ES2749181T3 - Moléculas de anticuerpo anti-GCC y uso de las mismas para ensayar la susceptibilidad a una terapia dirigida a GCC - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente; y tres regiones determinantes de 5 complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27, 28 y 29, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de anticuerpo anti-GCC y uso de las mismas para ensayar la susceptibilidad a una terapia dirigida a GCC Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de y la prioridad para la Solicitud Provisional de Estados Unidos de N.° de Serie 61/639.376, presentada el 27 de abril de 2012.

Campo de la invención

La invención se refiere a moléculas anticuerpo que se unen a GCC, y a métodos para el uso de las mismas para seleccionar pacientes para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC, tal como un inmunoconjugado que contiene una molécula de anticuerpo anti-GCC, o un fragmento del mismo, conjugado con un agente tal como un agente terapéutico.

Antecedentes

La guanilil ciclasa C (“GCC”) es un receptor de superficie celular transmembrana que actúa en el mantenimiento del líquido intestinal, en la homeostasis de electrolitos y en la proliferación celular, véase, por ejemplo, Carrithers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 100: 3018-3020 (2003). La GCC se expresa en el revestimiento de las células de la mucosa del intestino delgado, del intestino grueso y del recto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). La expresión de la GCC se mantiene después de la transformación neoplásica de las células epiteliales intestinales, con expresión en todos los tumores colorrectales primarios y metastásicos (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)). En el documento WO 2011/050242 se desvelan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a la GCC.

Sumario

La materia objeto para la cual se solicita protección es tal como se define en las reivindicaciones. La divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos anticuerpos anti-GCC. Por consiguiente, en un aspecto, la invención presenta una molécula de anticuerpo anti-GCC, tal como se desvela en el presente documento. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC son útiles como moléculas de anticuerpo desnudas (que no son inmunoconjugados) y como componentes de inmunoconjugados. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención presenta inmunoconjugados que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento y un agente o marcador terapéutico. La invención también presenta métodos de uso de las moléculas de anticuerpo anti-GCC e inmunoconjugados descritos en el presente documento, por ejemplo, para la detección de GCC y de células o tejidos que expresan GCC. Dichos métodos son útiles, entre otras cosas, para el diagnóstico, el pronóstico, la obtención de imágenes o la estadificación de una enfermedad mediada por GCC. Por consiguiente, en algunos aspectos, la invención presenta métodos de identificación de un sujeto para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia con anticuerpos anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconjugado que comprenda un anticuerpo anti-GCC conjugado con un agente terapéutico. La invención también presenta un método de determinación in vitro o in vivo de un sujeto que tiene cáncer que es un posible candidato para una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en el presente documento.

Los anticuerpos anti-GCC, por ejemplo, los anticuerpos anti-GCC descritos en el presente documento, también son útiles, por ejemplo, para modular una actividad o función de una proteína GCC; y para el tratamiento de una enfermedad mediada por GCC, tal como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el tratamiento incluye adquirir conocimiento y/o evaluar una muestra o un sujeto para determinar los niveles de expresión de GCC, y si el sujeto expresa GCC, entonces se le administra una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en el presente documento. En otros aspectos, el método presenta la generación de un informe de tratamiento personalizado, por ejemplo, un informe de tratamiento dirigido por GCC, obteniendo una muestra de un sujeto y determinando los niveles de expresión de GCC, por ejemplo, mediante un método de detección descrito en el presente documento, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-GCC descrito en el presente documento, y basándose en la determinación, seleccionar un informe de tratamiento dirigido para el sujeto.

En otro aspecto, la invención también presenta ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican secuencias de aminoácidos de la molécula de anticuerpo anti-GCC, así como vectores y células hospedadoras que comprenden dichos ácidos nucleicos y métodos para la producción de moléculas de anticuerpo anti-GCC. En el presente documento también se presentan mezclas de reacción y kits que comprenden los anticuerpos anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconjugado, descrito en el presente documento, así como ensayos in vitro, por ejemplo, que comprenden un anticuerpo anti-GCC descrito en el presente documento, para detectar la expresión de g Cc .

Otras características, objetos y ventajas de la invención (o invenciones) desvelados en el presente documento serán evidentes a partir de la descripción, de los dibujos y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un mapa circular de un vector de expresión de proteína utilizado para generar un dominio extracelular (ECD) de la GCC humana (hGCC) de la proteína de fusión Fc de ratón (mFc) (hGCC-ECD-mFc) de la invención.

Las Figuras 2A-2D representan gráficos de barra que resumen la distribución de la puntuación H combinada/agregada (apical y citoplasmática) de la expresión de GCC en todos los tipos de tumores de pacientes con cáncer explorados para participar en el Estudio C26001, un ensayo clínico en Fase I de un inmunoconjugado dirigido por GCC. La Figura 2A representa la distribución de la puntuación H agregada combinada entre pacientes con cáncer colorrectal explorados; la Figura 2B representa la distribución de la puntuación H agregada combinada entre pacientes con cáncer gástrico explorados; la Figura 2C representa la distribución de la puntuación H agregada combinada entre pacientes con cáncer de páncreas explorados; la Figura 2D representa la distribución de la puntuación H agregada combinada entre pacientes con cáncer esofágico explorados.

Las Figuras 3A-3C representan gráficos de barra que resumen la distribución de la puntuación H combinada/agregada (apical y citoplasmática) de la expresión de GCC en varias micromatrices específicas de tumor que se exploraron. La Figura 3A representa la distribución de la puntuación H combinada/agregada entre muestras en diversas micromatrices de tumor colorrectal exploradas para detectar la expresión de GCC; la Figura 3B representa la distribución de la puntuación H combinada/agregada entre muestras en una micromatriz de tumor gástrico explorada para detectar la expresión de GCC; la Figura 3C representa la distribución de la puntuación H combinada/agregada entre muestras en varias micromatrices de tumor pancreático exploradas para detectar la expresión de GCC.

Descripción detallada

La guanilil ciclasa C (GCC) (también conocida como STAR, receptor de ST, GUC2C y GUCY2C) es un receptor de la superficie celular transmembrana que actúa en el mantenimiento del líquido intestinal, en la homeostasis de electrolitos y en la proliferación celular (Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci Estados Unidos.100: 3018-3020 (2003); Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466 (1997); Pitari et al., Proc Natl Acad Sci Estados Unidos.

100: 2695-2699 (2003)); N.° de Registro de GenBank NM_004963. Esta función está mediada a través de la unión de guanilina (Wiegand et al. FEBS Lett. 311:150-154 (1992)). La GCC es también un receptor de la enterotoxina termoestable (ST, por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos de NTFYCCELCCNPACAGCY, SEQ ID NO: 1) que es un péptido producido por E. coli, así como otros organismos infecciosos (Rao, M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93 (1985); Knoop F. C. and Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72 (1992)). La unión de la ST con la GCC activa una cascada de señal que da como resultado la enfermedad entérica, por ejemplo, diarrea. La secuencia de nucleótidos de la GCC humana (N.° de Registro de GenBank NM_004963; SEQ ID NO: 2):

1 gaccagagag aagcgtgggg aagagtgggc tgagggactc cactagaggc tgtccatctg 61 gattccctgc ctccctagga gcccaacaga gcaaagcaag tgggcacaag gagtatggtt 121 ctaacgtgat tggggtcatg aagacgttgc tgttggactt ggctttgtgg tcactgctct 181 tccagcccgg gtggctgtcc tttagttccc aggtgagtca gaactgccac aatggcagct 241 atgaaatcag cgtcctgatg atgggcaact cagcctttgc agagcccctg aaaaacttgg 301 aagatgcggt gaatgagggg ctggaaatag tgagaggacg tctgcaaaat gctggcctaa 361 atgtgactgt gaacgctact ttcatgtatt cggatggtct gattcataac tcaggcgact 421 gccggagtag cacctgtgaa ggcctcgacc tactcaggaa aatttcaaat gcacaacgga 481 tgggctgtgt cctcataggg ccctcatgta catactccac cttccagatg taccttgaca 541 cagaattgag ctaccccatg atctcagctg gaagttttgg attgtcatgt gactataaag 601 aaaccttaac caggctgatg tctccagcta gaaagttgat gtacttcttg gttaactttt 661 ggaaaaccaa cgatctgccc ttcaaaactt attcctggag cacttcgtat gtttacaaga 721 atggtacaga aactgaggac tgtttctggt accttaatgc tctggaggct agcgtttcct 781 atttctccca cgaactcggc tttaaggtgg tgttaagaca agataaggag tttcaggata 841 tcttaatgga ccacaacagg aaaagcaatg tgattattat gtgtggtggt ccagagttcc 901 tctacaagct gaagggtgac cgagcagtgg ctgaagacat tgtcattatt ctagtggatc 961 ttttcaatga ccagtacttt gaggacaatg tcacagcccc tgactatatg aaaaatgtcc 1021 ttgttctgac gctgtctcct gggaattccc ttctaaatag ctctttctcc aggaatctat 1081 caccaacaaa acgagacttt gctcttgcct atttgaatgg aatcctgctc tttggacata 1141 tgctgaagat atttcttgaa aatggagaaa atattaccac ccccaaattt gctcatgctt 1201 tcaggaatct cacttttgaa gggtatgacg gtccagtgac cttggatgac tggggggatg 1261 ttgacagtac catggtgctt ctgtatacct ctgtggacac caagaaatac aaggttcttt 1321 tgacctatga tacccacgta aataagacct atcctgtgga tatgagcccc acattcactt 1381 ggaagaactc taaacttcct aatgatatta caggccgggg ccctcagatc ctgatgattg 1441 cagtcttcac cctcactgga gctgtggtgc tgctcctgct cgtcgctctc ctgatgctca 1501 gaaaatatag aaaagattat gaacttcgtc agaaaaaatg gtcccacatt cctcctgaaa 1561 atatctttcc tctggagacc aatgagacca atcatgttag cctcaagatc gatgatgaca 1621 aaagacgaga tacaatccag agactacgac agtgcaaata cgacaaaaag cgagtgattc 1681 tcaaagatct caagcacaat gatggtaatt tcactgaaaa acagaagata gaattgaaca 1741 agttgcttca gattgactat tacaacctga ccaagttcta cggcacagtg aaacttgata 1801 ccatgatctt cggggtgata gaatactgtg agagaggatc cctccgggaa gttttaaatg 1861 acacaatttc ctaccctgat ggcacattca tggattggga gtttaagatc tctgtcttgt 1921 atgacattgc taagggaatg tcatatctgc actccagtaa gacagaagtc catggtcgtc 1981 tgaaatctac caactgcgta gtggacagta gaatggtggt gaagatcact gattttggct 2041 gcaattccat tttacctcca aaaaaggacc tgtggacagc tccagagcac ctccgccaag 2101 ccaacatctc tcagaaagga gatgtgtaca gctatgggat catcgcacag gagatcatcc 2161 tgcggaaaga aaccttctac actttgagct gtcgggaccg gaatgagaag attttcagag 2221 tggaaaattc caatggaatg aaacccttcc gcccagattt attcttggaa acagcagagg 2281 aaaaagagct agaagtgtac ctacttgtaa aaaactgttg ggaggaagat ccagaaaaga 2341 gaccagattt caaaaaaatt gagactacac ttgccaagat atttggactt tttcatgacc 2401 aaaaaaatga aagctatatg gataccttga tccgacgtct acagctatat tctcgaaacc 2461 tggaacatct ggtagaggaa aggacacagc tgtacaaggc agagagggac agggctgaca 2521 gacttaactt tatgttgctt ccaaggctag tggtaaagtc tctgaaggag aaaggctttg 2581 tggagccgga actatatgag gaagttacaa tctacttcag tgacattgta ggtttcacta 2641 ctatctgcaa atacagcacc cccatggaag tggtggacat gcttaatgac atctataaga 2701 gttttgacca cattgttgat catcatgatg tctacaaggt ggaaaccatc ggtgatgcgt 2761 acatggtggc tagtggtttg cctaagagaa atggcaatcg gcatgcaata gacattgcca 2821 agatggcctt ggaaatcctc agcttcatgg ggacctttga gctggagcat cttcctggcc 2881 tcccaatatg gattcgcatt ggagttcact ctggtccctg tgctgctgga gttgtgggaa 2941 tcaagatgcc tcgttattgt ctatttggag atacggtcaa cacagcctct aggatggaat 3001 ccactggcct ccctttgaga attcacgtga gtggctccac catagccatc ctgaagagaa 3061 ctgagtgcca gttcctttat gaagtgagag gagaaacata cttaaaggga agaggaaatg 3121 agactaccta ctggctgact gggatgaagg accagaaatt caacctgcca acccctccta 3181 ctgtggagaa tcaacagcgt ttgcaagcag aattttcaga catgattgcc aactctttac 3241 agaaaagaca ggcagcaggg ataagaagcc aaaaacccag acgggtagcc agctataaaa 3301 aaggcactct ggaatacttg cagctgaata ccacagacaa ggagagcacc tatttttaaa Secuencia de aminoácidos de la GCC humana (N.° de Registro de GenPept NP_004954; SEQ ID NO: 3):

¹ mktllldlal wsllfqpgwl sfssqvsqnc hngsyeisvl mmgnsafaep lknledavne

61 gleivrgrlq naglnvtvna tfmysdglih nsgdcrsstc egldllrkis naqrmgcvli

121 gpsctystfq myldtelsyp misagsfgis cdyketltrl msparklmyf lvnfwktndl

181 pfktyswsts yvykngtete dcfwylnale asvsyfshel gfkvvlrqdk efqdilmdhn

241 rksnviimcg gpeflyklkg dravaedivi ilvdlfndqy fednvtapdy mknvlvltls

301 pgnsllnssf srnlsptkrd falaylngil lfghmlkif1 engenittpk fahafrnltf

361 egydgpvtld dwgdvdstmv llytsvdtkk ykvlltydth vnktypvdms ptftwknskl

421 pnditgrgpq ilmiavftlt gavvllllva llmlrkyrkd yelrqkkwsh ippenifple

481 tnetnhvslk idddkrrdti qrlrqckydk krvilkdlkh ndgnftekqk ielnkllqid

541 yynltkfygt vkldtmifgv ieycergslr evlndtisyp dgtfmdwefk isvlydiakg

601 msylhsskte vhgrlkstnc vvdsrmvvki tdfgcnsilp pkkdlwtape hlrqanisqk

661 gdvysygiia qeiilrketf ytlscrdrne kifrvensng mkpfrpdlf1 etaeekelev

721 yllvkncwee dpekrpdfkk iettlakifg lfhdqknesy mdtlirrlql ysrnlehlve

781 ertqlykaer dradrlnfml lprlvvkslk ekgfvepely eevtiyfsdi vgfttickys

841 tpmevvdmln diyksfdhiv dhhdvykvet igdaymvasg lpkrngnrha idiakmalei

901 lsfmgtfele hlpglpiwir igvhsgpcaa gvvgikmpry clfgdtvnta srmestglpl

961 rihvsgstia ilkrtecqf1 yevrgetylk grgnettywl tgmkdqkfnl ptpptvenqq

1021 rlqaefsdmi anslqkrqaa girsqkprrv asykkgtley lqlnttdkes _tyf

La proteína GCC tiene algunos dominios generalmente aceptados, cada uno de los cuales contribuye a una función distinguible en la molécula GCC. Las partes de GCC incluyen una secuencia señal (para dirigir la proteína a la superficie celular) desde el resto de aminoácido 1 a aproximadamente el resto 23, o del resto 1 a aproximadamente el resto 21 de la SEQ ID NO: 3 (escindido para la maduración para producir la proteína madura funcional a partir de los restos de aminoácidos 22 o 24 al 1073 de la SEQ ID NO: 3), un dominio extracelular para la unión del ligando, por ejemplo, guanilina o ST, a partir de aproximadamente el resto de aminoácido 24 a aproximadamente el resto de aminoácido 420, o aproximadamente del resto 54 a aproximadamente el resto 384 de la SEQ ID NO: 3, un dominio transmembrana de aproximadamente el resto de aminoácido 431 a aproximadamente el resto 454, o de aproximadamente el resto 436 a aproximadamente el resto 452 de la SEQ ID NO: 3, un dominio de homología a cinasa, que se prevé que tiene actividad tirosina cinasa desde aproximadamente el resto de aminoácido 489 a aproximadamente el resto 749, o de aproximadamente el resto 508 a aproximadamente el resto 745 de la SEQ ID NO: 3 y un dominio catalítico de guanilil ciclasa de aproximadamente el resto 750 a aproximadamente el resto 1007, o de aproximadamente el resto 816 a aproximadamente el resto 1002 de la SEQ ID NO: 3.

En tejidos humanos normales, la GCC se expresa en las células de la mucosa, por ejemplo, en las membranas del borde del cepillo apical, en el recubrimiento del intestino delgado, en intestino grueso y en el recto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). La expresión de GCC se mantiene después de la transformación neoplásica de las células epiteliales intestinales, con expresión en todos los tumores colorrectales primarios y metastásicos (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)). Las células neoplásicas del estómago, del esófago y la unión gastroesofágica también expresan GCC (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.767.704; Debruyne et al. Gastroenterology 130: 1191-1206 (2006)). La expresión específica de tejido y la asociación con cáncer, por ejemplo, de origen gastrointestinal, (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de esófago o cáncer de intestino delgado), pueden aprovecharse para el uso de GCC como un marcador de diagnóstico para estas enfermedades (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005)). Adicionalmente, tal como se demuestra en los Ejemplos del presente documento, se ha observado que diversos tipos diferentes de cáncer de origen no gastrointestinal expresan GCC, incluyendo pero sin limitación, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, sarcomas de tejido blando (por ejemplo, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma) tumores gastrointestinales o broncopulmonares neuroendocrinos y tumores neuroectodérmicos.

Como una proteína de la superficie celular, la GCC también puede servir como una diana de diagnóstico o terapéutica para proteínas de unión a receptores tales como anticuerpos o ligandos. En tejido intestinal normal, la GCC se expresa en el lado apical de las uniones herméticas de las células epiteliales que forman una barrera impermeable entre el entorno luminal y el compartimento vascular (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873); Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026 (1987)). Como tal, la administración intravenosa sistémica de una proteína de unión a GCC terapéutica tendrá un efecto mínimo sobre los receptores intestinales de GCC, a la vez que tienen acceso a las células neoplásicas del sistema gastrointestinal, incluyendo células de cáncer de colon invasivo o metastásico, tumores de colon extraintestinal o metastásico, tumores esofágicos o tumores de estómago, adenocarcinoma en la unión gastroesofágica. Adicionalmente, la GCC se internaliza a través de endocitosis mediada por receptor después de la unión con el ligando (Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995)).

Los anticuerpos policlonales suscitados contra el dominio extracelular de GCC (Nandi et al. Protein Expr. Purif.

8:151-159 (1996)) fueron capaces de inhibir la unión del péptido ST (enterotoxina termoestable ) con la GCC humana y de rata y de inhibir la producción de cGMP, mediada por ST, a través de la GCC humana.

La GCC se ha caracterizado como una proteína implicada en cánceres, incluyendo cánceres de colon. Véase también, Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995). Las moléculas de anticuerpo dirigidas contra GCC pueden por tanto utilizarse solas en forma no conjugada para inhibir células cancerosas que expresan GCC. Adicionalmente, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra GCC pueden utilizarse desnudas o marcadas, para detectar células cancerosas que expresan GCC. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC de la invención pueden unirse a la GCC humana. En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención puede inhibir la unión de un ligando, por ejemplo, guanilina o enterotoxina termoestable con GCC. En otras realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención no inhibe la unión de un ligando, por ejemplo, guanilina o enterotoxina termoestable con GCC.

Los anticuerpos monoclonales específicos de GCC incluyen GCC:B10 (Nandi et al., J. Cell. Biochem. 66:500-511 (1997)), GCC:4D7 (Vijayachandra et al. Biochemistry 39:16075-16083 (2000)) y GCC:C8 (Bakre et al. Eur. J. Biochem. 267:179-187 (2000)). GCC:B10 tiene una cadena ligera kappa y un isotipo IgG2a y reacciona en cruzado con la GCC de rata, de cerdo y de mono. GCC:B10 se une a los 63 primeros aminoácidos del dominio intracelular de GCC, específicamente a los restos 470-480 de la SEQ ID NO: 3 (Nandi et al. Protein Sci. 7:2175-2183 (1998)). GCC:4D7 se une al dominio de homología cinasa, dentro de los restos 491-568 de GCC (Bhandari et al. Biochemistry 40:9196-9206 (2001)). GCC:C8 se une al dominio de tipo proteína cinasa en la parte citoplasmática de GCC.

Definiciones

A menos que se defina de otra manera en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tienen los significados que normalmente entienden los expertos en la materia. Generalmente, la nomenclatura utilizada en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos e hibridación descritas en el presente documento son conocidas por los expertos en la materia. Los números de registro de GenBank o de GenPept y las secuencias de ácidos nucleicos y péptidos útiles pueden encontrarse en el sitio web mantenido por el National Center for Biotechnological Information, Bethesda Md. Se utilizan técnicas convencionales para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y la transformación y transfección de cultivo tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realizan habitualmente en la técnica o como se describen en el presente documento. Las siguientes técnicas y procedimientos se realizan generalmente según los métodos conocidos en la materia, por ejemplo, tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)) o véase en líneas generales, Harlow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, descritas en el presente documento se conocen en la materia. Además, salvo que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de anticuerpo” se refiere a un anticuerpo, a uno o varios péptidos de anticuerpo o inmunoglobulina, o a un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores, por ejemplo, de un anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo incluyen moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, scFv, véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883), y moléculas de anticuerpo de dominio sencillo, véase, por ejemplo, el documento WO9404678. Aunque no dentro de la expresión “moléculas de anticuerpo”, la invención también incluye “uno o más análogos de anticuerpo”, “armazones basados en proteínas de moléculas que no son anticuerpo”, por ejemplo, proteínas de fusión y/o inmunoconjugados que utilizan las CDR para proporcionar unión a antígeno específica.

Una “molécula de anticuerpo anti-GCC” se refiere a una molécula de anticuerpo (es decir, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo o un análogo de anticuerpo) que interacciona con o reconoce, por ejemplo, se une (por ejemplo, se une específicamente) a GCC, por ejemplo, a GCC humana. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC ejemplares son las que se resumen en las Tablas 1 y 2.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo”, la expresión “uno o más péptidos de anticuerpo” o “inmunoglobulina” se refiere a proteínas y glicoproteínas monocatenarias, bicatenarias y multicatenarias. El término anticuerpo incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, injertados con CDR humanos y humanizados, todo ello se analiza con más detalle en cualquier parte del presente documento. También se incluyen en el término los anticuerpos de camélidos, véase, por ejemplo, el documento US2005/0037421, y nanocuerpos, por ejemplo, IgNAR (anticuerpos de tiburón), véase, por ejemplo, el documento WO03/014161. El término “anticuerpo” también incluye variantes sintéticas y modificadas genéticamente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “fragmento de anticuerpo” o “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo se refiere, por ejemplo, a los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de cadena pesada funcionales (nanocuerpos), así como cualquier parte de un anticuerpo que tenga especificidad hacia al menos un epítopo deseado, que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica (por ejemplo, un fragmento que tiene secuencias CDR suficientes y que tiene secuencias estructurales suficientes para unirse específicamente a un epítopo). Por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno puede competir por la unión con un epítopo que se une al anticuerpo del cual deriva el fragmento. Deriva, como se usa en este contexto y en contextos similares, no implica ningún método particular o proceso de derivación, sino que puede referirse exclusivamente a una similitud de secuencia. Los fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas recombinantes, o mediante escisión enzimática o química de un anticuerpo intacto. La expresión, fragmento de unión a antígeno, cuando se usa con una sola cadena, por ejemplo, una cadena pesada de un anticuerpo que tiene una cadena ligera y pesada, significa que el fragmento de la cadena es suficientemente tal que cuando se empareja con una región variable completa de la otra cadena, por ejemplo, la cadena ligera, permite la unión de al menos el 25, 50, 75, 85 o 90 % de lo que se observa con toda la región variable de cadena pesada y ligera.

La expresión “constelación de unión a antígeno de CDR2 o “un número de CDR suficiente para permitir la unión” (y frases similares), tal como se usa en el presente documento, se refiere a CDR suficientes de una cadena, por ejemplo, la cadena pesada, de tal manera que cuando se coloca en una estructura y se empareja con una región variable completa de la otra cadena, o con una parte de la región variable de la otra cadena de longitud similar y que tiene el mismo número de CDR, por ejemplo, la cadena ligera, permitirá la unión, por ejemplo, de al menos el 25, 50, 75, 85 o 90 % de lo que se observa con toda la región variable pesada y ligera.

Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que deriva de un anticuerpo no humano, por ejemplo, conejo, roedor (por ejemplo, murino), oveja o cabra, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo originario pero que es menos inmunogénico en seres humanos. Humanizado como se usa en el presente documento pretende incluir anticuerpos desinmunizados. Normalmente, los anticuerpos humanizados incluyen CDR no humanas y estructuras humanas o derivadas de humano y regiones constantes.

La expresión anticuerpo “modificado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpo recombinante, anticuerpos aislados de un animal no humano (por ejemplo, un conejo, un ratón, una rata, una oveja o una cabra) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de a Dn . Dichos anticuerpos modificados incluyen anticuerpos humanizados, con injertos de CDR (por ejemplo, un anticuerpo que tiene las CDR de un primer anticuerpo y una región estructural de diferente origen, por ejemplo, de un segundo anticuerpo o una región estructural consenso), quiméricos, generados in vitro (por ejemplo, por presentación en fagos) y opcionalmente pueden incluir regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana o genes o anticuerpos de inmunoglobulina humana que se han preparado, expresado, creado o aislado mediante cualquier medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con secuencias de inmunoglobulina alternativas. En realizaciones, una molécula de anticuerpo modificada incluye una molécula de anticuerpo que tiene un cambio en la secuencia a partir de un anticuerpo de referencia.

La expresión “anticuerpo monoespecífico” se refiere a un anticuerpo o a una preparación de anticuerpos que presenta una especificidad y afinidad de unión sencilla por un epítopo particular. Esta expresión incluye un “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”.

La expresión “anticuerpo biespecífico” o “anticuerpo bifuncional” se refiere a un anticuerpo que presenta especificidad de unión doble por dos epítopos, en el que cada sitio de unión difiere y reconoce un epítopo diferente.

Las expresiones “anticuerpo no conjugado” y “anticuerpo desnudo” se utilizan indistintamente para referirse a una molécula de anticuerpo que no está conjugada con una fracción que no es de anticuerpo, por ejemplo, un agente o un marcador.

Cada uno de los términos “inmunoconjugado”, “conjugado de anticuerpo-fármaco” y “conjugado de anticuerpo” se usan indistintamente y se refieren a un anticuerpo que está conjugado con una fracción de no anticuerpo, por ejemplo, un agente o un marcador. El término “agente” se utiliza en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto fabricado a partir de materiales biológicos. La expresión “agente terapéutico” se refiere a un agente que tiene actividad biológica. Los agentes terapéuticos ejemplares son agentes quimioterapéuticos.

La expresión “agente contra el cáncer” o “agente quimioterapéutico” se utiliza en el presente documento para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o progresión de una neoplasia en un ser humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. La inhibición de la metástasis o angiogénesis es frecuentemente una propiedad de agentes contra el cáncer o quimioterapéuticos. Un agente quimioterapéutico puede ser un agente citotóxico o citostático. La expresión “agente citostático” se refiere a un agente que inhibe o suprime el crecimiento celular y/o la multiplicación de células.

“Agentes citotóxicos” se refiere a compuestos que causan principalmente la muerte celular interfiriendo directamente con el funcionamiento de la célula, incluyendo, pero sin limitación, agentes alquilantes, inhibidores del factor de necrosis tumoral, intercalantes, inhibidores del microtúbulo, inhibidores de cinasa, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasa. Una “carga tóxica” como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad suficiente de agente citotóxico que, cuando se suministra a una célula produce la muerte celular. El suministro de una carga tóxica puede realizarse mediante la administración de una cantidad suficiente de inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la invención y un agente citotóxico. El suministro de una carga tóxica también puede realizarse mediante la administración de una cantidad suficiente de un inmunoconjugado que comprende un agente citotóxico, en el que el inmunoconjugado comprende un anticuerpo secundario o un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce y se une a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención.

Como se usa en el presente documento la frase, una secuencia “derivada de” o “específica para una secuencia diseñada” se refiere a una secuencia que comprende una secuencia contigua y aproximadamente al menos 6 nucleótidos o de al menos 2 aminoácidos, al menos aproximadamente 9 nucleótidos o al menos 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos o 4 aminoácidos, o al menos aproximadamente 15-21 nucleótidos o 5-7 aminoácidos correspondientes, es decir, idénticas o complementarias a, por ejemplo, una región contigua de la secuencia diseñada. En determinadas realizaciones, la secuencia comprende toda de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos diseñada. La secuencia puede ser complementaria (en el caso de una secuencia de polinucleótidos) o idéntica a una región de secuencia que es única a una secuencia particular tal como se determina mediante técnicas conocidas en la materia. Las regiones a partir de las cuales pueden derivar las secuencias, incluyen pero sin limitación, regiones que codifican epítopos específicos, regiones que codifican las CDR, regiones que codifican secuencias estructurales, regiones que codifican regiones de domino constante, regiones que codifican regiones de dominio variable, así como regiones no traducidas y/o no transcritas. La secuencia no derivará necesariamente físicamente de la secuencia de interés que se está estudiando, sino que puede generarse de cualquier manera, incluyendo pero sin limitación, síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, que se basa en la información proporcionada por la secuencia de bases en la región o regiones a partir de la cual deriva el polinucleótido. Como tal, puede representar bien una orientación en sentido o antisentido de un polinucleótido original. Además, las combinaciones de regiones correspondientes a la de la secuencia diseñada pueden modificarse o combinarse de maneras conocidas en la técnica que son coherentes con el uso que se pretende. Por ejemplo, una secuencia puede comprender dos o más secuencias contiguas que comprenden cada una de ellas parte de una secuencia diseñada, y se interrumpen con una región que no es idéntica a la secuencia diseñada pero que pretende representar una secuencia derivada de la secuencia diseñada. Con respecto a las moléculas de anticuerpo “derivado del mismo” incluye una molécula de anticuerpo que está funcional o estructuralmente relacionada con un anticuerpo de comparación, por ejemplo, “derivada de la misma” incluye una molécula de anticuerpo que tiene similar o sustancialmente la misma secuencia o estructura, por ejemplo, que tiene la misma o similar CDR, región estructural o regiones variables. “Derivada de la misma” para un anticuerpo también incluye restos, por ejemplo, uno o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos, que pueden o no ser contiguos, pero se definen o identifican en consonancia con un esquema de numeración u homología con una estructura de anticuerpo general o proximidad tridimensional, es decir, dentro de una CDR o una región estructural conservada, de una secuencia de comparación. La expresión “derivada de la misma” no se limita a físicamente derivada de la misma sino que incluye la generación de cualquier manera, por ejemplo, mediante el uso de información de secuencias a partir de un anticuerpo de comparación para diseñar otro anticuerpo.

