Otras realizaciones incluyen anticuerpos específicos frente al FRa, o fragmentos de unión al antígeno, que poseen regiones de entramado, de armazón o de otro tipo que no se unen al receptor ni comparten una identidad considerable con los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente, pero que incorporan una o más CDR u otras secuencias necesarias para que se produzca la unión, y que son idénticas en un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a dichas secuencias descritas en el presente.
Un «vector» es un replicón, como un plásmido, fago, cósmido o virus en el que se puede insertar operativamente otro segmento de ácido nucleico para que se produzca la replicación o expresión del segmento.
Una célula se ha «transformado» cuando ácidos nucleicos exógenos o heterólogos como ADN se han introducido en el interior de la célula. El ADN transformante puede estar integrado (unido covalentemente) o no en el genoma de la célula. En las células procariotas, de levadura y de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener en un elemento episomal, como un plásmido. En relación con las células eucarióticas, una célula transformada de manera estable, o «célula estable», se demuestra mediante la capacidad de la célula eucariótica de establecer estirpes celulares
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o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un «clon» es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común mediante mitosis. Una «estirpe celular» es un clon de una célula primaria que puede crecer in vitro de manera estable durante muchas generaciones. En algunos ejemplos aportados en el presente, las células se transforman mediante su transfección con ADN.
Los términos «expresar» y «producir» se utilizan en el presente como si fueran sinónimos, y hacen referencia a la biosíntesis de un producto génico. Estos términos abarcan la transcripción de un gen a ARN. Estos términos también abarcan la traducción de ARN a uno o más polipéptidos, y también abarcan todas las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales que ocurren de manera natural. La expresión o producción de un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, puede tener lugar dentro del citoplasma celular, o en el medio extracelular, como el medio de crecimiento de un cultivo celular.
Los términos «tratar» o «tratamiento» hacen referencia a todo éxito o indicios de éxito en la mitigación o mejora de una lesión, patología o trastorno, incluido todo parámetro objetivo o subjetivo, como la reducción, remisión o disminución de los síntomas, o el hecho de que el trastorno se haga más tolerable para el paciente, el deterioro o declive tengan lugar más lentamente, el punto final del deterioro sea menos debilitante, el bienestar físico o mental del sujeto mejoren, o el tiempo de supervivencia se prolongue. El tratamiento se puede evaluar mediante parámetros objetivos o subjetivos, incluidos los resultados de una exploración física, un examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.
«Anticuerpo» hace referencia, a menos que se indique lo contrario, a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY), incluidas diversas formas monoméricas y poliméricas de cada isotipo.
Los fragmentos de unión al antígeno son toda estructura proteinácea que pueda mostrar afinidad de unión a un antígeno determinado. Algunos fragmentos de unión al antígeno están formados por partes de anticuerpos intactos que conservan la especificidad de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo original. Por ejemplo, los fragmentos de unión al antígeno pueden comprender al menos una región variable (una región variable de cadena ligera o de cadena pesada) o una o más CDR de un anticuerpo del cual se sabe que se une a un antígeno determinado. Entre los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno adecuados se incluyen, entre otros, dianticuerpos y moléculas monocatenarias, así como moléculas de Fab, F(ab')2, Fc, Fabc y Fv, anticuerpos monocatenarios, cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos o CDR y otras proteínas, armazones proteicos, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y una cadena ligera, y similares. Todos los isotipos de anticuerpos se pueden utilizar para producir fragmentos de unión al antígeno. Además, los fragmentos de unión al antígeno pueden incluir entramados proteináceos que no son anticuerpos y que pueden incorporar eficazmente segmentos polipeptídicos en una orientación que confiera afinidad a un determinado antígeno de interés, como armazones proteicos. Los fragmentos de unión al antígeno se pueden producir recombinantemente o mediante ruptura química o enzimática de anticuerpos intactos. La frase «un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo» se puede utilizar para indicar que un determinado fragmento de unión al antígeno incorpora uno o más segmentos de aminoácidos del anticuerpo al que se hace referencia en la frase.
«Unión específica», cuando se utiliza en el contexto de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, representa la unión mediante dominios codificados por genes de inmunoglobulinas o fragmentos de genes de inmunoglobulinas a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que ni reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas antigénicas. Normalmente, un anticuerpo se une a un antígeno análogo con una Kd inferior a, aproximadamente, 1x10-8 M, determinada mediante resonancia de plasmones superficiales o un ensayo de unión celular.
El término «sujeto» hace referencia a animales humanos y no humanos, incluidos todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, gallinas, anfibios y reptiles. En muchas realizaciones de los métodos descritos, el sujeto es un humano.
Como se utiliza en el presente, el término «receptor a del folato» (también denominado FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) hace referencia a la isoforma a del receptor del folato de alta afinidad. El FRa unido a la membrana está fijado en la superficie celular por medio de anclajes a glicosilfosfatidilinositol (GPI). Las formas solubles del FRa se pueden derivar de la acción de proteasas o fosfolipasas en los receptores del folato anclados en la membrana. La secuencia aminoacídica para el FRa humano se establece en el presente como la SEC. N.° ID: 1. Variantes, por ejemplo, variantes alélicas que se encuentran en la naturaleza o secuencias que contienen al menos una sustitución de un aminoácido, se abarcan mediante los términos como se utilizan en el presente. Como apreciarán los expertos en la materia, las formas del FRa humano asociadas a células y no asociadas a células pueden abarcar formas variantes de la SEC. N.° ID: 1.
El término «muestra» como se utiliza en el presente hace referencia a un grupo de fluidos, células o tejidos similares (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluido el aspirado con aguja fina) aislados a partir de un sujeto,
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así como a partir de fluidos, células o tejidos presentes en un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra es un fluido biológico. Los fluidos biológicos son normalmente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos naturales que se encuentran en, aspiran de, expresan en o extraen de un sujeto o fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos se derivan de determinados tejidos, órganos o regiones localizadas, y ciertos otros fluidos biológicos pueden estar situados de manera más global o sistémica en un sujeto o fuente biológica. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen la sangre, el suero y líquidos serosos, el plasma, la linfa, la orina, la saliva, el líquido quístico, las lágrimas, las heces, los esputos, las secreciones mucosas de los tejidos y órganos secretores, las secreciones vaginales, los líquidos ascíticos como los asociados a tumores no sólidos, los líquidos pleurales, pericardiales, peritoneales, abdominales y de otras cavidades corporales, los líquidos obtenidos mediante lavado bronquial y similares.
Los fluidos biológicos también pueden incluir soluciones líquidas puestas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos, incluido medio acondicionado de células u órganos, líquidos de lavado y similares. El término «muestra», tal y como se utiliza en el presente, abarca materiales extraídos a partir de un sujeto o materiales presentes en un sujeto.
El término «evolución», como se utiliza en el contexto de un cáncer con expresión del FRa que evoluciona, incluye el cambio en un cáncer de un estado menos grave a un estado más grave. Ello podría incluir un aumento en el número de tumores o la gravedad de estos, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer avanza o se propaga, y similares. Por ejemplo, «la evolución del cáncer de ovario» incluye la evolución de tal cáncer de un estado menos grave a un estado más grave, tal como la evolución de un estadio I a un estadio II, de un estadio II a un estadio III, etc.
El término «regresión», como se utiliza en el contexto de un cáncer con expresión del FRa que remite o experimenta una regresión, incluye el cambio en un cáncer de un estado más grave a un estado menos grave. Ello podría incluir una disminución en el número de tumores o la gravedad de estos, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer avanza o se propaga, y similares. Por ejemplo, «la regresión del cáncer de ovario» incluye la regresión de tal cáncer de un estado más grave a un estado menos grave, tal como la evolución de un estadio III a un estadio II, de un estadio II a un estadio I, etc.
Con el término «estable», como se utiliza en el contexto un cáncer con expresión del FRa que se mantiene estable, se pretende describir una alteración de la enfermedad que no está cambiando, o no ha cambiado, de manera lo suficientemente significativa a lo largo de un periodo de tiempo pertinente desde un punto de vista clínico como para que se pueda considerar que el cáncer está evolucionando o experimentando una regresión.
Las realizaciones descritas en el presente no se limitan a métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos determinados, los cuales pueden, por supuesto, variar.
Anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno específicos frente al FRa
En el presente se describen anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno aislados que se unen al FRa de manera específica. La estructura general de una molécula de anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno, el cual incluye cadenas ligeras y pesadas, y el dominio Fc, que tiene varias funciones, como la fijación del complemento y la unión a receptores de anticuerpos.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos incluyen todos los isotipos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, así como multímeros sintéticos de la estructura de inmunoglobulina con cuatro cadenas.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos también incluyen el isotipo IgY, por lo general encontrado en el suero de gallina o pavo, así como en la yema de huevo de gallina o pavo.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el apartado de ejemplos se han obtenido a partir de ratones. Anticuerpos similares se pueden obtener a partir de cualquier especie por medios recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden ser quiméricos de rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, pollo, conejo, camélido, burro, humano y similares. Para su uso en administración a humanos, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno no obtenidos a partir de humanos pueden ser alterados genética o estructuralmente para que sean menos antigénicos tras la administración a un paciente humano.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno son quiméricos. Como se utiliza en el presente, el término «quimérico» hace referencia a un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que al menos alguna parte de al menos un dominio variable procede de la secuencia aminoacídica del anticuerpo de un mamífero no humano, un roedor o un reptil, mientras que las partes restantes del anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, se obtienen a partir de un humano. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender un dominio de unión al antígeno de ratón con un Fc de humano u otros dominios estructurales de este tipo.
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En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima procedente de una 5 inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan con residuos de una CDR (anticuerpo donador) de una especie no humana, como el ratón, la rata o el conejo, que posee la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y comúnmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las zonas de 10 CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones de entramado son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede incluir al menos una parte de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina, comúnmente la de una inmunoglobulina humana.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente pueden existir en varias formas, pero incluirán 15 uno o más de los segmentos del dominio variable del anticuerpo o CDR que se muestran en el Cuadro 1. Los isotipos de los anticuerpos descritos en el Cuadro 1 se muestran entre paréntesis para describir la región constante de cada anticuerpo, de los que se sabe que poseen secuencias conservadas.
Cuadro 1. Segmentos de anticuerpo de los anticuerpos descritos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos («Cl» 20 significa cadena ligera y «Cp» significa cadena pesada).
Segmento de anticuerpo
SEC. N.° ID Secuencia
Anticuerpo monoclonal 9F3 (región constante de IgG2a murina)
CDR1 de Cl
2 RASSTVSYSYLH
CDR2 de Cl
3 GTSNLAS
CDR3 de Cl
4 QQYSGYPLT
Segmento de dominio variable de Cl
5 PAIMSASPGEKVTMTCRASSTVSYSYLHWYQQ KSGASPQLWIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSY SLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKL ELKRADAAP
CDR1 de Cp
6 SGYYWN
CDR2 de Cp
7 YIKSDGSNNYNPSLKN
CDR3 de Cp
8 EWKAMDY
Segmento de dominio variable de Cp
9 ESGPGLVRPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIR QFPGSRLEWMGYIKSDGSNNYNPSLKNRISITR DTSKNQFFKLNSVTTEDTATYFCTREWKAMD YWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDT
Anticuerpo monoclonal 19D4 (región constante de IgG2a murina)
CDR1 de Cl
10 RASESVDTYGNNFIH
CDR2 de Cl
11 LASNLES
CDR3 de Cl
12 QQNNGDPWT
Segmento de dominio variable de Cl
13 PASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNNFIHWY QQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTD FTLTIDPVEADDAATYYCQQNNGDPWTFGGGT KLEIKRADAAP
CDR1 de Cp
14 HPYMH
CDR2 de Cp
15 RIDPANGNTKYDPKFQG
CDR3 de Cp
16 EEVADYTMDY
Segmento de dominio variable de Cp
17 GAELVKPGASVKLSCTASGFNIKHPYMHWVKQ RPDQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITA DTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGREEVADYT MDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPV
Anticuerpo monoclonal 24F12 (región constante de IgG1 murina)
CDR1 de Cl
18 SASQGINNFLN
CDR2 de Cl
19 YTSSLHS
CDR3 de Cl
20 QHFSKLPWT
Dominio variable de Cl
21 TSSLSASLGDRVTISCSASQGINNFLNWYQQKP DGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLT ISNLEPEDIAIYYCQHFSKLPWTFGGGTKLEIKR
ADAAP
CDR1 de Cp
22 SYAMS
CDR2 de Cp
23 EIGSGGSYTYYPDTVTG
CDR3 de Cp
24 ETTAGYFDY
Dominio variable de Cp
25 SGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVR QSPEKRLEWVAEIGSGGSYTYYPDTVTGRFTISR DNAKSTLYLEMSSLRSEDTAIYYCARETTAGYF DYWGQGTTLTVSS
Anticuerpo monoclonal 26B3 (región constante de IgG1 murina)
CDR1 de Cl
26 RTSENIFSYLA
CDR2 de Cl
27 NAKTLAE
CDR3 de Cl
28 QHHYAFPWT
Segmento de dominio variable de Cl
29 PASLSASVGETVTITCRTSENIFSYLAWYQQKQ GISPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLK INSLQPEDFGSYYCQHHYAFPWTFGGGSKLEIK RADAAP
CDR1 de Cp
30 GYFMN
CDR2 de Cp
31 RIFPYNGDTFYNQKFKG
CDR3 de Cp
32 GTHYFDY
Segmento de dominio variable de Cp
33 GPELVKPGASVKISCKASDYSFTGYFMNWVMQ SHGKSLEWIGRIFPYNGDTFYNQKFKGRATLTV DKSSSTAHMELRSLASEDSAVYFCARGTHYFD YWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT
Anticuerpo monoclonal 9F3 (región constante de IgG2a murina)
CDR1 de Cl
34 AGGGCCAGCT CAACT GTAAGTT ACAGTT ACTT GCAC
CDR2 de Cl
35 GGCACATCCAACTTGGCTTCT
CDR3 de Cl
36 CAGCAGT ACAGT GGTTACCCACT CACG
Segmento de dominio variable de Cl
37 CCAGCAAT CAT GT CT GCAT CT CCAGGGGAAA AGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAC TGTAAGTTACAGTTACTTGCACTGGTACCAGC AGAAGTCAGGTGCCTCCCCCCAACTCTGGATT TATGGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCC T GCTCGCTT CAGT GGCAGT GGGT CT GGGACCT CTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCT GAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTA CAGTGGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGA CCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGC ACCAAC
CDR1 de Cp
38 AGTGGTTATTACTGGAAC
CDR2 de Cp
39 TACAT AAAGT CCGACGGTAG CAAT AATTACA ACCCAT CT CT CAAAAAT
CDR3 de Cp
40 GAGT GGAAGGCT AT GGACTAC
Segmento de dominio variable de Cp
41 GAGT CAGGACCT GGCCT CGT GAGACCTT CT CA GTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCT ACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGG ATCCGGCAGTTTCCAGGAAGCAGACTGGAAT GGATGGGCTACATAAAGTCCGACGGTAGCAA TAATTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCT CCAT CACTCGT GACACAT CT AAGAACCAGTTT TTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGA CACAGCTACATATTTCTGTACAAGGGAGTGG AAGGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACCT CAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACACC CCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGGTGTG GAGATACAAC
Anticuerpo monoclonal 19D4 (región constante de IgG2a murina)
CDR1 de Cl
42 AGAGCCAGT GAAAGT GTT GATACTTAT GGCA AT AATTTT ATACAC
CDR2 de Cl
43 CTT GCATCCAACCT AGAAT CT
CDR3 de Cl
44 CAGCAAAATAAT GGGGAT CCGT GGACG
Segmento de dominio variable de Cl
45 CCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAG GGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGT GTTGATACTTATGGCAATAATTTTATACACTG GTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAA CTCCTCATTTATCTTGCATCCAACCTAGAATC T GGGGTCCCT GCCAGGTT CAGT GGCAGT GGG TCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCC TGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACT GTCAGCAAAATAATGGGGATCCGTGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGG GCT GAT GCT GCACCAA
CDR1 de Cp
46 CACCCCTATATGCAC
CDR2 de Cp
47 AGGATT GATCCT GCGAAT GGT AAT ACT AAAT AT GACCCGAAGTT CCAGGGC
CDR3 de Cp
48 GAGGAGGTGGCGGACTATACTATGGACTAC
Segmento de dominio variable de Cp
49 GGGGCAGAGCTT GT GAAGCCAGGGGCCT CAG TCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAAC ATTAAACACCCCTATATGCACTGGGTGAAGC AGAGGCCTGACCAGGGCCTGGAGTGGATTGG AAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAA TATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTA TAACAGCAGACACATCCT CCAACACAGCCT A CCTACAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGAC ACTGCCGTCTATTACTGTGGTAGAGAGGAGG TGGCGGACTATACTATGGACTACTGGGGTCA AGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA ACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCC TGTGTG
Anticuerpo monoclonal 24F12 (región constante de IgG1 murina)
CDR1 de Cl
50 AGTGCAAGTCAGGGCATTAACAATTTTTTAAA C
CDR2 de Cl
51 T ACACAT CAAGTTT ACACT CA
CDR3 de Cl
52 CAGCACTTTAGTAAGCTTCCGTGGACG
Segmento de dominio variable de Cl
53 ACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAG AGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGC ATTAACAATTTTTTAAACTGGTATCAGCAGAA ACCAGATGGCACTGTTAAACTCCTGATCTATT ACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTT CAGT GGCAGT GGGT CT GGGACAGATT ATTCTCTCACCATCAGCAACCTGGAACCTGAA GATATTGCCATATACTATTGTCAGCACTTTAG TAAGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACC AAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCAC CAAC
CDR1 de Cp
54 AGCTATGCCATGTCT
CDR2 de Cp
55 GAAATT GGTAGTGGTGGT AGTTACACCT ACT A T CCAGACACT GT GACGGGC
