PT1377314E - Anticorpos monoclonais para a proteína clfa e método de utilização no tratamento ou prevenção de infecções - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais para a proteína ClfA e método de utilização no tratamento ou prevenção de infecções"

Campo do invento 0 presente invento refere-se em geral a anticorpos que foram gerados contra factor de agregação (clumping) A (ou ClfA), uma proteína localizada à superfície expressa em Staphylococcus aureus e noutras bactérias estafilocócicas, e em particular a um anticorpo monoclonal contra a proteína ClfA e seus fragmentos activos ou proteínas a partir do seu domínio de ligação de fibrinogénio tais como Clf33, e à sua utilização na inibição da ligação da proteína ClfA a fibrinogénio ou fibrina e no tratamento ou prevenção de infecções por S. aureus.

Antecedentes do invento A colonização bem sucedida do hospedeiro é um processo requerido para a maioria dos microrganismos causar infecções em animais e humanos. A adesão microbiana é o primeiro passo crucial numa série de eventos que podem conduzir eventualmente à doença. Os microrganismos patogénicos colonizam o hospedeiro ligando-se a tecidos do hospedeiro ou a biomateriais implantados condicionados em soro, tais como cateteres, articulações artificiais e enxertos vasculares, através de adesinas específicas presentes sobre a superfície das bactérias. As MSCRAM™ (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) são uma família de adesinas de superfície celular que reconhecem e especificamente se ligam a componentes distintos na matriz extracelular do hospedeiro. Após as bactérias terem aderido com sucesso e colonizado tecidos do hospedeiro, a sua fisiologia é dramaticamente alterada e são segregados componentes danificadores tais como toxinas e enzimas proteolíticas. Para além disso, bactérias aderentes produzem frequentemente um biofilme e tornam-se rapidamente mais resistentes ao efeito de morte da maioria dos antibióticos. 2

ΕΡ 1 377 314/PT Ο S. aureus causa um espectro de infecções que vão desde lesões cutâneas, tais como infecções em feridas, impetigo e furúnculos, até condições com ameaça para a vida que incluem pneumonia, artrite séptica, sepsia, endocardite e infecções relacionadas com biomateriais. 0 S. aureus é conhecido por expressar um repertório de diferentes MSCRAMM que podem actuar individualmente ou de modo concertado para facilitar a adesão microbiana a componentes específicos de tecido do hospedeiro. As MSCRAMM proporcionam um excelente alvo para ataque imunológico por anticorpos, em particular anticorpos monoclonais. A presença dos anticorpos apropriados anti-MSCRAMM de elevada afinidade pode ter um ataque em duas frentes, em primeiro lugar os anticorpos podem impedir a adesão microbiana e em segundo lugar os níveis aumentados de anticorpos de MSCRAMM facilitam uma rápida depuração do organismo a partir do corpo através de morte opsonofagocítica.

No entanto, tem ainda subsistido um problema em identificar e utilizar a informação referente a MSCRAMM™ de S. aureus, tais como a proteína ClfA, para gerar anticorpos monoclonais eficazes, por causa da variabilidade nas propriedades de ligação das diferentes MSCRAMM™ e do seu papel na infectividade e no espalhar de infecções bacterianas. Em particular, tem sido um problema desenvolver anticorpos monoclonais que se possam ligar a ClfA e que possam ser utilizados para inibir ou dificultar a ligação de ClfA estafilocócica a fibrinogénio ou fibrina, e assim ser úteis em métodos de prevenção ou tratamento de infecções estafilocócicas. Tem assim subsistido um objectivo altamente desejável no campo das doenças infecciosas em desenvolver anticorpos monoclonais e outras composições que sejam bem sucedidos no tratamento e prevenção de uma ampla variedade de infecções estafilocócicas, particularmente por inibição ou dificultação da capacidade das bactérias em se ligarem a fibrinogénio ou fibrina. A WO 00/64925 revela a utilização de anticorpos baseados nas regiões Clf40 e Clf41 de ClfA no tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias estafilocócicas. 3

ΕΡ 1 377 314/PT A US 6008341 descreve o isolamento da proteína de ligação a fibrinogénio de S. aureus e sua utilização na criação de anticorpos. 0'Connell et ai. (J. Biol. Chem. Vol. 273, N.° 12, págs. 6821-6898; 1998) investigam a proteína Cif A de S. aureus e demonstram que a região A de CifA se pode ligar a Ca2+ e que a interacção entre a região A de CifA e fibrinogénio é inibida por concentrações milimolares de Ca2+.

Hartford et ai. (Molecular Microbiol. (1997) 25(6), 1065-1076) estudam outra vez a proteína ClfA de S. aureus e em particular se a região R tem ou não um papel na exibição à superfície do domínio A da região de ligação a fibrinogénio.

Hartford et ai. (J. Biol. Chem. Vol. 276, N.° 4, págs. 2466-2473; 2001) descrevem também o estudo de proteína ClfA de S. aureus e em particular a sua ligação a fibrinogénio. Os autores descrevem anticorpos policlonais criados contra um truncado de ClfA recombinante, composto de resíduos 5000-559 da região A. Verificaram que estes anticorpos foram capazes de bloquear a interacção entre S. aureus e fibrinogénio.

Sumário do invento

Por conseguinte, é um objectivo do presente invento proporcionar um anticorpo monoclonal que se pode ligar à proteína do subdomínio Clf33 da proteína de ClfA de S. aureus e assim ser útil em métodos para tratar ou prevenir infecções estafilocócicas. O anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 12-9 possuindo (i) uma sequência leve variável codificada por uma sequência de ácido nucleico seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17 e seus degenerados; e (ii) uma cadeia pesada variável codificada por uma sequência de ácido nucleico seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 e seus degenerados. É também um objectivo do presente invento proporcionar um anticorpo monoclonal que é capaz de se ligar a ClfA, e que 4

ΕΡ 1 377 314/PT é gerado a partir do subdomínio de ligação da proteína Cif A de S. aureus, Clf33, ou suas porções activas, para ser utilizado em métodos de tratamento ou protecção contra infecções estafilocócicas. É também um objectivo do presente invento proporcionar um anticorpo monoclonal para a proteína Clf33 que pode ser útil em impedir a adesão de bactérias estafilocócicas por inibição ou dificultação da ligação da proteína CifA a fibrinogénio ou fibrina. É um objectivo adicional do invento proporcionar sequências de aminoácidos e as sequências de ácido nucleico que codificam a sequência leve variável e as sequências pesadas variáveis do anticorpo monoclonal do presente invento. É ainda um objectivo adicional do presente invento proporcionar um anticorpo monoclonal 12-9 para o subdomínio Clf33 de ClfA que é protector contra infecção por S. aureus, e que pode conseguir reactividade cruzada contra outros tipos de infecção estafilocócica.

Estes e outros objectivos são proporcionados em virtude do presente invento que compreende o isolamento e utilização de anticorpo monoclonal 12-9 para o subdomínio de ligação Clf33 da proteína ClfA para a prevenção e tratamento de infecções por Staphylococcus. 0 presente pedido de patente descreve assim a identificação, produção, caracterização e avaliação in vivo de um anticorpo monoclonal 12-9 contra Clf33 de ClfA, uma proteína localizada à superfície expressa por virtualmente cada uma das estirpes de S. aureus. Os dados aqui apresentados demonstram claramente que o anticorpo monoclonal 12-9 contra os subdomínios activos de ClfA tais como Clf33 pode ser utilizado para tratar ou proteger contra infecções por S. aureus. A identificação e isolamento de anticorpos monoclonais anti-ClfA de acordo com o presente invento pode assim ser utilizada para dificultar ou inibir a ligação da proteína ClfA a fibrinogénio ou fibrina e assim ser útil em métodos de tratamento ou prevenção de infecções estafilocócicas. São 5 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ também descritas composições e vacinas adequadas baseadas nos subdominios de proteína Cif A isolados e anticorpos criados contra estes, bem como métodos para a sua utilização.

Estas concretizações e outras alternativas e modificações dentro do âmbito do invento revelado tornar-se-ão prontamente evidentes para os peritos na especialidade da leitura do presente fascículo e/ou das referências aqui citadas.

Breve descrição das figuras A Figura 1 é um gráfico de uma análise Biacore utilizada para medir a ligação de CifA e a ligação/inibição subsequente de fibrinogénio quando anticorpos monoclonais 13-1 ou 13-2 de acordo com o presente invento estão ligados a um chip utilizando anticorpo Fc de coelho anti-ratinho (RAM-Fc). A Figura 2 é um gráfico de uma análise Biacore do anticorpo monoclonal 12-9 quimérico de acordo com o presente invento. A Figura 3 é um gráfico de uma análise de citometria de fluxo de anticorpo monoclonal 12-9 quimérico mostrando a ligação a S. aureus (estirpe Newman). A Figura 4 é um gráfico mostrando a afinidade de ligação a ClfA de anticorpo monoclonal 12-9 quimérico e humanizado de acordo com o invento. A Figura 5 é um gráfico mostrando a protecção contra Staphylococcus aureus num modelo murino de desafio letal. A Figura 6 é um gráfico mostrando a inibição de células inteiras da adesão de S. aureus a fibrinogénio imobilizado utilizando os anticorpos monoclonais do presente invento. A Figura 7 é um gráfico mostrando a ligação comparativa de S. aureus utilizando os anticorpos monoclonais 12-9 murino, 12-9 quimérico e 12-9 humanizado de acordo com o presente invento. 6 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ A Figura 8 é uma ilustração das sequências de cadeia pesada variável e leve variável dos anticorpos monoclonais do presente invento mostrando as sequências conservadas nas regiões CDR1, CDR2 e CDR3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

De acordo com o presente invento, é proporcionado um anticorpo monoclonal 12-9, que se pode ligar à proteína ClfA de S. aureus, e este anticorpo monoclonal foi criado contra proteína de subdomínio de ligação activa Clf33 que foi isolada e purificada pelos presentes inventores. Foi mostrado que o anticorpo monoclonal 12-9 de acordo com o invento trata ou protege contra infecções por S. aureus.

Anteriormente, McDevitt et al. (McDevitt et al. , 1994, Mol. Microbiol. 11, 237-248) identificaram uma proteína de superfície de 92 kDa, a partir de S. aureus da estirpe Newman, que se demonstrou ser responsável pela agregação de bactérias dependente de fibrinogénio, e esta é agora revelada na Patente dos E.U.A. N.° 6177084. O gene, designado ClfA, foi clonado e sequenciado, e este é revelado na Patente dos E.U.A. N.° 6008341, e esta região, representando uma proteína de 896 aminoácidos conforme prevista a partir da sequência de ADN, medeia a adesão de bactérias a superfícies revestidas com fibrinogénio, identificando desse modo ClfA como uma MSCRAMM™. O gene ClfA consiste de um domínio citoplásmico, um domínio transmembrana, um domínio de ancoragem à parede celular e uma região (designada por R) que liga os domínios de ancoragem da célula à região A NH2-terminal (composta de um segmento único de 520 resíduos). O domínio de ligação a fibrinogénio desta MSCRAMM foi localizado num segmento de 218 resíduos dentro da região A. McDevitt et al. (McDevitt et al., 1995, Mol. Microbiol. 16, 895-907) mostraram que a região A de ClfA é suficiente para o fenótipo de agregação.

Contudo, anteriormente, ninguém foi capaz de gerar anticorpos monoclonais para a proteína ClfA de S. aureus. Por conseguinte, o presente invento refere-se a um anticorpo monoclonal 12-9 isolado e/ou purificado que se pode ligar ao subdomínio de ligação Clf33 de proteína ClfA e que assim pode ser útil em métodos de prevenção e tratamento de infecção 7

ΕΡ 1 377 314/PT estafilocócica quando utilizado em quantidades eficazes para prevenir ou tratar tais infecções. Este anticorpo monoclonal pode ser produzido utilizando, e.g., o método de Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975), ou outros modos adequados conhecidos na área e, para além disso, pode ser preparado como anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos, de modos que serão bem conhecidos nesta área. Ainda adicionalmente, podem-se preparar anticorpos monoclonais a partir de uma cadeia simples, tal como as cadeias leve ou pesada, e para além disso podem ser preparados a partir de fragmentos activos de um anticorpo que retêm as caracteristicas de ligação (e.g., especificidade e/ou afinidade) do anticorpo inteiro. Por fragmentos activos pretende-se significar um fragmento de anticorpo que tem a mesma especificidade de ligação que um anticorpo completo que se liga à proteína Cif A, e o termo "anticorpo" como aqui utilizado pretende incluir os referidos fragmentos. Adicionalmente, são também contemplados pelo presente invento antissoros preparados utilizando anticorpo monoclonal 12-9 e estes podem ser preparados de vários modos adequados como será reconhecido por um perito na especialidade.

Como indicado acima, podem-se preparar anticorpos para Cif A de vários modos adequados que serão bem conhecidos na especialidade, tais como o método de Kohler e Milstein bem estabelecido acima descrito que pode ser utilizado para gerar anticorpos monoclonais. Neste método, injectam-se ratinhos intraperitonealmente uma vez por semana durante um período prolongado com uma proteína ClfA recombinante purificada, ou uma proteína de subdomínio isolada tal como Clf40, Clf33 ou ClfA N3, ou uma sua porção activa, seguindo-se uma análise ao sangue dos ratinhos imunizados para determinar a reactividade em relação à ClfA purificada. Após identificação de ratinhos reactivos em relação a ClfA, linfócitos isolados a partir de baços de ratinho são fundidos com células de mieloma de ratinho para produzir hibridomas positivos para os anticorpos contra ClfA que são depois isolados e cultivados, seguindo-se purificação e isotipagem.

De modo a gerar anticorpos monoclonais de acordo com o invento, é assim preferido que estes sejam gerados utilizando proteínas Clf33 preparadas recombinantemente utilizando 8

ΕΡ 1 377 314/PT métodos convencionais bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, um destes métodos emprega a utilização do vector de expressão de E. coli pQE-30 como um vector de expressão para clonagem e expressão de proteínas e péptidos recombinantes.

Utilizando PCR, amplificou-se o domínio A de ClfA (Clf40 representando AA 40-559 ou Clf33 representando AA 221-550) a partir de ADN genómico de S. aureus Newman e subclonou-se no vector de expressão de E. coli PQE-30 (Qiagen), o que permite a expressão de uma proteína de fusão recombinante contendo seis resíduos histidina. Este vector foi subsequentemente transformado na estirpe de E. coli ATCC 55151, cultivou-se num fermentador de 15 litros até uma densidade óptica (OD60o) de 0,7 e induziu-se com isopropil-l-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Colheram-se as células utilizando uma montagem de fibras ocas AG Technologies (tamanho de poro de 0,45 pm) e congelou-se a pasta de células a -80°C. Lisaram-se as células em PBS IX (10 mL de tampão/1 g de pasta de células) utilizando 2 passagens através da prensa francesa a 1100 psi. Centrifugaram-se as células lisadas a 17000 rpm durante 30 minutos para remover os resíduos celulares. Fez-se passar o sobrenadante sobre uma coluna quelante HiTrap (Pharmacia) de 5 ml carregada com NÍCI2 0,1 M. Após carregamento, lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampão A) . Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de 0-100% de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazole 200 mM (Tampão B) com 30 volumes de coluna. Clf40 ou Clf33 foram eluídas para ~13% de Tampão B (imidazole ~26 mM). Monitorizou-se a absorvância a 280 nm. As fracções contendo Clf40 ou Clf33 foram dialisadas em PBS lx.

