JP4171816B2 - Clfaタンパク質に対するモノクローナル抗体および感染症を処置または予防することにおける使用の方法 - Google Patents
Clfaタンパク質に対するモノクローナル抗体および感染症を処置または予防することにおける使用の方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、U.S.仮出願Ser.No.60/308,116(2001年7月30日 提出)、Ser.No.60/298,413(2001年6月18日 提出)、Ser.No.60/274,611(2001年3月12日 提出)、およびSer.No.60/264,072(2001年1月26日 提出)の利益を主張する。
本発明は、概して、凝集因子A(clumping factor A)(またはClfA)に対して生成された抗体、staphylococcus aureusまたはその他のブドウ球菌属細菌において発現される表面局在タンパク質に、そして特に、ClfAタンパク質に対するモノクローナル抗体およびその活性フラグメントまたはそのフィブリノゲン(fibrinogen)結合ドメインからのタンパク質(Clf40、Clf33またはClfA N3のような)、さらにフィブリノゲンまたはフィブリン(fibrin)へのClfAタンパク質の結合を阻害することおよびS.aureus感染を処置または予防することにおけるそれらの使用に関する。
宿主の首尾よいコロニー形成は、動物およびヒトにおいて、ほとんどの微生物が感染を引き起こすのに必要とされるプロセスである。微生物の付着(adhesion)は、最終的に疾患を引き起こし得る一連の出来事において、最初の重要なステップである。病原性微生物は、細菌の表面上に存在する特定の付着素(adhesins)を介して、カテーテル、人工関節、および脈管移植片のような宿主組織または血清のならされ埋入された生体材料に結合することによって、その宿主にコロニー形成する(colonized)。MSCRAMMTMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules)は、宿主の細胞外マトリックスにおける異なる成分を認識し且つ特異的に結合する細胞表面付着素のファミリーである。一旦細菌が付着に成功し、そして宿主組織にコロニー形成すると、それらの生理機能が劇的に変化し、そして損傷を与える成分(トキシンおよび蛋白加水分解酵素のような)が分泌される。さらに、付着性細菌はしばしば、バイオフィルムを生成し、そして迅速に主要な抗生物質の殺傷効果に対してより耐性になる。
従って、本発明の目的は、S.aureus ClfAタンパク質へ結合し、それゆえブドウ球菌感染を処置または予防するための方法において有用であり得る、モノクローナル抗体を提供することである。
本発明に従って、S.aureusのClfAタンパク質へ結合し得るモノクローナル抗体が提供され、これらのモノクローナル抗体は、本発明によって単離され且つ精製された活性な結合サブドメインタンパク質(Clf40、Clf33、およびClfA N3領域を含む)に対して惹起された。本発明に従うモノクローナル抗体は、S.aureus感染を処置または予防することが示された。
よって、本発明に従うモノクローナル抗体を作製するために、これらは、当該分野において周知の慣用方法を用いて、組換的に調製されるClfA、Clf40、Clf33またはN3タンパク質を用いて作製されることが好ましい。例えば、1つのこのような方法は、組換えタンパク質およびペプチドをクローニングおよび発現するための発現ベクターとしてE.coli発現ベクターpQE−30の使用を採用する。
本発明の好ましい実施態様の局面を例示する以下の実施例が提供される。当業者らは以下の実施例に開示される当該技術が、本発明の実施において有効に機能するように本発明者らによって発見された技術であり、またそれゆえに、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかしながら、本開示に鑑み、当業者は開示される特定の態様において多くの改変がなされ得、そしてまた本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果を得ることを理解すべきである。
PCRを使用し、ClfAのAドメイン(AA40−599を表すClf40またはAA221−550を表すClf33)を、S.aureus Newman ゲノムDNAから増幅し、そして6つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするE.coli発現ベクターPQE−30(Qiagen)中にサブローニングを行った。その後、このベクターをE.coli株ATCC 55151中に形質転換し、15−リットル発酵槽中で光学密度(OD600)0.7まで増殖させ、そして0.2mMイソプロピル−1−ベータ−Dガラクトシド(IPTG)と共に4時間誘導した。AGテクノロジーズ中空糸アッセンブリー(AG Technologies hollow−fiber assembly)(孔サイズ0.45μm)を使用してこの細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−80℃にて凍結した。French Press @1100psi.による2回の通過を用い、細胞を1×PBS(10mLの緩衝溶液/1g細胞ペースト)中で溶解した。細胞片を除去するために、溶解させた細胞を17.000rpmにて30分間スピンダウンした。0.1M NiCl2でチャージした5−mL HiTrap Chelating(Pharmacia)カラム上に、上清を通した。負荷後、該カラムを5カラム容量の10mM Tris、pH8.0、100mM NaCl (Buffer A)で洗浄した。30カラム容量以上の10mM Tris、pH8.0、100mM NaCl、200mM イミダゾール(Buffer B)の0−100%グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Clf40またはClf33は、〜13%Buffer B(〜26mMイミダゾール)にて溶出された。280nmにおける吸光度をモニターした。Clf40またはClf33を含む画分を、1×PBS中で透析した。
この精製されたClf40またはClf33タンパク質を使用し、マウスモノクローナル抗体のパネル(panel)を生成した。簡潔には、Balb/Cマウスの群は、溶液中または以下の表Iに示すアジュバンドと混合される50μgのClf40またはClf33タンパク質の一連の皮下免疫を受けた:
S.aureus細菌の試料(Barnett株、67−0、ATCC#25923およびATCC#49230)を採取、洗浄し、そしてウサギIGg(50mg/ml)でタンパク質A部位をブロッキングした後、2mg/mlの濃度にてMab13−2,12−9、13−1またはPBS単独(コントロール)と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−F(ab')2−抗−マウス−F(ab')2−FITCと共に、細菌の細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を解析するためにFACScaliber フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した(励起:488、発光:570)。各細菌株について、10,000イベントを採取し、測定した。
高結合96ウェルプレートを、PBS(pH7.4)中に1μg/mlのClf40溶液でコーティングし、カバー(covered)し、そして室温で2時間インキュベートした。その後、プレートをPBS、0.05%Tween20で洗浄し、そして1%BSA溶液で1時間、室温にてブロックした。洗浄に続き、モノクローナル抗体上清を加え、そしてプレートを1時間、室温にてインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、そして0.1mg/mlヒトフィブリノゲン溶液を各ウェルに加えた。プレートを1時間、室温にてインキュベートし、そして洗浄した。ヒツジ抗フィブリノゲンAP複合体を、PBS、0.05%Tween20、0.1%BSA中に1:750希釈にて加え、そして1時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、pNPP(現像溶液)を1mg/mlの最終濃度で加えた。プレートを15−30分、37℃にてインキュベートし、405nmにて結果を読みとり、そしてPerkin Elmer HTS7000 Bio−Assay readerを使用して解析した。