CDR3 de Cp
56 GAAACTACGGCGGGCT ACTTT GACT AC
Segmento de dominio variable de Cp
57 T CT GGGGGAGGCTTAGT GAGGCCT GGAGGGT CCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCG CCAGTCTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTC GCAGAAATT GGTAGT GGT GGTAGTTACACCT ACT ATCCAGACACT GT GACGGGCCGATT CAC CATCTCCAGAGACAATGCCAAGAGCACCCTG TACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGG ACACGGCCATCTATTACTGTGCAAGGGAAAC TACGGCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAA
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I | GGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
Anticuerpo monoclonal 26B3 (región constante de IgG1 murina)
CDR1 de Cl
58 CGAACAAGT GAGAAT ATfTTCAGTT ATTTAGC A
CDR2 de Cl
59 AAT GCAAAAACCTTAGCAGAG
CDR3 de Cl
60 CAACAT CATTAT GCTTTTCCGT GGACG
Segmento de dominio variable de Cl
61 CCAGCCT CCCTAT CT GCAT CT GT GGGAGAAAC TGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAAT ATTTTCAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAA ACAGGGAATATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATA ATGCAAAAACCTTAGCAGAGGGTGTGCCATC AAGGTICAGT GGCAGT GGAT CAGGCACACAG TTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGA AGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATT ATGCTTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCTCC AAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCAC CAAC
CDR1 de Cp
62 GGCTACTTTATGAAC
CDR2 de Cp
63 CGTATTTTTCCTTACAATGGTGATACTTTCTAC AACCAGAAGTTCAAGGGC
CDR3 de Cp
64 GGGACT CATT ACTTT GACT AC
Segmento de dominio variable de Cp
65 GGACCT GAGCT GGT GAAGCCT GGGGCTT CAG TGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGATTACTCT TTTACTGGCTACTTTATGAACTGGGTGATGCA GAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGA CGTATTTTTCCTTACAATGGTGATACTTTCTAC AACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACA1TGA CTGTAGACAAATCCTCTAGCACAGCCCACAT GGAGCI'CCGGAGCCT GGCAT CT GAGGACT CT GCAGTCTATTTTTGTGCAAGAGGGACTCATTA CTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CTGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCT GTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCA AACTAA
En el presente se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno aislados que se unen específicamente al FRa. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno son IgG murinas o derivados de estas. Aunque los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno ilustrados en el presente son murinos. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una secuencia aminoacídica de la CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tenga una secuencia aminoacídica de la CDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26; una secuencia aminoacídica de la CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27; y una secuencia aminoacídica de la CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una cadena pesada que tenga una secuencia aminoacídica de la CDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30; una secuencia aminoacídica de la CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31; y una secuencia aminoacídica de la CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden incluir una cadena ligera que tenga una secuencia aminoacídica de la cDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26; una secuencia aminoacídica de la CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27; y una secuencia aminoacídica de la CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28; y también tienen una cadena pesada que tiene una secuencia
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aminoacídica de la CDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.0 ID: 30; una secuencia aminoacídica de la CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31; y una secuencia aminoacídica de la CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de cadena ligera que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29. En algunas realizaciones, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 61 puede codificar esta secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena ligera. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir un dominio variable de cadena pesada que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33. En algunas realizaciones, un polinucleótido aislado que incluye una secuencia sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 65 puede codificar esta secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena pesada. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos pueden incluir dominios variables de cadena ligera y pesada, donde el dominio variable de cadena ligera incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33.
En algunas realizaciones, los anticuerpos han sido producidos por células productoras de anticuerpos depositadas en la Colección de Cultivos Americana (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 19 de mayo de 2011 y a las que se les ha asignado el número de acceso PTA-11885. En algunas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, tienen la misma afinidad de unión al FRa que los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, comprenden las CDR de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, comprenden las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos depositadas.
También se dan a conocer polinucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente al FRa. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una secuencia de la CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 58. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 59. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 63. En algunas realizaciones, los polinucleótidos aislados codifican un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tiene una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una cadena ligera con una CDR1 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 58; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 59; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 63; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que tenga una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 26, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 58; una CDR2 codificada por una secuencia nucleotídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 27, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 59; y una CDR3 codificada por una secuencia nucleotídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 28, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 60; y una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 30, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 62; una CDR2 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 31, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 63; y una CDR3 sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 32, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 64. Las disposiciones de CDR que se unen al antígeno también pueden construirse mediante técnicas de ingeniería genética utilizando como armazón para ellas proteínas similares a los anticuerpos. Tales proteínas que se unen al antígeno construidas mediante técnicas de ingeniería genética se encuentran dentro del alcance de la divulgación.
Los polinucleótidos descritos en el presente pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tengan un segmento del dominio variable de cadena ligera que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 61. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos
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pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tengan un segmento del dominio variable de cadena pesada que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 65. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos pueden codificar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que tengan un segmento del dominio variable de cadena ligera que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 29, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 61; y un segmento del dominio variable de cadena pesada que incluya una secuencia aminoacídica sustancialmente igual, o idéntica, a la SEC. N.° ID: 33, por ejemplo, la SEC. N.° ID: 65. Los polinucleótidos que pueden codificar los segmentos del dominio variable dados a conocer en el presente se pueden incluir en los mismos, o distintos, vectores para producir anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno.
Los polinucleótidos que codifican proteínas que se unen al antígeno construidas mediante técnicas de ingeniería genética también se encuentran dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos (y los péptidos que codifican) incluyen una secuencia guía. Se puede utilizar toda secuencia guía conocida en la técnica. La secuencia guía puede incluir, entre otros, un sitio de restricción o un sitio de inicio de la traducción.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente incluyen variantes con sustituciones, deleciones o adiciones de uno o varios aminoácidos que retienen las propiedades biológicas (es decir, afinidad de unión o actividad efectora inmunitaria) de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos. Los expertos en la técnica pueden producir variantes con sustituciones, deleciones o adiciones de uno o varios aminoácidos. Estas variantes pueden incluir: a) variantes en las que uno o más residuos aminoacídicos están sustituidos con aminoácidos conservados o no conservados; b) variantes en las que uno o más aminoácidos se añaden al polipéptido o se suprimen de este; c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente; y d) variantes en las que el polipéptido está fusionado con otro péptido o polipéptido, tal como un compañero de fusión, una etiqueta proteica u otro resto químico que pueda conferir propiedades útiles al polipéptido, tales como, por ejemplo, un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un resto de biotina y similares. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente pueden incluir variantes en las que los residuos aminoacídicos de una especie sustituyen a los residuos correspondientes a otras especies, tanto en las posiciones conservadas como en las no conservadas. En otras realizaciones, los residuos aminoacídicos en las posiciones no conservadas están sustituidos con residuos conservados o no conservados. Los expertos en la técnica conocen las técnicas para obtener estas variantes, incluidas técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente pueden incorporar varios isotipos de anticuerpos, como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. La especificidad del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo está en gran medida determinada por la secuencia aminoacídica y la disposición de las CDR. Por lo tanto, las CDR de un isotipo se pueden transferir a otro isotipo sin alterar la especificidad frente al antígeno. Por otra parte, se han desarrollado técnicas para hacer que los hibridomas cambien de producir un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad frente al antígeno. Por lo tanto, tales isotipos de anticuerpos se encuentran dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente poseen una afinidad de unión (en M) al FRa que incluye una constante de disociación (Kd) inferior a aproximadamente 1 *l0-8 M. En una realización el anticuerpo 9F3 tiene una afinidad al FRa de 7,15x10-10 M. En una realización el anticuerpo 19D4 tiene una afinidad al FRa de 5,67x10-10 M. En una realización el anticuerpo 24F12 tiene una afinidad al FRa de 1,02x10-10 M. En una realización el anticuerpo 26B3 tiene una afinidad al FRa de 2,73xl0-11 M. En una realización el anticuerpo 9F3 tiene una afinidad al FRa de aproximadamente 6,5*10-10 M a aproximadamente 8*10-10 M. En una realización el anticuerpo 19D4 tiene una afinidad al FRa de aproximadamente 5x10-10 M a aproximadamente 6,5x10-10 M. En una realización el anticuerpo 24F12 tiene una afinidad al FRa de aproximadamente 0,5x10-10 M a aproximadamente 2xl0-10 M. En una realización el anticuerpo 26B3 tiene una afinidad al FRa de aproximadamente M0-11 M a aproximadamente 3,5xl0-11 M.
También se dan a conocer vectores que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente.
Los vectores pueden ser vectores de expresión. Por lo tanto, los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés se contemplan como si estuvieran dentro del alcance de esta divulgación. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales, tales como, entre otras, secuencias reguladoras (p. ej., promotor, potenciador), un marcador de selección y una señal de poliadenilación. Los vectores para transformar una amplia variedad de células hospedadoras son bien conocidos e incluyen, entre otros, plásmidos, fagómidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), así como otros vectores bacterianos, víricos y de levadura.
Los vectores de expresión recombinantes dentro del alcance de la descripción incluyen fragmentos de ácidos nucleicos sintéticos, genómicos o procedentes de ADNc que codifican al menos una proteína recombinante que puede estar operativamente enlazada a elementos reguladores adecuados. Tales elementos reguladores pueden incluir un promotor
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de la transcripción, secuencias que codifican sitios adecuados de unión del ribosoma en el ARNm y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión, especialmente los vectores de expresión para mamíferos, también pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados enlazados al gen a expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3', secuencias no traducidas en 5' o 3' (tales como sitios necesarios de unión del ribosoma), un sitio de poliadenilación, sitios aceptor y donador de ayuste, o secuencias de terminación de la transcripción. También se puede incorporar un origen de replicación que confiera a un hospedador la capacidad de replicarse.
Las secuencias de control transcripcional y traduccional en los vectores de expresión a utilizar cuando se transforman células de vertebrados pueden ser de origen vírico. Se pueden construir vectores modelo como describen Okayama y Berg en 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).
En algunas realizaciones, la secuencia que codifica el anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, está colocada bajo el control de un promotor constitutivo muy fuerte, tales como los promotores de los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, P-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y otros. Además, muchos promotores víricos funcionan constitutivamente en células eucarióticas y son adecuados para su uso con las realizaciones descritas. Tales promotores víricos incluyen, entre otros, el promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), los promotores tempranos y tardíos del SV40, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del sarcoma de Rous (RSV) y otros retrovirus, así como el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple. En una realización, la secuencia que codifica el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo está colocada bajo el control de un promotor inducible, tal como el promotor de la metalotioneína, el promotor inducido por la tetraciclina, el promotor inducido por la doxiciclina, promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferones (ISRE), tales como la proteína cinasa R, las 2',5'-oligoadenilato sintetasas, los genes Mx, ADAR1 y similares.
Los vectores descritos en el presente pueden contener uno o más sitios internos de entrada del ribosoma (IRES). La inclusión de una secuencia IRES en vectores de fusión puede resultar beneficioso para aumentar la expresión de algunas proteínas. En algunas realizaciones, el sistema de vector incluirá uno o más sitios de poliadenilación (p. ej., SV40), que pueden estar situados, o bien secuencia arriba, o bien secuencia abajo, de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas más arriba. Los componentes del vector pueden estar enlazados en contigüidad, o dispuestos de manera que se logre un espaciado óptimo para que se expresen los productos génicos (es decir, mediante la introducción de nucleótidos «espaciadores» entre los ORF), o posicionados de cualquier otra manera. Los elementos reguladores, tales como el motivo IRES, también pueden estar dispuestos de manera que se logre un espaciado óptimo para la expresión.
Los vectores pueden comprender marcadores de selección, los cuales son bien conocidos en la técnica. Los marcadores de selección incluyen marcadores de selección positivos y negativos, por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos (p. ej., gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la higromicina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la tetraciclina, gen de resistencia a la penicilina), genes de la glutamato sintasa, HSV-TK, derivados de la HSV-TK para la selección con ganciclovir, o gen bacteriano de la fosforilasa de nucleósidos de purina para la selección con 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o el sitio de clonación puede estar, o bien secuencia arriba, o bien secuencia abajo, de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés o sitio de clonación.
Los vectores descritos en el presente se pueden utilizar para transformar varias células con los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos. Por ejemplo, los vectores se pueden utilizar para generar un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que produzca células. Por lo tanto, otro aspecto hace referencia a células hospedadoras transformadas con vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente al FRa, tales como los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente y ejemplificados.
En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en células, y se pueden utilizar para construir las células recombinantes con el objetivo de llevar a cabo los métodos descritos, de acuerdo con las diversas realizaciones descritas en el presente y ejemplificadas. La técnica utilizada debe facilitar la transferencia estable de la secuencia del gen heterólogo a la célula hospedadora, de manera que la secuencia del gen heterólogo se pueda heredar y se pueda expresar en la progenie de la célula, y para que ni el desarrollo necesario ni las funciones fisiológicas de las células receptoras se vean afectados. Entre las técnicas que se pueden utilizar se incluyen, entre otras, la transferencia de cromosomas (p. ej., la fusión celular, la transferencia de genes mediada por cromosomas, la transferencia de genes mediada por microcélulas), los métodos físicos (p. ej., transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, transporte en liposomas), la transferencia de vectores víricos (p. ej., virus con ADN recombinante, virus con ARN recombinante) y similares (descritos en Cline, 29 Pharmac.
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Ther. 69-92 (1985)). La precipitación de fosfato de calcio y la fusión inducida por polietilenglicol (PEG) de protoplastos bacterianos con células de mamífero también se pueden utilizar para transformar células.
Las células adecuadas para su uso en la expresión de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente son preferentemente células eucarióticas, más preferentemente células vegetales, de roedores o de humanos, como por ejemplo, entre otras, células NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-tsl3, BHK, HEK293, COS-7, T98G, CV-l/EBNA, L, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 de mieloma y estirpes celulares BHK, entre otras. Además, la expresión de los anticuerpos se puede lograr con células de hibridoma. Los métodos para producir hibridomas están bien desarrollados en la técnica.
