TW201348258A - 抗-gcc抗體分子及其用於測試對gcc標靶治療之易感性之用途 - Google Patents
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Abstract
本文揭示結合GCC之抗體及抗體之抗原結合片段。本發明亦提供利用本文提供之該等抗-GCC抗體鑑別應接受GCC標靶治療之患者的診斷方法。
Description
本發明係關於結合GCC之抗體分子及使用其選擇用GCC標靶治療來治療之患者之方法,該GCC標靶治療係(例如)含有偶聯至諸如治療劑等藥劑之抗-GCC抗體分子或其片段之免疫偶聯物。
鳥苷酸環化酶C(「GCC」)係在維持腸液、電解質平衡及細胞增殖中發揮功能的跨膜細胞表面受體,例如,參見Carrithers等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:3018-3020(2003)。GCC於小腸、大腸和直腸襯裏之黏膜細胞處表現(Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996))。在腸上皮細胞發生腫瘤轉化後,維持GCC表現,其中在所有原發性及轉移性結腸直腸腫瘤中皆有表現(Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996);Buc等人,Eur J Cancer 41:1618-1627(2005);Carrithers等人,Gastroenterology 107:1653-1661(1994))。
本發明至少部分地基於對新穎的抗-GCC抗體之發現。因此,在一個態樣中,本發明之特徵在於如本文所揭示之抗-GCC抗體分子。抗-GCC抗體分子可用作裸露抗體分子及免疫偶聯物之組份。因此,在另一態樣中,本發明之特徵在於包含本文所述抗-GCC抗體分子及治療劑或標記之免疫偶聯物。本發明之特徵亦在於使用本文所述抗-GCC抗體分子及免疫偶聯物(例如)檢測GCC及表現GCC之細胞或組織之方法。此等方法尤其可用於GCC介導之疾病之診斷、預後、成像或
分期。因此,在一些態樣中,本發明之特徵為鑑別用GCC標靶治療來治療之個體之方法,該GCC標靶治療係例如抗-GCC抗體治療,例如,包含與治療劑偶聯之抗-GCC抗體之免疫偶聯物。本發明之特徵亦為測定患有癌症之個體為GCC標靶治療(例如,本文所述GCC標靶治療)之潛在候選者的活體外或活體內方法。
抗-GCC抗體(例如,本文所述抗-GCC抗體)亦可用於(例如)調節GCC蛋白質之活性或功能;及用於治療GCC介導之疾病,如本文所述。在一些態樣中,治療包括獲得對試樣或個體的瞭解及/或評估試樣或個體以測定GCC表現量,且若個體表現GCC,則投與GCC標靶治療,例如,本文所述GCC標靶治療。在其他態樣中,該方法之特徵為產生個人化治療報告,例如,GCC標靶治療報告,其中藉由自個體獲得試樣並測定GCC表現量,例如,藉由本文所述檢測方法,例如,使用本文所述抗-GCC抗體,且基於該測定,選擇用於該個體之標靶治療報告。
在另一態樣中,本發明之特徵亦為編碼抗-GCC抗體分子胺基酸序列之經分離及/或重組核酸,以及包含此等核酸之載體及宿主細胞,及產生抗-GCC抗體分子之方法。本文之特徵亦為包含本文所述抗-GCC抗體(例如,免疫偶聯物)之反應混合物及套組,以及活體外分析,例如,包含本文所述抗-GCC抗體,用以檢測GCC表現。
本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全文皆以引用方式併入本文中。
根據說明書及圖式以及申請專利範圍將明瞭本文所揭示本發明之其他特徵、目的及優點。
圖1係用於產生本發明之人類GCC(hGCC)細胞外結構域(ECD)小鼠Fc(mFc)融合蛋白(hGCC-ECD-mFc)之蛋白質表現載體的環狀圖。
圖2A-2D繪示匯總來自經篩選入選C26001研究(GCC標靶免疫偶聯物之I期臨床試驗)中之癌症患者之腫瘤類型之GCC表現之經組合/合計(頂端及細胞質)H評分分佈的條形圖。圖2A繪示所篩選結腸直腸癌患者之經組合合計H評分分佈;圖2B繪示所篩選胃癌患者之經組合合計H評分分佈;圖2C繪示所篩選胰臟癌患者之經組合合計H評分分佈;圖2D繪示所篩選食道癌患者之經組合合計H評分分佈。
圖3A-3C繪示匯總所篩選各個腫瘤特異性微陣列之GCC表現之經組合/合計(頂端及細胞質)H評分分佈的條形圖。圖3A繪示針對GCC表現進行篩選之各個結腸直腸腫瘤微陣列上之試樣之經組合/合計H評分分佈;圖3B繪示針對GCC表現進行篩選之胃腫瘤微陣列上之試樣之經組合/合計H評分分佈;圖3C繪示針對GCC表現進行篩選之各個胰臟腫瘤微陣列上之試樣之經組合/合計H評分分佈。
鳥苷酸環化酶C(GCC)(亦稱為STAR、ST受體、GUC2C和GUCY2C)係在維持腸液、電解質平衡及細胞增殖中發揮功能的跨膜細胞表面受體(Carrithers等人,Proc Natl Acad Sci USA 100:3018-3020(2003);Mann等人,Biochem Biophys Res Commun 239:463-466(1997);Pitari等人,Proc Natl Acad Sci USA 100:2695-2699(2003));GenBank登錄號為NM_004963,各文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中)。此功能係經由鳥苷蛋白之結合來介導(Wiegand等人FEBS Lett.311:150-154(1992))。GCC亦係熱穩定性腸毒素(ST,例如,具有胺基酸序列NTFYCCELCCNPACAGCY,SEQ ID NO:1,其係由大腸桿菌(E.coli)以及其他感染性有機體產生之肽)之受體(Rao,M.C.Ciba Found.Symp.112:74-93(1985);Knoop F.C.及Owens,M.J.Pharmacol.Toxicol.Methods 28:67-72(1992))。ST對GCC之結合活化導致腸道疾病(例如,腹瀉)之信號級聯。
人類GCC之核苷酸序列(GenBank登錄號NM_004963;SEQ ID NO:2):
人類GCC之胺基酸序列(GenPept登錄號NP_004954;SEQ ID NO:3):
GCC蛋白質具有一些普遍接受的結構域,每一者促成GCC分子的單獨功能。GCC之部分包括信號序列(用於將蛋白質引導至細胞表面),來自SEQ ID NO:3之胺基酸殘基1至約殘基23或殘基1至約殘基21(經切離用於成熟以產生來自SEQ ID NO:3之約胺基酸殘基22或24至1073之功能性成熟蛋白質);用於配體(例如,鳥苷蛋白或ST)結合之細胞外結構域,來自SEQ ID NO:3之約胺基酸殘基24至約殘基420或約殘基54至約殘基384;跨膜結構域,來自SEQ ID NO:3之約胺基酸殘基431至約殘基454或約殘基436至約殘基452;激酶同源結構域,其預測具有酪胺酸激酶活性,來自SEQ ID NO:3之約胺基酸殘基489至約殘基749或約殘基508至約殘基745;及鳥苷酸環化酶催化結構域,來自SEQ ID NO:3之約殘基750至約殘基1007或約殘基816至約殘基1002。
在正常人類組織中,GCC係於小腸、大腸及直腸襯裏之黏膜細胞
處(例如,頂端刷狀緣膜處)表現(Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996))。在腸上皮細胞發生腫瘤轉化後,維持GCC表現,其中在所有原發性及轉移性結腸直腸腫瘤中皆有表現(Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996);Buc等人,Eur J Cancer 41:1618-1627(2005);Carrithers等人,Gastroenterology 107:1653-1661(1994))。來自胃、食道及胃食道接合部之腫瘤細胞亦表現GCC(例如,參見美國專利第6,767,704號;Debruyne等人Gastroenterology 130:1191-1206(2006))。可利用(例如)胃腸源癌症(例如,結腸直腸癌、胃癌、食道癌或小腸癌)之組織特異性表現及相關性使用GCC作為此疾病之診斷標記物(Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996);Buc等人Eur J Cancer 41:1618-1627(2005))。另外,如本文實例中所證實,已顯示若干不同類型的非胃腸源癌症表現GCC,包括(但不限於)胰臟癌、肺癌、軟組織肉瘤(例如,平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤)、胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤及神經外胚層腫瘤。
作為細胞表面蛋白質,GCC亦可用作諸如抗體或配體等受體結合蛋白之診斷或治療標靶。在正常腸組織中,GCC係在上皮細胞緊密接合部之頂面上表現,該等緊密接合部在腔內環境與血管腔隙之間形成不透性障壁(Almenoff等人,Mol Microbiol 8:865-873);Guarino等人,Dig Dis Sci 32:1017-1026(1987))。如此,靜脈內投與GCC結合蛋白治療劑將對腸GCC受體具有最低效應,同時可到達胃腸系統的腫瘤細胞,包括侵襲性或轉移性結腸癌細胞、腸外或轉移性結腸腫瘤、食管腫瘤或胃腫瘤、胃食道接合部之腺癌。另外,GCC在結合配體後經由受體介導之胞吞作用內在化(Buc等人Eur J Cancer 41:1618-1627(2005);Urbanski等人,Biochem Biophys Acta 1245:29-36(1995))。
針對GCC之細胞外結構域產生之多株抗體(Nandi等人Protein Expr.Purif.8:151-159(1996))能夠抑制ST肽結合至人類和大鼠GCC並
抑制人類GCC之由ST介導之cGMP產生。
已將GCC描述為參與包括結腸癌在內之癌症之蛋白質。亦參見Carrithers等人,Dis Colon Rectum 39:171-181(1996);Buc等人Eur J Cancer 41:1618-1627(2005);Carrithers等人,Gastroenterology 107:1653-1661(1994);Urbanski等人,Biochem Biophys Acta 1245:29-36(1995)。因此,指向GCC之抗體分子可以未偶聯形式單獨使用以抑制表現GCC之癌細胞。另外,指向GCC之抗體分子可以裸露或經標記形式使用,以檢測表現GCC之癌細胞。本發明之抗-GCC抗體分子可結合人類GCC。在一些實施例中,本發明之抗-GCC抗體分子可抑制配體(例如,鳥苷蛋白或熱穩定腸毒素)結合至GCC。在其他實施例中,本發明之抗-GCC抗體分子不抑制配體(例如,鳥苷蛋白或熱穩定腸毒素)結合至GCC。
對GCC具有特異性之單株抗體包括GCC:B10(Nandi等人,J.Cell.Biochem.66:500-511(1997))、GCC:4D7(Vijayachandra等人Biochemistry 39:16075-16083(2000))及GCC:C8(Bakre等人Eur.J.Biochem.267:179-187(2000))。GCC:B10具有κ輕鏈及IgG2a同種型且與大鼠、豬及猴GCC交叉反應。GCC:B10結合至GCC之細胞內結構域之前63個胺基酸,具體而言結合至SEQ ID NO:3之殘基470-480(Nandi等人Protein Sci.7:2175-2183(1998))。GCC:4D7結合至GCC之殘基491-568內之激酶同源結構域(Bhandari等人Biochemistry 40:9196-9206(2001))。GCC:C8結合至GCC之細胞質部分中之蛋白質激酶樣結構域。
除非本文另有定義,否則結合本發明使用之科學及技術術語具有彼等熟習此項技術者通常所理解之含義。通常,本文所述結合細胞及組織培養、分子生物學以及蛋白質及寡-或多核苷酸化學及雜交利
用之命名以及該等領域之技術係彼等為業內所熟知者。GenBank或GenPept登錄號以及可用核酸及肽序列可於由National Center for Biotechnological Information,Bethesda Md維護之網站找到。使用標準技術進行重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養及轉化及轉染(例如,電穿孔、脂轉染)。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書實施,或如業內慣常方法實施,或如本文所述實施。上述技術及程序通常根據業內已知方法實施,例如,如本說明書通篇內引述及論述之各種一般及更具體之參考文獻中所述實施。例如,參見Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000))或通常參見Harlow,E.及Lane,D.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。本文所述結合利用之命名以及其實驗室程序及技術為業內已知。此外,除非上下文另有要求,否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文所用術語「抗體分子」係指抗體、抗體肽或免疫球蛋白或上述中任一者(例如,抗體)之抗原結合片段。抗體分子包括單鏈抗體分子,例如,scFv,例如,參見Bird等人(1988)Science 242:423-426;及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883);及單結構域抗體分子,例如,參見WO9404678。儘管不在術語「抗體分子」範圍內,但本發明亦包括「抗體類似物」,其他基於非抗體分子蛋白質之構架,例如,使用CDR來提供特異性抗原結合之融合蛋白及/或免疫偶聯物。
「抗-GCC抗體分子」係指與GCC(例如,人類GCC)交互作用或識別該GCC(例如,結合(例如,特異性結合)至該GCC)之抗體分子(即,抗體、抗體之抗原結合片段或抗體類似物)。實例性抗-GCC抗體分子係例如彼等匯總於表1及2中者。
本文所用術語「抗體」、「抗體肽」或「免疫球蛋白」係指單鏈、雙鏈及多鏈蛋白質及糖蛋白。術語抗體包括多株、單株、嵌合、CDR-移植及人類或人類化抗體,所有該等抗體皆在本文別處有更詳細論述。該術語內亦包括駱駝科動物(camelid)抗體,例如,參見US2005/0037421;及奈米抗體,例如,IgNAR(鯊魚抗體),例如,參見WO03/014161。術語「抗體」亦包括合成及遺傳改造之變體。
本文所用術語「抗體片段」或抗體之「抗原結合片段」係指(例如)與完整抗體競爭特異性結合之Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、單鏈抗體、功能性重鏈抗體(奈米抗體),以及對至少一個期望表位具有特異性之任一抗體部分(例如,具有足夠CDR序列且具有足夠框架序列以特異性結合至表位之片段)。例如,抗原結合片段可競爭與結合衍生出該片段之抗體之表位結合。如此背景及類似背景下所用,衍生並不暗指任何特定的衍生方法或製程,而是可僅係指序列類似性。抗原結合片段可藉由重組技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體來產生。術語抗原結合片段當用於具有輕鏈及重鏈之抗體之單鏈(例如,重鏈)時,意指該鏈之該片段足以使得,當與另一鏈(例如輕鏈)之完整可變區配對時,其所允許結合將為利用完整重鏈及輕鏈可變區所觀察到者之至少25%、50%、75%、85%或90%。
本文所用術語「CDR之抗原結合群(constellation)」或「諸多足以允許結合之CDR」(及類似用語)係指一條鏈(例如,重鏈)之CDR足以使得,當置於框架中且與具有類似長度且具有相同數量之CDR之另一鏈(例如,輕鏈)之完全可變區配對、或與另一鏈之可變區之一部分配對時,所允許結合將為利用完整重鏈及輕鏈可變區所觀察到者之(例如)至少25%、50%、75%、85%或90%。
本文所用術語「人類化抗體」係指衍生自非人類抗體(例如,兔、齧齒類(例如,鼠類)、綿羊或山羊)且保留或實質上保留親本抗體
之抗原結合性質但在人類中之免疫原性較低之抗體。如本文所用,人類化意欲包括去免疫化抗體。通常,人類化抗體包括非人類CDR以及人類或衍生自人類之框架區及恆定區。
本文所用術語「經改質」抗體係指藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體,例如使用轉染至宿主細胞之重組表現載體表現之抗體、自重組之組合抗體文庫分離之抗體、自轉人類免疫球蛋白基因之非人類動物(例如,兔、小鼠、大鼠、綿羊或山羊)分離之抗體或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任一其他手段製備、表現、產生或分離之抗體。此等經改質抗體包括人類化抗體、經CDR移植抗體(例如,具有來自第一抗體之CDR及來自不同來源(例如,第二抗體)之框架區或共有框架之抗體)、嵌合抗體、活體外產生(例如,藉由噬菌體展示)之抗體,且可視情況包括源自人類種系免疫球蛋白序列或人類免疫球蛋白基因或已藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至替代性免疫球蛋白序列之任一手段製備、表現、產生或分離之抗體之可變區或恆定區。在實施例中,經改質抗體分子包括具有自參照抗體改變之序列之抗體分子。
術語「單特異性抗體」係指對特定表位展示單一結合特異性及親和力之抗體或抗體製劑。此術語包括「單株抗體」或「單株抗體組合物」。
術語「雙特異性抗體」或「雙功能性抗體」係指對兩個表位展示雙重結合特異性之抗體,其中各結合位點有所不同且識別不同表位。
術語「非偶聯抗體」及「裸露抗體」可互換使用,係指不偶聯至非抗體部分(例如,藥劑或標記)之抗體分子。
術語「免疫偶聯物」、「抗體-藥物偶聯物」及「抗體偶聯物」中之每一者可互換使用且係指偶聯至非抗體部分(例如,藥劑或標記)
之抗體。術語「藥劑」在本文中用於表示化學化合物、化學化合物混合物、生物巨分子或自生物材料製得之提取物。術語「治療劑」係指具有生物活性之藥劑。實例性治療劑係化學治療劑。
術語「抗癌劑」或「化學治療劑」在本文中用於指具有抑制人類腫瘤、尤其惡性(癌性)病灶(例如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病)產生或惡化之功能性質之藥劑。抑制轉移或血管生成通常係抗癌劑或化學治療劑之性質。化學治療劑可為細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。術語「細胞生長抑制劑」係指抑制或阻抑細胞生長及/或細胞增殖之藥劑。
「細胞毒性劑」係指主要藉由直接幹擾細胞功能發揮而造成細胞死亡之化合物,包括(但不限於)烷基化劑、腫瘤壞死因子抑制劑、嵌入劑、微管抑制劑、激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑及拓撲異構酶抑制劑。本文所用「毒性淨荷」係指當遞送至細胞時導致細胞死亡的足量細胞毒性劑。可藉由投與足夠量之包含本發明抗體或抗原結合片段及細胞毒性劑之免疫偶聯物來達成毒性淨荷之遞送。亦可藉由投與足夠量之包含細胞毒性劑之免疫偶聯物來達成毒性淨荷之遞送,其中免疫偶聯物包含識別並結合本發明抗體或抗原結合片段之二級抗體或其抗原結合片段。
如本文中所用,片語「衍生自」或「對指定序列具有特異性」之序列係指包含鄰接序列中約至少6個核苷酸或至少2個胺基酸、至少約9個核苷酸或至少3個胺基酸、至少約10-12個核苷酸或4個胺基酸或至少約15-21個核苷酸或5-7個胺基酸對應於(例如)指定序列之鄰接區(即,與其一致或互補)之序列。在某些實施例中,序列包含全部指定核苷酸或胺基酸序列。該序列可與如藉由業內已知技術所測定之特定序列特有之序列區互補(在多核苷酸序列之情況下)或一致。可衍生出序列之區包括(但不限於)編碼特異性表位之區、編碼CDR之區、編碼
框架序列之區、編碼恆定結構域區之區、編碼可變結構域區之區,以及非轉譯區及/或非轉錄區。所衍生之序列未必會以物理方式自研究中之所關注序列衍生得到,而是可基於由衍生出多核苷酸之區中之鹼基序列提供之資訊以任何方式產生,包括(但不限於)化學合成、複製、反向轉錄或轉錄。如此,其可代表原有多核苷酸之正義或反義取向。另外,可以業內已知方式改質或組合對應於指定序列之區之組合以使其符合預期應用。例如,序列可包含兩個或更多個鄰接序列,其各自包含一部分指定序列且間雜有與指定序列不一致但意欲代表衍生自指定序列之序列之區。就抗體分子而言,「自......衍生」包括在功能上或結構上與比較抗體有關之抗體分子,例如,「自......衍生」包括具有類似或實質上相同之序列或結構(例如,具有相同或類似之CDR、框架或可變區)之抗體分子。對於抗體而言,「自......衍生」亦包括可或可不鄰接,但根據編號方案或與一般抗體結構之同源性或比較序列之三維鄰近(即,在CDR或框架區內)界定或鑑別之殘基,例如,一或多個、例如2個、3個、4個、5個、6個或更多個殘基。術語「自......衍生」並不限於以物理方式自......衍生,且包括藉由任何方式產生,例如,藉由使用來自比較抗體之序列資訊來設計另一抗體。
本文所用片語「由......編碼」係指編碼多肽序列之核酸序列,其中該多肽序列或其一部分含有來自由該核酸序列編碼之多肽之至少3至5個胺基酸、至少8至10個胺基酸或至少15至20個胺基酸之胺基酸序列。
本文所用術語「結腸直腸癌」亦通常稱為結腸癌或腸癌,係指因結腸或直腸(部分大腸)或闌尾中細胞生長失控而引起之癌症。
術語「胃癌(stomach cancer及gastric cancer)」在本文中可互換使用。
兩種序列之間之「同源性」之計算可實施如下。為達成最佳比
較目的,對各序列實施比對(例如可在第一及第二胺基酸或核酸序列之一者或二者中引入空位以達成最佳比對,且出於比較目的可忽視非同源序列)。出於比較目的比對之參照序列之長度係參照序列之長度之至少30%、40%或50%、至少60%或至少70%、80%、90%、95%、100%。然後比較對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中佔據一位置之胺基酸殘基或核苷酸與第二序列中之對應位置相同時,該等分子在該位置處一致(本文所用胺基酸或核酸「一致性」等效於胺基酸或核酸「同源性」)。兩種序列間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數而變化,其中考慮為達成兩種序列最佳比對而需要引入之空位數及各空位長度。
兩種序列間之序列比較及同源性百分比之測定可使用數學算法達成。兩種胺基酸序列間之同源性百分比可使用業內已知之任何方法測定。例如,Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453(1970),已在GCG軟體包中納入GAP程式中之演算,使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣,以及16、14、12、10、8、6或4之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重。兩種核苷酸序列間之同源性百分比亦可在GCG軟體包(Accelerys公司,San Diego,Calif.)中使用GAP程式,使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或80之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。用於測定同源性之實例性參數集合係Blossum 62平分矩陣與12之空位罰分、4之空位擴展罰分及5之移碼空位罰分。
本文所用術語「在嚴格條件下雜交」闡述用於雜交及洗滌之條件。用於實施雜交反應之指導可參見Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。有水及無水方法闡述於該參考文獻中且可使用任一者。本文所提及之具體雜交條件如下:1)低嚴格性雜交條件為,在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約
45℃下,之後在0.2×SSC、0.1% SDS中至少在50℃(對於低嚴格性條件而言,可將洗滌溫度增加至55℃)下洗滌兩次;2)中嚴格性雜交條件為,在6×SSC中在約45℃下,之後在0.2×SSC、0.1% SDS中在60℃下洗滌一或多次;3)高嚴格性雜交條件為,在6×SSC中在約45℃下,之後在0.2×SSC、0.1% SDS中在65℃下洗滌一或多次;及4)極高嚴格性雜交條件為,0.5M磷酸鈉、7% SDS在65℃下,之後在0.2×SSC、1% SDS中在65℃下洗滌一或多次。極高嚴格性條件(4)通常係較佳條件且係除非另有規定否則應使用之條件。
應理解,本發明抗體及其抗原結合片段可具有對多肽功能不具有顯著效應的其他保守或非必需胺基酸取代。是否可容忍特定取代、即不會不良地影響期望的生物性質(例如結合活性)可如Bowie,J U等人Science 247:1306-1310(1990)或Padlan等人FASEB J.9:133-139(1995)中所述測定。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如,離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如,天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如,天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如,甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸)、具有β具支鏈側鏈之胺基酸(例如,蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
「非必需」胺基酸殘基係可自結合劑(例如,抗體)之野生型序列改變而不會消除或不實質上改變生物活性之殘基,而「必需」胺基酸殘基導致此一改變。在抗體中,必需胺基酸殘基可為特異性決定殘基(SDR)。
本文所用術語「經分離」係指自其原有環境(例如,若其為天然存在則為天然環境)移出之材料。例如,存在於活動物中之天然存於之多核苷酸或多肽並非經分離的,但自天然系統中共存之一些或全部材料分離之相同多核苷酸或DNA或多肽係經分離的。此多核苷酸或多肽可為載體之一部分,及/或此多核苷酸或多肽可為包含含有該多核苷酸或多肽之經分離細胞或培養細胞之組合物(例如,混合物、溶液或懸浮液)之一部分,且仍係分離的,此乃因該載體或組合物並非其天然環境之一部分。
本文所用術語「複製子」係指作為自主多核苷酸複製單元在細胞內運行之任何遺傳元件,例如質粒、染色體或病毒。
本文所用術語「可操作連接」係指所述組件呈允許其以預期方式發揮功能之關係的情況。因此,例如,「可操作地連接」至編碼序列之控制序列之接合方式應使該編碼序列之表現係在可與該等控制序列相容之條件下達成。
本文所用術語「載體」係指附接另一多核苷酸區段以引起所附接區段之複製及/或表現之複製子。
本文所用術語「控制序列」係指實現其所接合編碼序列之表現所必需之多核苷酸序列。此等控制序列之性質端視宿主有機體而有所不同。在原核生物中,此等控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點及終止子以及在一些情況下增強子。因此,術語「控制序列」意欲最低限度地包括所有存在對於表現必需之組份,且亦可包括存在有利之其他組份,例如,前導序列。
本文所用術語「經純化產物」係指已自通常與產物相關之細胞組份及/或自可存於所關注試樣中之其他類型之細胞分離之產物製劑。
本文所用術語「表位」係指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決
定因子。表位決定因子通常由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成,且其通常具有特定的三維結構特性以及特定的電荷特性。一些表位係線性表位,而其他係構象表位。線性表位係鄰接胺基酸主要序列包含所識別表位之表位。線性表位通常包括至少3個且更通常至少5個(例如,約8至約10個)鄰接胺基酸。構象表位可由至少兩種情況產生,例如:a)僅以某些蛋白質構象暴露於抗體結合之線性序列,例如,依賴於配體結合或依賴於信號傳導分子之改質(例如,磷酸化);或b)來自蛋白質之一個以上部分或在多亞單位蛋白質中來自一個以上亞單位之結構特徵之組合,其中該等特徵在三維空間中足夠鄰近以參與結合。
本文所用「同種型」係指由重鏈恆定區基因編碼的抗體種類(例如,IgM、IgA、IgE或IgG)。
本文所用術語「可檢測劑」、「標記」或「經標記」用於指在多肽或糖蛋白上納入可檢測標記物。各種標記多肽及糖蛋白之方法為業內已知且可使用。用於多肽之標記之實例包括(但不限於)以下:放射性同位素或放射性核種(例如,銦(111In)、碘(131I或125I)、釔(90Y)、鑥(177Lu)、錒(225Ac)、鉍(212Bi或213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、銠(188Rh)、鍀(99mTc)、鐠或磷(32P)或發射正子之放射性核種,例如,碳-11(11C)、鉀-40(40K)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)、鎵-68(68Ga)及碘-121(121I))、螢光標記(例如,FITC、玫瑰紅(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如,辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光物質、生物素基類(其可藉由經標記抗生物素蛋白檢測,例如,含有抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)部分及螢光標記物或可藉由光學或量熱方法檢測之酶活性之分子)及由二級報告子識別的預定多肽表位(例如,白胺酸拉鏈對序列、二級抗體結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。在一些實