ソフトウェアに含まれる、リガンド捕捉法(Ligand Capture method)を使用するBiacore 3000上にて反応速度論解析を行った。ウサギ抗−マウス−Fc抗体(Biacore)を、CM5チップにアミン結合(amin coupled)した。その後、この解析されたモノクローナル抗体を、前記Fcタンパク質への結合を可能にするために、このチップ上を通した。その後、様々な濃度のClf40またはClf33タンパク質を、このチップ表面上を通し、そしてデータを採取した。Biacore provided Evaluation software(バージョン3.1)を使用してKonおよびKoffを測定し、そしてKAおよびKDを算出した。
PCRを使用し、ClfAのAドメイン(AA40−599を表すClf40、AA221−550を表すClf33−N2N3ドメインまたはAA370−559を表すClf−N3ドメイン)を、S.aureus NewmanゲノムDNAから増幅し、そして6つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするE.coli発現ベクターPQE−30(Qiagen)中にサブローニングを行った。その後、このベクターをE.coli株ATCC 55151中に形質転換し、15−リットル発酵槽中で光学密度(OD600)0.7まで増殖させ、そして0.2mMイソプロピル−1−ベータ−Dガラクトシド(IPTG)と共に4時間誘導した。AGテクノロジーズ中空糸アッセンブリー(AG Technologies hollow−fiber assembly)(孔サイズ0.45mm)を使用して細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−80℃にて凍結した。French Press @1100psi.による2回の通過を用い、細胞を1×PBS(10mLの緩衝溶液/1g細胞ペースト)中で溶解した。溶解させた細胞を17.000rpmにて30分間スピンダウンし、細胞片を除去した。0.1M NiCl2でチャージした5−mL HiTrap Chelating (Pharmacia)カラム上に、上清を通した。負荷後、該カラムを5カラム容量の10mM Tris、pH8.0、100mM NaCl (Buffer A)で洗浄した。30カラム容量以上の10mM Tris、pH8.0、100mM NaCl、200mM イミダゾール(Buffer B)の0−100%グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Clfタンパク質を、〜13%Buffer B(〜26mMイミダゾール)にて溶出した。280nmにおける吸光度をモニターした。Clf40およびClf33を含む画分を、1×PBS中で透析した。
マウスモノクローナル抗体のパネルを生成するために、精製したClf40、Clf33またはN3タンパク質を使用した。簡潔には、Balb/CまたはSJLマウスの群は溶液または以下の表IIIに示すアジュバントと混合したタンパク質1−10mgの一連の皮下免疫を受けた:
この解析を通し、流速を常に10ml/minに保った。ClfA40注入の前に、RAM−Fc結合を通して、試験抗体を前記チップに吸着した。時間0にて、30mg/mlの濃度でのClf40を3分間、前記チップ上に注入し、続いて2分間解離(dissociation)した。解析のこの段階では、Mab/ClfA相互作用の相対的な結合および解離速度を測定した。この解析の第2段階において、フィブリノゲンに作用および結合するためのClfAに結合するMabの能力(ability)を測定した。100mg/ml濃度でのフィブリノゲンを前記チップ上に注入し、そして3分後にレポートポイント(report point)を取った。
細菌の試料(Newman)を採取、洗浄し、そしてウサギIGg(50mg/ml)でタンパク質Aサイトをブロッキングした後、2mg/mlの濃度にてMabまたはPBS単独(コントロール)と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−F(ab')2−抗−マウス−F(ab')2−FITCと共に、細菌細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を分析するためにFACScaliber フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した(励起:488、発光:570)。各細菌株について、10,000イベントを採取し、測定した。
高結合96ウェルプレートを、PBS(pH7.4)中に1μg/mlのClf40溶液でコーティングし、カバー(covered)し、そして室温で2時間インキュベートした。その後、プレートをPBS、0.05%Tween20で洗浄し、そして1%BSA溶液で1時間、室温にてブロックした。洗浄に続き、モノクローナル抗体上清を加え、そしてプレートを1時間、室温にてインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、そして0.1mg/mlヒトフィブリノゲン溶液を各ウェルに加えた。プレートを1時間、室温にてインキュベートし、洗浄した。ヒツジ抗フィブリノゲンAP複合体を、PBS、0.05% Tween20、0.1% BSA中に1:750希釈にて加え、そして1時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、pNPP(現像溶液)を1mg/mlの最終濃度で加えた。プレートを15−30分、37℃にてインキュベートし、405nmにて結果を読みとり、そしてPerkin Elmer HTS7000 Bio−Assay readerを使用して解析した。
以下の表IVは、Clf40、Clf33(ClfAドメインのN2N3領域を構成する)、およびClfAN3領域のみを含む、本発明の活性領域との免疫試験の結果を示す。
Biacore解析
図1に表されるこの実験を通し、流速を常に10ml/minに保った。ClfA40注入の前に、RAM−Fc結合を通して、Mab13−1の946RUおよびMab13−2の768RUを前記チップに吸着した。グラフ上の時間0にて、30mg/mlの濃度でのClfA40を3分間、前記チップ上に注入し、続いて2分間の解離(dissociation)を行った。ClfA注入時間の終わりにおいて、13−1MabはClfAの58RUに結合し、また13−2MabはClfAの168RUに結合した。該実験のこの段階は、Mab/ClfA相互作用の相対的な結合および解離速度論を測定した。該実験の第2段階において、フィブリノゲンに作用および結合するためにClfAに結合するMabの能力を測定した。100mg/ml濃度でのフィブリノゲンを前記チップ上に注入し、そして3分後、ClfAに結合するフィブリノゲンの64RUはMab13−1に結合したが、ClfAに結合するフィブリノゲンの0RUがMab13−2に結合した。
抗体のスケールアップおよび精製
ハイブリドーマ細胞を、RPMI/DMEM、2−3リットル培養容量に対し2mM ピルビン酸ナトリウム、4mM L−グルタミンおよび2×ペニシリン−ストレプトマイシンを含む1×Nutridoma−SP培地中で増殖した。その後、ハイブリドーマ上清を遠心分離によって回収した。この上清を0.45μMフィルターを介して濾過し、そしてプロテインGクロマトグラフィーを用いて、このIgGをアフィニティ精製した。0.1Mグリシン、pH2.7を使用してこのモノクローナル抗体を溶出し、直ちに10分の1容量の2M Tris、pH8.0で中和した。次いでこの精製したIgGを、1×D−リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4に対して透析した。必要であれば、この精製抗体を濃縮し、アリコートを凍結した。