Submeteu-se depois a proteína a um protocolo de remoção de endotoxina. Os tampões utilizados durante este protocolo foram libertados de endotoxina por passagem sobre uma coluna Mono-Q Sepharose (Pharmacia) de 5 ml. Dividiu-se a proteína equitativamente entre tubos 4x 15 ml. Ajustou-se o volume de cada tubo a 9 ml com Tampão A. Adicionou-se 1 ml de Triton X-114 a 10% a cada tubo e incubou-se com rotação durante 1 hora a 4°C. Colocaram-se os tubos num banho de água a 37°C para separar as fases. Centrifugaram-se os tubos a 2000 rpm durante 10 minutos e recolheu-se a fase aquosa superior de cada tubo e repetiu-se a extracção com detergente. 9 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Combinaram-se as fases aquosas da segunda extracção e fez-se passar sobre uma coluna quelante IDA (Sigma) de 5 ml, carregada com N1CI2 0,1 M para remover o detergente restante. Lavou-se a coluna com 9 volumes de coluna de Tampão A antes de se eluir a proteína com 3 volumes de coluna de Tampão B.

Fez-se passar o eluente sobre uma coluna Detoxigel (Sigma) de 5 ml e recolheu-se o caudal de saída e reaplicou-se à coluna. Recolheu-se o caudal de saída da segunda passagem e dialisou-se em PBS lx. Analisou-se o produto purificado em relação a concentração, pureza e nível de endotoxina antes da administração aos ratinhos. A sequência de aminoácidos para Clf40 obtida deste modo é aqui mostrada como SEQ ID NO: 2, e é codificada por ácidos nucleicos possuindo a sequência apresentada na SEQ ID NO:l, ou seus degenerados. Adicionalmente, a sequência de aminoácidos para Clf33 obtida deste modo é aqui mostrada como SEQ ID NO:4, e é codificada por ácidos nucleicos possuindo a sequência apresentada na SEQ ID NO:3, ou seus degenerados.

Após isolamento do subdomínio activo Clf33 de proteína ClfA, podem-se produzir anticorpos monoclonais para esta proteína de vários modos adequados. Por exemplo, num método preferido, utilizou-se a proteína Clf33 purificada para gerar um painel de anticorpos monoclonais murinos. Resumidamente, um grupo de ratinhos Balb/C recebeu uma série de imunizações subcutâneas de 50 pg de proteína Clf40 ou Clf33 em solução ou misturadas com adjuvante como a seguir descrito:

Injecção Dia Quantidade (pg) Via Adjuvante

Primária 0 50 Subcutânea Completo de Freund

Reforço #1 14 5 (Clf40) Intravenosa PBS 10 (ClfA33)

Três dias após o reforço final, removeram-se os baços, destacaram-se numa suspensão de células individuais e colheram-se os linfócitos. Fundiram-se depois os linfócitos com uma linha de células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC #1581). Fusão celular, plaqueamento subsequente e alimentação foram realizados de acordo com o protocolo para produção de 10 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ anticorpos monoclonais de Current Protocols in Immunology (Capitulo 2, Unidade 2.).

Quaisquer clones gerados a partir da fusão foram depois rastreados quanto à produção de anticorpo anti-Clf40 especifico utilizando um ensaio ELISA padrão. Expandiram-se os clones positivos e testaram-se adicionalmente. Identificaram-se originalmente quinze clones positivos e clonaram-se por diluição limitante para caracterização adicional. Testaram-se clones de células individuais quanto a actividade num ELISA de ligação directa, um ELISA modificado para medir a inibição da ligação de fibrinogénio a Clf40, ligação de células bacterianas inteiras por citometria de fluxo e afinidade pela ligação a Cif40 por análise Biacore.

Colheram-se amostras bacterianas de S. aureus (estirpes Barnett, 67-0, ATCC#25923 e ATCC#49230) , lavaram-se e incubaram-se com Mab 13-2, 12-9, 13-1 ou PBS sozinho (controlo) numa concentração de 2 mg/ml após bloquear os locais de proteína A com IgG de coelho (50 mg/ml) . Após incubação com anticorpo, incubaram-se as células bacterianas com Cabra-F(ab') 2-Anti-Ratinho-F(ab')2_FITC que serviu como o anticorpo de detecção. Após marcação de anticorpo, aspiraram-se as células bacterianas através do citómetro de fluxo FACScaliber para analisar a emissão de fluorescência (excitação: 488, emissão: 570). Para cada estirpe bacteriana, colheram-se e mediram-se 10000 eventos.

Revestiram-se placas de 96 poços de elevada ligação com solução 1 mg/ml de Clf40 em PBS (pH 7,4), cobriram-se e incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavaram-se depois as placas com PBS, Tween 20 a 0,05% e bloquearam-se com solução de BSA a 1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, adicionou-se sobrenadante de anticorpo monoclonal e incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e adicionou-se a cada poço solução de fibrinogénio humano 0,1 mg/ml. Incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente e lavaram-se. Adicionou-se conjugado AP anti-fibrinogénio de ovelha numa diluição 1:750 em PBS, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1% e deixaram-se incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e 11 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ adicionou-se ρΝΡΡ (solução de revelação) numa concentração final de 1 mg/ml. Incubaram-se as placas 15-30 minutos a 37°C e leram-se os resultados a 405 nm e analisaram-se utilizando um leitor HTS 7000 Bio-Assay da Perkin Elmer.

Realizou-se a análise cinética num Biacore 3000 utilizando o método de captura de ligando incluído no software. Um anticorpo Fc de coelho anti-ratinho (Biacore) foi acoplado por amina a um chip CM5. O anticorpo monoclonal a ser analisado foi depois passado sobre o chip, permitindo a ligação à porção Fc. Fizeram-se depois passar sobre a superfície do chip concentrações variáveis da proteína Clf40 ou Cif33 e recolheram-se os dados. Utilizando o software de avaliação fornecido pela Biacore (Versão 3.1), mediram-se kon e koff e calcularam-se KA e KD.

Como mostrado pelos dados abaixo, as imunizações para gerar anticorpos monoclonais dirigidos contra Clf40 ou porções activas de Clf40 (regiões N2N3 ou N3) produziram anticorpos monoclonais com diferentes e diversos perfis de reactividade e reactividade cruzada.

Ainda que se prefira a produção de anticorpos utilizando formas recombinantes da proteína CifA, podem também ser gerados anticorpos a partir de proteínas CifA naturais isoladas e purificadas ou regiões, e podem ser gerados anticorpos monoclonais ou policlonais utilizando as proteínas Cif A naturais ou regiões activas do mesmo modo como acima descrito para obter tais anticorpos. Estão ainda disponíveis outros modos convencionais para gerar os anticorpos de Cif A utilizando proteínas CifA purificadas naturais ou recombinantes ou suas regiões activas, como será reconhecido por um perito na especialidade.

Como será reconhecido por um perito na especialidade, os anticorpos do presente invento podem também ser formulados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente humano ou animal de modo a tratar ou prevenir uma infecção causada por bactérias estafilocócicas. Composições farmacêuticas contendo os anticorpos do presente invento, ou seus fragmentos aceitáveis, podem ser formuladas em combinação com qualquer veículo, excipiente ou transportador 12

ΕΡ 1 377 314/PT farmacêutico adequado que será habitualmente utilizado nesta especialidade, incluindo solução salina, dextrose, áqua, glicerol, etanol, outros compostos terapêutico e suas combinações. Como um perito nesta especialidade reconhecerá, o veiculo, excipiente ou transportador particular utilizado variará dependendo do paciente e da condição do paciente, e vários modos de administração serão adequados para as composições do invento, como será reconhecido por um técnico competente nesta especialidade. Métodos adequados de administração de qualquer composição farmacêutica revelados neste pedido de patente incluem, mas não estão limitados a, administração tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal e intradérmica.

Para administração tópica, a composição é formulada na forma de uma pomada, creme, gel, loção, gotas (tais como gotas oculares e gotas para o ouvido) ou solução (tal como um colutório). Pensos para feridas ou cirúrgicos, suturas e aerossóis podem ser impregnados com a composição. A composição pode conter aditivos convencionais, tais como conservantes, solventes para promover a penetração, e emolientes. As formulações tópicas podem também conter transportadores convencionais tais como bases de creme ou de pomada, etanol ou álcool oleilico.

Formas adicionais de composições de anticorpo, e outra informação referente a composições, métodos e aplicações em relação a outras MSCRAMM™ serão também geralmente aplicáveis ao presente invento envolvendo anticorpos para a MSCRAMM™ de Cif A e são reveladas, por exemplo, na Patente dos E.U.A. 6288214 (Hook et al.) .

As composições de anticorpo do presente invento que são geradas contra o subdominio Clf33 de proteína Cif A podem também ser administradas com um adjuvante adequado numa quantidade eficaz para melhorar a resposta imunogénica contra o conjugado. Por exemplo, adjuvantes adequados podem incluir alúmen (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), que é amplamente utilizado em humanos, e outros adjuvantes tais como saponina e o seu componente purificado Quil A, adjuvante completo de Freund, adjuvante RIBBI e outros adjuvantes 13

ΕΡ 1 377 314/PT utilizados em aplicações de investigação e veterinárias. Podem também ainda ser úteis outras preparações definidas quimicamente tais como muramildipéptido, monofosforil-lipido A, conjugados de fosfolipido tais como os descritos por Goodman-Snitkoff et al. , J. Immunol. 147:410-415 (1991), encapsulação do conjugado num proteolipossoma como descrito por Miller et ai., J. Exp. Med. 17 6:1739-1744 (1992) e encapsulação da proteina em vesículas de lipido tais como vesículas de lipido Novasome” (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH).

Em qualquer caso, as composições de anticorpo do presente invento serão assim úteis para interferência, modulação, inibição das interacções de ligação entre ClfA em bactérias estafilocócicas e fibrinogénio em células e tecidos de hospedeiro, ou desprendimento de bactérias estafilocócicas que ficaram ligadas a fibrinogénio associado a células e tecidos de hospedeiro. Por conseguinte, o presente invento terá aplicabilidade particular no desenvolvimento de composições e métodos para prevenção ou tratamento de infecções estafilocócicas, e para inibição da ligação de bactérias estafilocócicas a células e/ou tecido de hospedeiro. São aqui proporcionados métodos para prevenção ou tratamento de uma infecção estafilocócica que compreendem administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo para a sub-região Clf33 de ClfA como acima descrito em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a infecção. Para além disso, estes anticorpos monoclonais mostraram ser úteis na dificultação da ligação de bactérias estafilocócicas a fibrinogénio ou fibrina, e assim provaram ser eficazes no tratamento ou prevenção de infecção por bactérias estafilocócicas tais como S. aureus. Ainda adicionalmente, os anticorpos de acordo com o invento são duplamente eficazes pelo facto de terem mostrado ser reactivos de modo cruzado através de uma ampla variedade de estirpes de S. aureus o que assim melhorará a eficácia e a eficiência de composições baseadas nos anticorpos monoclonais do presente invento.

Por conseguinte, de acordo com o invento, a administração do anticorpo do presente invento em qualquer 14

ΕΡ 1 377 314/PT dos modos convencionais acima descritos (e.g., tópico, parentérico, intramuscular, etc.)/ proporcionará assim um método extremamente útil para tratar ou prevenir infecções estafilocócicas em pacientes humanos ou animais. Por quantidade eficaz pretende-se significar aquele nivel de utilização, tal como o nivel de um titulo de anticorpo, que será suficiente para impedir a adesão das bactérias, para inibir a ligação de bactérias estafilocócicas a células hospedeiras e assim ser útil no tratamento ou prevenção de uma infecção estafilocócica. Como será reconhecido por um técnico competente nesta especialidade, o nivel de titulo de anticorpo necessário para ser eficaz para tratar ou prevenir uma infecção estafilocócica variará dependendo da natureza e condição do paciente, e/ou da gravidade da infecção estafilocócica pré-existente.

Para além da utilização de anticorpo 12-9 para a sub-região Clf33 de proteína Cif A para tratar ou prevenir uma infecção por S. aureus como acima descrito, o presente invento contempla a utilização deste anticorpo de vários modos, incluindo a detecção da presença de S. aureus para diagnosticar uma infecção estafilocócica, seja num paciente ou num equipamento médico que pode também ficar infectado. Um método preferido para detectar a presença de infecções estafilocócicas envolve os passos de obter uma amostra suspeita de estar infectada por uma ou mais espécies ou estirpes de bactérias estafilocócicas, tais como uma amostra retirada de um indivíduo, por exemplo, do próprio sangue, saliva, tecidos, osso, músculo, cartilagem ou pele. As células podem depois ser lisadas, e o ADN extraído, precipitado e amplificado. Após isolamento da amostra, podem-se realizar ensaios de diagnóstico utilizando o anticorpo do presente invento para detectar a presença de S. aureus,. e estas técnicas de ensaio para determinar uma tal presença numa amostra são bem conhecidas dos peritos na especialidade e incluem métodos tais como radioimunoensaio, análise Western blot e ensaios ELISA. Em geral, é contemplado um método de diagnóstico de uma infecção por S. aureus onde a uma amostra suspeita de estar infectada com uma infecção por S. aureus se adiciona um anticorpo de proteína Clf33 de acordo com o presente invento, e o S. aureus é indicado pela ligação de anticorpo à proteína Clf33 na amostra. 15

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Por conseguinte, anticorpo 12-9 ou outros aqui descritos podem ser utilizados para a detecção especifica de proteínas map estafilocócicas, para a prevenção de infecção por bactérias estafilocócicas, para o tratamento de uma infecção em curso ou para utilização como ferramentas de investigação. 0 termo "anticorpos" como aqui utilizado inclui anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia simples, biespecíficos, simianizados e humanizados ou primatizados bem como fragmentos Fab, tais como aqueles fragmentos que mantêm a especificidade de ligação dos anticorpos para a proteína Clf33, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab. Por conseguinte, o invento contempla a utilização de cadeias simples tais como as cadeias variáveis pesada e leve dos anticorpos como será a seguir descrito. A geração de quaisquer destes tipos de anticorpos ou fragmentos de anticorpo é bem conhecida dos peritos na especialidade. No presente caso, gerou-se e isolou-se anticorpo monoclonal 12-9 para proteína Clf33 e mostrou-se que este protege contra infecção estafilocócica.

Qualquer dos anticorpos acima descritos pode ser marcado directamente com um marcador detectável para identificação e quantificação de bactérias estafilocócicas. São geralmente conhecidos dos peritos na especialidade marcadores para utilização em imunoensaios e incluem enzimas, radioisótopos, e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogénicas, incluindo partículas coradas tais como ouro coloidal ou pérolas de látex. Imunoensaios adequados incluem ensaios de imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

Alternativamente, o anticorpo pode ser marcado indirectamente por reacção com substâncias marcadas que possuem uma afinidade por imunoglobulina. 0 anticorpo pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada possuindo uma afinidade pela segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a biotina e o conjugado de anticorpo-biotina detectado utilizando avidina ou estreptavidina marcados. Similarmente, o anticorpo pode ser conjugado a um hapteno e o conjugado anticorpo-hapteno detectado utilizando anticorpo anti-hapteno marcado. Estes e 16 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ outros métodos de marcação de anticorpos e conjugados de ensaio são bem conhecidos dos peritos na especialidade.