施例中,標記係藉由各種長度之間隔臂附接以降低潛在的空間位阻。
如本文所用,「特異性結合」、「特異性地結合」或「結合特異性」意指,對於抗-GCC抗體分子而言,抗體分子以大於其結合至非GCC蛋白質(例如,BSA)之親和力結合至GC,例如,人類GCC蛋白。通常,抗-GCC分子對非GCC蛋白質(例如,BSA)之Kd將為其與GCC(例如,人類GCC蛋白質)之Kd的2倍、10倍、100倍、1,000倍、104倍、105倍或106倍。在測定Kd時,與GCC及非GCC蛋白質(例如,BSA)之Kd應在相同條件下進行。
術語「親和力」或「結合親和力」係指表觀締合常數或Ka。Ka係解離常數(Kd)之倒數。抗體對特定標靶分子之結合親和力可為(例如)至少105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1及1011M-1。抗體對第一標靶之結合親和力高於對第二標靶之結合親和力可藉由結合第一標靶之KA(或更小數值KD)高於結合第二標靶之KA(或數值KD)來指示。在此等情況下,抗體相對於第二標靶(例如,呈第二構象之相同蛋白質或其模擬物;或第二蛋白質)對第一標靶(例如,呈第一構象之蛋白質或其模擬物)具有特異性。結合親和力差異(例如,對於特異性或其他比較而言)可為至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍或105倍。
結合親和力可藉由多種方法測定,該等方法包括平衡透析、平衡結合、凝膠過濾、ELISA、表面19act cc共振或光譜(例如,使用螢光分析)。例如,抗-GCC抗體分子之相對親和力可自針對GCC蛋白質(例如,用於產生抗-GCC抗體分子之免疫原)進行ELISA量測藉由利用GCC表現細胞進行FACS量測來量測。
用於評估結合親和力之實例性條件係在TRIS-緩衝液(50mM TRIS,150mM NaCl,5mM CaCl2,pH7.5)中。該等技術可用於量測
結合及遊離結合蛋白隨結合蛋白(或標靶)濃度而變化之濃度。結合之結合蛋白([結合])之濃度與遊離結合蛋白([遊離])之濃度及標靶上結合蛋白之結合位點之濃度有關,其中(N)係結合位點數/標靶分子,表示為以下方程式:[結合]=N.[遊離]/((1/KA)+[遊離])。
並不始終需要對KA進行準確測定,但由於有時足以獲得對親和力之定量量測,例如,使用諸如ELISA或FACS分析等方法測定,其與KA成比例,且因此可用於比較,例如測定較高親和力(例如,2倍)是否能夠獲得對親和力之定性量測、或獲得對親和力之推論,例如,藉由功能分析(例如,活體外或活體內分析)中之活性來達成。抗-GCC抗體分子之親和力亦可使用諸如即時生物分子交互作用分析(BIA)等技術來量測(例如,參見Sjolander,S及Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345及Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。本文所用「BIA」或「表面電漿共振」係用於不標記任一交互作用物即時研究雙特異性交互作用之技術(例如,BIACORETM)。結合表面質量變化(指示結合事件)導致靠近表面之光之折射率改變(表面電漿共振(SPR)之光學現象),從而產生可用作生物分子間之即時反應之指示的可檢測信號。
使用BIACORETM T100系統(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)量測抗-GCC抗體分子之親和力闡述於美國專利申請公開案第US2011/0110936號之實例1中,其全部內容以引用方式併入本文中。簡言之,將抗-GCC抗體(Prep A)在10mM乙酸鈉(pH 4.0)中稀釋至適當濃度(例如,20μg/mL)且將參照/對照抗體(Prep B)在10mM乙酸鈉(pH 4.0)中稀釋至適當濃度(例如,10μg/mL)。使用標準時間偶合將各抗體共價固定至若干CM4 BIACORE晶片。對於所製備各CM4晶片而言,將Prep A抗體以約75-100RU固定於兩個流動槽上,而將Prep B
抗體以約70-80RU固定至一個流動槽上。使用各CM4晶片之剩餘4個流動槽作為參照流動槽。GCC蛋白質之濃度可使用Pace等人在Protein Science,4:2411(1995)中以及Pace及Grimsley在Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9(2003)中詳細說明之方法測定。對於各所製備之CM4晶片而言,經2分鐘以202nM-1.6nM(2倍連續稀釋)之濃度範圍注射GCC蛋白質、之後7分鐘解離。以一式三份隨機注射試樣,其中穿插若干次緩衝液注射循環用於雙重參照。為了獲得更顯著之離解速率衰減數據,以2分鐘注射及4小時解離時間實施3次額外的101nM GCC蛋白質注射及3次額外的緩衝液注射。所有實驗使用100μL/min之流動速率且利用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.0)實施20秒脈衝使所有表面再生。在添加有100μg/mL BSA之運行緩衝液(例如,Hepes-緩衝鹽水,0.005%聚山梨醇酯20,pH 7.4(HBS-P))中製備所有試樣。可用Scrubber 2.0軟體(BioLogic Software,Campbell,Australia)處理所有感測圖(表面電漿共振對時間之曲線圖)數據並使用CLAMPTM軟體將其以全局方式擬合至包括用於質量傳輸常數km之術語之1:1交互作用模型(Myszka及Morton Trends Biochem.Sci.23:149-150(1998))。
本文所用術語「治療(treat或treatment)」定義為向個體(例如,患者)投與抗-GCC抗體分子,或例如藉由施加向自個體分離且返回該個體之組織或細胞投與該抗-GCC抗體分子。抗-GCC抗體分子可單獨或與第二藥劑組合投與。治療可係治癒、癒合、減輕、緩解、改變、補救、改善、緩和、改良或影響病症(例如,癌症)、病症之症狀或患病症之傾向。不希望受限於理論,吾人相信治療可在活體外或活體內抑制、消除或殺死細胞(例如,異常細胞),或以其他方式降低細胞介導病症(例如,如本文所述病症)(例如,癌症)之能力。
本文所用術語「個體」意欲包括哺乳動物、靈長類動物、人類及非人類動物。例如,個體可為患有至少一些細胞表現GCC之癌症、
具有此等表現GCC之癌症之症狀或患此等表現GCC之癌症之傾向之患者(例如,人類患者或獸類患者),該癌症係(例如)胃腸源癌症(例如,結腸直腸癌、胃癌、小腸癌或食道癌)、胰臟癌、肺癌(例如,鱗狀細胞癌、腺鱗癌、腺癌)、軟組織肉瘤(例如,脂肪肉瘤或橫紋肌肉瘤)、神經內分泌腫瘤(例如,胃腸或枝氣管肺)或神經外胚層腫瘤。作為另一實例,個體可為患有胃腸系統之至少一些細胞表現GCC之胃腸病症(例如發炎性腸症候群、克隆氏病(Crohn’s disease)及便秘)之患者。作為又一實例,個體可為患有患者中樞神經系統內至少一些神經元表現GCC之神經病症(例如帕金森氏病(Parkinson’s Disease))之患者。除非另有說明,否則術語本發明之「非人類動物」包括所有非人類脊椎動物,例如,非人類哺乳動物及非哺乳動物,例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、奶牛、雞、兩棲動物、爬行動物、小鼠、大鼠、兔或山羊等。在實施例中,「個體」不包括一或多種或所有小鼠、大鼠、兔或山羊。
如本文所用,抗-GCC抗體分子「有效」或「足以」治療病症之量或「治療有效量」或「治療足夠量」係指抗體分子在單或多劑量投與個體後有效治療細胞(例如,癌細胞,例如,表現GCC之腫瘤細胞)或延長治癒、減輕、緩解或改良患有如本文所述病症之個體超出在不存在此治療時所預計之程度之量。本文所用「抑制腫瘤或癌症之生長」係指減緩、中斷、阻止或終止其生長及/或轉移且未必指示腫瘤生長之完全消除。
本文所用「GCC」亦稱為「STAR」、「GUC2C」、「GUCY2C」或「ST受體」蛋白質,係指哺乳動物GCC、較佳人類GCC蛋白質。人類GCC係指SEQ ID NO:3中所示之蛋白質及其天然存在之等位基因蛋白質變體。SEQ ID NO:3中之等位基因可由SEQ ID NO:2中所示GCC之核酸序列編碼。其他變體為業內已知。例如,參
見於殘基281處具有白胺酸之登錄號Ensp0000261170,Ensembl數據庫,European Bioinformatics Institute及Wellcome Trust Sanger Institute;已公開美國專利申請案第20060035852號之SEQ ID NO:14;或GenBank登錄號AAB 19934。通常,天然存在之等位基因變體與SEQ ID NO:3之GCC序列具有至少95%、97%或99%一致之胺基酸序列。該轉錄子編碼1073個胺基酸之蛋白質,且闡述於GenBank登錄號:NM_004963中。將GCC蛋白質描述為跨膜細胞表面受體蛋白質,且相信其在維持腸液、電解質平衡及細胞增殖中起到關鍵作用。
本文闡述尤其可用於檢測GCC表現之抗-GCC抗體分子。例如,可用於GCC檢測之抗-GCC抗體分子可包括(例如)以對GCC至少103M-1、104M-1、105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1及1011M-1之結合親和力特異性地結合至GCC之非人類抗-GCC抗體分子(例如,非人類及非鼠類抗體分子)。抗-GCC抗體分子可為非人類、非鼠類及非大鼠抗體分子,例如,兔抗-GCC抗體分子,例如,如本文所述。
在某些態樣中,本發明係關於包括諸如彼等匯總於表1及2中之特徵等特徵之抗-GCC抗體分子。在其他態樣中,本發明係關於包括諸如彼等匯總於表3、4、5及/或6中之特徵等特徵之抗-GCC抗體分子。
在實施例中,抗-GCC抗體分子係兔雜交瘤抗體且係抗體MIL-44-148-2或MIL-44-67-4中之一者。在實施例中,抗-GCC抗體分子係衍生自抗體MIL-44-148-2或MIL-44-67-4。
在實施例中,抗-GCC抗體分子將對GCC具有親和力,例如,如藉由直接結合或競爭結合分析所量測。在實施例中,抗-GCC抗體分子具有小於1×10-6M、小於1×10-7M、小於1×10-8M、小於1×10-9
M、小於1×10-10M、小於1×10-11M、小於1×10-12M或小於1×10-13M之Kd。在實施例中,抗體分子係IgG或其抗原結合片段,且具有小於1×10-6M、小於1×10-7M、小於1×10-8M或小於1×10-9M之Kd。在實施例中,抗-GCC抗體分子(例如,MIL-44-148-2抗體或自其衍生之抗體)具有約80pM至約200pM、較佳約100pM至約150pM或約120pM之Kd。在實施例中,抗-GCC抗體分子,例如,MIL-44-148-2抗體或自其衍生之抗體具有約0.9至約1.25×105M-1 s-1、較佳約1.1×105M-1 s-1之ka。在實施例中,抗體分子係ScFv且具有小於1×10-6M、小於1×10-7M、小於1×10-8M、小於1×10-9M、小於1×10-10M、1×10-11M、小於1×10-12M或小於1×10-13M之Kd。
在實施例中,抗體分子不為免疫偶聯物,即,為「裸露的」,且在實施例中,在結合至GCC後引起細胞反應。在相關實施例中,細胞反應係由抗體所結合之表現GCC之細胞來實施。例如,若抗體分子係GCC激動劑,則此一細胞反應可為由GCC介導之信號轉導(例如,參見美國專利申請公開案第US20040258687號)。在其他實施例中,細胞反應係由第二細胞(例如,免疫效應子細胞,例如,自然殺傷細胞)來實施,該第二細胞識別結合至第一細胞上之GCC之抗體分子。在一些實施例中,監視分子(例如,補體分子)在細胞反應前接觸結合GCC之抗體分子。該等實施例中之細胞反應可引起表現GCC之細胞之死亡。
在其他實施例中,為免疫偶聯物之抗體分子既可在結合至GCC後引起細胞反應且亦可內在化以將藥劑遞送至其所結合表現GCC之細胞。
在一些實施例中,本發明之抗-GCC抗體分子可阻斷配體結合至GCC。
在實施例中,抗體分子不為GCC:B10、GCC:4D7或GCC:C8。在
另一實施例中,抗-GCC抗體分子不結合GCC之細胞內結構域,即SEQ ID NO:3之約胺基酸殘基455至1073。例如,在此實施例中,抗-GCC抗體分子不結合GCC之激酶同源結構域或鳥苷酸環化酶結構域。
天然存在之哺乳動物抗體結構單元之典型特徵為四聚物。各四聚物由兩對多肽鏈構成,各對具有一條「輕」鏈(約25kDa)及一條「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別的具有約100至110或更多個胺基酸之可變區。各鏈之羧基末端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。人類輕鏈可分類為κ及λ輕鏈。重鏈可分類為μ、△、γ、α或ε,且將抗體之同種型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內,可變區及恆定區係由具有約12個或更多個胺基酸的「J」區接合,其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸的「D」區。通常參見Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.編輯,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))。各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。抗-GCC抗體分子之較佳同種型係具有不同γ重鏈之IgG免疫球蛋白,其可分類為4個亞類:IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。多數治療抗體係IgG1同種型之人類、嵌合或人類化抗體。在特定實施例中,抗-GCC抗體分子係兔IgG抗體。
各重鏈及輕鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此,完整IgG抗體具有兩個相同的結合位點。然而,雙功能性或雙特異性抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對從而產生兩個不同結合位點之人工雜交構築體。
該等鏈皆展現具有由3個超變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合的相對保守之框架區(FR)之相同的一般結構。來自各對之兩條鏈的CDR藉助框架區對準,使其能夠與特異性表位結合。自N端至C端,輕鏈及重鏈二者皆包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸在各結構域中之指配依照Kabat Sequences of
Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))或Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987);Chothia等人Nature 342:878-883(1989)之定義。如本文所用,CDR係針對各重鏈(HCDR1、HCDR2、HCDR3)及輕鏈(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
抗-GCC抗體分子可包含一種上文提及之兔抗體之重鏈及輕鏈中一者或二者之全部CDR或其抗原結合亞群。兔雜交瘤抗體(包括可變區及CDR)之胺基酸序列可在表3及表5中找到。
因此,在實施例中,抗體分子包括以下中之一者或二者:(a)一種上文提及之兔雜交瘤抗體之一個、兩個、三個或抗原結合數量之輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)。在實施例中,CDR可包含一或多個或全部如下LCDR1-3之胺基酸序列:LCDR1或一至七個胺基酸經保守取代之經改質LCDR1;LCDR2或一或兩個胺基酸經保守取代之經改質LCDR2;或LCDR3或一或兩個胺基酸經保守取代之經改質LCDR3;及(b)一種上文提及之兔雜交瘤抗體之一個、兩個、三個或抗原結合數量之重鏈CDR(HCDR1、HCDR2及/或HCDR3)。在實施例中,CDR可包含一或多個或全部如下HCDR1-3之胺基酸序列:HCDR1或一或兩個胺基酸經保守取代之經改質HCDR1;HCDR2或一至四個胺基酸經保守取代之經改質HCDR2;或HCDR3或一或兩個胺基酸經保守取代之經改質HCDR3。
可用於產生抗-GCC抗體分子之免疫原包括表現GCC(例如,人類GCC)之細胞(例如,腫瘤細胞系,例如,T84細胞或新鮮或冷凍結腸腫瘤細胞、表現GCC之重組細胞);表現GCC之細胞(例如,結腸腫瘤細胞系,例如,T84細胞)或新鮮或冷凍結腸腫瘤細胞之膜部分;表現GCC之重組細胞;經分離或純化GCC,例如,人類GCC蛋白質(例
如,以生物化學方式分離之GCC,例如,自表現GCC或其變體之胃腸腫瘤細胞或重組細胞分離)或其一部分(例如,GCC之細胞外結構域、GCC之激酶同源結構域或GCC之鳥苷酸環化酶催化結構域或對應於其一部分之肽,例如,包含SEQ ID NO:3之至少約8個、10個、12個、14個、16個、20個、24個、28個或32個胺基酸殘基);或免疫原,其包含SEQ ID NO:46或包含其無信號序列(即,無SEQ ID NO:46之胺基酸殘基1至約21或23)之成熟部分,例如,成熟hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII(本文亦稱作「pLKTOK108」)蛋白質SEQ ID NO:48。
可將免疫原融合至異源序列以輔助生物化學操縱、純化、免疫或抗體效價量測。此等免疫原可包含GCC之一部分,例如,細胞外結構域;及包含非GCC多肽之一部分。構築易於純化或固定至固體載體上之融合蛋白之選擇有許多,例如,親和力管柱或微量滴定板或另一適宜分析基質/晶片。例如,融合部分可添加可結合麩胱甘肽之結構域,例如,麩胱甘肽-S-轉移酶/激酶(GST);可結合至蛋白質A或蛋白質G之免疫球蛋白Fc區;可結合親和力管柱中之鎳或鈷之胺基酸殘基,例如,兩個、三個、四個、五個、較佳六個組胺酸殘基;可結合標籤特異性抗體之表位標籤,例如,c-myc腫瘤基因之一部分(myc標籤)、FLAG標籤(美國專利第4,703,004號)、血球凝集素(HA)標籤、T7基因10標籤、V5標籤、HSV標籤或VSV-G標籤;或可結合抗生蛋白鏈菌素之輔因子,例如,生物素。
包含免疫球蛋白之Fc部分之免疫原可保有溶液中或附接至細胞之GCC,其所呈組態允許宿主免疫監視組份在結構上接近GCC表位以有效產生抗體。由於包含Fc區之免疫球蛋白重鏈經由鏈間二硫鍵締合成二聚物,因此與Fc區融合所產生之免疫原係二聚物。融合蛋白之化合價可反映促成Fc區之免疫球蛋白之類型。例如,與IgG蛋白質之融合物可為二聚物,IgA融合物可達成四聚物免疫原,且IgM融合物可
融合物可達成十聚物免疫原,利用J鏈之共轉染可促進後兩者。用於Fc融合蛋白之實例性免疫球蛋白係IgG1。所用部分通常具有由單一外顯子編碼之IgG1鉸鏈、CH2及CH3結構域。由於此外顯子之一部分CH1區中之半胱胺酸亦傾向於與來自輕鏈之半胱胺酸形成二硫鍵,因此可用改質係使CH1半胱胺酸突變成(例如)絲胺酸,以確保在融合蛋白中不存在未配對半胱胺酸。此一突變亦增加鉸鏈之撓性。
用於融合至免疫原以供在宿主物種(例如,小鼠、大鼠、兔、山羊)中實施免疫的源自非宿主物種之Fc部分(例如,人類Ig Fc區)用作輔助物。此輔助功能可觸發針對Fc與GCC表位二者之特異性抗體。可在篩選期間鑑別Fc反應性抗體並將其丟棄。Fc部分可具有野生型序列或經突變以修改效應子功能之序列。例如,可將經突變恆定區(變體)納入融合蛋白中以將與Fc受體之結合及/或固定補體之能力降低至最低(例如,參見Winter等人,GB 2,209,757 B;Morrison等人,WO 89/07142;Morgan等人,WO 94/29351)。在較佳實例中,使根據Fc區標準編號之離胺酸235及甘胺酸237突變成(例如)丙胺酸。具有Fc-突變IgG之免疫原/融合蛋白與宿主中之Fc受體之交互作用可有所降低。較佳的可溶性免疫原融合蛋白(在成熟以裂解信號肽及分泌後)係hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII(pLKTOK108),其係由融合至突變小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc之SEQ ID NO:3之胺基酸殘基24至430(統稱為SEQ ID NO:48)組成。
為製備細胞表現之免疫原,免疫球蛋白部分可經結構化以模擬B細胞受體之免疫球蛋白部分。例如,免疫球蛋白Fc區可進一步融合至包含來自免疫受體(例如Fcγ受體、Fcα受體、Fcα/μ受體或Fcε受體)之跨膜區之多肽。若表現免疫原融合蛋白之細胞進一步包含抗原受體複合物(例如,B細胞IgM受體或IgD受體)之其他組份,則可改良充分暴
露於細胞表面上之此一Fc受體細胞結合之免疫原之恰當定向。複合物之適宜組份包括免疫球蛋白(Ig)鞘蛋白,例如形成異源二聚物之MB-1及B29(CD79A及CD79B;Hombach等人Eur.J.Immunol.20:2795-2799(1990),對於IgM受體而言)。Ig鞘蛋白可由受轉染細胞內源性地提供,例如,若轉染B細胞淋巴瘤細胞系;或藉由共轉染免疫原與鞘蛋白來提供,例如,在分開的載體中或在相同的載體中進行。
如本文所述抗-GCC抗體分子(例如,兔單株抗體或其人類化形式)可結合的來自GCC分子之可用表位(例如,參照表位)可在GCC之細胞外部分上發現。此等GCC表位可結合細胞表面上(例如,細胞外部上)之抗體分子。
例如,抗-GCC抗體分子之表位可位於SEQ ID NO:3之殘基1-50或其結合本發明抗-GCC抗體分子之片段(例如,其MIL-44-148-2結合片段)內,或包括來自該等殘基或片段之殘基。此等片段可包含SEQ ID NO:3之殘基1-25、5-30、10-35、15-40、20-45、25-50、5-45、10-40、15-35、20-30或33-50。在一些實施例中,抗-GCC抗體分子(例如,MIL-44-148-2抗體)之表位係進一步包含GCC胺基酸序列中一或多個超出殘基50(即,選自SEQ ID NO:3之約殘基50至1073)之其他胺基酸殘基的構象表位。
針對此等表位或細胞外結構域(例如,位於SEQ ID NO:3之胺基酸殘基24至420或其參照部分(例如,GCC之殘基24至75、75至150、150至225、225至300、300至375或375至420)內或包括來自該等殘基或參照部分之殘基的表位)產生之抗體或衍生其之抗體分子可用作治療抗體或診斷抗體,如本文所述。
在實施例中,抗-GCC抗體分子具有一或多種以下性質:a)其與匯總於表1及2中之一種上文提及之抗-GCC抗體分子(例如,兔雜交瘤抗體,例如,MIL-44-148-2)競爭結合,例如,競爭結
合至細胞表面GCC或經純化GCC;b)其結合至與GCC中匯總於表1及2中之一種上文提及之抗-GCC抗體分子(例如,兔雜交瘤抗體,例如,MIL-44-148-2)相同或實質上相同之表位。在實施例中,抗體結合如藉由一或多種肽陣列分析或藉由結合至在細胞表面或膜製劑上表現之截短突變體、嵌合體或點突變體所測定之相同表位,例如,本文闡述之彼等分析;c)其結合至與匯總於表1及2中之一種上文提及之抗-GCC抗體分子(例如,兔雜交瘤抗體,例如,MIL-44-148-2)之表位共有至少1個、2個、3個、4個、5個、8個、10個、15個或20個鄰接胺基酸殘基之表位;d)其結合人類GCC之由本發明抗-GCC抗體結合之區,其中該區(例如,細胞外或細胞質區)之長度為10-15個、10-20個、20-30個或20-40個殘基,且藉由(例如)結合至截短突變體來測定結合;在實施例中,抗-GCC抗體分子結合人類GCC之細胞外區。在實施例中,抗-GCC抗體分子可結合由SEQ ID NO:3之胺基酸殘基24至420所界定細胞外結構域之人類GCC部分。在實施例中,抗-GCC抗體分子可結合SEQ ID NO:3之胺基酸殘基931至954處之鳥苷酸環化酶標誌位點;或e)其結合至本文所述之參照表位。
在實施例中,抗-GCC抗體分子結合GCC序列ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS(SEQ ID NO:8)。
在實施例中,抗-GCC抗體分子結合GCC序列FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV(SEQ ID NO:9)。
在實施例中,抗體分子結合構象表位。在其他實施例中,抗體分子結合線性表位。
抗-GCC抗體分子可為多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、嵌合抗體(參見美國專利第6,020,153號)或人類化抗體或抗體片段或其衍
生物。本發明亦涵蓋任一上述者之合成及遺傳改造之變體(參見美國專利第6,331,415號)。單株抗體可藉由多種技術產生,包括習用鼠類單株抗體方法(例如,Kohler及Milstein,Nature 256:495(1975)之標準的體細胞雜交技術;通常參見Harlow,E.及Lane,D.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y)及由Epitomics(Burlingame,CA)提供之兔單株抗體技術及服務,該技術使用兔-兔雜交瘤產生定製的兔單株抗體(RabMAbs®),該等兔-兔雜交瘤係藉由融合來自經免疫兔之經分離B細胞與Epitomics之專屬融合配偶體細胞系產生,如美國專利7,402,409、7,429,487、7,462,697、7,575,896、7,732,168及8,062,867中所述,該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。
可利用蛋白質(例如,GCC)或可溶性部分、或包含一部分GCC之融合蛋白(例如,hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII,pLKTOK108)、或細胞或來自其之膜部分(例如,表現表面暴露之GCC之細胞或其一部分,例如,pLKTOK4產物)與經製備用於以誘導反應之方式注射之免疫原,例如,與佐劑(例如,完全弗氏佐劑,complete Freund's adjuvant)一起實施免疫。其他適宜佐劑包括Titermax Gold®佐劑(CYTRX公司,Los Angeles,Calif.)及明礬。可將小肽免疫原連接至較大分子,例如鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)。小鼠或兔可以多種方式(例如,皮下、靜脈內或肌內)於多個部位(例如,在腹膜中(i.p.)、尾巴底部或足蹠或部位之組合,例如,iP及尾巴底部(BIP))注射。加強注射可包括相同或不同免疫原且另外可包括佐劑,例如,不完全弗氏佐劑。可使用基因槍技術注射DNA(例如,編碼GCC或其一部分或包含GCC或其一部分之融合蛋白(例如,編碼hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII)之DNA)來實施免疫。例如,在短暫時期內以頻繁間隔將DNA加載至微觀金粒子上並注射至小鼠或兔中。
通常,倘若期望單株抗體,則藉由融合來自永生細胞系(例如,骨髓瘤細胞系,例如SP2/0、P3X63Ag8.653或雜交骨髓瘤)之適宜細胞與抗體產生細胞來產生雜交瘤。抗體產生細胞可自用所關注抗原免疫之人類、人類抗體轉基因動物或其他適宜動物(例如,兔)的周邊血或較佳脾臟或淋巴節獲得。產生人類源抗體(例如,人類抗體)之細胞可使用適宜方法產生,例如,融合人類抗體產生細胞與雜交骨髓瘤或三源雜交瘤或經由艾伯斯坦-巴爾(Epstein Barr)病毒感染將經活化人類B細胞永生化。(例如,參見美國專利第6,197,582號(Trakht);Niedbala等人,雜交瘤,17:299-304(1998);Zanella等人,J Immunol Methods,156:205-215(1992);Gustafsson等人,Hum Antibodies Hybridomas,2:26-32(1991)。)經融合或永生化抗體產生細胞(雜交瘤)可使用選擇性培養條件分離,並藉由限制性稀釋進行選殖。產生具有期望特異性之抗體之細胞可使用適宜分析(例如,ELISA(例如,利用固定在微量滴定孔上之免疫原,例如,hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII)或藉由對表現GCC或其一部分之細胞(例如,表現pLKTOK4產物之細胞)實施FACS)鑑別。例如,若GCC-免疫原包含為親和力試劑之融合部分,則此部分可允許包含GCC或其一部分之融合蛋白結合至基質,例如,經蛋白質G塗覆、經抗生蛋白鏈菌素塗覆、經麩胱甘肽衍生或經抗體塗覆之微量滴定板或分析晶片,然後將該等微量滴定板或分析晶片與來自雜交瘤或表現抗體之重組細胞之免疫血清或條件化培養基組合,並在有助於複合物形成之條件下(例如,在鹽及pH之生理條件下)培育該混合物。在培育後,洗滌微量滴定板孔或晶片單元以去除任何未結合之組份並量測抗-GCC抗體之結合。
在實施例中,對於治療應用而言,本發明抗體係人類化抗體。人類化抗體之優點在於其潛在地降低或消除抗體在宿主受體中之免疫原性,藉此允許增加生物利用度並降低發生不良免疫反應之可能性,
因此潛在地使得可進行多次抗體投與。
