PT2445522T - Composições imunogénicas de antigénios de staphylococcus aureus - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS DE ANTIGÉNIOS DE STAPHYLOCOCCUS ÁUREOS"

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o beneficio de prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. com o N.° 61/219.134, depositado a 22 de junho de 2009.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições imunogénicas, que compreendem polipéptidos e polissacáridos capsulares isolados a partir de Staphylococcus aureus. Além disso, a invenção refere-se a métodos para induzir uma resposta imunitária em individuos contra Staphylococcus aureus utilizando composições imunogénicas dos polipéptidos e polissacáridos capsulares de Staphylococcus aureus. Os anticorpos resultantes também podem ser utilizados para tratar ou prevenir uma infeção por Staphylococcus aureus através de imunoterapia passiva.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os seres humanos são reservatórios naturais para o Staphylococcus aureus (S. aureus). Indivíduos saudáveis podem ser colonizados por S. aureus na pele, nas narinas e na garganta, seja de forma persistente (10-35 %), intermitente (20-75 %) ou apresentar-se num estado de não portador (5-70 %) sem doença associada. Veja-se Vandenbergh et al., J. Clin. Micro. 37:3133-3140 (1999). A doença subsequentemente ocorre quando os indivíduos se tornam imunocomprometidos devido a quebras nas barreiras imunitárias, como durante cirurgia, colocação de cateteres permanentes ou outros dispositivos, trauma ou feridas. A infeção por S. aureus resultante pode causar uma ampla gama de doenças diferentes que variam de infeções cutâneas leves a endocardite, osteomielite, bacteremia, sepse e outras formas de doença com taxas de mortalidade elevadas acompanhantes. 0 grande reservatório humano potência a oportunidade para a evolução e disseminação de tipos clonais patogénicos adaptados.

As infeções estafilocócicas invasivas a partir dos cocos Gram-positivos S. aureus e S. epidermidis são de particular preocupação porque representam um problema de saúde pública crescente em todo o mundo. Especificamente, S. aureus é responsável pela maioria das infeções adquiridas em hospitais (nosocomiais) e a sua prevalência nas infeções com inicio nas comunidades está a aumentar. Por exemplo, a incidência de S. aureus resistente à meticilina invasivo (MRSA) foi estimada em 31,8 por 100.000 pessoas, incluindo 18.650 mortes nos Estados Unidos em 2005. Veja-se Klevens R.M. et al., JAMA, 298:1763-71 (2007) . O documento WO2007/113222 divulga composições imunogénicas que compreendem polissacárido ou oligossacárido capsular de Tipo 5 e/ou 8 a partir de S. aureus tendo entre 30-100 % de O-acetilação. 0 documento WO2007/113222 divulga composições vacinais que compreendem um polissacárido PNAG ou conjugado de oligossacárido, opcionalmente combinado com polissacáridos ou oligossacáridos de tipo 5 e/ou 8 de S. aureus.

Nanra J et al. (Vaccine. 2009; 27(25-26):3276-80) divulga que a expressão do fator de aglutinação A (ClfA) e antigénios de polissacárido capsular são heterogéneos e dependentes das estirpes de desafio examinadas e do microambiente in vivo.

Jones C (Carbohydr Res. 2005; 340 ( 6) :1097-106) divulga uma estrutura revista para os polissacáridos capsulares a partir dos tipos 5 e 8 de Staphylococcus aureus.

Fattom A et ai., (Infection and Immunity 1998, Vol; 66, N.° 10, p. 4588-4592) divulga um estudo sobre a imunogenicidade de CP de tipo 5 (CP 5) e de CP de tipo 8 (CP 8) de Staphylococcus aureus e a funcionalidade de anticorpos para a cadeia principal e as frações de O-acetilo. Eles concluíram que os resultados sugerem que as vacinas conjugadas de CP de S. aureus desencadeiam populações múltiplas de anticorpos com várias especificidades.