Tal como se usa en el presente documento, la frase “codificado por” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos, en la que la secuencia de polipéptidos, o una parte de la misma, contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 a 5 aminoácidos, al menos 8 a 10 aminoácidos o al menos 15 a 20 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “cáncer colorrectal” también conocido actualmente como cáncer de colon o cáncer intestinal, se refiere a un cáncer de crecimiento celular no controlado en el colon o recto (partes del intestino delgado) o en el apéndice.

Las expresiones “cáncer de estómago” y “cáncer gástrico” se usan indistintamente en el presente documento.

Los cálculos de “homología” entre dos secuencias pueden realizarse de la siguiente manera. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden ignorarse para fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos el 30 %, 40 % o 50 %, al menos el 60 %, o al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o en las posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento la “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de idénticas posiciones compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que debe introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático. El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácido puede determinarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), que se ha incorporado en el programa GAP del paquete del programa informático GCG, utilizando bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse utilizando el programa GAP del paquete informático GCG (Accelerys, Inc. San Diego, Calif.), utilizando NWSgapdna. La matriz CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 u 80, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros ejemplar para la determinación de la homología es la matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por cambio de hueco de 5.

Tal como se usa en el presente documento, la frase “hibrida en condiciones rigurosas” describe condiciones de hibridación y de lavado. En Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 puede encontrarse una guía para realizar reacciones de hibridación. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y puede usarse cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación específicas a las que se refiere el presente documento son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados en SSC a 0,2X, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentar a 55 °C para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC a 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC a 0,2X, SDS al 0,1 % a 60 °C; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en SSC a 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC a 0,2X, SDS al 0,1 % a 65 °C; y 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados en SSC a 0,2X, SDS al 1 % a 65 °C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) a menudo son condiciones preferidas y las que deben utilizarse a menos que se especifique otra cosa.

Debe entenderse que los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden tener sustituciones de aminoácido conservativas o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial sobre las funciones del polipéptido. Se puede determinar si se tolerará o no una sustitución particular, es decir, si no afectará adversamente a las propiedades biológicas, tales como actividad de unión, tal y como se describe en Bowie, J U et al. Science 247:1306-1310 (1990) o Padlan et al. FASEB J. 9:133-139 (1995). Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales betaramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que puede alterarse de la secuencia de tipo silvestre del agente de unión, por ejemplo, el anticuerpo, sin anular o sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido “esencial” da como resultado dicho cambio. En un anticuerpo, un resto de aminoácido esencial puede ser un resto determinante de especificidad (SDR).

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a material que se retira de su entorno natural (por ejemplo, el entorno natural de si se produce de forma natural). Por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de todo o de parte de los materiales coexistentes en el sistema natural está aislado. Dicho polinucleótido o polipéptido podría formar parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría formar parte de una composición, por ejemplo, una mezcla, una solución o una suspensión o comprende una célula aislada o una célula cultivada que comprende el polinucleótido o polipéptido, y seguirá estando aislado de manera que el vector o la composición no forme parte de su entorno natural.

Tal como se usa en el presente documento, el término “replicón” se refiere a cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un cromosoma o un virus, que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “unido operativamente” se refiere a una situación en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Por tanto, por ejemplo, una secuencia de control “unida operativamente” a una secuencia codificante está unida de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia control.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a un replicón en el que otro segmento de polinucleótido está unido como para lograr replicación y/o la expresión del segmento unido.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de control” se refiere a una secuencia de polinucleótidos que es necesaria para efectuar la expresión de una secuencia codificante a la cual está ligada. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión al ribosoma y terminadores y, en algunos casos, potenciadores. La expresión “secuencia de control” por tanto pretende incluir un mínimo de todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “producto purificado” se refiere a una preparación del producto que se ha aislado de los constituyentes celulares con los que el producto normalmente se asocia y/o de otros tipos de células que pueden estar presentes en la muestra de interés.

Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una proteína determinada capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente constan de unos grupos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales glucídicas y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Algunos epítopos son epítopos lineales mientras que otros son epítopos conformacionales. Un epítopo lineal es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácido contigua comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye normalmente al menos 3 y más normalmente al menos 5, por ejemplo, aproximadamente de 8 a 10 aminoácidos contiguos. Un epítopo conformacional puede resultar de al menos dos situaciones, tales como: a) una secuencia lineal que solo se expone al anticuerpo que se une en determinadas conformaciones de proteína; por ejemplo, dependiente de la unión de ligando o dependiente de la modificación (por ejemplo, fosforilación) mediante moléculas de señalización; o b) una combinación de características estructurales de más de una parte de la proteína, o en proteínas multisubunitarias, de más de una subunidad, en la que las características están en suficiente proximidad en el espacio tridimensional para participar en la unión.

Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgA, IgE o IgG) que está codificado por genes de la región constante de la cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “agente detectable”, “marcador” o “marcado” se utilizan para referirse a la incorporación de un marcador detectable en un polipéptido o glucoproteína. En la técnica se conocen diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glucoproteínas y pueden utilizarse. Los ejemplos de marcadores para los polipéptidos incluyen, pero limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, indio (111In), yodo (131I o 125I), itrio (90Y), lutetio (177Lu), actinio (225Ac), bismuto (212Bi o 213Bi), azufre (35S), carbono (14C), tritio (3H), rodio (188R), tecnetio (99mTc), praseodimio o fósforo (32P) o un radionúclido emisor de positrones, por ejemplo, carbono-11 (11C), potasio-40 (40K), nitrógeno-13 (13N), oxígeno-15 (15O)9, flúor-18 (18F), galio-68 (68Ga) y yodo-121 (121I)), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos biotinilados quimioluminiscentes (que pueden detectarse mediante una avidina marcada, por ejemplo, una molécula que contiene una fracción de estreptavidina y un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o calorímetros) y epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

Tal como se usa en el presente documento, “unión específica”, “se une específicamente” o “especificidad de unión” significa, para una molécula de anticuerpo anti-GCC, que la molécula de anticuerpo se une a GCC, por ejemplo, a la proteína GCC humana, con mayor afinidad de la que lo hace a una proteína no GCC, por ejemplo, BSA. Normalmente, una molécula anti-GCC tendrá una Kd para la proteína no GCC, por ejemplo, BSA, que es mayor de 2, mayor de 10, mayor de 100, mayor de 1000 veces, mayor de 104, mayor de 105 o mayor de 106 veces su Kd para la GCC, por ejemplo, la proteína GCC humana. En la determinación de la Kd, la K Kd para GCC y la proteína no GCC, por ejemplo, ^bS^a , puede realizarse en las mismas condiciones.

El término “afinidad” o la expresión “afinidad de unión” se refiere a una constante de asociación aparente o Ka. La Ka es la recíproca de la constante de disociación (Kd). Un anticuerpo puede, por ejemplo, tener una afinidad de unión de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M-1 por una molécula diana particular. Una afinidad de unión más alta de un anticuerpo con su primera diana con respecto a una segunda diana puede indicarse por una K^a mayor (o un valor Kd numérico más pequeño) para la unión a la primera diana en comparación con Ka (o un valor Kd numérico) para la unión a la segunda diana. En dichos casos, el anticuerpo tiene especificidad por la primera diana (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o mimético de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo, la misma proteína en una segunda conformación o mimético de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000 o 105 veces.

La afinidad de unión puede determinarse mediante diversos métodos incluyendo diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtrado en gel, ELISA, resonancia 19act cc de superficie o espectroscopía (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia). Por ejemplo, la afinidad relativa de una molécula de anticuerpo anti-GCC puede medirse a partir de mediciones ELISA contra la proteína GCC (por ejemplo, el inmunógeno utilizado para generar moléculas de anticuerpo anti-GCC), mediante mediciones de FACS con células que expresan GCC.

Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión son en tampón TRIS (TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM a pH 7,5). Estas técnicas pueden utilizarse para medir la concentración de unión y la proteína de unión libre en función de la concentración de la proteína de unión (o diana). La concentración de la proteína de unión unida ([Unida]) está relacionada con la concentración de la proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de los sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana mediante la siguiente ecuación:

[Unida] = N-[Libre]/((1/KA) [Libre]).

No siempre es necesario realizar una determinación exacta del valor de K^a, aunque, dado que algunas veces es suficiente obtener una medición cuantitativa de la afinidad, por ejemplo, determinada utilizando un método tal como un ensayo ELISA o un análisis por FACS, que es proporcional al valor de K^a y que por tanto debe utilizarse para comparaciones, tal como determinar si una mayor afinidad es, por ejemplo, 2 veces mayor, para obtener una medición cualitativa de la afinidad, o para obtener una inferencia de la afinidad, por ejemplo, por actividad en un ensayo funcional, por ejemplo, un ensayo in vitro o in vivo. La afinidad de las moléculas de anticuerpo anti-GCC también puede medirse utilizando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular en tiempo real (BIA, del inglés Biomolecular Interaction Analysis)) (véase, por ejemplo, Sjolander, S, y Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem.

63:2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Tal como se usa en el presente documento, la tecnología “BIA” o “resonancia de plasmón superficial” es una tecnología que permite estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIACORE™). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativa de un evento de unión) dan como resultado alteraciones del índice refractario de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance)), que da como resultado una señal detectable que puede utilizarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

La medición de la afinidad de las moléculas de anticuerpo anti-GCC utilizando un sistema BIACORE™ T100 (GE Healthcare Piscataway, N.J.) se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° US2011/0110936. Resumiendo, un anticuerpo anti-GCC (Prep A) se diluye a una concentración apropiada (por ejemplo, 20 pg/ml) en acetato de sodio 10 mM, a pH 4,0 y un anticuerpo de referencia/control (Prep B) se diluye a una concentración apropiada (por ejemplo, 10 pg/ml) en acetato de sodio 10 mM, a pH 4,0. Cada anticuerpo se inmoviliza covalentemente a diversas microplacas CM4 BIACORE utilizando acoplamiento estándar de amina. Para cada microplaca CM4 preparada, el anticuerpo Prep A se inmoviliza sobre dos celda de flujo a aproximadamente 75-100 UR mientras que el anticuerpo Prep B se inmoviliza en una celda de flujo a aproximadamente 70-80 UR. La restante cuarta celda de flujo de cada microplaca CM4 se utiliza como celda de flujo de referencia. La concentración de proteína GCC puede determinarse utilizando los métodos detallados por Pace et al. en Protein Science, 4:2411 (1995), y en Pace y Grimsley en Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9 (2003). Para cada microplaca de CM4 preparada, las proteínas GCC se inyectan durante 2 minutos a un intervalo de concentración de 202 nM - 1,6 nM (diluciones en serie con factor de 2) seguido de una disociación de 7 minutos. Las muestras se inyectan al azar por triplicado con diferentes ciclos de inyección de tampón interdispersor para una doble referenciación. Para obtener datos de degradación más significativos, se realizaron tres inyecciones adicionales de proteína GCC 101 nM y tres inyecciones adicionales de tampón con una inyección de 2 minutos y un tipo de disociación de 4 horas. En todos los experimentos se utiliza un caudal de 100 pl/min y todas las superficies se regeneran con un pulso de 20 segundos de glicina-HCl 10 mM (pH 2,0). Todas las muestras se prepararon en el tampón de ejecución (por ejemplo, solución salina tamponada con Hepes, polisorbato 20 al 0,005 %, pH 7,4 (HBS-P)) con 100 |jg/ml de BSA añadido. Todos los datos del sensograma (representación gráfica de la resonancia de plasmón superficial con respecto al tiempo) pueden procesarse con el programa informático Scrubber 2.0 (programa informático de BioLogic, Campbell, Australia) y ajustarse globalmente a un modelo de interacción de 1:1 que incluye un término para la constante de transporte de masa km utilizando el programa informático CLAMP™ (Myszka y Morton Trends Biochem. Sci. 23:149-150 (1998)).

Como se usa en el presente documento, el término “tratar” o “tratamiento” se define como la administración a un sujeto, por ejemplo, a un paciente, de una molécula de anticuerpo anti-GCC, o la administración, por ejemplo, mediante aplicación, a una célula o a un tejido aislado de un sujeto, que retorna al sujeto. La molécula de anticuerpo anti-GCC puede administrarse sola o en combinación con un segundo agente. El tratamiento puede curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, paliar, reponer o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o a la predisposición hacia el trastorno, por ejemplo, un cáncer. Aunque sin querer ligarse a ninguna teoría, se cree que el tratamiento produce la inhibición, ablación, o destrucción de una célula in vitro o in vivo, o que reduce la capacidad de una célula, por ejemplo, una célula aberrante, para actuar como mediadora en un trastorno, por ejemplo, un trastorno como se describe en el presente documento (por ejemplo, un cáncer).

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” pretende incluir mamíferos, primates, seres humanos y animales no humanos. Por ejemplo, un sujeto puede ser un paciente (por ejemplo, un paciente humano o un paciente veterinario), que tiene un cáncer en el que al menos alguna de las células expresan GCC, tal como un cáncer de origen gastrointestinal (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado o cáncer esofágico), cáncer pancreático, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcoma de tejido blando (por ejemplo, leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma), tumores neuroendocrinos (por ejemplo, gastrointestinal o broncopulmonar) o tumores neuroectodérmicos; un síntoma de dichos cánceres que expresan GCC; o una predisposición hacia dichos cánceres que expresan GCC. Como otro ejemplo, el sujeto puede ser un paciente que tenga un trastorno gastrointestinal en el que al menos algunas de las células del sistema gastrointestinal expresen GCC, tal como en el síndrome intestinal inflamatorio, enfermedad de Crohn y estreñimiento. Como otro ejemplo más, el sujeto puede ser un paciente que tenga un trastorno neurológico en el que al menos algunas neuronas del sistema nervioso central del paciente expresen GCC, tal como Enfermedad de Parkinson. A menos que se indique otra cosa, la expresión “animales no humanos” de la invención incluye todos los vertebrados no humanos, por ejemplo, mamíferos no mamíferos no humanos y animales, tales como primates no humanos, cabra, perro, vaca, pollo, anfibios, reptiles, ratón, rata o cabra, etc.,. En una realización, el término “sujeto” excluye uno o más o todos de un ratón, rata, conejo o cabra.

Como se usa en el presente documento, una cantidad “eficaz” o “suficiente” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad terapéuticamente suficiente” de una molécula de anticuerpo anti-GCC para tratar un trastorno, se refiere a una cantidad de la molécula de anticuerpo que, después de una sola administración o de administraciones múltiples a un sujeto, es eficaz para el tratamiento de una célula, por ejemplo, una célula de cáncer (por ejemplo, una célula de tumor que exprese GCC), o para prolongar la cura, el alivio la recuperación o mejoría de un sujeto con un trastorno como se describe en el presente documento por encima de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Como se usa en el presente documento, “inhibición del crecimiento” del tumor o cáncer se refiere a ralentizar, interrumpir, detener o parar su crecimiento y/o metástasis y no indica necesariamente una eliminación total del crecimiento del tumor.

Como se usa en el presente documento, la proteína “GCC”, también conocida como proteína “STAR”, “GUC2C”, “GUCY2C” o “receptor de ST”, se refiere a una GCC de mamífero, preferentemente una proteína GCC humana. La GCC humana se refiere a la proteína mostrada en la SEQ ID NO: 3 y a sus variantes de proteína alélica de origen natural. La secuencia de ácidos nucleicos de la GCC mostrada en la SEQ ID NO: 2 puede codificar el alelo en la SEQ ID NO: 3. En la técnica se conocen otras variantes. Véase, por ejemplo, el número de registro Ensp0000261170, de la Base de Datos Ensembl del European Bioinformatics Institute y del Wellcome Trust Sanger Institute, que tiene una leucina en el resto 281; la SEQ ID NO: 14 de la solicitud de patente de Estados Unidos publicada con el núm. 20060035852; o el número de registro AAB 19934 del GenBank. Normalmente, una variante alélica de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, 97 % o 99 % idéntica a la secuencia de GCC de SEQ ID NO: 3. El transcrito codifica un producto proteico de 1073 aminoácidos y se describe en el GenBank con el n.° de registro: NM_004963. La proteína GCC se caracteriza como una proteína receptora de la superficie celular transmembrana y se piensa que desempeña un papel crítico en el mantenimiento del líquido intestinal, en la homeostasis de electrolitos y en la proliferación celular.

Anticuerpos anti-GCC

En el presente documento se describen moléculas de anticuerpo anti-GCC útiles, entre otras cosas, para detectar la expresión de GCC. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, útiles para la detección de GCC, pueden incluir moléculas de anticuerpo anti-GCC no humano (por ejemplo, moléculas de anticuerpo no humano y no murino) que se unen específicamente a GCC, por ejemplo, con una afinidad de unión por GCC de al menos 103, 104, 105, 106, 107,108, 109, 1010 y 1011 M-1. La molécula de anticuerpo anti-GCC puede ser una molécula de anticuerpo no humano, no murino y no de rata, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC de conejo, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En determinados aspectos, la divulgación se refiere a moléculas de anticuerpo anti-GCC que incluyen características tales como se resumen en las Tablas 1 y 2. En otros aspectos, la divulgación se refiere a moléculas de anticuerpo anti-GCC que incluyen características tales como las que se resumen en las Tablas 3, 4, 5 y/o 6.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo de hibridoma de conejo y es un anticuerpo MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC deriva del anticuerpo MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4.

En una realización de la invención, una molécula de anticuerpo anti-GCC tendrá una afinidad por GCC, por ejemplo, medida mediante ensayos de unión directa o de unión competitiva. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC tiene una Kd menor de 1x10‘6 M, menor de 1x10‘7 M, menor de 1x10‘8 M, menor de 1x10‘9 M, menor de 1x10‘10 M, menor de 1x10‘11 M, menor de 1x10‘1212 M o menor de 1x10‘13 M. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo es una IgG, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y tiene una Kd menor de 1x10-6 M, menor de 1x10‘7 M, menor de 1x10‘8 M o menor de 1x10‘9 M. En la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2 o un anticuerpo derivado del mismo, tiene una Kd de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 pM, preferentemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 pM o aproximadamente 120 pM. En la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2 o un anticuerpo derivado del mismo, tiene una ka de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,25x105 M'1 s-1, preferentemente de aproximadamente 1,1x105 M'1 s-1. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo es un ScFv y tiene una Kd menor de 1x10‘6 M, menor de 1x10‘7 M, menor de 1x10-8 M, menor de 1x10‘9 M, menor de 1x10‘10 M, 1x10‘11 M, menor de 1x10‘12 M o menor de 1x10‘13 M.

En la presente divulgación, las moléculas de anticuerpo no son inmunoconjugados, es decir, están “desnudas” y en la presente divulgación producen una reacción celular después de unirse a GCC. En relación con la presente divulgación, la reacción celular la realiza la célula que expresa GCC a la cual se une el anticuerpo. Dicha reacción celular puede ser una transducción de señal mediada por GCC, por ejemplo, si la molécula de anticuerpo es un agonista de GCC (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n.° US20040258687). En la presente divulgación, la reacción celular la realiza una segunda célula, por ejemplo, una célula inmunoefectora (por ejemplo, un linfocito citolítico natural) que reconoce la molécula de anticuerpo unida a GCC en la primera célula. En la presente divulgación, antes de la reacción celular, moléculas vigilantes, por ejemplo, moléculas del complemento, se ponen en contacto con la molécula de anticuerpo unida a GCC. Las reacciones celulares de la divulgación pueden producir la muerte de la célula que expresa GCC.

En la presente divulgación, las moléculas de anticuerpo que son inmunoconjugados, después de unirse a GCC, pueden producir tanto una reacción celular como internalizarse para suministrar un agente a la célula con la que se une y que expresa GCC.

En la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación puede bloquear la unión del ligando con GCC.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo no es GCC:B10, GCC:4D7 o GCC:C8. En la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC no se une a un dominio intracelular de GCC, de aproximadamente 455 a 1073 restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, en la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC no se une al dominio de homología de cinasa ni al dominio de guanilil ciclasa de la GCC.

La unidad estructural de un anticuerpo de mamífero de origen natural, está tipificada por un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento antigénico. La parte carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas pueden clasificarse como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas pueden clasificarse como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en líneas generales, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo. Los isotipos preferidos para las moléculas de anticuerpo anti-GCC son inmunoglobulinas IgG, que pueden clasificarse en cuatro subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que tienen diferentes cadenas pesadas gamma. Los anticuerpos más terapéuticos son los anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados del isotipo IgG1. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo IgG de conejo.

Las regiones variables de cada par de cadenas pesadas y ligeras forman el sitio de unión al antígeno. Por tanto, un anticuerpo de IgG intacto tiene dos sitios de unión que son iguales. Sin embargo, los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos son construcciones híbridas artificiales que tienen dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes, dando como resultado dos sitios de unión diferentes.

Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones estructurales (FR, del inglés framework regions), relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR (del inglés complementary determining regions). Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones estructurales, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N al extremo C, las dos cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza conforme a las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o de Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). Como se usa en el presente documento, se hace referencia a las CDR de cada una de las cadenas pesadas (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y ligeras (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

Una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender todas, o un subconjunto de las CDR de unión a antígeno, de una o ambas de las cadenas pesadas y ligeras, o uno de los anticuerpos de conejo anteriormente indicados. En las Tablas 3 y 5, pueden encontrarse las secuencias de aminoácidos de anticuerpos de hibridoma de conejo, incluyendo las regiones variables y las CDR.

Por tanto, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación incluye uno o ambos de los siguientes apartados:

(a) una, dos, tres o diversas de las CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de unión a antígeno de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo anteriormente indicados. En la presente divulgación las CDR pueden comprender una secuencia de aminoácidos de una o más o todas las LCDR1-3 siguientes: LCDR1, o LCDR1 modificada, en donde de uno a siete aminoácidos están sustituidos de manera conservativa; LCDR2, o LCDR2 modificada, en donde uno o dos aminoácidos están sustituidos de manera conservativa; o LCDR3, o LCDR3 modificada, en donde uno o dos aminoácidos están sustituidos de manera conservativa; y

(b) una, dos, tres o diversas CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de unión a antígeno de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo anteriormente indicados. En la presente divulgación las CDR pueden comprender una secuencia de aminoácidos de una o más o todas las HCDR1-3 siguientes: HCDR1, o HCDR1 modificada, en donde uno o dos aminoácidos están sustituidos de manera conservativa; HCDR2, o HCDR2 modificada, en donde de uno a cuatro aminoácidos están sustituidos de manera conservativa; o HCDR3, o HCDR3 modificada, en donde uno o dos aminoácidos están sustituidos de manera conservativa.

Los inmunógenos útiles para la producción de moléculas de anticuerpo anti-GCC incluyen GCC, por ejemplo, células que expresan GCC humana (por ejemplo, un línea celular tumoral, por ejemplo, células T84, o células tumorales de colon recientes o congeladas, células recombinantes que expresan GCC); fracciones de membranas de células que expresan GCC (por ejemplo, un línea celular de tumor de colon, por ejemplo, células T84), o células tumorales colónicas recientes o congeladas; células recombinantes que expresan GCC; GCC aislada o purificada, por ejemplo, proteína GCC humana (por ejemplo, GCC bioquímicamente aislada, por ejemplo, aislada de células tumorales gastrointestinales o células recombinantes que expresan GCC o una variante de las mismas), o una parte de las mismas (por ejemplo, el dominio extracelular de GCC, el dominio de homología cinasa de GCC o el dominio catalítico guanilil ciclasa de GCC o un péptido correspondiente a una parte del mismo, por ejemplo, que comprende al menos aproximadamente 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 o 32 restos de aminoácido de SEQ ID NO: 3); o un inmunógeno que comprende la SEQ ID NO: 46 o que comprende una parte madura de la misma sin la secuencia señal (es decir, sin los restos de aminoácido 1 a aproximadamente 21 o 23 de SEQ ID NO: 46), por ejemplo, la proteína madura hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII (también denominada en el presente documento “pLKTOK108”), SEQ ID NO: 48.

Los inmunógenos pueden fusionarse con secuencias heterólogas para ayudar en la manipulación, purificación, inmunización bioquímica o para realizar mediciones de títulos de anticuerpos. Dichos inmunógenos pueden comprender una parte de GCC, por ejemplo, el dominio extracelular, y una parte que comprenda un polipéptido que no sea GCC. Existen muchas opciones para construir una proteína de fusión para facilitar la purificación o la inmovilización en un soporte sólido, por ejemplo, en una columna de afinidad o en una placa de microtitulación o en otro sustrato/microplaca de ensayo adecuado. Por ejemplo, una fracción de fusión puede añadir un dominio, por ejemplo, glutatión-S-transferasa/cinasa (GST), que puede unirse al glutatión; una región Fc de una inmunoglobulina, que puede unirse a la proteína A o la proteína G; restos de aminoácido, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, preferentemente seis restos de histidina que pueden unirse a níquel o cobalto en una columna de afinidad; una etiqueta epitópica, por ejemplo, una parte del oncogén c-myc (eiqueta myc), una etiqueta FLAG (Patente de Estados Unidos N.° 4.703.004), una etiqueta de hemaglutinina (HA), una etiqueta del gen 10 de T7, una etiqueta V5, una etiqueta de HSV, o una etiqueta de VSV-G que puede unirse a un anticuerpo específico de etiqueta; o un cofactor, por ejemplo, biotina, que puede unirse a estreptavidina.

Los inmunógenos que comprenden la parte Fc de una inmunoglobulina pueden mantener la GCC, en solución o unida a una célula, en una configuración que permita el acceso estructural a epítopos de GCC a través de los componentes de inmunovigilancia del hospedador para una generación eficaz de anticuerpos. Dado que las cadenas pesadas de la inmunoglobulina comprenden las regiones Fc asociadas en dímeros a través de enlaces disulfuro intercadena, los inmunógenos resultantes de la fusión con regiones Fc son dímeros. La valencia de las proteínas de fusión puede reflejar el tipo de inmunoglobulina que aporta una región Fc. Por ejemplo, las fusiones con proteínas de IgG pueden ser dímeros, las fusiones de IgA pueden producir inmunógenos tetraméricos y las fusiones de IgM pueden producir inmunógenos decaméricos, estos dos últimos se facilitan con la co-transfección de la cadena J. Una inmunoglobulina ejemplar para una proteína de fusión Fc es la IgG1. La parte utilizada normalmente tiene los dominios bisagra de IgG1, CH2 y CH3 codificados por un solo exón. Dado que este exón también tiene una parte de la región CH1, que tiene una cisteína orientada al enlace disulfuro con una cisteína de la cadena ligera, una modificación útil es mutar la cisteína de CH1, por ejemplo, por una serina, para garantizar que no haya cisteína no emparejada en la proteína de fusión. Dicha mutación también aumenta la flexibilidad de la bisagra.

Una parte Fc derivada de una especie no hospedadora, por ejemplo, la región Fc de Ig humana, actúa como adyuvante para fusionarse con un inmunógeno para la inmunización en una especie hospedadora, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cabra. Esta función adyuvante puede desencadenar anticuerpos específicos contra los dos epítopos de Fc y GCC. Durante la exploración pueden identificarse y descartarse anticuerpos reactivos con Fc. La parte Fc puede tener una secuencia de tipo silvestre o una secuencia que esté mutada para modificar la función efectora. Por ejemplo, una región constante mutada (variante) puede incorporarse en una proteína de fusión para minimizar la unión a receptores de Fc y/o para poder fijar el complemento (véase, por ejemplo, Winter et al, GB 2.209.757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351). En un ejemplo preferido, la lisina 235 y la glicina 237, numeradas de acuerdo con los estándares de la región Fc, se mutan, por ejemplo, a alanina. Un inmunógeno/proteína de fusión con la IgG mutada en la región Fc, puede tener una interacción reducida con receptores de Fc en el hospedador. Una proteína de fusión inmunogénica soluble preferida (después de la maduración para escindir el péptido señal y de secreción) es hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII (pLKTOK108), que consta de los restos de aminoácido 24 a 430 de SEQ ID NO: 3, fusionada a la parte Fc de la inmunoglobulina IgG2a de ratón mutada (conjuntamente SEQ ID NO: 48).

Para preparar un inmunógeno expresado en las células, la parte de inmunoglobulina puede estructurarse para imitar una parte de inmunoglobulina del receptor de linfocitos B. Por ejemplo, la región Fc de inmunoglobulina puede fusionarse además con un polipéptido que comprenda una región transmembrana desde un inmunorreceptor, tal como receptores Fcy, receptores Fca, receptor Fca/p o receptores Fc£. La orientación adecuada de dicho inmunógeno unido a células con receptor Fc con exposición adecuada en la superficie celular puede mejorarse si la célula que expresa la proteína de fusión inmunogénica comprende además otros componentes del complejo receptor antigénico, por ejemplo, receptor de IgM o receptor de IgD de linfocitos B. Los componentes adecuados del complejo incluyen proteínas de la cubierta de inmunoglobulina (Ig), tales como MB-1 y B29 (CD79A y CD79B; Hombach et al. Eur. J. Immunol. 20:2795-2799 (1990) para el receptor de IgM), que forman un heterodímero. La célula transfectada puede proporcionar las proteínas de la cubierta de Ig de manera endógena, por ejemplo, si se transfecta a una línea celular del linfoma de linfocito B; o mediante co-transfección del inmunógeno con proteínas de la cubierta, por ejemplo, en un vector distinto o en el mismo vector.

Epítopos útiles, por ejemplo, epítopos de referencia, de la molécula GCC, con los que pueden unirse las moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de conejo, o versiones humanizadas de los mismos, como se describe en el presente documento, pueden encontrarse en la parte extracelular de GCC. Dichos epítopos de GCC pueden unirse a moléculas de anticuerpo en la superficie de las células, por ejemplo, en el exterior de la célula.

Por ejemplo, un epítopo para una molécula de anticuerpo anti-GCC puede residir dentro, o incluir uno o más restos, de los restos 1-50 de la SEQ ID NO: 3, o un fragmento del mismo, que se une a una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación, por ejemplo, un fragmento de unión a MIL-44-148-2 del mismo. Dichos fragmentos pueden comprender los restos 1-25, 5-30, 10-35, 15-40, 20-45, 25-50, 5-45, 10-40, 15-35, 20-30 o 33-50 de la SEQ ID NO: 3. En la presente divulgación, un epítopo para una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2, es un epítopo conformacional que adicionalmente comprende uno o más restos de aminoácido adicionales en la secuencia de aminoácidos de GCC más allá del resto 50, es decir, seleccionado de aproximadamente el resto 50 a 1073 de la SEQ ID NO: 3.