Podem-se também utilizar anticorpos para Clf33 como acima descrito em instalações de produção ou laboratórios para isolar quantidades adicionais das proteínas, tal como por cromatografia de afinidade. Por exemplo, os anticorpos do invento podem também ser utilizados para isolar quantidades adicionais da proteína CifA ou seus fragmentos activos. 0 anticorpo 12-9 isolado do presente invento, ou seus fragmentos activos, pode também ser utilizado no desenvolvimento de vacinas para imunização passiva contra infecções estafilocócicas. Adicionalmente, quando administrados como composição farmacêutica a uma ferida ou utilizados para revestir dispositivos médicos ou biomateriais poliméricos in vitro e in vivo, os anticorpos do presente invento podem ser úteis naqueles casos onde existe uma infecção estafilocócica prévia por causa da capacidade deste anticorpo para restringir e inibir adicionalmente a ligação de S. aureus a fibrinogénio ou fibrina e assim limitar a extensão e a disseminação da infecção. Para além disso, o anticorpo pode ser modificado como necessário tal que, em certos casos, seja menos imunogénico no paciente a quem é administrado. Por exemplo, se o paciente é um humano, o anticorpo pode ser "humanizado" por transplante das regiões determinantes de complementaridade do anticorpo derivado de hibridoma para um anticorpo monoclonal humano como descrito, e.g., por Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986) ou Tempest et al. Biotechnology 9:266-273 (1991) ou "embutidos" por alteração dos resíduos de estrutura murinos expostos à superfície nas regiões variáveis de imunoglobulina para mimetizar uma estrutura correspondente humana homóloga como descrito, e.g., por Padlan, Molecular Imm. 28:489-498 (1991). Ainda adicionalmente, quando assim desejado, os anticorpos monoclonais do presente invento podem ser administrados em conjunto com um antibiótico adequado para intensificar adicionalmente a capacidade das presentes composições para combater infecções bacterianas.

Dispositivos médicos ou biomateriais poliméricos a serem revestidos com os anticorpos, proteínas e fragmentos activos 17

ΕΡ 1 377 314/PT aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, agrafos, suturas, válvulas cardíacas de substituição, dispositivos de assistência cardíaca, lentes de contacto duras e moles, implantes de lente intraocular (câmara anterior ou câmara posterior), outros implantes tais como inclusões corneanas, querato-próteses, stents vasculares, dispositivos de epiceratofacia, shunts de glaucoma, agrafos retinianos, ganchos esclerais, próteses dentárias, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringoplásticos, enxertos vasculares, próteses de tecido mole e duro incluindo, mas não limitadas a, bombas, dispositivos eléctricos incluindo estimuladores e registadores, próteses auditivas, pacemakers, laringe artificial, implantes dentários, implantes mamários, implantes penianos, tendões crânio/faciais, articulações, tendões, ligamentos, meniscos e discos artificiais, ossos artificiais, órgãos artificiais incluindo pâncreas artificial, corações artificiais, membros artificiais e válvulas cardíacas; stents, arames, arames guia, cateteres intravenosos e venosos centrais, dispositivos para angioplastia laser e de balão, dispositivos vasculares e cardíacos (tubos, cateteres, balões), auxiliares ventriculares, componentes para diálise ao sangue, oxigenadores de sangue, dispositivos uretrais/ureterais/urinários (cateteres de Foley, stents, tubos e balões), cateteres das vias aéreas (tubos endotraqueais e de traqueostomia e cuffs) , tubos de alimentação entérica (incluindo tubos nasogástricos, intragástricos e jejunais), tubos para drenagem de feridas, tubos utilizados para drenar as cavidades corporais tais como as cavidades pleurais, peritoneais, cranianas e pericárdicas, sacos para sangue, tubos de ensaio, tubos para colheita de sangue, tubos sob vácuo [vacutainers) , seringas, agulhas, pipetas, pontas de pipeta e tubagem para sangue.

Será entendido pelos peritos na especialidade que o termo "revestido" ou "revestimento", como aqui utilizado, significa aplicar o anticorpo ou fragmento activo, ou composição farmacêutica derivada destes, a uma superfície do dispositivo, preferivelmente uma superfície exterior que será exposta a infecção bacteriana estafilocócica. Não é necessário que a superfície do dispositivo esteja 18

ΕΡ 1 377 314/PT inteiramente coberta pela proteína, anticorpo ou fragmento activo.

Numa concretização preferida, o anticorpo 12-9 pode também ser utilizado como uma vacina passiva que será útil em proporcionar anticorpos adequados para tratar ou prevenir uma infecção estafilocócica. Como será reconhecido por um perito nesta especialidade, uma vacina pode ser embalada para administração de vários modos, tais como por administração parentérica (i.e., intramuscular, intradérmica ou subcutânea) ou administração nasofaríngica (i.e., intranasal). Um destes modos de administração é quando a vacina é injectada intramuscularmente, e.g., no músculo deltoide, contudo, o modo particular de administração dependerá da natureza da infecção bacteriana com que se está a lidar e da condição do paciente. A vacine é preferivelmente combinada com um transportador farmaceuticamente aceitável para facilitar a administração, e o transportador é usualmente água ou uma solução salina tamponada, com ou sem um conservante. A vacina pode ser liofilizada para ressuspensão no momento da administração ou solução. A dose preferida para administração de uma composição de anticorpo de acordo com o presente invento é aquela quantidade que será eficaz para prevenir ou tratar uma infecção estafilocócica, e será prontamente reconhecido que esta quantidade variará grandemente dependendo da natureza da infecção e da condição de um paciente. Como indicado acima, uma "quantidade eficaz" de anticorpo ou agente farmacêutico a utilizar de acordo com o invento pretende significar uma quantidade não tóxica mas suficiente do agente, de modo a produzir o efeito profiláctico ou terapêutico desejado. Como será salientado abaixo, a quantidade exacta do anticorpo ou de um agente particular que é requerida variará de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade e condição geral do sujeito, da gravidade da condição que está a ser tratada, do transportador ou adjuvante particular que está a ser utilizado e do seu modo de administração, e outros. Por conseguinte, a "quantidade eficaz" de qualquer composição de anticorpo particular variará com base nas circunstâncias particulares, e uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada em cada caso de aplicação por um técnico 19

ΕΡ 1 377 314/PT competente na especialidade utilizando apenas experimentação de rotina. A dose deverá ser ajustada para servir ao indivíduo a quem a composição é administrada e variará com a idade, peso e metabolismo do indivíduo. As composições podem conter adicionalmente estabilizantes ou conservantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como timerosal (sal de sódio de etil(2-mercaptobenzoato-S)mercúrio) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

Quando utilizados com marcadores adequados ou outras biomoléculas ou agentes químicos apropriados detectáveis, os anticorpos monoclonais aqui descritos são úteis para fins tais como diagnóstico in vivo e in vitro de infecções estafilocócicas ou detecção de bactérias estafilocócicas. A investigação em laboratório pode também ser facilitada através da utilização destes anticorpos. São bem conhecidos dos peritos na especialidade vários tipos de marcadores e métodos de conjugação dos marcadores aos anticorpos do invento, tais como os descritos abaixo.

Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado (directamente ou via quelação) a um marcador radioactivo tal como, mas não limitado a, 32P, 3H, 14C, 35S, 125I ou 131I. A detecção de um marcador pode ser realizada por métodos tais como contagem de cintilação, espectrometria de raios gama ou auto-radiografia. São também úteis marcadores bioluminescentes, tais como os derivados de luciferina de pirilampo. A substância bioluminescente é ligada covalentemente à proteína por métodos convencionais, e a proteína marcada é detectada quando uma enzima, tal como luciferase, catalisa uma reacção com ATP fazendo com que a molécula bioluminescente emita fotões de luza. Podem-se também utilizar fluorogénios para marcar proteínas. Exemplos de fluorogénios incluem fluoresceína e derivados, ficoeritrina, alo-ficocianina, ficocianina, rodamina e Vermelho do Texas. Os fluorogénios são geralmente detectados por um detector de fluorescência. A localização de um ligando em células pode ser determinada por marcação de um anticorpo como acima descrito e detecção do marcador de acordo com métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, tais como microscopia de 20

ΕΡ 1 377 314/PT imunofluorescência utilizando procedimentos tais como os descritos por Warren e Nelson (Mol. Cell. Biol, 7: 1326-1337, 1987).

Como acima indicado, o anticorpo monoclonal do presente invento, ou seus fragmentos ou porções activas, é particularmente útil para interferir com a interacção física inicial entre um patogénio estafilocócico responsável pela infecção e um hospedeiro de mamífero, tal como a adesão das bactérias a proteínas de matriz extracelular de mamífero tal como fibrinogénio, e esta interferência com a interacção física pode ser útil tanto no tratamento de pacientes como na prevenção ou redução de infecções bacterianas em dispositivos médicos implantáveis para os tornar mais seguros para utilização.

Noutra concretização do presente invento, é proporcionado um kit que pode ser útil no isolamento e identificação de bactérias e infecções estafilocócicas que compreende o anticorpo do presente invento numa forma adequada, tal como liofilizada num único vaso que depois se torna activa por adição de uma amostra aquosa suspeita de conter as bactérias estafilocócicas. Um tal kit incluirá tipicamente um recipiente adequado para alojar o anticorpo numa forma adequada em conjunto com um reagente de detecção imunológica adequado que permitirá a identificação de ligação de complexos ao anticorpo do invento. Por exemplo, o reagente de detecção imunológica pode compreender um sinal ou marcador detectável adequado, tal como uma biotina ou enzima que produz uma cor detectável, etc., que normalmente pode ser ligado ao anticorpo ou que pode ser utilizado de outros modos adequados para proporcionar um resultado detectável quando o anticorpo se liga ao antigénio.

Resumindo, o anticorpo do presente invento que se liga à proteína Clf33 ou seus fragmentos activos são assim extremamente úteis para tratar ou prevenir infecções estafilocócicas em pacientes humanos e animais e em dispositivos médicos ou outros dispositivos implantáveis. Por conseguinte, são também aqui descritos métodos para identificação e isolamento de anticorpos que se podem ligar a Clf33 e que podem ser úteis em métodos de tratamento de 21 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ infecções estafilocócicas que envolvem morte opsonofagocítica das bactérias.

EXEMPLOS São proporcionados os exemplos seguintes que exemplificam aspectos das concretizações preferidas do presente invento. Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas identificadas pelos inventores para funcionarem bem na prática do invento, e assim pode-se considerar que constituem modos preferidos para a sua prática. No entanto, à luz da presente revelação, os peritos na especialidade deverão reconhecer que se podem efectuar muitas modificações nas concretizações especificas que são reveladas e ainda assim obter um resultado idêntico ou similar sem sair do âmbito do invento.

Exemplo 1. Isolamento e sequenciação de Clf40 e Clf33

Utilizando PCR, amplificou-se o domínio A de Cif A (Clf40 representando AA 40-559 ou Clf33 representando AA 221-550) a partir de ADN genómico de S. aureus Newman e subclonou-se no vector de expressão de E. coli PQE-30 (Qiagen), o que permite a expressão de uma proteína de fusão recombinante contendo seis resíduos histidina. Este vector foi subsequentemente transformado na estirpe de E. coli ATCC 55151, cultivou-se num fermentador de 15 litros até uma densidade óptica (OD6oo) de 0,7 e induziu-se com isopropil-l-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Colheram-se as células utilizando uma montagem de fibras ocas AG Technologies (tamanho de poro de 0,45 μπι) e congelou-se a pasta de células a -80°C. Lisaram-se as células em PBS IX (10 mL de tampão/1 g de pasta de células) utilizando 2 passagens através da prensa francesa a 1100 psi. Centrifugaram-se as células lisadas a 17000 rpm durante 30 minutos para remover os resíduos celulares. Fez-se passar o sobrenadante sobre uma coluna quelante HiTrap (Pharmacia) de 5 ml carregada com N1CI2 0,1 M. Após carregamento, lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampão A) . Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de 0-100% de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazole 200 mM (Tampão B) com 30 volumes 22 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ de coluna. Clf40 ou Clf33 foram eluidas para ~13% de Tampão B (imidazole ~26 mM). Monitorizou-se a absorvância a 280 nm. As fracções contendo Clf40 ou Clf33 foram dialisadas em PBS lx.

Submeteu-se depois a proteína a um protocolo de remoção de endotoxina. Os tampões utilizados durante este protocolo foram libertados de endotoxina por passagem sobre uma coluna Mono-Q Sepharose (Pharmacia) de 5 ml. Dividiu-se a proteína equitativamente entre tubos 4x 15 ml. Ajustou-se o volume de cada tubo a 9 ml com Tampão A. Adicionou-se 1 ml de Triton X-114 a 10% a cada tubo e incubou-se com rotação durante 1 hora a 4°C. Colocaram-se os tubos num banho de água a 37 °C para separar as fases. Centrifugaram-se os tubos a 2000 rpm durante 10 minutos e recolheu-se a fase aquosa superior de cada tubo e repetiu-se a extracção com detergente. Combinaram-se as fases aquosas da segunda extracção e fez-se passar sobre uma coluna quelante IDA (Sigma) de 5 ml, carregada com N1CI2 0,1 M para remover o detergente restante. Lavou-se a coluna com 9 volumes de coluna de Tampão A antes de se eluir a proteína com 3 volumes de coluna de Tampão B. Fez-se passar o eluente sobre uma coluna Detoxigel (Sigma) de 5 ml e recolheu-se o caudal de saída e reaplicou-se à coluna. Recolheu-se o caudal de saída da segunda passagem e dialisou-se em PBS lx. Analisou-se o produto purificado em relação a concentração, pureza e nível de endotoxina antes da administração aos ratinhos. São incluídas abaixo as sequências de proteína e ácido nucleico. A sequência de aminoácidos de Clf40 é incluída a seguir como SEQ ID NO: 2, e esta é codificada pela sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:l, e será também codificada pelos seus degenerados. A sequência de aminoácidos de Clf33 é incluída a seguir como SEQ ID NO:4, e esta é codificada pela sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:3, e será também codificada pelos seus degenerados.

Exemplo 2. Produção de anticorpo monoclonal utilizando Clf40 e Clf33

Utilizou-se a proteína Clf40 ou Clf33 purificada para gerar um painel de anticorpos monoclonais murinos. Resumidamente, um grupo de ratinhos Balb/C recebeu uma série 23

ΕΡ 1 377 314/PT de imunizações subcutâneas de 50 μg de proteína Clf40 ou Clf33 em solução ou misturadas com adjuvante como a seguir descrito na Tabela I:

Tabela I:

Injecção Dia Quantidade (pg) Via Adjuvante

Primária 0 50 Subcutânea Completo de Freund

Reforço #1 14 5 (Clf40) Intravenosa PBS 10 (Cif33)

Três dias após o reforço final, removeram-se os baços, destacaram-se numa suspensão de células individuais e colheram-se os linfócitos. Fundiram-se depois os linfócitos com uma linha de células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC #1581). Fusão celular, plaqueamento subsequente e alimentação foram realizados de acordo com o protocolo para produção de anticorpos monoclonais de Current Protocols in Immunology (Capítulo 2, Unidade 2.).