As doenças estafilocócicas registaram um aumento dramático nos últimos 20 anos, este aumento é paralelo à utilização dos dispositivos intravasculares e procedimentos invasivos. Este aumento da incidência da doença é mais preocupante devido ao aumento paralelo da resistência aos antibióticos, portanto, existe uma necessidade urgente de composições imunogénicas para utilização em vacinas ou para desencadear anticorpos policlonais ou monoclonais para conferir imunidade passiva como meio de prevenir ou tratar a infeção estafilocócica e doenças associadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção está dirigida a uma composição imunogénica multiantigénica ou multicomponente que compreende pelo menos três antigénios isolados a partir de uma bactéria estafilocócica. Os antigénios, que são polipéptidos e polissacáridos, podem ser obtidos, inter alia, diretamente a partir da bactéria utilizando procedimentos de isolamento conhecidos pelos peritos na especialidade, ou podem ser produzidos utilizando protocolos sintéticos, ou podem ser produzidos de forma recombinante utilizando procedimentos de manipulação genética também conhecidos pelos peritos na especialidade, ou através de uma combinação de qualquer dos anteriores. Em determinadas formas de realização, uma composição imunogénica da divulgação compreende três ou mais antigénios selecionados a partir de um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteina transportadora, um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e uma proteína MntC de S. aureus isolada. Além disso, a presente divulgação proporciona métodos para induzir uma resposta imunitária contra uma bactéria estafilocócica, métodos para prevenir, reduzir a gravidade, ou atrasar o aparecimento de uma doença causada por uma bactéria estafilocócica, e métodos para prevenir, reduzir a gravidade, ou atrasar o aparecimento de pelo menos um sintoma de uma doença causada pela infeção com uma bactéria estafilocócica.

Consequentemente, numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, conforme definido nas reivindicações anexas.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, conforme definido nas reivindicações anexas.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, uma proteína MntC de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, conforme definido nas reivindicações anexas.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica gue compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, uma proteína MntC de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, conforme definido nas reivindicações anexas.

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um fragmento polipeptídico de ClfA isolado, em gue o fragmento polipeptídico de ClfA compreende um domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA. Numa forma de realização, o fragmento polipeptídico de ClfA compreende um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios Nl, N2 e N3 de ClfA. Numa forma de realização, o fragmento polipeptídico de ClfA compreende um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios N2 e N3 de ClfA. Numa forma de realização, as composições que contêm o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA apresentam uma ligação reduzida a fibrinogénio. Numa forma de realização, o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA liga-se ao fibrinogénio a um nível reduzido em comparação com a ligação observada ao fibrinogénio com o domínio de ligação de fibrinogénio nativo de ClfA. Numa forma de realização, as composições que contêm o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA apresentam uma ligação a fibrinogénio reduzida e têm uma substituição de aminoácidos num ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e Ile 387 da proteína de comprimento completo que contém a sequência de sinal. Numa forma de realização, as composições que contêm o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA apresentam uma substituição de aminoácidos num ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e Ile 387, em que o aminoácido em qualquer uma ou mais destas posições é alterado para uma Ala ou Ser. Numa forma de realização, a composição compreende um dominio de ligação de fibrinogénio de ClfA em que a Tyr na posição 338 é alterada para uma Ala.

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um fragmento polipeptídico de ClfB isolado, em que o fragmento polipeptídico de ClfB compreende um domínio de ligação de fibrinogénio de ClfB. Numa forma de realização, o fragmento polipeptídico de ClfB compreende um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios Nl, N2 e N3 de ClfB. Numa forma de realização, o fragmento polipeptídico de ClfB compreende um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios N2 e N3 de ClfB. Numa forma de realização, as composições que contêm o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfB apresentam uma ligação reduzida a fibrinogénio. Numa forma de realização, o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfB liga-se ao fibrinogénio a um nível reduzido em comparação com a ligação observada ao fibrinogénio com o domínio de ligação de fibrinogénio nativo de ClfB. A composição imunogénica compreende polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus que é um polissacárido de alta massa molecular de entre 70 e 300 kDa. Numa forma de realização, o polissacárido de alta massa molecular de tipo 5 tem uma massa molecular de entre 70 e 150 kDa.