經改質抗體包括人類化、嵌合或CDR-移植抗體。人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已導致研發嵌合體抗體或以其他方式人源化之抗體。儘管嵌合體抗體具有人類恆定區及非人類可變區,但預計,尤其在慢性或多劑量抗體利用中會觀察到某些人抗嵌合抗體(HACA)反應。此等非人類(例如,小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)來源的蛋白質可導致抗體之快速清除或可導致患者產生針對該抗體之免疫反應。為避免利用非人類源抗體,已研發將序列引入抗體序列中以使其更接近人類抗體序列之人類化抗體或藉由將人類抗體功能引入非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)中而產生之完全人類抗體,以使得非人類物種可產生具有完全人類序列之抗體。人類抗體可避免某些與具有兔、齧齒類、綿羊或山羊可變區及/或恆定區之抗體相關之問題。
人類化抗體分子可將非人類或非人類衍生之mAb固有之免疫原性及過敏性反應降至最低並因此增加所投與抗體之功效及安全性。使用人類化抗體分子可在治療需要重複投與抗體之慢性及復發性人類疾病(例如發炎、自體免疫及癌症)方面提供顯著優點。
可結合人類化技術及展示技術使用適當文庫來產生免疫原性降低之人類化抗體。應瞭解,來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊等)之抗體可使用業內已知技術進行人類化或靈長類化。例如,參見Winter及Harris Immunol Today 14:43-46(1993)及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992)。所關注抗體可藉由重組DNA技術用相應人類序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈結構域及/或框架結構域來改造(參見WO 92/02190及美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,792號、第5,714,350號及第5,777,085號)。此外,使用Ig cDNA來構築嵌合免疫球蛋白基因為業內
已知(Liu等人Proc Natl Acad Sci USA.84:3439(1987)及J.Immunol.139:3521(1987))。mRNA係自產生抗體之雜交瘤或另一細胞分離並用於產生cDNA。所關注cDNA可藉由聚合酶鏈反應使用特異性引子來擴增(美國專利第4,683,195號及第4,683,202號)。
另一選擇為,可使用噬菌體展示技術(例如,參見McCafferty等人,Nature,348:552-553(1990))來產生人類抗體或來自其他物種之抗體,以及活體外來自免疫球蛋白可變(V)結構域基因(例如,來自未經免疫供體之譜)之抗體片段。根據此技術,將抗體V結構域基因在框架內選殖至絲狀噬菌體(例如M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中,並在噬菌體粒子表面上展示為功能抗體片段。由於絲狀粒子含有噬菌體基因組之單鏈DNA拷貝,因此基於抗體功能性質之選擇亦達成對編碼展現彼等性質之抗體之基因實施選擇之目的。因此,噬菌體可模擬B細胞之一些性質。噬菌體展示可以多種形式來實施;關於其綜述,例如,參見Johnson及Chiswell,Current Opinion in Structural Biology,3:564-571(1993)。若干來源之V-基因區段可用於噬菌體展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)自源自經免疫小鼠脾臟之V基因的小型隨機組合文庫分離出抗-噁唑酮抗體之多樣陣列。可構建來自未經免疫之人類供體的V基因譜,且可依照Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所述之技術基本分離針對多樣抗原陣列(包括自身抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。展示文庫可含有具有人工胺基酸序列之抗體或抗體之抗原結合片段。例如,文庫可含有具有人工CDR(例如,隨機胺基酸序列)及人類框架區之Fab片段。(例如,參見美國專利第6,300,064號(Knappik等人)。)
人類恆定區基因之序列可參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,N.I.H.出版物第91-3242號。人類C
區基因可容易地自已知純系獲得。同種型之選擇將由期望的效應子功能(例如補體固定或在抗體依賴性細胞毒性中之活性)引導。同種型可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定實施例中,本發明抗體分子係IgG1及IgG2。可使用任一κ或λ人類輕鏈恆定區。然後藉由習用方法表現嵌合人類化抗體。
在一些實施例中,本發明抗-GCC抗體分子可將抗體依賴性細胞毒性(ADCC)引至表現GCC之細胞,例如,腫瘤細胞。具有IgG1及IgG3同種型之抗體因其結合Fc受體之能力而可用於在抗體依賴性細胞毒性能力方面誘發效應子功能。具有IgG2及IgG4同種型之抗體因其結合Fc受體之能力較低而可用於將ADCC反應降至最低。在相關實施例中,可在Fc區中進行取代或對抗體糖基化組成實施變化(例如,藉由在經改質真核細胞系中生長)以增強Fc受體識別、結合及/或介導抗-GCC抗體所結合細胞之細胞毒性之能力(例如,參見美國專利第7,317,091號、第5,624,821號及包括以下在內之出版物:WO 00/42072;Shields等人J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Lazar等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:4005-4010(2006);Satoh等人Expert Opin Biol.Ther.6:1161-1173(2006))。在某些實施例中,抗體或抗原結合片段(例如,人類源抗體、人類抗體)可包括改變或調整功能(例如,效應子功能)之胺基酸取代或置換。例如,人類源恆定區(例如,γ1恆定區、γ2恆定區)可經設計以減少補體活化及/或Fc受體結合。(例如,參見美國專利第5,648,260號(Winter等人)、第5,624,821號(Winter等人)及第5,834,597號(Tso等人),其全部教示內容以引用方式併入本文中。)較佳地,含有此等胺基酸取代或置換之人類源恆定區之胺基酸序列在全長內與人類源未經改變恆定區之胺基酸序列至少約95%一致,更佳地在全長內與人類源未經改變恆定區之胺基酸序列至少約99%一致。
在再一實施例中,效應子功能亦可藉由調節抗體之糖基化模式來改變。改變意指缺失一或多個於抗體中發現之碳水化合物部分及/或增加一或多個在抗體中不存在之糖基化位點。例如,具有增強之ADCC活性且具有缺乏附接至抗體Fc區之岩藻糖之成熟碳水化合物結構的抗體闡述於美國專利申請公開案第2003/0157108號(Presta)中。亦參見美國專利申請公開案第2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。Glycofi亦已研發能夠產生特定糖型之抗體之酵母細胞系。
另外或另一選擇為,可製備具有經改變糖基化類型之抗體,例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗體或具有增加之二等分GlcNac結構之抗體。已證實,此等經改變糖基化模式增加抗體之ADCC能力。此等碳水化合物改質可藉由(例如)在具有經改變糖基化機制之宿主細胞中表現抗體來達成。業內已闡述具有經改變糖基化機制之細胞且其可用作為宿主細胞,該等宿主細胞經改造以表現本發明重組抗體,以便藉此產生具有經改變糖基化之抗體。例如,頒予Hang等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖轉移酶之功能破壞之FUT8基因之細胞系,以使得在此一細胞系中表現之抗體展現低岩藻糖基化。頒予Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖附接至Asn(297)-連接之碳水化合物之能力降低之變體CHO細胞系Lec13細胞,亦導致在該宿主細胞中表現之抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740)。頒予Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現對糖蛋白進行改質之糖基轉移酶(例如,β(1,4)-N乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞系,以使得在該等經改造細胞系中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構,從而使該等抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人,1999 Nat.Biotech.17:176-180)。
亦可使用CDR-移植方法來製備人類化抗體。產生此等人類化抗
體之技術為業內已知。通常,人類化抗體係藉由以下步驟產生:獲得編碼結合至GCC之抗體之可變重鏈及可變輕鏈序列之核酸序列、鑑別可變重鏈及可變輕鏈序列中之互補決定區或「CDR」及將CDR核酸序列移植至人類框架核酸序列上。(例如,參見美國專利第4,816,567號及第5,225,539號)。可測定CDR及框架殘基之位置(參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號及Chothia,C.等人J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。本文所述抗-GCC抗體分子具有編碼列示於表5及6中之CDR之CDR胺基酸序列及核酸序列。在一些實施例中,可將來自表5及6之序列納入用於本文所述治療或診斷方法中之識別GCC之分子中。所選人類框架係適於活體內投與者,此意味著其不展示免疫原性。例如,可藉由預先在活體內使用此等抗體獲得經驗並研究胺基酸類似性來進行此一測定。適宜框架區可選自人類源抗體,該抗體在供體抗體(例如,抗-GCC抗體分子,例如,3G1)之等效部分(例如,框架區)之胺基酸序列內之框架區長度內具有至少約65%胺基酸序列一致性且較佳至少約70%、80%、90%或95%胺基酸序列一致性。可使用適宜的胺基酸序列比對算法(例如CLUSTAL W)使用預設參數來測定胺基酸序列一致性。(Thompson J.D.等人,Nucleic Acids Res.22:4673-4680(1994)。)
在鑑別經選殖抗體之欲人類化之CDR及FR後,鑑別編碼CDR之胺基酸序列並將對應核酸序列移植至所選人類FR上。此可使用已知引子及連接體進行,該等引子及連接體之選擇為業內已知。特定人類抗體之所有CDR可經至少一部分非人類CDR置換,或僅一些CDR可經非人類CDR置換。僅需要置換將人類化抗體結合至預定抗原所需數量之CDR。在將CDR移植至所選人類FR上後,使所得「人類化」可變重鏈及可輕鏈序列表現以產生結合至GCC之人類化Fv或人類化抗體。
較佳地,CDR-移植(例如,人類化)抗體以類似於供體抗體、實質上與供體抗體相同或優於供體抗體之親和力結合GCC蛋白質。通常,使人類化可變重鏈及輕鏈序列作為與人類恆定結構域序列之融合蛋白表現,由此獲得結合至GCC之完整抗體。然而,可產生不含有恆定序列之人類化Fv抗體。
已取代、缺失或添加特定胺基酸之人類化抗體亦在本發明範圍內。特定而言,人類化抗體可在框架區中具有胺基酸取代,以(例如)改良與抗原之結合。例如,人類化免疫球蛋白鏈之所選少量受體框架殘基可由相應供體胺基酸置換。取代位置包括毗鄰CDR或能夠與CDR交互作用之胺基酸殘基(例如,參見美國專利第5,585,089號或5,859,205號)。受體框架可為成熟人類抗體框架序列或共有序列。本文所用術語「共有序列」係指自相關家族成員內一區域中一序列中各位置處之最常見殘基最頻繁地發現或設計之序列。可利用諸多人類抗體共有序列,包括不同人類可變區亞群之共有序列(參見,Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991))。Kabat數據庫及其應用可在線免費獲得,例如經由IgBLAST於National Center for Biotechnology Information,Bethesda,Md.處獲得(亦參見Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Research 29:205-206(2001))。
用於將抗體人類化之其他技術闡述於Padlan等人EP 519596 A1(於1992年12月23日公開)中。
抗-GCC抗體分子包括其他人類化抗體,該等抗體亦可藉由揭示於PCT公開案第WO 98/52976號及第WO 00/34317號中之方法使人類T細胞特定表位發生缺失或使抗體「去免疫化」來改質,該等案件之內容以引用方式併入本文中。簡言之,可針對結合至MHC II類之肽來
分析抗-GCC抗體之兔或其他非人類物種重鏈及輕鏈可變區;該等肽代表潛在T-細胞表位。對於潛在T-細胞表位之檢測而言,可應用稱為「肽穿線(threading)」之電腦建模方法,且另外可在人類MHC II類結合肽數據庫中搜索存在於兔VH及VL序列中之基序,如PCT公開案第WO 98/52976號及第WO 00/34317號中所述。該等基序結合至18個主要MHC II類DR同種異型中之任一者,且因此構成潛在T細胞表位。所檢測之潛在T-細胞表位可藉由取代可變區中之少量胺基酸殘基或較佳藉由單一胺基酸取代來消除。儘可能地進行保守取代,通常但並非排他地,可使用人類種系抗體序列中此位置處常見之胺基酸。人類種系序列揭示於Tomlinson,I.A.等人,J.Mol.Biol.227:776-798(1992);Cook,G.P.等人,Immunol.Today,第16(5)卷:237-242(1995);Chothia,D.等人,J.Mol.Bio.227:799-817(1992)中。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合目錄(由Tomlinson,I.A.等人,MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK編譯)。在藉由對兔VH及VL基因實施誘變構築抗-GCC抗體之去免疫化VH及VL後,可視情況將經誘變可變序列融合至人類恆定區,例如,人類IgG1或K(κ)恆定區。
在其他實施例中,可藉由CDR中之胺基酸殘基之改變(例如,缺失、取代)來降低CDR-移植抗體之免疫原性反應(Kashmiri等人Methods 36:25-34(2005);美國專利第6,818,749號;Tan等人J.Immunol.169:1119-1125(2006))。例如,較佳不改變參與抗原接觸之位置處之殘基。通常,此等殘基(特異性決定殘基,SDR)係在抗體之間展示高度可變性之位置處。藉由(例如)Clustal方法(Higgins D.G.等人,Meth.Enzymol.266:383-402(1996))自抗-GCC抗體分子(例如,自本文所述抗體)衍生之共有序列輔助鑑別SDR。在本文所述抗-GCC抗體分子中,SDR如下:重鏈CDR1之至少第一個殘基或在一些實施例
中前4個殘基;重鏈CDR2之至少N端部分,例如,前7個、10個或13個殘基;幾乎所有重鏈CDR3;輕鏈CDR1之C端部分,例如,第6個、8個或9個殘基後;輕鏈CDR2之約第一個、中間一個及/或最後一個殘基;及大部分輕鏈CDR3或至少在殘基第2個或3個後。因此,為了在抗-GCC抗體分子人類化或改質後維持與GCC蛋白質之結合,此等在抗-GCC抗體分子之CDR中之SDR殘基比CDR或框架區之其他殘基中之殘基更不適於自(例如)兔殘基變成人類共有殘基。相反,可有益地將非人類(例如,兔)CDR中之殘基變成鑑別為人類CDR(例如,美國公開專利申請案第20110110936號中所述抗-GCC抗體分子之CDR)中共有之殘基,該案件之全部內容以引用方式併入本文中。
並非完整抗體之抗-GCC抗體亦可用於本發明中。此等抗體可衍生自任一上述抗體。此類可用抗體分子包括(i)Fab片段,即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段;(ii)F(ab')2片段,即包含兩個由鉸鏈區處之二硫橋連接之Fab片段的二價片段;(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段;(iv)由抗體之單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段;(v)由VH結構域組成之dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989));(vii)由VHH結構域組成之單結構域功能重鏈抗體(稱為奈米抗體),例如,參見Cortez-Retamozo等人,Cancer Res.64:2853-2857(2004),及其中所引述之參考文獻;及(viii)經分離CDR,例如,一或多個經分離CDR以及足以提供抗原結合片段之框架。此外,儘管Fv片段的兩個結構域VL及VH係由單獨基因編碼,但可使用重組方法由合成連接體將該兩個結構域接合在一起,該合成連接體使得能將該等結構域製成VL及VH區域配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv));例如,參見Bird等人Science 242:423-426(1988);及Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內。使用彼等熟習此項技
術者已知之習用技術獲得該等抗體片段,且以與完整抗體相同之方式篩選該等片段之效用。諸如Fv、F(ab')2及Fab等抗體片段可藉由完整蛋白質之裂解(例如藉由蛋白酶或化學裂解)來製備。
在實施例中,可在另一抗體分子中,例如,在CDR-移植、人類化或嵌合抗體分子中使用重鏈及輕鏈中一者或二者之一些或全部CDR序列。
實施例包括包含允許結合至細胞表面GCC之足夠CDR(例如,來自本文所述兔雜交瘤抗體中一者之全部6個CDR)的抗體分子。
在實施例中,在人類或人類衍生框架區中嵌入CDR,例如,全部HCDR或全部LCDR或全部6個。人類框架區之實例包括人類種系框架序列、已經親和力成熟(活體內或活體外)之人類種系序列或合成人類序列,例如,共有序列。在實施例中,重鏈框架係IgG1或IgG2框架。在實施例中,輕鏈框架係κ框架。
在實施例中,抗-GCC抗體分子,例如,CDR-移植或人類化抗體分子,包含足夠CDR,例如,來自一種本文所述抗體之全部6個CDR,例如,列示於表5中之序列,以允許結合至GCC。(可編碼列示於表5中之CDR胺基酸序列之實例性核酸序列提供於本文表6中)。在特定實施例中,抗-GCC抗體分子可包含來自MIL-44-148-2或MIL-44-67-4之CDR。
用於活體內治療或診斷應用之抗體片段可受益於改良其血清半衰期之改質。意欲延長抗體之活體內血清半衰期之適宜有機部分可包括一個、兩個或更多個選自以下之直鏈或具支鏈部分:親水性聚合基團(例如,直鏈或具支鏈聚合物(例如,聚烷烴二醇,例如聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇及諸如此類)、碳水化合物(例如,葡聚糖、纖維素、多糖及諸如此類)、親水性胺基酸聚合物(例如,聚離胺酸、聚天冬胺酸及諸如此類)、聚環氧烷及聚乙烯基吡咯啶酮)、脂肪酸基團(例
如,單羧酸或二羧酸)、脂肪酸酯基團、脂質基團(例如,二醯甘油基團、鞘脂基團(例如,神經醯胺基))或磷脂基團(例如,磷脂醯乙醇胺基團)。較佳地,有機部分結合至預定位點,其中有機部分與非偶聯抗體部分相比不損害所得免疫偶聯物之功能(例如,降低抗原結合親和力)。有機部分之分子量可為約500Da至約50,000Da、較佳約2000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da。改質具有有機部分之多肽(例如,抗體)之實例及方法可參見(例如)美國專利第4,179,337號及第5,612,460號、PCT公開案第WO 95/06058號及第WO 00/26256以及美國專利申請公開案第20030026805號。
抗-GCC抗體分子可包含一種上文提及之兔雜交瘤抗體之重鏈及輕鏈中一者或二者之全部可變區或其抗原結合片段。
在實施例中,(a)之輕鏈胺基酸序列可與一個(a)(i-ii)中提及之參照胺基酸序列相差多達1個、2個、3個、4個、5個、10個或15個殘基。在實施例中,差異係保守取代。在實施例中,差異係在框架區中。在實施例中,(b)之重鏈胺基酸序列可與一個(b)(i-ii)中提及之參照胺基酸序列相差多達1個、2個、3個、4個、5個、10個或15個殘基。在實施例中,差異係保守取代。在實施例中,差異係在框架區中。
在實施例中,抗-GCC抗體分子包含以下中之一者或二者:(a)以下中任一者之全部或其抗原結合片段之輕鏈胺基酸序列:(i)來自表3之輕鏈可變區胺基酸序列,例如,SEQ ID NO:13,或(ii)由來自表4之核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:12)編碼之輕鏈可變區胺基酸;及(b)以下中任一者之全部或其抗原結合片段之重鏈胺基酸序列:(i)來自表3之重鏈胺基酸序列,例如,SEQ ID NO:11,或(ii)由來自表4之核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:10)編碼之重鏈胺基酸序列。
在實施例中,抗-GCC抗體分子包含以下中之一者或二者:a)輕鏈可變區或其抗原結合片段,其與本發明抗-GCC抗體分子之輕鏈可變區具有至少85%、90%、95%、97%或99%同源性;及(b)重鏈可變區或其抗原結合片段,其與本發明抗-GCC抗體分子之重鏈可變區具有至少85%、90%、95%、97%或99%同源性。
本發明抗-GCC抗體之可變區之胺基酸序列可參見表3。
在一種方法中,可使用編碼重鏈及輕鏈J區之共有序列來設計用作引子之寡核苷酸以將可用限制位點引入J區中,以供隨後將V區區段連接至人類C區區段。C區cDNA可藉由定點誘變改質以將限制位點置於人類序列中之類似位置。
表現載體包括質粒、逆轉錄病毒、黏粒、YAC、EBV源游離基因體及諸如此類。便利的載體係編碼功能完全之人類CH或CL免疫球蛋白序列者,其中適當限制位點經改造,以使得任何VH或VL序列皆可容易地插入並表現。在此等載體中,剪接通常發生於經插入J區中之剪接供體位點與人類C區之前的剪接受體位點之間,且亦發生於出現於人類CH外顯子內之剪接區處。適宜表現載體可含有諸多組份,例如,複製起點、可選標記物基團、一或多種表現控制元件(例如轉錄控制元件,例如,啟動子、增強子、終止子)及/或一或多種轉譯信號、信號序列或前導序列及諸如此類。多聚腺苷酸化及轉錄終止發生於編碼區下游之天然染色體位點處。所得嵌合抗體可接合至任何強啟動子。可使用之適宜載體之實例包括彼等適於哺乳動物宿主且基於病毒複製系統者,例如猿猴病毒40(SV40)、勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK突變體(BKV)或小鼠及人類細胞巨大病毒(CMV)及莫洛尼(moloney)鼠類白血病病毒(MMLV)、天然Ig啟動子等。多種適宜載體為業內已知,包括以單拷貝或多拷貝維持或例如經LTR或經由經多個整合位點改造之人
工染色體變得整合至宿主細胞染色體中的載體(Lindenbaum等人Nucleic Acids Res.32:e172(2004);Kennard等人Biotechnol.Bioeng.在線,2009年5月20日)。適宜載體之其他實例列示於下文部分中。
因此,本發明提供包含核酸之表現載體,該核酸編碼結合GCC蛋白質之抗體、抗體之抗原結合片段(例如,任一上述者之人類化、嵌合抗體或抗原結合片段)、抗體鏈(例如,重鏈、輕鏈)或抗體鏈之抗原結合部分。
在真核宿主細胞中表現係有用的,此乃因此等細胞比原核細胞更有可能組裝並分泌經恰當摺疊且具有免疫活性之抗體。然而,所產生因不恰當摺疊而無活性之任何抗體皆可根據已知方法複性(Kim及Baldwin,「Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding」,Ann.Rev.Biochem.51,第459-89頁(1982))。宿主細胞可能將產生完整抗體之部分,例如輕鏈二聚物或重鏈二聚物,其亦為本發明抗體同源物。
此外,如本文別處所述,抗體或來自人類或非人類物種之抗體可使用業內熟知之技術經由展示型技術(包括(但不限於)噬菌體展示、逆轉錄病毒展示、核糖體展示)及其他技術產生,且可使所得分子經受額外成熟,例如親和力成熟,此乃因此等技術為業內已知。Winter及Harris Immunol Today 14:43-46(1993)及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992);Hanes及Plucthau PNAS USA 94:4937-4942(1997)(核糖體展示);Parmley及Smith Gene 73:305-318(1988)(噬菌體展示);Scott TIBS 17:241-245(1992);Cwirla等人Proc Natl Acad Sci USA 87:6378-6382(1990);Russel等人Nucl.Acids Research 21:1081-1085(1993);Hoganboom等人Immunol.Reviews 130:43-68(1992);Chiswell及McCafferty TIBTECH 10:80-84(1992)及美國專利第5,733,743號。若利用展示技術來產生非人類抗體,則此等抗體可如
上文所述經人類化。
應瞭解,所產生之抗體無需首先具有特定的期望同種型,而是,所產生之抗體可具有任一同種型。例如,由MIL-44-148-2兔雜交瘤產生之抗體具有IgG同種型。此後,可使用業內已知之習用技術將抗體之同種型轉換成(例如)IgG2或IgG3以在該抗體結合細胞上之GCC時誘發ADCC反應。此等技術尤其包括使用直接重組技術(例如,參見美國專利第4,816,397號)、細胞-細胞融合技術(例如,參見美國專利第5,916,771號)。在細胞-細胞融合技術中,製備具有具期望同種型之重鏈的骨髓瘤或另一細胞系,並製備具有輕鏈之另一骨髓瘤或另一細胞系。此後可將此等細胞融合,且可分離表現完整抗體之細胞系。
在某些實施例中,GCC抗體分子係兔抗-GCC IgG1抗體。由於此等抗體具有期望之與GCC分子之結合,因此此等抗體中之任一者皆可容易地進行同種型轉換以產生另一同種型,同時仍具有相同可變區(其一定程度地界定抗體之特異性及親和力)。因此,當產生滿足如上文所論述之期望「結構」屬性之候選抗體時,通常可經由同種型轉換向其提供至少某些期望的其他「功能」屬性。
在實施例中,可變區或其抗原結合片段可偶合至除與其一起產生之恆定區以外之恆定區(或其片段)(例如,來自另一抗體之恆定區(或其片段))或偶合至合成恆定區(或其片段)。在實施例中,恆定區係IgG1或IgG2恆定區(或其片段)。可在可變區或恆定區中進行序列變化以改良抗體分子之效應子活性。
本文所產生及表徵之關於GCC之抗體可為其他治療方式之設計作準備,其他治療方式包括其他抗體、其他拮抗劑或有助於除抗體以外之化學部分。此等方式包括(但不限於)具有類似結合活性或功能之抗體、高級抗體治療法(例如雙特異性抗體、免疫偶聯物及放射性標記
之治療法)、肽治療法之產生,尤其細胞內抗體及小分子。此外,如上文所論述,本發明抗體之效應子功能可藉由同種型轉換成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE或IgM來改變以用於各種治療應用。
可結合雙特異性抗體產生包含以下之雙特異性抗體:(i)偶聯在一起之兩種抗體,一種對GCC具有特異性且另一種對第二分子具有特異性,(ii)單一抗體,其具有一條對GCC具有特異性之鏈及對第二分子具有特異性之第二鏈,或(iii)單鏈抗體,其對GCC及該另一分子具有特異性。此等雙特異性抗體可使用已知技術產生。例如,雙特異性抗體可藉由使兩種或更多種抗體(具有相同類型或不同類型)交聯來產生。適宜交聯劑包括彼等具有異質雙官能基之交聯劑(例如,間-馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯)或同質雙官能基交聯劑(例如,辛二酸二琥珀醯亞胺酯),該等異質雙官能基交聯劑具有兩個由適當間隔體隔開的不同反應性基團。此等連接體可自Pierce Chemical Company,Rockford,Ill獲得。亦例如參見Fanger等人Immunomethods 4:72-81(1994)以及Winter及Harris Immunol Today 14:43-46(1993)及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992)且結合(iii),例如,參見Traunecker等人Int.J.Cancer(增刊)7:51-52(1992)。Songsivilai及Lachmann Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelny等人J.Immunol.148:1547-1553(1992)。
另外,亦可製備「κ抗體(Kappabodies)」(Ill.等人「Design and construction of a hybrid immunoglobulin with properties of both heavy and light chain variable regions」Protein Eng 10:949-57(1997))、「微型抗體」(Martin等人EMBO J.13:5303-9(1994);美國專利第5,837,821號)、「雙鏈抗體」(Holliger等人Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448(1993))或「嘉弩星(Janusin)」(Traunecker等人EMBO J.