Los anticuerpos suscitados contra dichos epítopos o el dominio extracelular, por ejemplo, epítopos que residen dentro, o que incluyen uno o más restos de los restos de aminoácido 24 a 420 de SEQ ID NO: 3, o una parte de referencia del mismo, por ejemplo, los restos 24 a 75, 75 a 150, 150 a 225, 225 a 300, 300 a 375 o 375 a 420 de GCC, o moléculas de anticuerpo derivadas de los mismos, pueden ser útiles como anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico, como se describe en el presente documento.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC tiene una o más de las siguientes propiedades:

a) compite por la unión, por ejemplo, la unión con la GCC en la superficie celular o con la GCC purificada, con una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC indicadas anteriormente resumidas en las Tablas 1 y 2, por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44-148-2);

b) se une al mismo, o sustancialmente al mismo, epítopo en GCC como una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC indicadas anteriormente resumidas en las Tablas 1 y 2, por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44-148-2). En la divulgación, el anticuerpo se une al mismo epítopo, según se determina mediante uno o más de un ensayo con matrices de péptidos o mediante la unión a mutantes de truncamiento, a quimeras o a mutantes puntuales expresados en la superficie celular o en preparaciones de membrana, por ejemplo, como en los ensayos que se describen en el presente documento;

c) se une un epítopo con al menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15 o 20 restos de aminoácido contiguos en común con el epítopo de una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC indicadas anteriormente resumidas en las Tablas 1 y 2, por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44-148-2).

d) se une a una región de la GCC humana que está unida mediante un anticuerpo anti-GCC de la invención, donde la región, por ejemplo, una región extracelular o citoplasmática, tiene una longitud de 10-15, 10-20, 20-30 o 20-40 restos, y la unión se determina, por ejemplo, mediante la unión a mutantes de truncamiento; en la presente divulgación la molécula de anticuerpo anti-GCC se une a la región extracelular de la GCC humana. En la presente divulgación una molécula de anticuerpo anti-GCC puede unirse a la parte GCC humana del dominio extracelular definido por los restos de aminoácido 24 a 420 de SEQ ID NO: 3. En la presente divulgación una molécula de anticuerpo anti-GCC puede unirse al sitio identificativo de la guanilato ciclasa en los restos de aminoácido 931 a 954 de SEQ ID NO: 3, o

e) se une a un epítopo de referencia descrito en el presente documento.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC, se une a la secuencia LVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEQ ID NO: 8) de la GCC.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC, se une a la secuencia FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV (SEQ ID NO: 9) de la GCC.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo conformacional. En otra parte de la presente divulgación una molécula de anticuerpo se une a un epítopo lineal.

Las moléculas de anticuerpo anti-GCC pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos quiméricos (véase la Patente de Estados Unidos N.° 6.020.153) o anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos. En la presente divulgación también se contemplan variantes sintéticas y modificadas genéticamente (véase la Patente de Estados Unidos N.° 6.331.415) de cualquiera de lo anterior. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales murinos (por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975); véase, en líneas generales, Harlow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), y tecnología de anticuerpos monoclonales de conejo y los servicios proporcionados por Epitomics (Burlingame, CA) que produce anticuerpos monoclonales de conejo por encargo (RabMAbs®) utilizando hibridomas de conejoconejo generados fusionando linfocitos B aislados de un conejo inmunizado con una línea celular compañera de fusión propiedad de Epitomics, como se describe en las Patentes de Estados Unidos 7429487, 7462697, 7 575896, 7732168 y 8062867.

La inmunización con proteínas, por ejemplo, con GCC o una parte soluble, o con proteínas de fusión que comprenden una parte de GCC (por ejemplo, hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII (pLKTOK108), o células o fracciones de membrana de las mismas, por ejemplo, células que expresan GCC expuesta en la superficie o una parte de la misma (por ejemplo, el producto pLKTOK4), puede realizarse con el inmunógeno preparado para inyección de una manera que se induce una respuesta, por ejemplo, con adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo de Freund. Otros adyuvantes adecuados incluyen, adyuvante Titermax Gold® (CYTRX Corporation, Los Ángeles, Calif.), y alumbre. Los inmunógenos de péptidos pequeños pueden ligarse a una molécula más grande, tal como hemocianina de lapa californiana. Los ratones o los conejos pueden recibir una inyección de diversas maneras, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa o intramuscular en diversos sitios, por ejemplo, en el peritoneo (i.p.), en la base de la cola, o en las almohadillas plantares, o en una combinación de sitios, por ejemplo, iP y la base de la cola (BIP). La inyecciones de refuerzo pueden incluir el mismo inmunógeno o uno diferente y adicionalmente pueden incluir un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund. La inmunización con ADN, por ejemplo, ADN que codifica la GCC o una parte de la misma o una proteína de fusión que comprende GCC o una parte de la misma (por ejemplo, que codifica hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII) puede inyectarse utilizando tecnología de bombardeo de genes. Por ejemplo, el ADN se carga en partículas de oro microscópicas y se inyecta en ratones o conejos a intervalos frecuentes durante un corto periodo de tiempo.

Generalmente, cuando se desea un anticuerpo monoclonal, se produce un hibridoma fusionando una célula adecuada de una línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma, tal como, SP2/0, P3X63Ag8.653 o un heteromieloma) con células productoras de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse de sangre periférica o, preferentemente, de bazo o ganglios linfáticos, de seres humanos, animales transgénicos con anticuerpos humanos u otros animales adecuados (por ejemplo, conejos) inmunizados con el antígeno de interés. Las células que producen anticuerpos de origen humano (por ejemplo, un anticuerpo humano) pueden producirse utilizando métodos adecuados, por ejemplo, fusionando una célula productora de anticuerpos humanos y un heteromieloma o trioma, o inmortalizando un linfocito B humano activado mediante infección con el virus de Epstein Barr. (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.197.582 (Trakht); Niedbala et al., Hybridoma, 17:299-304 (1998); Zanella et al., J Immunol Methods, 156:205-215 (1992); Gustafsson et al., Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32 (1991)). Las células productoras de anticuerpos fusionadas o inmortalizadas (hibridomas) pueden aislarse utilizando condiciones de cultivo selectivas, y clonarse mediante dilución limitante. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden identificarse utilizando un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA (por ejemplo, con inmunógeno, por ejemplo, hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutlI, inmovilizado en el pocillo de microtitulación) o mediante FACS en una célula que exprese GCC o una parte de la misma, por ejemplo, una célula que exprese el producto pLKTOK4). Por ejemplo, si el inmunógeno de GCC comprende una fracción de fusión que es un reactivo de afinidad, esta fracción puede permitir que la proteína de fusión que comprende la GCC, o una parte de la misma, se una a una matriz, por ejemplo, a microplacas de ensayo o placas de microtitulación revestidas con anticuerpos o derivatizadas con glutatión, revestidas con proteína G, revestidas con estreptavidina, que después se combinan con el suero inmunitario o medio acondicionado de un hibridoma o de una célula recombinante que exprese un anticuerpo y la mezcla se incuba en condiciones conductoras para la formación del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiológicas con respecto a la sal y el pH). Después de la incubación, las células que están en los pocillos de la placa de microtitulación o de la microplaca, se lavan para eliminar cualquiera de los componentes no unidos y se mide la unión del anticuerpo anti-GCC.

En la presente divulgación, para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos humanizados. La ventaja de los anticuerpos humanizados es que posiblemente disminuyen o eliminan la inmunogenicidad del anticuerpo en un receptor hospedador, permitiendo de este modo aumentar la biodisponibilidad y reducir la posibilidad de que se produzcan reacciones inmunitarias adversas, posiblemente permitiendo así administraciones múltiples de anticuerpos.

Los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos humanizados, quiméricos o injertados en una CDR (región determinante de la complementariedad). Las respuestas de los anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA, siglas del inglés human anti-mouse antibody) han llevado a desarrollar anticuerpos quiméricos o de otro modo humanizados. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable no humana, se espera que se observarán determinadas respuestas de anticuerpos humanos anti-quiméricos (HACA), particularmente en utilizaciones perdurables o multidosis del anticuerpo. La presencia de dichas proteínas derivadas de seres no humanos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja o cabra) puede conducir a la rápida eliminación de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente. Para impedir la utilización de anticuerpos derivados de seres no humanos, se han desarrollado anticuerpos humanizados en donde se introducen secuencias en una secuencia de anticuerpo para hacerlo más parecido a una secuencia de anticuerpo humano, o anticuerpos completamente humanos generados por la introducción de una función de anticuerpo humano en una especie no humana, tal como un ratón, rata, conejo, oveja o cabra, de tal manera que las especies no humanas producirían anticuerpos que tienen secuencias completamente humanas. Los anticuerpos humanos impiden que se produzcan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de conejo, roedor, oveja o cabra.

Tecnologías de humanización y presentación y modificaciones en anticuerpos

Las moléculas de anticuerpos humanizados pueden minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas contra los mAb no humanos o no humanos derivatizados y, por tanto, aumentar la eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados. El uso de moléculas de anticuerpos humanizados puede proporcionar una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tal como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de anticuerpos.

La producción de anticuerpos humanizados con inmunogenicidad reducida puede realizarse junto con técnicas de humanización y de presentación utilizando bibliotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos de especies no humanas, tales como ratones, ratas, conejos, ovejas, cabras, etc., pueden humanizarse o primatizarse utilizando técnicas conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede modificarse mediante ingeniería genética con técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios bisagra CH1, CH2, CH3 y/o el dominio estructural por la secuencia humana correspondiente (véase el documento WO 92/02190 y las Patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). Además, en la materia se conoce el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos (Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA.

84:3439 (1987) y J. Immunol. 139:3521 (1987)). El ARNm se aísla de un hibridoma o de otra célula que produce el anticuerpo y se utiliza para producir ADNc: El ADNc de interés puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos (Patentes de Estados Unidos N.° 4.683.195 y 4.683.202).

Como alternativa, puede utilizarse tecnología de presentación en fagos (véase, por ejemplo, McCafferty et al, Nature, 348:552-553 (1990)) para producir in vitro anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies, así como fragmentos de anticuerpo, a partir de genes de inmunoglobulina de dominio variable (V); por ejemplo, a partir de repertorios de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de anticuerpos de dominio V se clonan en marco en un gen de proteína de cubierta principal o secundaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basándose en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta estas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinion en Structural Biology, 3:564-571 (1993). Para la presentación en fagos pueden utilizarse diversas fuentes de segmentos de genes V. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie de diversos anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria al azar de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una serie de diversos antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) o Griffith et al, EMBO J., 12:725-734 (1993). Véanse también las Patentes de Estados Unidos N.° 5.565.332 y 5.573.905. Las bibliotecas de presentación pueden contener anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que contienen secuencias de aminoácidos artificiales. Por ejemplo, la biblioteca puede contener fragmentos Fab que contienen CDR artificiales (por ejemplo, secuencias de aminoácidos al azar) y regiones estructurales humanas. (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.300.064 (Knappik, et al.)).

Las secuencias de genes de regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publicación n.° 91-3242. A partir de clones conocidos puede disponerse con facilidad de genes de regiones C humanas. La elección del isotipo estará orientada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación al complemento, o actividad en cuanto a citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos pueden ser IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En la presente divulgación, las moléculas de anticuerpo de la divulgación son IgG1 e IgG2. Puede utilizarse cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera, kappa o lambda, humanas. Después, mediante métodos convencionales, se expresa el anticuerpo humanizado quimérico.

En la presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación puede provocar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) contra una célula que exprese GCC, por ejemplo, una célula tumoral. Los anticuerpos con los isotipos IgG1 e IgG3 son útiles para suscitar funciones efectoras en una capacidad citotóxica dependiente de anticuerpo, debido a su capacidad para unirse al receptor Fc. Los anticuerpos con los isotipos IgG2 e IgG4 son útiles para minimizar una respuesta de tipo CCDA debido a su baja capacidad para unirse al receptor Fc. En la presente divulgación, pueden realizarse sustituciones en la región Fc o cambios en la composición de la glucosilación de un anticuerpo, por ejemplo, cultivando una línea celular eucariota modificada, para potenciar la capacidad de los receptores Fc para reconocer, unirse y/o mediar en la citotoxicidad de las células a las cuales se unen los anticuerpos anti-GCC (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 7.317.091, 5.624.821 y las publicaciones que incluyen el documento WO 00/42072, Shields, et al. J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001), Lazar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:4005-4010 (2006), Satoh et al. Expert Opin Biol. Ther. 6:1161-1173 (2006)). En la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo de origen humano, anticuerpo humano) puede incluir sustituciones o reemplazos de aminoácidos que alteran o adaptan funciones (por ejemplo, funciones efectoras). Por ejemplo, puede diseñarse una región constante de origen humano (por ejemplo, la región constante y1, la región constante y2) para reducir la activación del complemento y/o la unión al receptor Fc. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.648.260 (Winter et al.), 5.624.821 (Winter et al.) y 5.834.597 (Tso et al.). Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de una región constante de origen humano que contiene dichas sustituciones o reemplazos de aminoácidos es al menos aproximadamente 95 % idéntica en toda la longitud a la secuencia de aminoácidos de la región constante no alterada de origen humano, más preferentemente al menos aproximadamente 99 % idéntica en toda la longitud a la secuencia de aminoácidos de la región constante no alterada de origen humano.

En la presente divulgación, las funciones efectoras también pueden alterarse modulando el patrón de glucosilación del anticuerpo. Por alterar se entiende delecionar una o más fracciones de hidrato de carbono encontradas en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. Por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0157108 (Presta) se describen anticuerpos con actividades de tipo CCDA potenciadas con una estructura de hidrato de carbono madura que carece de fucosa unida a una región Fc del anticuerpo. Véase también la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Glycofi también ha desarrollado líneas de células de levadura capaces de producir glucoformas específicas de anticuerpos.

De manera adicional o alternativa, puede crearse un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras de GlcNac biseccionadas aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de tipo CCDA de los anticuerpos. Dichas modificaciones de hidratos de carbono pueden realizarse por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glucosilación alterada y pueden utilizarse como células hospedadoras en las que se realizan modificaciones por ingeniería genética para expresar anticuerpos recombinantes de la divulgación para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, en el documento EP 1.176.195 de Hang et al. se describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente desestabilizado, que codifica una fucosil transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. La Publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea de células CHO variante, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a hidratos de carbono ligados a Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). En la Publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. Se describen líneas celulares modificadas mediante ingeniería genética que expresan glucosil transferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas modificadas mediante ingeniería genética presentan estructuras de GlcNac biseccionadas aumentadas lo que da como resultado una actividad de tipo CCDa aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

También pueden prepararse anticuerpos humanizados utilizando una estrategia de injerto en CDR. En la materia se conocen técnicas de generación de dichos anticuerpos humanizados. En general, los anticuerpos humanizados se producen obteniendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias ligera variable y pesada variable de un anticuerpo que se une a GCC, identificando la región determinante de complementariedad o “CDR” en las secuencias ligera variable y pesada variable e injertando las secuencias de ácidos nucleicos de la CDR en secuencias de ácido nucleico estructurales humanas. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.816.567 y 5.225.539). La localización de las CDR y de los restos estructurales puede determinarse (véase, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242, y Chothia, C. et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en el presente documento tienen las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las CDR indicadas en las Tablas 5 y 6. En la presente divulgación, las secuencias de las Tablas 5 y 6 pueden incorporarse en moléculas que reconocen la GCC para su uso en métodos terapéuticos o de diagnóstico descritos en el presente documento. La estructura humana que se selecciona es una que es adecuada para la administración in vivo, lo que significa que no presenta inmunogenicidad. Por ejemplo, dicha determinación puede realizarse mediante un experimento anterior con el uso in vivo de dichos anticuerpos y estudios de similitudes de aminoácidos. Una región estructural adecuada puede seleccionarse a partir de un anticuerpo de origen humano que tenga al menos aproximadamente 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos y preferentemente al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda la longitud de la región estructural dentro de la secuencia de aminoácidos de la parte equivalente (por ejemplo, la región estructural (framework)) del anticuerpo donador, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC (por ejemplo, 3G1). La identidad de secuencia de aminoácidos puede determinarse utilizando un algoritmo de alineamiento de secuencias de aminoácidos adecuado tal como CLUSTAL W, utilizando los parámetros por defecto. (Thompson J. D. et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994)).

Una vez identificadas las CDR y las FR del anticuerpo clonado que se va a humanizar, las secuencias de aminoácidos que codifican las CDR se identifican y las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes se injertan en las FR humanas seleccionadas. Esto puede realizarse utilizando cebadores y enlazadores conocidos, cuya selección se conoce en la técnica. Todas las CDR de un anticuerpo humano particular puede reemplazarse con al menos una parte de una CDR no humana o solo con alguna de las CDR pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana o solo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado con un antígeno predeterminado. Después de que las CDR se hayan injertado sobre las FR humanas seleccionadas, las secuencias ligera variable y pesada variable “humanizadas” resultantes se expresan para producir un anticuerpo Fv humanizado o humanizado que se une a GCC. Preferentemente, el anticuerpo con injerto de CDR (por ejemplo, humanizado) se une a una proteína de GCC con una afinidad similar a, sustancialmente igual que, o mejor que, la del anticuerpo donador. Normalmente, las secuencias ligera y pesada variables humanizadas se expresan como una proteína de fusión con secuencias humanas de dominio constante para obtener un anticuerpo intacto que se una a GCC. Sin embargo, puede producirse un anticuerpo Fv humanizado que no contenga las secuencias constantes.

Además dentro del alcance de la divulgación, se encuentran anticuerpos humanizados en los que se han sustituido, delecionado o añadido aminoácidos específicos. En particular, los anticuerpos humanizados pueden tener sustituciones de aminoácidos en la región estructural, de tal manera que se mejora la unión con el antígeno. Por ejemplo, un número pequeño y seleccionado de restos estructurales aceptores de la cadena de inmunoglobulina inmunizada puede reemplazarse por los aminoácidos donadores correspondientes. Las localizaciones de las sustituciones incluyen restos de aminoácidos adyacentes a la CDR, o que son capaces de interaccionar con una CDR (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.585.089 o 5.859.205). La estructura aceptora puede ser una secuencia estructural o una secuencia consenso de anticuerpo humano maduro. Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia consenso” se refiere a la secuencia encontrada más frecuentemente o derivada de los restos más comunes en cada posición en una secuencia en una región entre miembros de una familia relacionada. Se dispone de diversas secuencias consenso de anticuerpos humanos, incluyendo secuencias consenso de los diferentes subgrupos de regiones variables humanas (véase, Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). Las bases de datos de Kabat y sus aplicaciones se encuentran disponibles gratuitamente en línea, por ejemplo, mediante IgBLAST en el National Center for Biotechnology Information Bethesda, Md. (véase también, Johnson, G. y Wu, T. T., Nucleic Acids Research 29:205-206 (2001)).

En Padlan et al. EP 519596 A1, publicada el 23 de diciembre de 1992, se describen otras técnicas de humanización de anticuerpos.

La molécula de anticuerpo anti-GCC incluye otros anticuerpos humanizados que también pueden modificarse mediante deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o “desinmunización” mediante los métodos desvelados en las Publicaciones PCT N.° WO 98/52976 y WO 00/34317. En resumen, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de especies de conejo, o de otras especies no humanas, de un anticuerpo anti-GCC, pueden analizarse para determinar péptidos que se unan al MHC de Clase II; estos péptidos representan posibles epítopos de linfocitos T. Para la detección de posibles epítopos de linfocitos T, puede aplicarse una estrategia informática de modelado denominada “reconocimiento del plegamiento de péptidos (peptide threading)”, y además puede analizarse una base de datos de péptidos de unión al MHC de clase II humano para determinar motivos presentes en las secuencias VH y VL de conejo, como se describe en las Publicaciones PCT N.° WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos DR principales del MHC de clase II, y por tanto, constituyen posibles epítopos de linfocitos T. Los posibles epítopos de linfocitos T detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de restos de aminoácidos en las regiones variables, o preferentemente, mediante simples sustituciones de aminoácidos. En la medida que sea posible, se realizan sustituciones conservativas, pudiendo utilizarse a menudo pero no exclusivamente, un aminoácido habitual en esta posición en las secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. En Tomlinson, I. A. et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992), se desvelan secuencias de la línea germinal humana. El directorio de BASES V proporciona un directorio exhaustivo de secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (recopilado por I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Después, la VH y VL de un anticuerpo anti-GCC desinmunizado se construye mediante mutagénesis de los genes VH y VL de conejo, pudiendo la secuencia variable mutagenizada, opcionalmente, fusionarse con una región constante humana, por ejemplo, las regiones constantes IgG1 o K (kappa) humanas.

En la presente divulgación, la reducción de una respuesta inmunogénica mediante un anticuerpo con CDR injertada puede realizarse mediante cambios, por ejemplo, deleciones, sustituciones, de restos de aminoácido en las CDR (Kashmiri et al. Methods 36:25-34 (2005), Patente de Estados Unidos No. 6,818,749, Tan et al. J. Immunol.

169:1119-1125 (2006)). Por ejemplo, los restos que están en posiciones implicadas en el contacto con el antígeno preferentemente no deberían cambiarse. Normalmente, dichos restos, los restos determinantes de especificidad (SDR, del inglés specifity determining residues), están en posiciones que presentan altos niveles de variabilidad entre los anticuerpos. Las secuencias consenso derivadas, por ejemplo, por el método Clustal (Higgins D. G. et al., Meth. Enzymol. 266:383-402 (1996)), de moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, de anticuerpos descritos en el presente documento, ayudan a identificar los SDR. En las moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en el presente documento, los SDR son los siguientes, al menos el primer resto, o en la presente divulgación, los cuatro primeros restos de la CDR1 de cadena pesada; al menos la parte N terminal, por ejemplo, los siete, diez o trece primeros restos de la CDR2 de cadena pesada; casi toda la CDR3 de cadena pesada; la parte C terminal, por ejemplo, después del resto seis, ocho o nueve de la CDR1 de cadena ligera; aproximadamente el primer resto, el resto del medio y/o el último resto de la CDR2 de cadena ligera; y la mayor parte de la CDR3 de cadena ligera, o al menos después del resto dos o tres. Por consiguiente, para mantener la unión con la proteína GCC después de la humanización o modificación de una molécula de anticuerpo anti-GCC, dichos restos SDR en las CDR de las moléculas de anticuerpo anti-GCC son menos susceptibles a cambios, por ejemplo, de restos de conejo a restos consenso humanos en comparación con restos en otros restos de las CDR o regiones estructurales. A la inversa, puede ser beneficioso cambiar restos en CDR no humanas, por ejemplo de conejo, por restos identificados como consenso en CDR humanas, por ejemplo, CDR de moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada N.° 20110110936.

En esta divulgación también son útiles anticuerpos anti-GCC que no son anticuerpos intactos. Dichos anticuerpos pueden proceder de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Como moléculas útiles de anticuerpo de este tipo se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), que consiste en un dominio VH; (vii) un anticuerpo de cadena pesada funcional de un solo dominio, que consiste en un dominio VHH (conocido como nanocuerpo) véase, por ejemplo, Cortez-Retamozo, et al., Cancer Res. 64: 2853-2857 (2004), y referencias citadas en su interior; y (vii) una C^d R aislada, por ejemplo, una o más CDR aisladas junto con suficientes estructuras para proporcionar un fragmento de unión a antígeno. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH están codificados por genes distintos, estos pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que los permite constituirse como una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988); y Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios se incluyan en la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y la utilidad de los fragmentos se explora de la misma manera que se hace para los anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab')2 y Fab pueden prepararse mediante escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante escisión con proteasas o escisión química.

En la presente divulgación, algunas o todas las secuencias CDR, de una o de las dos cadenas pesada y ligera, pueden utilizarse en otra molécula de anticuerpo, por ejemplo, en una molécula de anticuerpo con CDR injertada, humanizada o quimérica.

Las realizaciones incluyen una molécula de anticuerpo que comprende suficientes CDR, por ejemplo, las seis CDR de uno de los anticuerpos de hibridoma de ratón descritos en el presente documento para permitir la unión con la GCC de la superficie celular.

En la presente divulgación las CDR, por ejemplo, todas las HCDR, o todas las LCDR, o las seis, están incluidas en una o más regiones estructurales derivadas de ser humano o de ser humano. Como ejemplos de regiones estructurales humanas se incluyen secuencias estructurales de la línea germinal humana, secuencias de la línea germinal humana que se han madurado por afinidad (in vivo o in vitro), o secuencias humanas sintéticas, por ejemplo, secuencias consenso. En la presente divulgación, estructura de cadena pesada es una estructura IgG1 o IgG2. En la presente divulgación, la estructura de cadena ligera es una estructura kappa.

En presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, una molécula de anticuerpo con CDR injertada o humanizada, comprende suficientes CDR, por ejemplo, las seis CDR de uno de los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, las secuencias enumeradas en la Tabla 5, para permitir la unión a GCC. (En la Tabla 6 del presente documento se proporcionan secuencias de ácido nucleico ejemplares que pueden codificar las secuencias de aminoácidos de CDR enumeradas en la Tabla 5). En presente divulgación, una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender las CDR de MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4.

Los fragmentos de anticuerpo para uso terapéutico o diagnóstico in vivo pueden beneficiarse de modificaciones que mejoran su semivida en suero. Las fracciones orgánicas adecuadas destinadas a aumentar la semivida en suero in vivo del anticuerpo pueden incluir una, dos o más fracciones lineales o ramificadas seleccionadas de un grupo polimérico hidrófilo (por ejemplo, un polímero lineal o ramificado (por ejemplo, un polialcano glicol, tal como polietilenglicol, monometoxipolietilenglicol y similares), un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, una celulosa, un polisacárido y similares), un polímero de un aminoácido hidrófilo (por ejemplo, polilisina, poliasparato y similar), un óxido de polialcano y polivinilpirrolidona), un grupo de ácido graso (por ejemplo, un ácido monocarboxilico o un ácido dicarboxílico), un grupo éster de ácido graso, un grupo lipídico (por ejemplo, un grupo dicialglicerol, un grupo esfingolípido (por ejemplo, ceramidilo)) o un grupo fosfolipídico (por ejemplo, grupo fosfatidil etanolamina). Preferentemente, la fracción orgánica está unida a un sitio predeterminado en donde la fracción orgánica no afecta a la función (por ejemplo, disminuye la afinidad de unión al antígeno) del inmunoconjugado resultante en comparación con la fracción de anticuerpo no conjugada. La fracción orgánica puede tener un peso molecular de aproximadamente 500 Da a aproximadamente 50000 Da, preferentemente de aproximadamente 2 000, 5000, 10000 o 20000 Da. Ejemplos y métodos de modificación de polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos, con fracciones orgánicas pueden encontrarse, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.179.337 y 5.612.460, en las Publicaciones PCT N.° WO 95/06058 y WO 00/26256, y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20030026805.

Una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender toda la región variable o un fragmento de unión a antígeno de la región variable, de una o de las dos cadenas pesada y ligera, de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo anteriormente indicados.

En la presente divulgación la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de (a) puede diferir de una de la secuencia o secuencias de aminoácidos de referencia mencionadas en (a)(i-ii) a lo sumo en 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 15 restos. En la presente divulgación, las diferencias son sustituciones conservativas. En la presente divulgación, las diferencias están en las regiones estructurales. En la presente divulgación, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de (b) puede diferir de una de la secuencia o secuencias de aminoácidos de referencia mencionadas en (b)(i-ii) a lo sumo en 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 15 restos. En la presente divulgación las diferencias son sustituciones conservativas. En la presente divulgación las diferencias están en las regiones estructurales.

En la presente divulgación la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende una o ambas de:

(a) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de toda, o de un fragmento de unión a antígeno de, cualquiera de, (i) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la Tabla 3, por ejemplo, SEQ ID NO: 13 o (ii) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos de la Tabla 4, por ejemplo, SEQ ID NO: 12; y

(b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de toda, o de un fragmento de unión a antígeno de, cualquiera de, (i) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la Tabla 3, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 o (ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos de la Tabla 4, por ejemplo, SEQ ID NO: 10.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende una o ambas de:

(a) una región variable de cadena ligera, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que tiene al menos 85, 90, 95, 97 o 99 % de homología con la región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación; y

(b) una región variable de cadena pesada, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que tiene al menos 85, 90, 95, 97 o 99 % de homología con la región variable de cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación.

En la Tabla 3 pueden encontrarse secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-GCC de la divulgación.

En una estrategia, pueden utilizarse secuencias consenso que codifican las regiones J de cadena ligera y pesada para diseñar oligonucleótidos para su uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para posterior ligamiento de segmentos de la región V con segmentos de la región C humana. El ADNc de la región C puede modificarse mediante mutagénesis dirigida para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC (siglas del inglés yeast artificial chromosome, cromosoma artificial de levadura), episomas derivados de EBV y similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados modificados por ingeniería genética de manera que cualquiera de la secuencia VH o VL puede insertarse y expresarse fácilmente. En dichos vectores, normalmente el corte y empalme se produce entre el sitio donador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que se producen dentro de los exones CH humanos. Los vectores de expresión adecuados pueden contener diversos componentes, por ejemplo, un origen de replicación, un gen marcador de selección, uno o más elementos de control de la expresión, tal como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, promotor, potenciador, terminador), y/o una o más señales de traducción, una secuencia señal o secuencia líder y similares. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos aguas abajo de las regiones codificantes. El anticuerpo quimérico resultante puede unirse a cualquier promotor fuerte. Como ejemplos de vectores adecuados que pueden utilizarse se incluyen aquellos que son adecuados para los hospedadores de mamífero y que se basen en sistemas de replicación vírica, tal como el virus 40 simio (SV40), virus de sarcoma de Rous (RSV), adenovirus 2, papilomavirus bovino (BPV), papovarirus BK mutante (BKV) o citomegalovirus (CMV) de ratón y ser humano, y el virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), promotores de Ig nativos, etc. En la técnica se conoce una variedad de vectores adecuados, incluyendo vectores que están conservados en una sola copia o en múltiples copias, o que comienzan a integrarse en el cromosoma de la célula hospedadora, por ejemplo, mediante LTR, o mediante cromosomas artificiales modificados genéticamente con sitios de integración múltiples (Lindenbaum et al. Nucleic Acids Res. 32:e172 (2004), Kennard et al. Biotechnol. Bioeng. Online 20 de mayo de 2009). En un apartado más adelante se enumeran ejemplos adicionales de vectores adecuados.

Por tanto, la divulgación describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humanizado, quimérico o fragmento de unión de antígeno de cualquiera de lo anterior), una cadena de anticuerpo (por ejemplo, cadena pesada, cadena ligera) o parte de unión al antígeno de una cadena de anticuerpo que se une a la proteína GCC. La expresión en células hospedadoras eucariotas es útil porque en comparación con las células procariotas es mucho más probable que dichas células se ensamblen y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y correctamente plegado. Sin embargo, cualquier anticuerpo producido que sea inactivo debido a un plegamiento incorrecto puede renaturalizarse de acuerdo con métodos conocidos (Kim and Baldwin, “Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding”, Ann. Rev. Biochem. 51, págs. 459-89 (1982)). Es posible que las células hospedadoras produzcan partes de anticuerpos intactos, tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada, que también son homólogos de anticuerpo según la presente divulgación.