S.aureus細胞は凍結グリセロールストックから得られ、そして一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして24時間、37℃で増殖させた。その後、単独コロニーを新たな血液寒天プレート上に移した。50mlsの最終凍結ストックを用意するために、80プレートに植え付けた。その後、このプレートを24時間、37℃でインキュベーションした。インキュベーション後、この細菌をスクレイパー(scraper)から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、このコロニーを各プレートの表面から10mlsの1×PBSを含む4つの50ml管(1管あたり20プレート)へ掻き取った。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる10mlsの1×PBSを10mlsの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を10分間、3500×g、4℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をD−PBS中で洗浄し、そして50mlsの凍結培地に再び懸濁した。この細菌ストックを、エタノール/ドライアイス浴中で急速凍結することによって1mlのアリコート中に入れ、そして−80℃の冷凍庫中に置いた。凍結ストックの濃度(CFU/ml)を、ストックの1mlアリコートを解凍し、10-5から10-11の連続希釈液を調製することで測定した。希釈液を二分して、血液寒天プレート上にプレーティングし、そして16−18時間、37℃でインキュベートした。このCFU/mlを測定し(CFU/ml=(コロニー平均#×希釈ファクター)/0.050mls)そして平均CFU/mlを測定するために各希釈液を平均した。注射の日、各株のアリコートを解凍し、その後それぞれの株について1つの管に混合し、そして攪拌した。
動物、性別、種、数、年齢および供給源
Taconic Quality Laboratory Animals and Services for Research(Germantown, NY)より雌のBalb/Cマウス(5−6週齢)を購入した。動物は、処理開始前に少なくとも14日間の間、順応させた。到着してすぐに、マウスは検診され、吸湿性のある敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した(5/ケージ)。全てのマウスは、the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに示される必要な飼育基準の下、12時間の明暗周期に置かれた。
同定および無作為化
全ての動物は、投与前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理の開始前に、動物は個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が評価された。マウスを無作為化し、そして等級別に分けた体重を用いて処理群に割り当てた。
ClfA特異的モノクローナル抗体(Mab)、アイソタイプ
ClfA特異的マウスモノクローナル抗体を、マウスのアイソタイピング用のBecton Dickenson Cytometric Bead Arrayを使用してアイソタイプ化(isotyped)した。製造業者プロトコルに従い、フローサイトメトリーを使用してアイソタイプを決定した。
13.1 Clf40 Mab, IgG1
13.2 Clf40 Mab, IgG1
12.9 Clf33 Mab, IgG1
コントロール
ATTC 1771, IgG1
リン酸緩衝食塩水、pH7.4(PBS)を、Life Technologies, Inc(Cat.No.10010−023; Lot No.1078749)から購入した。
実験計画
0.5mgのモノクローナル抗体13−2、アイソタイプコントロールモノクローナル抗体CRL−1771、またはPBSでマウスを腹腔内(IP;0.5ml)注射によって処理した。IgG投与の18時間後、マウスをS.aureus BernettまたはS.aureus ATCC25923の単独静脈(IV)注射でチャレンジ(challenge)した。12日間の後、この時点にて全ての生存しているマウスを犠牲にした。処理群間での相対的な生存時間において、有意差が検出された。Mab13−2を受けたマウスの83パーセント(10/12)、CRL−1771を受けた動物の13%(2/15)、およびPBSを受けたものの0%(0/15)が、S.aureus Bernett(13−2vs.PBS,p<0.0001; 13−2vs.CRL−1771, p=0.0009)との細菌チャレンジを生き延びた(survived)。動物データの統計分析は、Mantel−Cox(logrank)試験と共にKaplan−Meier Survival Analysisを使用して実施された。S.aureus ATCC 25923が細菌チャレンジであった実験において、Mab13−2を投与されたマウスの67%(8/12)が生存し、CRL−1771処理群においては27%(4/12)が生存し、そしてPBSグループでは、7%(1/15)のみが生存した(13−2vs.CRL−1771,p=0.02;13−2vs.PBS,0.0002)。これらの結果は、MSCRAMM特異モノクローナル抗体は、S.aureus株での致死的感染に対する有意なレベルの防御を提供することを明確に示している。
A. モノクローナル抗体13−2
Fast Track 2.0キット(Invitrogen; cat#K4500)を使用して、ClfA13−2ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNAを単離した。簡潔には、10%FBSを含むDMEM−10培地中で培養した1.4×108ハイブリドーマ細胞をPBSで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Protein/RNase Degraderを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−dTセルロース上でのアフィニティ精製によって、PolyA+ mRNAを単離した。第一鎖(first strand)cDNA合成は、5μgのmRNAおよび各可変重および可変軽鎖に対する、20pmolの3’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー(Novagen; cat#69796および69812)を含む、cDNA合成キット(Novagen;cat#69001−3)中の逆転写酵素を使用することによって達成された。PCR Reagent System(Life Tecnologies;cat#10198−018)ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット(Novagen;cat#70081−3、各5pmol)を使用する30サイクル(94C ホットスタートの後、94C 1分間、50C 1分間そして72C 1分間のサイクル)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、cDNAの一部(5から50ng)を増幅した。PCR産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の1%超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするPCR断片をそのゲルから切り出し、そしてpCR2.1−TOPO(Invitrogen)プラスミドへのライゲーションのためにBIO101 Genecleanスピンカラム(cat#1101−400)を使用して精製し、続いてコンピテントTOP10 E.coli (Invitrogen;cat#K4500)への形質転換を行った。QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN;cat#27106)を使用してプラスミドDNAを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてM13フォワードおよびM13リバースプライマーを使用してABI自動シークエンサー上で配列決定した。
13−2VLA−1(可変軽配列)