10:3655-3659(1991)及Traunecker等人Int J Cancer Suppl 7:51-52(1992))。
在另一實施例中,本發明係關於編碼或代表本文所述抗體分子之多核苷酸及多肽序列。此等多核苷酸編碼各重鏈及輕鏈之可變區與恆定區二者,但本發明根據本文所述之組合物亦涵蓋其他組合。本發明亦涵蓋衍生自所揭示多核苷酸及與該等多核苷酸互補之核酸序列之寡核苷酸片段。
多核苷酸可呈RNA或DNA形式。呈DNA、cDNA、基因組DNA、核酸類似物及合成DNA形式之多核苷酸在本發明範圍內。DNA可為雙鏈或單鏈,且若為單鏈,則可為編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。編碼多肽之編碼序列可與本文所提供之編碼序列一致或可為不同編碼序列,該編碼序列因遺傳密碼之冗餘性或簡併性而編碼與本文所提供之DNA相同之多肽。
在所提供之實施例中,多核苷酸編碼本發明之至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區,例如,如表4中所匯總。
本發明亦包括含有諸如以下等改質之變體多核苷酸:多核苷酸缺失、取代或添加及自變體多核苷酸序列產生之任一多肽改質。本發明多核苷酸亦可具有為本文所提供編碼序列之變體之編碼序列。例如,變體多核苷酸可與列示於表4中之多核苷酸具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%一致性。在實施例中,變體多核苷酸編碼抗-GCC抗體分子。
本發明進一步係關於代表本發明抗體以及此等多肽之片段、類似物及衍生物之多肽。本發明多肽可為重組多肽、天然產生之多肽或合成多肽。本發明多肽之片段、衍生物或類似物可為一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸殘基(較佳保守胺基酸殘基)取代者且此等
經取代胺基酸殘基可或可不為由遺傳密碼編碼者;或其可為一或多個胺基酸殘基包括取代基者;或其可為該多肽與另一化合物(例如用以延長多肽半衰期之化合物,例如,聚乙二醇)融合者;或其可為其他胺基酸(例如前導或分泌序列或用於純化該多肽之序列或前蛋白序列)融合至該多肽者。此等片段、衍生物及類似物在本發明範圍內。在各種態樣中,本發明多肽可為經部分地純化或經純化之產物。
本發明多肽之胺基酸序列可與本文所述抗體(例如,匯總於表2或3中者)一致,或因一或多個胺基酸取代所致之微小改變而不同。改變可為通常在約1至5個胺基酸範圍內之「保守變化」,其中經取代胺基酸具有類似結構或化學性質,例如,白胺酸經異白胺酸置換或蘇胺酸經絲胺酸置換;離胺酸經精胺酸或組胺酸置換。與此相反,改變可包括非保守變化,例如,甘胺酸經色胺酸置換。類似的微小改變亦可包括胺基酸缺失或插入或二者。測定可取代、插入或缺失哪些及多少胺基酸殘基而不改變生物或免疫學活性之指導可使用業內已知之電腦程式(例如DNASTAR軟體,DNASTAR公司,Madison,Wis.)發現。
在另一態樣中,本發明之特徵在於編碼抗-GCC抗體分子之經分離及/或重組核酸。在實施例中,核酸編碼以下中之一或多者:抗體分子、重鏈、輕鏈、輕鏈可變區、重鏈可變區、本文所述抗體分子之重鏈及輕鏈之部分(例如,在與全長重鏈可變區配對時為抗原結合之輕鏈可變區片段,或在與全長輕鏈可變區配對時為抗原結合之重鏈可變區片段)及CDR。實施例包括此等佈置於載體(例如,表現載體)中之核酸。此外,本發明涵蓋由宿主細胞(例如,表現由此等質粒編碼之抗體分子)產生之抗體分子。
在實施例中,提供包含以下中之一者或二者之載體,例如,表現載體:編碼以下之序列:輕鏈可變區,例如,闡述於表3中之輕鏈可變
區,例如,列示於表4中之序列;該輕鏈可變區之抗原結合片段;或來自本文所述輕鏈之一個、兩個或三個CDR(及視情況框架區),例如,闡述於表5中之CDR,例如,表6中之CDR編碼序列;及編碼以下之序列:重鏈可變區,例如,闡述於表3中之重鏈可變區,例如,列示於表4中之序列;該重鏈可變區之抗原結合片段;或來自本文所述重鏈之一個、兩個或三個CDR(及視情況框架區),例如,闡述於表5中之CDR,例如,表6中之CDR編碼序列。
在所提供之實施例中,多核苷酸編碼本發明抗體之至少一個重鏈可變區或至少一個輕鏈可變區。在所提供之實施例中,多肽可編碼本發明抗體之至少一個重鏈可變區及一個輕鏈可變區。
在實施例中,抗-GCC抗體分子包含以下中之一者或二者:(a)輕鏈可變區或其抗原結合片段,其由在所選嚴格性條件下與以下雜交之核酸編碼:(i)本文所述(例如,表4中)編碼抗-GCC抗體分子之核酸序列之補體,或(ii)任一編碼本發明抗-GCC抗體分子(例如,匯總於表1及2中之上文提及之兔抗體中之一者)之輕鏈之核酸序列;及(b)重鏈可變區或其抗原結合片段,其由在所選嚴格性條件下與以下雜交之核酸編碼:(i)本文所述(例如,表4中)編碼抗-GCC抗體分子之核酸序列之補體,或(ii)任一編碼本發明抗-GCC抗體分子(例如,匯總於表1及2中之一種上文提及之兔抗體)之重鏈之核酸序列。
在實施例中,所選嚴格性條件係高嚴格性或極高嚴格性條件,例如,本文闡述彼等條件。
本發明亦提供包括本發明多核苷酸之載體、經本發明載體遺傳改造之宿主細胞及藉由重組技術產生之本發明抗體。
可藉由多種程序將適當DNA序列插入載體中。一般而言,藉由業內已知程序將DNA序列插入適當的限制性核酸內切酶位點中。表現
載體中之多核苷酸序列可操作地連接至適當表現控制序列(即啟動子)以引導mRNA合成。此等啟動子之實例包括(但不限於)勞斯肉瘤病毒LTR或早期或晚期SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λ P L 啟動子及已知控制基因在原核(例如,tac、T3、T7啟動子,用於大腸桿菌)或真核(例如,細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EF-1a啟動子)細胞或其病毒中表現之其他啟動子。表現載體亦含有用於轉譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。載體亦可包括用於擴增表現之適當序列。例如,載體可含有為病毒源或基因組源轉錄刺激性DNA序列之增強子,病毒源轉錄刺激性DNA序列係例如彼等衍生自諸如SV40等猿猴病毒、多瘤病毒、細胞巨大病毒、牛乳頭狀瘤病毒或莫洛尼肉瘤病毒者。載體較佳亦含有複製起點。載體可經構築以含有外源性複製起點,或此一複製起點可衍生自SV40或另一病毒來源,或藉由宿主細胞染色體複製機制獲得。
另外,載體視情況含有用於選擇經轉染宿主細胞之標記物基因,例如允許利用甲胺蝶呤在多種宿主中進行選擇之二氫葉酸還原酶標記物基因;或抗生素基因,例如.β.-內醯胺酶基因(胺苄青黴素(ampicillin)抗性)、用於原核細胞中之Tet基因(用於四環素抗性)或新黴素(neomycin)、GA418(遺傳黴素(geneticin),一種新黴素衍生物)gpt(黴酚酸,mycophenolic acid)、胺苄青黴素或潮黴素(hygromycin)抗性基因;或彌補宿主細胞之遺傳病灶(例如不存在胸苷激酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶、二氫葉酸還原酶等)之基因。通常使用編碼宿主之營養缺陷性標記物之基因產物之基因(例如,LEU2、URA3、HIS3)作為酵母可選標記物。
為獲得本發明抗體,應將一或多個編碼本發明抗體之輕鏈及重鏈可變區以及輕鏈及重鏈恆定區之多核苷酸序列納入載體中。可將編碼本發明抗體之輕鏈及重鏈之多核苷酸序列納入一或多個載體中且隨
後納入宿主細胞中。
適於在哺乳動物細胞中表現之表現載體包括(例如)pCDM8、pcDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,Calif.)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pCDEF3(Goldman,L.A.等人,Biotechniques,21:1013-1015(1996))、pSVSPORT(GIBCO部門,Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,Calif.)、pEF-Bos(Mizushima,S.等人,Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))、雙順反GPEX®逆轉錄病毒載體(Gala Biotech,Middleton,Wis.)及諸如此類。亦可利用適用於各種表現宿主之表現載體,該等表現宿主係(例如)原核細胞(大腸桿菌)、昆蟲細胞(果蠅施耐德(Schnieder)S2細胞、Sf9)及酵母(嗜甲醇畢赤酵母(P.methanolica)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、啤酒酵母(S.cerevisiae))。實例性載體係pLKTOK58(野生型IgG1 Fc序列)及pLKTOK59(經突變IgG1 Fc序列)(參見美國專利申請公開案第20060147445號)。
如應瞭解,本發明抗體可在除雜交瘤細胞系以外之細胞系中表現。編碼特定抗體之cDNA或基因組純系之序列可用於適宜的哺乳動物或非哺乳動物宿主細胞。可藉由將多核苷酸引入宿主細胞中之任一已知方法來達成轉化,包括例如將多核苷酸封裝於病毒中(或至病毒載體中)及用病毒(或載體)轉導宿主細胞或藉由業內已知轉染程序將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中,轉染程序係例如葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸囊封至脂質體中及直接微注射DNA分子。所用轉化程序端視欲轉化之宿主而定。將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為業內已知且包括(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、粒子轟擊、在脂質體中囊封多核苷
酸、樹枝狀聚合物、肽偶聯物及將DNA直接微注射至細胞核中。
在另一態樣中,本發明之特徵在於包含本文所述核酸之宿主細胞。在實施例中,細胞表現本文所述抗體分子或其組份。再一實施例提供產生抗體分子(例如,本文所述抗-GCC抗體分子,例如兔抗體分子或其人類化形式)之方法,其包含在適於表現之條件下維持宿主細胞,藉此表現免疫球蛋白鏈並產生抗體分子。又一實施例提供包含任一上述編碼重鏈及輕鏈抗體序列之表現載體之宿主細胞。宿主細胞可為真核細胞,例如,哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞;或原核細胞,例如,大腸桿菌。例如,哺乳動物細胞可為經培養細胞或細胞系。實例性哺乳動物細胞包括淋巴球細胞系(例如,NS0)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COS細胞。在特定實施例中,經培養宿主細胞係包含編碼MIL-44-148-2抗體分子之核酸序列的CHO細胞。在另一實施例中,宿主細胞係雜交瘤MIL-44-148-2(PTA-8132)。另外,細胞包括卵母細胞及來自轉基因動物之細胞,例如,乳腺上皮細胞。例如,編碼本文所述抗體分子之核酸可在非人類轉基因動物中表現。
可用作表現用宿主細胞之哺乳動物細胞系為業內已知且包括許多可自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)獲得之永生化細胞系,包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎臟(BHK)細胞、猴腎臟細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及諸多其他細胞系。亦可使用包括(但不限於)細菌、酵母、昆蟲及植物在內之非哺乳動物細胞來表現重組抗體。對抗體CH2結構域實施定點誘變以消除糖基化可能較佳,以防止因非人類糖基化而導致的免疫原性、藥物代謝動力學及/或效應子功能之變化。表現方法係藉由測定產生最高表現量並產生具有組成型GCC結合性質之抗體之系統來選擇。
再一實施例提供產生抗-GCC抗體分子(例如,兔抗體分子或其人
類化形式)之方法,其包含在適於表現免疫球蛋白之條件下維持包含本文所述核酸(例如,一或多個列示於表4或6中之核酸序列)之宿主細胞,藉此表現免疫球蛋白鏈並產生結合GCC之抗體分子(例如,兔抗體分子或其人類化形式)或其片段或變體。例如,表現抗體分子之方法包括使用以下宿主細胞:在單一表現載體中包含編碼抗體分子(例如,兔抗體輕鏈或其人類化形式)之第一重組核酸分子及編碼抗體分子(例如,兔抗體重鏈或其人類化形式)之第二重組核酸分子。在其他實施例中,其係在單獨載體中。若需要,則該方法可進一步包含分離或回收抗體、抗體之抗原結合片段、抗體鏈或抗體鏈之抗原結合片段之步驟。
例如,可使用任何適於所選宿主細胞之方法(例如轉化、轉染、電穿孔、感染)將編碼結合GCC蛋白質之兔(或人類化)抗體之重鏈及輕鏈之核酸分子(即一或多種核酸分子)、或包含此(等)核酸分子之表現構築體(即一或多種構築體)引入適宜宿主細胞中來產生重組宿主細胞,以便將核酸分子可操作地連接至一或多種表現控制元件(例如在載體中、在藉由細胞內處理產生之構築體中、整合至宿主細胞基因組中之控制元件)上。可將所得重組宿主細胞維持在適於表現之條件下(例如在誘導物存在下,在適宜非人類動物中,在補充有適宜鹽、生長因子、抗生素、營養補充品等之適宜培養基中),藉此產生所編碼多肽。若需要,則可分離或回收所編碼蛋白質(例如自動物、宿主細胞、培養基、乳汁)。此方法涵蓋在非人類轉基因動物(例如,參見WO 92/03918,GenPharm International)或植物宿主細胞中表現。
此外,可使用諸多已知技術增強本發明抗體(或來自其之其他部分)自產生細胞系之表現。例如,麩醯胺酸合成酶及DHFR基因表現系統係用於在某些條件下增強表現之常見方式。可使用習用技術(例如限制性稀釋選殖、微滴技術或業內已知之任何其他方法)來鑑別高表
現細胞純系。結合歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號全部或部分地論述GS系統。
在用於重組表現本發明經改質抗體或其抗原結合部分之實例性系統中,藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈二者之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內,抗體重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接至增強子/啟動子調控元件(例如,衍生自SV40、CMV、腺病毒及諸如此類,例如CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調控元件)以驅使該等基因之高程度轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因,從而使得可對已利用甲胺蝶呤選擇/擴增經載體轉染的CHO細胞進行選擇。對所選轉化體宿主細胞進行培養以表現抗體重鏈及輕鏈並自培養基回收完整抗體。利用標準分子生物學技術來製備重組表現載體,對宿主細胞實施轉染,選擇轉化體,培養宿主細胞並自培養基回收抗體。
亦可經由產生經所關注免疫球蛋白重鏈及輕鏈序列轉基因之哺乳動物或植物並自其產生可回收形式之抗體以轉基因方式來產生本發明抗體。結合哺乳動物中之轉基因產生,可在山羊、奶牛或其他哺乳動物之乳中產生或自其回收抗體。例如,參見美國專利第5,827,690號、第5,756,687號、第5,750,172號及第5,741,957號。
本文所述抗體、抗原結合片段、抗體鏈及其抗原結合部分亦可在適宜的活體外表現系統中藉由化學合成或藉由任何其他適宜方法產生。
本文所述抗-GCC抗體可藉由任一適宜的方法(例如,化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)在功能上連接至一或多種非抗體分子實體。
可產生本文所述抗-GCC抗體分子及非抗體部分為單一連續多肽
鏈之組份的融合蛋白。非抗體部分可位於抗體部分之N端、C端或內部。例如,可藉由將編碼免疫球蛋白序列之核酸插入諸如以下等適宜表現載體中來產生一些實施例:pET載體(例如,pET-15b,Novagen)、噬菌體載體(例如,pCNATAB 5 E,Pharmacia)或另一載體,例如,pRIT2T蛋白質A融合載體,Pharmacia)。所得構築體可經表現以產生包含非抗體部分(例如,組胺酸標籤、E標籤或蛋白質A IgG結合結構域)之抗體鏈。融合蛋白可使用諸如層析等任一適宜技術利用適宜親和力基質分離或回收(例如,參見Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M等人編輯,第2卷,增刊26,第16.4.1-16.7.8頁(1991))。
本發明提供指向且在實施例中內在化至細胞中之抗-GCC抗體分子。其能夠將治療劑或可檢測劑遞送至表現GCC之細胞或遞送至其中,而不遞送至不表現該標靶之細胞或不遞送至其中。因此,本發明亦提供抗-GCC免疫偶聯物,其包含偶聯至治療劑或可檢測劑之本文所述抗-GCC抗體分子。在實施例中,抗-GCC免疫偶聯物對GCC之親和力係未偶聯抗體之至少10%、25%、50%、75%、80%、90%或95%。此可使用細胞表面GCC或經分離GCC測定。在實施例中,抗-GCC抗體分子(例如,免疫偶聯物)具有小於1,000pM、500pM、250pM、100pM或50pM之LD50,如藉由本文所述分析所測定。
可利用業內已知技術對抗-GCC抗體分子進行改質以用作免疫偶聯物。例如,參見Vitetta Immunol Today 14:252(1993)。亦參見美國專利第5,194,594號。經放射性標記之抗體的製備亦可利用業內已知技術容易地製備。例如,參見Junghans等人,Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版,Chafner及Longo編輯,Lippincott Raven(1996))。亦參見美國專利第4,681,581號、第4,735,210號、第5,101,827號、第5,102,990號(美國再頒予專利第35,500號)、第
5,648,471號及第5,697,902號。
在一些實施例中,抗體分子及非抗體部分係藉助連接體連接。在此等實施例中,免疫偶聯物由式(I)代表:
其中,Ab係本文所述抗-GCC抗體分子;X係連接Ab與Z之部分,例如,本文所述連接體在共價連接至Ab及Z中之一者或二者後之殘基;Z係治療劑或標記;且m在約1至約15範圍內。
變量m代表免疫偶聯物中每抗體分子之--X--Z部分數。在各實施例中,m在1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2範圍內。在一些實施例中,m在2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3範圍內。在其他實施例中,m係1、2、3、4、5或6。在包含複數種式(I)免疫偶聯物之組合物中,m係每Ab之--X--Z部分之平均數,亦稱作平均載藥量。平均載藥量可在每Ab 1至約15個-X--Z部分範圍內。在一些實施例中,當m代表平均載藥量時,m係約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8。在實例性實施例中,m係約2至約8。在一個實施例中,m係約8。在另一實施例中,m係約4。在另一實施例中,m係約2。
每Ab之--X--Z部分之平均數可藉由諸如質譜、ELISA分析及HPLC等習用手段表徵。亦可測定免疫偶聯物之m之定量分佈。在一些情況下,可藉助諸如反相HPLC或電泳等手段來達成m為某一值之同質免疫偶聯物與具有其他載藥量之免疫偶聯物的分離、純化及表徵。
式(I)之免疫偶聯物可以混合物形式存在,其中混合物之各組份具有不同m值。例如,式(I)免疫偶聯物可以兩種單獨免疫偶聯物組份之混合物形式存在:一種為m為7之免疫偶聯物組份且另一種為m為8之免疫偶聯物組份。
在一個實施例中,式(I)免疫偶聯物以三種單獨免疫偶聯物之混合物形式存在,其中三種單獨免疫偶聯物之m分別為1、2及3;分別為3、4及5;分別為5、6及7;分別為7、8及9;分別為9、10及11;分別為11、12及13;或分別為13、14及15。
用於製備免疫偶聯物之多種適宜連接體(例如,將抗體分子連接至治療劑或標記之異質雙官能試劑)及方法為業內已知。(例如,參見Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)。)連接體可例如在生理條件下(例如,在細胞內條件下)裂解,以便在細胞內環境中裂解連接體釋放藥物(即,治療劑或標記)。在其他實施例中,連接體不可裂解,且藉由例如抗體降解來釋放藥物。
連接體可鍵結至抗體部分上之化學反應性基團,例如,至遊離胺基、亞胺基、羥基、硫醇基或羧基(例如,至N-或C-端、至一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之遊離羧酸基或至一或多個半胱胺酸基殘基之巰基)。結合連接體之位點可為抗體部分之胺基酸序列中之天然殘基,或藉由(例如)DNA重組技術(例如,藉由在胺基酸序列引入半胱胺酸或蛋白酶裂解位點)或藉由蛋白質生物化學(例如,還原、pH調節或蛋白水解)可將其引入抗體部分中。
一種最常用之非特異性共價附接方法係實施碳化二亞胺反應以將化合物之羧基(或胺基)連接至抗體分子之胺基(或羧基)。另外,已使用諸如二醛或亞胺酸酯等雙官能劑來將化合物之胺基連接至抗體分子之胺基。亦可利用席夫鹼反應(Schiff base reaction)將藥物(即,治
療劑或標記)附接至抗體分子。該方法涉及含有二醇或羥基之藥物的高碘酸鹽氧化,由此形成醛,其隨後與抗體分子反應。經由與抗體分子之胺基形成席夫鹼來進行附接。亦可使用異硫氰酸酯作為偶合劑將藥物共價附接至抗體分子。其他技術為熟習此項技術者已知且在本發明範圍內。
在某些實施例中,使為連接體(X)之前體之中間體與藥物(Z)在合適條件下反應。在某些實施例中,在藥物及/或中間體上使用反應基團。隨後使藥物(即治療劑或標記)與中間體間之反應產物或衍生化藥物與抗體分子合適條件下反應。
可藉由採用彼等熟習此項技術者熟知之方法自反應物純化免疫偶聯物,該等方法係(例如)管柱層析(例如,親和力層析、離子交換層析、凝膠過濾、疏水性交互作用層析)、透析、透析過濾或沈澱。可藉由採用彼等熟習此項技術者熟知之方法(例如,SDS-PAGE、質譜或毛細管電泳)來評估免疫偶聯物。
在一些實施例中,連接體可由存在於細胞內環境中(例如,在溶酶體或胞內體或胞膜窖(caveolea)內)之裂解劑裂解。連接體可為(例如)由包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶在內之細胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接體。在一些實施例中,肽基連接體長至少兩個胺基酸或長至少三個胺基酸。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D及纖溶酶,已知所有該等裂解劑皆使二肽藥物衍生物水解,從而導致活性藥物(即治療劑或標記)在標靶細胞內釋放(例如,參見Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。最典型者係可由存在於表現GCC之細胞中之酶裂解的肽基連接體。例如,可使用可由硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B(其在癌性組織中高度表現)裂解之肽基連接體(例如,Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接體(SEQ ID NO:319)。此等連接體之其他實例闡述於(例如)美國專利第6,214,345號中,該專利
之全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中。在具體實施例中,可由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接體係Val-Cit連接體或Phe-Lys連接體(例如,參見美國專利第6,214,345號,其闡述使用val-cit連接體來合成阿黴素(doxorubicin))。利用藥物(即治療劑或標記)之細胞內蛋白水解釋放之一個優點在於藥物在偶聯時通常經減毒且偶聯物之血清穩定性通常較高。
在其他實施例中,可裂解連接體具有pH敏感性,即,在某些pH值下對水解敏感。通常,pH敏感性連接體可在酸性條件下水解。例如,可使用可在溶酶體中水解之酸不穩定性連接體(例如,腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、順式-烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或諸如此類)。(例如,參見美國專利第5,122,368號、第5,824,805號、第5,622,929號;Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123;Neville等人,1989,Biol.Chem.264:14653-14661。)此等連接體在中性pH條件下(例如在血液中)相對穩定,但在低於pH 5.5或5.0下(溶酶體之近似pH)不穩定。在某些實施例中,可水解連接體係硫醚連接體(例如,經由醯腙鍵附接至治療劑之硫醚)(例如,參見美國專利第5,622,929號)。
在其他實施例中,連接體可在還原條件下裂解(例如,二硫化物連接體)。多種二硫化物連接體為業內已知,包括(例如)彼等可使用以下化合物形成者:SATA(N-琥珀醯亞胺基-5-乙醯基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB及SMPT(例如,參見Thorpe等人,1987,Cancer Res.47:5924-5931;Wawrzynczak等人,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編輯,Oxford U.Press,1987。亦參見美國專利
第4,880,935號。)
在其他具體實施例中,連接體係丙二酸酯連接體(Johnson等人,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯連接體(Lau等人,1995,Bioorg Med.Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在其他實施例中,連接體單元不可裂解且藉由抗體降解來釋放藥物(即治療劑或標記)。(例如,參見美國公開案第20050238649號,其全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中)。
通常,連接體對細胞外環境實質上不敏感。在連接體背景下,本文所用「對細胞外環境實質上不敏感」意指當免疫偶聯物存在於細胞外環境中(例如,在血漿中)時,免疫偶聯物試樣中不超過約20%、通常不超過約15%、更通常不超過約10%且甚至更通常不超過約5%、不超過約3%或不超過約1%的連接體裂解。可藉由(例如)將免疫偶聯物與血漿一起培育預定時間段(例如,2、4、8、16或24小時)且隨後定量血漿中存在之遊離藥物的量來測定連接體對細胞外環境是否實質上不敏感。
在其他非互斥實施例中,連接體促進細胞內在化。在某些實施例中,當偶聯至治療劑或標記(Z)時,連接體促進細胞內在化。在其他實施例中,當偶聯至Z部分與抗-GCC抗體分子二者時,連接體促進細胞內在化。
多種可與本發明組合物及方法一起使用之實例性連接體闡述於WO 2004-010957、美國公開案第20060074008號、美國公開案第20050238649號及美國公開案第20060024317號中(各案件之全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中)。