Las células transformadas con los vectores de expresión descritos en el presente se pueden seleccionar o cribar según la expresión recombinante de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente. Las células en las que se produjo la recombinación se expanden y se criban para seleccionar los subclones que muestran el fenotipo deseado, como un elevado nivel de expresión, propiedades de crecimiento potenciado, o la capacidad de producir proteínas con las características bioquímicas deseadas, por ejemplo, debido a modificaciones de la proteína o a la alteración de las modificaciones postraduccionales. Estos fenotipos podrían ser debidos a propiedades inherentes de un determinado subclon o a una mutación. Las mutaciones se pueden efectuar mediante el uso de compuestos químicos, luz ultravioleta, radiación, virus, mutágenos por inserción, inhibición de la reparación de discordancias en el ADN o una combinación de tales métodos.
En el presente se dan a conocer métodos para detectar el FRa en una muestra mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo aquí descrito, o fragmento de unión al antígeno del mismo. Como se describe en el presente, la muestra podría proceder de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen la detección del FRa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato, como se define en las reivindicaciones. En realizaciones en las que se utilizan dos anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, uno de los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno del mismo, son como se definen en las reivindicaciones y el segundo anticuerpo se selecciona de entre:
a. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
b. el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos
c. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende las secuencias aminoacídicas de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1;
d. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1; o
e. un anticuerpo que tiene la secuencia aminoacídica del anticuerpo producido por cualquiera de las estirpes celulares depositadas en la ATCC con número de acceso PTA-11887, PtA-11884, PTA-11886 o PTA-11885, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con más de uno de los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, descritos en el presente.
Por ejemplo, una muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, y a continuación, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, donde el primer anticuerpo o fragmento de unión al antígeno y el segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno no son el mismo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, puede estar fijado a una superficie, como una placa multipocillo, un chip o sustratos similares, antes de ponerlo en contacto con la muestra. En otras realizaciones, el primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, puede no estar fijado, o anclado, a nada en absoluto antes de ponerlo en contacto con la muestra.
Se pueden utilizar diversas combinaciones de los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, para detectar el FRa en una muestra.
En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las
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secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y cDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se muestra en el Cuadro 1). En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se muestra en el Cuadro 1). En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se muestra en el Cuadro 1).
En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) ya continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3 (como se muestra en el Cuadro 1). En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 24F12 (como se muestra en el Cuadro 1). En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 26B3 (como se muestra en el Cuadro 1) y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprenda las secuencias aminoacídicas del segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 19D4 (como se muestra en el Cuadro 1).
En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con el anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11885 en la ATCC, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11884 en la ATCC, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con el anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11885 en la ATCC, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11887 en la ATCc, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En una realización, la muestra se puede primeramente poner en contacto con el anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11885 en la ATCC, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y a continuación, por separado, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo producido por la estirpe celular con número de acceso PTA-11886 en la ATCC, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno descritos pueden estar marcados de manera que se pueden detectar. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno marcados pueden facilitar la detección del FRa mediante los métodos descritos en el presente. Muchos marcajes como estos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, entre los marcajes adecuados se incluyen, entre otros, marcajes radiactivos, marcajes fluorescentes (como DyLight® 649), etiquetas epitópicas, biotina, marcajes cromóforos, marcajes electroquimioluminiscente o enzimas. Más específicamente, los marcajes descritos incluyen rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriamino-pentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y P-galactosidasa, polihistidina (cola de His), colorantes de acridina, colorantes de cianuro, colorantes de fluorona, colorantes de oxazina, colorantes de fenantridina, colorantes de rodamina, colorantes Alexafluor® y similares.
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno descritos se pueden utilizar en varios ensayos para detectar el FRa en una muestra. Algunos ensayos adecuados incluyen, entre otros, análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo,
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inmunofluorometría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (EQL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ELISA.
En algunas realizaciones descritas en el presente la detección en un sujeto de células cancerígenas que expresan el FRa se puede utilizar para determinar si el sujeto puede ser tratado con un agente terapéutico específico para el FRa. En algunas realizaciones, el agente terapéutico específico para el FRa puede ser un anticuerpo, como Farletuzumab.
Métodos para diagnosticar el cáncer
En el presente se dan a conocer métodos para diagnosticar en un sujeto cáncer de origen epitelial, ya sea de ovario, de mama, de tiroides, colorrectal, endometrial, de trompas de Falopio o de pulmón. En algunas realizaciones, como se describe más arriba, la detección del FRa en una muestra, como una muestra histológica, una muestra de aspirado con aguja fina, tejido tumoral resecado, células en circulación, células tumorales en circulación y similares, aporta la posibilidad de diagnosticar cáncer en el sujeto del cual se obtuvo la muestra. En algunas realizaciones, se podría ya saber que el sujeto del que se obtuvo la muestra presenta cáncer, pero el tipo de cáncer que padece el sujeto podría no haberse diagnosticado, o un diagnóstico preliminar podría no ser claro, por lo que la detección del FRa es una muestra obtenida a partir del sujeto puede permitir, o aclarar, el diagnóstico del cáncer.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la cantidad de FRa presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la cantidad de FRa en la muestra de control indica que el sujeto padece un cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. Se pueden utilizar métodos similares para determinar si el sujeto padece un cáncer que no está asociado con una mayor producción de FRa. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede proceder de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
En algunas realizaciones, el método de diagnóstico de un cáncer con expresión del FRa supone: la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico frente al FRa, o fragmento de unión al antígeno del mismo (como los que se pueden derivar de los anticuerpos y fragmentos que figuran en el Cuadro 1), la determinación de la cantidad de FRa presente en la muestra que está unido al anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, la comparación de la cantidad de FRa presente en la muestra con un patrón conocido; y la determinación de si la concentración de FRa del sujeto se encuentran dentro del intervalo de concentraciones de FRa asociadas al cáncer. En otra realización, tras el método de diagnóstico se puede realizar un paso adicional en el que se administra o receta un tratamiento específico contra el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico contra el cáncer puede ser para cánceres con expresión del FRa, como Farletuzumab.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la cantidad de FRa asociado a una célula o tejido que está presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la cantidad de FRa en la muestra de control indica que el sujeto padece un cáncer con expresión del FRa.
En algunas realizaciones, la muestra de control se puede obtener a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la muestra de control se puede obtener a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa, un aumento observado en la cantidad de FRa presente en la muestra, con respecto a la observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que no padece cáncer con expresión del FRa, una disminución o similitud observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado no padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa, una similitud observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado padece cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se obtiene a partir de un sujeto que padece cáncer con expresión del FRa, una disminución observada en la cantidad de FRa presente en la muestra problema, con respecto a la observada en la muestra de control, indica que el sujeto evaluado no padece cáncer con expresión del FRa.
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En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si un sujeto padece cáncer con expresión del FRa mediante la determinación de la cantidad de FRa no asociado a una célula o tejido que está presente en una muestra obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto y la cantidad de FRa en la muestra de control indica que el sujeto padece un cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en la muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparados histológicos y similares.
En varias realizaciones de los métodos descritos, el cáncer puede ser un cáncer con expresión del FRa. En una realización particular, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer endometrial. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de tiroides.
En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de las trompas de Falopio. En otra realización, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de pulmón no microcítico, como un adenocarcinoma. Por otra parte, los métodos descritos se pueden utilizar para diagnosticar un cáncer sin expresión del FRa, como carcinoma de células escamosas.
En diversos aspectos, la cantidad de FRa se determina mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa, como se define en las reivindicaciones 1 a 3, y a continuación, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. El segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
a. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
b. el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos;
c. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende las secuencias aminoacídicas de las CDR1, cDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1; o
d. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1; o
e. un anticuerpo que tiene la secuencia aminoacídica del anticuerpo producido por cualquiera de las estirpes celulares depositadas en la ATCC con número de acceso PTA-11887, PtA-11884, PTA-11886 o PTA-11885, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
Se pueden utilizar diversas combinaciones de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en los apartados (a) a (e), como se especifica más arriba en la sección general donde se describen los métodos de detección, como «primer» y «segundo» anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para llevar a cabo los métodos de diagnóstico descritos.
En determinadas realizaciones, la cantidad de FRa se determina mediante análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorometría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (EQL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ELISA.
En diversas realizaciones de los métodos de diagnóstico descritos se utiliza una muestra de control. La muestra de control puede ser un control positivo o negativo para el ensayo que garantiza que el ensayo utilizado funciona correctamente; por ejemplo, un ensayo de control de este tipo se podría utilizar normalmente para ensayos inmunohistoquímicos. Por otra
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parte, la muestra de control puede ser una cantidad de FRa de referencia estándar en un sujeto sano. En algunas realizaciones, la concentración observada de FRa en el sujeto evaluado se puede comparar con las concentraciones de FRa observadas en muestras de sujetos de control de los que se sabe que presentan cáncer con expresión del FRa. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa del sujeto de control es cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón, como adenocarcinoma. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control presenta cáncer con expresión del FRa en estadio temprano, como cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (p. ej., adenocarcinoma) en estadio I. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control presenta cáncer con expresión del FRa en estadio intermedio, como cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (p. ej., adenocarcinoma) en estadio II. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control presenta cáncer con expresión del FRa en estadio terminal, como cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de pulmón (p. ej., adenocarcinoma) en estadio III.
Los métodos de diagnóstico descritos en el presente también aportan una base sobre la que se podría predecir si un sujeto presenta una probabilidad relativamente más elevada o más baja de sobrevivir cinco años tras el diagnóstico. En algunas realizaciones, el método descrito se puede utilizar para predecir un desenlace clínico favorable para un sujeto con adenocarcinoma, y un desenlace clínico favorable se define como una tasa de supervivencia a los 5 años más elevada. Como los datos aquí aportados indican, los sujetos para los que se ha determinado que presentan adenocarcinoma en estadio I o II sin expresión del FRa tienen una probabilidad 2 veces mayor de fallecer en los 5 años siguientes que los sujetos para los que se ha determinado que presentan adenocarcinoma en estadio I o II con expresión del FRa.
Por lo tanto, los métodos de diagnóstico descritos en el presente se pueden combinar con este conocimiento para obtener un método que permita predecir la probabilidad de supervivencia a los 5 años de los sujetos para los que se ha determinado que presentan cáncer. En algunas realizaciones, el método se utiliza para predecir la probabilidad de supervivencia a los 5 años de los sujetos para los que se ha determinado que presentan adenocarcinoma.
En algunas realizaciones, el método de pronóstico descrito supone: la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico frente al FRa, o fragmento de unión al antígeno del mismo (como los que se pueden derivar de los anticuerpos y fragmentos que figuran en el Cuadro 1), la determinación de la cantidad de FRa presente en la muestra unido al anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, la comparación de la cantidad de FRa presente en la muestra con un patrón conocido; y la determinación de si la concentración de FRa en el sujeto indica la presencia de un cáncer con expresión del FRa, de manera que se pueda predecir la probabilidad de que el sujeto sobreviva durante 5 años después de que se la haya diagnosticado cáncer. En algunas realizaciones se sabe que el sujeto presenta o va a presentar adenocarcinoma. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
Métodos para vigilar el cáncer
En el presente se dan a conocer métodos para vigilar cáncer de origen epitelial en un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra obtenida a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable. A este respecto, una muestra problema con una cantidad de FRa más elevada con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una cantidad de FRa más baja con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una cantidad de FRa cuya diferencia con la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en una muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede proceder de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
En algunas realizaciones, el método para vigilar un cáncer con expresión del FRa supone: la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico frente al FRa, o fragmento de unión al antígeno del mismo (como los que se pueden derivar de los anticuerpos y fragmentos que figuran en el Cuadro 1), la determinación de la cantidad de FRa presente en la muestra unido al anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, la comparación de la cantidad de FRa presente en la muestra con la cantidad de FRa determinada en una muestra obtenida del mismo sujeto en el pasado, y la determinación de si la concentración de FRa en el sujeto ha cambiado a lo largo del tiempo. Una
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muestra problema con una cantidad de FRa más elevado con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una cantidad de FRa más baja con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una cantidad de FRa cuya diferencia con la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la concentración de FRa en la muestra se puede comparar con un patrón conocido, solamente o además de con la concentración de FRa observada en una muestra evaluada en el pasado. En algunas realizaciones, el patrón conocido puede ser proteína FRa a una concentración conocida (p. ej., una muestra de proteína FRa recombinante o purificada).
En otra realización, tras el método de diagnóstico se puede realizar un paso adicional en el que se administra un tratamiento específico contra el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico contra el cáncer puede ser para cánceres con expresión del FRa, como Farletuzumab.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra obtenida de manera similar a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable.
A este respecto, una muestra problema con una cantidad de FRa más elevada con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una cantidad de FRa más baja con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa. Por lo tanto, una muestra problema con una cantidad de FRa cuya diferencia con la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en una muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, como aspirado con aguja fina), preparados histológicos y similares.