Asimismo, como se describe en cualquier otra parte del presente documento, utilizando técnicas bien conocidas en la materia, pueden prepararse anticuerpos o anticuerpos de especies humanas o no humanas generados a través de tecnologías de presentación en fagos, incluyendo, sin limitación, presentación en fagos, en retrovirus en ribosomas y otras técnicas y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración por afinidad, tal y como se conocen dichas técnicas en la materia. Winter y Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes y Plutchau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (presentación en ribosomas), Parmley y Smith Gene 73:3005:318 (1988) (presentación en fagos), Scott TIBS 17:241:245 (1992), Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1981-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol Reviews 130: 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992), y la patente de Estados Unidos No. 5 733 743. Si se utilizan tecnologías de presentación para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos pueden humanizarse como se describe anteriormente.

Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente un isotipo deseado particular, sino que el anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo. Por ejemplo, el anticuerpo producido por el hibridoma de conejo MIL-44-148-2 tiene un isotipo IgG. El isotipo del anticuerpo se puede cambiar posteriormente, por ejemplo, a IgG2 o IgG3 para provocar una respuesta de tipo CCDA cuando el anticuerpo se une a GCC en una célula, usando técnicas convencionales conocidas en la materia. Dichas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.397), técnicas de fusión célulacélula (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.916.771), entre otras. En la técnica de fusión célulacélula, se prepara un mieloma u otra línea celular que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma u otra línea celular que posee la cadena ligera. Dichas células pueden fusionarse posteriormente y puede aislarse una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti GCC es un anticuerpo de IgG1 anti-GCC de conejo. Dado que dichos anticuerpos poseen la unión deseada con la molécula de CCG, uno cualquiera de dichos anticuerpos puede cambiarse fácilmente de isotipo para generar otro isotipo mientras posee la misma región variable (que define la especificidad y afinidad del anticuerpo, hasta cierto punto). En consecuencia, a medida que se generan candidatos de anticuerpos que cumplen con los atributos "estructurales" deseados como se indicó anteriormente, generalmente se les puede proporcionar al menos ciertos atributos "funcionales" adicionales que se desean mediante el cambio de isotipo.

En la presente divulgación, la región variable o el fragmento de unión al antígeno de la misma, se puede acoplar a una región constante (o fragmento de la misma) distinta de la región constante de la que se generó, por ejemplo, una región constante (o fragmento de la misma) de otro anticuerpo o se puede acoplar a una región constante sintética (o fragmento de la misma). En la presente divulgación, la región constante es una región constante de IgG1 o IgG2 (o un fragmento de la misma). Para modificar la actividad efectora de la molécula de anticuerpo Se pueden hacer cambios de secuencia en las regiones variables o constantes.

Diseño y generación de otras terapias

Los anticuerpos que se producen y caracterizan en el presente documento con respecto a CCG proporcionan el diseño de otras modalidades terapéuticas que incluyen otros anticuerpos, otros antagonistas o fracciones químicas distintas de los anticuerpos. Dichas modalidades incluyen, sin limitación, anticuerpos que tienen una actividad o funcionalidad de unión similar, opciones terapéuticas avanzadas con anticuerpos, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunoconjugados y fármacos terapéuticos radiomarcados, generación de opciones terapéuticas con péptidos, particularmente intracuerpos, y moléculas pequeñas. Asimismo, como se desveló anteriormente, la función efectora de los anticuerpos de la divulgación puede cambiarse mediante el cambio de isotipo a una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE o IgM para diversos usos terapéuticos.

En relación con los anticuerpos biespecíficos, se pueden generar anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad para GCC y otro para una segunda molécula con la que se conjuga, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica para GCC y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo monocatenario que tiene especificidad para GCC y la otra molécula. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden producirse entrecruzando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. Véase también, por ejemplo, Fanger et al. Immunomethods 4: 72-81 (1994) y Winter y Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993) y Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) y en relación con (iii) véase, por ejemplo, Traunecker et al. En t. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992). Songsivilai y Lachmann Clin. Exp. Immunol 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

Además, también pueden prepararse "Kappacuerpos" (Ill. et al. Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin et. al. EMBO J. 13: 5303-9 (1994), Patente de Estados Unidos N° 5837821), "Diacuerpos" (Holliger et al. Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Traunecker y col., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker et al., Int J Cancer Supl 7: 51-52 (1992)).

Ácidos Nucleicos y Polipéptidos

En la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que codifican o representan las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento. Dichos polinucleótidos codifican las regiones variables y constantes de cada una de las cadenas pesadas y ligeras, aunque en la presente divulgación también se contemplan otras combinaciones de acuerdo con las composiciones descritas en el presente documento. En la presente divulgación también se contemplan fragmentos de oligonucleótidos derivados de las secuencias de polinucleótidos y ácidos nucleicos desveladas complementarias a estos polinucleótidos.

Los polinucleótidos pueden estar en forma de ARN o ADN. Los polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico, análogos de ácidos nucleicos y ADN sintético, están dentro del alcance de la presente divulgación. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario, puede ser la cadena codificante (sentido) o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificante proporcionada en el presente documento o puede ser una secuencia codificante diferente cuya secuencia codificante, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido que el ADN proporcionado en el presente documento.

En la presente divulgación proporcionada, los polinucleótidos codifican al menos una región variable de la cadena pesada y al menos una región variable de la cadena ligera de la presente divulgación, por ejemplo, como se resume en la Tabla 4.

La presente divulgación también incluye polinucleótidos variantes que contienen modificaciones tales como deleciones, sustituciones o adiciones de polinucleótidos, y cualquier modificación de polipéptidos resultante de la secuencia polinucleotídica variante. Un polinucleótido de la presente divulgación también puede tener una secuencia codificante que sea una variante de la secuencia codificante proporcionada en este documento. Por ejemplo, un polinucleótido variante puede tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 97 % de identidad con un polinucleótido enumerado en la Tabla 4. En la presente divulgación, el polinucleótido variante codifica una molécula de anticuerpo anti-GCC.

La presente divulgación se refiere además a polipéptidos que representan los anticuerpos de la presente divulgación, así como a fragmentos, análogos y derivados de dichos polipéptidos. Los polipéptidos de la presente divulgación pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos producidos de manera natural o polipéptidos sintéticos. El fragmento, derivado o análogos de los polipéptidos de la presente divulgación puede ser uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético; o puede ser uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente; o puede ser uno en el que el polipéptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); o puede ser uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido o una secuencia de proproteína. Dichos fragmentos, derivados y análogos, están dentro del alcance de la presente divulgación. En diversos aspectos, los polipéptidos de la divulgación pueden ser productos parcialmente purificados o purificados.

Un polipéptido de la presente divulgación puede tener una secuencia de aminoácidos que sea idéntica a la de los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, resumidos en las Tablas 2 o 3, o que sea diferente por variaciones menores debido a una o más sustituciones de aminoácidos. La variación puede ser un "cambio conservativo" normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, en el que el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, el reemplazo de leucina por isoleucina o treonina por serina; el reemplazo de lisina por arginina o histidina. Por el contrario, las variaciones pueden incluir cambios no conservativos, por ejemplo, el reemplazo de una glicina por un triptófano. Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos o ambas cosas. Se puede encontrar orientación para determinar cuáles y cuántos restos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o delecionar sin cambiar la actividad biológica o inmunológica utilizando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, el programa informático DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.).

En otro aspecto, la divulgación presenta ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican moléculas de anticuerpo anti-GCC. En la presente divulgación, los ácidos nucleicos codifican uno o más de una molécula de anticuerpo, una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable de cadena ligera, una región variable de cadena pesada, partes de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento (por ejemplo, un fragmento de la región variable de cadena ligera que, cuando se empareja con una región variable de cadena pesada de longitud completa, se une al antígeno, o un fragmento de región variable de cadena pesada que cuando se combina con una región variable de cadena ligera de longitud completa se une a antígeno), y las CDR . Las realizaciones incluyen dichos ácidos nucleicos dispuestos en vectores, por ejemplo, vectores de expresión. Aún más, la divulgación abarca moléculas de anticuerpo producidas por células hospedadoras, por ejemplo, que expresan las moléculas de anticuerpo codificadas por dichos plásmidos.

En la presente divulgación, se proporciona un vector, por ejemplo, un vector de expresión, que comprende una o ambas de:

secuencias que codifican una región variable de cadena ligera, por ejemplo, una región variable de cadena ligera descrita en la Tabla 3, por ejemplo, una secuencia enumerada en la Tabla 4, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o una, dos o tres CDR de una cadena ligera (y opcionalmente un región estructural), descritas en el presente documento, por ejemplo, las CDR descritas en la Tabla 5, por ejemplo, una secuencia codificante de CDR en la Tabla 6; y

secuencias que codifican una región variable de cadena pesada, por ejemplo, una región variable de cadena pesada descrita en la Tabla 3, por ejemplo, una secuencia enumerada en la Tabla 4, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o una, dos o tres CDR de una cadena pesada (y opcionalmente una región estructural), descritas en el presente documento, por ejemplo, las CDR descritas en la Tabla 5, por ejemplo, una secuencia codificante de CDR en la Tabla 6.

En la presente divulgación proporcionada, los polinucleótidos codifican al menos una región variable de cadena pesada o al menos una región variable de cadena ligera de los anticuerpos de la presente divulgación. En la presente divulgación proporcionada, los polipéptidos pueden codificar al menos una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de los anticuerpos de la presente divulgación.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende una o ambas de:

(a) una región variable de cadena ligera, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, codificada por un ácido nucleico que hibrida en condiciones de restricción seleccionadas con, (i) el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 4, o (ii) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación, por ejemplo, uno de los anticuerpos de conejo mencionados anteriormente resumidos en las Tablas 1 y 2; y

(b) una región variable de cadena pesada, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, codificada por un ácido nucleico que hibrida en condiciones de restricción seleccionadas con, (i) el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 4, o (ii) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación, por ejemplo, uno de los anticuerpos de conejo mencionados anteriormente resumidos en las Tablas 1 y 2.

En la presente divulgación, las condiciones de rigurosidad seleccionadas son condiciones de alta rigurosidad o de muy alta rigurosidad, por ejemplo, tal como se describen en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona vectores que incluyen los polinucleótidos de la presente divulgación, células hospedadoras que están genéticamente modificadas con vectores de la presente divulgación y la producción de los anticuerpos de la presente divulgación mediante técnicas recombinantes.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitios de endonucleasa de restricción apropiados mediante procedimientos conocidos en la técnica. La secuencia de polinucleótidos en el vector de expresión está unida operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada (es decir, promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, entre otros, la LTR (del inglés long terminal repeat, repetición terminal larga) del virus del sarcoma de Rous o el promotor temprano o tardío de SV40, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor P^l del fago lambda y otros promotores conocidos que controlan la expresión de genes en células procariotas (por ejemplo, promotores tac, T3, T7 de E. coli) o eucariotas (por ejemplo, promotor de citomegalovirus, promotor tardío de adenovirus, promotor EF-1a) o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Por ejemplo, el vector puede contener potenciadores, que son secuencias de ADN de origen vírico que estimulan la transcripción, tales como las derivadas de virus simios tal como el SV40, virus de polioma, citomegalovirus, papilomavirus bovino o virus del sarcoma de Moloney, o de origen genómico. El vector también contiene, preferentemente, un origen de replicación. El vector puede construirse para que contenga un origen de replicación exógeno o dicho origen de replicación puede derivar del virus SV40 o de otra fuente vírica, o puede construirse a través del mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Además, para la selección de células hospedadoras transfectadas, los vectores contienen opcionalmente un gen marcador, tales como los genes marcadores de dihidrofolato reductasa para permitir la selección con metotrexato en una variedad de hospedadores, o antibióticos, tales como el gen de la beta-lactamasa (resistencia a la ampicilina), el gen de Tet (de resistencia a tetraciclina) utilizado en células procariotas o genes de resistencia a neomicina, GA418 (geneticina, un derivado de neomicina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina, o genes que complementan una lesión genética de las células hospedadoras, como la ausencia de timidina cinasa, hipoxantina fosforibosiltransferasa, dihidrofolato reductasa, etc. Los genes que codifican el producto génico de los marcadores auxotróficos del hospedador (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) a menudo se usan como marcadores de selección en levaduras.

Para obtener los anticuerpos de la presente divulgación, una o más secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada y las regiones constantes de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos de la presente divulgación deben incorporarse en un vector. Las secuencias de polinucleótidos que codifican las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos de la presente divulgación pueden incorporarse en uno o múltiples vectores y después incorporarse en las células hospedadoras.

Los vectores de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero incluyen, por ejemplo, pCDM8, pcDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5 , pXT1 (Stratagene, La Jolla, California), pCDEF3 (Goldman, LA, et al., Biotechniques, 21: 1013-1015 (1996)), pSVSPORT (división GIBCO de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990)), retrovector bicistrónico GPEX® (Gala Biotech, Middleton, Wis.) y similares. Vectores de expresión que son adecuados para su uso en diversos hospedadores de expresión, tales como células procariotas (E. coli), células de insectos (células de Drosophila Schnieder S2, Sf9) y levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) también están disponibles. Los vectores ejemplares son pLKTOK58 (secuencia de Fc de IgG1 de tipo silvestre) y pLKTOK59 (secuencia de Fc de IgG1 mutada) (véase la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 20060147445).

Como se apreciará, los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación, pueden expresarse en líneas celulares distintas de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican los ADNc o los clones genómicos para los anticuerpos particulares, pueden usarse para células hospedadoras de mamífero o no mamíferos adecuadas. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, que incluye, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector vírico) y transducir una célula hospedadora con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los) polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa de la molécula de ADN. El procedimiento de transformación utilizado depende del hospedador a transformar. En la técnica se conocen métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen, pero sin limitación, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, bombardeo de partículas, encapsulación del(de los) polinucleótido(s ) en liposomas, conjugados peptídicos, dendrímeros y microinyección directa del ADN en los núcleos.

En otro aspecto, la divulgación presenta, una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico descrito en el presente documento. En la presente divulgación, la célula expresa una molécula de anticuerpo, o un componente de la misma, descrito en el presente documento. Aún más, la presente divulgación describe un método para producir una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de conejo, o una versión humanizada de la misma, que conservar la célula hospedadora en condiciones apropiadas para la expresión, por lo que la(s) cadena(s) de inmunoglobulina se expresa(n) y se produce una molécula de anticuerpo. La presente divulgación describe una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión anteriores que codifican secuencias de anticuerpos de cadena pesada y ligera. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula procariota, por ejemplo, E. coli. Por ejemplo, la célula de mamífero puede ser una célula o una línea celular cultivada. Las células de mamífero ejemplares incluyen líneas celulares linfocíticas (por ejemplo, NS0), células de ovario de hámster chino (CHO), células COS. En la presente divulgación, la célula hospedadora cultivada es una célula CHO que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de anticuerpo MIL-44-148-2. En la presente divulgación, la célula hospedadora es el hibridoma MIL-44-148-2 (PTA-8132). Además, las células incluyen células de ovocitos y células de un animal transgénico, por ejemplo, células epiteliales mamarias. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento pueden expresarse en un animal no humano transgénico.

En la técnica se conocen líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), incluidas, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células HeLa, células renales de cría hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y diversas otras líneas celulares. Las células que no son de mamífero, incluyendo pero sin limitación, bacterias, levaduras, insectos y plantas, también pueden usarse para expresar anticuerpos recombinantes. Se puede preferir la mutagénesis dirigida del dominio CH2 del anticuerpo para eliminar la glucosilación con el fin de impedir cambios en cualquiera de las funciones inmunogenicidad, farmacocinética y/o efectoras resultantes de la glucosilación no humana. Los métodos de expresión se seleccionan determinando qué sistema genera los niveles de expresión más altos y produce anticuerpos con propiedades de unión a CCG constitutivas.

En la presente divulgación, se describe un método de producción de una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, que comprende conservar la célula hospedadora que comprende los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, por ejemplo, una o más secuencias de ácidos nucleicos enumeradas en la Tabla 4 o 6, en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina, mediante lo cual se expresan las cadenas de inmunoglobulina, y se produce una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de conejo, o una versión humanizada de la misma, que se une a GCC, o a un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, los métodos de expresión de moléculas de anticuerpo incluyen el uso de células hospedadoras en las que una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, y una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una cadena pesada de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, están comprendidas en un solo vector de expresión. En la presente divulgación, están en vectores distintos. Si se desea, el método puede comprender además la etapa de aislar o recuperar el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, la cadena de anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cadena de anticuerpo.

Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (es decir, una o más moléculas de ácido nucleico) que codifica las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de conejo (o humanizado) que se une a una proteína GCC, o una construcción de expresión (es decir, una o más construcciones) que comprende dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, se puede introducir en una célula hospedadora adecuada para crear una célula hospedadora recombinante usando cualquier método apropiado para la célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de modo que la(s) molécula(s) de ácido nucleico está(n) unida(s) operativamente a uno o más elementos de control de expresión (por ejemplo, en un vector, en una construcción creada por procesos en la célula, integrados en el genoma de la célula hospedadora). La célula hospedadora recombinante resultante puede conservarse en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de un inductor, en un animal no humano adecuado, en medios de cultivo adecuados complementados con sales, factores de crecimiento, antibióticos, complementos nutricionales, etc. adecuados) mediante lo cual se produce(n) el(los) polipéptido(s) codificado(s). Si se desea, la proteína codificada se puede aislar o recuperar (por ejemplo, del animal, de la célula hospedadora, del medio, de la leche). Este proceso abarca la expresión de una planta o de un animal transgénico no humano, en una célula hospedadora (véase, por ejemplo, el documento WO 92/03918, GenPharm International).

Además, la expresión de los anticuerpos de la divulgación (o de otras fracciones de los mismos) a partir de líneas celulares de producción, se puede mejorar usando diversas técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión de los genes de glutamina sintetasa y de DHFR son estrategias habituales para mejorar la expresión en determinadas condiciones. Pueden identificarse clones de células con alto nivel de expresión usando técnicas convencionales, tales como clonación con dilución limitada, tecnología de microgota o cualquier otros métodos conocidos en la técnica. El sistema GS se comenta en su totalidad o en parte en relación con las Patentes Europeas N°. 0216846, 0256055 y 0323997 y con la solicitud de Patente Europea N°. 89303964.4.

En un sistema ejemplar, para la expresión recombinante de un anticuerpo modificado, o de una parte de unión a antígeno del mismo, de la divulgación, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo, se introduce en células dhfr-CHO mediante transfección mediada con de fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno de los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo está unido operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tal como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para estimular altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadora transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo, se utilizan técnicas estándar de biología molecular.

Los anticuerpos de la divulgación también se pueden producir de forma transgénica a través de la generación de un mamífero que es transgénico o de una planta que es transgénica para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable a partir de los mismos. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos se pueden producir en, y recuperar de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5827690, 5 756687, 5750172 y 5741 957.

Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, cadenas de anticuerpo y partes de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, también se pueden producir en un sistema de expresión in vitro adecuado, mediante síntesis química o mediante cualquier otro método adecuado.

Proteínas de fusión e inmunoconjugados

Los anticuerpos anti-GCC descritos en el presente documento pueden unirse funcionalmente mediante cualquier método adecuado (por ejemplo, acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro) a una o más entidades moleculares que no son anticuerpos.

Se pueden producir proteínas de fusión en las que una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en el presente documento y una fracción que no es un anticuerpo, son componentes de una sola cadena de polipéptidos continua. La fracción que no es un anticuerpo se puede localizar en el extremo N terminal, C-terminal o internamente, con respecto a la fracción de anticuerpo. Por ejemplo, la presente divulgación se puede producir mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica secuencias de inmunoglobulina en un vector de expresión adecuado, tal como un vector pET (por ejemplo, pET-15b, Novagen), un vector de fago (por ejemplo, pCNATAB 5 E, Pharmacia) u otro vector, por ejemplo, vector de fusión pRIT2T y Proteína A, Pharmacia). La construcción resultante se puede expresar para producir cadenas de anticuerpos que comprenden una fracción que no es un anticuerpo (por ejemplo, una etiqueta de histidina, etiqueta E o dominio de unión de IgG con proteína A). Las proteínas de fusión pueden aislarse o recuperarse usando cualquier técnica adecuada, tal como cromatografía usando una matriz de afinidad adecuada (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M et al., Eds., Vol. 2, Supl. 26 , págs. 16.4.1-16.7.8 (1991)).

La divulgación describe moléculas de anticuerpo anti-GCC que se dirigen a las células, y en la presente descripción, se internalizan en ellas. Estas moléculas son capaces de administrar agentes terapéuticos o agentes detectables a las células que expresan CCG o dentro de ellas, pero no a las células, o dentro de ellas, donde no se expresa la diana. Por tanto, la divulgación también describe inmunoconjugados anti-GCC que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en el presente documento, que se conjuga con un agente terapéutico o un agente detectable. En la presente divulgación, la afinidad por CCG de un inmunoconjugado anti-CCG es al menos 10, 25, 50, 75, 80, 90, o 95 % de la del anticuerpo no conjugado. Esto se puede determinar utilizando GCC de la superficie celular o GCC aislada. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconjugado, tiene una LD50, determinada mediante un ensayo descrito en el presente documento, menor de 1 000, 500, 250, 100 o 50 pM.

La molécula de anticuerpo anti-GCC puede modificarse para actuar como un inmunoconjugado utilizando técnicas conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14: 252 (1993). Véase también la patente de Estados Unidos N° 5194594. La preparación de anticuerpos radiomarcados también puede realizarse fácilmente utilizando técnicas conocidas en la materia. Véanse, por ejemplo, Junghans et al. en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes de Estados Unidos N° 4681 581, 4735210, 5101827, 5 ,102990 (Re. Pat. de Estados Unidos N°. 35500), 5648471 y 5697902.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo y la fracción que no es anticuerpo están conectadas por medio de un enlazador. En la presente divulgación, el inmunoconjugado se representa con la fórmula (I):

Ab(X-Z)m

en la que,

Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento;

X es una fracción que conecta Ab y Z, por ejemplo, el resto de un enlazador descrito en el presente documento después de la unión covalente con uno, o ambos, de Ab y Z;

Z es un agente o marcador terapéutico; y

m varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 15.

La variable m representa el número de fracciones --X--Z por molécula de anticuerpo en un inmunoconjugado de fórmula (I). En la presente divulgación, m varía de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o de 1 a 2. En la presente divulgación, m varía de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o de 2 a 3. En otra parte de la presente divulgación, m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En composiciones que comprenden una pluralidad de inmunoconjugados de fórmula (I), m es el número promedio de fracciones --X--Z por Ab, también denominado carga promedio de fármaco. La carga promedio de fármaco puede variar de 1 a aproximadamente 15 fracciones --X--Z por Ab. En la presente divulgación, cuando m representa la carga promedio de fármaco, m es aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 u aproximadamente 8. En la presente descripción, m es de aproximadamente 2 a aproximadamente 8. En la presente divulgación, m es aproximadamente 8. En la presente divulgación, m es aproximadamente 4. En la presente divulgación, m es aproximadamente 2.

El número promedio de fracciones --X--Z por Ab puede caracterizarse por medios convencionales, tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA y HPLC. La distribución cuantitativa de los inmunoconjugados en términos de m también puede determinarse. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de inmunoconjugados homogéneos, donde m es un valor determinado, a diferencia de los inmunoconjugados con otras cargas de fármacos, se puede realizar por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis.

Los inmunoconjugados de fórmula (I) pueden existir como mezclas, en donde cada componente de la mezcla tiene un valor m diferente. Por ejemplo, un inmunoconjugado de fórmula (I) puede existir como una mezcla de dos componentes inmunoconjugados distintos: un componente inmunoconjugado en donde m es 7, y el otro componente inmunoconjugado en donde m es 8.

En la presente divulgación, el inmunoconjugado de fórmula (I) existe como una mezcla de tres inmunoconjugados distintos, en donde m para los tres inmunoconjugados distintos es 1, 2 y 3, respectivamente; 3, 4 y 5, respectivamente; 5, 6 y 7, respectivamente; 7, 8 y 9, respectivamente; 9, 10 y 11, respectivamente; 11, 12 y 13, respectivamente; o 13, 14 y 15, respectivamente.

En la técnica se conoce una variedad de enlazadores adecuados (por ejemplo, reactivos heterobifuncionales para conectar una molécula de anticuerpo a un agente o marcador terapéutico) y métodos para la preparación de inmunoconjugados. (Véase, por ejemplo, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)). El enlazador puede ser escindible, por ejemplo, en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en condiciones intracelulares, de tal manera que la escisión del enlazador libera el fármaco (es decir, el agente o marcador terapéutico) en el entorno intracelular. En la presente divulgación, en enlazador no es escindible, y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo.

El enlazador puede estar unido a un grupo químicamente reactivo en la fracción de anticuerpo, por ejemplo, a un grupo libre amino, imino, hidroxilo, tiol o carboxilo (por ejemplo, en el extremo N o C, en el grupo amino épsilon de uno o más restos de lisina, en el grupo libre de ácido carboxílico de uno o más restos de ácido glutámico o ácido aspártico, o en el grupo sulfihidrilo de uno o más restos de cisteinilo). El sitio al cual se une el enlazador puede ser un resto natural en la secuencia de aminoácidos de la fracción de anticuerpo o puede introducirse en la fracción de anticuerpo, por ejemplo, mediante tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, introduciendo un sitio de escisión de cisteína o proteasa en la secuencia de aminoácidos) o mediante bioquímica de proteínas (por ejemplo, reducción, ajuste de pH o proteólisis).

Uno de los métodos inespecíficos más habitualmente utilizados de unión covalente es de la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto con grupos amino (o carboxi) de la molécula de anticuerpo. Adicionalmente, se han utilizado agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto con grupos amino de una molécula de anticuerpo. Para la unión de fármacos (es decir, un agente o marcador terapéutico) con moléculas de anticuerpo también se dispone de la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación de peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, formando así un aldehído que después reacciona con la molécula de anticuerpo. La unión se produce mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino de la molécula de anticuerpo. Los isotiocianatos también pueden utilizarse como agentes de acoplamiento para unir de manera covalente fármacos con la molécula de anticuerpo. El experto en la materia conoce otras técnicas y se encuentran dentro del ámbito de la presente divulgación.

Eb determinados casos de la presente divulgación, un producto intermedio, que es el precursor del enlazador (X), reacciona con el fármaco (Z) en condiciones apropiadas. En ciertos casos de la presente divulgación, se utilizan grupos reactivos en el fármaco y/o el producto intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco (es decir, el agente o marcador terapéutico) y el producto intermedio, o el fármaco derivatizado, reacciona posteriormente con la molécula de anticuerpo en condiciones apropiadas.

El inmunoconjugado puede purificarse de los reactantes empleando metodologías bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía de interacción hidrófoba), diálisis, diafiltración o precipitación. El inmunoconjugado puede evaluarse empleando metodologías bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, SDS-PAGE, espectroscopia de masas o electroforesis capilar.

En algunos casos de la presente divulgación, el enlazador es escindible mediante un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde mediante una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. En la presente divulgación, el enlazador de peptidilo tiene una longitud de al menos dos aminoácidos, o de al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, y se sabe que todas ellas hidrolizan derivados de fármacos dipeptídicos dando como resultado la liberación del fármaco activo (es decir, el agente o marcador terapéutico), dentro de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Más habituales son los enlazadores de peptidilo que son escindibles por enzimas que están presentes en las células que expresan GCC. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador de peptidilo que es escindible por la proteasa catepsina B dependiente de tiol, que se expresa a niveles muy elevados en tejido canceroso (por ejemplo, un enlazador de Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 319)). Otros ejemplos de dichos enlazadores se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6214345. En la presente divulgación, el enlazador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit o un enlazador Phe-Lys (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador val-cit). Una ventaja del uso de la liberación proteolítica intracelular del fármaco (es decir, el agente o marcador terapéutico) es que el fármaco se atenúa normalmente cuando se conjuga y la estabilidad en suero de los conjugados es normalmente alta.

En la presente divulgación, el enlazador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrolisis a determinados valores de pH. Normalmente, el enlazador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un enlazador ácido-lábil que se hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida de ácido cis-aconítico, ortoéster, acetal, cetal o similar). (Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Dichos enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tal como las de la sangre, pero son inestables a un pH por debajo de 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En la presente divulgación, el enlazador hidrolizable es un enlazador tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace de acilhidrazona (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.622.929).

En la presente divulgación, el enlazador es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador de disulfuro). En la técnica se conocen diversos enlazadores disulfuro, incluyendo, por ejemplo, aquellos que pueden formarse utilizando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno)-, SPDB y SMPT (Véase, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la Patente de Estados Unidos N.° 4880935).

En la presente divulgación, el enlazador es un enlazador de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res.

15:1387-93), un enlazador de maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg Med. Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).

En la presente divulgación, la unidad enlazadora no es escindible y el fármaco (es decir, agente o marcador terapéutico) se libera por degradación del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N.° 20050238649

Normalmente, el enlazador no es sustancialmente sensible en el entorno extracelular. Como se usa en el presente documento, “no sustancialmente sensible en el entorno extracelular”, en el contexto de un enlazador, significa, en una muestra de inmunoconjugado, que no más de aproximadamente el 20 %, normalmente no más de aproximadamente el 15 %, más normalmente no más de aproximadamente el 10 %, e incluso más normalmente no más de aproximadamente el 5 %, no más de aproximadamente el 3 % o no más de aproximadamente el 1 % de los enlazadores, se escinden cuando el inmunoconjugado se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). El hecho de que un enlazador no sea sustancialmente sensible en el entorno extracelular puede determinarse, por ejemplo, incubando con plasma el inmunoconjugado durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y después cuantificando la cantidad del fármaco libre presente en el plasma.

En la presente divulgación, el enlazador promueve la internalización celular. En la presente divulgación, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente o marcador (Z) terapéutico. En la presente divulgación, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con la fracción Z como con la molécula de anticuerpo anti-GCC.

Con las presentes composiciones y métodos descritos en el documento WO 2004-010957, Publicación de Estados Unidos N.° 20060074008, Publicación de Estados Unidos N.° 20050238649 y Publicación de Estados Unidos N.° 20060024317 puede utilizarse una variedad de enlazadores ejemplares.