能夠用於將抗體分子偶合至治療劑或標記之連接體之實例包括(例如)馬來醯亞胺基己醯基(mc);馬來醯亞胺基己醯基-對-胺基苯甲
基胺基甲酸酯;馬來醯亞胺基己醯基-肽-胺基苯甲基胺基甲酸酯連接體,例如,馬來醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯及馬來醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc);N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(亦稱為N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯或SPP);4-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT);N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP);N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB);2-亞胺基四氫噻吩;S-乙醯基琥珀酸酐;二硫化苯甲基胺基甲酸酯;碳酸酯;腙連接體;N-(α-馬來醯亞胺基乙醯氧基)琥珀醯亞胺酯;N-[4-(對-疊氮基水楊基胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫代)丙醯胺(AMAS);N-[.β.-馬來醯亞胺基丙氧基]琥珀醯亞胺酯(BMPS);[N-ε-馬來醯亞胺基己醯氧基]琥珀醯亞胺酯(EMCS);N-[-馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS);琥珀醯亞胺基-4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧基-[6-胺基己酸酯](LC-SMCC);琥珀醯亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代1-丙醯胺基)己酸酯(LC-SPDP);間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS);N-琥珀醯亞胺基[4-碘代乙醯基]胺基苯甲酸酯(SIAB);琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(SMCC);N-琥珀醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙醯胺基(SPDP);[N-ε-馬來醯亞胺基己醯氧基]磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-EMCS);N-[γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基]磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS);4-磺基琥珀醯亞胺基-6-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯醯胺基]己酸酯)(磺基-LC-SMPT);磺基琥珀醯亞胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫代]-丙醯胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP);間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBS);N-磺基琥珀醯亞胺基[4-碘代乙醯基]胺基苯甲酸酯(磺基-SIAB);磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC);磺基琥珀醯亞胺基4-[對-馬
來醯亞胺基苯基]丁酸酯(磺基-SMPB);乙二醇-雙(琥珀酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)(EGS);二琥珀醯亞胺基酒石酸酯(DST);1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA);二伸乙基三胺-五乙酸(DTPA);及硫脲連接體。
在一些實施例中,治療劑係細胞生長抑制劑或細胞毒性劑。實例包括(但不限於)抗代謝物(例如,硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、氟達拉濱(fludarabine)、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)、胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)、甲胺蝶呤、甲氧苄啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶、培美曲塞(pemetrexed));烷基化劑(例如,環磷醯胺、氮芥(mechlorethamine)、烏拉莫司汀(uramustine)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、噻替派(thiotepa)/苯丁酸氮芥、異環磷醯胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、沙鉑(satraplatin)、四硝酸三鉑(triplatin tetranitrate)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide));蒽環(例如,道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素、泛艾黴素(epirubicin)、艾達魯比辛(idarubicin)、伐魯比辛(valrubicin));抗生素(例如,放線菌素(dactinomycin)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、安麯黴素(anthramycin)、鏈佐黴素(streptozotocin)、滅革蘭菌素D(gramicidin D)、絲裂黴素(mitomycin)(例如,絲裂黴素C(mitomycin C))、多卡米星(duocarmycin)(例如,CC-1065)、卡奇黴素(calicheamicin));抗有絲分裂劑(包括,例如,類美登素(maytansinoid)、奧裡斯他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、念珠藻素(cryptophycin)、長春花
生物鹼(vinca alkaloid)(例如,長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、紫杉烷(taxane)(例如,太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫衫醇(docetaxel)或新穎紫杉烷(例如,參見2001年5月31日公開之國際專利公開案第WO 01/38318號))及秋水仙鹼;拓撲異構酶抑制劑(例如,愛萊諾迪肯(irinotecan)、托泊替坎(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依妥普賽(etoposide)、坦尼坡賽(teniposide)、邁杜蔥酮(mitoxantrone));及蛋白酶體抑制劑(例如,肽基酸)。
在一些實施例中,治療劑係類美登素。類美登素化合物及用於將其偶聯至抗體之方法闡述於(例如)Chari等人,Cancer Res.,52:127-131(1992);Widdison等人,J.Med.Chem.49:4392-4408(2006);及美國專利第5,208,020號及第6,333,410號中。類美登素之實例包括具有經改質芳香族環之美登素(maytansine)類似物(例如,C-19-去氯、C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基)及彼等在其他位置具有改質者(例如,C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14-羥基甲基或醯氧基甲基、C-15-羥基/醯氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-去甲基、4,5-去氧)。在某些實施例中,類美登素係N2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)美登素DM3)、N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素DM1)或N2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)美登素DM4)。
可使用藉助硫醚或二硫連接連接至類美登素化合物之異質雙官能連接體將包含巰基之類美登素化合物偶合至抗體。在一些此等實施例中,將連接體偶合至抗體上之胺基(例如,末端胺基或離胺酸殘基之ε胺基。在一些實施例中,用於將類美登素化合物偶合至抗體之異質雙官能連接體係N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(亦稱為N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯或SPP)、4-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-琥珀醯亞胺基
4[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、2-亞胺基四氫噻吩或S-乙醯基琥珀酸酐。
在一些其他實施例中,治療劑係尾海兔素。在一些實施例中,治療劑係奧裡斯他汀,例如奧裡斯他汀E(業內亦稱作尾海兔素-10衍生物)或其衍生物。奧裡斯他汀化合物及用於將其偶聯至抗體之方法闡述於(例如)以下文獻及專利中:Doronina等人,Nature Biotech.,21:778-784(2003);Hamblett等人,Clin.Cancer Res.,10:7063-7070(2004);Carter及Senter,Cancer J.,14 154-169(2008);美國專利第7,498,298號、第7,091,186號、第6,884,869號、第6,323,315號、第6,239,104號、第6,034,065號、第5,780,588號、第5,665,860號、第5,663,149號、第5,635,483號、第5,599,902號、第5,554,725號、第5,530,097號、第5,521,284號、第5,504,191號、第5,410,024號、第5,138,036號、第5,076,973號、第4,986,988號、第4,978,744號、第4,879,278號、第4,816,444號及第4,486,414號;美國專利公開案第20090010945號、第20060074008號、第20080300192號、第20050009751號、第20050238649號及第20030083236號;及國際專利公開案第WO 04/010957號及第WO 02/088172號,該等文獻及專利中每一者之全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中。
奧裡斯他汀可為(例如)由奧裡斯他汀E與酮酸之間形成之酯。例如,可使奧裡斯他汀E與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應以分別產生AEB及AEVB。其他典型的奧裡斯他汀包括奧裡斯他汀苯丙胺酸苯二胺(AFP)、單甲基奧裡斯他汀E(MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F(MMAF)。
在一些實施例中,治療劑係放射性核種。可在輻射療法中用作毒素之放射性核種的實例包括:47Sc、67Cu、90Y、109Pd、123I、125I、
131I、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb及212B。彼等熟習此項技術者已使用之其他放射性核種包括:32P及33P、71Ge、77As、103Pb、105Rh、111Ag、119Sb、121Sn、131Cs、143Pr、161Tb、177Lu、191Os、193MPt、197Hg、所有β負發射體及/或鄂惹(auger)發射體。一些較佳放射性核種包括:90Y、131I、211At及212Pb/212Bi。
熟習此項技術者可使用熟知技術將抗-GCC抗體分子偶聯至放射性核種。例如,Magerstadt,M.(1991)Antibody Conjugates And Malignant Disease,CRC Press,Boca Raton,Fla.以及Barchel,S.W.及Rhodes,B.H.,(1983)Radioimaging and Radiotherapy,Elsevier,NY,N.Y.(該等文獻中之每一者皆以引用方式併入本文中)教示將各種治療及診斷放射性核種偶聯至抗體之胺基酸。可應用此等反應利用適當螯合劑及/或連接體將放射性核種偶聯至本發明抗-GCC抗體分子。
兔單株抗-GCC抗體係藉由若干方法產生,如實例中所更詳細論述。簡言之,兔單株抗體MIL-44-148-2及MIL-44-67-4係藉由傳統免疫技術在兔中產生。真正的兔-兔雜交瘤係由Epitomics(Burlingame,CA)藉由融合自經免疫兔分離之B細胞與Epitomics之專屬融合配偶體細胞系來產生(參見美國專利7,402,409、7,429,487、7,462,697、7,575,896、7,732,168及8,062,867)。抗體對GCC之特異性係藉由ELISA及流式細胞術(FCM)測試。
下表1匯總使用hGCC(ECD)/mIgG2a FcR-mutII免疫原產生之本發明兔單株抗-GCC抗體。
測定輕鏈及重鏈可變區之序列。下表2係若干抗體之可變區之SEQ ID NO之匯總。兔抗-GCC抗體各重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸及核酸序列分別示於表3及4中。
抗-GCC抗體之重鏈及輕鏈各CDR之胺基酸及核酸序列分別示於
表5及6中。
對CDR之定序允許測定可用作毒素偶聯位點之殘基之豐度。例如,抗原結合區中之未配對遊離半胱胺酸可為奧裡斯他汀偶聯用位點且離胺酸可為美坦辛偶聯用位點。毒素偶聯至CDR之胺基酸會提出對改變抗體與GCC之結合親和力之擔憂。因此,在實施例中,CDR缺乏可偶聯至治療劑之胺基酸。
MIL-44-148-2 H2核酸(SEQ ID NO:4)
MIL-44-148-2 H2胺基酸(SEQ ID NO:42)
MIL-44-148-2 L5核酸(SEQ ID NO:5)
MIL-44-148-2 L5胺基酸(SEQ ID NO:43)
MIL-44-67-4 H2核酸(SEQ ID NO:6)
MIL-44-67-4 H2胺基酸(SEQ ID NO:44)
MIL-44-67-4 L4核酸(SEQ ID NO:7)
MIL-44-67-4 L4胺基酸(SEQ ID NO:45)
本文所述兔單株抗-GCC抗體分子具有活體外及活體內效用。例如,可將該等抗體分子投與培養中(例如活體外或離體)之細胞,或投與個體中,例如,活體內,以治療及/或預防多種病症。在本發明治療應用之某些實施例中,使用一或多種本文上述技術將本發明之兔單株抗-GCC抗體分子人類化。
本文所述抗體分子、免疫偶聯物及融合蛋白可用於調節GCC蛋白質之活性或功能,例如配體結合(例如,結合ST或鳥苷蛋白)、GCC介導之信號轉導、維持腸液、電解質平衡、細胞內鈣釋放(鈣流)、細胞分化、細胞增殖或細胞活化。
在一個態樣中,本發明之特徵在於殺死表現GCC之細胞、抑制或調節其生長或干擾其代謝之方法。在一個實施例中,本發明提供抑制GCC介導之細胞信號傳導之方法或殺死細胞之方法。該方法可與任一表現GCC之細胞或組織(例如癌細胞)一起使用。表現GCC之癌細胞之實例包括(但不限於)來自以下之細胞:胃腸源癌症(例如,結腸直腸癌、胃癌、小腸癌或食道癌)、胰臟癌、肺癌(例如,鱗狀細胞癌、腺鱗癌、腺癌)、軟組織肉瘤(例如脂肪肉瘤或橫紋肌肉瘤)、胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤或神經外胚層腫瘤或其任何轉移性病灶。表現GCC之細胞之非限制性實例包括T84人類結腸腺癌細胞、新鮮或冷凍之結腸腫瘤細胞及包含編碼GCC之重組核酸或其一部分之細胞。
本發明方法包括使細胞與有效量(即,足以抑制GCC-介導細胞信號傳導之量或足以殺死該細胞之量)之本文所述抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物接觸之步驟。該方法可用於培養中(例如活體外、活體內、離體或原位)之細胞。例如,可在活體外在培養基中培養表現GCC之細胞(例如,藉由生檢腫瘤或轉移性病灶收集之細胞、來自已建立之癌細胞系之細胞或重組細胞),且可藉由將抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物添加至該培養基中來實現接觸步驟。在殺死細胞之方法中,該方法包含使用裸露抗-GCC抗體分子或包含抗-GCC抗體分子及細胞毒性劑之免疫偶聯物。該方法可殺死表現GCC之細胞,特定而言包括表現GCC之腫瘤細胞(例如,結腸腫瘤細胞)。
可使用彼等熟習此項技術者所熟知之免疫螢光顯微鏡檢查技術來測試本發明兔單株抗體或其人類化形式在結合至GCC後之細胞內在
化。此等經確認內在化之抗體當連接至用於治療目的之細胞毒性部分或用於細胞成像之部分時係有用的。未內在化之抗體仍可用於診斷目的或用於使用經設計以誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性反應之裸露抗體的治療方法或可能用於脂質體遞送方法。
本發明之抗-GCC抗體分子結合至GCC之細胞外結構域或其在表現該抗原之細胞中之部分。因此,當實踐本發明方法來殺死、阻抑或檢測癌細胞時,抗體或抗原結合片段不僅結合至經固定細胞或細胞內抗原結構域以其他方式暴露於細胞外環境之細胞,而且結合至所有此等細胞。因此,抗體或抗原結合片段之結合集中於存在表現GCC之細胞之區域中,不論該等細胞經固定抑或未經固定,是活的抑或壞死的。另外或另一選擇為,抗-GCC抗體分子在結合表現GCC之細胞後結合至該抗原並與其一起內在化。
亦可作為活體內方案之一部分對存在於個體中之細胞實施該方法。在一個實施例中,該個體係人類個體。另一選擇為,個體可為表現與本文所揭示抗-GCC抗體分子交叉反應之GCC抗原的哺乳動物。可向人類個體投與抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物用於治療目的。亦可向表現與該抗體交叉反應之GCC樣抗原之非人類哺乳動物(例如,靈長類動物、豬或小鼠)投與抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物用於獸醫目的或作為人類疾病之動物模型。動物模型可用於評估本發明抗體之治療功效(例如,測試投與劑量及時程)。對於活體內實施例而言,在個體中實現接觸步驟且包括在有效允許抗-GCC抗體分子與細胞上表現之GCC之細胞外結構域結合及對細胞進行處理二者的條件下向該個體投與該抗體分子或其免疫偶聯物。
在一個實施例中,本發明提供藉由向需要治療之患者投與抗-GCC抗體分子或包含抗-GCC抗體分子及細胞毒性劑之免疫偶聯物來治療癌症之方法。該方法可用於治療包括至少一些表現GCC抗原之細
胞之任一癌性病症。本文所用術語「癌症」意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官,不論侵襲性之組織病理類型或階段。術語「癌症」及「腫瘤」可互換使用(例如,當用於治療方法之背景下時,「治療癌症」及「治療腫瘤」具有相同意義)。
在實施例中,治療足以減慢或抑制個體腫瘤之生長,減少轉移性病灶之數量或大小,降低腫瘤載荷,降低原發性腫瘤載荷,降低侵襲性,延長存活時間或維持或改良生命品質。
癌性病症之實例包括(但不限於)實體腫瘤、軟組織腫瘤及轉移性病灶。實體腫瘤之實例包括各種器官系統之惡性腫瘤,例如,肉瘤、腺癌及癌,例如彼等影響結腸者。腺癌包括諸如非小細胞肺癌等惡性腫瘤。亦可使用本發明之方法及組合物來治療或預防上述癌症之轉移性病灶。
在一些實施例中,欲治療之表現GCC之癌症係原發性或轉移性胃腸源癌症,例如結腸直腸癌、胃癌、小腸癌或食道癌。在一些實施例中,欲治療之表現GCC之癌症係原發性或轉移性胰臟癌。在一些實施例中,欲治療之表現GCC之癌症係原發性或轉移性肺癌,例如鱗狀細胞癌、腺鱗癌或腺癌。在一些實施例中,欲治療之表現GCC之癌症係肉瘤,例如平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。在一些實施例中,欲治療之表現GCC之癌症係原發性或轉移性神經外胚層腫瘤,例如嗜鉻細胞瘤或副神經節瘤。在一些實施例中,表現GCC之癌症係原發性或轉移性枝氣管肺或胃腸神經內分泌腫瘤。
該方法可用於治療處於任一階段或亞分類之相關病症。例如,方法可用於治療早期或晚期結腸癌或階段0、I、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IIIC及IV中任一者之結腸癌。
在一些實施例中,治療表現GCC之癌症(例如,結腸直腸癌、胃
癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經內分泌腫瘤、神經外胚層腫瘤等)之方法包含向需要此治療之患者投與本文所述裸露的抗-GCC抗體分子。在其他實施例中,該方法包含投與包含本文所述抗-GCC抗體分子及細胞毒性劑(例如類美登素或奧裡斯他汀或其衍生物)之免疫偶聯物。投與抗體分子及免疫偶聯物之方法闡述於上文中。所用分子之適宜劑量將端視個體之年齡及重量以及所用特定化合物。
在一些實施例中,抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物係在治療週期中投與。「治療週期」由以下組成:治療期,在此期間如上文所述投與抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物;之後為停藥期,在此期間不投與抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物。可視需要重複治療週期以達成期望效應。
本文所述抗-GCC抗體(例如,裸露的抗-GCC抗體分子或包含抗-GCC抗體分子及治療劑之免疫偶聯物)可與其他療法組合使用。例如,組合療法可包括與一或多種其他治療劑共調配及/或共投與之本發明組合物,其他治療劑係(例如)一或多種抗癌劑,例如,細胞毒性劑或細胞生長抑制劑、激素治療、疫苗及/或其他免疫療法。在其他實施例中,抗-GCC抗體係與其他治療性治療方式組合投與,其他治療性治療方式包括手術、輻射、冷凍手術及/或溫熱療法。此等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑,由此避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。
本文所用「與......組合」投與意指在個體患病過程期間向個體遞送兩次(或更多次)不同治療,例如,在個體已診斷有病症後及在已治癒或消除該病症之前遞送兩次或更多次治療。在一些實施例中,當第二次遞送開始時,一次治療之遞送仍在進行,因此存在重疊。此在本文中有時稱作「同時」或「併行遞送」。在其他實施例中,在開始另
一治療之遞送前結束一次治療之遞送。在任一情形之一些實施例中,治療因組合投與而更為有效。例如,與在第一次治療不存在下投與第二次治療所觀察之效果相比,第二次治療更為有效,例如,利用更少第二次治療觀察到等效效應,或第二次治療更大程度地減少症狀,或利用第一次治療觀察到類似情況。在一些實施例中,遞送應使得症狀減少,或與病症有關之其他參數大於利用在另一治療不存在下遞送之一次治療所觀察到者。兩次治療之效應可為部分加性、完全加性或大於加性。遞送可使得在遞送第二治療時仍可檢測到所遞送第一次治療之效應。
在一些實施例中,抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物與化學治療劑組合使用。破壞DNA之化學治療劑之非限制性實例包括拓撲異構酶I抑制劑(例如,愛萊諾迪肯、托泊替坎、喜樹鹼及其類似物或代謝物及阿黴素);拓撲異構酶II抑制劑(例如,依妥普賽、坦尼坡賽及道諾黴素);烷基化劑(例如,美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、噻替派、異環磷醯胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀(semustine)、鏈脲菌素、達卡巴嗪、甲胺蝶呤、絲裂黴素C及環磷醯胺);DNA嵌入劑(例如,順鉑、奧沙利鉑及卡鉑);DNA嵌入劑及遊離基產生劑(例如博來黴素);及核苷模擬物(例如,5-氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱、氟達拉濱、阿糖胞苷、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁及羥基脲)。
破壞細胞複製之化學治療劑包括:太平洋紫杉醇、歐洲紫衫醇及有關類似物;長春新鹼、長春鹼及有關類似物;沙利竇邁(thalidomide)、雷利度胺(lenalidomide)及有關類似物(例如,CC-5013及CC-4047);蛋白質酪胺酸激酶抑制劑(例如,甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)及艾瑞莎(gefitinib));蛋白酶體抑制劑(例如,硼替佐米(bortezomib));NF-κB抑制劑,包括IκB激酶抑制劑;結合至在癌症中過表現之蛋白質且藉此下調細胞複製之抗體(例如,曲妥珠單抗
(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)及貝伐單抗(bevacizumab));及已知在癌症中上調、過表現或活化之蛋白質或酶之其他抑制劑,該等蛋白質或酶之抑制下調細胞複製。
欲與本發明抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物組合之治療劑或治療方式之選擇將端視欲治療之病症而定。其他藥劑或治療方式可包括(例如)用於所治療適應症之標準批準療法。例如,當抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物用於治療結腸癌時,其可與(例如)以下組合使用:手術;輻射療法;5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱、甲醯四氫葉酸、愛萊諾迪肯、奧沙利鉑、貝伐單抗、西妥昔單抗、帕木單抗(panitumum)其或組合(例如,奧沙利鉑/卡培他濱(XELOX)、5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸/-奧沙利鉑(FOLFOX)、5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸/愛萊諾迪肯(FOLFIRI)、FOLFOX+貝伐單抗或FOLFIRI+貝伐單抗)。