Fast Track 2.0キット(Invitrogen; cat#K4500)を使用して、ClfA12−9ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNAを単離した。簡潔には、10%FBSを含むDMEM−10培地中で培養した1.4×108ハイブリドーマ細胞をPBSで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Protein/RNase Degraderを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−dTセルロース上でのアフィニティ精製によって、PolyA+ mRNAを単離した。第一鎖(first strand)cDNA合成は、5μgの mRNAおよび各可変重および可変軽鎖に対する、20pmolの3’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー(Novagen; cat#69796および69812)を含む、cDNA合成キット(Novagen;cat#69001−3)中の逆転写酵素を使用することによって達成された。PCR Reagent System(Life Tecnologies;cat#10198−018)ならびにマウス可変重および軽鎖特異的プライマーセット(Novagen;cat#70081−3、各5pmol)を使用する30サイクル(94C ホットスタートの後、94C 1分間、50C 1分間そして72C 1分間のサイクル)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、cDNAの一部(5から50ng)を増幅した。PCR産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の1%超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするPCR断片をそのゲルから切り出し、そしてpCR2.1−TOPO(Invitrogen)プラスミドへのライゲーションのためにBIO101 Genecleanスピンカラム(cat#1101−400)を使用して精製し、続いてコンピテントTOP10 E.coli (Invitrogen;cat#K4500)への形質転換を行った。QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN;cat#27106)を使用してプラスミドDNAを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてM13フォワードおよびM13リバースプライマーを使用してABI自動シークエンサー上で配列決定した。
12−9VLA−1(可変軽配列)
可変領域配列の単離および配列決定:
Fast Track 2.0キット(Invitrogen; cat#K4500)を使用して、ClfA35−220ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNAを単離した。簡潔には、10%FBSを含むDMEM−10培地中で培養した1.4×108ハイブリドーマ細胞をPBSで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Protein/RNase Degraderを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−dTセルロース上でのアフィニティ精製によって、PolyA+ mRNAを単離した。第一鎖(first strand)cDNA合成は、5mgのmRNAおよび各可変重および可変軽鎖に対する、20pmolの3’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー(Novagen; cat#69796および69812)を含む、cDNA合成キット(Novagen;cat#69001−3)中の逆転写酵素を使用することによって達成された。PCR Reagent System(Life Technologies;cat#10198−018)ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット(Novagen;cat#70081−3、各5pmol)を使用する30サイクル(94C ホットスタートの後、94C 1分間、50C 1分間そして72C 1分間のサイクル)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、cDNAの一部(5から50ng)を増幅した。PCR産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の1%超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするPCR断片をそのゲルから切り出し、そしてpCR2.1−TOPO(Invitrogen)プラスミドへのライゲーションのためにBIO101 Genecleanスピンカラム(cat#1101−400)を使用して精製し、続いてコンピテントTOP10 E.coli (Invitrogen;cat#K4500)への形質転換を行った。QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN;cat#27106)を使用してプラスミドDNAを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてM13フォワードおよびM13リバースプライマーを使用してABI自動シークエンサー上で配列決定した。
35−220VLD−4(可変軽配列DNA)
可変領域配列の単離および配列決定:
Fast Track 2.0キット(Invitrogen; cat#K4500)を使用して、ClfA35−006ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNAを単離した。簡潔には、10%FBSを含むDMEM−10培地中で培養した1.4×108ハイブリドーマ細胞をPBSで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Protein/RNase Degraderを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−dTセルロース上でのアフィニティ精製によって、PolyA+ mRNAを単離した。第一鎖cDNA合成は、5mgのmRNAおよび各可変重および可変軽鎖に対する、20pmolの3’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー(Novagen; cat#69796および69812)を含む、cDNA合成キット(Novagen;cat#69001−3)中の逆転写酵素を使用することによって達成された。PCR Reagent System(Life Tecnologies;cat#10198−018)ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット(Novagen;cat#70081−3、各5pmol)を使用する30サイクル(94C ホットスタートの後、94C 1分間、50C 1分間そして72C 1分間のサイクル)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、cDNAの一部(5から50ng)を増幅した。PCR産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の1%超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするPCR断片をそのゲルから切り出し、そしてpCR2.1−TOPO(Invitrogen)プラスミドへのライゲーションのためにBIO101 Genecleanスピンカラム(cat#1101−400)を使用して精製し、続いてコンピテントTOP10 E.coli (Invitrogen;cat#K4500)への形質転換を行った。QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN;cat#27106)を使用してプラスミドDNAを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてM13フォワードおよびM13リバースプライマーを使用してABI自動シークエンサー上で配列決定した。
35−006VLD−1(可変軽配列DNA)