Los ejemplos de enlazadores capaces de utilizarse para acoplar una molécula de anticuerpo a un agente o marcador terapéutico incluyen, por ejemplo, enlazadores de maleimidocaproilo (mc); maleimidocaproil-paminobencilcarbamato; enlazadores de maleimidocaproil-péptido-aminobencilcarbamato, por ejemplo, enlazadores de maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobencilcarbamato y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-paminobencilcarbamato (vc); N-succinimidil 3-(2-piridilditio)proprionato (también conocido como N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato o SPP); 4-succinimidil-oxicarbonil-2-metil-2-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT); N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP); N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butirato (SPDB); 2-iminotiolano; anhídrido S-acetilsucínico; disulfuro benzil carbamato; carbonato; enlazadores de hidrazona; éster de N-(amaleimidoacetoxi)succinimida; N-[4-(p-azidosalicilamido) butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamida (AMAS); éster de N-[.beta.-maleimidopropiloxi]succinimida (BMPS); éster de [N-£-maleimidocaproiloxi]succinimida (EMCS); éster de N-[^y-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS); succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amidocaproato] (LC-SMCC); succinimidil 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato (LC-SPDP); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); N-succinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato (SIAB); Succinimidil 4-[Nmaleimidometil]cidohexano-1-carboxilato (SMCC); N-succinimidil 3-[2-piridilditio]-propionamido (SPDP); éster de [N-£-maleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida (sulfo-EMCS); éster de N-[Y-maleimidobutiriloxi]sulfosuccinimida (sulfo-GMBS); 4-sulfosuccinimidil-6-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato) (sulfo-LC-SMPT); sulfosuccinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato (sulfo-LC-SPDP); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS); N-sulfosuccinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato (sulfo-SIAB); sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); sulfosuccinimidil 4-[p-maleimidofenil]butirato (sulfo-SMPB); etilenglicol-bis(ácido succínico de éster de N-hidroxisuccinimida) (EGS); tartrato de disuccinimidilo (DST); ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacético (DOTA); ácido dietilentriamina-pentaacético (DTPA); y enlazadores de tiourea.

En la presente divulgación, el agente terapéutico es un agente citostático o citotóxico. Como ejemplos se incluyen, sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina, cladribina, 5-fluorouracilo (5FU), floxuridina (FUDR), arabinósido de citosina (citarabina), metotrexato, trimetoprim, pirimetamina, pemetrexed); agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalan, clorambucilo, tiotepa/clorambucilo, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, busulfan, dibromomanitol, cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxaliplatino, satraplatino, triplatino, tetranitrato, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida, temozolomida); antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina); antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina, estreptozotocina, gramicidina D, mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), duocarmicinas (por ejemplo, CC-1065), caliceamicinas); agentes antimitóticos (incluyendo, por ejemplo, maitansinoides, auristatinas, dolastatinas, criptoficinas, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorrelbina), taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, o un nuevo taxano (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente International N.° WO 01/38318, publicada el 31 de mayo de 2001)), y colchicinas; inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, irinotecan, topotecan, amsacrina, etopósido, tenipósido, mitoxantrona); e inhibidores de proteasoma (por ejemplo, ácido peptidilborónico).

En la presente divulgación, el agente terapéutico es un maitansinoide. Los compuestos maitansinoides y métodos para su conjugación con anticuerpos se describen, por ejemplo, en Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131 (1992); Widdison et al., J. Med. Chem. 49: 4392-4408 (2006); y en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.208.020 y 6.333.410. Como ejemplos de maitansinoides se incluyen análogos de maitansina que tienen un anillo aromático modificado (por ejemplo, C-19-decloro, C-20-demetoxi, C-20-aciloxi) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones (por ejemplo, C-9-CH, C-14-alcoximetilo, C-14-hidroximetilo o aciloximetilo, C-15-hidroxi/aciloxi, C-15-metoxi, C-18-N-demetil, 4,5-desoxi). En la presente divulgación, el maitansinoide es N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (DM3), N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) o N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)maitansina (DM4).

Los compuestos maitansinoides que comprenden un grupo sulfhidrilo pueden acoplarse a anticuerpos utilizando un enlazador heterobinfuncional que está conectado al compuesto maitansinoide mediante un enlace tioéter o disulfuro. En la presente divulgación, el enlazador está acoplado a un grupo amino en el anticuerpo (por ejemplo, un grupo amino terminal o el grupo amino épsilon de un resto de lisina. En la presente divulgación, el enlazador heterobifuncional que se utiliza para acoplar un compuesto maitansinoide con un anticuerpo es N-succinimidil 3-(2-piridilditio)proprionato (también conocido como N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato o SPP), 4-succinimidiloxicarbonil-2-metil-2-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), N-succinimidil 4[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato(SMCC), N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP); N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butirato (SPDB), 2-iminotiolano o anhídrido S-acetilsuccínico.

En la presente divulgación, el agente terapéutico es una dolastatina. En algunos casos de la presente divulgación, el agente terapéutico es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en la técnica como un derivado de dolastatina-10) o un derivado de la misma. Compuestos de auristatina y métodos para su conjugación con anticuerpos se describen, por ejemplo, en Doronina et al., Nature Biotech., 21: 778-784 (2003); Hamblett et al, Clin. Cancer Res., 10: 7063-7070 (2004); Carter y Senter, Cancer J., 14154-169 (2008); Patentes de Estados Unidos N.° 7.498.298, 7.091.186, 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414; Publicaciones de Patente de Estados Unidos N.° 20090010945, 20060074008, 20080300192, 20050009751, 20050238649 y 20030083236; y Publicaciones de Patente International N.° WO 04/010957 y WO 02/088172.

La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E puede reaccionar con ácido paraacetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen auristatin fenilalanin fenilendiamina (AFP), monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMFA).

En la presente divulgación, el agente terapéutico es un radionúclido. Como ejemplos de radionúclidos útiles como toxinas en radioterapia se incluyen: 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb y 212B. Otros radionúclidos que han utilizado los expertos habituales en la técnica incluyen: 32P y 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193MPt, 197Hg, todos ellos emisores beta negativos y/o de electrones Auger. Algunos radionúclidos preferidos incluyen: 90Y, 131I, 211At y 212Pb/212Bi.

Un experto habitual en la técnica puede conjugar una molécula de anticuerpo anti-GCC con un radionúclido utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.; y Barchel, S. W. y Rhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., enseñan la conjugación de diversos radionúclidos terapéuticos y de diagnóstico con aminoácidos de anticuerpos. Dichas reacciones pueden aplicarse para conjugar radionúclidos con moléculas de anticuerpo anti-GCC de la divulgación con un agente quelante y/o enlazador apropiado.

Secuencias de anticuerpos anti-CCG

Se generaron anticuerpos monoclonales anti-GCC de conejo mediante varios métodos, como se indica con más detalle en los Ejemplos. Resumiendo, se generaron anticuerpos monoclonales de conejo MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 mediante tecnología de inmunización tradicional en conejos. Se generaron hibridomas verdaderos de conejoconejo en Epitomics (Burlingame, CA) fusionando linfocitos B aislados de un conejo inmunizado con la línea celular compañera de fusión propiedad de Epitomics (véanse las patentes de Estados Unidos 7429487, 7462697, 7 575896, 7732168 y 8062867). La especificidad de los anticuerpos contra GCC se ensayó mediante ELISA y citometría de flujo (CMF).

En la Tabla 1 a continuación se muestra un resumen de los anticuerpos monoclonales anti-GCC de conejo de la divulgación generados usando el inmunógeno hGCC (ECD)/mIgG2a FcR-mutII.

Se determinaron las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En la Tabla 2 a continuación se muestra un resumen de las SEC ID NO para las regiones variables de varios anticuerpos. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de las regiones variables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-GCC de conejo se muestran en las Tablas 3 y 4, respectivamente.

Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de cada una de las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-GCC se muestran en las Tablas 5 y 6, respectivamente.

La secuenciación de las CDR permitió la determinación de la abundancia de restos que podrían servir como sitios de conjugación con toxinas. Por ejemplo, una cisteína libre no emparejada en la región de unión al antígeno podría ser un sitio para la conjugación de auristatina y una lisina podría ser un sitio para la conjugación de maitansina. La conjugación de toxinas con un aminoácido de la CDR suscitaría la alteración de la afinidad de unión del anticuerpo con GCC. Por lo tanto, en la presente divulgación, las CDR carecen de un aminoácido con el que puedan conjugarse a un agente terapéutico.

T - jo

(SEQ ID NO: 4) de ácidos nucleicos de MIL-44-148-2 H2

A T G G A G A C T G G G C T G C G C T G G C T T C T C C T G G T C G C T G T G C T C A A A G G T G T C C A G T G T C A G T C A G T G A A G G A G T C C G G G G G A G G C C T C T T C A A G C C A A C G G A T A C C C T G A C A C T C A C C T G C A C C G T C T C T G G A T T C T C C C T C A G T A G T C A T A G A A T G A A C T G G G T C C G C C A G A C T C C A G G G A A G G G G C T G G A A T G G A T C G C A A T C A T T A C T C A T A A T A G T A T C A C A T A C T A C G C G A G C T G G G C G A A A A G C C G A T C C A C C A T C A C C A G A A A C A C C A G C G A G A A C A C G G T G A C T C T G A A A A T G A C C A G T C T G A C A G C C G C G G A C A C G G C C A C T T A T T T C T G T G C C A G A G A G G A T A G T A T G G G G T A T T A T T T T G A C T T G T G G G G C C C A G G C A C C C T G G T C A C C A T C T C C T C A G G G C A A C C T A A G G C T C C A T C A G T C T T C C C A C T G G C C C C C T G C T G C G G G G A C A C A C C C A G C T C C A C G G T G A C C C T G G G C T G C C T G G T C A A A G G G T A C C T C C C G G A G C C A G T G A C C G T G A C C T G G A A C T C G G G C A C C C T C A C C A A T G G G G T A C G C A C C T T C C C G T C C G T C C G G C A G T C C T C A G G C C T C T A C T C G C T G A G C A G C G T G G T G A G C G T G A C C T C A A G C A G C C A G C C C G T C A C C T G C A A C G T G G C C C A C C C A G C C A C C A A C A C C A A A G T G G A C A A G A C C G T T G C G C C C T C G A C A T G C A G C A A G C C C A C G T G C C C A C C C C C T G A A C T C C T G G G G G G A C C G T C T G T C T T C A T C T T C C C C C C A A A A C C C A A G G A C A C C C T C A T G A T C T C A C G C A C C C C C G A G G T C A C A T G C G T G G T G G T G G A C G T G A G C C A G G A T G A C C C C G A G G T G C A G T T C A C A T G G T A C A T A A A C A A C G A G C A G G T G C G C A C C G C C C G G C C G C C G C T A C G G G A G C A G C A G T T C A A C A G C A C G A T C C G C G T G G T C A G C A C C C T C C C C A T C G C G C A C C A G G A C T G G C T G A G G G G C A A G G A G T T C A A G T G C A A A G T C C A C A A C A A G G C A C T C C C G G C C C C C A T C G A G A A A A C C A T C T C C A A A G C C A G A G G G C A G C C C C T G G A G C C G A A G G T C T A C A C C A T G G G C C C T C C C C G G G A G G A G C T G A G C A G C A G G T C G G T C A G C C T G A C C T G C A T G A T C A A C G G C T T C T A C C C T T C C G A C A T C T C G G T G G A G T G G G A G A A G A A C G G G A A G G C A G A G G A C A A C T A C A A G A C C A C G C C G G C C G T G C T G G A C A G C G A C G G C T C C T A C T T C C T C T A C A G C A A G C T C T C A G T G C C C A C G A G T G A G T G G C A G C G G G G C G A C G T C T T C A C C T G C T C C G T G A T G C A C G A G G C C T T G C A C A A C C A C T A C A C G C A G A A G T C C A T C T C C C G C T C T C C G G G T A A A T G A

(SEQ ID NO: 42) de aminoácidos de MIL-44-148-2 H2

M E T G L R W L L L V A V L K G V Q C Q S V K E S G G G L F K P T D T L T L T C T V S G F S L S S H R M N W V R Q T P G K G L E W IA IIT H H S IT Y Y A S W A K S R S T IT R N T S E N T V T L K M T S L T A A D T A T Y F C A R E D S M G Y Y F D L W G P G T L V T IS S G Q P K A P S V F P L A P C C G D T P S S T V T L G C L V K G Y L P E P V T V T W N S G T L T N G V R T F P S V R Q S S G L Y S L S S W S V T S S S Q P V T C N V A H P A T N T K V D K T V A P S T C S K P T C P P P E L L G G P S V F IF P P K P K D T L M IS R T P E V T C V W D V S Q D D P E V Q F T W Y IN N E Q V R T A R P P L R E Q Q F N S T IR W S T L P IA H Q D W L R G K E F K C K V H N K A L P A P IE K T IS K A R G Q P L E P K V Y T M G P P R E E L S S R S V S L T C M IN G F Y P S D IS V E W E K N G K A E D N Y K T T P A V L D S D G S Y F L Y S K L S V P T S E W Q R G D V F T C S V M H E A L H N H Y T Q K S IS R S P G K

(SEQ ID NO: 5) de ácidos nucleicos de MIL-44-148-2

A T G G A C A C G A G G G C C C C C A C T C A G C T G C T G G G G C T C C T G C T G C T C T G G C T C C C A G G T G C C A G A T G T G C C T A T G A T A T G A C C C A G A C T C C A G C C T C T G T G G A G G T A G C T G T G G G A G G C A C A G T C A C C A T C A A G T G C C A G G C C A G T C A G A G C A T T A G T A A C T G G T T A G C C T G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G C A G T C T C C C A A G C C C C T G A T C T A C A G G G C A T C C A C T C T G G C A T C T G G G G T C T C A T C G C G G T T C A G A G G C A G T G G A T C T G G G A C A C A G T T C A C T C T C A C C A T C A G T G G C G T G G A G T G T G C C G A T G C T G C C A C T T A C T A C T G T C A G C A G A C T T A T A C T A A T A A T C A T C T T G A T A A T G G T T T C G G C G G A G G G A C C G A G G T G G T G G T C A A A

G G T G A T C C A G T T G C A C C T A C T G T C C T C A T C T T C C C A C C A G C T G C T G A T C A G G T G G C A A C T G G A A C A G T C A C C A T C G T G T G T G T G G C G A A T A A A T A C T T T C C C G A T G T C A C C G T C A C C T G G G A G G T G G A T G G C A C C A C C C A A A C A A C T G G C A T C G A G A A C A G T A A A A C A C C G C A G A A T T C T G C A G A T T G T A C C T A C A A C C T C A G C A G C A C T C T G A C A C T G A C C A G C A C A C A G T A C A A C A G C C A C A A A G A G T A C A C C T G C A G G G T G A C C C A G G G C A C G A C C T C A G T C G T C C A G A G C T T C A A T A G G G G T G A C T G T T A G

(SEQ ID NO: 43) de aminoácidos de MIL-44-148-2 L5

M D T R A P T Q L L G L L L L W L P G A R C A Y D M T Q T P A S V E V A V G G T V T IK C Q A S Q S IS N W L A W Y Q Q K P G Q S P K P L IY R A S T L A S G V S S R F R G S G S G T Q F T L T IS G V E C A D A A T Y Y C Q Q T Y T N N H L D N G F G G G T E W V K G D P V A P T V L IF P P A A D Q V A T G T V T IV C V A N K Y F P D V T V T W E V D G T T Q T T G IE N S K T P Q N S A D C T Y N L S S T L T L T S T Q Y N S H K E Y T C R V T Q G T T S W Q S F NRGD C

(SEQ ID NO: 6) de ácidos nucleicos de MIL-44-67-4 H2

A T G G A G A C T G G G C T G C G C T G G C T T C T C C T G G T C G C T G T G C T C A A A G G T G T C C A G T G T C A G T C G G T G G A G G A G T C C G G G G G T C G C C T G G T C A C G C C T G G G A C A C C C C T G A C A C T C A C C T G C A C A G C C T C T G G A T C C G A C A T C A G T A A C T A T G C A A T A T C C T G G G T C C G C C A G G C T C C A G G G A A G G G G C T G G A A T T C A T C G G A T A T A T T A G T T A T G G T A A A A G T A T A T A C T A C G C G A G C T G G G C G A A A G G C C G G T T C G C C A T C T C C A A A A C C T C G T C G A C C A C G G T G G A T C T G G A A A T C A C C A G T C C G A C A A C C G A G G A C A C G G C C A C C T A T T T T T G T G C C A G A G A G G A T A G T G C T A C T T A T A G T C C T A A C T T G T G G G G C C C A G G C A C C C T G G T C A C C G T C T C C T C A G G G C A A C C T A A G G C T C C A T C A G T C T T C C C A C T G G C C C C C T G C T G C G G G G A C A C A C C C A G C T C C A C G G T G A C C C T G G G C T G C C T G G T C A A A G G G T A C C T C C C G G A G C C A G T G A C C G T G A C C T G G A A C T C G G G C A C C C T C A C C A A T G G G G T A C G C A C C T T C C C G T C C G T C C G G C A G T C C T C A G G C C T C T A C T C G C T G A G C A G C G T G G T G A G C G T G A C C T C A A G C A G C C A G C C C G T C A C C T G C A A C G T G G C C C A C C C A G C C A C C A A C A C C A A A G T G G A C A A G A C C G T T G C G C C C T C G A C A T G C A G C A A G C C C A C G T G C C C A C C C C C T G A A C T C C T G G G G G G A C C G T C T G T C T T C A T C T T C C C C C C A A A A C C C A A G G A C A C C C T C A T G A T C T C A C G C A C C C C C G A G G T C A C A T G C G T G G T G G T G G A C G T G A G C C A G G A T G A C C C C G A G G T G C A G T T C A C A T G G T A C A T A A A C A A C G A G C A G G T G C G C A C C G C C C G G C C G C C G C T A C G G G A G C A G C A G T T C A A C A G C A C G A T C C G C G T G G T C A G C A C C C T C C C C A T C G C G C A C C A G G A C T G G C T G A G G G G C A A G G A G T T C A A G T G C A A A G T C C A C A A C A A G G C A C T C C C G G C C C C C A T C G A G A A A A C C A T C T C C A A A G C C A G A G G G C A G C C C C T G G A G C C G A A G G T C T A C A C C A T G G G C C C T C C C C G G G A G G A G C T G A G C A G C A G G T C G G T C A G C C T G A C C T G C A T G A T C A A C G G C T T C T A C C C T T C C G A C A T C T C G G T G G A G T G G G A G A A G A A C G G G A A G G C A G A G G A C A A C T A C A A G A C C A C G C C G G C C G T G C T G G A C A G C G A C G G C T C C T A C T T C C T C T A C A G C A A G C T C T C A G T G C C C A C G A G T G A G T G G C A G C G G G G C G A C G T C T T C A C C T G C T C C G T G A T G C A C G A G G C C T T G C A C A A C C A C T A C A C G C A G A A G T C C A T C T C C C G C T C T C C G G G T A A A T G A

(SEQ ID NO: 44) de aminoácidos de MIL-44-67-4 H2

M E T G L R W L L L V A V L K G V Q C Q S V E E S G G R L V T P G T P L T L T C T A S G S D IS N Y A IS W V R Q A P G K G L E F IG Y IS Y G K S IY Y A S W A K G R F A IS K T S S T T V D L E IT S P T T E D T A T Y F C A R E D S A T Y S P N L W G P G T L V T V S S G Q P K A P S V F P L A P C C G D T P S S T V T L G C L V K G Y L P E P V T V T W N S G T L T N G V R T F P S V R Q S S G L Y S L S S W S V T S S S Q P V T C N V A H P A T H T K V D K T V A P S T C S K P T C P P P E L L G G P S V F IF P P K P K D T L M IS R T P E V T C V W D V S Q D D P E V Q F T W Y IN N E Q V R T A R P P L R E Q Q F N S T I R W S T L P I A H Q D W L R G K E F K C K V H N K A L P A P I E K T I S K A R G Q P L E P K V Y T M G P P R E E L S S R S V S L T C M I N G F Y P S D IS V E W E K N G K A E D N Y K T T P A V L D S D G S Y F L Y S K L S V P T S E W Q R G D V F T C S V M H E A L H N H Y T Q K S IS R S P G K

(SEQ ID NO: 7) de ácidos nucleicos de MIL-44-67-4 L4

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATAT GACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTA ACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCA TCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGC CGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTATAATAATCTTGATCGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGG TGGTGGTCACA

GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGT GTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCG AGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAG TACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGA CTGTTAG

(SEQ ID NO: 45) de aminoácidos de MIL-44-67-4 L4

M D T R A P T Q L L G L L L L W L P G A R C A Y D M T Q T P A S V E V A V G G T V T IK C Q A S Q S IN T Y L A W Y Q Q K P G Q R P K L L IY R A S T L A

S G V S S R F K G S G S G T E F T L T IS G V E C A D A A T Y Y C Q Q G Y S Y N N L D R A F G G G T E V W T G D P V A P T V L IF P P A A D Q V A T G T

V T IV C V A N K Y F P D V T V T W E V D G T T Q T T G IE N S K T P Q N S A D C T Y N L S S T L T L T S T Q Y N S H K E Y T C K V T Q G T T S W Q S F

iT r:-" '1

T l 2 R m n l E ID l r i n ri l l mA ni- n

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de las re iones variables de mAb de los mAb anti-GCC de coneo

Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de las CDR de los mAb anti-GCC de conejo

T l n i i n l i l DR l mA ni- n

Usos terapéuticos

Las moléculas de anticuerpo monoclonal anti-GCC de conejo descritas en el presente documento, tienen utilidades in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas de anticuerpo pueden administrarse a las células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o administrarse a un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar y/o prevenir diversos trastornos. En determinadas realizaciones de aplicaciones terapéuticas de la divulgación, las moléculas de anticuerpo monoclonal anti-GCC de conejo de la divulgación se humanizan, utilizando una o más técnicas descritas anteriormente en el presente documento.

Las moléculas de anticuerpo, los inmunoconjugados y las proteínas de fusión que se describen en el presente documento, pueden utilizarse para modular una actividad o función de una proteína GCC, tal como la unión a ligandos (por ejemplo, unión a la enterotoxina termoestable o la guanilina), transducción de señales mediada por GCC, mantenimiento del líquido intestinal, homeostasis de electrolitos, liberación de calcio intracelular (flujo de calcio), diferenciación celular, proliferación celular o activación celular.

En un aspecto, la divulgación presenta un método de destrucción, inhibición o modulación del crecimiento de, o interferencia con el metabolismo de, una célula que expresa GCC. En la presente divulgación, la divulgación describe un método de inhibición de la señalización celular mediada por GCC o un método de destrucción de una célula. El método puede utilizarse con cualquier célula o tejido que exprese GCC, tal como una célula cancerosa. Ejemplos de células cancerosas que expresan GCC incluyen, pero sin limitación, una célula de un cáncer de origen gastrointestinal (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado, o cáncer esofágico), cáncer pancreático, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcomas de tejido blando tales como leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma, tumores neoendocrinos gastrointestinales o broncopulmonares o tumores neuroectodérmicos, o cualquier lesión metastásica de los mismos. Ejemplos no limitantes de células que expresan GCC incluyen células de adenocarcinoma colónico humano T84, células de tumor colónico recientes o congeladas y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica la GCC o una parte de la misma.

Los métodos de la divulgación incluyen las etapas de poner en contacto la célula con una molécula de anticuerpo anti-GCC o con un inmunoconjugado de la misma, como se describe en el presente documento, en una cantidad eficaz, es decir, una cantidad suficiente para inhibir la señalización celular mediada por GCC o una cantidad suficiente para destruir la célula. El método puede utilizarse en células en cultivo, por ejemplo, in vitro, in vivo, ex vivo o in situ. Por ejemplo, células que expresan GCC (por ejemplo, células recogidas mediante biopsia de una lesión tumoral o metastásica; células de una línea celular de cáncer establecida; o células recombinantes), pueden cultivarse in vitro en un medio de cultivo y la etapa de puesta en contacto puede efectuarse añadiendo la molécula de anticuerpo anti-GCC o el inmunoconjugado al medio de cultivo. En los métodos de destrucción de una célula, el método comprende utilizar una molécula de anticuerpo anti-GCC no marcada desnuda), o un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente citotóxico. El método dará como resultado la destrucción de las células que expresan GCC, incluyendo en particular células tumorales que expresan GCC (por ejemplo, células de tumor colónico).

Los anticuerpos monoclonales de conejo de la divulgación, o sus versiones humanizadas, pueden ensayarse con respecto a la internalización celular después de unirse a GCC usando técnicas de microscopía con inmunofluorescencia bien conocidas por los expertos en la materia. Dichos anticuerpos que se confirma que se internalizan podrían ser útiles cuando se enlazan con una fracción citotóxica con fines terapéuticos, o con una fracción para la obtención de imágenes de células. Los anticuerpos que no se internalizan pueden incluso utilizarse con fines de diagnóstico o en métodos terapéuticos utilizando un anticuerpo no marcado diseñado para suscitar una respuesta citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpo o quizá para métodos de suministro de liposomas.

Las moléculas de anticuerpo anti-GCC de la presente divulgación se unen a dominios extracelulares de GCC o a partes de los mismos en células que expresan el antígeno. Como resultado, cuando los métodos de la presente divulgación se llevan a la práctica para destruir, suprimir o detectar células cancerosas, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, se unen a todas estas células, no solamente a células que están fijas o a células cuyos dominios antigénicos intracelulares están de otra manera expuestos en el entorno extracelular. Como consecuencia, la unión de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, se concentra en zonas en las que las células que expresan GCC, independientemente de si estas células están fijas o no, son viables o necróticas. Adicionalmente o como alternativa, las moléculas de anticuerpo anti-GCC, se unen a, y están internalizadas con, GCC después de la unión de las células que expresan el antígeno.

El método también puede realizarse en células presentes en un sujeto, como parte de un protocolo in vivo. En la presente divulgación, el sujeto es un sujeto humano. Como alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que exprese un antígeno GCC con el que una molécula de anticuerpo anti-GCC desvelada en el presente documento reacciona en cruzado. Una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma puede administrarse a un sujeto humano con fines terapéuticos. Una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado también puede administrarse a un mamífero no humano que exprese el antígeno similar a GCC con el cual reacciona en cruzado el anticuerpo (por ejemplo, un primate, cerdo o ratón) con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Los modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la divulgación (por ejemplo, ensayar las dosificaciones y las duraciones de la administración). Para la evaluación in vivo de la presente divulgación, la etapa de puesta en contacto se efectúa en un sujeto e incluye administrar al sujeto una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado de la misma, en condiciones eficaces para permitir tanto la unión de la molécula de anticuerpo con el dominio extracelular de la GCC expresada en la célula, como el tratamiento de la célula.

En la presente divulgación, la divulgación describe un método de tratamiento de cáncer administrando a un paciente que necesite dicho tratamiento, una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente citotóxico. El método puede utilizarse para el tratamiento de cualquier trastorno canceroso que incluya al menos algunas células que expresen el antígeno GCC. Como se usa en el presente documento, el término “cáncer” significa que incluye todos los tipos de crecimientos canceroso o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados de manera neoplásica, independientemente del tipo histopatológico o estadio de invasividad. Los términos “cáncer” y “tumor” pueden usarse indistintamente (por ejemplo, cuando se utilizan en el contexto de métodos de tratamiento, “tratamiento de un cáncer” y “tratamiento de un tumor” tienen el mismo significado).

En la presente divulgación, el tratamiento es suficiente para reducir o inhibir el crecimiento del tumor del sujeto, reducir el número o el tamaño de lesiones metastásicas, reducir la carga tumoral, reducir la carga tumoral primaria, reducir la invasividad, prolongar el tiempo de supervivencia o conservar o mejorar la calidad de vida.

Los ejemplos de trastornos cancerosos incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, tumores de tejidos blandos y lesiones metastásicas. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen neoplasias, por ejemplo, sarcomas, adenocarcinomas y carcinomas de los diversos sistemas de órganos, tales como los que afectan al colon. Los adenocarcinomas incluyen neoplasias tales como carcinoma no microcítico de pulmón. Las lesiones metastásicas de los cánceres mencionados anteriormente también pueden tratarse o prevenirse utilizando los métodos y las composiciones de la divulgación.

En la presente divulgación, el cáncer que va a tratarse, que expresa GCC, es un cáncer primario o metastásico de origen gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado o cáncer esofágico. En la presente divulgación, el cáncer que va a tratarse, que expresa GCC, es cáncer pancreático primario o metastásico. En la presente divulgación, el cáncer que va a tratarse, que expresa GCC, es un cáncer de pulmón primario o metastásico, tal como carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso o adenocarcinoma. En la presente divulgación, el cáncer que va a tratarse, que expresa GCC, es un sarcoma, tal como leimiosarcoma o rabdomiosarcoma. En la presente divulgación, el cáncer que va a tratarse, que expresa GCC, es un tumor neuroectodérmico primario o metastatizado, tal como un feocromocitoma o un paraganglioma. En la presente divulgación, el cáncer que expresa GCC es un tumor neuroendrocino broncopulmonar o gastrointestinal primario o metastatizado.

El método puede ser útil en el tratamiento de un trastorno relevante en cualquier estadio o subclasificación. Por ejemplo, el método puede utilizarse para tratar cáncer de colon en estadio temprano o tardío o cáncer de colon en cualquiera de los estadios 0, I, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC y IV.

En la presente divulgación, el método para el tratamiento de un cáncer que expresa GCC (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, tumor neuroendocrino, tumor neuroectodérmico, etc.) comprende administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una molécula de anticuerpo anti-GCC no marcada descrita en el presente documento. En la presente divulgación, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento y un agente citotóxico tal como un maitansanoide o una auristatina, o sus derivados. Más adelante se describen métodos de administración de moléculas de anticuerpo e inmunoconjugados. Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y del peso del sujeto y del compuesto particular utilizado.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado, se administra en ciclos de tratamiento. Un “ciclo de tratamiento” consiste en un período de tratamiento, durante el cual la molécula de anticuerpo anti-GCC o el inmunoconjugado se administra como se ha descrito anteriormente, seguido de un periodo de descanso, durante el cual no se administra molécula de anticuerpo anti-GCC ni inmunoconjugado. El ciclo de tratamiento puede repetirse si fuese necesario para conseguir el efecto deseado.

Los anticuerpos anti-GCC descritos en el presente documento (por ejemplo, moléculas de anticuerpo anti-GCC no marcadas o inmunoconjugados, que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente terapéutico) pueden utilizarse en combinación con otras terapias. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente divulgación co-formulada con, y/o co-administrada con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más agentes contra el cáncer, por ejemplo, agentes citotóxicos o citostáticos, tratamiento hormonal, vacunas y/u otras inmunoterapias. En la presente divulgación, los anticuerpos anti-GCC se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéuticas, incluyendo cirugía, radiación, criocirugía y/o termoterapia. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, impidiendo así posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.