在另一態樣中,本發明之特徵在於本文所述抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物在製造藥劑中之應用。在實施例中,該藥劑用於治療癌症,例如,胃腸癌。在一些實施例中,該藥劑包含具有匯總於表1-6中之特徵之抗-GCC抗體分子。在一些實施例中,該藥劑包含MIL-44-148-2或MIL-44-67-4抗體分子或其人類化形式。
用於本文所述方法(例如,在活體外及活體內檢測中,例如,診斷、分期或成像法)中之抗-GCC抗體分子可經可檢測物質直接或間接標記以促進經結合或未結合之結合劑之檢測。適宜的可檢測物質包括各種生物活性酶、配體、輔基、螢光材料、發光材料、化學發光材料、生物發光材料、發色材料、電子緻密材料、順磁性(例如,核磁共振活性)材料及放射性材料。在一些實施例中,將抗-GCC抗體分子偶合至放射性離子,例如,銦(111In)、碘(131I或125I)、釔(90Y)、鑥(177Lu)、錒(225Ac)、鉍(212Bi或213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、銠
(188Rh)、鍀(99mTc)、鐠或磷(32P);或發射正子之放射性核種,例如,碳-11(11C)、鉀-40(40K)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)、鎵(68Ga)及碘-121(121I)。可偶聯至本發明抗體用於活體外或活體內診斷/檢測方法中之其他放射性試劑闡述於下文中。
實例性標記包括螢光團,例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物、玫瑰紅及其衍生物、丹醯基、繖形酮、螢光素酶(例如,螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素及2,3-二氫酞嗪二酮。其他實例性標記包括辣根過氧化物酶(HRP);鹼性磷酸酶;半乳糖苷酶;葡萄糖澱粉酶;溶菌酶;糖氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖6-磷酸脫氫酶;雜環氧化酶,例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶,其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合;生物素/抗生物素蛋白;自旋標記;噬菌體標記;穩定自由基及諸如此類。
經螢光團及發色團標記之抗體分子可自業內已知之標準部分製備。由於抗體及其他蛋白質吸收波長至多約310nm之光,因此螢光部分應經選擇以在高於310nm且較佳高於400nm之波長下具有顯著吸收。Stryer Science,162:526(1968)及Brand,L.等人Annual Review of Biochemistry,41:843-868(1972)闡述了多種適宜的螢光化合物及發色團。可藉由習用程序(例如彼等揭示於美國專利第3,940,475號、第4,289,747號及第4,376,110號中者)用螢光發色團基團標記抗體。
一群具有諸多上述合意性質之螢光劑係喔染料,其包括衍生自3,6-二羥基-9-苯基醇及瑞薩胺(resamine)之螢光素以及衍生自3,6-二胺基-9-苯基醇及麗絲胺(lissanime)玫瑰紅B之玫瑰紅。9-鄰-羧基苯基醇之玫瑰紅及螢光黃衍生物具有9-鄰-羧基苯基。可容易地獲得具有諸如胺基及異硫氰酸酯基團等反應性偶合基團之螢光黃化合物,例如螢光黃異硫氰酸酯及螢哢明(fluorescamine)。另一群螢光化
合物係在α或β位置具有胺基之萘胺。
可在諸多背景下(例如)以診斷及/或實驗方式使用經標記抗體分子,包括(i)藉由諸如親和力層析或免疫沈澱等標準技術來分離預定抗原;(ii)檢測預定抗原(例如,細胞溶解物或細胞上清液中),以評估蛋白質表現之豐度及模式;(iii)監測組織中之蛋白質含量作為臨床測試程序之部分,例如,以測定給定治療方案之功效。
本文所述抗-GCC抗體及免疫偶聯物可用於檢測GCC之存在或不存在,例如,檢測自個體獲得之離體生物試樣中GCC之存在或不存在(即,活體外檢測),或檢測個體中GCC之存在或分佈或不存在(即,活體內檢測)。此等檢測方法可用於檢測或診斷多種病症,或指導治療決定。本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。本文所用檢測GCC或GCC蛋白質意指檢測完整GCC蛋白質或檢測一部分包含與抗-GCC抗體分子結合之表位之GCC蛋白質。
因此,在另一態樣中,本發明之特徵在於檢測生物試樣(例如具有一或多個表現GCC之細胞之細胞或組織,例如,腫瘤細胞或腫瘤)中之GCC表現之方法。該方法包含:在允許在抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質之間形成複合物之條件下使生物試樣與本文所述抗-GCC抗體分子(例如,MIL-44-148-2或MIL-44-67-4)接觸;及檢測抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質之間之複合物之形成,以藉此檢測GCC蛋白質之存在,例如,檢測表現GCC之細胞或腫瘤。
在實施例中,抗-GCC抗體分子係包含可檢測標記之免疫偶聯物。可檢測標記可為放射性試劑。另一選擇為,可檢測標記係非放射性試劑(例如上述螢光團或發色團)。
在某些實施例中,生物試樣包括表現GCC之正常及/或癌細胞或組織。表現GCC之正常細胞或組織之實例包括(但不限於)胃腸源細胞
或組織,尤其正常結腸直腸細胞或組織。表現GCC之癌細胞或組織之實例包括(但不限於):胃腸源癌症,例如結腸直腸癌、胃癌、小腸癌及食道癌;胰臟癌;肺癌,例如鱗狀細胞癌、腺鱗癌及腺癌;軟組織肉瘤,例如平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤;胃腸及枝氣管肺神經內分泌腫瘤;及神經外胚層腫瘤。在特定實施例中,正常及/或癌細胞組織可相對於其他組織(例如諸如B細胞及/或B細胞相關組織等其他組織)以更高量表現GCC。
本文所述活體外抑或活體內檢測方法可用於評估個體之病症。在某些實施例中,病症係細胞增殖性病症,例如癌症或腫瘤,例如,結腸直腸癌、胃癌或胰臟癌。
在一個態樣中,本發明提供檢測活體外生物試樣(例如,在自個體獲得之細胞或組織生物檢體)中GCC蛋白質之存在或不存在的方法。該方法包含:(i)使自個體獲得之生物試樣與抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物接觸及(ii)檢測抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質之間之複合物之形成。複合物形成指示生物試樣中GCC蛋白質之存在或含量,而無複合物形成指示生物試樣中GCC蛋白質之不存在。
用於本文所述方法之實例性生物試樣包含一個細胞、多個細胞、組織或體液,例如發炎性滲出物、血液、血清、腸液、糞便試樣。在特定實施例中,生物試樣包含癌細胞或組織。例如,試樣可為腫瘤生物檢體,例如,結腸直腸腫瘤、胃腫瘤、食道腫瘤、小腸腫瘤、肺腫瘤、軟組織肉瘤、神經內分泌腫瘤、神經外胚層腫瘤或來自其任何轉移性部位之組織試樣之生物檢體。在其他實施例中,生物試樣可血液或另一流體,其中該流體包含癌細胞。可使用諸多業內方法中之任一者獲得生物試樣。此外,可用諸如甲醛等固定劑處理生物試樣且將其包埋在石蠟中並實施切片以供使用。另一選擇為,可採用新鮮或冷凍組織。在其他實施例中,可使用細針抽出物。
在某些實施例中,自懷疑患有與GCC表現相關之病症之個體獲得測試細胞或組織。在某些實施例中,自懷疑患有以下病症之個體獲得測試細胞或組織:與除腸上皮細胞之頂表面以外之位置中之GCC表現相關(例如,腸上皮細胞中之細胞質GCC表現)之病症或與非腸細胞或組織(例如胰臟、肺、軟組織或神經內分泌或神經外胚層源組織)中之GCC表現相關之病症。在某些實施例中,自懷疑患有與GCC表現增加相關之病症之個體獲得測試細胞或組織。
在實施例中,比較來自個體之試樣中或個體中之GCC含量與參照含量,例如,對照材料(例如,與個體細胞具有相同組織源的正常細胞或GCC含量與此一正常細胞相當之細胞)中之GCC含量。該方法可包含(例如)因應所檢測GCC含量,提供對病症之診斷、預後、治療功效之評估或分期。試樣或個體中之GCC含量高於對照材料指示與GCC表現增加相關之病症之存在。試樣或個體中之GCC含量高於對照材料亦可指示對疾病之治療功效相對缺乏、預後相對較差或疾病階段較晚。GCC之含量亦可用於評估或選擇以後治療,例如,對侵襲性較大或較小治療之需要或自一種治療方案轉換為另一種治療方案之需要。在一些實施例中,該等方法進一步包含至少部分地基於所測定GCC含量選擇GCC-標靶治療(例如,本文所述GCC標靶治療)及視情況向個體投與所選GCC標靶治療。
抗-GCC抗體分子與GCC之間之複合物形成可藉由量測結合至GCC抗原之抗體(或抗體片段)或未結合之抗體分子或使其顯現來檢測。熟習此項技術者可容易地瞭解眾多檢測抗-GCC抗體與GCC之結合之方式。此等方法包括(但不限於)業內已知之抗原結合分析,例如西方墨點(western blot)、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析及免疫組織化學(IHC)。
在特定實施例中,藉由免疫組織化學使用本發明抗-GCC抗體來檢測或量測GCC。免疫組織化學技術可用於鑑別表現GCC之細胞並基本上將其染色。此「染色」允許分析轉移性遷移。使抗-GCC抗體(例如彼等本文所述者)與經固定細胞接觸並使存在於該等細胞中之GCC與該等抗體反應。使用經標記第二抗體或蛋白質A將細胞染色以可檢測方式標記或檢測該等抗體。在一個特定實施例中,在IHC分析中使用MIL-44-148-2抗體來檢測或量測生物試樣中之GCC表現。
可使用其他習用檢測分析,例如,西方墨點、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析及免疫組織化學(IHC)或放射免疫分析(RIA)。
作為標記抗-GCC抗體分子之替代方式,可藉由競爭免疫分析利用經可檢測物質標記之標準物及未經標記之抗-GCC抗體分子分析試樣中GCC之存在。在此分析中,將生物試樣、經標記標準物及GCC結合劑組合並測定結合至未經標記抗體之經標記標準物之量。試樣中GCC之量與結合至GCC結合劑之經標記標準物之量成反正。
亦可藉由(例如)利用螢光能量轉移技術(FET,例如,參見Lakowicz等人,美國專利第5,631,169號;Stavrianopoulos等人,美國專利第4,868,103號)直接檢測GCC-抗-GCC抗體分子複合物形成,而不進一步操縱或標記組份(GCC或抗體分子)。第一「供體」分子上之螢光團標記經選擇以使得,在經適當波長之入射光激發後,其所發射螢光能量將被第二「受體」分子上之螢光標記吸收,該第二「受體」分子上之螢光標記進而因所吸收能量而能夠發螢光。另一選擇為,「供體」蛋白質分子可僅僅利用色胺酸殘基之天然螢光能量。選擇發射不同波長光之標記,以使得可區別「受體」分子標記與「供體」分子標記。由於標記間之能量轉移效率與分隔分子之距離有關,因此可
評價分子間之空間關係。在分子之間發生結合之情況下,分析中受體」分子標記之螢光發射應當最大。FET結合事件可經由業內熟知之標準螢光檢測手段(例如,使用螢光計)便利地量測。
在另一實例中,對抗體分子識別GCC之能力之測定可不標記任一分析組份(GCC或抗體分子)藉由利用諸如即時生物分子交互作用分析(BIA)等技術來達成(例如,參見Sjolander,S及Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345及Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。本文所用「BIA」或「表面電漿共振」係用於不標記任一交互作用物即時研究生物特異性交互作用之技術(例如,BIACORETM)。結合表面質量變化(指示結合事件)導致靠近表面之光之折射率改變(表面電漿共振(SPR)之光學現象),從而產生可用作生物分子間之即時反應之指示的可檢測信號。
在一些態樣中,本發明之特徵在於包括本文所述抗體分子(例如,包括本文所述抗體分子及例如標記之免疫偶聯物)及生物試樣(例如,本文所述生物試樣)之反應混合物。在其他實施例中,反應混合物可包括本文所述抗體分子(例如,包括本文所述抗體分子及例如標記之免疫偶聯物)及自生物試樣(例如,本文所述生物試樣)獲得之GCC。
在某些實施例中,方法(例如彼等上述者)包含檢測抗-GCC抗體與細胞表面上或自表面上表現GCC之細胞獲得之膜製劑中表現之GCC的結合。在某些實施例中,該方法包含在允許抗-GCC抗體結合至GCC之條件下使細胞與抗-GCC抗體接觸及檢測抗-GCC抗體與細胞表面上之GCC之間是否形成複合物。用於檢測抗-GCC抗體與細胞表面上表現之GCC之結合的實例性分析係「FACS」分析。
在再一實施例中,本發明提供活體內檢測表現GCC之細胞或組織
之存在或不存在之方法。該方法包括(i)向個體(例如,患有癌症之患者)投與本發明之抗-GCC抗體分子(即,MIL-44-148-2或MIL-44-67-4)或其抗原結合片段、較佳偶聯至可檢測標記或標記物之抗體或其抗原結合片段;(ii)使該個體暴露於用於檢測結合至表現GCC之組織或細胞之該可檢測標記或標記物的工具。此等活體內方法可用於罹患諸如癌症等病症之患者的評估、診斷、分期及/或預後。該方法包含:(i)向個體投與抗-GCC抗體分子或其免疫偶聯物;及(ii)檢測抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質之間之複合物之形成。複合物形成指示個體中GCC之存在或含量,而無複合物形成指示個體中GCC之不存在。
可將此等個體診斷為罹患表現GCC之轉移性癌症且表現GCC之轉移性癌細胞可藉由以下步驟來檢測:較佳藉由靜脈內投與向該個體投與包含醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及包含抗-GCC抗體分子及活性部分(其中該活性部分係放射性試劑)之偶聯化合物之醫藥組合物,及檢測指示表現GCC之細胞之存在的局部放射性累積或聚集之存在。在本發明之一些實施例中,醫藥組合物包含醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及包含抗-GCC抗體分子及活性部分之偶聯化合物,其中該活性部分係放射性試劑且該抗-GCC抗體分子係本文所述MIL-44-148-2抗體其或片段或衍生物。
在一個實施例中,放射性核種可偶聯至本發明抗-GCC抗體分子以供在活體內成像程序中用作成像劑。成像劑係可用診斷程序以及用於鑑別轉移性細胞之位置之程序。例如,可將個體診斷為罹患轉移性結腸直腸癌且轉移性結腸直腸癌可藉由以下步驟來檢測:較佳藉由靜脈內投與向該個體投與包含醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及包含本發明抗-GCC抗體分子及活性部分(其中該活性部分係放射性核種)之偶聯化合物之醫藥組合物,及檢測指示表現GCC之細胞之存在的局部放射性累積或聚集之存在。
可藉由彼等熟習此項技術者所熟知之許多程序來實施成像且可藉由熟知手段將可用於此等程序中之適當成像劑偶聯至本發明抗-GCC抗體分子。可用於本發明診斷成像之標記之實例係放射性標記,例如32P、3H、14C、188Rh、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、99Tc、111In、113M In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb及206Bi及213Bi;螢光標記,例如螢光黃及玫瑰紅;核磁共振活性標記;氧、氮、鐵、碳或鎵之發射正子之同位素(例如,68Ga、18F),其可藉由單光子發射電腦斷層掃描(「SPECT」)檢測器或正子發射斷層掃描(「PET」)掃描儀檢測;化學發光體,例如螢光素;及酶標記物,例如過氧化物酶或磷酸酶。亦可採用短程輻射發射體,例如可藉由短程檢測器探針(例如經直腸探針)檢測之同位素。亦可藉由(例如)放射性閃爍攝影術、核磁共振成像(MRI)或電腦斷層掃描(CT掃描)來實施成像。藉由CT掃描成像可採用重金屬,例如鐵螯合物。MRI掃描可採用釓或錳之螯合物。
可使用業內已知技術用此等試劑標記抗體。例如,Magerstadt,M.(1991)Antibody Conjugatess And Malignant Disease,CRC Press,Boca Raton,Fla.;及Barchel,S.W.及Rhodes,B.H.,(1983)Radioimaging and Radiotherapy,Elsevier,NY,N.Y.(該等文獻中每一者皆以引用方式併入本文中)教示將各種治療及診斷放射性核種偶聯至抗體之胺基酸。可應用此等反應利用適當螯合劑及/或連接體將放射性核種偶聯至本發明抗-GCC抗體分子。關於與放射性標記抗體有關之技術,亦參見Wensel及Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,N.Y。亦參見D.Colcher等人Meth.Enzymol.121:802-816(1986)。
在經放射性標記之抗體之情形下,向患者投與該抗體,將其定位至帶有與該抗體反應之抗原之腫瘤,並使用已知技術(例如放射性
核掃描)利用(例如)γ照相機或發射斷層掃描或電腦斷層掃描進行活體內檢測或「成像」。例如,參見A.R.Bradwell等人,「Developments in Antibody Imaging」,Monoclonal for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin等人(編碼),第65-85頁(Academic Press 1985)。另一選擇為,可使用正子發射經軸斷層掃描儀,例如位於Brookhaven National Laboratory之指定Pet VI,其中放射性標記發射正子(例如,11C、18F、15O及13N、68Ga)。
在其他實施例中,本發明提供測定當向個體(例如,人類個體)投與偶聯至放射性同位素之抗-GCC抗體分子時不同組織所暴露之劑量(例如,輻射劑量)之方法。該方法包括:(i)向個體投與本文所述抗-GCC抗體分子,例如,經放射性同位素標記之抗-GCC抗體分子;(ii)於不同時間點量測定位於不同組織(例如,腫瘤或血液)中之放射性同位素之量,直至一些或全部放射性同位素已自個體之機體消除;及(iii)計算所分析各組織接受之總輻射劑量。可在向個體投與(第0天)放射性標記之抗-GCC抗體分子後於計劃時間點(例如,第1天、第2天、第3天、第5天、第7天及第12天)進行量測。可利用存於給定組織中之放射性同位素之濃度對時間進行積分且乘以放射性同位素之比活性來計算給定組織接受之劑量。可利用使用經一種放射性同位素(例如,γ-發射體,例如,111In)標記之抗-GCC抗體分子產生之藥理學資訊來計算相同組織可自不能容易地量測之不同放射性同位素(例如,β-發射體,例如,90Y)接受的預計劑量。
本文所述活體外及活體內診斷方法可用於分別基於患者細胞或組織之表面上或在其內部之GCC表現之存在或不存在,告知罹患諸如癌症等增殖性疾病或諸如發炎性腸症候群、克隆氏病或便秘等胃腸病症之患者是否應當用GCC標靶治療來治療。具有一或多個在細胞表面
上或細胞內表現GCC之細胞之患者係用GCC標靶治療來治療之候選者。
在某些態樣中,本發明提供測定懷疑罹患表現GCC之疾病或病症之患者對GCC標靶治療之敏感性的方法,其包含以下步驟:(i)使自個體獲得之生物試樣與本發明抗-GCC抗體分子接觸;(ii)檢測抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質間之複合物之形成;其中複合物形成指示生物試樣中GCC蛋白質之存在或含量,而無複合物形成指示生物試樣中GCC蛋白質之不存在,藉此測定患者對GCC標靶治療之敏感性。在特定實施例中,經由免疫組織化學使用本文所述抗體分子(例如,本文所述MIL-44-1482抗體)檢測抗-GCC抗體分子與生物試樣中GCC蛋白質之間之複合物形成。
實例性生物試樣包含一個細胞、多個細胞、組織或體液,例如發炎性滲出物、血液、血清、腸液、糞便試樣。在特定實施例中,生物試樣包含癌細胞或組織。例如,試樣可為腫瘤生物檢體,例如,結腸直腸腫瘤、胃腫瘤、食道腫瘤、小腸腫瘤、肺腫瘤、軟組織肉瘤、神經內分泌腫瘤、神經外胚層腫瘤或來自其任何轉移性部位之組織試樣之生物檢體。在其他實施例中,生物試樣可為血液或另一流體,其中該流體包含癌細胞。可使用諸多業內方法中之任一者獲得生物試樣。此外,可用諸如甲醛等固定劑處理生物試樣且將其包埋在石蠟中並實施切片以供使用。另一選擇為,可採用新鮮或冷凍組織。在其他實施例中,可使用細針抽出物。
可使用本文所述伴隨診斷方法評估(例如,診斷)及治療之實例性疾病/病症包括(但不限於)增殖性病症,包括(但不限於)結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌(例如,鱗狀細胞癌、腺鱗癌、腺癌)、軟組織肉瘤(例如平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤)、胃腸及枝氣管肺神經內分泌腫瘤及神經外胚層腫瘤;胃腸病症,例如發炎性腸症
候群、克隆氏病及便秘;及神經病症,例如帕金森氏病。
本發明方法指導醫師對測定是否用GCC標靶治療來治療患者作出決定。本文所提供方法亦允許利用(例如)本文所述GCC標靶治療產生個人化治療報告,例如,個人化癌症治療報告。
GCC標靶治療係治療或預防表現GCC之疾病或GCC介導之疾病(例如,本文所述表現GCC之疾病或GCC介導之疾病)之治療劑。在本發明之某些態樣中,GCC標靶治療係偶聯至諸如治療劑等藥劑之GCC-配體,例如抗-GCC抗體分子或肽配體(例如,ST肽)。偶聯至治療劑之實例性GCC-配體(即,免疫偶聯物)闡述於(例如)美國已公開專利申請案第20110110936號中,該案件之全部內容以引用方式併入本文中。在特定實施例中,GCC標靶治療劑係偶聯至細胞毒性劑之抗-GCC人類IgG1單株抗體,其中mAb包括列示於下表7(胺基酸序列)及8(對應核酸序列)中之具有三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)之輕鏈可變區(VL)及具有三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)之重鏈可變區(VH),以及列示於下表9(胺基酸序列)及10(對應核酸序列)中之重鏈可變區及輕鏈可變區。
表10:mAb可變區之核酸序列
下文列示含有表7及8中所示VL CDR及VH CDR以及表9及10中所示可變重鏈及輕鏈區的完全hIgG1重鏈及hκ輕鏈序列之胺基酸及對應核酸序列:
hIgG1重鏈核苷酸序列為:
(SEQ ID NO:83)。
hIgG1重鏈蛋白質序列為:
(SEQ ID No:84)。
κ輕鏈核苷酸序列為:
(SEQ ID NO:85)。
hκ輕鏈蛋白質序列為:
(SEQ ID NO:86)。
在本發明之一個特定態樣中,GCC標靶治療係具有抗-GCC抗體分子偶聯至奧裡斯他汀分子之免疫偶聯物。在一個實施例中,免疫偶聯物包含偶聯至奧裡斯他汀分子之包括三個重鏈(VH)CDR(SEQ ID NO:67、68及69)以及三個輕鏈(VL)CDR區(SEQ ID NO:70、71及72)之抗-GCC抗體分子。在另一實施例中,免疫偶聯物包含偶聯至奧裡斯他汀分子之包括重鏈可變區SEQ ID NO:79及輕鏈可變區SEQ ID NO:80之抗-GCC抗體分子。在再一實施例中,免疫偶聯物包含偶聯至奧裡斯他汀分子之分別包括重鏈及輕鏈可變區SEQ ID NO 79及80之抗-GCC抗體分子。
在一些實施例中,藉助含有馬來醯亞胺部分(例如,馬來醯亞胺基己醯基部分)之連接體將奧裡斯他汀分子連接至抗-GCC抗體分子上之半胱胺酸部分。
在一些實施例中,使用連接至奧裡斯他汀分子上之羥基之異質雙官能連接體將奧裡斯他汀分子偶合至抗-GCC抗體分子。在一些此等實施例中,連接體包含腙。在一些實施例中,連接體係藉由馬來醯亞胺基己醯基醯肼與酮羧酸(例如,5-苯甲醯基戊酸)之反應形成之腙化合物。在特定實施例中,連接體係(Z)-6-(2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)亞肼基)-6-苯基己酸。
在一些其他實施例中,使用連接至奧裡斯他汀分子上之單甲基胺基之異質雙官能連接體將奧裡斯他汀分子偶合至抗-GCC抗體分子。在一些實施例中,連接體包含可裂解部分(例如,肽部分)及自脫落(self-immolative)對-胺基苯甲基胺基甲酸酯間隔體。實例性連接體包括馬來醯亞胺基己醯基(mc)、馬來醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯及馬來醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc)。
在某些實施例中,GCC標靶治療係特徵在於以下各式之免疫偶聯物:Ab-(vc-MMAF) m (式( I-4 ))、Ab-(vc-MMAE) m (式( I-5 ))、Ab-(mc-MMAE) m (式( I-6 ))或Ab-(mc-MMAF) m (式( I-7 )),其中Ab係包括諸如表7、8、9或10中任一者中所述特徵等特徵的抗-GCC抗體分子,S係抗體之硫原子,且m在約1至約15範圍內。在某些實施例中,m係1至約5之整數。
在一些實施例中,式( I-4 )、( I-5 )、( I-6 )或( I-7 )中之變量m在約2至約10、約6至約8、約4至約6、約3至約5或約1至約3範圍內。
在某些特定實施例中,標靶GCC治療係式( I-4 )、( I-5 )、( I-6 )或( I-7 )之免疫偶聯物,其中Ab係包括三個重鏈(VH)CDR(SEQ ID NO:67、68及69)及三個輕鏈(VL)CDR區(SEQ ID NO:70、71及72)之抗體分子,且m係約3至約5(例如,約4)。在某些態樣中,分別包括重鏈CDR(SEQ ID NO:67、68及69)以及三個輕鏈CDR(SEQ ID NO:70、71及72)之Ab係人類單株抗體、較佳人類IgG1抗體。
在其他特定實施例中,GCC標靶治療係式( I-4 )、( I-5 )、( I-6 )或( I-7 )之免疫偶聯物,其中Ab係包括重鏈可變區SEQ ID NO:79及輕鏈可變區SEQ ID NO:80之單株抗體分子,且m係約3至約5(例如,約4)。在某些態樣中,分別包括重鏈及輕鏈可變區(SEQ ID NO79及80)之Ab係人類單株抗體、較佳人類IgG1抗體。
在其他某些實施例中,GCC標靶治療係式( I-4 )、( I-5 )、( I-6 )或( I-7 )之免疫偶聯物,其中Ab係包括重鏈IgG1序列SEQ ID NO:84及κ輕鏈
序列SEQ ID NO:86之人類IgG單株抗體分子,且m係約3至約5(例如,約4)。
在再一實施例中,GCC標靶治療係能夠穿過血腦障壁之GCC-配體偶聯物。例如,在某些態樣中,本發明係關於能夠穿過血腦障壁的偶聯至諸如L-多巴等神經保護劑之GCC-配體。此等GCC-配體偶聯物之實例闡述於已公開PCT申請案WO2013/016662中,其全部內容以引用方式併入本文中。在本發明實施例中,罹患或懷疑患有表現GCC之神經元之神經病症(例如,帕金森氏病)的患者可視為用偶聯至神經保護劑之GCC-配體治療的良好候選者。
在本發明之一些態樣中,GCC標靶治療係GCC拮抗劑。在一個實施例中,GCC標靶治療係GCC之肽拮抗劑(例如,ST肽)或小分子抑制劑。
在一些態樣中,GCC標靶治療係GCC激動劑。在一個實施例中,GCC激動劑係ST肽。在特定實施例中,GCC激動劑係包含以下胺基酸序列之ST肽:H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH(SEQ ID NO:87),其中在Cys1與Cys6之間、Cys2與Cys10之間及Cys5與Cys13之間存在3個二硫鍵。在特定實施例中,GCC激動劑係結合GCC之肽激動劑,例如利那洛肽(Linaclotide)(Ironwood Pharmaceuticals)。