ヒト志願者の全血から単離されたヒト不変領域(軽鎖:カッパ;重鎖:G1、3または4)を使用して、キメラ12−9を生成した(Poly A RNAの選択および第一鎖cDNAのPCR増幅)。哺乳類細胞中での発現のため、重および軽鎖可変領域配列の両方の5‘末端に、固有の制限サイトBsm1を加えた。3’末端(それぞれの不変領域に対するスプライス部位)では、Bsiw1部位を軽鎖可変領域に加え、また重鎖可変領域にはApa1部位を加えた。これは、オリゴヌクレオチドプライマーの設計および適切な12−9DNAテンプレートのPCR増幅に続く確認DNA配列決定(confirmatory DNA sequencing)によって達成された。
このヒト化工程は、分子の特異性およびClfA標的抗原に対する親和性に関与しないマウス可変領域の溶媒露出残基(solvent exposed residue)のみを変化することに焦点を合わせている。これらの決定のための情報は、Pdlanによって出版された、溶媒利用可能性決定(solvent availability determinations)(抗体可変ドメインの免疫原性を減少する一方、それらのリガンド結合特性を保存するために可能な方法。Molecular Immunology, 28(4); 489−498, 1991)を利用し、またこれらの決定をするために、T−細胞エピトープを決定するためのインシリコまたはアルゴリズムにおける分子モデリングは、使用しなかった。
Staphylococcus aureus
MRSA株67−0細胞は凍結グリセロールストックから得られ、そして一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして24時間、37℃で増殖させた。その後、単独コロニーを新たな血液寒天プレート上に移した。80プレートを接種し、50mlsの最終凍結ストックを調製した。その後、プレートを24時間、37℃でインキュベーションした。インキュベーション後、細菌をスクレイパー(scraper)から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、コロニーを各プレートの表面から10mlsの1×PBSを含む4つの50ml管(1管あたり20プレート)へ掻き取った。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる10mlsの1×PBSを10mlsの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を10分間、3500×g、4℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をD−PBS中で洗浄し、そして50mlsの凍結培地に再び懸濁した。この細菌ストックを、エタノール/ドライアイス浴中で急速凍結することによって1mlのアリコート中に入れ、そして−80℃の冷凍庫中に置いた。凍結ストックの濃度(CFU/ml)を、ストックの1mlアリコートを解凍し、10-5から10-11の連続希釈液を用意することで測定した。希釈液を二分して、血液寒天プレート上にプレーティングし、そして16−18時間、37℃でインキュベートした。このCFU/mlを測定し(CFU/ml=(コロニー平均#×希釈ファクター)/0.050mls)そして平均CFU/mlを決定するために各希釈液を平均した。注射の日、各株のアリコートを解凍し、1つの管に混合し、攪拌した。その後、各ストックの希釈液が用意される。
12−9Aモノクローナル抗体(IgG1サブタイプ)を、プロテインGアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度1.0EU/mgタンパク質を有する7.0mg/mlの濃度であると報告された。この材料を、4℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、0.6mg/mlまで希釈し、そして0.5mlを適切な動物群に腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、0.3mgのIgGになる。
35−052モノクローナル抗体(IgG1サブタイプ)を、プロテインGアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度1.0EU/mgタンパク質を有する4.2mg/mlの濃度であると報告された。この材料を、4℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、0.6mg/mlまで希釈し、そして0.5mlを適切な動物群に腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、0.3mgのIgGになる。
CRL1771モノクローナル抗体(IgG1サブタイプ)を、プロテインGアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度0.2EU/mgタンパク質を有する5.0mg/mlの濃度であると報告された。この材料を、4℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、0.6mg/mlまで希釈し、そして0.5mlを腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、0.3mgのIgGになる。
受け取ってすぐに、全ての動物を検診し、吸湿性のあるbed−o−cobb敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した(5/ケージ)。全ての動物は、12時間の明暗周期で、自由に食事(Harlan/Teklad Mouse Pelleted Diet #7012)および水道水を得ることができる。動物の世話および必要な飼育条件の全ての面は、the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従った。
全てのマウスは、処理前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理の開始前に、マウスは個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が再評価された。マウスを体重の階層化による無作為化に基づき処理群に割り当てた。
このデータは、ClfA−フィブリノゲン結合と無関係な部位においてClfAを認識する特異的コントロール(35−052)だけでなく、非ClfA特異的アイソタイプコントロール(CRL1771)と比較した、ClfA−フィブリノゲン接着を妨げる12−9などの抗−ClfA抗体の治療価値を示す。
S.aureus細菌試料(株Newman−WT, 67−0, 560 Sal 1, 203 Sal 2, 451 Sal 4, 206 Sal 5, 397 Sal 6, 49, 189, 203 および4046)を、3時間および一晩にて採取し、洗浄し、そしてウサギIgG(50mg/ml)でタンパク質A部位をブロッキングした後、2mg/mlの濃度にてMab12−9、35−52または1771単独(コントロール)と共にインキュベートした。Sal記号(designation)を含むS.aureus株は、全ての臨床分離株の65.68%を占める5つの明確な系を表す(Booth,ら,Infect.Immun.69,345−353,2001)。同様に、Newman ClfA::emr(ClfAノックアウト)およびNewman Spa::kan(プロテインAノックアウト)を、特異性コントロールと同じように解析した。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−F(ab')2−抗−マウス−F(ab')2−FITCと共に、細菌の細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を解析するためにFACScaliber フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した(励起:488、発光:570)。各細菌株について、10,000イベントを採取し、測定した。
実施例12.全細胞S.aureus結合を阻害する抗−ClfA抗体における可変領域の相同性