Quaisquer clones gerados a partir da fusão foram depois rastreados quanto à produção de anticorpo anti-Clf40 específico utilizando um ensaio ELISA padrão. Expandiram-se os clones positivos e testaram-se adicionalmente. Identificaram-se originalmente quinze clones positivos e clonaram-se por diluição limitante para caracterização adicional. Testaram-se clones de células individuais quanto a actividade num ELISA de ligação directa, um ELISA modificado para medir a inibição da ligação de fibrinogénio a Clf40, ligação de células bacterianas inteiras por citometria de fluxo e afinidade pela ligação a Clf40 por análise Biacore. Os resultados dos testes estão incluídos na Tabela II seguinte: 24

ΕΡ 1 377 314/PT

Tabela II:

Anticorpo monoclonal de CifA Cinética de ligação Inibição da ligação a fibrinogénio Ligação a S. aureus Barnett Ligação a S. aureus 67-0 Ligação a S. aureus ATCC #25923 Ligação a S. aureus ATCC #49230 F12-9 kon 7,74xl05 50-70% 72% 62% 60% 94% ko££ 4,46xlCT4 KD 5,76xlO"10 F13-1 kon Ι,ΙΙχΙΟ5 0-15% - - - 9% ko££ 6,13xl0"3 KD 5,51xl0"6 F13-2 kon 1,19χ105 40-60% 59% 65% 55% 93% ko££ 2,81χ10"4 KD 2,35χ10"9

Ligação a bactérias inteiras

Colheram-se amostras bacterianas de S. aureus (estirpes Barnett, 67-0, ATCC#25923 e ATCC#49230), lavaram-se e incubaram-se com Mab 13-2, 12-9, 13-1 ou PBS sozinho (controlo) numa concentração de 2 mg/ml após bloquear os locais de proteína A com IgG de coelho (50 mg/ml) . Após incubação com anticorpo, incubaram-se as células bacterianas com Cabra-F(ab') 2-Anti-Ratinho-F(ab'J2-FITC que serviu como o anticorpo de detecção. Após marcação de anticorpo, aspiraram-se as células bacterianas através do citómetro de fluxo FACScaliber para analisar a emissão de fluorescência (excitação: 488, emissão: 570). Para cada estirpe bacteriana, colheram-se e mediram-se 10000 eventos.

Inibição (ELISA)

Revestiram-se placas de 96 poços de elevada ligação com solução de 1 pg/ml de Clf40 em PBS (pH 7,4), cobriram-se e incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavaram-se depois as placas com PBS, Tween 20 a 0,05% e bloquearam-se com solução de BSA a 1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, adicionou-se sobrenadante de anticorpo monoclonal e incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e 25

ΕΡ 1 377 314/PT adicionou-se a cada poço solução de fibrinogénio humano 0,1 mg/ml. Incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente e lavaram-se. Adicionou-se conjugado AP anti-fibrinogénio de ovelha numa diluição 1:750 em PBS, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1% e deixaram-se incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e adicionou-se pNPP (solução de revelação) numa concentração final de 1 mg/ml. Incubaram-se as placas 15-30 minutos a 37°C e leram-se os resultados a 405 nm e analisaram-se utilizando um leitor HTS 7000 Bio-Assay da Perkin Elmer.

Análise cinética

Realizou-se a análise cinética num Biacore 3000 utilizando o método de captura de ligando incluído no software. Um anticorpo Fc de coelho anti-ratinho (Biacore) foi acoplado por amina a um chip CM5. O anticorpo monoclonal a ser analisado foi depois passado sobre o chip, permitindo a ligação à porção Fc. Fizeram-se depois passar sobre a superfície do chip concentrações variáveis da proteína Clf40 ou Cif33 e recolheram-se os dados. Utilizando o software de avaliação fornecido pela Biacore (Versão 3.1), mediram-se kon e k0ff e calcularam-se KA e KD.

Exemplo 3. Estudos adicionais de Clf40 e Clf33

Utilizando PCR, amplificou-se o domínio A de ClfA (Clf40 representando AA 40-559, domínio C1Í33-N2N3 representando AA 221-550 ou domínio Clf-N3 representando AA 370-559) a partir de ADN genómico de S. aureus Newman e subclonou-se no vector de expressão de E. coli PQE-30 (Qiagen), o que permite a expressão de uma proteína de fusão recombinante contendo seis resíduos histidina. Este vector foi subsequentemente transformado na estirpe de E. coli ATCC 55151, cultivou-se num fermentador de 15 litros até uma densidade óptica (OD6oo) de 0,7 e induziu-se com isopropil-l-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Colheram-se as células utilizando uma montagem de fibras ocas AG Technologies (tamanho de poro de 0,45 μπι) e congelou-se a pasta de células a -80°C. Lisaram-se as células em PBS IX (10 mL de tampão/1 g de pasta de células) utilizando 2 passagens através da prensa francesa a 1100 psi. Centrifugaram-se as células lisadas a 17000 rpm 26 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ durante 30 minutos para remover os resíduos celulares. Fez-se passar o sobrenadante sobre uma coluna quelante HiTrap (Pharmacia) de 5 ml carregada com N1CI2 0,1 M. Após carregamento, lavou-se a coluna com 5 volumes de coluna de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampão A) . Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de 0-100% de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazole 200 mM (Tampão B) com 30 volumes de coluna. A proteína Cif foi eluída para ~13% de Tampão B (imidazole ~26 mM). Monitorizou-se a absorvância a 280 nm. As fracções contendo Clf40 ou Clf33 foram dialisadas em PBS lx.

Submeteu-se depois a proteína a um protocolo de remoção de endotoxina. Os tampões utilizados durante este protocolo foram libertados de endotoxina por passagem sobre uma coluna Mono-Q Sepharose (Pharmacia) de 5 ml. Dividiu-se a proteína equitativamente entre tubos 4x 15 ml. Ajustou-se o volume de cada tubo a 9 ml com Tampão A. Adicionou-se 1 ml de Triton X-114 a 10% a cada tubo e incubou-se com rotação durante 1 hora a 4°C. Colocaram-se os tubos num banho de água a 37°C para separar as fases. Centrifugaram-se os tubos a 2000 rpm durante 10 minutos e recolheu-se a fase aquosa superior de cada tubo e repetiu-se a extracção com detergente. Combinaram-se as fases aquosas da segunda extracção e fez-se passar sobre uma coluna quelante IDA (Sigma) de 5 ml, carregada com N1CI2 0,1 M para remover o detergente restante. Lavou-se a coluna com 9 volumes de coluna de Tampão A antes de se eluir a proteína com 3 volumes de coluna de Tampão B. Fez-se passar o eluente sobre uma coluna Detoxigel (Sigma) de 5 ml e recolheu-se o caudal de saída e reaplicou-se à coluna. Recolheu-se o caudal de saída da segunda passagem e dialisou-se em PBS lx. Analisou-se o produto purificado em relação a concentração, pureza e nível de endotoxina antes da administração aos ratinhos.

Produção de anticorpo monoclonal

Utilizou-se a proteína Clf40, Clf33 ou N3 purificada para gerar um painel de anticorpos monoclonais murinos. Resumidamente, um grupo de ratinhos Balb/C ou SJL recebeu uma série de imunizações subcutâneas de 1-10 mg de proteína em solução ou misturadas com adjuvante como a seguir descrito na Tabela III: 27 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Tabela III:

Injecção RIMMS Dia Quantidade(mg) Via Adjuvante #1 0 5 Subcutânea FCA/RIBI #2 2 1 Subcutânea FCA/RIBI #3 4 1 Subcutânea FCA/RIBI #4 7 1 Subcutânea FCA/RIBI #5 9 1 Subcutânea FCA/RIBI Injecção Convencional Dia Quantidade(mg) Via Adj uvante Primária 0 5 Subcutânea FCA Reforço #1 14 1 Intraperitoneal RIBI Reforço #2 28 1 Intraperitoneal RIBI Reforço #3 42 1 Intraperitoneal RIBI

No momento do sacrifício ( RIMMS) ou sete dias após um reforço (convencional) recolheu -se o soro e titulou-se em ensaios ELISA contra MSCRAMM ou em células inteiras (S. aureus e S. epidermidis) . Três dias após o reforço final, removeram-se os baços ou os nódulos linfáticos, destacaram-se numa suspensão de células individuais e colheram-se os linfócitos. Fundiram-se depois os linfócitos com uma linha de células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC #1581). Fusão celular, plaqueamento subsequente e alimentação foram realizados de acordo com o protocolo para produção de anticorpos monoclonais de Current Protocols in Immunology (Capitulo 2, Unidade 2 . ) .

Quaisquer clones gerados a partir da fusão foram depois rastreados quanto à produção de anticorpo anti-Clf40, SdrG ou FnbpA especifico utilizando um ensaio ELISA padrão. Expandiram-se os clones positivos e testaram-se adicionalmente. Testaram-se ainda os candidatos quanto a actividade num ELISA de ligação directa, um ELISA modificado para medir a inibição da ligação de fibrinogénio a Clf40, ligação de células bacterianas inteiras por citometria de fluxo e ligação a Clf40 / inibição da ligação de fibrinogénio-Clf40 por análise Biacore.

Análise Biacore

Ao longo da análise, o caudal permaneceu constante a 10 ml/min. Antes da injecção de ClfA40, o anticorpo de teste foi 28

ΕΡ 1 377 314/PT adsorvido ao chip através de ligação RAM-Fc. No momento 0, injectou-se Cif A 40 numa concentração de 30 mg/ml sobre o chip durante 3 min seguindo-se 2 minutos de dissociação. Esta fase da análise mediu as cinéticas de associação e dissociação relativas da interacção Mab/ClfA. Na segunda fase da análise, mediu-se a capacidade da Cif A ligada a Mab para interagir e se ligar a fibrinogénio. Injectou-se fibrinogénio numa concentração de 100 mg/ml sobre o chip e após 3 minutos colheu-se um ponto de registo.

Ligação a bactérias inteiras

Colheram-se amostras bacterianas (Newman), lavaram-se e incubaram-se com Mab ou PBS sozinho (controlo) numa concentração de 2 mg/ml após bloquear os locais de proteína A com IgG de coelho (50 mg/ml) . Após incubação com anticorpo, incubaram-se as células bacterianas com Cabra-F(ab' )2-Anti-Ratinho-Fjab')2_FITC que serviu como o anticorpo de detecção. Após marcação de anticorpo, aspiraram-se as células bacterianas através do citómetro de fluxo FACScaliber para analisar a emissão de fluorescência (excitação: 488, emissão: 570) . Para cada estirpe bacteriana, colheram-se e mediram-se 10000 eventos.

Inibição (ELISA)

Revestiram-se placas de 96 poços de elevada ligação com solução de 1 pg/ml de Clf40 em PBS (pH 7,4), cobriram-se e incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavaram-se depois as placas com PBS, Tween 20 a 0,05% e bloquearam-se com solução de BSA a 1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, adicionou-se sobrenadante de anticorpo monoclonal e incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e adicionou-se a cada poço solução de fibrinogénio humano 0, 1 mg/ml. Incubaram-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente e lavaram-se. Adicionou-se conjugado AP anti-fibrinogénio de ovelha numa diluição 1:750 em PBS, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1% e deixaram-se incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas e

adicionou-se pNPP (solução de revelação) numa concentração final de 1 mg/ml. Incubaram-se as placas 15-30 minutos a 37°C 29

ΕΡ 1 377 314/PT e leram-se os resultados a 405 nm e analisaram-se utilizando um leitor HTS 7000 Bio-Assay da Perkin Elmer.

Exemplo 4. A imunização com a totalidade ou porções de Clf40 gera anticorpos monoclonais com diferentes padrões de reactividade. A Tabela IV abaixo mostra os resultados dos ensaios de imunização com as regiões activas do presente invento, incluindo Clf40, Clf33 (que constitui a região N2N3 do domínio A de ClfA), e a região N3 de ClfA sozinha.

Tabela IV

Antigénio Fusão Monoclonal Reactividade

ELISA Biacore Citometria Inibição FYI Clf40 SdrGFnbpALigação Inibição de fluxo ClfA N3 inclui RIMMS F29-19 Y N N N N nt nt os seguintes: F29-71 Y N N N N nt nt F29 F30 F31 F29-92 Y N N N N nt nt F32 F34 F36 F31-20 Y N N N N nt nt F31-36 Y N N N N nt nt F31-100 Y N N N N nt nt F31-195 Y N N N N nt nt F32-22 Y N N N N nt nt F34-15 Y N N N N nt nt F36-77 Y N N N N nt nt F36-197 Y N N N N nt nt ClfA N2N3 Convencional INH- Y N N Y N Y Y 12-9 (Clf33) inclui M010001 os seguintes: F12-3 Y nt nt Y nt Y N Fll F12 F17 F12-1 Y nt nt Y nt Y N F18 F12-5 Y nt nt Y nt Y N F12-10 Y nt nt Y nt Y Y ClfA N2N3 RIMMS F33-7 Y N N Y Y Y nt (Clf33) inclui F35-279 Y N N Y Y N nt os seguintes: F35-177 Y N N Y N Y nt F33 F35 F38 F40-7 Y N N Y Y Y nt F40 F38-300 Y N N Y Y N nt F35-129 Y N N N N nt nt Cif40 inclui Convencional INH- Y nt nt Y N Y Y 13-2 os seguintes: M000030 F13 F14 F15 INH- Y nt nt Y N Y N 15- F16 M010004 EC6 INH- Y nt nt Y N N N 13-1 M010003 F13-6 Y nt nt Y nt Y Y Y = um resultado positivo N = um resultado negativo nt = não testado

Os resultados apresentados nesta tabela mostram que as imunizações para gerar anticorpos monoclonais com Clf40 ou 30

ΕΡ 1 377 314/PT porções de Clf40 (N2N3 ou N3) produzem anticorpos monoclonais com amplos e diversos perfis de reactividade e que exibem reactividade cruzada substancial através de uma ampla variedade de estirpes estafilocócicas.

Exemplo 5: Utilização do Biacore para seleccionar Mabs de elevada afinidade que bloqueiam a ligação de ClfA a fibrinogénio.

Análise Biacore

Ao longo da experiência representada na Figura 1, o caudal permaneceu constante a 10 ml/min. Antes da injecção de ClfA 40, adsorveram-se ao chip 946 RU de Mab 13-1 e 768 RU de Mab 13-2 através de ligação RAM-Fc. No tempo 0 no gráfico, injectou-se sobre o chip ClfA 40 numa concentração de 30 mg/ml durante 3 min seguindo-se 2 minutos de dissociação. O Mab 13-1 ligou 58 RU de ClfA e o Mab 13-2 ligou 168 RU de ClfA no final do tempo de injecção de ClfA. Esta fase da experiência mediu as cinéticas de associação e dissociação relativas da interacção Mab/ClfA. A segunda fase da experiência mede a capacidade da ClfA ligada a Mab para interactuar e se ligar a fibrinogénio. Injectou-se fibrinogénio sobre o chip numa concentração de 100 mg/ml e após 3 minutos à ClfA ligada a Mab 13-1 ligaram-se 64 RU de fibrinogénio mas à ClfA ligada a Mab 13-2 ligaram-se 0 RU de fibrinogénio.