在本發明之某些實施例中,腫瘤細胞在其表面上表現GCC之患者可視為用毒素-偶聯抗-GCC抗體分子(例如本文所述免疫偶聯物或美國已公開專利申請案第20110110936號中所述之毒素-偶聯抗體)治療之良好候選者,該案件之全部內容以引用方式併入本文中。不欲受任一理論限制,腫瘤細胞在其表面上表現低量GCC之患者可能不為此治療之良好候選者或可為組合GCC標靶治療與其他治療方法之候選者或為裸露抗體治療之候選者。在另一實例中,GCC標靶治療之劑量可經調
節以反映腫瘤細胞表面上表現之GCC分子之數量。例如,與腫瘤細胞表面上表現之GCC分子數較低之患者相比,可用更低劑量之GCC標靶治療來治療腫瘤細胞表面上具有大量GCC分子之患者。活體內檢測表現GCC之腫瘤細胞之存在可允許鑑別其中已轉移有表現GCC之原發性腫瘤之組織。瞭解哪些組織已轉移可有助於標靶應用腫瘤治療。
如上文所論述,本文所述抗體分子允許評價正常組織與腫瘤組織中GCC蛋白質之存在,藉此可評價疾病之存在或嚴重程度、疾病惡化及/或治療功效。例如,可監測治療並評價功效。在一個實例中,可檢測及/或量測自患有增殖性疾病之個體獲得之第一試樣中之GCC蛋白質且可起始治療。稍後,可自該個體獲得第二試樣且可檢測及/或量測該試樣中之GCC蛋白質。第二試樣中檢測或量測之GCC蛋白質量降低可指示治療功效。
不欲受任一理論限制,GCC標靶治療到達表現GCC之腫瘤可能需要血管形成,尤其在GCC標靶治療係經靜脈內投與之情況下。因此,在本發明方法之某些實施例中,評估或表徵腫瘤血管系統並對GCC蛋白質進行檢測或結合對GCC蛋白質之檢測評估或表徵腫瘤血管系統可能有用。例如,可用鑑別血管內皮細胞之試劑(例如抗-CD-31抗體或抗-馮威裏(von Willebrand)因子抗體分子及本發明抗-GCC抗體)將組織試樣染色以同時(simultaneously或contemporaneously)表徵GCC表現及組織血管形成。在本發明之某些態樣中,此對GCC表現及血管系統之同時表徵可作為患者選擇工具用於標靶-標靶治療。
在另一態樣中,GCC標靶治療可能需要GCC之細胞表面表現以影響對表現GCC之腫瘤細胞之殺傷。例如,一些腫瘤細胞可表現GCC,但並非在細胞表面上。若治療端視細胞表面GCC表現而定,則此一治療可能並不能殺死GCC主要在細胞內之細胞。因此,在本發明之一些實施例中,診斷或預後分析可進一步包括對GCC之細胞位置之分析及
/或定量,例如,可區別細胞表面表現與細胞內表現及/或對其進行定量之方法。不欲受任一理論限制,腫瘤主要具有細胞內GCC表現之患者可能並非結合至GCC之細胞外結構域之抗-GCC抗體分子之良好候選者。另一選擇為,此一分析結果可提示首先用誘導GCC之細胞表面表現之藥劑進行治療(例如,參見PCT公開案第WO04/071436號)。在進行GCC細胞表面誘導後或結合該誘導,可投與已到達或僅結合至在細胞外表現之GCC的抗-GCC抗體分子。
包含本文所述抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物之套組亦在本發明範圍內。進一步包括包含含有抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物之脂質體組合物之套組。套組可包括一或多個其他要素,包括:使用說明書;其他試劑,例如,標記、治療劑或可用於螯合或以其他方式偶合之試劑、結合至標記或治療劑之抗體或放射性保護組合物;用於製備投與用抗體之裝置或其他材料;醫藥上可接受之載劑;及用於投與個體之裝置或其他材料。使用說明書可包括關於以下之說明書:診斷應用抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物以在活體外(例如,在試樣中,例如,來自患有癌症之患者之生物檢體或細胞)或活體內檢測GCC。該等說明書可包括治療應用指導,包括所建議之投與劑量及/或方式,例如,在癌症(例如,胃腸源癌症,例如結腸癌、胃癌、食道癌)患者中。其他說明書可包括關於將抗體偶合至螯合劑、標記或治療劑或關於自(例如)未反應偶聯組份純化偶聯抗體的說明書。如上文所論述,套組可包括標記,例如,任一本文所述標記。如上文所論述,套組可包括治療劑,例如,本文所述治療劑。在一些應用中,抗體將與其他組份(例如,螯合劑或標記或治療劑,例如,放射性同位素,例如,釔或鑥)反應。在此等情形下,套組可包括一或多個用以實施反應之反應容器或用於自起始材料或反應中間體分離成品之分離裝置(例
如,層析管柱)。
套組可進一步含有至少一種其他試劑,例如診斷或治療劑,例如,本文所述診斷或治療劑;及/或一或多種其他抗-GCC抗體分子或免疫偶聯物,其視需要以一或多個單獨醫藥製劑調配。
套組可進一步含有放射保護劑。已知同位素(例如,90釔(90Y))之放射分解性質。為克服此放射分解,例如,在反應緩衝液中可包括放射保護劑,只要此等放射保護劑係良性的,此意味著其不會抑制或以其他方式不利地影響(例如)諸如90Y等同位素與抗體之標記反應。本發明調配物緩衝液可包括將因釔或其他強放射性核種所致之放射分解降至最低之放射保護劑,例如人類血清白蛋白(HSA)或抗壞血酸鹽。其他放射保護劑為業內已知且亦可用於本發明調配物緩衝液中,即,自由基清除劑(酚、亞硫酸鹽、麩胱甘肽、半胱胺酸、龍膽酸、菸酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、HOP(:O)H2I甘油、次硫酸甲醛鈉、Na2S2O、Na2S2O3及SO2等)。
所提供套組係可用於以下目的者:利用治療性放射性同位素對螯合劑偶聯蛋白質或肽進行放射性標記以供投與患者。套組包括(i)含有螯合劑偶聯抗體之小瓶,(ii)含有用於穩定經放射性標記之抗體及向患者投與該抗體之調配物緩衝液之小瓶,及(iii)關於實施放射性標記程序之說明書。套組使螯合劑偶聯抗體在溫和條件(例如,如說明書中所推薦)下於放射性同位素或其鹽下暴露足夠長時間。產生具有足夠純度、比活性及結合特異性之經放射性標記之抗體。可將經放射性標記之抗體在(例如)調配緩衝液中稀釋至適當濃度,且直接投與患者,而進行或不進行進一步純化。螯合劑偶聯抗體可以凍乾形式供應。
以下實例闡釋本發明,而並不意欲限制本發明。
用於免疫及篩選之所分泌人類(h)鳥苷酸環化酶(GCC)(hGCC)細胞外結構域(ECD)/小鼠免疫球蛋白(Ig)G2a重鏈恆定(Fc)(具有受體結合區突變)(FcRbr-mutII)融合蛋白(即,hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII融合蛋白,在本文中亦稱作pLKTOK108及MIL-44)之產生實施如下。藉由將一部分編碼包含以下GCC序列之序列(信號序列及細胞外結構域)之GCC基因亞選殖至pLKTOK4表現載體中來製備GCC抗原:
(SEQ ID NO:46)。
選擇427至430位處之胺基酸序列Gly-Arg-Gly-Pro-Gln(SEQ ID NO:66)以終止細胞外GCC片段。在GCC中,緊隨此序列之後為與曾經用於起始人類IgG1 Fc融合蛋白之Pro同源之位置處之Pro充分對準之Pro。
pLKTOK108之小鼠IgG2a Fc區經設計以在功能上為CH1結構域末端之胺基酸序列[Pro-Arg-纈胺酸(Val)-Pro-Iso白胺酸(Ile)-蘇胺酸(Thr)-Glu-天冬醯胺(Asn)](SEQ ID NO:58)開始。使小鼠IgG2a恆定區中之兩個區突變。除白胺酸(Leu)-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:59)至Leu-丙胺酸(Ala)-Gly-Ala(SEQ ID NO:60)之突變(234至237位離胺酸[Lys]-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO:61)突變成Lys-Ala-Gly-Ala(SEQ ID NO:62))外,亦使318至322位之第二Fc受體區突變如下:麩胺酸
(Glu)-苯丙胺酸(Phe)-Lys-半胱胺酸(Cys)-Lys(SEQ ID NO:63)突變成Ala-Phe-Lys-Cys-Lys(SEQ ID NO:64)且隨後突變成Phe-Lys-Cys-Lys(SEQ ID NO:65)。
在設計出完整融合蛋白序列後,添加BamHI及XbaI之側接限制酶序列以及Kozak序列(CTCACC)及末端終止密碼子以完成融合蛋白cDNA。融合蛋白pLKTOK108(hGCC/mIgG2a FcRmutII)之核苷酸及胺基酸序列提供如下(BamHI及XbaI限制位點以小楷字母示於SEQ ID NO:47中):
人類GCC-ECD/小鼠IgG2a Fc核苷酸序列(SEQ ID NO:47)
人類GCC-ECD/小鼠IgG2a Fc胺基酸序列(SEQ ID NO:48):
如上文所述,重組蛋白質pLKTOK108組合人類GCC之融合至小鼠IgG2a Fc區之細胞外區,其中使兩個突變Fc受體結合區(FcR)突變
以阻止Fc受體結合(mIgG2a FcRmutII)。藉由如下三步PCR過程產生pLKTOK108之重組DNA插入:
第一步驟產生含有35個核苷酸之重疊序列的經適應細胞外人類GCC及經適應小鼠IgG2a FcRmutII DNA片段。該等PCR反應使用闡述於表11及表12中之模板及引子與闡述於表13中之方案來產生兩個片段。使用Qiagen凝膠純化套組(Valencia,CA)自1%瓊脂糖凝膠分離該等DNA片段。藉由含有人類GCC之序列之蛋白質表現載體(Clontech Laboratories公司,Mountain View,CA,USA)提供人類GCC模板。自融合至具有兩個突變Fc受體結合區(FcRmutII)之小鼠IgG2aFc之人類1228(稱作pLKTOK84)的表現構築體獲得用於Fc結構域之模板,該pLKTOK84本身係使用載體pLKTOK61(闡述於美國專利7,053,202中,其全部內容以引用方式併入本文中)作為模板產生。
第二PCR反應以列示於表14中之濃度組合模板。列示於表15中之反應方案產生單重組融合蛋白基因。此反應之產物在第三PCR反應中直接用作模板。
第三PCR反應使用闡述於表16及表12中之模板及引子與闡述於下表17中之方案來產生完整片段。使用Qiagen凝膠純化套組(Appendix F)及硫胺酸核苷(TA)懸垂TOPO® TA選殖套組(Appendix F)自0.7%瓊脂糖凝膠分離該等DNA片段。使用Qiagen之DNA miniprep套組(Appendix F)分離獨特純系並純化DNA。利用引子M13f、M13r及pSMUCH2對DNA實施定序以鑑別彼等具有期望序列者。中間TOPO純系TOK108-15含有期望重組DNA序列。
為產生表現載體pLKTOK4,使用pcDNA3.1TM作為骨幹載體。其含有抗G-418(遺傳黴素®)之新黴素(NEO)基因以允許在研究條件下進行容易的選擇。藉由定點誘變自pcDNATM3.1消除SpeI限制位點。將來自質粒pcDEF3(最初為pEF-BOS4)之EF-1α啟動子插入pcDNA TM3.1中,由此消除CMV啟動子。pLKTOK4表現載體之環狀圖繪示於圖1中。
使用TOPO® TA選殖套組對最終PCR產物實施選殖。在用BamHI及XbaI限制酶消化後,將來自TOPO純系之期望片段接合至亦用BamHI及XbaI消化之表現載體pLKTOK4。使用接合反應來轉化K12化學感受態大腸桿菌細胞且隨後在Luria肉湯(LB)/胺苄青黴素瓊脂板上進行選擇。使用QIAGEN之DNA miniprep套組分離來自個體大腸桿菌純系之質粒並利用引子SP6(SEQ ID NO:55)、EF5S(SEQ ID NO:54)及pSMUCH2(SEQ ID NO:53)定序。
藉由DNA定序測定純系含有期望重組DNA且將其用於使用QIAGEN Maxiprep套組製備大量純質粒DNA。此maxiprep DNA用於轉染至二氫葉酸還原酶失陷性中國倉鼠卵巢(CHO-DG44)細胞中。
使用適應無血清懸浮之CHO-DG44細胞系(稱作S1-CHO-DG44)來研發pLKTOK108產生細胞系。簡言之,使用來自Amaxa Biosystems之Nucleofector®裝置及Nucleofection®套組V利用非線性化環狀DNA或經Pvu I限制酶處理之線性化質粒DNA進行轉染。將經轉染細胞在IS-CHO-V-GS生長培養基中維持48小時,然後更換成G-418選擇培養
基。向活轉染細胞進給新鮮G-418選擇培養基且維持培養直至鋪滿(約10至14天)。使用小鼠IgG2a ELISA分析來評價各轉染彙集物之pLKTOK108產率且將細胞擴增以形成冷凍細胞庫。將藉由小鼠IgG2a ELISA所測定具有最高產率之轉染彙集物鑑別用於限制性稀釋選殖,其中將細胞於G-418選擇培養基中平鋪至5×96孔組織培養板中(每隔一個孔中約有1個細胞)。在具有5% CO2之37℃培育器中將96孔板無進料培育2週。將50μL來自具有單集落之各孔之上清液直接轉移至96孔分析板中以實施小鼠IgG2a ELISA分析。鑑別出23個具有高產率之純系且依序經由24孔細胞培養板及隨後6孔細胞培養板將其擴增。在小鼠IgG2a ELISA分析中以3個不同稀釋度量測來自該等純系之上清液之抗體效價。
在G-418選擇培養基中擴增最佳6個基於小鼠IgG2a效價之純系以形成冷凍細胞庫且使其適應無血清懸浮Sigma 21號培養基。使用Cedex自動化細胞培養分析儀測定細胞密度及活力,且使用小鼠IgG2a ELISA分析來量測上清液中之蛋白質濃度。在細胞達到對數生長期後,將其收穫並在-80℃下冷凍過夜且隨後轉移至液氮冷凍室儲存。
為產生融合蛋白,將細胞解凍並平鋪,且隨後以3.0×105個細胞/mL之開始密度連接擴增至更大T形瓶中且然後擴增至搖瓶中且在設定為105rpm之定軌振盪器中在設定為37℃、5% CO2之加濕培育器中培育。在第4天及第7天向最終培養物進給10體積% Sigma 21號專門進料培養基,且在第10天進料5體積%。Sigma 21號進料培養基由補充有40g/L葡萄糖、10g/L L-麩醯胺酸、10g/L酵母萃取特及10g/L大豆蛋白腖之Sigma 21號培養基組成。藉由離心收穫振盪培養物。經由0.2-μm低蛋白質結合聚醚碸(PES)膜過濾單元過濾含有所分泌pLKTOK108蛋白質之上清液,其中含有pLKTOK108之粗製濾液準備用於純化或在-80℃下儲存用於以後純化。
初始純化涉及使含有pLKTOK108之經過濾上清液在約4℃下在蛋白質A Sepharose管柱上循環通過。然後用PBS pH7.4洗滌樹脂,且用存於PBS中之0.1M甘胺酸(pH 3.0)溶析蛋白質並用1M磷酸鈉(pH 6.5)中和。使用分子量截止值(MWCO)為30kDa之Vivaspin濃縮器濃縮經中和溶析液並將其加載至用PBS(pH 7.4)緩衝液預平衡之Superdex 200尺寸排除層析(SEC)管柱(Appendix G)上以分離出此蛋白質之聚集物。經純化pLKTOK108蛋白質以單一峰形式溶析,其中根據SDS-PAGE及考馬斯(Coomassie)染色確認純度。彙集含有hGCC(ECD)/mIgG2a Fc同質二聚物之部分。在藉由NanoDropTM ND1000分光光度計上280nm下之UV吸光度測定經彙集材料之濃度後,將經純化pLKTOK108蛋白質等分並在-80℃下儲存。
使用由Epitomics(Burlingame,CA)提供之RabMAb® service產生抗hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII融合蛋白(pLKTOK108)之兔單株抗體。出於產生MAb之目的,hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII融合蛋白(pLKTOK108)融合蛋白在本文中稱作MIL-44。
使用習用免疫技術用MIL-44對3隻兔(ML1009、ML1010及ML1011)實施免疫。使用測試採血來評估針對MIL-44及非GCC複篩(counterscreen)抗原(hMadCAM-mFc)之血清效價。在初始免疫後給予加強免疫。選擇具有最高血清效價之兔(兔ML1010)作為候選者以供進行脾切除及使用Epitomics之專屬融合配偶體細胞系及方法進行單株融合。
在單獨兩天(第1天及第2天)後,將2百萬淋巴球細胞與1億融合配偶體細胞融合且分別平鋪於20×96孔板上。將板於組織培養培育器中保持在標準條件下。在融合後2-3週檢查細胞生長並利用生長孔之數量除以所檢查孔之總數來計算融合效率。第1天融合之融合效率量測
為72%融合效率,而第2天之融合效率為79%。檢查最少兩個板之各融合如下:
使用標準ELISA方法篩選所有40個板,其中用50ng MIL-44/孔塗覆板。使用ML1010以1:10K稀釋度之采血作為陽性對照。將151個O.D.大於0.5之純系推定地視為陽性且進一步擴增至24孔板中。
藉由ELISA使用塗覆有50ng MIL-44或50ng hMadCAM-mFc/孔之板實施隨後的確認篩選。確認143個純系對MIL-44為陽性且其中將72個鑑別為MIL-44特異性,即,其對hMadCAM-mFc蛋白質為陰性。
在進行多純系上清液評估後,對若干MIL-44特異性多純系進行亞選殖:包括多純系148號及67號。使用限制性細胞稀釋法進行亞選殖。藉由ELISA篩選若干亞純系上清液。亞純系148-2號及67-4號之雜交瘤細胞經選擇用於冷凍/存庫(banking)及作為GCC檢測試劑在免疫組織化學(IHC)分析中用於進一步篩選及分析,如實例3中所述。
亦將MIL-44-148-2及MIL-44-67-4抗體選殖至pcDNA3.1+ neo(Invitrogen)中以用於藉由瞬時轉染在哺乳動物細胞中產生及用於定序。MIL-44-148-2及MIL-44-67-4抗體之重鏈及輕鏈之核酸及胺基酸序列提供於下文中。各IgG鏈中之信號序列以斜體顯示;各IgG鏈中之可變區以粗體字形顯示;CDR以底線顯示。
MIL-44-148-2 H2核酸序列(SEQ ID NO:4)
MIL-44-148-2 H2胺基酸序列(SEQ ID NO:42)
MIL-44-148-2 L5核酸序列(SEQ ID NO:5)
MIL-44-148-2 L5胺基酸序列(SEQ ID NO:43)
MIL-44-67-4 H2核酸序列(SEQ ID NO:6)
MIL-44-67-4 H2胺基酸序列(SEQ ID NO:44)
MIL-44-67-4 L4核酸序列(SEQ ID NO:7)
MIL-44-67-4 L4胺基酸序列(SEQ ID NO:45)
mCRC人類腫瘤異種移植物模型中之GCC表現之檢測
研發使用MIL-44-148-2抗體之IHC分析以在雌性SCID小鼠中評估HEK293-GCC異種移植物腫瘤及若干源自轉移性結腸直腸癌(mCRC)患者試樣之原發性人類腫瘤異種移植物(PHTX)中之GCC表現。
以5μm厚切片評價經福馬林(Formalin)固定、石蠟包埋(FFPE)之組織中之GCC蛋白質含量且將其與MIL-44-148-2抗體(3.5μg/mL)在Ventana Medical Systems(Tucson,AZ)Discovery XT®自動化染色器上一起培育1小時。用兔抗-山羊二級抗體(Vector Laboratories)將抗體生物素化並用3,3’-二胺基聯苯胺(DAB)受質定位系統(Ventana Medical Systems)顯色。用蘇木精對載玻片進行對比染色並使用Aperio全載玻片掃描系統使之成像。
該等腫瘤之間之GCC含量顯著不同,其中HEK293-GCC腫瘤異種
移植物之H-評分(下文所述評分系統)在4+範圍內,且各種PHTX腫瘤異種移植物之H-評分在1+、1-2+、2+、2-3+及4+範圍內。一般而言,在維持極化上皮結構且具有中度/充分分化之腫瘤細胞之腫瘤中,GCC集中於腫瘤組織之腔側。
人類結腸試樣及腫瘤微陣列中之GCC表現之檢測
亦在上述IHC方案中使用上文提及之原發性人類腫瘤異種移植物(PHTX)、HT29及HEK293 GCC轉染細胞粒以及惡性及良性人類結腸試樣(FFPE及腫瘤微陣列(TMA))將本文所述MIL-44-148-2及MIL-44-67-4抗體作為GCC檢測試劑篩選。
如所預計將HT-29及HEK293 GCC轉染細胞粒染色。MIL-44-148-2及MIL-44-67-4純系對PHTX顯示寬範圍之染色強度。MIL-44-148-2與MIL-44-67-4二者在充分或中度分化之原位或轉移性結腸癌中皆染色為陽性。不充分分化之腫瘤染色強度較低。正常結腸組織顯示使用由MIL-44-148-2與MIL-44-67-4亞純系二者產生之抗體進行頂端染色為陽性。
來自MIL-44-148-2與MIL-44-67-4亞純系二者之抗體在經GCC轉染之HEK293細胞及HT29細胞中提供顯而易見、強度大且具有特異性之染色,而在HEK293及HT29親本細胞系中無任何非特異性染色。兩種純系亦在充分或中度分化之原位或轉移結腸癌中染色為陽性。觀察到兩種亞純系在不充分分化之癌中較少染色。正常結腸顯示,利用兩種純系進行頂端染色為陽性,如所預計。MIL-44-148-2在IHC中顯示總體敏感性及特異性高於MIL-44-67-4。儘管MIL-44-67-4在細胞粒中顯示優於MIL-44-148-2之動態範圍,但MIL-44-148-2在TMA中顯示優於MIL-44-67-4之動態範圍。總之,MIL-44-148-2亞純系在IHC中顯示相對於MIL-67-4之優越性(顯示更高敏感性及特異性),且在TMA中顯示全動態範圍,且在正常結腸中在低濃度下顯示強染色(+2 IHC評
分)。
基於上述初始IHC實驗結果,選擇MIL-44-148-2亞純系使用Tek-Mate自動化染色器來研發及驗證等效於上述IHC方案之自動化方案。自動化IHC分析係用於篩選表現GCC之腫瘤之癌症患者之有用工具,其作為臨床試驗入選準則用於GCC標靶癌症治療,且通常作為篩選工具用於選擇應接受GCC標靶治療之患者(例如,癌症患者)。
研發表18中所示IHC方案用於檢測FFPE人類細胞及組織中之GCC,並針對GCC表現篩選約53個結腸直腸腫瘤及20個正常結腸組織以及2個結腸癌TMA(購自US Biomax)。該等腫瘤涵蓋一系列腫瘤等級以及結腸癌轉移性組織。
自不同組織試樣準備4微米切片。經4、5分鐘依次將二甲苯、梯度醇系列更換為蒸餾水將組織切片脫蠟。利用蒸汽熱誘導之表位恢復(SHIER)使SHIER2溶液在Black & Decker蒸箱之上室中之毛細管間隙中保持20分鐘。
上述方案使用1.0μg/ml MIL-44-148-2之過夜抗體培育與基於非生物素之過氧化物酶檢測(來自Thermo/Lab Vision之Ultravision套組)且
使用DAB作為發色原。此程序使用TechMate 500或TechMate 1000(Roche Diagnostics),完全自動化。在染色後,經由醇系列至無水乙醇、之後二甲苯沖洗將載玻片脫水。用玻璃蓋玻片及CytoSeal將載玻片永久覆蓋。在顯微鏡下檢查載玻片以評價染色。藉由棕色(DAB-HRP)反應產物之存在來指示陽性染色。蘇木精對比染色提供藍色核染色以評價細胞及組織形態。
在評估GCC染色後,測定H-評分方法將為定量GCC表現之最佳方法。H-評分方法為在腫瘤類型內及之間測定染色強度及腫瘤百分比之變異提供最佳數據解析。其亦提供用於測定陽性染色之臨限值之良好工具。在此方法中,提供染色強度在0-3+範圍內之腫瘤內之細胞(0-100)百分比。利用本方法,提供強度為0、0.5、1、2及3之評分。端視標記物而言,可0.5染色評定為陽性或陰性,且其反映標記物之雖淺但可察覺之染色。為獲得H-評分,將腫瘤細胞百分比乘以各強度且將其加在一起:H評分=(腫瘤%*1)+(腫瘤%*2)+(腫瘤%*3)。例如,若腫瘤為20%陰性(0)、30% +1、10% +2、40% +3,則此將得到170之H評分。
按照亞細胞定位(即,頂端或細胞質),若用3+強度標記100%腫瘤細胞,則最大H-評分係300(100% * +3)。首先,作為對照,不使用單獨總H-評分來比較試樣,而是對其進行評估,另外綜述各強度下細胞百分比之分項(break-down)。例如,90之評分可代表具有1+強度之90%腫瘤細胞染色或具有3+強度之30%細胞。該等試樣具有相同的H-評分,但極為不同的GCC表現。欲在各強度下評分之細胞之百分比可有所不同,但通常以10%增量評分;然而,小百分比之單一組份評分亦可以1%及5%估計,以顯示存在某一程度之染色。對於GCC而言,可認為頂端染色係以低度增量(例如1%及5%)進行評估。
使用H-評分方法針對GCC對兩種不同的亞細胞定位進行評分。
該等包括細胞質染色及頂端相關染色。通常觀察到細胞質染色模式為擴散於整個腫瘤細胞之細胞質內。然而,在一些情形下,存在細胞質染色之變化形式,其包括強球狀染色或點狀粗粒狀染色。將強球狀染色評分為3+細胞質染色。點狀染色與頂端染色相關且並不針對此類細胞質染色給予單獨評分(n=4個試樣,對於點狀染色而言)。當存在腔時,觀察到GCC頂端染色。所觀察到之其他GCC染色模式包括膜樣非腔染色(一例)及存在於腫瘤腔中之細胞外染色。在正常結腸組織中,染色通常為頂端以及擴散性細胞質染色。
由於獲得細胞質與頂端GCC表現二者之H評分,且由於不瞭解一類定位在GCC標靶治療功效方面之重要性是否大於另一類,因此捕獲所有數據,且在一些情況下,藉由使用頂端與細胞質GCC表現二者之總和產生合計H評分。在此等情況下,合計評分之最大H評分變成600(300頂端+300細胞質)。
總之,正常結腸試樣染色表明,GCC在解剖學上優先在頂端表面上表現。GCC在超過95%之腫瘤試樣上表現且與正常組織相比在一些情形下顯示擴散性細胞質染色。亦在人類CRC肝轉移試樣中發現強病灶性GCC染色。
表19A顯示所篩選正常及腫瘤組織之細胞質及頂端H-評分染色結果。表19A中所示數據係根據試樣源(內部(表示為MLNM)、TMA(表示為BIOMAX)及CRO(表示為QualTek))及腫瘤等級來分類(broken-out)。提供在使用0.5及1.0+染色強度之臨限值時之陽性匯總數據。對總共173個腫瘤試樣進行評分。當對於細胞質或頂端染色使用0.5+截止值之陽性染色強度時,將95%腫瘤視為陽性。當使用1.0+截止值時,將92%試樣視為陽性。
組織來源顯示陽性腫瘤細胞百分比以及H-評分之變異。對於1+染色陽性臨限值而言,範圍為84%(CRO腫瘤MTB試樣)至100%(內部
試樣或CRO單一組織試樣-注意該等群組中之試樣數較小)。內部腫瘤組織顯示253之極高頂端H-評分(n=9個試樣)。2個TMA之評分結果亦存在差異。US Biomax TMA C0992染色強於C0701。不欲受任一理論限制,TMA之差異可歸因於固定差異與組織來源,或一塊可比另一者更早切割。
考慮抗原在切割區段中之穩定性及切割試樣之新鮮性。本研究中所測試之試樣包括經切割並儲存之試樣及新近切割之試樣,指示需要進一步研究組織試樣隨時間之穩定性。
在GCC陽性及腫瘤等級方面觀察到一些差異(參見表19B),其中充分分化之腫瘤相對於不充分分化之腫瘤具有更大陽性染色(6個來自US Biomax之腫瘤不包括等級)。等級1腫瘤(n=20)顯示100%陽性;等級2腫瘤(n=95)經98%陽性情形標記;且等級3腫瘤(n=44)以88%陽性率標記。不充分分化腫瘤通常缺乏腔,此可解釋一些因缺乏頂端染色所致之此類染色降低。此陽性百分比係基於0.5+染色強度臨限值。7個遠端轉移中有7個為陽性(來自內部及CRO組織)。來自US Biomax TMA之轉移性腫瘤列示為轉移至淋巴結。
總之,不論組織來源或腫瘤等級如何,GCC可對極高百分比之結腸腫瘤及正常結腸組織染色
表19B:藉由腫瘤等級所確定結腸癌染色之匯總
利用各自來自三個細胞粒及14個不同結腸癌組織的5個重複在一次運行內評估GCC IHC分析之分析內精確度。在單獨的載玻片上準備細胞粒。在兩個不同的多腫瘤塊內包括結腸腫瘤試樣。對該等組織之GCC IHC反應性進行評分。
細胞粒之精確性染色:在3個細胞粒之所有5個運行內重複中觀察到接近相同之染色。
結腸腫瘤試樣之精確性染色:在14個結腸腫瘤試樣之5個運行內重複間觀察到極類似於接近相同之染色。試樣係由持證病理學家使用上文所述H-評分方法評分。標準偏差顯示,在所有情形下,方差最小,由此證實染色在同一運行內之良好精確度。總之,所測試細胞粒及結腸癌試樣皆具有極一致之運行內GCC IHC染色。