フィブリノゲンへのClfA結合を阻害する能力に基づく抗−ClfA抗体の選択からの予想外の結果は、軽および重可変鎖領域の相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列における類似性である。これをプロファイルするために、抗−ClfA抗体を、以下の工程を使用するフィブリゲン−コーティングしたプレートへの結合の全細胞S.aureus阻害に基づいて選択した:対象の抗体を、アッセイ緩衝溶液中に4μg/mlの濃度から始め、連続的に希釈した。同時に(cocurrently)、S.aureus(Newman spa::kan)の一晩の培養を洗浄、ウサギIgGでブロックし、その後Syto13細胞浸透性蛍光DNA染色(cell permeable fluorescent DNA stain)で染色し、そして10分間インキュベートした。等量の染色細胞および希釈抗体を混合し、そして30分間4℃にてインキュベートし、その後、ヒトフィブリノゲンコーティングした/ブロックしたマイクロタイタープレートの2重のウェルを各サンプルに加えた。プレートを1時間4℃にてインキュベートし、洗浄し、各ウェルに緩衝溶液を加え、そして蛍光プレートリーダー(fluorescent plate reader)において読み取った。
図7に示されるように、このデータは、フィブリノゲンへのS.aureus結合の阻害と共に、抗−ClfAモノクローナルに対する結合特異性を規定する免疫グロブリン鎖の最も可変な部分の中に、かなりの保存があるということを示す。この相同性は、3つの異なるハイブリドーマ−生成融合物(fusions)(12、13および35)から表される;Clf−A抗原の作成のように変わりやすい条件下における、融合の前の免疫の方法およびシーケンス。特に、このデータは、本発明の抗体の可変軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域における保存領域と同様に、ClfAに結合するモノクローナル抗体の可変重鎖のCDR1およびCDR2領域におけるコンセンサス(consensus)保存領域を明らかにした。このデータは、したがって、保存配列を有する抗体の調製は、同一の結合特性を有すべきであることを示し、したがって本発明の範囲に含まれる。
実施例13. 前−臨床および臨床使用のためのヒト化12−9の発現
重および軽免疫グロブリンポリペプチド鎖の同時発現のため、2つの遺伝子を、別々のhCMV−MIEプロモーターの制御下にある各遺伝子を有する単独プラスミド中にクローニングした。この二重遺伝子ベクターは、単独のトランスフェクションイベントにおいて、宿主細胞中への導入のためのGS選択マーカー(Lonza; Slough, UK)の単独コピーを保持する。細胞を、製造業者によって示される条件下で、Fugene−6(Roche)を使用してトランスフェクションした。上清を、一時的(transient)または安定的(stably)由来の細胞系から試験し、そしてマウスおよびキメラ由来12−9と比較した。
Claims (27)
- S.aureus ClfAタンパク質のAドメインを認識し、配列番号6のアミノ酸配列を有する可変軽鎖及び配列番号8のアミノ酸配列を有する可変重鎖を有するモノクローナル抗体13−2によって認識されるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
- S.aureus ClfAタンパク質のAドメインを認識し、配列番号5の配列又はその縮重体を有する核酸配列によってコードされた可変軽鎖及び配列番号7の配列又はその縮重体を有する核酸によってコードされた可変重鎖を有するモノクローナル抗体13−2によって認識されるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
- S.aureus ClfAタンパク質のAドメインを認識し、配列番号10のアミノ酸配列を有する可変軽鎖及び配列番号12のアミノ酸配列を有する可変重鎖を有するモノクローナル抗体12−9によって認識されるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
- S.aureus ClfAタンパク質のAドメインを認識し、配列番号9の配列又はその縮重体を有する核酸配列によってコードされた可変軽鎖及び配列番号11の配列又はその縮重体を有する核酸によってコードされた可変重鎖を有するモノクローナル抗体12−9によって認識されるエピトープに結合するモノクローナル抗体。
- 前記抗体がヒトまたは動物におけるS.aureus感染を処置または予防する、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が、フィブリノゲン(fibrinogen)またはフィブリン(fibrin)へのブドウ球菌属細菌(staphylococcal bacteria)の結合を阻害する、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトまたは動物における非経口、経口、鼻腔内、皮下、エアゾール化(aerosolized)または静脈内投与に適している、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- モノクローナル抗体が、マウス、キメラ、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される型に属する、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- ヒト化モノクローナル抗体が配列番号18のアミノ酸配列を有する可変軽鎖及び配列番号20のアミノ酸配列を有する可変重鎖を有するヒト化モノクローナル抗体12−9である、請求項8に記載の抗体。
- ヒト化モノクローナル抗体が配列番号17の配列又はその縮重体を有する核酸配列によってコードされた可変軽鎖及び配列番号19の配列又はその縮重体を有する核酸によってコードされた可変重鎖を有するヒト化モノクローナル抗体12−9である、請求項8に記載の抗体。
- 抗体が、単鎖モノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して惹起される、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- タンパク質が配列番号1または配列番号3に記載の核酸配列、またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の抗体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体を含む単離抗血清。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体およびその抗体による結合を検出するための手段を含む診断キット。
- 前記結合を検出するための手段が前記抗体へ連結される検出可能な標識を含む、請求項15に記載の診断キット。
- 有効量の請求項1〜4のいずれかの抗体および薬学的に許容されるビヒクル(vehicle)、担体、または賦形剤を含む、S.aureusの感染を処置又は予防するための、薬学的組成物。
- S.aureus Clf40タンパク質、S.aureus Clf33タンパク質、およびS.aureus N3タンパク質からなる群より選択されるS.aureus由来の単離タンパク質に対するハイブリドーマを惹起すること、及び前記エピトープとの反応性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすることを含む、請求項1〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体を作成する方法。
- 配列番号2のアミノ酸配列へ結合する能力を有する請求項1〜4のいずれかに記載の単離抗体。
- 配列番号1の核酸配列またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列へ結合する能力を有する請求項1〜4のいずれかに記載の単離抗体。
- 生理学的に許容される抗生物質をさらに含む請求項1〜4のいずれかに記載の単離抗体。
- 可変重鎖が配列RYSVHを含むCDR1領域を有する、請求項3又は4のいずれかに記載の抗体。
- 可変重鎖が配列MIWGGGNTDYNSALKSを含むCDR2領域を有する、請求項3又は4のいずれかに記載の抗体。
- 可変軽鎖が配列KSSQSVLYSSNQKNYLAを含むCDR1領域を有する、請求項3又は4のいずれかに記載の抗体。