Administrado “en combinación”, como se usa en el presente documento, significa que, durante el tiempo que dure la aflicción del sujeto con el trastorno, al sujeto se le suministran dos (o más) tratamientos diferentes, por ejemplo, los dos o más tratamientos se suministran después de que al sujeto se le haya diagnosticado el trastorno y antes de que el trastorno se haya curado o eliminado. En la presente divulgación, el suministro de un tratamiento se producirá incluso cuando empieza el suministro del segundo, de tal forma que se solapen. Algunas veces esto recibe el nombre de suministro “simultáneo” o “concurrente”. En la presente divulgación, el suministro de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En cualquiera de los casos de la presente divulgación, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida, de lo que se observaría si se administrase el segundo tratamiento en ausencia del primer tratamiento, o se observa la situación análoga con el primer tratamiento. En la presente divulgación, el suministro es tal que la reducción de un síntoma, o de otro parámetro relacionado con el trastorno, es mayor de lo que se observaría con un tratamiento suministrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, completamente aditivo, o más que aditivo. El suministro puede ser tal que el efecto del primer tratamiento suministrado sea aún detectable cuando se suministre el segundo tratamiento.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma se usa en combinación con un agente quimioterapéutico. Ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN incluyen inhibidores de topoisomerasa I (por ejemplo, irinotecán, topotecán, campotecina y análogos o metabolitos de los mismos, y doxorrubicina); inhibidores de topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, tenipósido y daunorrubicina); agentes alquilantes (por ejemplo, melfalán, clorambucilo, busulfán, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, decarbazina, metotrexato, mitomicina C y ciclofosfamida); intercalantes de ADN (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino); intercalantes de ADN y generadores de radicales libres tales como bleomicina; y miméticos de nucleósido (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitibina, gemcitabina, fludarabina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e hidroxiurea).

Los agentes quimioterapéuticos que alteran la replicación celular incluyen: paclitaxel, docetaxel y análogos relacionados; vincristina, vinblastina y análogos relacionados; talidomina, lenalidomida y análogos relacionados (por ejemplo, CC-5013 y CC-4047); inhibidores de proteín tirosina cinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib y gefitinib); inhibidores de proteasoma (por ejemplo, bortezomib); inhibidores de NF-kB, incluyendo inhibidores de IkB cinasa; anticuerpos que se unen a proteínas sobreexpresadas en cánceres y por lo tanto que regulan negativamente la replicación celular (por ejemplo, trastuzumab, rituximab, cetuximab y bevacizumab); y otros inhibidores de proteínas o enzimas que se sabe que están reguladas positivamente, sobreexpresadas o activadas en cánceres, cuya inhibición regula negativamente la replicación celular.

La selección de uno o más agentes terapéuticos o la modalidad de tratamiento a combinar con una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la divulgación, dependerá del trastorno que se vaya a tratar. El agente o agentes adicionales o la modalidad de tratamiento pueden incluir, por ejemplo, terapias estándar autorizadas para la indicación que se vaya a tratar. Por ejemplo, cuando la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma se usa para tratar cáncer de colon, puede utilizarse en combinación, por ejemplo, con cirugía; radioterapia; 5-fluorouracilo (5-FU), capecitibina, leucovorina, irinotecán, oxaliplatino, bevacizumab, cetuximab, panitumum o combinaciones de los mismos (por ejemplo, oxaliplatino/capecitibina (XELOX), 5-fluorouracilol/leucovorina/-oxaliplatino (FOLFOX), 5-fluorouracilo/leucovorina/irinotecán (FOLFIRI), FOLFOX más bevacizumab o FOLFIRI más bevacizumab).

En otro aspecto, la divulgación presenta el uso de una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento. En la presente divulgación, el medicamento es para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, un cáncer gastrointestinal. En la presente divulgación, el medicamento comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC cuyas características se resumen en las Tablas 1­ 6. En la presente divulgación, el medicamento comprende una molécula de anticuerpo MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4, o versiones humanizadas de las mismas.

Marcaje y detección de anticuerpos

Las moléculas de anticuerpo anti-GCC utilizadas en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en la detección in vitro e in vivo, por ejemplo, en métodos de diagnóstico, tinción u obtención de imágenes, pueden marcarse directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del agente unido o no unido. Sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, ligandos, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales quimioluminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales cromofóricos, materiales electrónicos densos, materiales paramagnéticos (por ejemplo, resonancia activa magnética nuclear) y materiales radioactivos, que son activos desde un punto de vista biológico. En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC está acoplada a un ion radioactivo, por ejemplo indio (111In), yodo (131I o 125I), itrio (90Y), lutenio (177Lu), actinio (225Ac), bismuto (212Bi o 213Bi), azufre (35S), carbono (14C), tritio (3H), rodio (188R), tecnecio (99mTc), praseodimio o fósforo (32P); o un radionúclido emisor de positrones, por ejemplo, carbono-11 (11C), potasio-40 (40K), nitrógeno-13 (13N), oxígeno-15 (15O), flúor-18 (18F), galio (68Ga) y yodo-l2l (121I). Más adelante se describen agentes radioactivos adicionales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la divulgación para su uso en métodos de diagnóstico/detección in vitro o in vivo.

Marcadores ejemplares incluyen fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos N.° 4747456), luciferina y 2,3-dihidroftalazinodionas. Otros marcadores ejemplares incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acoplados con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lacoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

Las moléculas de anticuerpo marcadas con fluoróforos y cromóforos pueden prepararse a partir de fracciones estándar conocidas en la técnica. Dichos anticuerpos y otras proteínas absorben luz que tiene longitudes de onda de hasta aproximadamente 310 nm, las fracciones fluorescentes deben seleccionarse para que tengan absorción sustancial a longitudes de onda por encima de 310 nm y preferentemente por encima de 400 nm. Stryer Science, 162:526 (1968) y Brand, L. et al. Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972) describen una variedad de compuestos y cromóforos fluorescentes adecuados. Los anticuerpos pueden marcarse con grupos cromóforos fluorescentes mediante procedimientos convencionales tales como los desvelados en las Patentes de Estados Unidos N.° 3940475, 4289747 y 4376110.

Un grupo de agentes fluorescentes que tienen varias de las propiedades deseables descritas anteriormente, son los colorantes de xanteno que incluyen las fluoresceínas derivadas de 3,6-dihidroxi-9-henilxantidrol y resaminas y rodaminas derivadas de 3,6-diamino-9-fenilxantidrol y lisanima rodamina B. Los derivados de rodamina y fluoresceína de 9-o-carboxifenilxantidrol tienen un grupo 9-o-carboxifenilo. Los compuestos de fluoresceína que tienen grupos de acoplamiento reactivos tales como grupos amino e isotiocianato tales como isotiocianato de fluoresceína y fluoresceína son fáciles de obtener. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en la posición a o p.

Las moléculas de anticuerpo marcadas pueden utilizarse, por ejemplo, diagnóstica y/o experimentalmente en diversos contextos, incluyendo (i) aislar un antígeno predeterminado mediante técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación; (ii) detectar un antígeno predeterminado (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína; (iii) monitorizar los niveles de proteína en tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado.

Diagnósticos in vitro

Los anticuerpos anti-GCC e inmunoconjugados descritos en el presente documento pueden utilizarse para detectar la presencia o ausencia de GCC, por ejemplo, detectar la presencia o ausencia de g Cc en una muestra biológica ex vivo obtenida de un sujeto (es decir, detección in vitro), o detectar la presencia o la distribución o ausencia de GCC en un sujeto (es decir, detección in vivo). Dichos métodos de detección son útiles para detectar o diagnosticar diversos trastornos, o para aconsejar decisiones terapéuticas. El término “detectar”, como se usa en el presente documento, abarca detección cuantitativa o cualitativa. La detección de GCC o de la proteína GCC, como se usa en el presente documento, significa detectar la proteína GCC intacta o detectar una parte de la proteína GCC que comprende el epítopo al cual se une la molécula de anticuerpo anti-GCC.

Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgación presenta un método de detección de la expresión de GCC en una muestra biológica, tal como una célula o tejido, por ejemplo, una célula tumoral, o un tumor que tiene una o más células que expresan GCC. El método comprende: poner en contacto una muestra biológica con una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en el presente documento (por ejemplo, MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4), en condiciones que permitan la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC; y detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC, para así detectar la presencia de la proteína GCC, por ejemplo, detectar una célula o un tumor que exprese GCC.

En la presente divulgación, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un inmunoconjugado que comprende un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un agente radioactivo. Como alternativa, el marcador detectable es un agente no radioactivo (por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo como se ha descrito anteriormente).

En la presente divulgación, la muestra biológica incluye células o tejidos normales y/o cancerosos que expresan GCC. Ejemplos de células o tejidos normales que expresan GCC incluyen, pero sin limitación, células o tejidos de origen gastrointestinal, particularmente células o tejidos colorrectales normales. Ejemplos de células o tejidos cancerosos que expresan GCC incluyen, pero sin limitación: cáncer de origen gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado y cáncer esofágico; cáncer pancreático, cáncer de pulmón, tal como carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso y adenocarcinoma; sarcomas de tejidos blandos tal como leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores neuroendocrinos gastrointestinales y broncopulmonares; y tumores neuroectodérmicos. En la presente divulgación, las células o tejidos normales y/o cancerosos pueden expresar GCC a niveles más altos con respecto a otros tejidos, por ejemplo, otros tejidos tales como tejidos asociados a linfocitos B y/o linfocitos B.

Los métodos de detección descritos en el presente documento, tanto in vitro como in vivo, pueden usarse para evaluar un trastorno en su sujeto. En la presente divulgación, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de estómago o cáncer pancreático.

En un aspecto, la divulgación describe un método para detectar in vitro la presencia o la ausencia de la proteína GCC en una muestra biológica (por ejemplo, en una biopsia de células o tejidos obtenida de un sujeto). El método comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC. La formación del complejo indica la presencia o el nivel de la proteína GCC en la muestra biológica, mientras que la no formación del complejo indica la ausencia de la proteína g Cc en la muestra biológica.

Muestras biológicas ejemplares para los métodos descritos en el presente documento, comprenden una célula, células, un tejido o un líquido corporal, tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, una muestra de heces. En la presente divulgación, la muestra biológica comprende una o más células o tejido canceroso. Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia de tumor, por ejemplo, una biopsia de un tumor colorrectal, un tumor gástrico, un tumor esofágico, un tumor de intestino delgado, un tumor de pulmón, un sarcoma de tejidos blandos, un tumor neuroendocrino, un tumor neuroectodérmico, o proceder de una muestra tisular de cualquier sitio metastásico de la misma. En la presente divulgación, la muestra biológica puede ser sangre u otro líquido, en el que el líquido comprende una célula de cáncer. Una muestra biológica puede obtenerse utilizando cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica. Además, una muestra biológica puede tratarse con un fijador, tal como formaldehído, e incluirse en parafina y seccionarse para su uso. Como alternativa, puede emplearse tejido reciente o congelado. En la presente divulgación, puede usarse aspirados con aguja fina.

En la presente divulgación, una célula o tejido de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado a la expresión de GCC. En la presente divulgación, una célula o tejido de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado a la expresión de ^g C^c en un lugar distinto de la superficie apical de células epiteliales intestinales (por ejemplo, expresión citoplasmática de GCC en células epiteliales intestinales), o un trastorno asociado con la expresión de GCC en células o tejidos no intestinales, tales como de origen pancreático, pulmonar, de tejido blando o de tejido de origen neuroendocrino o neuroectodérmico. En la presente divulgación, una célula o tejido de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado a expresión aumentada de GCC.

En la presente divulgación, el nivel de GCC en una muestra del sujeto, o en el sujeto, se compara con un nivel de referencia, por ejemplo, el nivel de GCC en un material de control, por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que el de la célula del sujeto o una célula que tiene GCC a niveles comparables a los de dicha célula normal. El método puede comprender, por ejemplo, responder al nivel de GCC detectado, proporcionar un diagnóstico, un pronóstico, una evaluación de la eficacia del tratamiento, o la estadificación de un trastorno. Un nivel más alto de GCC en la muestra o sujeto, en comparación con el material de control, indica la presencia de un trastorno asociado a expresión aumentada de GCC. Un nivel más alto de GCC en la muestra o sujeto en comparación con el material de control, también puede indicar la ausencia relativa de eficacia de un tratamiento, un pronóstico relativamente más malo o un estadio de enfermedad posterior. El nivel de GCC también puede utilizarse para evaluar o seleccionar tratamientos futuros, por ejemplo, la necesidad de tratamientos más o menos agresivos, o la necesidad de cambiar un régimen de tratamiento por otro. En la presente divulgación, los métodos comprenden adicionalmente seleccionar una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en el presente documento, basándose, al menos en parte, en los niveles de GCC determinados y opcionalmente administrando al sujeto la terapia seleccionada dirigida a GCC.

La formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y GCC puede detectarse midiendo o visualizando el anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) unido al antígeno GCC o la molécula de anticuerpo no unida. Un experto familiarizado con la técnica puede apreciar fácilmente la multitud de maneras para detectar la unión de anticuerpos anti-GCC a GCC. Dichos métodos incluyen, sin limitación, ensayos de unión a antígeno conocidos en la técnica, tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHQ).

En la presente divulgación, la GCC se detecta o mide mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-GCC de la divulgación. Las técnicas de inmunohistoquímica pueden utilizarse para identificar y esencialmente teñir células que expresen GCC. Dicha “tinción” permite analizar la migración metastásica. Los anticuerpos anti-GCC, tales como los descritos en el presente documento, se ponen en contacto con células fijas y la GCC presente en las células reacciona con los anticuerpos. Los anticuerpos se marcan de manera detectable o se detectan utilizando un anticuerpo secundario marcado o proteína A para teñir las células. En la presente divulgación, el anticuerpo MIL-44-148-2 se utiliza en un ensayo de IHQ para detectar o medir la expresión de GCC en una muestra biológica.

Pueden utilizarse otros ensayos de detección convencionales, por ejemplo, transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHQ) o radioinmunoensayo (RIE).

Como alternativa al mareaje de la molécula de anticuerpo anti-GCC, la presencia de GCC puede analizarse en una muestra mediante un inmunoensayo competitivo utilizando patrones marcados con una sustancia detectable y una molécula de anticuerpo anti-GCC no marcada. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones marcados y el agente de unión a GCC, se combinan y se determina la cantidad de patrón marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de GCC en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de patrón marcado unido al agente de unión a GCC.

También es posible detectar directamente la formación de complejo de GCC con la molécula de anticuerpo anti-GCC sin manipulación adicional o marcaje de ninguno de los componentes (GCC o molécula de anticuerpo), por ejemplo, utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (TEF, véase, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de Estados Unidos N.° 5631 169; Stavrianopoulos, et al., Patente de Estados Unidos N.° 4868103). Un marcador fluoróforo en la primera molécula “donadora” se selecciona de tal manera que, después de la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por un marcador fluorescente en una segunda molécula “aceptora”, que a su vez puede emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. Como alternativa, la molécula de proteína “donadora” puede utilizar simplemente la energía fluorescente natural de los restos de triptófano. Se seleccionan marcadores que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de tal manera que el marcador de la molécula “aceptora” pueda diferenciarse del de la “donadora”. Dado que la eficacia de la transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, las relaciones espaciales entre las moléculas pueden ensayarse. En una situación en la que la unión se produce entre las moléculas, la emisión fluorescente del marcador de la molécula “aceptora” en el ensayo debe ser máxima. A través de medios estándar de detección fluorométrica, bien conocidos en la técnica, puede medirse convenientemente un acontecimiento de unión mediante TEF (transferencia de energía de fluorescencia) (utilizando, por ejemplo, un fluorímetro).

En otro ejemplo, la determinación de la capacidad de una molécula de anticuerpo para reconocer GCC puede realizarse sin marcar ningún componente del ensayo (GCC o molécula de anticuerpo) utilizando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular (AIB) en tiempo real (véase, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr. Opin. struct. Biol. 5:699-705). Como se usa en el presente documento, el “AIB” o “resonancia de plasmón superficial” es una tecnología que permite estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIACORE™). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un acontecimiento de unión) producen alteraciones del índice refractario de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (RPS)), dando como resultado una señal detectable que puede utilizarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En algunos aspectos, la divulgación presenta una mezcla de reacción que incluye una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento (por ejemplo, un inmunoconjugado que incluye una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento y, por ejemplo, un marcador) y una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica descrita en el presente documento. En la presente divulgación, la mezcla de reacción puede incluir una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento (por ejemplo, un inmunoconjugado que incluye una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento y, por ejemplo, un marcador) y GCC obtenida de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica descrita en el presente documento.

En la presente divulgación, un método, tal como los descritos anteriormente, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-GCC con GCC expresada en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa GCC en su superficie. En la presente divulgación, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-GCC en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-GCC con GCC, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-GCC y ^g C^c en la superficie celular. Un ensayo ejemplar para detectar la unión de un anticuerpo anti-GCC con GCC expresada en la superficie de la célula, es un ensayo “FACS” (por sus siglas en inglés Fluorescence-Activated Cell Sorting, clasificación de células activadas por fluorescencia).

Diagnósticos in vivo

En la presente divulgación, la divulgación describe un método para detectar in vivo la presencia o ausencia de células o tejidos que expresan GCC. El método incluye (i) administrar a un sujeto (por ejemplo, a un paciente que tiene un cáncer) una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación (es decir, MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, preferentemente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una etiqueta o un marcador detectable; (ii) exponer al sujeto a un medio para detectar dicha etiqueta o marcador detectable en los tejidos o células que expresan GCC. Dichos métodos in vivo pueden usarse para establecer una evaluación, un diagnóstico, una estadificación y/o un pronóstico de un paciente que padece un trastorno como cáncer. El método comprende: (i) administrar a un sujeto una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado de la misma; y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC. La formación del complejo indica la presencia o el nivel de GCC en el sujeto mientras que la no formación del complejo indica la ausencia de GCC en el sujeto.

Dichos individuos pueden diagnosticarse como que padecen cáncer metastatizado que expresa GCC y las células de cáncer metastatizado que expresan GCC pueden detectarse administrando al individuo, vehículo mediante administración intravenosa, una composición farmacéutica que comprenda un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprenda una molécula de anticuerpo anti-GCC y una fracción activa en la que la fracción activa sea un agente radioactivo, y detectar la presencia de una acumulación o agregación de radioactividad localizada, indicando la presencia de células que expresan GCC. En la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y una fracción activa en la que la fracción activa es un agente radioactivo y la molécula de anticuerpo anti-GCC es el anticuerpo MIL-44-148-2 descrito en el presente documento, o fragmentos o derivados del mismo.

En la presente divulgación, los radionúclidos pueden conjugarse con una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación para su uso como un agente de formación de imágenes en procedimientos de formación de imágenes in vivo. Los agentes de formación de imágenes son procedimientos de diagnóstico útiles así como los procedimientos utilizados para identificar la localización de células metastatizadas. Por ejemplo, los individuos pueden diagnosticarse como que padecen cáncer colorrectal metastatizado y las células metastatizadas de cáncer colorrectal pueden detectarse administrando al individuo, preferentemente mediante administración intravenosa, una composición farmacéutica que comprenda un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprenda una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación y una fracción activa, en la que la fracción activa sea un radionúclido y detectar la presencia de una acumulación o agregación de radioactividad localizada, indicativa de la presencia de células que expresan GCC.

La formación de imágenes puede realizarse mediante muchos procedimientos bien conocidos por los expertos habituales en la técnica y el agente de formación de imágenes apropiado en dichos procedimientos puede conjugarse con una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación mediante medios bien conocidos. Ejemplos de marcadores útiles para la formación de imágenes de diagnóstico, de acuerdo con la presente divulgación, son radiomarcadores tales como 32P, 3H, 14C, 188Rh, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr, 87MSr, 99Tc, 111In, 113M In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb y 206Bi y 213Bi; marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina; marcadores activos de resonancia magnética nuclear; isótopos de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono o galio (por ejemplo, 68Ga, 18F) emisores de positrones detectables mediante un detector de tomografía computarizada de emisión monofotónica (“SPECT”, del inglés single photon emission computed tomography) o escáner de tomografía por emisión de positrones (“PET”, del inglés positrón emisión tomography); agentes quimioluminiscentes tales como luciferina; y marcadores enzimáticos tales como peroxidasa o fosfatasa. También pueden emplearse emisores de radiación de corto alcance, tales como isótopos detectables mediante sondas detectoras de corto alcance, tales como una sonda transrectal. La formación de imágenes también puede realizarse, por ejemplo, mediante radiocentelleo, obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) o tomografía computarizada (CT, del inglés computed tomography). La obtención de imágenes mediante tomografía computarizada puede emplear un metal pesado tal como quelatos de hierro. La RMN puede emplear quelatos de gadolinio o manganeso.

El anticuerpo puede marcarse con dichos reactivos usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Ratón, Fla.; y Barchel, S. W. y Rhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., enseñan la conjugación de diversos radionúclidos terapéuticos y de diagnóstico con aminoácidos de anticuerpos. Dichas reacciones pueden aplicarse para conjugar radionúclidos con moléculas de anticuerpo anti-GCC de la divulgación con un agente y/o enlazador quelante apropiado. Véase también Wensel y Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y., para técnicas relacionadas con el radiomarcado de anticuerpos. Véase también, D. Colcher et al. Meth. Enzymol. 121: 802-816 (1986).

En el caso de un anticuerpo radiomarcado, el anticuerpo que se administra al paciente, se localiza en el tumor portador del antígeno con el que reacciona el anticuerpo y se detecta o “se forma una imagen” in vivo utilizando técnicas conocidas tales como exploración radionuclear utilizando, por ejemplo, una cámara gamma o tomografía de emisión o tomografía computarizada. Véase, por ejemplo, A. R. Bradwell et al., “Developments in Antibody Imaging”, Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), págs. 65-85 (Academic Press 1985). Como alternativa, puede utilizarse un escáner de tomografía transaxial de emisión de positrones, tal como el denominado Pet VI ubicado en el Brookhaven National Laboratory, donde el radiomarcador emite positrones (por ejemplo, 11C, 18F, 15O y 13N, 68Ga),

En la presente divulgación, la divulgación describe métodos para la determinación de la dosis, por ejemplo, dosis de radiación, a la que se exponen diferentes tejidos cuando a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, se le administra una molécula de anticuerpo anti-GCC que se conjuga con un isótopo radioactivo. El método incluye: (i) administrar a un sujeto una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en el presente documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC, que está marcada con un isótopo radioactivo; (ii) medir la cantidad de isótopo radioactivo que se localiza en diferentes tejidos, por ejemplo, tumor o sangre, a diversos momentos hasta que algún o todos los isótopos radioactivos se hayan eliminado del cuerpo del sujeto; y (iii) calcular la dosis de radiación total recibida por cada tejido analizado. Las mediciones pueden tomarse en momentos programados, por ejemplo, el día 1, 2, 3, 5, 7 y 12, después de administrar (el día 0) al sujeto la molécula de anticuerpo anti-GCC marcada con radioactividad. La concentración de radioisótopo presente en un tejido determinado, integrado con el tiempo y multiplicado por la actividad específica del radioisótopo, puede utilizarse para calcular la dosis que recibe un tejido. La información farmacológica generada utilizando moléculas de anticuerpo anti-GCC marcadas con un isótopo radioactivo, por ejemplo, un emisor gamma, por ejemplo, 111In, puede usarse para calcular la dosis esperada que el mismo tejido recibiría de un isótopo radioactivo diferente que no puede medirse fácilmente, por ejemplo, un emisor beta, por ejemplo, 90Y.

Diagnósticos complementarios para terapia dirigida a GCC

Los métodos de diagnóstico in vitro e in vivo descritos en el presente documento son útiles para informar sobre si un paciente que padece una enfermedad proliferativa, tal como cáncer, o un trastorno gastrointestinal, tal como síndrome inflamatorio intestinal, enfermedad de Crohn o estreñimiento, debe tratarse o no con una terapia dirigida a GCC, basándose en la presencia o ausencia, respectivamente, de la expresión de GCC en la superficie, o dentro, de las células o tejidos del paciente. Un paciente que tiene una o más células que expresan GCC en la superficie celular o dentro de la célula, es un candidato para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC.

En determinados aspectos, la divulgación describe un método de determinación de la sensibilidad de un paciente que se sospecha que padece una enfermedad o un trastorno que expresa GCC a una terapia dirigida a GCC, que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con una molécula de anticuerpo anti-GCC de la divulgación; (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC; en el que la formación del complejo indica la presencia o el nivel de proteína GCC en la muestra biológica, mientras que la no formación de complejo indica la ausencia de proteína GCC en la muestra biológica, determinando así la sensibilidad del paciente a una terapia dirigida a GCC. En la presente divulgación, la formación de complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y la proteína GCC en la muestra biológica se detecta mediante inmunohistoquímica utilizando una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, por ejemplo, el anticuerpo MIL-44-1482 descrito en el presente documento.

Las muestras biológicas ejemplares pueden comprender una célula, células, tejidos o líquido corporal, tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, líquido intestinal, una muestra de heces. En la presente divulgación, la muestra biológica comprende una o más células o tejido canceroso. Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia de tumor, por ejemplo, una biopsia de un tumor colorrectal, un tumor gástrico, un tumor esofágico, un tumor del intestino delgado, un tumor de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroendocrino, un tumor neuroectodérmico o de una muestra tisular de cualquier sitio metastásico de la misma. En la presente divulgación, la muestra biológica puede ser sangre u otro líquido, en el que el líquido comprende una célula cancerosa. Una muestra biológica puede obtenerse utilizando cualquiera de los diversos métodos de la técnica. Además, una muestra biológica puede tratarse con un fijador, tal como formaldehído, e incluirse en parafina y seccionarse para su uso. Como alternativa, puede emplearse tejido reciente o congelado. En la presente divulgación, pueden utilizarse aspirados con aguja fina.

Las enfermedades/trastornos ejemplares que pueden evaluarse (por ejemplo, diagnosticarse) y tratarse utilizando los métodos de diagnóstico complementarios descritos en el presente documento, incluyen pero sin limitación, trastornos proliferativos, que incluyen pero sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcoma de tejidos blandos tal como leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma, tumores neuroendocrinos gastrointestinales y broncopulmonares y tumores neuroectodérmicos, trastornos gastrointestinales, tales como síndrome inflamatorio intestinal, enfermedad de Crohn y estreñimiento, y trastornos neurológicos tales como enfermedad de Parkinson.

Los métodos de la divulgación conducen a decisiones médicas a la hora de determinar si tratar a un paciente con una terapia dirigida a GCC. Los métodos proporcionados en el presente documento también permiten la generación de un informe de tratamiento personalizado, por ejemplo, un informe de tratamiento de cáncer personalizado, por ejemplo, con una terapia dirigida a GCC descrita en el presente documento.

Una terapia dirigida a GCC es un agente terapéutico que trata o previene una enfermedad que expresa GCC o una enfermedad mediada por GCC, por ejemplo, una enfermedad que expresa GCC o una enfermedad mediada por GCC descrita en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, la terapia dirigida a GCC es un ligando de GCC, tal como una molécula de anticuerpo anti-GCC o un ligando peptídico (por ejemplo, un péptido ST) conjugado con un agente, tal como un agente terapéutico. Los ligandos de GCC ejemplares conjugados con agentes terapéuticos (es decir, inmunoconjugados) se describen, por ejemplo, en la solicitud de Patente publicada de Estados Unidos N.° 20110110936. En la presente divulgación, el agente terapéutico dirigido a GCC es un anticuerpo monoclonal de IgG1 humano anti-GCC conjugado con un agente citotóxico, en el que el mAb (siglas del inglés monoclonal antibody) incluye una región variable de cadena ligera (VL) que tiene las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) y una región variable de cadena pesada (VH) que tiene las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) enumeradas más adelante en las Tablas 7 (secuencias de aminoácidos) y 8 (que corresponden a las secuencias de ácidos nucleicos) y una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera enumeradas más adelante en las Tablas 9 (secuencias de aminoácidos) y 10 (que corresponden a las secuencias de ácidos nucleicos).

Tabla 7: Secuencia de aminoácidos de las CDR VL CDR VH

Tabla 8: Secuencia de ácidos nucleicos de las CDR VL CDR VH

Tabla 9: Secuencia de aminoácidos de la re ión variable del mAb

Tabla 10: Secuencia de ácidos nucleicos de la re ión variable del mAb

A continuación se enumeran las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos correspondientes para las secuencias completas de la cadena pesada de hIgGI y la cadena ligera hKappa que contienen las VL CDR y VH CDR mostradas en las Tablas 7 y 8, y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada mostradas en las Tablas 9 y 10:

La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de hIgG1 es:

GAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACA GGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTC GGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTTTGGTGGGTCTTTCAGTGGTTACTACTGG AGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCA TCGTGGAAACACCAACGACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAG ACACGTCCAAGAACCAGTTCGCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACG GCT GTTT ATT ACTGT GCG AG AG AACGT GG AT ACACCT AT GGT AACTTT G ACC ACT GG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATAATAGGGATAACAGGGTAATACTAGAG (SEQ ID NO: 83)

La secuencia proteica de la cadena pesada de hIgG1 es;

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRQ

PPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARE

RGYTYGNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT

VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK

VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 84)

La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera Kappa es:

GCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTA CAGGTGTCCACTCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTA

( ,( < U , I \ I ( ^{\ ( i ( ' \ n \ \ \ (} í ' U ,( ,( ( ■ \( ^{I i} ,( I ( ( ( \1 .( ,( I < ( I I \ l( ■ I \ K ^{¡ i} . U .( \ | í i ACCAGGGCCACTGGAATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTT CACTCTCACCATCGGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCA GTATAAAACCTGGCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAACGTGGAAATCAAACGTA CGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTG GAACT GCCT CTGTT GT GT GCCT GCT G AAT A ACTTCT ATCCCAG AG AGGCC AA AGT AC AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGC AGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTCTAGA (SEQ ID NO: 85)

La secuencia proteica de la cadena ligera hKappa es:

MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKP GQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQ GTNVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 86)

En un aspecto particular de la divulgación, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado que tiene una molécula de anticuerpo anti-GCC conjugada con una molécula de auristatina. En la presente divulgación el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye tres regiones CDR de cadena pesada (VH) de acuerdo con las SEQ ID NO: 67, 68 y 69, y tres regiones CDR de cadena ligera (VL) de acuerdo con las SEQ ID NO: 70, 71 y 72, conjugada con una molécula de auristatina. En la presente divulgación, el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye una región variable de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 80, conjugada con una molécula de auristatina. En la presente divulgación, el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye las regiones variables de la cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 79 y 80, respectivamente, conjugada con una molécula de auristatina.

En la presente divulgación, la molécula de auristatina está unida a una fracción de cisteína en la molécula de anticuerpo anti-GCC mediante un enlazador que contiene una fracción de maleimida, por ejemplo, una fracción de maleimidocaproilo.

En la presente divulgación, la molécula de auristatina está acoplada a una molécula de anticuerpo anti-GCC utilizando un enlazador heterobifuncional que está conectado a un grupo hidroxilo en la molécula de auristatina. En la presente divulgación, el enlazador comprende una hidrazona. En la presente divulgación, el enlazador es un compuesto de hidrazona formado por la reacción de maleimidocaproilhidrazida y un ácido cetocarboxílico, por ejemplo, ácido 5-benzoilvalérico. En la presente divulgación, el enlazador es ácido (Z)-6-(2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidrazono)-6-fenilhexanoico.