Exemplo 6. Comparação de Mab 13.2 contra S. aureus estirpe Barnett e S. aureus ATCC 25923

Amplificação de anticorpo e purificação

Cultivaram-se células de hibridoma em meios RPMI/DMEM, IX Nutridoma-SP contendo piruvato de sódio 2 mM, L-glutamina 4 mM e penicilina-estreptomicina 2X até volumes de cultura de 2-3 litros. Colheram-se depois os sobrenadantes de hibridoma por centrifugação. Filtraram-se os sobrenadantes através de filtros de 0,45 pm e a IgG foi purificada por afinidade utilizando cromatografia de proteína G. Eluíram-se os anticorpos monoclonais utilizando glicina 0,1 M, pH 2,7 e neutralizaram-se de imediato com um décimo de volume de Tris 31

ΕΡ 1 377 314/PT 2 Μ, ρΗ 8,0. Dialisou-se depois a IgG purificada contra solução salina tamponada com D-fosfato IX, pH 7,4. Se necessário, concentrou-se o anticorpo purificado e congelaram-se aliquotas.

Estirpes de Staphylococcus aureus

Retiraram-se células de S. aureus de uma reserva em glicerol congelada e inocularam-se sobre uma única placa de agár de sangue e cultivaram-se durante 24 horas a 37 °C. Transferiram-se depois as colónias individuais para novas placas de agár de sangue. Inocularam-se oitenta placas para preparar 50 ml de reserva congelada final. Incubaram-se depois as placas durante 24 horas a 37°C. Após incubação, rasparam-se as colónias da superfície de cada placa para quatro tubos de 50 ml contendo 10 ml de PBS IX (20 placas por tubo) enquanto se agitava suavemente num vórtice para remover as bactérias do raspador. Adicionaram-se depois mais 10 ml de PBS IX aos 10 ml de suspensão bacteriana, enquanto se agitava vigorosamente num vórtice para facilitar a separação de quaisquer resíduos de agár das bactérias. Sedimentou-se a suspensão por centrifugação, 3500 x g a 4°C durante 10 minutos. Lavaram-se as bactérias em D-PBS e ressuspenderam-se em 50 ml de meio de congelação. Colocou-se a reserva bacteriana em aliquotas de 1 ml por congelação instantânea num banho de etanol/gelo seco e colocou-se num congelador a -80°C. Determinou-se a concentração (CFU/ml) da reserva congelada por descongelação de uma alíquota de 1 ml da reserva e preparação de diluições em série de 10“5 a 10~η.

Plaquearam-se diluições em duplicado sobre placas de agár de sangue e incubaram-se a 37°C durante 16-18 horas.

Determinaram-se as CFU/ml (CFU/ml = (número médio de colónias x factor de diluição)/0,050 ml) e ponderaram-se para cada diluição para determinar a CFU/ml média. No dia da injecção, descongelaram-se aliquotas de cada estirpe, combinaram-se num tubo por estirpe e agitaram-se em vórtice.

Animal, sexo, espécie, número, idade e origem

Ratinhos Balb/C fêmeas (5-6 semanas de idade) foram adquiridos no Taconic Quality Laboratory Animais and Services for Research (Germantown, NY) . Deixaram-se os animais 32

ΕΡ 1 377 314/PT aclimatar durante pelo menos 14 dias antes do inicio do tratamento. À chegada, examinaram-se os ratinhos, alojaram-se em grupo (5/gaiola) em gaiolas tipo caixa de sapatos de policarbonato com cama absorvente. Todos os ratinhos foram colocados num ciclo de 12 horas de luz-escuridão segundo as normas de pecuária requeridas que se podem encontrar no Guide for the Care and Use of Laboratory Animais da NIH.

Identificação e randomização

Todos os animais foram identificados de modo único utilizando tatuagens na cauda antes da dosagem. Antes do inicio do tratamento, pesaram-se individualmente os animais e avaliou-se o seu estado de saúde. Randomizaram-se os ratinhos e atribuiram-se a grupos de tratamento utilizando pesos corporais estratificados.

Anticorpos monoclonais (Mab) específicos de ClfA, isótipo

Os isótipos de anticorpos monoclonais murinos específicos de ClfA foram determinados utilizando um Becton Dickenson Cytometric Bead Array para isotipagem murina. Determinou-se o isótipo utilizando citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante. 13.1 Cif40 Mab, IgGi 13.2 Cif40 Mab, IgGi 12.9 Cif33 Mab, IgGi

Controlo ATTC 1771, IgGi A solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (PBS), foi comprada na Life Technologies, Inc. (N.° de Cat. 10010- 023; Lote N.°: 1078749). 33 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Desenho experimental

Tabela V. TRATAMENTO DESAFIO Grupo # N. ° de ratinhos Anticorpo Dose Via Frequência Tempo Bactéria Diluição da reserva Volume/Via 1 12 13-2 36 mg/ kg i.p. Uma vez -18 h ATCC 25923 1:20 0.1 ml/IV 2 15 CRL-1771 36 mg/ kg ATCC 25923 1:20 3 15 D-PBS N/A ATCC 25923 1:20 4 12 13-2 36 mg/ kg Barnett 1:20 5 15 CRL17 71 36 mg/ kg Barnett 1:20 6 15 D-PBS N/A Barnett 1:20

Dados dos animais in vivo

Trataram-se os ratinhos por injecção intraperitoneal (IP, 0,5 ml) com 0,5 mg de anticorpo monoclonal 13-2, anticorpo monoclonal de controlo de isótipo CRL-1771 ou PBS. Dezoito horas após administração de IgG, desafiaram-se os ratinhos com uma única injecção intravenosa (IV) de S. aureus estirpe Barnett ou S. aureus ATCC 25923. Seguiram-se os ratinhos durante 12 dias tempo após o qual todos os ratinhos restantes foram sacrificados. Foram detectadas diferenças significativas nos tempos de sobrevivência relativos entre grupos de tratamento. Oitenta por cento (10/12) dos ratinhos que receberam Mab 13-2, 13% (2/15) dos animais que receberam CRL-1771 e 0% (0/15) que receberam PBS sobreviveram ao desafio bacteriano com S. aureus Barnett (13-2 vs. PBS, p<0,0001; 13-2 vs. CRL-1771, p = 0,0009). A análise estatística dos dados dos animais foi conduzida utilizando análise de sobrevivência de Kaplan-Meier com um teste de Mantel-Cox (ordenamento log). Na experiência em que S. aureus ATCC 25923 foi o desafio bacteriano, sobreviveram 67% (8/12) dos ratinhos aos quais de administrou Mab 13-2, 27% (4/12)

sobreviveram no grupo tratado com CRL-1771 e apenas 7% (1/15) sobreviveram no grupo de PBS (13-2 vs. CRL-1771, p = 0,02; 13-2 vs. PBS, 0,0002). Estes resultados indicam claramente que anticorpos monoclonais específicos de MSCRAMM 34

ΕΡ 1 377 314/PT proporcionam um nivel de protecção significativo contra infecção letal com estirpes de S. aureus.

Exemplo 7. Isolamento e sequenciação de sequências da região variável. A. Anticorpo monoclonal 13-2.

Isolou-se ARN mensageiro a partir de células de hibridoma Cif A 13-2 utilizando o kit Fast Track 2.0 (Invitrogen; cat. #K4500) . Resumidamente, 1,4χ108 células de hibridoma cultivadas em meio DMEM-10 com 10% de FBS foram lavadas com PBS, sedimentadas por centrifugação e depois lisadas em detergente contendo Protein/RNase Degrader. Isolou-se ARNm Poli-A+ por purificação de afinidade sobre oligo-dT celulose. A síntese de ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 5 pg de ARNm e transcriptase reversa num kit de síntese de ADNc (Novagen; cat. #69001-3) contendo 20 pmol de iniciadores de 3'-oligonucleótido específicos de ratinho (Novagen; cat.# 69796 e 69812) para cada cadeia pesada variável e leve variável. Uma porção (5 a 50 ng) do ADNc foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o PCR Reagent System (Life Technologies; cat.#10198-018) e um conjunto de iniciadores específicos de cadeia pesada e cadeia leve variáveis de ratinho (Novagen; cat.#70081-3, 5 pmol de cada) durante 30 ciclos (início a quente a 94°C e depois ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min e 72°C durante 1 min). Os produtos de PCR foram fraccionados electroforeticamente num gel de agarose ultra puro a 1% em tampão de acetato de sódio e visualizados por coloração com brometo de etídio. Excisaram-se do gel fragmentos de PCR correspondendo ao tamanho previsto e purificaram-se utilizando colunas spin BIO 101 Geneclean (cat. #1101-400) para ligação no plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguindo-se transformação em E. coli TOP10 competente (Invitrogen, cat.# K4500). Após isolamento de ADN de plasmídeo utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat.# 27106), identificaram-se os clones positivos com inserções por digestão com endonuclease de restrição e electroforese em gel de agarose, seguindo-se sequenciação num sequenciador automático ABI utilizando iniciadores directo M13 e reverso M13. 35 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

As sequências resultantes foram as seguintes: 13-2VLA-1 (sequência leve variável)

AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAA

GGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAA

GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTGA

TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT

GGAT CT GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTACAAGCT GAAG ACCT G

GCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGAC

CAAGCTGGAAATAAAA

NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKMYLAWVQQKPGQSPKLLIY

WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCHQYLSSHTFGGGTKLE

IK • Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. 13-2VHC-3 (sequência pesada variável)

CAGGTGCATCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCC

TGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGATTCTCATTATCCAGATATAATATACACTG

GGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGT

GGTGAAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA

CACAGCCATGTACTACTGTGCCAGCGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTA

CTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

QVHLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYíJIHWVRQPPGKGLEWLGMlWGGE

NTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCASAYYGNSWFAYWG

QGTLV7VSA • Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. B. Anticorpo monoclonal 12-9.

Isolou-se ARN mensageiro a partir de células de hibridoma Cif A 12-9 utilizando o kit Fast Track 2.0 (Invitrogen; cat. #K4500) . Resumidamente, 1,4><108 células de hibridoma cultivadas em meio DMEM-10 com 10% de FBS foram lavadas com PBS, sedimentadas por centrifugação e depois lisadas em detergente contendo Protein/RNase Degrader. Isolou-se ARNm Poli-A+ por purificação de afinidade sobre oligo-dT celulose. A síntese de ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 5 pg de ARNm e transcriptase reversa num kit de síntese de ADNc (Novagen; cat. #69001-3) contendo 20 pmol de iniciadores de 3'-oligonucleótido específicos de ratinho (Novagen; cat.# 69796 e 69812) para cada cadeia 36 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ pesada variável e leve variável. Uma porção (5 a 50 ng) do ADNc foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o PCR Reagent System (Life Technologies; cat.#10198-018) e um conjunto de iniciadores específicos de cadeia pesada e cadeia leve variáveis de ratinho (Novagen; cat.#70081-3, 5 pmol de cada) durante 30 ciclos (início a quente a 94°C e depois ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min e 72°C durante 1 min). Os produtos de PCR foram fraccionados electroforeticamente num gel de agarose ultra puro a 1% em tampão de acetato de sódio e visualizados por coloração com brometo de etídio. Excisaram-se do gel fragmentos de PCR correspondendo ao tamanho previsto e purificaram-se utilizando colunas spin BIO 101 Geneclean (cat. #1101-400) para ligação no plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguindo-se transformação em E. coli TOP10 competente (Invitrogen; cat.# K4500). Após isolamento de ADN de plasmídeo utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat.# 27106), identificaram-se os clones positivos com inserções por digestão com endonuclease de restrição e electroforese em gel de agarose, seguindo-se sequenciação num sequenciador automático ABI utilizando iniciadores directo M13 e reverso M13.

As sequências resultantes foram as seguintes: 12-9VLA-1 (sequência leve variável)

AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAA

GGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAA

GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGA

TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT

GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT

GGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGA

CCAAGCTGGAAATAAAA

NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY

WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSYTFGGGTKLEI

K • Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. 12-9VHC-1 (sequência pesada variável)

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCC

TGTCCATCACATGCGCTATCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACT 37

ΕΡ 1 377 314/PT

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGG TGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAA GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA CAC AG CCAT GTATTACT GTG CCAGAAAAG GGG AATT CTACTAT GGTTACG ACG GGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCAISGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGG

GNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARKGEFYYGYDGFV

YWGQGTLVTVSA • Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. C. Anticorpo monoclonal 35-220.

Isolamento e sequenciação de sequências da região variável:

Isolou-se ARN mensageiro a partir de células de hibridoma CifA 35-220 utilizando o kit Fast Track 2.0 (Invitrogen; cat. #K4500) . Resumidamente, 1,4*108 células de hibridoma cultivadas em meio DMEM-10 com 10% de FBS foram lavadas com PBS, sedimentadas por centrifugação e depois lisadas em detergente contendo Protein/RNase Degrader. Isolou-se ARNm Poli-A+ por purificação de afinidade sobre oligo-dT celulose. A síntese de ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 5 mg de ARNm e transcriptase reversa num kit de síntese de ADNc (Novagen; cat. #69001-3) contendo 20 pmol de iniciadores de 3' -oligonucleótido específicos de ratinho (Novagen; cat.# 69796 e 69812) para cada cadeia pesada variável e leve variável. Uma porção (5 a 50 ng) do ADNc foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o PCR Reagent System (Life Technologies; cat.#10198-018) e um conjunto de iniciadores específicos de cadeia pesada e cadeia leve variáveis de ratinho (Novagen; cat.#70081-3, 5 pmol de cada) durante 30 ciclos (início a quente a 94°C e depois ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min e 72°C durante 1 min). Os produtos de PCR foram fraccionados electroforeticamente num gel de agarose ultra puro a 1% em tampão de acetato de sódio e visualizados por coloração com brometo de etídio. Excisaram-se do gel fragmentos de PCR correspondendo ao tamanho previsto e purificaram-se utilizando colunas spin BIO 101 Geneclean (cat. #1101-400) para ligação no plasmídeo pCR2.1-T0P0 (Invitrogen), seguindo-se transformação em E. coli TOP10 competente (Invitrogen, cat.# K4500). Após isolamento de ADN de plasmídeo utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN; 38

ΕΡ 1 377 314/PT cat.# 27106), identificaram-se os clones positivos com inserções por digestão com endonuclease de restrição e electroforese em gel de agarose, seguindo-se sequenciação num sequenciador automático ABI utilizando iniciadores directo M13 e reverso M13.

As sequências resultantes foram as seguintes: 35-220VLD-4 (ADN de sequência leve variável)

MCATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAA

GGTCACTATGAGCTGTAGGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAA

GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGA

TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT

GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT

GGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGA

CCAAGCTGGAAATAAAA 35-220VLD-4 (sequência leve variável)

NiMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC R S S Q S V L YSSNQKNYLA WYQQKPGQSPTLLIY W A S T R ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA V Y Y C HQYLSSYT FGGGTKLEIK

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. 35-220VHC-1 (ADN de sequência pesada variável)

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCC

TGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACT

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGG

TGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCACCAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA

CACAGCCATGTACTACTGTGCCACCGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTA

CTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 35-220VHC-1 (sequência pesada variável)

QVQLKESGPGLVAPSQSLS1TCTVSGFSLSE Y S V H WVRQPPGKGLEWLG MtWGGGNTDYN SALKS RLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTA MYYCAT AYYGNSWFAY WGQGTLVTVSA

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. 39

ΕΡ 1 377 314/PT D. Anticorpo monoclonal 35-006.