- 可変軽鎖が配列WASTRESを含むCDR2領域を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 可変軽鎖が配列HQYLSSYTを含むCDR3領域を有する、請求項3又は4のいずれかに記載の抗体。
- S.aureusの複数の株に対して交差反応性(cross−reactive)である、請求項1〜4のいずれかに記載の単離抗体。
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US7425328B2 (en) * | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
US8475798B2 (en) * | 2005-06-16 | 2013-07-02 | Inhibitex, Inc. | Monoclonal antibodies recognizing a coagulase-negative staphylococcal protein |
CA2637152A1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-09 | Merck & Co., Inc. | Antigen-binding proteins targeting s. aureus orf0657n |
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EP2095125A2 (en) * | 2006-11-22 | 2009-09-02 | 3M Innovative Properties Company | Systems and methods for preparing and analyzing samples |
JP2010510526A (ja) * | 2006-11-22 | 2010-04-02 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 細菌全細胞を捕捉する方法及び細菌について試料を分析する方法 |
US20100062418A1 (en) * | 2006-11-22 | 2010-03-11 | Mach Patrick A | Inactivated and dried biological preparations |
US20100209946A1 (en) * | 2007-04-19 | 2010-08-19 | Naiyong Jing | Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules |
US8597959B2 (en) * | 2007-04-19 | 2013-12-03 | 3M Innovative Properties Company | Methods of use of solid support material for binding biomolecules |
MX2009012891A (es) * | 2007-05-31 | 2009-12-10 | Merck & Co Inc | Proteinas de union a antigeno dirigidas a staphylococcus aureus orf0657n. |
WO2009067595A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | 3M Innovative Properties Company | Method of analyzing a sample for a bacterium using diacetylene-containing polymer sensor |
EP2250503A2 (en) * | 2008-02-20 | 2010-11-17 | 3M Innovative Properties Company | Methods of analyzing samples for bacteria using whole cell capture and atp analysis |
PT2445522T (pt) | 2009-06-22 | 2017-10-04 | Wyeth Llc | Composições imunogénicas de antigénios de staphylococcus aureus |
DK2454284T3 (en) | 2009-07-15 | 2018-07-02 | Aimm Therapeutics Bv | GRAM POSITIVE BACTERIA-SPECIFIC BINDING COMPOUNDS |
WO2011026242A1 (en) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Vancouver Biotech Ltd. | Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor |
US8785600B2 (en) * | 2009-10-23 | 2014-07-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Anti-GCC antibody molecules and related compositions and methods |
WO2011071883A1 (en) * | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Decimmune Therapeutics, Inc. | Anti-inflammatory antibodies and uses therefor |
PL2663579T3 (pl) | 2011-01-14 | 2017-09-29 | The Regents Of The University Of California | Przeciwciała terapeutyczne przeciwko białku receptorowemu ror 1 oraz sposoby ich stosowania |
KR101044438B1 (ko) * | 2011-03-29 | 2011-06-27 | 최희선 | 저수탱크 |
WO2013012743A2 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | The University Of Chicago | Methods and compositions for inhibiting staphylococcus agglutination in blood |
WO2013041707A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Peptide or arrangement of peptides forming a staphylococcus aureus epitope binding site |
US8834898B2 (en) * | 2011-12-16 | 2014-09-16 | Boise State University | Cholera toxin chimera and its use as a staph vaccine |
EP2793944A4 (en) | 2011-12-23 | 2015-09-02 | Nicholas B Lydon | IMMUNOGLOBULINS AND VARIANTS DIRECTED AGAINST PATHOGENIC MICROBES |
US9988439B2 (en) | 2011-12-23 | 2018-06-05 | Nicholas B. Lydon | Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes |
KR102046435B1 (ko) | 2012-04-27 | 2019-11-19 | 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 | 항-gcc 항체 분자 및 gcc-표적화 치료법에 대한 감수성을 평가하기 위한 그 용도 |
EP2705852A1 (en) * | 2012-09-06 | 2014-03-12 | Université de Lausanne | An immunogenic composition against Staphylococcus aureus comprising an inactivated recombinant non-pathogenic bacterium |