En algunas realizaciones, los métodos descritos suponen la evaluación de si el cáncer con expresión del FRa evoluciona, remite o se mantiene estable mediante la determinación de la cantidad de FRa presente en una muestra problema obtenida a partir del sujeto; y la comparación de la cantidad de FRa observada con la cantidad de FRa en una muestra obtenida de manera similar a partir del sujeto en el pasado, donde una diferencia entre la cantidad de FRa en la muestra problema y la muestra obtenida en el pasado aporta una indicación de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable. A este respecto, una muestra problema con una cantidad de FRa más elevada con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la evolución de un cáncer con expresión del FRa. A la inversa, una muestra problema con una cantidad de FRa más baja con respecto a la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado puede indicar la regresión de un cáncer con expresión del FRa.
Por lo tanto, una muestra problema con una cantidad de FRa cuya diferencia con la cantidad observada en la muestra obtenida en el pasado sea negligible puede indicar que un cáncer con expresión del FRa se mantiene estable. En algunas realizaciones, la cantidad de FRa en una muestra obtenida a partir del sujeto se evalúa mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une al FRa, como los anticuerpos descritos en el presente. La muestra en la que se evalúa la presencia de FRa puede ser de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, preparados histológicos y similares.
En diversas realizaciones de los métodos descritos, el cáncer puede ser cáncer con expresión del FRa. En una realización particular, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer endometrial. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de las trompas de Falopio. En otra realización, el cáncer con expresión del FRa es cáncer de pulmón no microcítico, como un adenocarcinoma.
En diversos aspectos, la cantidad de FRa se determina mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa.
En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. En algunas realizaciones, la muestra se puede poner en contacto con un primer anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa como se define en las reivindicaciones 1 a 3 y a continuación, se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al FRa. El segundo anticuerpo se puede seleccionar de entre:
a. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo
9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3;
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b. el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos;
c. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende las secuencias aminoacídicas de las CDR1, cDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias aminoacídicas de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1;
d. un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el segmento del dominio variable de cadena pesada y el segmento del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3, como se describe en el Cuadro 1; o
e. un anticuerpo que tiene la secuencia aminoacídica del anticuerpo producido por cualquiera de las estirpes celulares depositadas en la ATCC con número de acceso PTA-11887, PtA-11884, PTA-11886 o PTA-11885, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
Se pueden utilizar diversas combinaciones de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en los apartados (a) a (e), como se especifica más arriba en la sección general donde se describen los métodos de detección, como «primer» y «segundo» anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para llevar a cabo los métodos de vigilancia descritos.
En determinadas realizaciones, la cantidad de FRa se determina mediante análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorometría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (EQL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ELISA.
Otros aspectos de la materia expuesta se dan a conocer en mayor detalle en la descripción detallada, los ejemplos aportados y las figuras correspondientes.
Kits para detectar el FRa
En el presente se dan a conocer kits para detectar el FRa en una muestra según se define en la reivindicación 29.
El anticuerpo dado a conocer, o fragmento de unión al antígeno, puede estar en solución, liofilizado, fijado a un sustrato, portador o placa, o conjugado con un marcaje detectable.
Los kits descritos también pueden incluir otros componentes útiles para llevar a cabo los métodos descritos en el presente. A título de ejemplo, los kits pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra de control, como por ejemplo, una muestra procedente de un sujeto que presenta cáncer con evolución lenta y/o un sujeto que no presenta cáncer, uno o más compartimentos para muestras y/o material de instrucciones donde se describe la ejecución de un método de la invención y controles/patrones específicos para un tejido.
Los medios para determinar la concentración de FRa también pueden incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos para uso en un ensayo de determinación de la concentración de FRa. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresión del FRa.
Los kits descritos también pueden incluir medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender una o más partes de equipos o reactivos que se pueden utilizar para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para obtener una muestra de un sujeto también pueden comprender medios para aislar componentes sanguíneos, como suero, de una muestra de sangre. Preferentemente, el kit está diseñado para su uso en un sujeto que sea un humano.
Los kits descritos también pueden incluir un reactivo de bloqueo que se puede aplicar a una muestra para disminuir la unión inespecífica de un anticuerpo primario o secundario. Un ejemplo de reactivo de bloqueo es la albúmina sérica bovina (BSA), la cual se puede diluir en un tampón antes de usarla. Otros reactivos de bloqueo disponibles en el mercado, como Block Ace y ELISA Synblock (AbD serotec), Background Punisher (BIOCARE MEDICAL) y StartingBlock (Thermo Fisher Scientific) son conocidos en la técnica. Los kits descritos también pueden incluir como control negativo un anticuerpo primario que no se una al FRa lo suficientemente como para dar un resultado positivo en un ensayo de detección con anticuerpos. Además, los kits descritos pueden incluir un anticuerpo secundario capaz de unirse a un anticuerpo primario del FRa, como el anticuerpo 9F3, el anticuerpo 19D4, el anticuerpo 24F12 o el anticuerpo 26B3. En algunas realizaciones, los anticuerpos secundarios pueden estar conjugados con un marcaje detectable, como peroxidasa de rábano picante (HRP) o un fluoróforo, para permitir la detección del anticuerpo primario unido a la muestra. Los kits descritos también pueden incluir un sustrato colorimétrico o quimioluminiscente que permita la presencia de un anticuerpo secundario unido a detectar en una muestra. En algunas realizaciones, el sustrato colorimétrico o quimioluminiscente puede ser ácido 2,2'- azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS); 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB); 3,3'-diaminobencidina (DAB); SuperSignal (Thermo Fisher Scientific); reactivo para EQL (Thermo Fisher Scientific) u otros reactivos similares conocidos
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por los expertos en la técnica.
Los siguientes ejemplos se aportan para complementar la divulgación anterior y para proporcionar una mejor comprensión de la materia descrita en el presente. No debe considerarse que estos ejemplos limiten la materia descrita.
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Todos los ejemplos que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones se aportan solamente a título de referencia y no forman parte de la invención.
EJEMPLO 1 - Expresión y purificación del FRa humano recombinante
Para llevar a cabo los experimentos asociados a los estudios descritos en el presente se crearon varios sistemas o estirpes celulares que expresaban el receptor a del folato (FRa), a fin de generar sustratos celulares que expresaran el FRa o para generar proteína FRa humana recombinante purificada.
Un sistema de expresión utilizado fue la estirpe celular de insecto Sf9, que expresa el FRa humano recombinante mediante baculovirus. Este sistema se preparó con una secuencia del FRa humano, que contenía una secuencia guía optimizada para la expresión en células de insecto, una etiqueta epitópica de 6 histidinas (6xhis) en el N-terminal, con el sitio nativo de anclaje mediante GPI intacto. A continuación, las células se incubaron en un matraz en agitación de 1 L y los cultivos de células de insecto Sf9 en fase de crecimiento logarítmico se infectaron con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) < 1. Las células procedentes de un cultivo de 30 L se recolectaron, se lisaron y se extrajeron 2 veces con una solución salina tamponada con fosfato 1X que contenía 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1- propanosulfonato (CHAPS) 10 mM. La concentración de NaCl se ajustó a 300 mM y se filtró a través de una membrana de 0,2 pm. El sobrenadante clarificado se purificó mediante cromatografía de afinidad, utilizando PBS 1X con NaCl 2 M, CHAPS 1 mM, pH 7,4 como tampón de lavado. A continuación se realizó una elución con ácido 3-(N- morfolino)propanosulfónico (MOPS) 10 mM, MgCh 3 M, CHAPS 1 mM, pH 6,8. Las fracciones de pico se dializaron exhaustivamente frente a PBS 1X a pH 7,4, su pureza se determinó mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante el ensayo del ácido bicinconínico (BCA), se alicuotaron y se almacenaron a -80 °C.
Se produjo una estirpe celular de ovario de hámster chino (CHO) con expresión y secreción estable del FRa humano utilizando una secuencia del receptor a del folato (FRa) humano que contenía una secuencia guía de la inmunoglobulina k humana y una etiqueta epitópica de 6 histidinas en el C-terminal que reemplazaba el sitio de anclaje mediante GPI. Una vez producidas, las células de CHO con expresión del FRa se dejaron crecer en bolsas wave de 25 L. Para purificar la proteína FRa secretada, se eliminaron los desechos celulares del sobrenadante de células mediante filtración en profundidad y a continuación, este se concentró 10 veces mediante filtración de flujo tangencial y se diafiltró en fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 1 mM, pH 8,0. Este se depositó en una columna Talon® para IMAC previamente empaquetada con un FPLC. El material no unido se eliminó mediante un lavado con fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, pH 8,0 y la proteína unida se eluyó con un gradiente lineal de imidazol 5 mM - 100 mM en fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0. Las fracciones de pico se dializaron exhaustivamente frente a PBS 1X a pH 7,4, su pureza se determinó mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante el ensayo del BCA, se alicuotaron y se almacenaron a - 80 °C.
También se produjo un sistema celular similar para el receptor p del folato (FRp) humano, el receptor y del folato (FRy) humano y el receptor 5 del folato (FR5) humano. En breve, para transfectar transitoriamente cultivos de 1 L de células 293F, se utilizaron construcciones de FRp, FRy o FR5 que contenían una secuencia guía de la inmunoglobulina k humana y una etiqueta epítópica de 6 histidinas en el C-terminal que reemplazaba el sitio de anclaje mediante GPI. Las proteínas FR recombinantes se purificaron como se describe más arriba para el FRa humano.
También se preparó una estirpe celular de ovario de hámster chino (CHO) con expresión y secreción estable de una secuencia de mesotelina humana que contenía una secuencia guía de la inmunoglobulina k humana y una etiqueta epitópica de 6 histidinas en el C-terminal que reemplazaba el sitio de anclaje mediante GPI, ya que la mesotelina se ha utilizado como control negativo en muchos estudios. Las células CHO que expresaban mesotelina humana se dejaron crecer en bolsas wave de 25 L.
Para purificar la proteína mesotelina secretada, se eliminaron los desechos del sobrenadante de células mediante filtración por fibras huecas y el sobrenadante clarificado se concentró 10 veces mediante filtración de flujo tangencial. La concentración de NaCl del sobrenadante se ajustó a 300 mM de NaCl y 0,5 mM de imidazol. Este se depositó en una columna Talon® para IMAC previamente empaquetada con un FPLC. El material no unido se eliminó mediante un lavado con fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 3 mM, pH 8,0, y la proteína unida se eluyó con fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM, pH 8,0. Las fracciones de pico se dializaron exhaustivamente frente a fosfato potásico 50 mM a pH 7,5. Se añadió sulfato amónico hasta una concentración final de 1 M, y la purificación final se realizó en una columna previamente empaquetada con fenil sefarosa siguiendo un gradiente escalonado de sulfato amónico 1 M - 0 M en fosfato potásico 50 mM a pH 7,5. Las fracciones de pico se dializaron exhaustivamente frente a PBS 1X a pH 7,4, su
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pureza se determinó mediante SDS-PAGE, se cuantificaron mediante el ensayo del BCA, se alicuotaron y se almacenaron a -80 °C.
EJEMPLO 2 - Producción de FRa alquilado y reducido purificado
Se trató de producir una forma antigénica del FRa reducida y alquilada. Para reducir la proteína, el FRa purificado se concentró a 2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) mediante filtros de centrífuga (Amicon Ultra, límite de peso molecular: 3 kD). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo del BCA (Thermo Scientific). El FRa resultante se diluyó en urea 8 M/PBS (1:1) para obtener una concentración final de FRa de 1 mg/ml en PBS con urea 4 M. Se añadió una solución de ditiotreitol (500 mM en PBS) hasta alcanzar una concentración final de 10 mM. La solución se incubó a 65 °C durante una hora, y se dejó enfriar a temperatura ambiente.
A continuación, se añadió una solución de yodoacetamida 1 M en solución salina tamponada con fosfato a la solución de receptor del folato reducido hasta alcanzar una concentración final de 10 mM, y la reacción se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La proteína se mantuvo en solución en estas condiciones. El FRa reducido final para su uso en inmunizaciones se almacenó en una solución salina tamponada con fosfato que contenía urea 4 M, DTP 10 mM y yodoacetamida 10 mM.
En la Figura 1 se muestra la migración diferencial de la proteína FRa nativa y la proteína reducida y alquilada analizada mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
EJEMPLO 3 - Producción de hibridomas con el FRa
Se inmunizaron ratones hembra Balb/c de 8 semanas con proteína FRa marcada con 6 histidinas (n=5) o con proteína FRa reducida y alquilada (n=5). Las inmunizaciones iniciales administradas en el día 0 por vía intraperitoneal comprendían 50 pg del inmunógeno respectivo mezclado en una relación 1:1 (v:v) con adyuvante completo de Freund (Rockland, n.° cat. D614-0050). A los ratones se les administró por vía intraperitoneal 50 pg adicionales de inmunógeno mezclado en una relación 1:1 (v:v) con adyuvante completo de Freund (Rockland, n.° cat. D614-0050) 14 días más tarde y cada 21 días a partir de entonces. Se extrajeron muestras de sangre de los ratones inmunizados 24 días tras la inmunización inicial y cada 21 días a partir de entonces.
Las muestras de sangre extraídas se analizaron mediante inmunoensayo directo ligado a enzimas (EIA) frente al FRa. Las placas se recubrieron con proteína FRa (100 ml de una solución de 1 mg/ml en PBS, fosfato potásico 0,02 M, cloruro sódico 0,15 M, pH 7,2), se incubaron durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBS que contenía Tween®-20 (PBST; Rockland, n.° cat. MB-075-1000) al 0,2 % y se bloquearon con gelatina de pescado (Sigma) al 3 % durante una hora a temperatura ambiente. Una serie de diluciones a 1:3 de muestras independientes de suero de ratón se dejaron que se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación, las placas se lavaron 3 veces con PBST y después se rastrearon utilizando como sonda un anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con HRP (Rockland, n.° cat. 610-4320) a una dilución de 1:2500 durante 30 minutos a 37 °C. Se añadió sustrato TMB (Rockland, n.° cat. TMBE-100) y la reacción se paró a los 30 minutos mediante la adición de 100 ml de HCl 1M. A continuación, se midió la absorbancia a 450 nm (Microplate Reader “Benchmark”; Biorad). Todas las muestras se contraanalizaron frente a la proteína mesotelina recombinante marcada con 6 histidinas (mesotelina-His6) como control negativo.
Los bazos de ratón que mostraron los títulos más elevados de especificidad frente al antígeno se recolectaron y los hibridomas se prepararon mediante electrofusión (Hybrimune™ Model CEEF-50B Waveform Generator; Cellectis, Romainville, Francia) de esplenocitos con células Sp2/0 Agl4 de mieloma (ATTC CRL1581). A continuación, el sobrenadante de los hibridomas se analizó mediante ELISA frente al FRa y la mesotelina-His6 recombinante tal y como se describe más arriba a fin de seleccionar las estirpes celulares que expresan la fusión parental.
A continuación, las estirpes celulares parentales seleccionadas determinadas para producir anticuerpos reactivos frente al FRa humano recombinante (rhFRa) se subclonaron mediante dilución límite. A continuación, los anticuerpos producidos por estas células se volvieron a analizar para evaluar su unión al FRa y se isotiparon con el sistema Clonetyping™ (SouthemBiotech, Birmingham, Alabama, Estados Unidos de América). A fin de determinar la especificidad frente al receptor, el sobrenadante de estos clones se volvió a analizar mediante ELISA directo frente a otras tres isoformas del receptor del folato humano (FRp, FRy y FRó). Las placas se recubrieron durante la noche con 100 pl de una solución de l pg/ml de la isoforma respectiva del FRa a 4 °C, se lavaron con PBS que contenía Tween®-20 (Rockland, n.° cat. MB-075- 1000) al 0,2 % y se bloquearon con gelatina de pescado (Sigma) al 3 %. Una serie de diluciones a 1:3 del sobrenadante de los cultivos se dejaron que se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación, las placas se lavaron y se rastrearon utilizando como sonda un anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP tal y como se describe más arriba. Los clones que producían anticuerpos reactivos frente al FRp, FRy y Fró no se seleccionaron para más análisis.
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Los cuatro clones de hibridoma seleccionados, 19D4.B7, 26B3.F2, 24F12.B1 y 9F3.H9.H3.H3.B5.G2, se depositaron en la Colección de Cultivos Americana el 19 de mayo de 2011 y se les asignaron los números de acceso de la ATCC PTA- 11884, PTA-11885, PTA-11886 y PTA-11887, respectivamente.
EJEMPLO 4 - Producción de anticuerpos monoclonales purificados del FRa
Las estirpes celulares seleccionadas se evaluaron para comprobar la presencia de micoplasma mediante un kit para tal fin (Rockland, n.° cat. MAB-012) antes de sembrarlas a una densidad de 0,5*l05 células/ml en botellas rodantes de 1 L que contenían medio sin suero (invitrogen, n.° cat. 12045-076) y SFB con IgG a una concentración baja del 5 % (Gibco, n.° cat. 16250-078). Los cultivos se dejaron crecer a 37 °C durante 14 o 21 días, tras lo cual el sobrenadante se recogió y se concentró aproximadamente 10 veces a través de una membrana de filtración de 50 kDa (Spectrum Labs, Rancho Dominguez, California, Estados Unidos de América) y a continuación, se purificó mediante cromatografía de proteína A (Rockland, n.° cat. PA). El anticuerpo unido se eluyó con citrato sódico 0,1 M a pH 13,5/4,5, dependiendo del isotipo de anticuerpo, y el tampón se dializó frente a PBS utilizando tubos con membrana de 12-14 kDa (Spectrum Labs, Rancho Dominguez California, Estados Unidos de América). El anticuerpo purificado se sometió a una filtración esterilizante con Express™PLUS Stericups de 0,22 pm (Millipore, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos de América) y se almacenó a 4 °C para realizar más pruebas.