Isolamento e sequenciação de sequências da região variável:

Isolou-se ARN mensageiro a partir de células de hibridoma CifA 35-006 utilizando o kit Fast Track 2.0 (Invitrogen; cat. #K4500) . Resumidamente, 1,4*108 células de hibridoma cultivadas em meio DMEM-10 com 10% de FBS foram lavadas com PBS, sedimentadas por centrifugação e depois lisadas em detergente contendo Protein/RNase Degrader. Isolou-se ARNm Poli-A+ por purificação de afinidade sobre oligo-dT celulose. A síntese de ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 5 mg de ARNm e transcriptase reversa num kit de síntese de ADNc (Novagen; cat. #69001-3) contendo 20 pmol de iniciadores de 3'-oligonucleótido específicos de ratinho (Novagen; cat.# 69796 e 69812) para cada cadeia pesada variável e leve variável. Uma porção (5 a 50 ng) do ADNc foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o PCR Reagent System (Life Technologies; cat.#10198-018) e um conjunto de iniciadores específicos de cadeia pesada e cadeia leve variáveis de ratinho (Novagen; cat.#70081-3, 5 pmol de cada) durante 30 ciclos (início a quente a 94°C e depois ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min e 72°C durante 1 min). Os produtos de PCR foram fraccionados electroforeticamente num gel de agarose ultra puro a 1% em tampão de acetato de sódio e visualizados por coloração com brometo de etídio. Excisaram-se do gel fragmentos de PCR correspondendo ao tamanho previsto e purificaram-se utilizando colunas spin BIO 101 Geneclean (cat. #1101-400) para ligação no plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguindo-se transformação em E. coli TOP10 competente (Invitrogen, cat.# K4500). Após isolamento de ADN de plasmídeo utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat.# 27106), identificaram-se os clones positivos com inserções por digestão com endonuclease de restrição e electroforese em gel de agarose, seguindo-se sequenciação num sequenciador automático ABI utilizando iniciadores directo M13 e reverso M13. 40

ΕΡ 1 377 314/PT

As sequências resultantes foram as seguintes: 35-006VLD-1 (ADN de sequência leve variável)

AACATTAT G AT GACACAGT CGCCAT CATCT CTG GCTGTGT CTG CAGG AG AAAA

G GTCACTAT G AG CTGTAAGT CCAGTCAAAGT GTTTTATAC AGTT C AAATC AG AA

GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGA

TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT

GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT

GGCAGTTTATTGCTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGA

CCGAGCTGGAAATAAAA 35-006VLD-1 (sequência leve variável)

NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC K S S Q S V L YSSNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY W A S T R ESG VPDRFT GSGSGTDFTLTISSVQAEDLA V Y C C HQYLSSYT FGGGTELEIK

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados. 35-006VHC-1 (ADN de sequência pesada variável)

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCC

TGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACT

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGG

TGGTGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAACATCAGCAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA

CACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAAGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCG

CAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 35-006VHC-1 (sequência pesada variável)

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSR Y S V H WVRQPPGKGLEWLG MIWGGGSTDYN S A L K S RLNISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTA MYYCAR R L W Y F D VWGAGTTVTVSS

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados.

Exemplo 8. Geração de 12-9 quimérico com equivalência em cinética de ligação e reactividade com células inteiras ao 12-9 murino.

Foi gerado 12-9 quimérico utilizando regiões constantes de humano (cadeia leve: capa; cadeia pesada: Gl, 3 ou 4) 41 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ isoladas a partir de sangue de voluntários humanos (selecção de ARN poli A e amplificação por PCR de ADNc de primeira cadeia). Para expressão em células de mamífero, adicionou-se um único local de restrição Bsm 1 à extremidade 5' de ambas as sequências da região variável de cadeia pesada e leve. Na extremidade 3' (a junção de montagem (splice) para a região constante respectiva) adicionou-se um local Bsiwl à região variável de cadeia leve e um local Apal à região variável de cadeia pesada. Isto foi realizado através do desenho de iniciadores de oligonucleótido e amplificação por PCR do modelo de ADN 12-9 apropriado seguindo-se sequenciação de ADN para confirmação. A expressão de versões quiméricas de proteína 12-9 foi realizada utilizando o vector de expressão de mamífero pCEP4 (Invitrogen, cat.#V044-50) contendo uma sequência de secreção líder de imunoglobulina humana (Bsml como o local de clonagem) com uma região constante capa para expressão da cadeia leve ou uma região constante gama (1, 3 ou 4) para expressão da cadeia pesada. 0 plasmídeo de expressão de mamífero foi desenhado para expressão de ambas as cadeias pesada e leve com promotores de hCMV separados no mesmo plasmídeo ou para a expressão das cadeias leve e pesada em plasmídeos pCEP4 separados via co-transfecção. 0 12-9 quimérico funcional foi expresso após transfecção de ADN de plasmídeo contendo as cadeias pesada e leve de 12-9 em células HEK293 EBNA com Fugene (Roche Diagnostic, cat.# 1814443) sob selecção com higromicina (300 pg/ml). Colheram-se os sobrenadantes e analisaram-se por Biacore em relação à cinética de ligação e por citometria de fluxo em relação à ligação a células de S. aureus.

Os resultados representados nas Figuras 2 e 3 com 12-9 quimérico recombinante confirmam que a sequência das cadeias pesada e leve de 12-9 replica a cinética de ligação e a especificidade do 12-9 original caracterizado como um sobrenadante de hibridoma. 42 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Exemplo 9. Humanização das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 12-9

Este processo de humanização incide sobre a alteração apenas dos resíduos expostos a solvente das regiões variáveis de ratinho que não estão envolvidas na especificidade e afinidade da molécula pelo antigénio alvo ClfA. A informação para estas determinações utilizou determinações de disponibilidade a solvente publicadas por Padlan ("A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties", Molecular Immunology, 28(4); 489-498, 1991), e a modelação molecular in silico ou algoritmos para determinar epítopos de células T não foram utilizados para efectuar estas determinações. A abordagem representa um processo pelo qual os resíduos da região variável de ratinho da cadeia pesada e leve são alterados por mutagénese dirigida para reflectir a arquitectura exposta à superfície da região variável humana mais homóloga a partir da base de dados pública. Especificamente, aos aminoácidos definindo as cadeias pesada e leve variáveis, atribuiu-se um número de posição de Kabot e uma designação de "exposição" baseada em Padlan, permitindo o alinhamento dos aminoácidos de cada subgrupo de estrutura (framework) humano (I-III para a cadeia pesada e I-IV para a cadeia leve). Para suportar esta análise, foi realizada uma pesquisa BLAST na base de dados de imunoglobulina humana bem como na base de dados de proteína inteira onde a região variável com a homologia mais elevada com a sequência de ratinho (de linha germinal e madura) foi escolhida e alinhada com a sequência murina de interesse. Uma vez alinhadas, identificou-se o subgrupo de humano com a homologia mais elevada com a sequência de ratinho. Os resíduos aminoácido de ratinho expostos foram mutados para mimetizar o subgrupo de humano mais homólogo. Em casos onde existia mais do que um aminoácido no subgrupo nessa posição, utilizou-se o aminoácido representado na sequência da linha germinal de humano com a homologia mais elevada com o 12-9. Estas alterações foram efectuadas com oligonucleótidos mutagénicos via PCR seguida de sequenciação de ADN conformacional. 43 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ 12-9VL-Hu (ADN de sequência leve variável humanizada)

GAC ATT GT G AT G ACACAGT CGCCAGACTCT CTGGCTGTGTCTCTG GG AG AAAG

G GT C ACTAT G AACT GTAAGTCC AGT CAAAGT GTTTTATAC AGTT C AAAT C AG AA

G AACTACTTGGCCTGGTACCAG OAGAAACCAG GGC AGT CT CCTAAACTGCT GA

TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCAGCGGCAGT

GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT

GGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGA CCAAGCTGGAAATAAAA 12-9VL-Hu (sequência leve variável humanizada)

DIVMTQSPDSUWSLGERVTMNCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQOKPGOSPKI I ÍY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAWYCHQYLSSYTFGGGTKLE IK

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados, os aminoácidos a negrito representam a alterações de humanização. 12-9VH-Hu (ADN de sequência pesada variável humanizada)

GAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAGCCCTCACAGACCC

TGTCCATCACATGCACCATCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACT

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGG

TGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAA

AGACAACTCCAAGAACCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGACCGCCGCTGA

CACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAAAAGGGGAATTCTACTATGGTTACGACG GGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC 12-9VH-Hu (sequência pesada variável humanizada)

QVQLKESGPGLVKPSQTLSlTCTISGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMiWGG

GNTDYNSALKSRLSISKDNSKNQVFLKMNSLTAADTAVYYCARKGEFYYGYDGFV

YWGQGTLVTVSS

Os aminoácidos representando uma CDR estão sublinhados, os aminoácidos a negrito representam a alterações de humanização.

Exemplo 10. Comparação dos anticorpos monoclonais de ClfA, 12-9A (INH-M010001) e 35-052.1 (INH-M01016), com o anticorpo CRL1771 de controlo com o mesmo isótipo, INH-M000029, num modelo de sepsia de ratinho utilizando S. aureus da estirpe 67-0 resistente a meticilina (MRSA). 44 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ Ο propósito deste exemplo é caracterizar os efeitos protectores dos anticorpos monoclonais de ClfA, 12-9A (INH- M010001) e 35-052.1 (INH-M01016) em comparação com o anticorpo CRL1771 de controlo com o mesmo isótipo (INH-M000029) utilizando uma dose de 0,3 mg de anticorpo e S. aureus da estirpe 67-0 num modelo de sepsia de ratinho.

Espécie Estirpe Sexo Número Idade* Peso* Origem* Ratinho Balb/C Fêmea 90 4-5 semanas 12-16 gramas Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY) *Intervalo estimado no início do estudo. A dosagem foi realizada pela administração de uma injecção intraperitoneal (i.p.) de anticorpo monoclonal aos animais apropriados (ver abaixo). A administração do anticorpo foi realizada aproximadamente 18 horas antes da injecção intravenosa (i.v.) de S. aureus. A infecção sistémica foi medida utilizando um único parâmetro (mortalidade) . TRATAMENTO DESAFIO Grupo# N. ° de AnticorpojjDoseii Via jFrequênciaSTempo* Bactéria \ CFU :jVolume/Via ratinhos \ § \ $ ”T~™~ 30 12-9A | 0,3 (i . p. | Uma vez 5—18 ti ..........sT...........ρϊοΤ'όΤΓ’πα"/"" | mg ; ΐ \ aureus ; Ij i.v. .........2........ ...........30........... .....35-052"" j"õ73l | | 67-0 | | | mg ; j \ $ .........3........ ...........30........... CRLÍ77 Ϊ Ι'ο,Ύ}............]...............................j................... | | | mg | \ *Os tempos reflectem as horas após desafio bacteriano.

Preparação, armazenamento e manuseamento:

Staphylococcus aureus

Retiraram-se células MRSA da estirpe 67-0 de uma reserva em glicerol congelada e inocularam-se sobre uma única placa de agár de sangue e cultivaram-se durante 24 horas a 37 °C. Transferiram-se depois as colónias individuais para novas placas de agár de sangue. Inocularam-se oitenta placas para preparar 50 ml de reserva congelada final. Incubaram-se depois as placas durante 24 horas a 37°C. Após incubação, 45 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ rasparam-se as colónias da superfície de cada placa para quatro tubos de 50 ml contendo 10 ml de PBS IX (20 placas por tubo) enquanto se agitava suavemente num vórtice para remover as bactérias do raspador. Adicionaram-se depois mais 10 ml de PBS IX aos 10 ml de suspensão bacteriana, enquanto se agitava vigorosamente num vórtice para facilitar a separação de quaisquer resíduos de agár das bactérias. Sedimentou-se a suspensão por centrifugação, 3500 x g a 4°C durante 10 minutos. Lavaram-se as bactérias em D-PBS e ressuspenderam-se em 50 ml de meio de congelação. Colocou-se a reserva bacteriana em alíquotas de 1 ml por congelação instantânea num banho de etanol/gelo seco e colocou-se num congelador a -80°C. Determinou-se a concentração (CFU/ml) da reserva congelada por descongelação de uma alíquota de 1 ml da reserva e preparação de diluições em série de 10~5 a 10~n. Plaquearam-se diluições em duplicado sobre placas de agár de sangue e incubaram-se a 37°C durante 16-18 horas. Determinaram-se as CFU/ml (CFU/ml = (número médio de colónias x factor de diluição)/0,050 ml) e ponderaram-se para cada diluição para determinar a CFU/ml média. No dia da injecção, serão descongeladas alíquotas de cada estirpe, combinadas num tubo por estirpe e agitadas em vórtice. Serão então preparadas diluições de cada reserva.

Anticorpo monoclonal de ClfA 12-9A, INH-M010001 (LN: IAA2E1354) O anticorpo monoclonal 12-9A (subtipo IgGi) foi purificado a partir de meio de cultura de hibridoma isento de soro utilizando cromatografia de afinidade de proteína G. Verificou-se que o material estava numa concentração de 7,0 mg/ml com uma concentração de endotoxina de 1,0 EU/mg de proteína. O material foi armazenado refrigerado a 4°C. No dia de injecção, o material será diluído a 0,6 mg/ml e serão administrados 0,5 ml através de uma injecção intraperitoneal ao grupo de animais apropriado. A dose final que será administrada será 0,3 mg de IgG. 46 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Anticorpo monoclonal de ClfA 35-052.1, INH-M01016 (LN: IAA2H1422) 0 anticorpo monoclonal 35-052 (subtipo IgGi) foi purificado a partir de meio de cultura de hibridoma isento de soro utilizando cromatografia de afinidade de proteína G. Verificou-se que o material estava numa concentração de 4,2 mg/ml com uma concentração de endotoxina de 1,0 EU/mg de proteína. O material foi armazenado refrigerado a 4°C. No dia de injecção, o material será diluído a 0,6 mg/ml e serão administrados 0,5 ml através de uma injecção intraperitoneal ao grupo de animais apropriado. A dose final que será administrada será 0,3 mg de IgG.

Anticorpo monoclonal de controlo CRL 1771 (INH-M000029, LN: IAA2E1337) O anticorpo monoclonal CRL 1771 (subtipo IgGi) foi purificado a partir de meio de cultura de hibridoma isento de soro utilizando cromatografia de afinidade de proteína G. Verificou-se que o material estava numa concentração de 5,0 mg/ml com uma concentração de endotoxina de 0,2 EU/mg de proteína. O material foi armazenado refrigerado a 4°C. No dia de injecção, o material será diluído a 0,6 mg/ml e serão administrados 0,5 ml através de uma injecção intraperitoneal. A dose final que será administrada será 0,3 mg de IgG.

Alojamento, alimento, água e ambiente:

Na recepção, examinaram-se todos os animais e alojaram-se em grupo (5/gaiola) em gaiolas tipo caixa de sapatos de policarbonato com cama absorvente bed-o-cobb. Todos os animais têm acesso livre a alimento (dieta granulada para ratinho Harlan/Teklad #7012) e água da torneira com um ciclo de 12 horas de luz-escuridão. Todos os aspectos de cuidados dos animais e as condições de pecuária requeridas estarão de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animais da NIH. 47

ΕΡ 1 377 314/PT

Identificação e randomização

Todos os ratinhos foram identificados de modo único por tatuagem na cauda antes do tratamento. Antes do tratamento, pesaram-se individualmente os ratinhos e reavaliou-se o seu estado de saúde. Os ratinhos foram atribuídos a grupos de tratamento com base em randomização por pesos corporais estratificados.