HUE049012T2 (hu) | 2012-11-06 | 2020-09-28 | Medimmune Llc | Antitestek S. aureus felszíni determinánsok ellen |
CA2905940A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Decimmune Therapeutics, Inc. | Humanized, anti-n2 antibodies |
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WO2017079681A1 (en) * | 2015-11-05 | 2017-05-11 | The Texas A&M University System | Targeting of ligand binding sites in clfa |
AU2017214733B2 (en) | 2016-02-04 | 2022-09-29 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides and use of same in the treatment of diseases, disorders or conditions associated with a mutant p53 |
CA3024476A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Genmab B.V. | Antibodies and methods of use thereof in treatment of infectious disease |
WO2019040617A1 (en) * | 2017-08-23 | 2019-02-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PATHOLOGICAL ALPHA-SYNUCLEIN AND METHODS USING SAME |
US20210214684A1 (en) * | 2018-05-23 | 2021-07-15 | National University Of Singapore | Blockade of cd2 surface expression and expression of chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies |
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US11155606B2 (en) | 2018-07-24 | 2021-10-26 | Medimmune, Llc | Antibody directed against S. aureus clumping factor a (ClfA) |
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US20220153819A1 (en) | 2019-02-12 | 2022-05-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for using bispecific antibodies to bind complement and a target antigen |
US20220298255A1 (en) * | 2019-05-31 | 2022-09-22 | Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute | E-cadherin activating antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DK219084D0 (da) | 1984-05-02 | 1984-05-02 | Frederik Carl Peter Lindberg | Antigen |
US5240833A (en) * | 1989-01-30 | 1993-08-31 | The Biomembrane Institute | Method for the production of monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides |
CA2072249C (en) | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
US5256542A (en) * | 1992-03-09 | 1993-10-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise |
ZA936260B (en) * | 1992-09-09 | 1994-03-18 | Smithkline Beecham Corp | Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man |
GB9223377D0 (en) * | 1992-11-04 | 1992-12-23 | Medarex Inc | Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes |
CA2153661A1 (en) | 1993-01-12 | 1994-07-21 | Anthony George Gristina | Methods and compositions for the direct concentrated delivery of passive immunity |
ES2279511T3 (es) * | 1994-02-09 | 2007-08-16 | Epitopix Llc | Inmunizacion activa utilizando una proteina receptor de sideroforo. |
US5648240A (en) | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
US6008341A (en) * | 1994-08-22 | 1999-12-28 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | S. aureus fibrinogen binding protein gene |
EP0781847A1 (en) * | 1995-11-06 | 1997-07-02 | MERCK PATENT GmbH | Humanized monoclonal antibody |
CA2255669A1 (en) * | 1996-05-16 | 1997-11-20 | The Texas A & M University System | Collagen binding protein compositions and methods of use |
SE9704141D0 (sv) | 1997-11-12 | 1997-11-12 | Sbl Vaccin Ab | New protein and nucleotide sequence, encoding said protein |
AU762978B2 (en) * | 1998-08-31 | 2003-07-10 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
EP1125130B1 (de) * | 1998-10-29 | 2006-07-26 | DakoCytomation Denmark A/S | Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl |
WO2000064925A1 (en) | 1999-04-28 | 2000-11-02 | The Provost Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | Method of inhibiting leukocyte adhesion to fibrinogen |
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