Se trató de secuenciar las cadenas pesadas y ligeras de cuatro clones de hibridoma seleccionados (9F3-H9, 19D4-B7, 24F12-B1 y 26B3-F2). Primero, el ARN total se aisló de la estirpe celular de cada hibridoma (sedimentos celulares de 1x103 a 1*105 células cada uno) con el kit RNAqueous® (Ambion) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific).
A continuación, el ARN aislado se amplificó mediante RT-PCR múltiple, realizada por triplicado para cada hibridoma en un Mastercycler® EP Gradient Thermocycler (Eppendorf). Primero, para cada hibridoma se realizaron dos amplificaciones independientes del ADNc específico para el gen (<1 pg ARN/reacción) a fin de determinar cuáles eran los genes de cadena pesada y ligera de la Ig que se utilizaban durante el reordenamiento de la Ig. Cada mezcla consistía en cebadores singulares específicos para la familia diseñados para hibridarse a cualquiera de las posibles familias de genes murinos de la Ig V (IgHv, IgKv) y genes de la región constante de las Ig (IgHcGamma, IgKc). La generación y amplificación del ADNc se realizó con el Superscript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) en las condiciones siguientes: 55 °C durante 30 minutos y 95 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto, 68 °C durante 1 minuto y finalmente, 68 °C durante 10 minutos. Los productos del ADN se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2 %. Las bandas correspondientes se cortaron y purificaron del gel con el kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN purificado se envió para su secuenciación (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, Nueva Jersey, Estados Unidos de América) a fin de determinar los segmentos del gen de la estirpe germinal expresados por cada hibridoma.
A continuación se realizaron más análisis de RT-PCR adecuados para los genes concretos identificados para cada hibridoma utilizando la misma fuente de ARN de más arriba y cebadores específicos para el gen (en contraposición a los cebadores específicos para la familia utilizados en la mezcla para RT-PCR múltiple). Para facilitar la clonación, los ADNc de Ig amplificados se colocaron en un vector de expresión In-Fusion (IF); cada cebador específico para el gen también contenía secuencias complementarias al vector, lo que permitiría un entrecruzamiento homólogo. Todos los otros reactivos y condiciones del termociclador son iguales a los utilizados para los experimentos de RT-PCR múltiple descritos más arriba.
EJEMPLO 5: Caracterización de la unión del anticuerpo al FRa
Las características de unión de los anticuerpos monoclonales purificados al FRa se determinaron mediante experimentos de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C utilizando un BIAcore T100 con chips CM5 para investigación (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. Inicialmente, la IgG anti-ratón suministrada en el kit para captura de anticuerpos de ratón (GE Healthcare) se inmovilizó mediante la formación de enlaces amida con los chips sensores CM5. Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-FRa (26B3, 24F12, 19D4 o 9F3) se capturaron en celdas de flujo individuales por ciclo de unión, y la cuarta celda de flujo se utilizó como referencia. Los experimentos de unión se realizaron utilizando HBS-P (GE Healthcare) como tampón de análisis a un caudal de 30 pl/min. Cada muestra de anticuerpo monoclonal (0,5 pg/ml) se inyectó durante 3 minutos para capturar el anticuerpo. A continuación, se inyectó FRa humano recombinante purificado (rh-FRa) a diversas concentraciones (1nM - 30nM) en las superficies de referencia y en las superficies específicas para el FRa durante 3 minutos a fin de registrar los sensogramas de unión mediante un método de cinética de un solo ciclo. El perfil de disociación se monitorizó durante 25 minutos. Entre uniones, la superficie se regeneró con una inyección de 30 pl de glicina 10 mM (pH 1,7). Los sensogramas se procesaron y se ajustaron a un modelo de unión 1:1 de Langmuir con el software de evaluación BIAcore T100 (versión 2.0.1). Algunas de las características de unión de los anticuerpos 26B3, 24F12, 19D4 y 9F3 se muestran en el Cuadro 2.
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Cuadro 2: Características de unión de los anticuerpos específicos frente al FRa
Nombre abreviado del clon
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) X2
26B3
5,24x105 1,43x10-5 2,73x10-11 2,48
24F12
3,93*105 3,99xl0-5 1,02x10-10 1,08
19D4
4,27x105 2,42x10-4 5,67x10-10 0,656
9F3
4,34x105 3,10x10-4 7,15x10-10 1,89
EJEMPLO 6: Mapeo de los epítopos de los anticuerpos específicos frente al FRa seleccionados
Los anticuerpos específicos frente al FRa, 26B3, 24F12 y 9F3, también se evaluaron en estudios de unión al epítopo mediante Octet QK. Los resultados mostraron que 26B3 y 24F12, los cuales poseen una elevada afinidad al FRa humano purificado, compiten entre ellos para unirse al FRa. Así, estos anticuerpos podrían tener un epítopo en común, o epítopos inmediatamente adyacentes el uno al otro. Los resultados también indican que el anticuerpo 9F3 tiene un epítopo singular, ya que no compitió con otros anticuerpos específicos frente al FRa para unirse al FRa.
Se realizaron más estudios de mapeo de epítopos mediante ExSAR™ con espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio y métodos de acoplamiento simulado. Los resultados de estos estudios obtenidos para los anticuerpos 9F3, 24F12 y 26B3 se muestran en la Figura 2.
En lo que respecta al epítopo para el anticuerpo 26B3, estos datos apuntan a que este es accesible en la estructura nativa anclada en la membrana, dado la capacidad de 26B3 de reconocer el FRa nativo mediante citometría de flujo. Además, estos datos también apuntan a que las restricciones conformacionales del epítopo reconocido por el AcM 26B3, como demuestra su incapacidad de detectar la proteína en transferencias de Western en condiciones reductoras, están relacionadas con la cisteína de la posición 185 en la proteína FRa, la cual forma un puente disulfuro con la cisteína de la posición 111.
EJEMPLO 7: Reconocimiento de formas del FRa desnaturalizadas y químicamente conservadas
Se realizaron experimentos para determinar si cualquiera de los anticuerpos específicos frente al FRa descritos más arriba podían reconocer formas desnaturalizadas del FRa. Para estos análisis, las células CHOK1 con expresión estable del FRa, p o A humano enlazado a GPI se lisaron en tampón OBG al 1,1 % (tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, OBG al 1,1 %) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana, Estados Unidos de América) y PMSF (100 nM), y se dejaron sobre hielo durante 15 minutos. Los lisados se preclarificaron mediante centrifugación a 13 000 r.p.m. durante 15 minutos para eliminar los desechos. Para las muestras reducidas y desnaturalizadas, se hirvió la misma cantidad de proteína (20 pg) durante 10 minutos en tampón de carga NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía p-mercaptoetanol al 5 % + DTT 40 mM. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) con gel bis-tris al 4-12 % (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con PBST + leche descremada al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente tras lo cual, la membrana se lavó dos veces con PBST. La inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos monoclonales purificados de ratón 9F3, 19D4, 24F12 o 26B3 (1 pg/ml) específicos frente al FRa, que se detectaron con un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con HRP y se visualizaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, Illinois, Estados Unidos de América). La luminiscencia se visualizó con el sistema Omega 12iC de obtención de imágenes moleculares (Ultra-Lum, Claremont, California, Estados Unidos de América) y el análisis de las imágenes se realizó con el software UltraQuant™ 6.0 (Ultra-Lum).
Los análisis de transferencia de Western también se realizaron con preparados de receptor del folato purificado. Para estos experimentos, 0,5 pg de FRa, p, r o A humano purificado, producidos como se describe en el Ejemplo 1, se incubaron en tampón de carga 1X SDS-PAGE (Invitrogen) con o sin DTT 20 mM, se hirvieron durante 10 min y se separaron por electroforesis en geles de SDS-PAGE con un gradiente del 4-12 %. La proteína se transfirió a una membrana de PVDF y las transferencias se rastrearon con una sonda como se describe más arriba. Los geles se resolvieron utilizando el marcador de pesos moleculares con proteínas preteñidas de Benchmark™ (Novex®). Los geles para los que se utilizaron proteínas FR recombinantes purificadas también se visualizaron mediante tinción con plata para asegurarse de que se había depositado la misma cantidad de proteínas.
Los análisis de transferencia de Western indican que los anticuerpos 19D4, 9F3, 24F12 y 26B3 reconocen el FRa no
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reducido, sin embargo, no se detectó la unión a muestras reducidas y desnaturalizadas para ninguno de estos anticuerpos (Figuras 3(A) y (B)).
También se realizaron estudios de inmunohistoquímica (IHQ) a fin de determinar si cualquiera de estos anticuerpos se podía unir a muestras de tejido de cáncer de ovario seroso papilar fijadas en formol e incluidas en parafina. Las pruebas de IHQ indirecta para el FRa se realizaron con el kit MACH4™ para detección universal de HRP-polímero (Universal HRP- Polymer Detection, Biocare Medical). Las muestras fijadas en formol e incluidas en parafina se cortaron en un tamaño de 5 micrómetros sobre unos portaobjetos de vidrio cargados positivamente y se calentaron durante aproximadamente 60 minutos a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinizaron en 3 baños consecutivos de xileno de 3 minutos cada uno, se transfirieron a tres baños consecutivos de alcohol al 100 % de 3 minutos cada uno, seguido de 3 baños consecutivos de alcohol al 95 % de 3 minutos cada uno y finalmente, se enjuagaron durante 5 minutos con agua desionizada. A continuación, las muestras preparadas se pretrataron con la solución Diva para recuperación de epítopos inducida por calor (Biocare Medical) diluida a 1:10 en agua desionizada y se colocaron en una olla a presión (decloaking chamber) presurizada llena con 500 ml de agua desionizada. Las muestras se incubaron durante 15 minutos en una olla a presión (decloaking chamber) donde la incubación presurizada alcanzó un máximo de 125 °C a 16 psi durante 30 segundos y a continuación, se enfrió durante 15 minutos hasta alcanzar los 95 °C. A continuación, los portaobjetos se enfriaron durante 15 minutos hasta alcanzar la temperatura ambiente. Tras enfriar, los portaobjetos se lavaron en 3 baños consecutivos de 3 minutos cada uno con tampón de lavado de solución salina tamponada Tris/Tween-20® al 0,1 % (TBST). Todos los lavados posteriores con tampón también se realizaron de esta manera. A continuación, los portaobjetos se bloquearon con solución de bloqueo de peroxidasa-1 (Biocare Medical) durante 5 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con TBST y entonces se aplicó el reactivo de bloqueo universal sin suero Background Sniper (Biocare Medical) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras bloquear las muestras, los portaobjetos se incubaron en una solución del anticuerpo 26B3 en diluyente para anticuerpos (Antibody Diluent, Dako) a 2,5 pg/ml o del anticuerpo de ratón para control negativo universal listo para usar (Universal Negative Control - Mouse ready-to-use negative control antibody, Dako, para tejido con isotipo negativo) durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se lavaron con TBST y se incubaron con un realzador de la señal del anticuerpo primario de ratón (Mouse Probe Primary Antibody Enhancer, suministrado en el kit MACH4™ de Biocare Medical) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron otra vez con TBST y se incubaron con un reactivo para polímero-HRP (suministrado en el kit MACH4™ de Biocare Medical) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, los portaobjetos se lavaron con TBST y se incubaron en una solución de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Dako) durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se enjuagaron con abundante agua desionizada 3 veces durante 30-60 segundos cada vez y se contratiñeron con hematoxilina (Dako) durante 2 minutos, se lavaron con TBST, se deshidrataron en 3 baños consecutivos de alcohol al 95 % y alcohol al 100 % de 30 segundos cada uno, y se clarificaron en 3 baños consecutivos de xileno de 30 segundos cada uno. Finalmente, se aplicaron cubreobjetos a los portaobjetos antes del análisis.
Se suele creer que para que un anticuerpo sea eficaz en el análisis inmunohistoquímico de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, este ha de poder reconocer un epítopo lineal del antígeno de interés, pues el antígeno no posee una estructura terciaria debido a la naturaleza destructiva de la fijación del tejido. Por lo tanto, resultó sorprendente que el anticuerpo 26B3 pudiera reconocer el FRa en este ensayo (Fig. 4), ya que no reconoce el FRa reducido y desnaturalizado mediante transferencia de Western. Además, el perfil de tinción del FRa con el anticuerpo 26B3 observado en tejidos normales fue coherente con estudios publicados en la bibliografía en los que se utilizaron otros anticuerpos y técnicas, y el páncreas, la tiroides, el pulmón, las glándulas salivales, el riñón, la hipófisis, el cuello uterino y la mama mostraron expresión en diversos grados (Cuadro 3). Como se muestra en la Figura 5, el perfil de tinción en tejidos normales, ilustrado en cortes de pulmón normal (A) y riñón normal (B), está muy restringido a las células epiteliales y es de naturaleza comúnmente apical.
Cuadro 3. Expresión del FRa en tejidos humanos normales
Tipo de tejido
Tinción (Número/intensidad) Comentarios
Cerebro
0/3
Cerebelo
0/3
Suprarrenal
0/3
Ovarios
0/3
Páncreas
3/3; 2+ Limitada a los bordes luminales de las células ductales y acinares
Tiroides
2/5; 1+ (dispersa) Tinción citoplasmática en las células foliculares
Hipófisis
3/3; 1 + Predominantemente citoplasmática
Testículos
0/3
Mamas
3/3; 1+/2+ Células ductales con tinción luminal y de la membrana
Bazo
0/3
Amígdalas
0/3
Timo
0/3
Médula ósea
0/3
Pulmones
3/3; 2+ Tinción en las células alveolares y bronquiales
Corazón
0/3
Esófago
0/3
Estómago
0/2
Intestino delgado
0/3
Colon
0/3
Hígado
0/3
Glándulas salivales
3/3; 3+ Células ductales y acinares
Riñones
3/3; 3+ Tinción luminal de las células tubulares proximales
Próstata
0/3
Endometrio
0/3
Cuello uterino
1/3; 1 + Células endocervicales
Músculo esquelético
0/3
Piel
0/3
Nervios
0/3
Mesotelio (pleura y pulmón)
3/3; 2+ Células alveolares
EJEMPLO 8: Reconocimiento de formas nativas del FRa
5 Se realizaron estudios de citometría de flujo para evaluar la capacidad de los anticuerpos específicos frente al FRa seleccionados para unirse a la proteína nativa. Para estos estudios se recolectaron células de ovario de hámster chino
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(CHO) que expresaban el FRa y a continuación, se lavaron y se resuspendieron en medio de crecimiento enfriado con hielo (RPMI suplementado con SFB al 10 %). Las células se incubaron durante 1 hora sobre hielo con 9F3, 19D4, 24F12 o 26B3 (1 pg/ml), se lavaron y a continuación, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con FITC (dilución a 1:100) (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Estados Unidos de América). Antes del análisis, las células se marcaron con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos de América) para excluir las células no viables. También se sometieron a los mismos procedimientos de laboratorio a células CHO que no expresaban el FRa, como control negativo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo EasyCyte™ (Guava® Technologies, Hayward, California, Estados Unidos de América). Los datos que figuran en el Cuadro 4 indican que los cuatro anticuerpos pueden unirse al FRa nativo.
Cuadro 4: Anticuerpos específicos frente al FRa reconocen el FRa expresado en la superficie celular
Diana
Media geométrica observada para el anticuerpo:
9F3
26B3 24F12 19D4
Solo células
2,7 2,7 2,7 2,0
CHOK1
5,9 5,7 5,9 —
FRa
759,5 853,7 777,0 1130,5
FRP
6,1 5,9 6,6 —
FRA
5,6 5,4 5,9 —
EJEMPLO 9: Detección del FRa en el suero de sujetos de los que se sabe que presentan cáncer de ovario
Se realizaron estudios de electroquimioluminiscencia para determinar si los anticuerpos específicos frente al FRa descritos en el presente podían detectar FRa en el suero de pacientes de los que se sabía que presentaban cáncer de ovario. Para estos experimentos se utilizó el AcM 26B3 como AcM de captura y se añadió a placas de EQL a una concentración de 750 pg/ml. Las placas se lavaron, se añadieron 50 pl de suero de muestra a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Las muestras de suero se obtuvieron de mujeres sanas normales (control negativo) y de pacientes con cáncer de ovario. Las muestras se diluyeron a 1:4 en PBST (solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 que contenía Tween®20 al 0,01 %). Tras la incubación, las muestras se lavaron con PBST y para detectar la muestra unida, a cada pocillo se añadieron 25 pl del AcM 19D4 (1 pg/ml) marcado con Ru en una relación de aproximadamente 13 marcadores/molécula de IgG. Tras un período de incubación de 2 horas, las placas se lavaron con PBST y se leyeron con 2X MSD Buffer T. Los resultados que figuran en el Cuadro 5 muestran que el FRa en el suero se puede capturar y detectar con los anticuerpos monoclonales 26B3y 19D4.
Cuadro 5: Concentración sérica relativa de FRa
Categoría (n)
Concentración media de FRA (pg/ml) Desviación estándar
Normal (15)
223 74
Cáncer de ovario (15)
1815 3896
EJEMPLO 10: Detección del FRa en el suero y la orina de sujetos de los que se sabe que presentan cáncer de ovario
A continuación se realizaron estudios de electroquimioluminiscencia para determinar si los anticuerpos específicos frente al FRa descritos en el presente podían detectar el FRa en el suero y la orina de pacientes de los que se sabía que presentaban cáncer de ovario. Para estos experimentos se utilizó el AcM 26B3 como AcM de captura y se añadió a placas de EQL a una concentración de 75 pg/ml. Las placas se lavaron, se añadieron 50 pl de suero de muestra a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas.
Las muestras de suero y orina equivalentes se obtuvieron de mujeres sanas normales (control negativo) y de pacientes con cáncer de ovario. Las muestras (suero u orina) se diluyeron a 1:4 en PBST (solución salina tamponada con fosfato a
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pH 7,4 que contenía Tween®20 al 0,01 %). Tras la incubación, las muestras se lavaron con PBST y para detectar la muestra unida, a cada pocillo se añadieron 25 pl del AcM 19D4 (1 pg/ml) marcado con Ru en una relación de aproximadamente 13 marcadores/molécula de IgG.
Tras un período de incubación de 2 horas, las placas se lavaron con PBST y se leyeron con 2X MSD Buffer T. Los resultados que figuran en el Cuadro 6 muestran que el FRa en el suero y la orina se puede capturar y detectar con los anticuerpos monoclonales 26B3 y 19D4.
Cuadro 6: Concentraciones relativas de FRa en el suero y la orina
Designación del paciente
Concentración de FRa en el suero (pg/ml) Concentración de FRa en la orina (pg/ml)
Normal 1
398 3080
Normal 2
236 11508
Normal 3
315 7704
Normal 4
320 13198
Cáncer de ovario 1
19479 368066
Cáncer de ovario 2
4144 23738
Cáncer de ovario 3
986 165826
Cáncer de ovario 4
719 414187
EJEMPLO 11: Puntuación M como parámetro para medir los resultados de inmunohistoquímica
Se estableció un parámetro (puntuación M) para medir la tinción de las muestras, el cual se puede definir de la siguiente manera:
i- s¡=w} «