En la presente divulgación la molécula de auristatina está acoplada a la molécula de anticuerpo anti-GCC utilizando un enlazador heterobifuncional que está conectado a un grupo monometil amino en la molécula de auristatina. En la presente divulgación, el enlazador comprende una fracción escindible, por ejemplo, una fracción peptídica, un espaciador auto-inmolativo de p-aminobencilcarbamato. Enlazadores ejemplares incluyen maleimidocaproilo (mc), maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobencilcarbamato, y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-paminobencilcarbamato (vc).

En la presente divulgación, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado caracterizado por la fórmula Ab-(vc-MMAF)m (fórmula (I-4)); Ab-(vc-MMAE)m (fórmula (I-5)); Ab-(mc-MMAE)m (fórmula (I-6)); o Ab-(mc-MMAF)m, (fórmula (I-7)), en la que Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye características tales como las características descritas en una cualquiera de las Tablas 7, 8, 9 o 10, S es un átomo de azufre del anticuerpo y m varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 15. En la presente divulgación, m es un número entero de 1 a aproximadamente 5.

En la presente divulgación, la variable m en las fórmulas (I-4), (I-5), (I-6) o (I-7) varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.

En la presente divulgación, la terapia dirigida a GCC es un inmunconjugado de fórmulas (I-4), (I-5), (I-6) o (I-7), donde Ab es una molécula de anticuerpo que incluye tres regiones CDR de cadena pesada (VH) de acuerdo con las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y tres regiones ^c D^r de cadena ligera (VL) de acuerdo con las SEQ ID N^o : 70, 71 y 72, y m varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4). En determinados aspectos, el Ab que incluye las CDR de cadena pesada de acuerdo con las ^s E^q ID NO: 67, 68 y 69 y las tres CDR de cadena ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 70, 71 y 72, respectivamente, es un anticuerpo monoclonal humano, preferentemente un anticuerpo de IgG1 humana.

En la presente divulgación, la terapia dirigida a GCC es un inmunconjugado de fórmulas (I-4), (I-5), (I-6) o (I-7), donde Ab es una molécula de anticuerpo monoclonal que incluye una región variable de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 79 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 80, y m varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4). En determinados aspectos, el Ab que incluye las regiones variables de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEQ ID NO: 79 y 80, respectivamente, es un anticuerpo monoclonal humano, preferentemente un anticuerpo de IgG1 humana.

En la presente divulgación, la terapia dirigida a GCC es un inmunconjugado de fórmulas (I-4), (I-5), (I-6) o (I-7), donde Ab es una molécula de anticuerpo monoclonal de IgG humana que incluye una secuencia de IgG1 de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 84, y una secuencia de cadena ligera Kappa de acuerdo con la SEQ ID NO: 86, y m varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4).

En la presente divulgación, la terapia dirigida a GCC es un conjugado de GCC-ligando capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, en determinados aspectos la divulgación se refiere a un conjugado de GCC-ligando con un agente neuroprotector, tal como L-dopa, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. En la solicitud PCT publicada WO2013/016662, se describen ejemplos de dichos conjugados de GCC-ligando. En realizaciones de la invención, los pacientes que padecen, o que se sospecha que tienen, un trastorno neurológico (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) cuyas neuronas expresan GCC, se considerarían buenos candidatos para el tratamiento con un conjugado de GCC-ligando con un agente neuroprotector.

En algunos aspectos de la invención, la terapia dirigida a GCC es un antagonista de GCC. En una realización, la terapia dirigida a GCC es un antagonista peptídico (por ejemplo, un péptido ST) o un inhibidor de GCC de molécula pequeña.

En algunos aspectos, la terapia dirigida a GCC es un agonista de GCC. En la presente divulgación, el agonista de GCC es un péptido ST. En la presente divulgación, el agonista de GCC es un péptido ST que comprende la secuencia de aminoácidos: H-HCys1-cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH (SEQ ID NO: 87), en la que hay tres enlaces disulfuro: entre Cys1 y Cys6, entre Cys2 y Cys10 y entre Cys5 y Cys13. En la presente divulgación, el agonista de GCC es un agonista peptídico, tal como Linaclotida (Ironwood Pharmaceuticals), que se une a GCC.

En la presente divulgación, los pacientes cuyas células tumorales expresan GCC en su superficie, se consideran buenos candidatos para el tratamiento con moléculas de anticuerpo anti-GCC conjugadas con toxinas, tal como un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, o los anticuerpos conjugados con toxina como se describe en la Solicitud de Patente publicada de Estados Unidos N.° 20110110936. Sin pretender ligarse a ninguna teoría, los pacientes cuyas celulares tumorales expresan bajas candidatos de GCC en su superficie no son buenos candidatos para esto o podían ser candidatos para combinar la terapia dirigida a GCC con un método de tratamiento adicional, o ser candidatos para una terapia con anticuerpos no marcados. En otro ejemplo, la dosis de la terapia dirigida a GCC podría ajustarse para reflejar el número de moléculas de GCC expresadas en la superficie de las células tumorales. Por ejemplo, los pacientes con altos números de moléculas GCC expresadas en la superficie de sus células tumorales, podrían tratarse con dosis más bajas de una terapia dirigida a GCC que los pacientes con bajos números de moléculas GCC expresadas en la superficie de las células tumorales. La detección in vivo de la presencia de células tumorales que expresan GCC puede permitir la identificación de tejidos en el tumor primario que expresa GCC que ha metastatizado. El conocimiento de qué tejidos tienen metástasis puede conducir a la aplicación dirigida de terapia tumoral.

Como se ha indicado anteriormente, las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, permiten evaluar la presencia de una proteína GCC en tejidos normales frente a neoplásicos, a través de lo cual puede evaluarse la presencia o la gravedad de la enfermedad, el avance de la enfermedad y/o la eficacia de la terapia. Por ejemplo, la terapia puede monitorizarse y puede evaluarse la eficacia. En un ejemplo, una proteína GCC puede detectarse y/o medirse en una primera muestra obtenida de un sujeto que tiene una enfermedad proliferativa y la terapia puede iniciarse. Posteriormente, puede obtenerse una segunda muestra del sujeto y la proteína GCC puede detectarse y/o medirse en la muestra. Una disminución en cuanto a la cantidad de proteína GCC detectada o medida en la segunda muestra, puede ser indicativa de eficacia terapéutica.

Sin pretender ligarse a ninguna teoría, para una terapia dirigida a CGG, la vascularización puede ser necesaria para acceder a un tumor que exprese GCC, particularmente en casos en los que la terapia dirigida a GCC se administre por vía intravenosa. Por tanto, en determinadas realizaciones de los métodos de la invención, puede ser útil evaluar o caracterizar la vasculatura tumoral además de, o junto con, la detección de la proteína g Cc . Por ejemplo, una muestra tisular puede teñirse con un agente que identifique una célula endotelial vascular, tal como un anticuerpo anti-CD-31 o una molécula de anticuerpo anti-Factor de von Willebrand, y un anticuerpo anti-GCC de la invención para caracterizar de manera simultánea o al mismo tiempo la expresión de GCC y la vascularización tisular. En determinados aspectos de la invención, dicha caracterización simultánea o al mismo tiempo de la expresión de GCC y de la vascularización tisular, es útil como una herramienta de selección de pacientes para una terapia dirigida. En otro aspecto, la expresión de GCC en la superficie celular puede ser necesaria para una terapia dirigida a GCC para afectar a la destrucción de una célula tumoral que exprese GCC. Por ejemplo, algunas células tumorales pueden expresar GCC, pero no en la superficie celular. Si una terapia depende de la expresión de GCC en la superficie celular, puede que dicha terapia no sea capaz de destruir una célula donde la GCC sea principalmente intracelular. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, el ensayo de diagnóstico o pronóstico puede incluir adicionalmente análisis y/o cuantificación de localización celular de GCC, por ejemplo, un método que pueda diferenciar y/o cuantificar la expresión de la superficie celular de la expresión intracelular. Sin pretender ligarse a ninguna teoría, puede que un paciente cuyo tumor tiene principalmente expresión de GCC intracelular no sea un buen candidato para una molécula de anticuerpo anti-GCc que se une al dominio extracelular de GCC. Como alternativa, dicho resultado analítico puede solicitar un tratamiento inicial con un agente que induzca la expresión de GCC en la superficie celular (véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO04/071436). Después, o junto con la inducción de GCC en la superficie celular, puede administrase una molécula de un anticuerpo anti-GCC que tiene acceso a, que se une solo con, GCC expresada extracelularmente.

Kits

Además dentro del alcance de la invención se incluyen kits que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. Adicionalmente se incluyen kits que comprenden composiciones de liposomas que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado. El kit puede incluir uno o más elementos distintos que incluyen: instrucciones para su uso; otros reactivos; por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico, o un agente útil para quelar o, de otra manera, acoplar un anticuerpo a un marcador o agente terapéutico, o una composición radioprotectora; dispositivos u otros materiales para preparar el anticuerpo para la administración; vehículos farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto. Las instrucciones para su uso pueden incluir instrucciones para aplicaciones de diagnóstico de la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado para detectar GCC, in vitro, por ejemplo, en una muestra, por ejemplo, una biopsia o células de un paciente que tiene un cáncer o in vivo. Las instrucciones pueden incluir pautas para la aplicación terapéutica que incluyen dosificaciones y/o modos de administración sugeridos, por ejemplo, en un paciente con un cáncer (por ejemplo, un cáncer de origen gastrointestinal, tal como, por ejemplo, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer esofágico). Otras instrucciones pueden incluir instrucciones sobre el acoplamiento del anticuerpo con un quelante, un marcador o un agente terapéutico, o para la purificación de un anticuerpo conjugado, por ejemplo, de componentes de conjugación que no han reaccionado. Como se ha indicado anteriormente, el kit puede incluir un marcador, por ejemplo, cualquiera de los marcadores descritos en el presente documento. Como se ha indicado anteriormente, el kit puede incluir un agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico descrito en el presente documento. En algunas aplicaciones el anticuerpo reaccionará con otros componentes, por ejemplo, un quelante o un marcador o agente terapéutico, por ejemplo, un radioisótopo, por ejemplo, itrio o lutecio. En dichos casos, el kit puede incluir uno o más de un recipiente de reacción para realizar la reacción o un dispositivo distinto, por ejemplo, una columna cromatográfica, para su uso en la separación del producto acabado de los materiales de partida o productos de reacción intermedios.

El kit puede contener adicionalmente al menos un reactivo adicional, tal como un agente de diagnóstico o terapéutico, por ejemplo, un agente de diagnóstico o terapéutico como se describe en el presente documento, y/o una o más moléculas adicionales de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugados, formulados según sea apropiado, en una o más preparaciones farmacéuticas distintas.

El kit puede contener adicionalmente un radioprotector. La naturaleza radiolítica de los isótopos, por ejemplo, 90Itrio (90Y) se conoce. Para superar esta radiolisis, pueden incluirse radioprotectores, por ejemplo, en el tampón de reacción, siempre que dichos radioprotectores sean benignos para el anticuerpo, lo que significa que no inhiben o, de otra manera, no influyen adversamente en la reacción de marcaje, por ejemplo, de un isótopo, tal como 90Y. El tampón de formulación de la presente divulgación puede incluir un radioprotector tal como seroalbúmina humana (SAH) o ascorbato, que minimiza la radiolisis debido al itrio o a otros radionúclidos fuertes. En la técnica se conocen otros radioprotectores y pueden utilizarse también en el tampón de formulación de la presente divulgación, es decir, neutralizadores de radicales libres (fenol, sulfitos, glutatión, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo, HOP(:O)H2l glicerol, sulfoxilato de formaldehído sódico, Na2S2O, Na2S2O3, y SO2, etc.).

Un kit proporcionado es uno que es útil para el radiomarcado de una proteína o un péptido conjugado con un quelante con un radioisótopo terapéutico para su administración a un paciente. El kit incluye (i) un vial que contiene un anticuerpo conjugado con un quelante, (ii) un vial que contiene un tampón de formulación para estabilizar y administrar el anticuerpo radiomarcado a un paciente e (iii) instrucciones para realizar el procedimiento de radiomarcado. El kit proporciona la exposición de un anticuerpo conjugado con un quelante al radioisótopo o sal del mismo durante una cantidad de tiempo suficiente en condiciones afables, por ejemplo, como se recomienda en las instrucciones. Se produce un anticuerpo radiomarcado que tiene suficiente pureza, actividad específica y especificidad de unión. El anticuerpo radiomarcado puede diluirse a una concentración apropiada, por ejemplo, en un tampón de formulación, y administrarse directamente al paciente con o sin purificación adicional. El anticuerpo conjugado con quelante puede proporcionarse en forma liofilizada.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no significa que sean limitantes de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de una proteína de fusión dominio extracelular de GCC humana-Fc de ratón (hGCC-ECD-mFc)

La generación de una proteína de fusión del dominio extracelular (ECD, extracelular domain) de la guanilil ciclasa (GCC) humana (h) (hGCC)/(Fc) constante de cadena pesada de (Ig)G2a de inmunoglobulina de ratón (con la mutación en la región de unión al receptor (FcRbr-mutII)) (es decir, la proteína de fusión hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII, también denominada en el presente documento pLKTOK108 y MIL-44) secretada para la inmunización y exploración, se realizó de la siguiente manera. En antígeno GCC se preparó subclonando una parte del gen de GCC que codifica una secuencia que comprende la siguiente secuencia de GCC (secuencia señal y dominio extracelular) en el vector de expresión pLKTOK4:

MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEP

LKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIFTNSGDCRSSTC

EGLDLLRKJSNAQRMGCVL1GPSCTYSTFQMYLDTELSYPM1SAGSFGLS

CDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETE

DCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCG

GPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS

PGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKJFLENGENITTPK

FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTH

VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL (SEQ ID NO: 46)

La secuencia de aminoácidos GLy-Arg-Gly-Pro-Gln (SEQ ID NO: 66), en las posiciones 427 a 430, se seleccionó para finalizar el fragmento de GCC extracelular. En la GCC, esta secuencia va inmediatamente seguida de una Pro que se alinea bien con una Pro en la posición homóloga a la Pro que se utiliza históricamente para iniciar las proteínas de fusión de IgG Fc humanas.

La región Fc de IgG2a de ratón de pLKTOK108 se diseñó para comenzar con la secuencia de aminoácidos que funcionalmente es el extremo del dominio CH1 [Pro-Arg-Valina (Val)-Pro-Isoleucina (Ile)-Treonina (Thr)-Glu-Asparagina (Asn)] (SEQ ID NO: 58). En la región constante de la IgG2a de ratón, se mutaron dos regiones. Además de las mutaciones de leucina (Leu)-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO: 59) a Leu-alanina (Ala)-Gly-Ala (SEQ ID NO: 60) (posiciones 234 a 237 Lisina [Lys]-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 61) a Lys-Ala-Gly-Ala (SEQ ID NO: 62), también se mutó la segunda región de receptor Fc en las posiciones 318 a 322 de la siguiente manera: ácido glutámico (Glu)-Fenilalanina (Phe)-Lys-Cisteína (Cys)-Lys (SeQ ID NO: 63) a Ala-Phe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 64) y después a Phe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 65).

Una vez diseñada la secuencia completa de la proteína de fusión, para completar el ADNc de la proteína de fusión, se añadieron las secuencias flanqueantes de las enzimas de restricción para BamHI y Xbal, así como la secuencia Kozak (CTCACC) y un codón de terminación terminal. A continuación se proporcionan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la proteína de fusión pLKTOK108 (hGCC/mIgG2a FcRmutII) (los sitios de restricción BamHI y Xbal se muestran en letras minúsculas en la SEQ ID NO: 47).

Secuencia de nucleótidos del ECD-GCC humana/Fc de IgG2a de ratón (SEQ ID NO: 47) cgcggatccctcaccATGAAGACGTTGCTGTTGGACTTGGCTTTGTGGTCACTGCTCTTCCAG CCCGGGTGGCTGTCCTTTAGTTCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTAT GAAATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGCCTTTGCAGAGCCCCTGAAAAACTTG GAAGATGCGGTGAATGAGGGGCTGGAAATAGTGAGAGGACGTCTGCAAAATGCTGG CCT A A ATGTG ACT GT G A ACGCT ACTTT C AT GT ATT CGG AT GGT CTG ATTC AT A ACT C A GGCGACTGCCGGAGTAGCACCTGTGAAGGCCTCGACCTACTCAGGAAAATTTCAAA TGCACAACGGATGGGCTGTGTCCTCATAGGGCCCTCATGTACATACTCCACCTTCCA GATGTACCTTGACACAGAATTGAGCTACCCCATGATCTCAGCTGGAAGTTTTGGATT GTC AT GT G ACT AT AA AGAAACCTT A ACCAGGCT G ATGTCTCCAGCT AGAAAGTT G AT GTACTTCTTGGTTAACTTTTGGAAAACCAACGATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGG AGCACTTCGTATGTTTACAAGAATGGTACAGAAACTGAGGACTGTTTCTGGTACCTT A AT GCT CTGG AGGCT AGCGTTTCCT ATTT CTCCC ACG A ACTCGGCTTT A AGGT GGT GT T AAGACAAG AT AAGGAGTTTCAGG AT ATCTTA ATGGACCACAACAGG AAAAGCA AT GTGATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGGGTGACCGAGCA GTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGACCAGTACTTGGAG GACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCTTGTTCTGACGCTGTCTCCT GGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCAGGAATCTATCACCAACAAAACGAGAC TTT GCT CTT GCCT ATTT G A AT GG AATCCTGCT CTTTGG ACAT AT GCTG A AGAT ATTTC TTGAAAATGGAGAAAATATTACCACCCCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCA

CTTTT G AAGGGT ATG ACGGTCCAGT G ACCTT GG ATG ACTGGGGGG AT GTTG AC AGT A

CCATGGTGCTTCTGTATACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTTGACCT

ATG AT ACCCACGT A A AT A AG ACCT AT CCT GT GG AT AT G AGCCCC AC ATTC ACTT GG A

AG AACTCT AAACTTCCT AAT G AT ATT ACAGGCCGGGGCCCTCAGCCC AG AGT GCCC A

TAACACAGAACCCCTGTCCTCCACTCAAAGAGTGTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACC TCGCAGGTGCACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGA TCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAG

ACGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAA

ACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAG

CACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGCATTCAAATGCAAGGTCAACAACAGAGCCCT

CCCATCCCCCATCGAGAAAACCATCTCAAAACCCAGAGGGCCAGTAAGAGCTCCAC

AGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGCAGAAGAGATGACTAAGAAAGAGTTCAGTCTG

ACCTGCATGATCACAGGCTTCTTACCTGCCGAAATTGCTGTGGACTGGACCAGCAAT

GGGCGTACAGAGCAAAACTACAAGAACACCGCAACAGTCCTGGACTCTGATGGTTC

TTACTTCATGTACAGCAAGCTCAGAGTACAAAAGAGCACTTGGGAAAGAGGAAGTC TTTTCGCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCTTACGACTAAGACCA TCTCCCGGTCTCTGGGTAAATAAtctagagca

Secuencia de aminácidos del ECD-GCC humana/Fc de IgG2a de ratón (SEQ ID NO: 48):

MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAV NEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGL1HNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGC VLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWK TNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDI LMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYLEDNVTAPDYMKN VLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHA FRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSP TFTWKNSKLPNDITGRGPOPRVP1TONPCPPLKECPPCAAPDLAGAPSVFIFPPKIKDVLMI SLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTERVVSATP1QHQ DWMSGKAFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMIT GFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVV HEGLHNHLTTKTISRSLGK

Como se ha indicado anteriormente, la proteína recombinante pLKTOK109 combina la región extracelular de la GCC humana fusionada a una región Fc de IgG2a de ratón en la que las dos regiones de unión al receptor Fc mutadas (FcR) se mutaron para impedir la unión al receptor Fc (mIgG2a FcRmutII). El inserto de ADN recombinante para pLKTOK108 se creó mediante un proceso de PCR en tres etapas de la siguiente manera:

En la primera etapa se crearon los fragmentos de ADN de la GCC humana extracelular adaptada y de FcRmutlI de la IgG2a de ratón adaptada que contenían 35 nucleótidos de secuencias solapantes. Estas reacciones de PCR utilizaron los moldes y los cebadores descritos en las Tablas 11 y 12 con el protocolo descrito en la Tabla 13 para crear los dos fragmentos. Estos fragmentos de ADN se aislaron de un gen de agarosa al 1 % utilizando un kit de Purificación en Gel de Qiagen (Valencia, CA). El molde de la GCC humana se proporcionó mediante un vector de expresión de proteína que contenía la secuencia de la GCC humana (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA). El molde para el dominio Fc se obtuvo a partir de una construcción de expresión para la 1228 humana fusionada a la IgG2aFc de ratón con dos regiones de unión al receptor Fc mutadas (FcRmutII), denominada pLKTOK48, que en sí misma se creó utilizando como molde el vector pLKTOK61 (descrito en la Patente de Estados Unidos 7.053.202).

Tabla 11: Moldes utilizados en las reacciones de ensamblaje de la primera etapa de PCR para crear ADN r m in n r LKT K1

T l 12 r iliz n l r i n P R r r r LKT K1

Tabla 13: Protocolo de reacción utilizado en las reacciones de ensamblaje de la primera etapa de PCR para crear AD r m in n r LKT K1

La segunda reacción de PCR combinó los moldes en las concentraciones indicadas en la Tabla 14. El protocolo de reacción indicado en la Tabla 15 creó un solo gen de proteína de fusión recombinante. El producto de esta reacción se utilizó directamente como el molde en la tercera reacción de PCR.

Tabla 14: Moldes utilizados en las reacciones de ensamblaje de la segunda etapa de PCR para crear ADN recombinante ara LKTOK108

Tabla 15: Protocolo de reacción utilizado en las reacciones de ensamblaje de la segunda etapa de PCR para crear AD r m in n r LKT K1

La tercera reacción de PCR utilizó los moldes y los cebadores descritos en las Tablas 16 y 12 con el protocolo descrito en la Tabla 17 a continuación para crear los fragmentos completos. Estos fragmentos de ADN se aislaron de un gel de agarosa al 0,7 % utilizando un kit de Purificación en Gel de Qiagen y un kit de Clonación TOPO® TA con un saliente de tiamina adenosina (TA) (Anexo F). Los clones únicos se aislaron y el ADN se purificó utilizando el kit de miniprep de ADN de Qiagen (Anexo F). El ADN se secuenció con los cebadores M13f, M13r y pSMUCH2 para identificar los que tenían la secuencia deseada. El clon TOPO intermedio TOK108-15 contenía la secuencia de ADN recombinante deseada.

Tabla 16: Moldes utilizados en las reacciones de ensamblaje de la tercera etapa de PCR para crear ADN

recombinante ara LKTOK108

Tabla 17: Protocolo de reacción utilizado en la reacción de ensamblaje de la tercera etapa de PCR para crear ADN r m in n ^ r LKT K1

Para crear el vector de expresión pLKTOK4, se utilizó pcDNA3.1™ como un vector troncal. Este vector contiene el gen de neomicina (NEO) de resistencia a G-418 (Geneticin®) que permite facilitar la selección en condiciones de búsqueda. El sitio de restricción Spel se eliminó del vector pcDNA3.1™ mediante mutagénesis dirigida. El promotor EF-1a del plásmido pcDEF3 (originalmente EF-BOS4) se insertó en el vector pcDNA3.1™, eliminando así el promotor de CMV. En la Figura 1 se representa un mapa circular del vector de expresión pLKTOK4.

La clonación se realizó en los productos finales de la PCR utilizando un kit de Clonación TOPO® TA. Después de la digestión con las enzimas de restricción BamHl y Xbal, el fragmento deseado del clon TOPO se ligó en el vector de expresión pKLTOK4 que también se dirigió con BamHl y Xbal. La reacción de ligamiento se utilizó para transformar células de E. coli K12 químicamente competentes y después se seleccionaron en placas de agar con caldo de Luria (LB)/ampicilina. Los plásmidos de clones de E. coli individuales se aislaron utilizando el kit miniprep de ADN de QIAGEN y se secuenciaron con los cebadores SP6 (SEQ ID NO: 55), EF5S (SEQ ID NO: 54) y pSMUCH2 (SEQ ID NO: 53).

Mediante secuenciación de ADN se determinó un clon que contenía el ADN recombinante deseado y se utilizó para preparar una gran cantidad de ADN plasmídico puro utilizando un kit Maxiprep de QIAGEN. El ADN de maxiprep se utilizó para la transfección en células de ovario de hámster Chino deficientes en dihidrofolato reductasa (CHO-DG44).

Para el desarrollo de líneas celulares de producción de pLKTOK108 se utilizó la línea celular CHO-DG44 adaptada en suspensión, sin suero, denominada S1-CHO-DG44. En resumen, las transfecciones se realizaron utilizando un dispositivo Nucleofector® de Amaxa Biosystems y el kit V de Nucleofection® utilizando ADN circular, no linearizado, o ADN plasmídico linearizado tratado con la enzima de restricción Pvu I. Las células transfectadas se mantuvieron en medio de crecimiento IS-CHO-V-GS durante 48 horas antes de cambiar al medio de selección G-418. Las células vivas, transfectadas, recibieron medio de selección G-418 reciente y se mantuvieron en cultivo hasta la confluencia (~10 a 14 días). La productividad de pLKTOK108 de cada grupo de transfección se evaluó utilizando un ensayo ELISA con IgG2a de ratón y las células se expandieron para preparar bancos de células congeladas. El grupo de transfección con la productividad más alta mediante ELISA con IgG2a de ratón se identificó mediante clonación por dilución limitada donde las células se sembraron en 5 placas de cultivo tisular de 96 pocillos en Medio de Selección G-418 (aproximadamente 1 célula en pocillos alternos). Las placas de 96 pocillos se incubaron en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % durante 2 semanas sin suministro. Se transfirieron cincuenta pl de sobrenadante de cada pocillo que tenía una sola colonia directamente a una placa de ensayo de 96 pocillos para realizar el ensayo ELISA con IgG2a de ratón. Se identificaron veintitrés clones con alta productividad y expandieron secuencialmente a través de placas de cultivo celular de 24 pocillos y después en placas de cultivo celular de 6 pocillos. El título de anticuerpo del sobrenadante de estos clones se midió a 3 diluciones diferentes en el ensayo ELISA con IgG2a de ratón.

Basándose en el título de IgG2a de ratón, los 6 mejores clones se expandieron en Medio de Selección G-418 para preparar bancos de células congeladas y se adaptaron a medio Sigma n.° 21 en suspensión, sin suero. La densidad y viabilidad celular se determinaron usando el analizador de Cultivo Celular Automatizado Cedex y la concentración proteica en el sobrenadante se midió utilizando el ensayo ELISA con IgG2a de ratón. Una vez que las células alcanzaron la fase de crecimiento logarítmico, se recogieron y se congelaron a -80 °C durante una noche y después se transfirieron a una criocámara con nitrógeno líquido para su conservación.

Para producir la proteína de fusión, las células se descongelaron y se sembraron en placas y posteriormente se expandieron en serie en matraces de tipo T más grandes y después en matraces agitadores a densidades iniciales de 3,0 x 105 células/ml y se incubaron en una incubadora humidificada programada a 37 °C, con CO2 al 5 % en un agitador orbital programado a 105 rpm. Los cultivos finales recibieron un volumen del 10 % del Medio de Suministro Especial Sigma n.° 21 los Días 4 y 7 y un volumen al 5 % el Día 10. El Medio de Suministro Sigma n.° 21 consiste en un Medio Sigma n.° 21 complementado con glucosa 40 g/l, L-glutamina 10 g/l, extracto de levadura 10 g/l y peptona de soja 10 g/l. El cultivo agitado se recogió por centrifugación. El sobrenadante que contenía la proteína pLKTOK108 secretada se filtró a través de una unidad de filtro de membrana de poliétersulfona (PES) de unión de proteína baja de 0,2-pm, conteniendo el filtrado pLKTOK108 sin procesar listo para su purificación o conservado a -80 °C para una purificación futura.

La purificación inicial implicó distribuir los sobrenadantes filtrados que contenían pLKTOK108, sobre una columna de Proteína A Sepharose a aproximadamente 4 °C. Después, la resina se lavó con PBS a un pH de 7,4 y la proteína se eluyó con glicina 0,1 M en PBS a un pH de 3,0 y se neutralizó con fosfato de sodio 1 M a un pH de 6,5. El eluato neutralizado se concentró utilizando un concentrador Vivaspin con un límite de peso molecular (MWCO) de 30 kDa y se cargó en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) Superdex 200 (Anexo G) que se preequilibró con tampón PBS a pH de 7,4 para separar los agregados de esta proteína. La proteína pLKTOK108 purificada eluye como un solo sencillo con una pureza confirmada en SDS-PAGE y tinción Coomassie. Las fracciones que contenían los homodímeros hGCC(ECD)/mIgG2a Fc se agruparon. Después, la concentración del material agrupado se determinó mediante absorbancia UV a 280 nm en un espectrofotómetro NanoDrop™ ND1000 y la proteína pLKTOK108 purificada se dividió en alícuotas y se conservó a -80 °C.

Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales de conejo mediante inmunización de proteínas

Se generaron anticuerpos monoclonales de conejo contra la proteína de fusión hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII (pLKTOK108) utilizando el servicio RabMAb® proporcionado por Epitomics (Burlingame, CA). En el presente documento, con la intención de generar mAb, la proteína de fusión hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII (pLKTOK108) recibe el nombre de MIL-44.

Utilizando técnicas de inmunización convencionales, tres conejos (ML1009, ML1010 y ML1011), se inmunizaron con MIL-44. Utilizando sangrados de ensayo se evaluó el título en suero contra MIL-44 y el de un antígeno no-GCC de exploración por contraste (hMadCAM-mFc). Después de las inmunizaciones iniciales, se proporcionaron inmunizaciones de refuerzo. El conejo ML1010, que tenía el título en suero más alto, se seleccionó como un candidato para la esplenectomía y fusión monoclonal utilizando una línea celular compañera de fusión y los métodos propiedad de Epitomics.

En dos días distintos (Día 1 y Día 2), doscientos millones de células de linfocitos se fusionaron con 100 millones de células compañeras de fusión y se sembraron en placas 20X de 96 pocillos, respectivamente. Las placas se mantuvieron en incubadores de cultivo tisular en condiciones estándar. El crecimiento celular se examinó 2-3 semanas después de la fusión y la eficacia de la fusión se calculó utilizando el número de pocilios con crecimiento dividido entre el número total de pocillos examinados. La eficacia de la fusión, para la fusión el Día 1, se midió a una eficacia de fusión del 72 %, mientras que la eficacia de fusión el Día 2 era del 79 %. Se examinó un mínimo de dos placas para cada fusión de la siguiente manera:

Las 40 placas se exploraron utilizando métodos ELISA estándar recubriendo las placas con 50 ng de MIL-44/pocillo. Como control positivo se utilizó un sangrado de ML1010 a una dilución de 1:10 K. 151 clones que tenían una D.O. mayor de 0,5 se consideraron supuestamente positivos y se expandieron adicionalmente en una placa de 24 pocillos.