在5次單獨的GCC IHC染色運行中評估運行間分析可變性及因不同操作者所致之可變性。一位操作者於不同天實施4次運行且第二位操作者實施第5次運行。染色包括測試上述精確度測試中之相同組織。
細胞粒之可再現性染色:在3個細胞粒之所有5個運行間重複中觀察到接近相同之染色。
結腸腫瘤試樣之可再現性染色:在14個結腸腫瘤試樣之5個運行間重複間觀察到極類似於接近相同之染色。試樣係由持證病理學家使用上文所述H-評分方法評分。標準偏差顯示,在所有情形下,方差最小,由此證實不同天數與不同操作者染色之良好可再現性。總之,所
測試細胞粒及結腸癌試樣皆具有極一致之運行間及操作者間GCC IHC染色。
GCC IHC分析之特異性係藉由測試一組正常人類組織來評估。該等正常人類組織包括30種不同組織類型:腎上腺、膀胱、骨髓、乳房、大腦皮質、子宮頸、輸卵管、心臟、腎臟、肝、肺、淋巴結、神經、卵巢、胰臟、腮腺(唾液腺)、垂體、胎盤、前列腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管及子宮。對於各組織類型而言,對至少3個獨特樣品進行染色且評估GCC免疫反應性。
總之,藉由本文所述IHC分析顯示使用MIL-44-148-2抗體之GCC IHC分析與正常組織染色、尤其頂端染色相比對結腸腫瘤試樣具有極高特異性。僅在2個胃試樣中檢測到頂端染色;然而,亦在陰性對照中觀察到此染色。在若干組織類型中觀察到通常較淺之細胞質染色,包括卵泡(3個試樣中之1個)、皮膚(濾泡及真皮,3個試樣中之2個)、胃壁細胞(3個試樣之2個)、前列腺腺上皮(較淺,3例中之3例)、垂體(3例中之2例)、子宮上皮(3例中之3例)、輸卵管上皮(3例中之2例)、胎盤滋養層(較淺,3例中之2例)及肺(內皮,3例中之3例;及細枝氣管上皮,3例中之1例)。最強細胞質染色(2+)存在於一例輸卵管及一例垂體中。在兩種情形下,在陰性對照中之相同區室中皆存在較淺染色。血漿細胞在包括脾、扁桃體及淋巴結在內之諸多組織中為陽性。組織球在脾、肺及淋巴結中為陽性。基質染色存在於睪丸(3例中之2例)、子宮(3例中之3例)及卵巢(3例中之1例)中。廣泛地觀察到細胞外血管染色且其似乎非特異性地結合血清。
使用兔單株抗體MIL-44-148-2在TechMate染色平臺上進行之GCC分析顯示腫瘤及對照細胞粒之一致的運行間及運行內染色。GCC分析似乎在結腸癌中高度敏感,此乃因其將所測試的絕大多數結腸腫瘤試
樣染色。GCC分析對結腸腫瘤之特異性亦似乎遠遠高於對正常組織。在許多結腸腫瘤中觀察到之GCC表現遠遠強於在30個組織正常組中觀察到之任何染色,其中各組織類型至少有3個重複。在任何正常組織中皆未檢測到特異性頂端GCC染色,而頂端染色在多數GCC試樣中較為常見。僅在一些正常組織類型中觀察到細胞質染色且此染色通常較淺。MIL-44-148-2抗體似乎為用於將經福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)之結腸腫瘤染色的可再現、敏感且相對特異之IHC標記物。
在雌性SCID小鼠中及在對胰臟癌、胃癌、食道癌、肺癌及平滑肌肉瘤/橫紋肌肉瘤具有特異性之各種腫瘤微陣列(TMA)中使用實例3中所述自動化IHC分析來評估在多種來自不同來源之非結腸直腸試樣中之GCC表現(即,頂端、細胞質及/或合計GCC表現),該等來源包括源自胃癌及胰臟癌患者試樣之原發性人類腫瘤異種移植物(PHTX)。亦經由自動化IHC分析在多種人類臨床試樣中評價GCC表現,包括自參與運行自動化IHC分析之專用CRO(QualTek)組織數據庫獲得之人類胃腫瘤、胰臟腫瘤及食道腫瘤試樣,以及源自癌症患者之結腸直腸癌、胃癌、胰臟癌、食道癌及小腸癌試樣,在入選在患有表現鳥苷酸環化酶C之晚期胃腸惡性腫瘤之成人患者中進行之GCC標靶抗體-藥物偶聯物(稱為MLN0264)之開放式(open-label)、多中心、劑量遞增、首次用於人類(first-in-human)之研究(研究C26001,ClinicalTrials.gov標識符為NCT01577758)中之前測試該等患者之GCC表現。
所測試各種不同的非結腸直腸組織及組織來源之IHC染色結果示於下表20-31中。表20-31包括所測試各種組織中頂端(「A」)及細胞質(「C」或「Cyto」)GCC染色二者之IHC評分(0、0.5+、1+、2+及3+)及基於IHC評分計算之對應H評分。
實例3及4中所示GCC IHC染色結果證實,GCC在多種胃腸惡性腫瘤(包括結腸直腸腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤及食道腫瘤)以及非胃腸腫瘤(包括胰臟腫瘤及肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤)中表現。各種腫瘤微陣列分析之匯總示於下表32中。
*(陽性%定義為H評分>10)
胃腸及GI-相關惡性腫瘤之人類臨床試樣亦測試為不同GCC表現量之陽性,如下表33中所匯總。
(陽性定義為頂端或細胞質中之H評分>=10)
匯總於表33中之結果類似於經由表32中所示TMA篩選觀察到之結果。
來自入選篩選用於C26001試驗之患者之腫瘤類型之GCC表現的組合/合計H評分分佈繪示於圖2A-2D中。
來自各個所篩選結腸直腸、胃及胰臟腫瘤微陣列之GCC表現之組合/合計H評分分佈繪示於圖3A-3C中。
儘管已參照本發明提供之實施例顯示並闡述本發明,但彼等熟習此項技術者應理解,可對本發明在形式及細節上做出各種改變,此並不背離隨附申請專利範圍所涵蓋之本發明範圍。
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<220>
<223> 人工序列說明:合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 73
<210> 74
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 74
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 75
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 76
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 77
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成寡多核苷酸
<400> 78
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成多肽
<400> 79
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成多核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成多核苷酸
<400> 82
<210> 83
<211> 1444
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
<210> 84
<211> 468
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
<210> 85
<211> 722
<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
<210> 86
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成肽
<220>
<223> N端H
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 殘基間之二硫鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(10)
<223> 殘基間之二硫鍵
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 殘基間之二硫鍵
<220>
<223> C端OH
<400> 87
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成His標籤
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 此序列可涵蓋2個、3個、4個、5個或6個殘基
<400> 88
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成肽
<400> 89
Claims (105)
- 一種抗-GCC抗體分子,其包含三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23或分別包含SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29或分別包含SEQ ID NO:39、40及41。
- 一種抗-GCC抗體分子,其競爭結合與包含以下之抗-GCC抗體相同之表位或結合該表位:三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29。
- 一種抗-GCC抗體分子,其競爭結合與包含以下之抗-GCC抗體相同之表位或結合該表位:三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:39、40及41。
- 如請求項1至3中任一項之抗-GCC抗體分子,其中該抗-GCC抗體分子係單株抗體。
- 如請求項1至3中任一項之抗-GCC抗體分子,其中該抗-GCC抗體分子係兔或兔源抗體。
- 如請求項5之抗-GCC抗體分子,其中該抗體係兔單株抗體。
- 如請求項1之抗-GCC抗體分子,其進一步包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17之輕鏈可變區。
- 如請求項1之抗-GCC抗體分子,其中該等重鏈CDR1、CDR2及 CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23,且該等輕鏈CDR分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29。
- 如請求項7之抗-GCC抗體分子,其中該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:11且該輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:13。
- 如請求項1至3及7至9中任一項之抗-GCC抗體分子,其中該抗-GCC抗體分子偶聯至可檢測標記。
- 如請求項10之抗-GCC抗體分子,其中該可檢測標記係選自由以下組成之群:辣根過氧化物酶(HRP);鹼性磷酸酶;半乳糖苷酶;葡萄糖澱粉酶;溶菌酶;糖氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖6-磷酸脫氫酶;雜環氧化酶,例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶,其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合;生物素/抗生物素蛋白;自旋標記;噬菌體標記;及穩定自由基。
- 如請求項10之抗-GCC抗體分子,其中該可檢測標記係選自以下之螢光團:螢光黃或其衍生物、玫瑰紅或其衍生物、丹醯基、繖形酮、螢光素酶、螢光素及2,3-二氫酞嗪二酮。
- 如請求項10之抗-GCC抗體分子,其中該可檢測標記係選自由以下組成之群之放射性試劑:32P、3H、14C、188Rh、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、99Tc、111In、113M In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb及206Bi及213Bi。
- 一種經分離核酸序列,其編碼如請求項1、7、8及9中任一項之抗體分子。
- 一種細胞,其包含如請求項14之經分離核酸序列。
- 一種產生如請求項1、7、8或9之抗體分子之方法,其包含在允 許產生抗體分子之條件下培養如請求項15之細胞,藉此產生如請求項1、7、8或9之抗體分子。
- 一種載體,其包含如請求項1、7、8或9之抗體分子之輕鏈及重鏈中之一者或二者。
- 一種檢測生物試樣中之GCC分子之方法,其包含使該生物試樣與如請求項1至13中任一項之抗體分子接觸及測定該抗體分子是否結合至該GCC分子。
- 如請求項18之方法,其中該檢測方法包含免疫組織化學分析。
- 如請求項18或19之方法,其中該生物試樣係源自懷疑患有表現GCC之癌症之患者的腫瘤生物檢體。
- 如請求項18或19之方法,其進一步包含定量該生物試樣中之GCC表現之步驟。
- 如請求項21之方法,其中該GCC表現之定量包含該生物試樣中之頂端GCC表現、該生物試樣中之細胞質GCC表現或二者。
- 如請求項21之方法,其中該定量步驟包含H-評分方法。
- 如請求項20之方法,其中該表現GCC之癌症係選自由以下組成之群:結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、軟組織肉瘤、神經外胚層腫瘤及神經內分泌腫瘤。
- 如請求項24之方法,其中該肺癌係鱗狀細胞癌或腺癌。
- 如請求項24之方法,其中該軟組織肉瘤係平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。
- 如請求項24之方法,其中該神經內分泌腫瘤係胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤。
- 一種套組,其包含如請求項1至13中任一項之抗-GCC抗體分子及使用說明書。
- 如請求項28之套組,其進一步包含GCC標靶治療劑。
- 如請求項29之套組,其中該GCC標靶治療劑包含抗-GCC抗體分子。
- 如請求項30之套組,其中該治療性抗-GCC抗體分子係單株抗體。
- 如請求項30或31之套組,其中該治療性抗-GCC抗體分子係人類IgG1抗體。
- 如請求項30或31之套組,其中該治療性抗-GCC抗體分子包含三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:67、68及69;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:70、71及72。
- 如請求項33之套組,其中該治療性抗-GCC抗體分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:79之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO:80之輕鏈可變區。
- 如請求項30或31之套組,其中該治療性抗-GCC抗體分子偶聯至細胞毒性劑。
- 如請求項35之套組,其中該細胞毒性劑係奧裡斯他汀(auristatin)分子。
- 如請求項36之套組,其中該奧裡斯他汀分子係單甲基奧裡斯他汀E(MMAE)或單甲基奧裡斯他汀F(MMAF)。
- 如請求項35之套組,其中該細胞毒性劑經由含有馬來醯亞胺部分之連接體偶聯至該抗體。
- 如請求項38之套組,其中該馬來醯亞胺連接體係選自由以下組成之群:馬來醯亞胺基己醯基(mc)、馬來醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯及馬來醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc)。
- 如請求項29之套組,其中該GCC標靶治療劑係特徵在於式( I-4 )、( I-5 )或( I-6 )中任一者之免疫偶聯物:
- 如請求項40之套組,其中m係3至5。
- 如請求項41之套組,其中m係約4。
- 一種GCC標靶治療劑、例如本文所述GCC標靶治療劑之用途,其用於製造用以治療患有特徵在於一或多個表現GCC之細胞之疾病之患者的藥劑,其中該患者係藉由包含以下之方法來選擇:藉由例如如請求項18至27中任一項之方法檢測自該患者獲得之生物試樣中之GCC蛋白質表現;且 若該生物試樣表現GCC,則向該患者投與該藥劑。
- 如請求項43之用途,其中該檢測步驟包含以下步驟:i)使該生物試樣與本文所述抗-GCC抗體分子、例如如請求項1至13中任一項之抗-GCC抗體分子、例如包含以下之抗-GCC抗體分子接觸:三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23或SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29或SEQ ID NO:39、40及41;及ii)檢測該抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質間之複合物之形成。
- 如請求項44之用途,其中該檢測步驟係經由免疫組織化學來實施。
- 如請求項44之用途,其中該GCC標靶治療劑包含抗-GCC抗體分子。
- 如請求項46之用途,其中該治療性抗-GCC抗體分子係單株抗體。
- 如請求項46或47之用途,其中該治療性抗-GCC抗體分子係人類IgG1抗體。
- 如請求項46之用途,其中該抗-GCC抗體分子包含三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:67、68及69;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:70、71及72。
- 如請求項49之用途,其中該抗-GCC抗體分子進一步包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:79之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO:80之輕鏈可變區。
- 如請求項46之用途,其中該抗-GCC抗體分子偶聯至細胞毒性 劑。
- 如請求項51之用途,其中該細胞毒性劑係奧裡斯他汀分子。
- 如請求項52之用途,其中該奧裡斯他汀分子係單甲基奧裡斯他汀E(MMAE)或單甲基奧裡斯他汀F(MMAF)。
- 如請求項51至54之用途,其中該細胞毒性劑係經由含有馬來醯亞胺部分之連接體偶聯。
- 如請求項54之用途,其中該馬來醯亞胺連接體係選自由以下組成之群:馬來醯亞胺基己醯基(mc)、馬來醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯及馬來醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc)。
- 如請求項43之用途,其中該GCC標靶治療係特徵在於式( I-4 )、( I-5 )或( I-6 )中任一者之免疫偶聯物:
- 如請求項56之用途,其中m係約3至約5。
- 如請求項57之用途,其中m係約4。
- 如請求項43至47、49至53及55至58中任一項之用途,其中該特徵在於一或多個表現GCC之細胞之疾病係選自由以下組成之群:癌症、發炎性腸症候群、克隆氏病(Crohn’s disease)或帕金森氏病(Parkinson’s disease)。
- 如請求項59之用途,其中該癌症係選自由以下組成之群:結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、軟組織肉瘤、神經外胚層腫瘤及神經內分泌腫瘤。
- 如請求項60之用途,其中該肺癌係鱗狀細胞癌或腺癌。
- 如請求項60之用途,其中該軟組織肉瘤係平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。
- 如請求項60之用途,其中該神經內分泌腫瘤係胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤。
- 如請求項43至47、49至53及55至58之用途,其中該生物試樣係細胞或組織生物檢體。
- 如請求項64之用途,其中該細胞或組織生物檢體係腫瘤生物檢體。
- 一種測定癌細胞對GCC標靶治療劑之敏感性及/或評估個體是否為GCC標靶治療之潛在候選者的方法,該方法包含以下步驟:i)自患有癌症之患者提供來自癌細胞之試樣;ii)使該試樣與本文所述抗-GCC抗體分子、例如如請求項1至13中任一項之抗-GCC抗體、例如包含以下之抗-GCC抗體接觸:三 個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23或SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29或SEQ ID NO:39、40及41;及iiii)檢測該抗-GCC抗體分子與GCC蛋白質間之複合物之形成,藉此測定該癌症對該GCC標靶治療劑、例如本文所述GCC標靶治療劑之敏感性,及/或測定個體是否為用GCC標靶治療、例如本文所述GCC標靶治療來治療之候選者。
- 如請求項66之方法,其中該檢測步驟係經由免疫組織化學來實施。
- 如請求項66或67之方法,其中該癌症係選自由以下組成之群:結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、軟組織肉瘤、神經外胚層腫瘤及神經內分泌腫瘤。
- 如請求項68之方法,其中該肺癌係鱗狀細胞癌或腺癌。
- 如請求項68之方法,其中該軟組織肉瘤係平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。
- 如請求項68之方法,其中該神經內分泌腫瘤係胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤。
- 如請求項66或67之方法,其進一步包含向該患者投與該GCC標靶治療劑、例如本文所述GCC標靶治療劑之步驟。
- 如請求項72之方法,其中該GCC標靶治療劑包含抗-GCC抗體分子。
- 如請求項73之方法,其中該治療性抗-GCC抗體分子係單株抗體。
- 如請求項73之方法,其中該治療性抗-GCC抗體分子係人類IgG1抗體。
- 如請求項73之方法,其中該治療性抗-GCC抗體分子包含三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:67、68及69;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:70、71及72。
- 如請求項76之方法,其中該治療性抗-GCC抗體分子進一步包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:79之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO:80之輕鏈可變區。
- 如請求項73之方法,其中該抗-GCC抗體分子偶聯至細胞毒性劑。
- 如請求項78之方法,其中該細胞毒性劑係奧裡斯他汀分子。
- 如請求項79之方法,其中該奧裡斯他汀分子係單甲基奧裡斯他汀E(MMAE)或單甲基奧裡斯他汀F(MMAF)。
- 如請求項78之方法,其中該細胞毒性劑係經由含有馬來醯亞胺部分之連接體偶聯。
- 如請求項81之方法,其中該馬來醯亞胺連接體係選自由以下組成之群:馬來醯亞胺基己醯基(mc)、馬來醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯及馬來醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對-胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc)。
- 如請求項66或67之方法,其中該GCC標靶治療劑係特徵在於式( I-4 )、( I-5) 或( I-6 )中任一者之免疫偶聯物:
- 如請求項83之方法,其中m係約3至約5。
- 如請求項84之方法,其中m係約4。
- 一種反應混合物,其包含生物試樣及本文所述抗-GCC抗體分子,例如,如請求項1至13中任一項之抗-GCC抗體,例如,包含以下之抗-GCC抗體分子:三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23或SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29或SEQ ID NO:39、40及41。
- 如請求項86之反應混合物,其中該生物試樣包含一或多個細胞。
- 如請求項86之反應混合物,其中該生物試樣包含組織試樣。
- 如請求項88之反應混合物,其中該組織試樣係經石蠟包埋之組 織試樣。
- 如請求項86之反應混合物,其中該生物試樣係原發性或轉移性腫瘤生物檢體試樣。
- 如請求項86之反應混合物,其中該生物試樣係安裝在載玻片上。
- 如請求項90之反應混合物,其中該腫瘤係結腸直腸腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、食道腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤、軟組織肉瘤、神經外胚層腫瘤或神經內分泌腫瘤。
- 如請求項92之反應混合物,其中該肺腫瘤係鱗狀細胞癌或腺癌。
- 如請求項92之反應混合物,其中該軟組織肉瘤係平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。
- 如請求項92之反應混合物,其中該神經內分泌腫瘤係胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤。
- 如請求項86之反應混合物,其中懷疑該生物試樣含有GCC蛋白質。
- 如請求項86至96中任一項之反應混合物,其進一步包含適於檢測該抗-GCC抗體與GCC蛋白質間之複合物之形成的試劑。
- 一種產生個人化癌症治療報告之方法,該方法包含以下步驟:使包含一或多個自懷疑患有表現GCC之癌症之癌症患者獲得之癌細胞的生物試樣與本文所述抗-GCC抗體分子、例如如請求項1至13中任一項之抗-GCC抗體分子、例如包含以下之抗-GCC抗體分子接觸:三個重鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:21、22及23或SEQ ID NO:33、34及35;及三個輕鏈互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3),其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:27、28及29或SEQ ID NO: 39、40及41;藉由例如如請求項18至27中任一項之方法檢測該生物試樣中該抗-GCC分子與GCC蛋白質間之複合物之形成;定量該生物試樣中之GCC表現;比較該GCC表現量與包含GCC標靶治療、例如本文所述GCC標靶治療之數據庫;及基於該GCC表現量選擇GCC標靶治療及視情況給藥方案。
- 如請求項98之方法,其中該表現GCC之癌症係結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、軟組織肉瘤、神經外胚層腫瘤或神經內分泌腫瘤。
- 如請求項99之方法,其中該肺腫瘤係鱗狀細胞癌或腺癌。
- 如請求項99之方法,其中該軟組織肉瘤係平滑肌肉瘤或橫紋肌肉瘤。
- 如請求項99之反應混合物,其中該神經內分泌腫瘤係胃腸或枝氣管肺神經內分泌腫瘤。
- 如請求項98至102中任一項之方法,其中該檢測步驟係經由免疫組織化學來實施。
- 如請求項98至102中任一項之方法,其中該GCC表現之定量包含該生物試樣中之頂端GCC表現、該生物試樣中之細胞質GCC表現或二者。
- 如請求項98至102之方法,其中該定量步驟包含H-評分方法。
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