En la ecuación, Xy representa el porcentaje de tumor teñido a una intensidad j para el paciente i, y wj es el valor absoluto de la intensidad (que va de 0 a 3+). El intervalo teórico de este parámetro va de 0 (sin tinción positiva) a 50 (el 100 % de las células se tiñen a una intensidad de 3+). Así, la puntuación M es una puntuación ponderada para estimar la tinción mediante IHQ del FRa en la membrana de las células tumorales; dicha puntuación incluye tanto el porcentaje de células con positividad para el FRa como la intensidad de la tinción. Cuando fue necesario, las puntuaciones M de cada paciente se promediaron sobre varias muestras de micromatrices de tejidos (TMA). Si una muestra no daba resultados, es decir, no había ni tumor ni tejido necrótico, la puntuación M se asignaba a las determinaciones no nulas.
Una aplicación práctica de la ecuación anterior se muestra a continuación:
3+
2+ 1 + 0 Puntuación M
x = 40
y = 30 Z = 10 M = (3x + 2y+z)/6
3 x 40 = 120
2 x 30 = 60 1 x 10 = 10 (120+60+10)/6 = 31,67
Aquí, x = % de tumor teñido con una intensidad de 3+; y = % de tumor teñido con una intensidad de 2+; z = % de tumor teñido con una intensidad de 1+.
La tasa de positividad para la expresión del FRa en una histología determinada se calculó como el porcentaje de muestras que se tiñeron positivamente según la definición de resultado positivo (> 5 % de la totalidad de células tumorales se tiñen). Los intervalos de confianza binomiales exactos se determinaron mediante métodos convencionales (Clopper C.J. and Pearson R.C., Biometrika. 26:404-13 (1934)). Las estadísticas resumidas se presentan aquí para todas las variables demográficas y para la puntuación M.
Las diferencias correspondientes a los valores medios se determinaron mediante un ANOVA unilateral con pruebas a posteriori con control del error de tipo I general. Se consideró que las diferencias entre los valores medios eran
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estadísticamente distintas si el valor de p asociado a la prueba era menor que el error de tipo I ajustado por el método de Bonferroni para esa prueba (error de tipo I máximo = 0,05).
EJEMPLO 12: Tinción comparativa de células de carcinoma de pulmón con el anticuerpo 26B3 y el anticuerpo BN3.2
Existe una variabilidad considerable en la bibliografía en lo que respecta al porcentaje de los diversos carcinomas que expresan el FRa, determinado mediante IHQ, lo que se debe en parte al uso de diversos anticuerpos, la mayoría de los cuales no están disponible en el mercado. Un AcM específico frente al FRa disponible en el mercado para el que se ha demostrado que detecta el FRa en cortes FFIP mediante IHQ es el anticuerpo BN3.2 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, Illinois, Estados Unidos de América). Por lo tanto, se realizaron estudios para comparar el anticuerpo BN3.2 con el anticuerpo 26B3 en términos de especificidad y sensibilidad para la detección del FRa utilizando una TMA disponible en el mercado que contenía diversos tipos histológicos de cáncer de pulmón. Ambos anticuerpos eran altamente específicos frente al adenocarcinoma en comparación con otros subtipos histológicos, en particular, el carcinoma de células escamosas. Sin embargo, el anticuerpo 26B3 fue significativamente más sensible que el BN3.2: el anticuerpo 26B3 identificó 26/36 (72 %; puntuación M media ± SD = 19,84 + 18,64) muestras de adenocarcinoma, mientras que el anticuerpo BN3.2 identificó 22/36 (61 %; puntuación M media ± SD = 11,38 + 14,25). Estos datos demuestran que el anticuerpo BN3.2 es significativamente menos sensible que el anticuerpo 26B3 para detectar la expresión del FRa en muestras de tejido FFIP y, como se muestra en la Figura 6, existe una relación no lineal entre las puntuaciones M observadas en muestras de adenocarcinoma de pulmón con estos dos anticuerpos.
EJEMPLO 13: Detección del FRa en sujetos de los que se sabe que presentan adenocarcinoma de pulmón
Se realizaron experimentos para determinar si la presencia de histología con positividad para el FRa, según se detectó con el anticuerpo 26B3, estaba asociada a determinadas formas de cáncer de pulmón. Se evaluó una micromatriz de tejidos con muestras duplicadas de tejido pulmonar normal y canceroso en estadio I, II, III y IV para determinar la expresión del FRa mediante tinción IHQ con el anticuerpo 26B3, como se describe en el Ejemplo 7. Como se puede observar en los datos del Cuadro 6, el FRa se asocia a adenocarcinomas relacionados con carcinomas de células escamosas, los cuales mostraron una tinción positiva limitada.
Cuadro 7: Evaluación histológica de muestras de tejidos cancerosos
Tinción de membrana
Membrana positiva Total
Negativa
Positiva
Grupos histológicos
Adenocarcinoma Recuento % en cada grupo histológico 11 28,9 % 27 71,1 % 38 100,0 %
Escamoso
Recuento % en cada grupo histológico 28 90,3 % 3 9,7 % 31 100,0 %
Otros carcinomas
Recuento % en cada grupo histológico 17 81,0 % 4 19,0 % 21 100,0 %
Normal
Recuento % en cada grupo histológico 2 20,0 % 8 80,0 % 10 100,0 %
Total
Recuento % en cada grupo histológico 58 58,0 % 42 42,0 % 100 100,0 %
Se realizaron análisis adicionales en 89 de las muestras histológicas de la micromatriz de tejidos, de las que 36 (40 %) eran de adenocarcinoma, 32 (36 %) eran de carcinoma de células escamosas, 2 (2 %) eran de carcinomas adenoescamosos y las 19 (21%) restantes representaban diversas histologías (Cuadro 8). Las tasas globales de positividad para el FRa fueron sustancialmente distintas para cada subtipo histológico. Un porcentaje significativamente más elevado de tumores de adenocarcinoma mostraron positividad para el FRa en comparación con los carcinomas de células escamosas (72 % frente al 13 %, p < 0,0001). De las 4 muestras de carcinoma de células escamosas que se tiñeron, solo 1 mostró tinción con una intensidad de 3+ en ambas muestras; 1 mostró tinción con una intensidad moderada (2+) en ambas muestras; y las otras 2 se tiñeron débilmente en una sola muestra (5-10 % de las células tumorales mostraron una intensidad de 1 +). Además, las dos muestras de carcinoma adenoescamoso también mostraron positividad
para el FRa, y en estas muestras la tinción se restringió a la parte con adenocarcinoma (Figura 7). Cuadro 8: Distribución de la expresión del FRa entre los tipos de CPNM#
Variable
Con negatividad para el FRa (%) Con positividad para el FRa (%) Total Valor de p*
Histología del tumor
Normal
1 (10 %) 9 (90 %) 10
Carcinoma de células escamosas
28 (87 %) 4 (14 %) 32 <0,0001
Carcinoma de células grandes
3 (60 %) 2 (40 %) 5
Carcinoma de células pequeñas
7 (87 %) 1 (13 %) 8
Carcinoma neuroendocrino
4 (67 %) 2 (33 %) 6
Adenocarcinoma**
10 (16 %) 28 (74 %) 38
Grado del tumor
Grado 1
1 (20 %) 4 (80 %) 5
Grado 2
5 (22 %) 18 (78 %) 23
Grado 3
4 (40 %) 6 (60 %) 10 0,517
Estadio del tumor
Estadio I
4 (29 %) 11 (71 %) 15
Estadio II
2 (17 %) 10 (83 %) 12
Estadio III + IV***
4 (36) 7 (64) 11 0,563
Sexo
Hembra
3 (18 %) 14 (82 %) 17
Varón
7 (33 %) 14 (67 %) 21 0,46
5
#TMA de cáncer de pulmón de US Biomax (Lung Cancer TMA, n.° cat. BC041114; 90 casos, partes centrales duplicadas). * Los valores de p se determinaron mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de la x2: carcinoma de células escamosas frente a adenocarcinoma, p < 0,0001; varón frente a mujer, p = 0,46; estadio, p = 0,563; grado, p = 0,517.
** Incluye 2 casos de adenoescamoso, ambos con positividad para el FRa solamente en la parte con adenocarcinoma.
10 *** Solo un caso en estadio IV.
Los análisis de la puntuación M de las muestras histológicas de adenocarcinoma duplicadas mostraron escasas diferencias en lo que respecta a la tinción con el anticuerpo 26B3 (Figura 8), lo que indica la fiabilidad de la tinción con el anticuerpo 26B3. Además, un análisis de las puntuaciones M según el estadio y el grado en cada subtipo histológico de 15 adenocarcinoma indicó que ni el estadio ni el grado de la enfermedad estaban asociados al grado de tinción como se define mediante las puntuaciones M (los datos no se muestran).
La distribución de las puntuaciones M correspondientes a la tinción del FRa en muestras de adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas se muestra en la Figura 9. La puntuación M media (±SD) correspondiente a las 20 muestras de adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas teñidas con el anticuerpo 26B3 fueron 19,84 (± 18,64) y 1,39 (± 5,54), respectivamente (p<0,0001). La puntuación M correspondiente al adenocarcinoma también fue
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significativamente más elevada cuando se comparó con todos los demás tipos histológicos de cáncer de pulmón. Además, se realizó un análisis de árbol para determinar las posibilidades de que la histología del cáncer fuera adenocarcinoma. Una puntuación M >21,7 dio como resultado una razón de posibilidades (OR) igual a 16, lo que demuestra una vez más que el FRa se expresa predominantemente en la histología de adenocarcinoma (el análisis no se muestra).
Los bloques de tejido fijados en formol e incluidos en parafina (FFIP) raramente se pueden obtener de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón en estadio terminal, ya que no se suelen realizar resecciones quirúrgicas. Por lo tanto, se realizaron estudios para determinar la idoneidad de las muestras de aspirado con aguja fina (FNA) para el análisis IHQ del FRa con el AcM 26B3, ya que el cáncer de pulmón en estadio terminal se diagnostica con más frecuencia mediante biopsia pequeña o material citológico. Para estos estudios, las muestras se obtuvieron de nueve pacientes con adenocarcinoma en estadio terminal que habían sido diagnosticados mediante evaluación citológica de un aspirado de ganglios linfáticos torácicos (Figura 10), y se demostró que la tasa de positividad para el FRa (63 %) era similar a la observada en las muestras histológicas evaluadas de la tMa de cáncer de pulmón.
Aunque el tamaño de la muestra era pequeño, estos datos apuntan a que las muestras citológicas podrían constituir una fuente de tejido adecuada para determinar la expresión del FRa en pacientes con adenocarcinoma en estadio terminal.
EJEMPLO 14: El FRa se expresa en células CK+/CD45-, pero no en células CK-/CD45+, aisladas de la sangre de pacientes de los que se sabe que presentan carcinoma de pulmón no microcítico
Se realizaron estudios para determinar el perfil de expresión del FRa en células tumorales en circulación (CTC) de pacientes de los que se sabía que presentaban carcinoma de pulmón no microcítico
Para estos estudios, las muestras de sangre se obtuvieron de 15 donantes sanos y de 5 pacientes con cáncer de pulmón en estadio IV. Las muestras se concentraron para enriquecerlas en CTC mediante el sistema ApoCell's ApoSteam™. Tras el enriquecimiento, cada muestra se tiñó para determinar la presencia de citoqueratina (CK), CD45 (receptor tipo C de la proteína tirosina fosfatasa), núcleos y FRa.
La tinción del FRa se realizó con el anticuerpo 26B3 como anticuerpo primario, que a continuación se detectó con un anticuerpo secundario específico de ratón conjugado con DyLight® 649. Como se muestra en el Cuadro 9, la expresión del FRa se observó en cTc CK+/CD45-, pero no en CTC CK-/CD45+.
Cuadro 9 - Expresión del FRa en células tumorales en circulación de pacientes de los que se sabe que presentan carcinoma de pulmón no microcítico
Id. del paciente
Recuento de CK- /CD45+ CK-/CD45+/FRa+ (%) MFI del FRa (CK- /CD45+)
Paciente 1
2,270 0,0 No procede
Paciente 2
24,462 0,0 No procede
Paciente 3
26,503 0,0 No procede
Paciente 4
16,540 0,0 No procede
Paciente 5
2,652 0,0 No procede
Id. del paciente
Recuento de células CK+/CD45- en 7,5 ml CK+/CD45-/FRa+ (%) MFI del FRa (CK+/CD45-)
Paciente 1
55 15,6 82,195
Paciente 2
105 32,8 172,669
Paciente 3
216 9,3 146,521
Paciente 4
57 16,7 179,027
Paciente 5
47 8,1 277,335
EJEMPLO 15: Supervivencia a los 5 años de sujetos que presentan adenocarcinoma de pulmón con y sin expresión del FRa
Se realizaron experimentos para determinar si la presencia de histología con positividad para el FRa, según se detectó con el anticuerpo 26B3, se podía asociar a una mejor o peor supervivencia a los 5 años. Se analizaron mediante tinción
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30
35
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50
55
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IHQ, como se describe en el Ejemplo 7, muestras de tejido pulmonar, normal y canceroso, adenocarcinoma en estadio I o estadio II, y después se midieron los resultados. Se registró el porcentaje de cada intensidad de tinción (3+, 2+, 1 + y 0) en el tumor. Había 177 portaobjetos que se podían interpretar como duplicados o triplicados de un paciente. Cuando se combinaron con los datos clínicos e histológicos evaluables, se identificaron 53 casos evaluables. Los análisis se realizaron teniendo en cuenta los datos relativos al estado demográfico, clínico y de supervivencia 5 años tras el diagnóstico de adenocarcinoma de pulmón no microcítico.
Para determinar el valor de corte óptimo para la puntuación M se realizó un análisis de la curva de eficacia diagnóstica (ROC). La exactitud del diagnóstico no revistió importancia en este análisis; no obstante, la relación entre la relación de probabilidad diagnóstica de la prueba positiva frente a la relación de probabilidad diagnóstica de la prueba negativa sí que fue importante. Estas relaciones se definen según está descrito en el libro The statistical evaluation of medical tests for classification andprediction, de Pepe MS, New York: Oxford University Press (2003). Para un valor de corte de 10, la razón de posibilidades alcanzó un máximo de 6,62. Este valor de M se seleccionó para determinar la positividad de un corte teñido.
Las funciones de supervivencia de Kaplan-Meier se representaron con la asociación al FRa como factor pronóstico. Una prueba del rango logarítmico indicó que la positividad para el FRa era beneficiosa para acontecimientos no mortales (X2 = 7,34, df = l, p = 0,007). La Figura 11 muestra las funciones de supervivencia correspondientes a los grupos con adenocarcinoma en estadio I y II que se consideró que presentaban positividad para el FRa y para los que la detección del FRa con 26B3 fue negativa. A los 5 años el cociente de riesgos instantáneos es 2,42. Ello indica que los sujetos con tumores negativos para el FRa (M<10) tienen una probabilidad de morir en los 5 años que siguen al diagnóstico 2,5 veces mayor que los sujetos con tumores positivos para el FRa (M>10).
EJEMPLO 16: La expresión del receptor a del folato se asocia a formas de cáncer de mama triple negativo
Se realizaron estudios para evaluar la expresión del FRa en muestras de tejido de cáncer de mama. Los análisis se realizaron con muestras de la micromatriz de tejidos (TMA) teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7, y muestras histológicas FFIP preparadas y teñidas con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7.
La distribución de las histologías presentes en la TMA de cáncer de mama (U.S. BioMAX n.° cat. BR1503a; 72 casos, partes centrales duplicadas) se muestra en el Cuadro 10; la mayoría de los casos representados se identificaron como carcinoma ductal infiltrante (CDI). La TMA incluyó 2 muestras de mama normales, las cuales eran positivas para el FRa, según se determinó con el AcM 26B3. La tinción en las muestras de mama normales se limitó a las células ductales, con tinción de membrana y luminal. Dos de tres (67 %) casos de fibroadenoma, 0/2 (0 %) casos de sarcoma quístico y 1/6 (17 %) casos de carcinoma ductal localizado fueron positivos para el FRa. El carcinoma lobulillar infiltrante (CLI) único no mostró tinción del FRa. De las 59 muestras de CDI, 18 (31 %) fueron positivas para el FRa (Figura 12).
Dado el reducido número de casos positivos en esta TMA, no fue posible realizar un análisis válido de la expresión del FRa en función del estadio o grado; sin embargo, cabe señalar que la mayoría de las muestras eran de T1 o T2. Se demostró que la expresión del FRa estaba asociada a tumores negativos para el RE/RP en comparación con tumores positivos para el RE/RP (p = 0,012) y a cánceres de mama triple negativo (CMTN) (RE/RP+ o Her2+ frente a RE/RP/Her2-
, p < 0,0001).
De los 18 casos de CDI positivos para el FRa, solo 2 (11 %) fueron positivos para Her2, lo que significa que la gran mayoría (89 %) eran negativos para Her2. Estos datos apuntan a que la positividad para el FRa está más correlacionada con la negatividad para Her2. Además, de los l8 casos de CDI positivos para el FRa, 3 mostraron positividad para el receptor del estrógeno (Re) y 4 mostraron positividad para el receptor de la progesterona (RP), pero todos los casos con positividad para el RE/RP y/o positividad para el FRa fueron negativos para Her2. De los 18 casos de CDI positivos para el FRa, 12 (67 %) eran cánceres de mama triple negativo (CMTN), lo que apunta a que el FRa podría constituir un marcador y una diana para un subtipo molecular del CMTN con un pronóstico muy desfavorable. Si se examina la TMA en su conjunto, solo 2 (15 %) de los 13 casos con positividad para Her2 también mostraron positividad para el FRa, mientras que 16 (35 %) de los 46 casos con negatividad para Her2 también mostraron positividad para el FRa, lo que corrobora la hipótesis de que la expresión del FRa está correlacionada negativamente con la expresión de Her2. En la Figura 13 se muestra una representación de la distribución de las puntuaciones M para esta TMA en función del subtipo molecular (her-2 (+) y her-2 (-)).
La TMA descrita más arriba estaba compuesta principalmente por cánceres de mama en estadio temprano: estadio I, 6/60 (10 %); estadio II, 44/60 (73 %); estadio III, 10/60 (17 %). Por lo tanto, para confirmar y ampliar los resultados obtenidos en la TMA, se evaluaron 61 bloques de tejido FFIP de cánceres de mama negativos para Her2 en estadio IV (T4) cuya positividad para el RE/RP se conocía e iba del 0 al 100 % (los bloques de tejido FFIP se obtuvieron de los archivos de Genzyme Genetics). Todas estas 61 muestras eran de metástasis, y no de tumores primarios. Los resultados de este estudio se exponen en el Cuadro 11.
Cuadro 10: Distribución de la positividad para el FRa entre los tipos histológicos - datos de la TMA 5
Histología del tumor
Con positividad para el FRa N (%) Con negatividad para el FRa N (%) Total Valor de p*
Normal
2 (100 %) 0 (0 %) 2
Fibroadenoma
2 (67 %) 1 (33 %) 3
Sarcoma quístico
0 (0 %) 2 (100 %) 2
Carcinoma ductal localizado (CDL)
1 (17 %) 5 (83 %) 6
Carcinoma lobulillar infiltrante (CLI)
0 (0 %) 1 (100 %) 1
Carcinoma ductal infiltrante (CDI)
18 (31 %) 41 (69 %) 59
Carcinomas totales:
21 (30 %) 50 (70 %) 71
Análisis del subtipo molecular de CDI:
RE/RP+
4 (14 %) 24 (86 %) 28 —
RE/RP-
14 (45 %) 17 (55 %) 31 _ 0,012
Her2+
2 (15 %) 11 (85 %) 13 _
Her2-
16 (35 %) 30 (65 %) 46 0,307
RE/RP/Her2-
12 (67 %) 6 (33 %) 18 <0,0001
(RE/RP+ o Her2+ frente a RE/RP/Her2-)
T1
3 (43 %) 4 (57 %) 7
T2
10 (26 %) 29 (74 %) 39
T3
5 (63 %) 3 (37 %) 8
T4
0 (0 %) 5 (100 %) 5
N0
18 (35 %) 33 (65 %) 51 ~1
N1/N2**
0 (0 %) 8 (100 %) 8 J 0,092
5
10
15
20
25
30
35
Grado 1
1 (14 %) 6 (86 %) 7 —
Grado 2
12 (36 %) 21 (64 %) 33 J 0,393
Grado 3
5 (26 %) 14 (74 %) 19 0,6465
* Los valores de p se determinaron mediante un análisis de tablas de contingencia 2 x 2 utilizando la prueba exacta de Fisher.
** 4/8 (50 %) de las muestras N1/N2 eran Her2+.
Se encontró expresión del FRa (Figura 14) en 22/61 (36 %) de estos pacientes, lo que demuestra que el porcentaje de tumores/muestras positivas para el FRa determinado para el estadio temprano de la enfermedad se mantiene en el estadio terminal metastásico en una población con negatividad para Her2 (positividad en la TMA = 35 %; cáncer metastásico en estadio IV = 36 %). De los 22 pacientes con metástasis en estadio IV y con positividad para el FRa, solo 3 (14 %) mostraron positividad para el RE/RP, y dicha positividad tendía al intervalo bajo (de hasta el 30 %). Así pues, 19/22 (86 %) de los pacientes con positividad para el FRa pertenecían al subtipo molecular triple negativo. De nuevo, estos datos resultan favorables cuando se comparan con los datos obtenidos para el estadio temprano de la enfermedad en la TMA, donde el 67 % de los pacientes con positividad para el FRa pertenecían al subtipo triple negativo.