Se realizó una exploración confirmatoria posterior por ELISA utilizando placas recubiertas con 50 ng de MIL-44 o 50 ng de hMadCAM-mFc/pocillo. 143 clones se confirmaron positivos contra MIL-44 y entre ellos se identificaron 72 como específicos de MIL-44, es decir, eran negativos contra la proteína hMadCAM-mFc.

Después de la evaluación del sobrenadante de los multiclones, se subclonaron diversos de los multiclones específicos de MIL-44: incluidos los multiclones n.° 148 y n.° 67. La subclonación se realizó utilizando el método de dilución celular limitada. Diversos sobrenadantes de los subclones se exploraron por el ELISA. Las células de hibridoma de los sublones n.° 148-2 y n.° 67-4 se seleccionaron para su congelación/depósito en banco y para exploración y análisis adicional como un reactivo de detección de GCC en un ensayo de inmunohistoquímica (IHQ), como se describe en el Ejemplo 3.

Los anticuerpos MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 también se clonaron en pcDNA3.1+neo (Invitrogen) para la producción mediante transfección transitoria en células de mamífero y para la secuenciación. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 se proporcionan más adelante. La secuencia señal en cada cadena de IgG se muestra en cursiva; la región variable en cada cadena de IgG se muestra en negrita; y las CDR se muestran subrayadas.

Secuencia de ácidos nucleicos de MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 4)

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGT CAGTCAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCTGCA CCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCATAGAATGAACTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGG GCTGGAATGGATCGCAATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAAGC CGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAG CCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAGAGAGGATAGTATGGGGTATTATTTTGACTTGTG GGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCA CGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTC GGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAG CCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACC CCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGC AGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCA GTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGC AAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAG CAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAG TGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACG GCTCCTACTTCCTCT^{acagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctcc} GTGATGCACGAGGCC TTGCACAACCAC TACACGCAGAAGTCCATCTCCCGC TCTCCGGGTAAATGA

Secuencia de aminoácidos de MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 42)

METGLiWLLLVA VXKGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCWSGFSLSSHRMNWVRQTPGKGLE WIAIITHNSITYYASWAKSRSTITRNTSENTVTLKMTSLTAADTATYFCAREDSMGYYFDLWGP GTLVTISS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYS LSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTLPIAHQDWLRG KEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVE WEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRS

Secuencia de ácidos nucleicos de MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 5)

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT GTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCAT CAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG TCTCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAGAG GCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCAC TTACTACTGTCAGCAGACTTATACTAATAATCATCTTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAG GTGGTGGTCAAA

GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAA CAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGA TGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACC TACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCT GCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG

Secuencia de aminoácidos de MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 43) MDTPAPrQLLGLLLLWLPGAPCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISNWLAWYQQKPGQ SPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTYTNNHLDNGFGGGTE VWK G DPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTW EVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCT YNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGDC

Secuencia de ácidos nucleicos de MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 6)

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGG TGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTC TGGATCCGACATCAGTAACTATGCAATATCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAA TTCATCGGATATATTAGTTATGGTAAAAGTATATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGGTTCG CCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGGAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACAC GGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATAGTGCTACTTATAGTCCTAACTTGTGGGGCCCAGGC ACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCA CGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTC GGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAG CCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACC CCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGC AGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCA GTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGC AAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAG CAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAG TGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACG GCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTT CACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCT CCGGGTAAATGA

Secuencia de aminoácidos de MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 44) MgrGL^^LLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISNYAISWVRQAPGKGLE F IG YISYGKSIYYASWAKGRFAISKTSSTTVDLEITSPTTEDTATYFCAREDSATYSPNLWGPG TLVTVSS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYS LSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTLPIAHQDWLRG KEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVE WEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRS PGK

Secuencia de ácidos nucleicos de MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 7)

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT GTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCAT CAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG CGTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAG GCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCAC TTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTATAATAATCTTGATCGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAG GTGGTGGTCACA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAA CAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGA TGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACC TACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCT GCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG

Secuencia de aminoácidos de MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 45) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSINTYLAWYQQKPGQ RPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVECADAATYYCQQGYSYNNLDRAFGGGTE VW T GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCT YNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSWQSFNRGDC

Ejemplo 3: Inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-GCC

Detección de la expresión de GCC en modelos de xenoinjerto de tumor humano de CCRm

Utilizando el anticuerpo MIL-44-148-2, se desarrolló un ensayo de IHQ para evaluar la expresión de GCC en tumores de xenoinjerto de células HEK293 transfectadas con GCC (KEK293-GCC) y en diversos xenoinjertos de tumor humano primario (XTHP) derivados de muestras de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) en ratones hembra con SCID (severe combined immunodeficiency, inmunodeficiencia combinada grave).

Los niveles de proteína GCC en tejidos incluidos en parafina y fijados con formaldehído (FFPE, siglas del inglés Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) se evaluaron en secciones de 5 pm de grosor y se incubaron con el anticuerpo MIL-44-148-2 (3,5 pg/ml) durante 1 hora en el aparato de tinción automático de Ventana Medical Systems (Tucson, AZ) Discovery XT®. Los anticuerpos se marcaron con biotina con un anticuerpo secundario de conejo anti-cabra (Vector Laboratories) y se revelaron con el sistema de mapeo de sustrato de 3,3'-diaminobexidina (DAB) (Ventana Medical Systems). Los portaobjetos se tiñeron con contraste con hematoxilina y se obtuvieron imágenes utilizando el sistema Aperio de barrido completo de portaobjetos.

Los niveles de GCC difirieron significativamente entre estos tumores con puntuaciones H (sistema de puntuación descrito más adelante) que variaban de 4+ en xenoinjertos de tumor HEK293-GCC y de 1+, 1-2+, 2+, 2-3+ y 4+ en diversos xenoinjertos de tumor humano primario (XTHP). En general, en los tumores con células tumorales moderadas/bien diferenciadas que conservaron una estructura epitelial polarizada, la GCC se concentró en el lado luminal del tejido tumoral.

Detección de la expresión de GCC en muestras de colon humano y en micromatrices de tumor

Los anticuerpos MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 descritos en el presente documento, también se exploraron como un reactivo de detección de GCC en un protocolo de IHQ descrito anteriormente, utilizando los xenoinjertos de tumor humano primario (XTHP), anteriormente indicados, sedimentos de células HT29 y HEK293 transfectadas con GCC, además de muestras de colon humano neoplásico y benigno (FFPE y micromatrices de tumores (MMT)).

Los sedimentos de células HT29 y HEK293 transfectadas con GCC se tiñeron según se esperada. Los XTHP demostraron una amplia gama de intensidades de tinción con los clones MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4. Tanto MIL-44-148-2 como MIL-44-67-4 dieron una tinción positiva en carcinoma de colon bien o moderadamente diferenciado in situ o con metástasis. Los tumores mal diferenciados se tiñeron con menos intensidad. El tejido de colon normal demostró tinción apical positiva utilizando anticuerpos producidos por los dos subclones MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4.

Los anticuerpos de los dos subclones MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 proporcionaron tinción específica e intensa fácilmente aparente en las células HEK293 y HT29 transfectadas con GCC, sin ninguna tinción inespecífica en las líneas celulares parentales HEK293 y HT29. Ambos clones también dieron tinción positiva en carcinoma de colon bien o moderadamente diferenciado in situ o con metástasis. Se observó menor tinción en ambos subclones en carcinomas mal diferenciados. Como era de esperar, el colon normal demostró tinción apical positiva en ambos clones. MIL-44-148-2 demostró tener una sensibilidad y especificidad global más alta en comparación con MIL-44-67-4 mediante un ensayo de IHQ. Aunque MIL-44-67-4 demostró tener un intervalo dinámico mejor que el de MIL-44-148-2 en sedimentos celulares, MIL-44-148-2 demostró tener un intervalo dinámico superior al de MIL-44-67-4 en las MMT. En general, el subclon MIL-44-148-2 mostró superioridad sobre el subclon MIL-67-4, lo que demostraba mayor sensibilidad y especificidad en un ensayo de IHQ, y un intervalo dinámico completo en las m Mt y una tinción intensa (puntuación IHQ 2) en colon normal a una concentración baja.

Basándose en los resultados de los experimentos de IHQ iniciales descritos anteriormente, el subclon MIL-44-148-2 se seleccionó para el desarrollo y la validación de un protocolo automatizado equivalente al protocolo de IHQ descrito anteriormente, utilizando un aparato de tinción automático Tek-Mate. El ensayo de IHQ automatizado es una herramienta útil para explorar pacientes con cáncer para tumores que expresan GCC como un criterio de inclusión en un ensayo clínico para una terapia del cáncer dirigida a GCC y generalmente como una herramienta de exploración para seleccionar pacientes (por ejemplo, pacientes con cáncer) que recibirán una terapia dirigida a GCC. Para la detección de GCC en células y tejidos humanos FFPE (incluidos en parafina y fijados con formaldehído) se desarrolló el protocolo de IHQ mostrado en la Tabla 18 y se exploraron aproximadamente 53 tejidos de tumores colorrectales y 20 de colon normal, así como 2 MMT de cáncer de colon (adquiridas en US Biomax) para detectar la expresión de GCC. Estos tumores cubrieron una serie de grados tumorales así como de tejidos metastásicos de cáncer de colon.

Se prepararon secciones de cuatro micrómetros para las diversas muestras tisulares. Se retiró la cera de las secciones tisulares mediante cambios xileno durante 4, 5-minutos seguido de una serie de alcoholes graduados en agua destilada. Se utilizó recuperación de epítopos inducida por calor de vapor (SHIER, steam heat induced epitope recovery) con solución de SHIER2 durante 20 minutos en la cavidad capilar en la cámara superior de un vaporizador Black and Decker.

Tabla 18A: Procedimiento de IH

Tabla 18B: Reactividad de anticuer os hoa es ecífica

Un experto en la materia reconocería que el potenciador de anticuerpo primario puede ser un anticuerpo secundario anti-conejo suscitado en una especie que no sea conejo (por ejemplo, ser humano, rata, cabra, ratón, etc.) que tenga el mismo isotipo que el de los mAb de conejo MIL-44-148-2 o MIL-44-67 (IgG de conejo) o un reactivo similar que sea adecuado para amplificar la señal de MIL-44.

El protocolo anterior utilizó una incubación de anticuerpo durante una noche de MIL-44-148-2 a 1,0 ug/ml con una detección de peroxidasa no basada en biotina (kit Ultravision de Thermo/Lab Vision) y DAB como cromógeno. Este procedimiento se automatizó por completo utilizando el aparato de tinción TechMate 500 o TechMate 1000 (Roche Diagnostics). Después de la tinción, los portaobjetos se deshidrataron mediante una serie de alcoholes en etanol absoluto seguido de aclarados con xileno. Los portaobjetos se cubrieron permanentemente con cubreobjetos de vidrio y CytoSeal. Los portaobjetos se examinaron al microscopio para evaluar la tinción. Una tinción positiva indica la presencia de un producto de reacción de color marrón (DAB-HRP). La tinción de contraste con hematoxilina proporciona una tinción nuclear azul para evaluar la morfología de las células y tejidos.

Después de evaluar la tinción de GCC, se determinó que una estrategia de puntuación H sería la mejor estrategia para cuantificar la expresión de GCC. La estrategia de puntuación H proporciona una resolución de datos óptima para determinar la variación en cuanto a la intensidad y el porcentaje tumoral de la tinción dentro y entre los tipos de tumores. También proporciona una buena herramienta para determinar umbrales de tinción positiva. En este método, se proporciona el porcentaje de células (0-100) de un tumor con intensidades de tinción que varían de 0-3+. Con el presente método, se proporcionan puntuaciones con intensidades de 0, 0,5, 1, 2 y 3. Dependiendo del marcador, la tinción de 0,5 puede puntuarse como positiva o negativa y refleja luz aunque tinción perceptible para el marcador. Para obtener una puntuación H, el porcentaje de las células tumorales se multiplica por cada intensidad y se añade conjuntamente. Puntuación H = (% tumor*1) (% tumor*2) (% tumor*3). Por ejemplo, si un tumor es 20 % negativo (0), 30 % 1, 10 % 2, 40 % 3, este daría una puntuación H de 170.

La puntuación H máxima es de 300 (100 % * 3), por localización subcelular (es decir, apical o citoplasmática), si el 100 % de las células tumorales se marcan con una intensidad de 3+. Inicialmente, como un control, la puntuación H total no solo se usó para comparar muestras, sino que se evaluó además de una revisión del desglose del porcentaje de células en cada intensidad. Por ejemplo, una puntuación de 90 representaría el 90 % de las células tumorales que se tiñen con una intensidad 1+ o el 30 % de células con una intensidad 3+. Estas muestras tienen la misma puntuación H pero una expresión de GCC muy diferente. El porcentaje de células a puntuar en cada intensidad puede variar, pero normalmente se puntúa en incrementos del 10 %; sin embargo, un pequeño porcentaje de puntuación de un solo componente puede estimarse al 1 % y 5 % también para demostrar que existe algún nivel de tinción. Para la GCC, se puede considerar la tinción apical para evaluar en incrementos de bajo nivel, tal como 1 y 5 %.

Utilizando la estrategia de puntuación H, se puntuaron dos localizaciones subcelulares diferentes para la GCC. Estas incluyen tinción citoplasmática y tinción apical asociada. El patrón de tinción citoplasmática se observó generalmente como difuso en todo el citoplasma de las células tumorales. Sin embargo, en algunos casos, hubo variaciones de la tinción citoplasmática, que incluyó tinción globular intensa o tinción granular gruesas punteada. La tinción globular intensa se puntuó como tinción citoplasmática 3+. La tinción punteada se asoció con tinción apical y no se la dio una puntuación distinta para este tipo de tinción citoplasmática (n=4 muestras para la tinción punteada). Se observó tinción apical de GCC cuando había lumen. Otros patrones de tinción de GCC observados incluyeron tinción de tipo membrana, sin lumen (un caso) y tinción extracelular presente en el lumen tumoral. En tejidos normales de colon, la tinción fue generalmente apical junto con la tinción citoplasmática difusa.

Dado que se obtuvieron puntuaciones H para la expresión tanto citoplasmática como apical de GCC, y dado que no se sabe si un tipo de localización es más crítico que otro para determinar la eficacia de una terapia dirigida a GCC, se recogieron todos los datos y, en algunos casos, se generó una puntuación H agregada utilizando la suma de la expresión de GCC tanto apical como citoplasmática. En dichos casos, la puntuación H máxima se convirtió en 600 para la puntuación agregada (300 apical 300 citoplasmática).

En general, la tinción en muestras de colon normales ilustra que la GCC es anatómicamente privilegiada, expresándose en la superficie apical. La GCC se expresó en más del 95 % de las muestras tumorales y, a diferencia del tejido normal, demostró tinción citoplasmática difusa en algunos casos. También se observó fuerte tinción focal de GCC en muestras de metástasis hepáticas de CCR humano.

Las Tabla 19A muestra resultados de tinción de la puntuación H citoplasmática y apical de los tejidos normales y tumorales que se exploraron. Los datos mostrados en la Tabla 19A se desglosan de acuerdo con el origen de la muestra (interna (indicada como MLNM), MMT (indicada como BIOMAX) y CRO (indicada como QualTek) y el grado del tumor. Se proporcionan datos resumidos de positividad cuando se utilizan umbrales de intensidad de tinción de 0,5 y 1,0+. Se puntuó un total de 173 muestras tumorales. Cuando se utiliza un límite de 0,5+ para una intensidad de tinción positiva para la tinción citoplasmática o apical, el 95 % de los tumores se consideran positivos. Cuando se utiliza un límite de 1,0+, el 92 % de las muestras se consideraron positivas.

La fuente de los tejidos muestra variación en el porcentaje de células tumorales positivas así como en las puntuaciones H. Para un umbral de positividad de tinción 1+, el intervalo es del 84 % (muestras MTB de tumor CRO) al 100 % (muestras internas o muestras de tejido único CRO - tenga en cuenta el menor número de muestras está en estos grupos). Los tejidos tumorales internos mostraron una puntuación H apical muy alta de 253 (n = 9 muestras). También hubo diferencias en los resultados de puntuación de las 2 MMT. US Biomax TMA C0992 se tiñó más fuerte que CO701. Sin pretender ligarse a ninguna teoría, la diferencia en la MMT puede deberse a una diferencia con la fijación con la fuente de los tejidos o que un bloque podía haberse cortado más recientemente que el otro.

Se tuvo en cuenta la estabilidad del antígeno en una sección cortada y la frescura de las muestras cortadas. Las muestras analizadas en el presente estudio incluyeron muestras cortadas y conservadas y muestras cortadas recientes, lo que indica la necesidad de investigar más la estabilidad de las muestras tisulares a lo largo del tiempo. Se observaron algunas diferencias en la positivad de la GCC y el grado del tumor (véase la Tabla 19B), con una mayor tinción positiva asociada a tumores bien diferenciados frente a tumores mal diferenciados (seis tumores de US Biomax no incluyeron ningún grado). Los tumores de grado 1 (n=20) mostraron positividad del 100 %; los tumores de grado 2 (n=95) se marcaron con 98 % de casos positivos y los tumores de grado 3 (n=44) se marcaron a una tasa de positividad de 88 %. Los tumores mal diferenciados generalmente carecen de lumen, lo que puede explicar parte de esta disminución en la tinción debido a la ausencia de tinción apical. Este porcentaje de positividad se basó en un umbral de intensidad de tinción de 0,5+. Siete de 7 metástasis distantes fueron positivas (de tejidos internos y CRO). Los tumores metastásicos de la MMT de US Biomax se enumeraron como metástasis en ganglios linfáticos.

En general, GCC tiñe un porcentaje muy elevado de tumores de colon y de tejidos de colon normales independientemente de la fuente del tejido o del grado del tumor.

T l 1 B R m n in i n n r l n r r m ral

La precisión intraensayo del ensayo de IHQ para GCC se evaluó dentro de un proceso utilizando 5 copias de cada uno de tres sedimentos celulares y 14 tejidos de carcinoma de colon diferentes. Los sedimentos celulares se prepararon en portaobjetos distintos. Las muestras de tumor de colon se incluyeron en dos bloques multitumorales diferentes. Estos tejidos se puntuaron con respecto a la reactividad IHQ de GCC.

Tinción de precisión de los sedimentos celulares: se observó una tinción casi idéntica en las 5 copias intraprocesadas de los 3 sedimentos celulares.

Tinción de precisión de las muestras de tumor de colon: se observó una tinción muy similar a casi idéntica entre las 5 copias intraprocesadas de las 14 muestras de tumor de colon. Un patólogo certificado puntuó las muestras utilizando la estrategia de puntuación H como se ha descrito anteriormente. La desviación estándar demostró que, en todos los casos, la variación era mínima, demostrando así una buena precisión de tinción dentro del mismo proceso. En general, hubo una tinción IHQ de GCC entre procesos muy coherente de las muestras de sedimento celular y de carcinoma de colon analizadas.

La variabilidad de ensayo entre procesos y la variabilidad debida a diferentes operarios, se evaluaron en 5 procesos de tinción IHQ de GCC distintos. Un operario realizó cuatro procesos en días diferentes y un segundo operario realizó el quinto proceso. La tinción incluyó el ensayo de los mismos tejidos en el ensayo de precisión descrito anteriormente.

Tinción de reproducibilidad de los sedimentos celulares: se observó tinción casi idéntica en las 5 copias entre procesos de los 3 segmentos celulares.

Tinción de reproducibilidad de las muestras de tumor de colon: se observó una tinción muy similar a casi idéntica entre las 5 copias entre procesos de las 14 muestras de tumor de colon. Un patólogo certificado puntuó las muestras utilizando la estrategia de puntuación H como se ha descrito anteriormente. La desviación estándar demostró que, en todos los casos, la variación era mínima, demostrando así una buena reproducibilidad de tinción diaria y con diferente operario. Generalmente, hubo una tinción IHQ de GCC muy coherente entre procesos y entre operadores de las muestras de sedimento celular y de carcinoma de colon analizadas.

La especificidad del ensayo de IHQ de GCC se evaluó analizando un panel de tejidos humanos normales. Estos tejidos humanos normales incluyeron 30 tipos de tejidos diferentes: suprarrenal, vejiga, médula ósea, mama, corteza cerebral, cuello uterino, trompa de Falopio, corazón, riñón, hígado, pulmón, ganglios linfáticos, nervio, ovario, páncreas, parótida (glándula salivar), pituitaria, placenta, próstata, músculo esquelético, piel, médula espinal, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, amígdalas, uréter y útero. Para cada tipo de tejido, se tiñeron al menos 3 especímenes únicos y se evaluaron para detectar su inmunorreactividad con GCC.

En general, el ensayo de IHQ de GCC utilizando el anticuerpo MIL-44-148-2 demostró, mediante el ensayo de IHQ descrito en el presente documento, ser muy específico para muestras de tumor de colon en comparación con la tinción de tejido normal, particularmente para la tinción apical. La tinción apical solo se detectó en 2 de las muestras de estómago; sin embargo, esta tinción también se observó en el control negativo. La tinción citoplasmática, generalmente ligera, se observó en varios tipos de tejidos, incluyendo folículo ovárico (1 de 3 muestras), piel (folículo y dermis, 2 de 3 muestras), células parietales del estómago (2 de 3 muestras), epitelio glandular de próstata (ligera en 3 de 3 casos), pituitaria (2 de 3 casos), epitelio del útero (3 de 3 casos), epitelio de las trompas de Falopio (2 de 3 casos), trofoblasto de placenta (ligera en 2 de 3 casos) y pulmón (endotelio en 3 de 3 casos y epitelio de bronquiolo en 1 de 3 casos). La tinción citoplasmática más fuerte (2+) estaba presente en un caso de trompa de Falopio y en un caso de pituitaria. En ambos casos hubo una tinción más ligera en los mismos compartimentos en el control negativo. Las células plasmáticas fueron positivas en diversos tejidos incluidos bazo, amígdalas y ganglios linfáticos. Los histiocitos fueron positivos en bazo, pulmón y ganglios linfáticos. La tinción del estroma estaba presente en testículos (2 de 3 casos), útero (3 de 3 casos) y ovarios (1 de 3 casos). La tinción extracelular de los vasos sanguíneos se observó ampliamente y parecía ser una unión no específica del suero.

El ensayo de GCC, utilizando el anticuerpo monoclonal de conejo, MIL-44-148-2, en la plataforma de tinción TechMate muestra tinción consistente inter e intra-proceso de tumores y de sedimentos de células de control. El ensayo de GCC parece ser muy sensible en el carcinoma de colon ya que tiñe la mayor parte de las muestras de tumor de colon analizadas. El ensayo de GCC también parece ser mucho más específico para los tumores de colon en comparación con los tejidos normales. La expresión de GCC observada en muchos tumores de colon es mucho más fuerte que cualquier tinción observada en un panel normal de 30 tejidos con al menos 3 copias de cada tipo de tejido. No se detectó tinción apical específica de GCC en ninguno de los tejidos normales, mientras que la tinción apical es común en la mayoría de las muestras de GCC. Solo se observó tinción citoplasmática en algunos tipos de tejidos normales y esta tinción es generalmente ligera. El anticuerpo MIL-44-148-2 parece ser un marcador de IHQ reproducible, sensible y relativamente específico para la tinción de tumores de colon fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE).

Ejemplo 4: Inmunohistoquímica adicional en modelos PHTX no colorrectales y en micromatrices de tumores y en muestras clínicas humanas colorrectales y no colorrectales

El ensayo de IHQ automatizado descrito en el Ejemplo 3 se utilizó para evaluar la expresión de GCC (es decir, expresión de GCC apical, citoplasmática y/o agregada) en varias muestras no colorrectales de diferentes fuentes, incluyendo xenoinjertos de tumores humanos primarios (XTHP) derivados de muestras de pacientes con cáncer gástrico y cáncer pancreático en ratones hembra SCID, y diversas micromatrices de tumores (MMT) adquiridas en US BioMax, Pantomics y en otras fuentes comerciales) específicas de cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de pulmón y leiomiosarcomas/rabdomiosarcomas. La expresión de GCC también se evaluó mediante el ensayo de IHQ automatizado descrito en el Ejemplo 3 en varias muestras clínicas humanas, incluidas muestras de tumor gástrico, pancreático y esofágico humano obtenidas de la base de datos de tejidos de un CRO especializado (QualTek) contratado para procesar el ensayo de IHQ automatizado y cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer esofágico y cáncer del intestino delgado de pacientes con cáncer sometidos a ensayo para detectar la expresión GCC antes de incluirse en un estudio abierto, multicéntrico, con aumento progresivo de la dosis, realizado por primera vez en seres humanos de un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido a GCC, denominado MLN0264, en pacientes adultos con neoplasias gastrointestinales avanzadas que expresan Guanilil Ciclasa C (Estudio C26001, ClinicalTrials.gov identificador NCT01577758).

Los resultados de la tinción IHQ en diversas muestras de tejido colorrectal normal y canceroso y en tejidos no colorrectal (gástrico, pancreático, intestino delgado, esofágico, pulmón, rabdiomiosarcoma, leiomiosarcoma) de diversas fuentes (XTHP, muestras clínicas humanas y micromatrices de tumor) se muestran más adelante en las Tablas 20-32. Las Tablas 20-32 incluyen las puntuaciones IHQ (0, 0,5+, 1+, 2+ y 3+) y las puntuaciones H correspondientes calculadas basándose en las puntuaciones IHq para la tinción tanto Apical (“A”) como citoplasmática (“C” o “Cito”) de GCC en los diversos tejidos analizados. Además, la Tabla 32 muestra una comparación de datos de expresión de GCC mediante IHQ en muestras clínicas humanas de cáncer primario y metastásico, en cada caso obtenidas del mismo paciente. Como se muestra en la primera columna de la izquierda, las muestras “A” (es decir, 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A 10A, etc.), se refieren a muestras de tumor primario, mientras que las muestras “B” (es decir, 1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, etc.) se refieren a muestras de tumor metastásico obtenidas del mismo paciente a partir del cual se obtiene la muestra de tumor primario correspondiente (la muestra “A” correspondiente). En otras palabras, la nomenclatura “1A” y “1B” se refiere a tumores primarios y metastásicos, respectivamente, obtenidos del mismo paciente; la nomenclatura “2A” y “2B” se refiere a tumores primarios y metastásicos, respectivamente, obtenidos de otro paciente y así sucesivamente. En la Tabla 32 se muestra una mayoría de las muestras tumorales obtenidas de pacientes con cáncer colorrectal primario y metastásico, excepto cuando se indica otra cosa como se refleja en la columna de “Comentarios”, en cuyo caso se especifica el tipo de cáncer no colorrectal particular. Como puede observarse en la columna “Comentarios” de la Tabla 32, algunas muestras de tumores neuroendocrinos, carcinomas de células renales, tumores gástricos, GIST gástrico, tumores pancreáticos y leiomiosarcoma uterino también eran para determinar la expresión GCC mediante el ensayo de IHQ.

T l 2 n IH n n m l XTHP n r ri h m n

(continuación)

(continuación)

T l 22B R mn inin n mir m ri MMT m r nr i Bimx P121

Tabla 2B R mn inin n mirm ri MMT m r nr i Bimx PA1 2

Tabl 24B R mn inin n MMT m r nr i Pn mi ^PA 41- rte 1

Tabl 24D R mn inin n MMT m r nr i Pn mi PA 41- rte 2

Tabl 2B R mn inin n MMT m r ri Bimx T 1 1- rte 1

Tabl 2D R mn inin n MMT m r ri Bimx T 1 1- rte 2

Tabla 26B: Resumen de tinción de GCC en micromatrices de tumor esofá ico Pantomics ESC1021

Tabla 27B: Resumen de tinción de GCC en MMT de tumor esofáico US BioMax ES8010- arte 1

Tabla 27D: Resumen de tinción de GCC en MMT de cáncer esofáico US BioMax ES8010-arte 2

T l 2B R mn inin n MMT m r lmn BiMx L 2 13

o o m _o Cü 3

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Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27, 28 y 29, respectivamente.

2. La molécula de anticuerpo anti-GCC de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

3. La molécula de anticuerpo anti-GCC de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la molécula de anticuerpo es:

(a) un anticuerpo monoclonal; y/o

(b) un anticuerpo de conejo o derivado de un conejo, opcionalmente un anticuerpo monoclonal de conejo o un anticuerpo monoclonal de conejo humanizado.

4. La molécula de anticuerpo anti-GCC de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de anticuerpo está conjugada con un marcador detectable, en el que el marcador detectable se selecciona de una enzima biológicamente activa, un ligando, un grupo prostético, un material fluorescente, un material luminiscente, un material quimioluminiscente, un material bioluminiscente, un material cromofórico, un material electrónico denso, un material paramagnético y un material radioactivo.

5. Secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que comprende las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de la reivindicación 5.

7. Un método de producción de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar una célula que comprende las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6, en condiciones que permiten la producción de una molécula de anticuerpo, produciendo de este modo la molécula de anticuerpo.

8. Un método de detección de una molécula de GCC en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra biológica con una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y determinar si dicha molécula de anticuerpo se une a dicha molécula de GCC.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la detección de una molécula de GCC comprende un ensayo de inmunohistoquímica.

10. El método de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicha muestra biológica es una biopsia de tumor de un paciente que se sospecha que tiene un cáncer que expresa GCC, en el que el cáncer se selecciona opcionalmente de cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico y un tumor neuroendocrino.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que adicionalmente comprende cuantificar la expresión apical y/o citoplasmática de GCC en dicha muestra biológica.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la cuantificación comprende una estrategia de puntuación H.

13. Un kit que comprende la molécula de anticuerpo anti-GCC de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 e instrucciones para su uso.

14. Un método de determinación de la sensibilidad de células cancerosas a una terapia dirigida a GCC y/o de evaluación de si un sujeto es un posible candidato para una terapia dirigida a GCC, que comprende:

i) poner en contacto una muestra de células cancerosas, obtenida de un paciente que tiene cáncer, con la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y

ii) detectar en la muestra la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la proteína GCC, determinando así la sensibilidad de las células cancerosas a una terapia dirigida a GCC, y/o determinando si un sujeto es un candidato para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC.

15. Una mezcla de reacción que comprende una muestra biológica y una molécula de anticuerpo anti-GCC de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

16. Un método de generación de un informe personalizado de tratamiento de un cáncer utilizando la molécula anticuerpo anti-GCC de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

i) poner en contacto una muestra biológica que comprende una o más células cancerosas, obtenida de un paciente con cáncer que se sospecha que tiene un cáncer que expresa GCC, con la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;

ii) detectar en la muestra biológica, la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y una proteína GCC;

iii) cuantificar la expresión de GCC en la muestra biológica a partir del complejo;

iv) comparar el nivel de expresión de GCC con una base de datos que comprende una terapia dirigida a GCC; y v) seleccionar una terapia dirigida a GCC y, opcionalmente, un régimen de dosificación basándose en el nivel de expresión de GCC determinado en la muestra.

17. El método de la reivindicación 14 o la reivindicación 16, en el que el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico y un tumor neuroendocrino.