Os dados demonstram o valor terapêutico de um anticorpo anti-ClfA tal como 12-9 que interfere com a adesão Cif A -fibrinogénio em comparação com um controlo de isótipo não específico de ClfA (CRL 1771) bem como um controlo específico (35-052) que reconhece ClfA num local independente da ligação ClfA - fibrinogénio.

Exemplo 11. Reconhecimento da estirpe de S. aureus de 12-9 e 35-052 em comparação com o controlo de isótipo (CRL 1771)

Colheram-se amostras bacterianas de S. aureus (estirpes Newman -WT, 67-0, 560 Sal 1, 203 Sal 2, 451 Sal 4, 206 Sal 5, 397 Sal 6, 49, 189, 203 e 4046) às 3 h e durante a noite, lavaram-se e incubaram-se com Mab 12-9, 35-52 ou 1771 sozinho (controlo) numa concentração de 2 mg/ml após bloquear os locais de proteína A com IgG de coelho (50 mg/ml) . As estirpes de S. aureus contendo uma designação Sal representam 5 linhagens distintas totalizando 65,68% de todos os isolados clínicos (Booth, et ai., Infect. Immun. 69, 345-353, 2001).

Analisaram-se também Newman ClfA::emr (ClfA knockout) e Newman Spa::kan (Proteína A knockout) do mesmo modo como controlos de especificidade. Após incubação com anticorpo, incubaram-se as células bacterianas com Cabra-F(ab')2-Anti-Ratinho-P(ab')2_FITC que serviu como o anticorpo de detecção. Após marcação de anticorpo, aspiraram-se as células bacterianas através do citómetro de fluxo FACScaliber para analisar a emissão de fluorescência (excitação: 488, emissão: 570) . Para cada estirpe bacteriana, colheram-se e mediram-se 10000 eventos. 48 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Tabela VI. Reactividade da estirpe de S. aureus

Intensidade de fluorescência (média geométrica) Estirpe de S. aureus Tempo de cultura 12-9 35-052 CRL 1771 Newman WT 3 h 30, 8 11, 1 0,5 durante a noite 44,3 30 0,9 67-0 3 h 11,2 4,2 2 durante a noite 27, 6 1,9 1,1 560 SAL 1 3 h 28,8 8,4 3,9 durante a noite 36, 1 6, 2 1,2 203 SAL 2 3 h 16,1 0, 6 2,2 durante a noite 40,4 1,9 1,4 451 SAL 4 3 h 1,1 0 0 durante a noite 12,9 0 0 206 SAL 5 3 h 8,8 1,3 1 durante a noite 33,5 7,7 0,9 397 SAL 6 3 h 28,9 7,9 0,3 durante a noite 62,1 40, 0 1,0 49 Europe 3 h 7,3 1,2 0 durante a noite 11,3 5,7 0 189 Japan 3 h 11, 0 0 0 durante a noite 15, 7 0 0 203 Singapore 3 h 22,1 3,3 0,1 durante a 15, 4 2,5 0,2 49 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Intensidade de fluorescência (média geométrica) Estirpe de S. aureus Tempo de cultura 12-9 35-052 CRL 1771 noite 4046 USA 3 h 27,7 2,5 1,3 durante a noite 23, 5 1,2 0,3 Newman ClfA::emr 3 h 0,2 0, 3 0,2 durante a noite 1,4 0, 8 0,9 Newman Spa::kan 3 h 18, 6 4,9 0 durante a noite 23, 9 9,2 0 □ Indica actividade positiva

Estes dados salientam a importância de se seleccionar um anticorpo anti-ClfA (tal como 12-9) que é capaz de reconhecer um epitopo funcional na molécula de ClfA: i.e. o local de ligação para fibrinogénio.

Outro conjunto de isolados de S. aureus, uma representação de 11 complexos de genótipo clonal diferente identificados como desproporcionadamente comuns como causas de doença, obtidos através de tipagem de sequência multi-locus (Day, et al. 2001, "A link between virulence and ecological abundance in natural populations of Staphylococcus aureus", Science, 292:114-116). Cada estirpe foi testada quanto à reactividade contra 12-9 por citometria de fluxo como acima descrito. 50 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Tabela VII. Reactividade de 12-9 com isolados de S. aureus

Designação da estirpe de S. aureus Tipo de sequência Complexo clonal Reactividade de 12-9 16 25 8 + 96 47 10 + 117 12 4 + 138 30 9 + 150 9 14 + 160 34 7 + 207 15 5 + 252 36 9 + 315 8 3 + 364 39 9 + 396 30 9 + 433 5 2 + 434 8 3 + 451 5 2 + 456 45 10 + 458 15 5 + 476 1 1 + 481 47 10 + 512 1 1 + 597 25 8 + 720 22 7 + 730 45 10 + 837 12 4 + 863 20 11 + 888 39 9 + 959 34 9 +

Esta reactividade demonstra adicionalmente a conservação do epitopo 12-9 em Cif A através de estirpes isoladas de S. 51

ΕΡ 1 377 314/PT aureus, sugerindo que a ligação CifA - fibrinogénio é conservada funcionalmente.

Exemplo 12. Homologia de região variável em anticorpos anti-ClfA que inibem a ligação de células inteiras de S. aureus.

Um resultado inesperado da selecção de anticorpos anti-ClfA baseada na sua capacidade para inibir a ligação de CifA a fibrinogénio foi a similaridade nas sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade (CDR) das regiões de cadeia variável leve e pesada. Para determinar estes perfis, seleccionaram-se anticorpos anti-ClfA com base na inibição da ligação de células inteiras de S. aureus a placas revestidas com fibrinogénio utilizando o procedimento seguinte: Diluiram-se os anticorpos de interesse em série começando com 4 pg/ml em tampão de ensaio. Concorrentemente, lavou-se uma cultura de um dia para o outro de S. aureus (Newman spa::kan), bloqueou-se com IgG de coelho e depois corou-se com corante de ADN fluorescente permeável nas células Syto 13 e incubou-se durante 10 min. Misturaram-se volumes iguais de células coradas e anticorpo diluído e incubaram-se a 4°C durante 30 min e depois adicionou-se cada amostra a poços em duplicado de uma placa de microtitulação bloqueada/revestida com fibrinogénio humano. Incubaram-se as placas a 4°C durante uma hora, lavaram-se, adicionou-se tampão a cada poço e leu-se num leitor de placas fluorescentes.

As cadeias variáveis leve e pesada dos anticorpos monoclonais anti-ClfA, 12-9, 13-2, 35-006 e 35-220 bem como CRL 1771 (controlo não específico) foram clonadas e sequenciadas para derivar uma sequência de aminoácidos prevista do seguinte modo: Resumidamente, 1,4χ108 células de hibridoma cultivadas em meio DMEM-10 com 10% de FBS foram lavadas com PBS, sedimentadas por centrifugação e depois lisadas em detergente contendo Protein/RNase Degrader. Isolou-se ARNm Poli-A+ por purificação de afinidade sobre oligo-dT celulose. A síntese de ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 5 mg de ARNm e transcriptase reversa num kit de síntese de ADNc (Novagen; cat. #69001-3) contendo 20 pmol de iniciadores de 3'-oligonucleótido específicos de ratinho (Novagen; cat.# 69796 e 69812) para cada cadeia 52 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ pesada variável e leve variável. Uma porção (5 a 50 ng) do ADNc foi amplificada por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando o PCR Reagent System (Life Technologies; cat.#10198-018) e um conjunto de iniciadores específicos de cadeia pesada e cadeia leve variáveis de ratinho (Novagen; cat.#70081-3, 5 pmol de cada) durante 30 ciclos (início a quente a 94°C e depois ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min e 72°C durante 1 min). Os produtos de PCR foram fraccionados electroforeticamente num gel de agarose ultra puro a 1% em tampão de acetato de sódio e visualizados por coloração com brometo de etídio. Excisaram-se do gel fragmentos de PCR correspondendo ao tamanho previsto e purificaram-se utilizando colunas spin BIO 101 Geneclean (cat. #1101-400) para ligação no plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguindo-se transformação em E. coli TOP10 competente (Invitrogen, cat.# K4500). Após isolamento de ADN de plasmídeo utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat.# 27106), identificaram-se os clones positivos com inserções por digestão com endonuclease de restrição e electroforese em gel de agarose, seguindo-se sequenciação num sequenciador automático ABI utilizando iniciadores directo M13 e reverso M13.

Como se mostra na Figura 7, os dados mostram que existe conservação considerável na porção mais variável das cadeias de imunoglobulina que definem a especificidade de ligação pelos anticorpos monoclonais anti-ClfA com inibição da ligação de S. aureus a fibrinogénio. Esta homologia é representada a partir de três fusões geradoras de hibridoma diferentes (12, 13 e 35); sob condições variáveis tais como a constituição do antigénio Cif A, o método e a sequência das imunizações antes da fusão. Em particular, estes dados revelaram regiões conservadas de consenso nas regiões CDR1 e CDR2 da cadeia pesada variável de anticorpos monoclonais que se ligam a Cif A bem como regiões conservadas nas regiões CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias leves variáveis dos anticorpos do presente invento. Estes dados mostram assim que a preparação de anticorpos com as sequências conservadas deverão ter as mesmas propriedades de ligação e assim cairão dentro do âmbito do presente invento. 53 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Por conseguinte, de acordo com o presente invento, anticorpos que se ligarão a CifA podem ser preparados utilizando cadeias variáveis leve e pesada que têm as mesmas regiões CDR chave como indicado no consenso da Figura 8. Em particular, estes anticorpos incluirão aqueles que possuem uma cadeia pesada variável onde a região CDR1 inclui a sequência RYSVH, e/ou uma região CDR2 que inclui a sequência MIWGGGNTDYNSALKS, e uma cadeia leve variável que possui uma região CDR1 que inclui a sequência KSSQSVLYSSNQKNYLA, uma região CDR2 que inclui a sequência WASTRES, e/ou uma região CDR3 que inclui a sequência HQYLSSYT.

Exemplo 13. Expressão de 12-9 humanizado para utilização pré-clinica e clinica

Para expressão simultânea das cadeias polipeptidicas de imunoglobulina pesada e leve, os dois genes foram clonados num único plasmideo com cada gene sob o controlo de um promotor hCMV-MIE separado. Este vector de duplo gene inclui uma única cópia do marcador seleccionável GS (Lonza; Slough, Reino Unido) para introdução na célula hospedeira num único evento de transfecção. Transfectaram-se as células utilizando Fugene-6 (Roche) sob condições sugeridas pelo fabricante. Testaram-se os sobrenadantes de linhas de células transientes ou derivadas de modo estável e compararam-se com 12-9 derivado de murino e quimérico.

Este exemplo demonstra que o 12-9 humanizado pode ser humanizado, clonado e expresso numa única cassete de expressão capaz de rendimentos para suportar uma qualidade e pureza à escala comercial.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> PATTI, Joseph M HUTCHINS, Jeff T DOMANSKI, Paul PATEL, Pratiksha HALL, Andrea <120> ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA A PROTEÍNA CLFA ...

<130> P07069US04/BAS <150> 60/308116 54 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ <151> 2001-07-30 <150> 60/298413 <151> 2001-06-18 <150> 60/274611 <151> 2001-03-12 <150> 60/264072 <151> 2001-01-26 <160> 20 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1560

<212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 1 agtgaaaata gtgttacgca atctgatagc gcaagtaacg aaagcaaaag taatgattca 60 agtagcgtta gbgctgeaec taaaacagac gacacaaacg tgagtgatac taaaacatcg 120 tcaaacacta ataatggcga aacgagtgtg gcgcaaaafcc cagcacaaca ggaaacgaca 100 caatcatcat caacaaatgc aactacggaa gaaacgccgg taactggtga agctactact 240 acgacaacga atcaagctaa tacaccggca acaactcaat caagcaatac aaatgcggag 300 gaattagtga atcaaacaag taatgaaacg acttttaatg atactaatac agtatcatct 360 gtaaattcac ctcaaaattc tacaaatgcg gaaaatgttt caacaacgca agatacttca 420 actgaagcaa caccttcaaa caatgaatca gctccacaga gtacagatgc aagtaataaa 480 gatgtagtta atcaagcggt taatacaagt gcgcctagaa tgagagcatt tagtttagcg 540 gcagtagctg cagatgcacc ggcagctggc acagatatta cgaatcagtt gacgaatgtg 600 acagttggta ttgactctgg tacgactgtg tatccgcacc aagcaggtta tgtcaaaetg 660 720 aattatggtt tttcagtgcc taattctgct gttaaaggtg acacattcaa aataactgta 55

ΕΡ 1 377 314/PT cctaaagaat taaacttaaa tggtgtaact tcaactgcta aagtgccacc aattatggct 780 ggagatcaag tattggcaaa tggtgtaatc gatagtgatg gtaatgttat ttatacattt 840 acagactatg taaatactaa agatgatgta aaagcaacfct tgaccatgcc cgcttatatt 900 gaccctgaaa atgttaaaaa gacaggtaat gtgacattgg ctactggcat aggtagtaca 960 acagcaaaca aaacagtatt agtagattat gaaaaatatg gtaagtttta taacttatct 1020 attaaaggta caattgacca aatcgataaa acaaataata cgtatcgtca gacaatttat 1080 gtcaatccaa gtggagataa cgttattgcg ccggttttaa caggtaattt aaaaccaaat 1140 acggatagta atgcattaat agatcagcaa aatacaagta ttaaagtata taaagtagat 1200 aatgcagctg atttatctga aagttacttt gtgaatccag aaaactttga ggatgtcact 1260 aatagtgtga atattacatt cccaaatcca aatcaatata aagtagagtt taatacgect 1320 gatgatcaaa ttacaacacc gtatatagta gttgttaatg gtcatattga tccgaatagc 1380 aaaggtgatt tagctttacg ttcaacttta tatgggtata actcgaatat aatttggcgc 1440 tctatgtcat gggacaacga agtagcattt aataacggat caggttctgg tgacggtatc 1500 gataaaccag ttgttcctga acaacctgat gagcctggtg aaattgaacc aattccagag 1560

<210> 2 <211> 520 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2

Ser Qlu Asn Ser Vai Thr Gin Ser Asp Ser Ala Ser Asn Gin Ser i>ys 15 10 15

Ser Asn Asp Ser Ser Ser Vai Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr 20 25 30

Asn Vai Ser Asp Thx Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Qlu Thr 35 40 45

Ser Vai Ala Gin Asn Pro Ala Gin Gin Glu Thr Thr Gin Ser Ser ser 50 55 60

Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro Vai Thr Gly Glu Ala Thr Thr 65 70 75 80 56 56 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Thr Thr Thr Asn Gin Ala Asn Thr Pro Ala Thr Thr Gin Ser Ser Asn 85 90 95

Thr Asn Ala Glu Glu Leu Vai Asn Gin Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe 100 105 110

Asn Asp Thr Asn Thr Vai Ser Ser Vai Asn Ser Pro Gin Asn Ser Thr 11S 120 125

Asn Ala Glu Asn Vai Ser Thr Thr Gin Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr 130 135 140

Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gin Ser Thr Asp Ala Ser Asn Lys 145 150 155 160