Cuadro 11: Distribución de la positividad para el FRa en subtipos moleculares de cáncer de mama metastásico
Subtipo de tumor molecular
Con positividad para el FRa N (%) Con negatividad para el FRa N (%) Total Valor de p*
Muestras totales:
22 (36 %) 39 (64 %) 61
RE/RP+
3 (14 %) 20 (86 %) 23
RE/RP/Her2-
19 (50 %) 19 (50 %) 38 0,0054 (RE/RP+ frente a RE/RP/Her2-)
Grado 1
3 (30 %) 7 (70 %) 10
Grado 2
11 (28 %) 28 (72 %) 39 1,0 (Grado 1 frente a grado 2)
Grado 3
8 (67 %) 4 (33 %) 12 0,037 (Grado 1 o 2 frente a grado 3)
* Los valores de p se determinaron mediante un análisis de tablas de contingencia 2 x 2 utilizando la prueba exacta de Fisher.
Además, las muestras de cáncer metastásico en estadio IV se obtuvieron de varios sitios con metástasis, incluidos los ganglios linfáticos, los huesos, la piel y el hígado, así como muestras de fluidos y aspirado con aguja fina (FNA) principalmente obtenidas de la pleura y mediante paracentesis. Varias de estas «biopsias fluidas» mostraron una tinción positiva para el FRa (Figura 15), lo que apunta a la aplicabilidad general del método de IHQ descrito a varios tipos de muestras.
EJEMPLO 17: Evaluación de la expresión del receptor a del folato en muestras histológicas de cánceres ginecológicos
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en neoplasias malignas ginecológicas de ovario, endometrio y trompas de Falopio. Los análisis se realizaron con muestras de la micromatriz de tejidos (TMA) teñidas con el anticuerpo 26B3, como se describe en el Ejemplo 7, y muestras histológicas FFIP preparadas y teñidas con el anticuerpo 26B3, como se describe en el Ejemplo 7. Las micromatrices de tejidos disponibles en el mercado se obtuvieron de US Biomax, Inc. (Rockville, MD) para los carcinomas de ovario (n.° cat. OV1921; 96 casos, partes centrales duplicadas); carcinomas de endometrio (n.° cat. EMC1021; 102 casos, partes centrales únicas); y carcinomas de las trompas de Falopio (n.° cat. UTE601; 30 casos, partes centrales duplicadas).
5
10
15
20
25
30
35
40
Se consideró que una muestra era positiva para la expresión del FRa si el porcentaje de células tumorales con tinción de membrana positiva era superior o igual al 5 % para cualquier intensidad.
Se rechazaban y por consiguiente, no se incluían en los análisis aquellas muestras que el patólogo ginecológico determinó que faltaban por completo o estaban formadas por tejido necrótico con un número insuficiente de células viables para evaluar. De las muestras de endometrio, seis contenían únicamente hiperplasia compleja atípica sin adenocarcinoma. La clasificación histológica del tipo celular y grado se realizó basándose en la “Clasificación de la OMS de las mamas y órganos genitales femeninos” (Tavassoli y Devilee). El fabricante de la TMA (US Biomax) aportó un estadiaje clínico basado en los sistemas FIGO y TNM.
La tasa de positividad para la expresión del FRa en un tipo determinado de tumor se calculó como el porcentaje de tumores con tinción positiva según la definición de un resultado positivo (±5 % de la membrana de las células tumorales se tiñe). Las diferencias en la positividad para el FRa entre grupos, como histologías, estadio o grado, se evaluaron mediante tablas de contingencia 2 x 2 y la prueba exacta de Fisher. Se consideró que las diferencias entre los valores medios eran estadísticamente distintas si el valor de p asociado a la prueba era menor que el error de tipo I ajustado por el método de Bonferroni para esa prueba (error de tipo I máximo = 0,05).
A la intensidad de tinción citoplasmática y de membrana se le asignó una puntuación de 0 si no había tinción; de 1+ si era débil; de 2+ si era moderada y de 3+ si era intensa. También se determinó el porcentaje de células para cada intensidad en la muestra. El tejido se analizó a un aumento de 4x, 10x, 20x y 40x. La tinción intensa (3+) de membrana se visualizaba fácilmente a un aumento de 4x y se confirmaba a 10x. La tinción moderada (2+) de membrana se visualizaba a un aumento de l0x y se confirmaba a 20x. La tinción débil (1+) requería un aumento de 20x o 40x (Figura 16). Para la tinción con una intensidad de 3+, la membrana era gruesa y se localizaba en los bordes celulares apicales y laterales. En los cortes tangenciales, se observa claramente una distribución periférica y completa (Figuras 16 (A) y (B)). La tinción de membrana con una intensidad de 2+ era más débil y fina que la de 3+, localizada normalmente en los bordes luminales apicales y a veces, en los bordes celulares laterales. La tinción de membrana con una intensidad de 1 + por lo general se limitaba a los bordes luminales. La tinción citoplasmática concomitante presentaba diferencias, dependiendo del tipo de tumor.
De las 94 muestras evaluables en la TMA de tumores de ovario, 70 (74 %) eran de tipo seroso, 10 (11 %) eran de tipo mucinoso, 4 (4 %) eran de tipo endometrioide, 3 (3 %) eran de células claras y las 7 (8 %) restantes eran de tumores raros variados. De las 87 muestras de carcinomas de ovario, la tasa de positividad para el FRa en cada tipo celular fue la siguiente: 100 % (70/70) eran de tipo seroso, 80 % (8/10) eran de tipo mucinoso, 75 % (3/4) eran de tipo endometrioide y 67 % (2/3) eran de células claras.
La diferencia entre los tipos seroso y mucinoso es significativa, con un valor de p igual a 0,014, obtenido con la prueba exacta de Fisher (Cuadro 12). El estado del FRa no fue significativo ni para el grado histológico ni para el estadio clínico. La tinción citoplasmática concomitante era de una intensidad normalmente de 2+ o 3+ en el tipo seroso y más débil y menos frecuente en otros tipos de tumores.
Cuadro 12: Distribución de la positividad para el FRa según el tipo histológico, el estadio clínico y el grado histológico en carcinomas de ovario
Histología del tumor*
Con negatividad para el FRa N (%) Con positividad para el FRa N (%) Total Valor de p**
Carcinoma seroso
0 (0 %) 70 (100 %) 70
Carcinoma mucinoso
2 (20 %) 8 (80 %) 10 0,014
Carcinoma endometrioide
1 (25 %) 3 (75 %) 4
Carcinoma de células claras
1 (33 %) 2 (67 %) 3
Total
4 (5 %) 83 (95 %) 87
Estadio II
4 (9 %) 41 (91 %) 45
Estadio III
0 (0 %) 29 (100 %) 29 0,15
Estadio IV
0 (0 %) 13 (100 %) 13
Grado 1
2 (15 %) 11 (85 %) 13 NS***
Grado 2
1 (3 %) 31 (97 %) 32 NS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Grado 3
1 (3 %) 39 (97 %) 40 NS
* 1 carcinoma de células de transición, 1 carcinoma de células escamosas, 1 carcinoma embrionario, 2 tumores de saco vitelino y 2 tumores de células de la granulosa no incluidos en el análisis.
** Los valores de p se determinaron mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de la x2: carcinoma seroso frente a carcinoma mucinoso, p = 0,014.
*** NS = no significativo.
En las muestras endometrioides, el FRa se expresó en el 80 % (4/5) de las normales (Figura 17(A)), el 100 % (6/6) de la hiperplasia atípica compleja (Figura 17(B)) y el 89 % (80/90) de adenocarcinomas, incluidos 88 de tipo endometrioide y 1 de células claras (Figuras 18 y 19). Ocho adenocarcinomas endometrioides contenían zonas de metaplasia escamosa. En el endometrio normal, la tinción de membrana era débil y se limitaba a los bordes luminales apicales (Figura 17(A)). En la hiperplasia atípica compleja y los carcinomas, la tinción era predominantemente luminal con tinción adicional en los bordes celulares laterales en algunos casos (Figura 17(B)). En los casos de tinción de membrana con una intensidad de 3+, la tinción citoplasmática era de intensa (Figura 18(A)) a débil (Figuras 18(B) y (C)). Las células tumorales con una tinción de membrana con una intensidad de 1+ o 2+ raramente mostraban tinción citoplasmática. La mayoría de las células escamosas metaplásicas y células claras mostraron una tinción de membrana de moderada a intensa. (Figuras 19(A) y (B)).
La expresión del FRa fue positiva en el 100 % de los tumores de grado 1, el 96 % de los de grado 2 y el 74 % de los de grado 3 (grado 1 frente a grado 3, valor de p = 0,0029; grado 2 frente a grado 3, p = 0,034). El estado del FRa no fue significativo en términos de T1 frente a T2/3, N0 frente a Nl, ni estadio I frente a estadio II/NI.
Diecisiete partes centrales de trompas de Falopio normales, 16 muestras de salpingitis crónica y 20 muestras de carcinomas serosos tubáricos mostraron una tinción intensa de la membrana y el citoplasma (Figuras 20 (A) a (C)).
EJEMPLO 18: Evaluación de la expresión del receptor a del folato en muestras histológicas colorrectales
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en muestras de tejido colorrectal. Los análisis se realizaron con muestras de una micromatriz de tejidos (TMA) que se obtuvo de US Biomax (n.° cat. BC051 111). La TMA contenía 90 muestras duplicadas de tejidos obtenidos de sujetos de los que se sabía que presentaban cáncer colorrectal y 10 muestras colorrectales normales. Las muestras se tiñeron con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7. De las 90 muestras obtenidas de los sujetos de los que se sabía que presentaban cáncer colorrectal, 18 (20 %) fueron positivas para la expresión del FRa, mientras que ninguna de las muestras normales fueron positivas. Además, la tinción positiva fue por lo general de moderada a débil, y no se observó ninguna relación obvia con el estadio de la enfermedad.
EJEMPLO 19: Evaluación de la expresión del receptor a del folato en muestras histológicas de tiroides
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para evaluar la expresión del FRa en muestras de tejido de tiroides. Los análisis se realizaron con muestras de una micromatriz de tejidos (TMA) que se obtuvo de US Biomax (n.° cat. TH802a). Las muestras se tiñeron con el anticuerpo 26B3 como se describe en el Ejemplo 7. El carcinoma papilar de tiroides se mostró intensamente positivo para la expresión del FRa en la membrana (26/28, 93 %) y se pudo distinguir del carcinoma medular, donde ninguna de las 5 muestras mostró tinción del FRa, lo que concuerda con informes anteriores. Resulta interesante que los adenomas foliculares se podían dividir en dos tipos, macrofolicular y microfolicular, los cuales mostraron una positividad para la expresión del FRa de 3/13 (23 %) y 18/22 (82 %), respectivamente. También se observó cierta positividad en el pequeño número de muestras de tumores de células de Hurthle (2/3, 67 %) y carcinoma folicular (3/7, 43 %) de esta TMA. Estos resultados se exponen en el Cuadro 13.
Cuadro 13 - Expresión del FRa en muestras de tejido de tiroides
Subtipo histológico de cáncer de tiroides (N = 78)
Con positividad para el FRa N (%) Con negatividad para el FRa N (%)
Carcinoma papilar, 28 (36 %)
26 (93 %) 2 (7 %)
Carcinoma medular, 5 (6 %)
0 (0 %) 5 (100 %)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Adenoma folicular de tipo macrofolicular, 13 (17 %)
3 (23 %) 10 (77 %)
Adenoma folicular de tipo microfolicular, 22 (28 %)
18 (82 %) 4 (18 %)
Tumor de células de Hurthle 3 (4 %)
2 (67 %) 1 (33 %)
Carcinoma folicular, 7 (9 %)
3 (43 %) 4 (57 %)
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.
<120> ANTICUERPOS FRENTE AL RECEPTOR ALFA DEL FOLATO Y USOS DE LOS MISMOS.
<130> MOR-0839
<140>
<141>
<150> 61/604,954 <151> 2012-02-29
<150> 61/604,412 <151> 2012-02-28
<150> 61/508,444 <151> 2011-07-15
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 257 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Leu
Tyr Arg Phe Asn Trp Asn Hi s Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85 90 95
Lys
Arg Hi s Phe Ile Gl n Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu
Gly Pro Trp Ile Gl n Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 12 5
Val
Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130 135 140
Asp
Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp Hi s Lys Gly Trp
145
150 155 160
Asn
Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro
Phe Hi s Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp
Thr Hi s Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys
Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210
215 220
Val
Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225
230 235 240
Ala
Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
245 250 255
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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Pro
Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
1
5 10 15
Arg
Ala Ser Ser Thr Val Ser Tyr Ser Tyr Leu Hi s Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys
Ser Gly Ala Ser Pro Gln Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu
35 40 45
Ala
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Tyr
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Tyr
65
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Tyr
Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Lys
Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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20
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30
35
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45
50
55
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Ile
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35 40 45
Ser
Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile
Ser
50 55 60
Ile
Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gl n Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser
65
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Val
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85 90 95
Ala
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Ala
100 105 110
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Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Q_ l/l <
115 120 12 5
Thr
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Pro
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1
5 10 15
Arg
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20 25 30
Tyr
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Ser
50 55 60
Arg
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Gly
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5
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Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 16 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: péptido sintético" <400> 16
Glu Glu Val Ala Asp Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 17 <211> 126 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polipéptido sintético" <400> 17
Gly
Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr
1
5 10 15
Ala
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Hi s Pro Tyr Met Hi s Trp Val Lys Gln
20 25 30
Arg
Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn
35 40 45
Gly
Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr
50 55 60
Ala
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr
65
70 75 80
Ser
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Glu Glu Val Ala Asp
85 90 95
Tyr
Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gl n Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
50
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
100 105 110
Ala Lys Thr
Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val
115
120 12 5
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Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Phe Leu Asn 1 5 10
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Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5
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Gln His Phe Ser Lys Leu Pro Trp Thr 1 5
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Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys 1 5 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Ser
Ala Ser Gl n Gly Ile Asn Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gl n Gl n Lys
20 25 30
Pro
Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Hi s
35 40 45
Ser
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
50 55 60
Ser
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Ile Tyr Tyr
65
70 75 80
Cys
Gl n Hi s Phe Ser Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
85 90 95
Leu
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105
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Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
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Glu Ile Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 1 5 10 15
Gly
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<221> fuente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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Glu Thr Thr Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5
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Ser
Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
1
5 10 15
Ala
Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
20 25 30
Gln
Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Gly Ser Gly
35 40 45
Gly
Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser
Arg Q_ l/l < Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Glu Met Ser Ser Leu
65
70 75 80
Arg
Ser Glu Q_ l/l < Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Thr Thr Ala
85 90 95
Gly
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gl n Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<221> fuente
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Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
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Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5
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<220>
<221> fuente
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Gln His His Tyr Ala Phe Pro Trp Thr 1 5
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<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
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Pro
Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys
1
5 10 15
Arg
Thr Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Gln
Gly Ile Ser Pro Gl n Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala
35 40 45
Glu
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe
50 55 60
Ser
Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gl n Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr
65
70 75 80
Cys
Gl n Hi s Hi s Tyr Ala Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys
85 90 95
Leu
Glu Ile Lys Arg Ala Q_ l/l < Ala Ala Pro
100 105
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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Gly Tyr Phe Met Asn 1 5
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<213> Secuencia artificial
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Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly
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Gly Thr His Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 33 <211> 128 <212> PRT
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<220>
<221> fuente
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Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15
Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Met Gln 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Ser
Hi s Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn
35 40 45
Gly
Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr
50 55 60
Val
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Hi s Met Glu Leu Arg Ser Leu Ala
65
70 75 80
Ser
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr Hi s Tyr Phe
85 90 95
Q_ l/l <
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
100 105 110
Thr
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln
Thr
115 120 12 5
<210> 34 <211> 36 <212> ADN
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agggccagct caactgtaag ttacagttac ttgcac
<210> 35 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 35
ggcacatcca acttggcttc t
<210> 36 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 36
cagcagtaca gtggttaccc actcacg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 37 <211> 323 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 37

ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggaa aaggtcacca tgacctgcag ggccagctca 60

actgtaagtt acagttactt gcactggtac cagcagaagt caggtgcctc cccccaactc 120

tggatttatg gcacatccaa cttggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 180

tctgggacct cttactctct cacaatcagc agtgtggagg ctgaagatgc tgccacttat 240

tactgccagc agtacagtgg ttacccactc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg 300

aaacgggctg atgctgcacc aac 323
<210> 38 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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agtggttatt actggaac 18
<210> 39 <211> 48 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 39
tacataaagt ccgacggtag caataattac aacccatctc tcaaaaat 48
<210> 40 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
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gagtggaagg ctatggacta c 21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 41

gagtcaggac ctggcctcgt gagaccttct cagtctctgt ctctcacctg ctctgtcact 60

ggctactcca tcaccagtgg ttattactgg aactggatcc ggcagtttcc aggaagcaga 120

ctggaatgga tgggctacat aaagtccgac ggtagcaata attacaaccc atctctcaaa 180

aatcgaatct ccatcactcg tgacacatct aagaaccagt ttttcctgaa gttgaattct 240

gtgactactg aggacacagc tacatatttc tgtacaaggg agtggaaggc tatggactac 300

tggggtcagg gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaaa caacaccccc atcagtctat 360

ccactggccc ctgggtgtgg agatacaac 389
<210> 42 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 42
agagccagtg aaagtgttga tacttatggc aataatttta tacac 45
<210> 43 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
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cttgcatcca acctagaatc t 21
<210> 44 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
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cagcaaaata atggggatcc gtggacg 27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 45 <211> 331 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 45

ccagcttctt tggctgtgtc tctagggcag agggccacca tatcctgcag agccagtgaa 60

agtgttgata cttatggcaa taattttata cactggtacc agcagaaacc aggacagcca 120

cccaaactcc tcatttatct tgcatccaac ctagaatctg gggtccctgc caggttcagt 180

ggcagtgggt ctaggacaga cttcaccctc accattgatc ctgtggaggc tgatgatgct 240

gcaacctatt actgtcagca aaataatggg gatccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag 300

ctggagatca aacgggctga tgctgcacca a 331
<210> 46 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 46
cacccctata tgcac 15
<210> 47 <211> 51 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 47
aggattgatc ctgcgaatgg taatactaaa tatgacccga agttccaggg c 51
<210> 48 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 48
gaggaggtgg cggactatac tatggactac 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<211> 380 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 49

ggggcagagc ttgtgaagcc aggggcctca gtcaagttgt cctgcacagc ttctggcttc 60

aacattaaac acccctatat gcactgggtg aagcagaggc ctgaccaggg cctggagtgg 120

attggaagga ttgatcctgc gaatggtaat actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag 180

gccactataa cagcagacac atcctccaac acagcctacc tacagctcag cagcctgaca 240

tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtggt agagaggagg tggcggacta tactatggac 300

tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcca aaacaacagc cccatcggtc 360

tatccactgg cccctgtgtg 380
<210> 50 <211> 33 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 50
agtgcaagtc agggcattaa caatttttta aac 33
<210> 51 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 51
tacacatcaa gtttacactc a 21
<210> 52 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 52
cagcacttta gtaagcttcc gtggacg 27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 53 <211> 320 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 53

acatcctccc tgtctgcctc tctgggagac agagtcacca tcagttgcag tgcaagtcag 60

ggcattaaca attttttaaa ctggtatcag cagaaaccag atggcactgt taaactcctg 120

atctattaca catcaagttt acactcagga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct 180

gggacagatt attctctcac catcagcaac ctggaacctg aagatattgc catatactat 240

tgtcagcact ttagtaagct tccgtggacg ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 300

cgggctgatg ctgcaccaac 320
<210> 54 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 54
agctatgcca tgtct 15
<210> 55 <211> 51 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 55
gaaattggta gtggtggtag ttacacctac tatccagaca ctgtgacggg c 51
<210> 56 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 56
gaaactacgg cgggctactt tgactac 27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<211> 336 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 57

tctgggggag gcttagtgag gcctggaggg tccctgaaac tctcctgtgc agcctctgga 60

ttcactttca gtagctatgc catgtcttgg gttcgccagt ctccagagaa gaggctggag 120

tgggtcgcag aaattggtag tggtggtagt tacacctact atccagacac tgtgacgggc 180

cgattcacca tctccagaga caatgccaag agcaccctgt acctggaaat gagcagtctg 240

aggtctgagg acacggccat ctattactgt gcaagggaaa ctacggcggg ctactttgac 300

tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336
<210> 58 <211> 33 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 58
cgaacaagtg agaatatttt cagttattta gca 33
<210> 59 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 59
aatgcaaaaa ccttagcaga g 21
<210> 60 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 60
caacatcatt atgcttttcc gtggacg 27
<210> 61 <211> 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 61

ccagcctccc tatctgcatc tgtgggagaa actgtcacca tcacatgtcg aacaagtgag 60

aatattttca gttatttagc atggtatcag cagaaacagg gaatatctcc tcagctcctg 120

gtctataatg caaaaacctt agcagagggt gtgccatcaa ggttcagtgg cagtggatca 180

ggcacacagt tttctctgaa gatcaacagc ctgcagcctg aagattttgg gagttattac 240

tgtcaacatc attatgcttt tccgtggacg ttcggtggag gctccaagct ggaaatcaaa 300

cgggctgatg ctgcaccaac 320
<210> 62 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 62
ggctacttta tgaac 15
<210> 63 <211> 51 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 63
cgtatttttc cttacaatgg tgatactttc tacaaccaga agttcaaggg c 51
<210> 64 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético" <400> 64
gggactcatt actttgacta c 21
<210> 65 <211> 386 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: polinucleótido sintético"
<400> 65

ggacctgagc tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatat cctgcaaggc ttctgattac 60

tcttttactg gctactttat gaactgggtg atgcagagcc atggaaagag ccttgagtgg 120

attggacgta tttttcctta caatggtgat actttctaca accagaagtt caagggcagg 180

gccacattga ctgtagacaa atcctctagc acagcccaca tggagctccg gagcctggca 240

tctgaggact ctgcagtcta tttttgtgca agagggactc attactttga ctactggggc 300

caaggcacca ctctcactgt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg 360

gcccctggat ctgctgccca aactaa 386
<210> 66 <211> 6 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: etiqueta 6xHis sintética" <400> 66
His His His His His His 1 5

Claims (50)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente a la secuencia del receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 27, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 28, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 30, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 31 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 32.
  2. 2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
  3. 3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 29, y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 33.
  4. 4. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa), donde la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 26, la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 27, la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 28, la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 30, la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.o ID: 31 y la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo codificado comprende la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 32.
  5. 5. El polinucleótido según la reivindicación 4, que comprende las secuencias nucleotídicas de las SEC. N.° ID: 61 y 65.
  6. 6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4, que comprende las secuencias nucleotídicas de la SEC. N.° ID: 58, la SEC. N.° ID: 59, la SEC. N.° ID: 60, la SEC. N.° ID: 62, la SEC. N.° ID: 63 y la SEC. N.° ID: 64.
  7. 7. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6.
  8. 8. Una célula recombinante que comprende el vector de la reivindicación 7.
  9. 9. La célula recombinante de la reivindicación 8, donde la célula es una célula eucariótica, una célula vegetal o una bacteria.
  10. 10. Un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11885.
  11. 11. Un método para detectar el receptor a del folato (FRa) o cáncer con expresión del FRa en una muestra biológica, que comprende exponer la muestra al anticuerpo de la reivindicación 1 o 10, o fragmento de unión al antígeno del mismo, y detectar el receptor a del folato (FRa).
  12. 12. El método de la reivindicación 11, donde la muestra biológica se obtiene a partir de un humano, roedor, primate no humano, conejo o perro.
  13. 13. Un método para diagnosticar cáncer con expresión del receptor a del folato en un sujeto, que comprende:
    a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo;
    b. determinar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra;
    c. comparar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra con un patrón conocido; y
    d. determinar si las concentraciones de receptor a del folato (FRa) en el sujeto se encuentran dentro del intervalo de concentraciones del receptor a del folato (FRa) asociadas al cáncer.
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  14. 14. El método de la reivindicación 13, donde un hallazgo de que las células de adenocarcinoma del sujeto expresan receptor a del folato indica que el sujeto tendrá una probabilidad más elevada de presentar una mejor tasa de supervivencia a los 5 años que si las células de adenocarcinoma no expresan receptor a del folato.
  15. 15. Un método para vigilar un cáncer con expresión del receptor a del folato en un sujeto, que comprende:
    a. exponer una muestra biológica del sujeto al anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo;
    b. determinar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra unido al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo;
    c. comparar la cantidad de receptor a del folato (FRa) presente en la muestra con
    i. un patrón conocido; o
    ii. una muestra biológica obtenida a partir del sujeto en el pasado; y
    d. determinar si la concentración de receptor a del folato (FRa) en el sujeto es indicativa de si el cáncer evoluciona, remite o se mantiene estable.
  16. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, donde la muestra biológica se deriva de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células en circulación, células tumorales en circulación, células no asociadas a tejidos, tejidos, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, muestras de aspirado con aguja fina o preparados histológicos.
  17. 17. El método de la reivindicación 13, donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal,
    cáncer endometrial, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer de ovario.
  18. 18. El método de la reivindicación 17, donde el cáncer es cáncer de pulmón.
  19. 19. El método de la reivindicación 18, donde el cáncer de pulmón es adenocarcinoma.
  20. 20. El método de la reivindicación 13, donde el patrón conocido comprende:
    a. concentraciones de receptor a del folato (FRa) procedentes de sujetos identificados como que no presentan cáncer o un preparado con proteína receptor a del folato a una concentración conocida;
    b. concentraciones de FRa procedentes de sujetos identificados como que presentan cáncer con expresión del receptor a del folato en estadio temprano;
    c. concentraciones de FRa procedentes de sujetos identificados como que presentan cáncer con expresión del receptor a del folato en estadio intermedio; o
    d. concentraciones de FRa procedentes de sujetos identificados como que presentan cáncer con expresión del receptor a del folato en estadio terminal.
  21. 21. El método de la reivindicación 20, donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de ovario o cáncer de pulmón.
  22. 22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, que además comprende, tras dicho paso de exposición, exponer la muestra biológica del sujeto a un segundo anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, seleccionado de entre:
    i. el anticuerpo de la reivindicación 1;
    ii. el anticuerpo de la reivindicación 10;
    iii. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la
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    SEC. N.0 ID: 10, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.0 ID: 11, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 12, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 14, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 15 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 16;
    iv. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11884;
    v. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 18, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 19, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 20, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 22, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 23 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 24;
    vi. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11886;
    vii. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 2, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 3, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 4, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 6, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 7 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 8; y
    viii. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11887;
    donde el segundo anticuerpo es distinto al primer anticuerpo.
  23. 23. El método de la reivindicación 22, donde la muestra biológica del sujeto está expuesta al anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o fragmento de unión al antígeno del mismo, y a continuación se expone a:
    a. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 10, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 11, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 12, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 14, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 15 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 16;
    b. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11884;
    c. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 18, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 19, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 20, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 22, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 23 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 24;
    d. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11886;
    e. un anticuerpo aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, específico frente al receptor a del folato (FRa) que comprende una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC.
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    N.0 ID: 2, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.0 ID: 3, una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 4, una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 6, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 7 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia aminoacídica de la SEC. N.° ID: 8;
    f. un anticuerpo aislado específico frente al receptor a del folato (FRa) producido por la estirpe celular depositada en la ATCC con número de acceso PTA-11887;
  24. 24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, donde el método se realiza tras el tratamiento anticancerígeno del sujeto.
  25. 25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24, donde el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, está marcado.
  26. 26. El método de la reivindicación 25, donde el marcaje es un marcaje radiactivo, un marcaje fluorescente, una etiqueta epitópica, biotina, un marcaje cromóforo, un marcaje EQL o una enzima.
  27. 27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24, donde el receptor a del folato (FRa) expuesto está o no unido a una célula.
  28. 28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 24, donde la presencia de receptor a del folato (FRa) en la muestra se detecta mediante transferencia de Western, inmunohistoquímica, citometría de flujo, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (EQLIA) o ELISA.
  29. 29. Un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica, que comprende al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
  30. 30. Un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica, que comprende:
    al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo;
    donde el anticuerpo incluido, o fragmento de unión al antígeno del mismo, está fijado a un soporte sólido.
  31. 31. Un kit para detectar la presencia de receptor a del folato (FRa) en una muestra biológica, que comprende:
    al menos un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 10, o un fragmento de unión al antígeno del mismo;
    donde el anticuerpo incluido, o fragmento de unión al antígeno del mismo, está marcado de manera que se puede detectar.
  32. 32. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la concentración de receptor a del folato (FRa) en el sujeto es indicativa del tipo de cáncer que padece el sujeto.
  33. 33. El método de la reivindicación 32, donde el cáncer es adenocarcinoma de pulmón o carcinoma de pulmón de células escamosas.
  34. 34. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 10, donde el anticuerpo está marcado de manera que se puede detectar.
  35. 35. El anticuerpo de la reivindicación 34, donde el marcaje detectable es un marcaje radiactivo, un marcaje fluorescente, una etiqueta epitópica, biotina, un marcaje cromóforo, un marcaje EQL o una enzima.
  36. 36. El anticuerpo de la reivindicación 35, donde el marcaje es rutenio, 111ln-DOTA, ácido 111In- dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y P-galactosidasa o polihistidina.
  37. 37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, donde el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, está
    fijado a un soporte sólido.
  38. 38. El método de la reivindicación 13 o 14, que además comprende la predicción de un desenlace clínico favorable para un sujeto que presenta adenocarcinoma con expresión del receptor a del folato (FRa), donde un desenlace 5 clínico favorable se define como una tasa de supervivencia a los 5 años más elevada.
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    imagen1
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    Marcador de peso molecular FRa (nativo)
    FRa (reducido y alquilado)
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    MAQRMTTQLL LLLVWVAWG EAQTRIAWAR TELLNVCMNA KHHKEKPGPE DKIHEQCRPW
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    RKNACCS
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    TNT SQEAHKDVSY LYRFNWNHCG EMAPACKRHF IQDTCLYECS PNLGPWIQQV
    130 140 150 160 170 180
    DQSWRKERVL NVPLCKEDCE QWWEDCRTSY TCKSNWHKGW NWTSGFNKCA VGAACQPFHF
    190 200 210 220 230 240
    YFPTPTVLCN EIWTHSYKIVS NYSRGSGRQI QMWFDPAQGN PNEEVARFYA AAMSGAGPWA
    250
    : (SEC. N.o ID: 1)
    Leyenda
    Residuos 1-24 (subrayado doble) = Secuencia de señal (no presente en rh-FRa) Residuos 41-53 (sombreado) = Epítopo del AcM 9F3 (PTA-11887)
    Residuos 68-80 y 92-105 (sombreado) = Epítopo del AcM 24F12 (PTA-11886) Residuos 199-209 (sombreado) = Epítopo del AcM 26B3 (PTA-11885)
    Residuos 236-257 (subrayado) = Secuencia de anclaje a GPI (no presente en rh-FRa)
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    imagen3
    é ¥ &
    $ 5 8 7 S
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    8N3,2
    IK26
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    2$-
    imagen6
    imagen7
    4
    9F3
    19D4
    24F12
    26B3
    imagen8
    Figura 4
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    imagen9
    imagen10
    Figura 5
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    imagen11
    Adenocarcinoma de CPNM: AcM 26B3 comparado con clon BN3.2
  39. 50.00
    •
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    Puntuación M de AcM 26B3
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    imagen13
    D
    imagen14
    Figura 8
    Puntuación M Parte central 2
    imagen15
    78
    p <0.0001
    imagen16
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    imagen17
    Figura 10
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    Funciones de supervivencia
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    Tiempo hasta la muerte o la censura (meses)
    T
  50. 40.00
    —f— 60 00
    Puntuación M cortada a 10 FRa negativo FRa positivo FRa negativo-censurado FRa positivo-censurado
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    Aumento
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    Figura 13
    Puntuación M
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    Figura 21
ES12736054.3T 2011-07-15 2012-07-13 Anticuerpos frente al receptor alfa del folato y usos de los mismos Active ES2663556T3 (es)

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