Asp Vai Vai Asn Gin Ala Vaír Asn Thr Ser Ala Pro Arg Met Arg Ala 165 170 175

Phe Ser Leu Ala Ala Vai Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp 180 185 190

Ile Thr Asn Gin Leu Thr Asn Vai Thr Vai Gly Ile Asp Ser Gly Thr 195 200 205

Thr Vai Tyr Pro His Gin Ala Gly Tyr Vai Lys Leu Asn Tyr Gly Phe 210 215 220

Ser Vai Pro Asn Ser Ala Vai Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr vai 225 230 235 240

Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Vai Thr Ser Thr Ala Lys Vai Pro 245 250 255

Pro Ile Met Ala Gly Asp Gin Vai Leu Ala Asn Gly Vai Ile Asp Ser 260 265 270

Asp Gly Asn Vai Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Vai Asn Thr Lys Asp 275 280 285

Asp Vai Lys Ala Thr Leu Thr Met Pro Ala Tyr Ile Asp Pro Glu Asn 290 295 300 57

57 Ερ 1 377 314/PT

Vai Lys Lys Thr Qly Asn Vai Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr 305 310 315 330

Thr Ala Asn Lys Thr Vai Leu Vai Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe 325 330 335

Tyr Asn Leu Ser Ile Lys Gly Thr Ile Asp Gin Ile Asp Lys Thr Asn 340 345 350

Asn Thr Tyr Arg Gin Thr Ile Tyr Vai Asn Pro Ser Gly Asp Asn Vai 355 360 365

Ile Ala Pro Vai Leu Thr Gly Asn Leu Lys Pro Aen Thr Asp Ser Asn 370 375 380

Ala Leu Ile Asp Gin Gin Asn Thr Ser ile Lys Vai Tyr Lys Vai Asp 385 390 395 400

Asn Ala Ala Asp Leu Ser Glu Ser Tyr Phe Vai Asn Pro Glu Asn Phe 405 410 415

Glu Asp Vai Thr Asn Ser Vai Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gin 420 425 430

Tyr Lys Vai Glu Phe Asn Thr Pro Asp Asp Gin Ile Thr Thr Pro Tyr 435 440 445

Ile Vai Vai Vai Asn Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu 450 455 460

Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg 465 470 475 480

Ser Met Ser Trp Asp Aen Glu Vai Ala Phe Asn Asn Qly Ser Gly Ser 485 490 495

Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Vai Vai Pro Glu Gin Pro Asp Glu Pro 500 505 510

Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu 515 520

<210> 3 <211> 990 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 3 58

ΕΡ 1 377 314/PT gtagctgcag atgcaccggc agctggcaca gatattacga atcagttgac gaatgtgaca 60 gttggtattg actctggtac gactgtgtat ccgcaccaag caggttatgt caaactgaat 120 tatggttttt cagtgcctaa ttctgctgtt aaaggtgaca cattcaaaat aactgtacct 180 aaagaattaa acttaaatgg tgtaacttca actgctaaag tgccaccaat tatggctgga 240 gatcaagtat tggcaaatgg tgtaatcgat agtgatggta atgttattta tacatttaca 300 gactatgtaa atactaaaga tgatgtaaaa gcaactttga ccatgcccgc ttatattgac 360 cctgaaaatg ctaaaaagac aggtaatgtg acattggcta ctggcatagg tagtacaaca 420 gcaaacaaaa cagtattagt agattatgaa aaatatggta agttttataa cttatctatt 4B0 aaaggtacaa ttgaccaaat cgataaaaca aataatacgt atcgtcagac aatttatgtc 540 aatccaagtg gagataacgt tattgcgecg gttttaacag gtaatttaaa accaaatacg 600 gatagtaatg cattaataga tcagcaaaat acaagtatta aagbatataa agtagataat 660 gcagctgatt tatctgaaag ttactttgtg aatccagaaa actttgagga tgtcactaat 720 agtgtgaata ttacattccc aaatccaaat caatataaag tagagtttaa tacgcctgat 780 gatcaaatta caacaccgta tatagtagtt gttaatggtc atattgatcc gaatagcaaa 340 ggtgatttag ctttacgttc aactttatat gggtataact cgaatataat ttggcgctct 900 atgtcatggg acaacgaagt agcatttaat aacggatcag gttctggtga cggtatcgat 960 aaaccagttg ttcctgaaca acctgatgag 990

<210> 4 <211> 331 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 4

Met Val Ala Ala Aap Ala Fro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gin 15 10 15

Leu Thr Asn Val Thr val Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Val Tyr Pro 20 25 30 59 59 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

His Gin Ala Gly Tyr Vai Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Vai Pro Asn 35 40 45

Ser Ala Vai Lys Gly Asp Thr Phe Lys Xle Thr Vai Pro Lya Glu Leu 50 55 60

Asn Leu Asn Gly Vai Thr Ser Thr Ala Lys Vai Pro Pro Ile Met Ala 65 70 75 80

Gly Asp Gin Vai Leu Ala Asn Gly Vai Ile Asp Ser Asp Gly Asn Vai 85 90 95

Ile Tyr Thr phe Thr Asp Tyr Vai Asn Thr Lys Asp Asp Vai Lys Ala 100 105 110

Thr Leu Thr Met pro Ala Tyr ile Asp Pro Glu Asn Vai Lys Lys Thr 115 120 125

Gly Asn Vai Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys 130 135 140

Thr Vai Leu Vai Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser 145 150 155 160

Ile Lys Gly Thr Ile Asp Gin Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg 165 170 175

Gin Thr Ile Tyr Vai Asn Pro Ser Gly Asp Asn Vai Ile Ala Pro Vai 180 185 190

Leu Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp 195 200 205

Gin Gin Asn Thr Ser Ile Lys Vai Tyr Lys Vai Asp Asn Ala Ala Asp 210 215 220

Leu Ser Glu ser Tyr Phe Vai Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Vai Thr 225 230 235 240

Asn Ser Vai Asn He Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gin Tyr Lys Vai Glu 245 250 255 60

ΕΡ 1 377 314/PT

Phe Asn Thr Pro Asp Asp Gin Ile Thr Thr Pro Tyr Ile val Val Val 260 265 270 Asn Gly His lie Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser 275 280 285 Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp 290 295 300 Aep Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile 305 310 315 320 Asp Lys Pro Val Val Pro Glu Gin Pro Asp Glu 32S 330

<210> 5 <211> 336 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 5 aacattatga tgacacagtc atgagctgta agtccagtca tggtaccagc agaaaccagg gaatctggtg tccctgatcg atcaacagtg tacaagctga cacacgttcg gaggggggac gcoatcatct ctggctgtgt aagtgtttta tacagttcaa gcagtctcct aaactactga cttcacaggc agtggatetg agacctggca gtttattact caagctggaa ataaaa ctgcaggaga aaaggtcact atcagaagaa ctacttggcc tctactgggc atccactagg ggaeagattt tactcttacc gtcatcaata cctctcctcg 60 120 180 240 300 338

<210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 6

Asn lie Met Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Vai Leu Tyr Ser 20 25 30 ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin.

61 ΕΡ 1 377 314/PT 35 40 45

Ser Pro Lys leu leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Asn Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys hís Gin 85 90 55

Tyr Leu Ser Ser Hís Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 354 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 7 60 120 180 24 0 300 354 caggtgcatc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctctggatt ctcattatcc agatataata tacactgggt tegccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtgaaaacac agactataat tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaea gtctgeaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgceag cgcctactat ggtaactcct ggtttgctta etggggceag gggactctgg tcactgtcte tgca

<210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8

Gin Vai His Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin 15 10 15 ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30

Asn Ile His Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

62 ΕΡ 1 377 314/PT

Gly Met IIe Trp 50

Gly Gly Glu Asn Thr Asp 55

Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 60

Ser Arg Leu Ser 65

Ile Ser Lys Asp Asn Ser 70

Lys Ser Gin Vai Phe Leu 75 80

Lys Met Asn Ser

Leu Gin Thr Asp Asp Thr 85 S0

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 95

Ser Ala Tyr Tyr 100

Gly Asn Ser Trp Phe Ala 105

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110

Ser Ala

Leu Vai Thr Vai 115

<210> 9 <211> 336 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 9 aacattatga tgacacagtc atgagctgta agtccagtca tggtaccagc agaaaccagg gaatctggtg tccotgatcg atcagcagtg tacaagctga tacacgttcg gaggggggac gccatcatct ctggctgtgt aagtgtttta tacagttcaa gcagtctcct aaactgctga cttcacaggc agtggatctg agacctggca gtttattact caagctggaa ataaaa ctgcaggaga aaaggtcact atcagaagaa ctacttggcc tctactgggc atccactagg ggacagattt tactcttacc gtcatcaata cctctcetcg 60 12 0 18 0 24 0 300 336

<210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 10

Asn Ile Met Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 1 5 10 15

Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Vai Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 63 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu 50

Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 55 60

Gly Vai

Pro Asp Arg Phe Thr 65

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 70 75

Leu Thr 80

Ile Ser Ser Vai Gin 85

Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys 90

Hls Gin 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr 100

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 105 110

Ile Lys

<210> 11 <211> 363 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 11 caggtgcagc tgaaggagtc acatgcgcta tctctgggtt ccaggaaagg gtctggagtg tcagctctca aatccagact aaaatgaaca gtctgcaaac ttctactatg gttacgacgg gca aggacctggc ctggtggcac ctcattatcc agatatagtg gctgggaatg atatggggtg gagcatcagc aaggacaact bgatgacaca gccatgtatt gtttgtttac tggggccaag cctcacagag cctgtccatc tacactgggt tcgccagcct gtggaaacac agactataat ccaagagcca agttttctta actgtgccag aaaaggggaa ggactctggt cactgtctct 60 120 180 240 300 360 363 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 12

Gin Vai Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 .30 64

ΕΡ 1 377 314/PT

Ser Vai His Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Xle Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Lys Gly Glu Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Phe Vai Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu vai Thr Vai Ser Ala 115 120

<210> 13 <211> 336 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 13 60 120 180 240 300 336 aacattatga tgacacagtc gecatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact atgagctgta ggtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct acactgctga tctactgggc atccactagg gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa

<210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 14

Asn Ile Met Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 15 10 15 65

ΕΡ 1 377 314/PT

Glu Lys Vai Thr Met Ser 20

Cya Arg Ser ser Gin Ser 25

Vai Leu Tyr Ser 30

Ser Aen Gin Lys Asn Tyr 35

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 40

Lys Pro Gly Gin 45

Ser Pro Thr Leu Leu Ile 50

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 55 60

Glu Ser Gly Vai

Pro Asp Arg Phe Thr Gly 65 70

Ser Gly Ser Gly Thr Asp 75

Phe Thr Leu Thr 80

Ile Ser Ser Vai Gin Ala 85

Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 90

Tyr Cys His Gin 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe 100

Gly Gly Gly Thr Lys 105

Leu Glu Ile Lys 110

<210> 15 <211> 354 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 15 caggtgcagc tgaaggagtc acatgcactg tctctgggtt ccaggaaagg gtctggagtg tcagctctca aatccagact aaaatgaaca gtctgcaaac ggtaactcct ggfcttgctta cctcacagag cctgtccatc tacactgggt tcgccagcct gtggaaacac agactataat ccaagagcca agttttctta actgtgccac cgcctactat tcactgtctc tgca aggacctggc ctggtggcac cbcattatcc agatatagtg gctgggaatg atatggggtg gagcatcacc aaggacaact tgatgacaca gccatgtact ctggggccaa gggactctgg 60 120 180 240 300 354

<210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 16

Gin Vai Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 66 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Ser Vai Híb 35

Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 45

Gly Met Ile 50

Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 55 60 ser Arg Leu 65

Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu 70 75 B0

Lye Met Asn

Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thx Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 55 90 95

Tlir Ala Tyr

Tyr Gly Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr 115 val Ser Ala

<210> 17 <211> 336 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 17 60 120 180 240 300 336 gacattgtga tgacacagtc gccagactct ctggctgtgt ctctgggaga aagggtcact atgaactgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg gaatctggtg tccctgatcg cttcagcggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15 67 ΕΡ 1 377 314/ΡΤ

Glu Arg Vai Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Vai Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 4S

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 B0

Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys His Gin B5 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 363 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 19 60 12 0 180 240 300 360 363 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtgaagc ectcacagac cctgtccatc acatgcacca tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataat tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagaacca agttttctta aaaatgaaca gtctgaccgc cgctgacaca gccgtgtatt aetgtgccag aaaaggggaa ttctactatg gttacgacgg gtttgtttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tcc <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 20

Gin Vai Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 68

ΕΡ 1 377 314/PT

Thr Leu Ser He Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30

Ser Vai His Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gin Vai Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Lys Gly Glu Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Phe Vai Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

Lisboa, 2011-12-13

Claims (20)

1. ΕΡ 1 377 314/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal que se liga ao subdomínio de ligação Clf33 da proteína ClfA de S. aureus, onde o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 12-9 possuindo (i) uma sequência leve variável codificada por uma sequência de ácido nucleico seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17 e seus degenerados; e (ii) uma cadeia pesada variável codificada por uma sequência de ácido nucleico seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 e seus degenerados.
2. 2. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1, onde o referido anticorpo trata ou previne uma infecção por S. aureus num humano ou animal.
3. 3. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1, onde o referido anticorpo inibe a ligação de bactérias estafilocócicas a fibrinogénio ou fibrina.
4. 4. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1, onde o referido anticorpo é adequado para administração parentérica, oral, intranasal, subcutânea, por aerossol ou intravenosa num humano ou animal.
5. 5. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 onde o anticorpo monoclonal é de um tipo seleccionado entre o grupo consistindo de anticorpos monoclonais de murino, quimérico, humanizado e humano.
6. 6. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal de cadeia simples.
7. 7. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 que § criado contra uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
8. 8. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 7 onde a proteína tem uma sequência de aminoácidos codificada por uma ΕΡ 1 377 314/ΡΤ 2/3 sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 3, ou seus degenerados.
9. 9. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 possuindo uma cadeia leve variável seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:18.
10. 10. Ant icorpo de acordo com a Reivindicação 1 possuindo uma cadeia pesada variável seleccionada entre o grupo consistindo de SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:20.
11. 11. Antissoros contendo um anticorpo de acordo com a Reivindicação 1.
12. 12. Kit de diagnóstico compreendendo um anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 e meios para detectar a ligação por esse anticorpo.
13. 13. Kit de diagnóstico de acordo com a Reivindicação 12 onde os referidos meios para detectar a ligação compreendem um marcador detectável que está ligado ao referido anticorpo.
14. 14. Método de diagnóstico de uma infecção de S. aureus compreendendo adicionar um anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 a uma amostra suspeita de estar infectada com S. aureus, e determinar se anticorpos se ligaram à amostra.
15. 15. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma infecção de S. aureus compreendendo uma quantidade eficaz do anticorpo da Reivindicação 1 e um veiculo, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
16. 16. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 para utilização no tratamento ou prevenção de uma infecção de S. aureus compreendendo administrar a um paciente humano ou animal uma quantidade eficaz do referido anticorpo.
17. 17. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 compreendendo adicionalmente um antibiótico fisiologicamente aceitável. ΕΡ 1 377 314/ΡΤ 3/3
18. 18. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 que é reactivo de modo cruzado com múltiplas estirpes de S. aureus.
19. 19. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 que reconhece o domínio A da proteína CifA de S. aureus.
20. 20. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 possuindo uma cadeia leve variável possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:10 e uma cadeia pesada variável possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:12. Lisboa, 2011-12-13