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que é entre 10 % e 100 % O-acetilado. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que é entre 50 % e 100 % O-acetilado. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que é entre 75 % e 100 % 0-acetilado. A composição imunogénica compreende polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus que é um polissacárido de alta massa molecular de entre 70 e 300 kDa. Numa forma de realização, o polissacárido de alta massa molecular de tipo 8 tem uma massa molecular de entre 70 e 150 kDa.

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que é entre 10 % e 100 % O-acetilado. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que é entre 50 % e 100 % O-acetilado. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que é entre 75 % e 100 % 0-acetilado. 0 polissacárido capsular 5 e 8 presente na composição imunogénica é conjugado com o toxoide CRMi97 de Corynebacterium diphtheriae (C. diphtheriae).

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende a MntC de S. aureus, que é uma proteina lipidada. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende a MntC de S. aureus, que não é uma proteína lipidada.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica como descrita no presente documento, que compreende adicionalmente pelo menos uma proteína a partir da família da proteína de repetição de serina-aspartato (Sdr) selecionada a partir do grupo que consiste em SdrC, SdrD e SdrE.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica como descrita no presente documento, que compreende adicionalmente a proteína B determinante de superfície regulada por ferro (IsdB).

Em cada das formas de realização descritas no presente documento onde uma composição imunogénica compreende três ou mais antigénios recitados, essa composição pode compreender adicionalmente outras substâncias imunogénicas e/ou não imunogénicas. Em determinadas formas de realização, cada composição imunogénica pode, alternativamente, "consistir essencialmente em" ou "consistir em" três ou mais dos antigénios recitados e compreender adicionalmente uma ou mais substâncias não imunogénicas, como descrito em maior detalhe no presente documento.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma composição imunogénica como descrita no presente documento, que compreende adicionalmente qualquer um dos seguintes antigénios: 0pp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação a fibronectina (fnbA), proteína B de ligação a fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e as suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador Ni ABC, RAP, autolisina, recetores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB) , SBI, Npase, EBP, sialoproteína de ligação óssea II, precursor de aureolisina (AUR)/Seppl, Cna, e fragmentos dos mesmos como M55, TSST-1, mecA, exopolissacárido de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina Cl e nova autolisina. Em determinadas formas de realização da invenção, quando a composição imunogénica compreende determinadas formas de CP5 e/ou CP8, pode não compreender adicionalmente PNAG.

Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende adicionalmente um adjuvante. Numa forma de realização, a composição imunogénica compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a composição imunogénica é utilizada para formular uma vacina. Numa forma de realização, a vacina é utilizada para induzir uma resposta imunitária num indivíduo contra S. aureus. Numa forma de realização, a composição imunogénica é utilizada para gerar uma formulação de anticorpo para conferir imunidade passiva a um indivíduo.

Numa forma de realização, a divulgação proporciona um método para indução de uma resposta imunitária contra S. aureus que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade imunogénica de qualquer das composições imunogénicas descritas no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a divulgação proporciona um método para prevenir ou reduzir a infeção com S. aureus, ou um método para prevenir ou reduzir a gravidade de pelo menos um sintoma associado com uma infeção causada por S. aureus, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogénica de qualquer das composições imunogénicas descritas no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, os métodos para indução de uma resposta imunitária contra S. aureus compreendem a administração das composições imunogénicas com um adjuvante. Numa forma de realização, os métodos para indução de uma resposta imunitária contra S. aureus proporcionam a administração das composições imunogénicas com um portador farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a resposta imunitária induzida pelas composições imunogénicas descritas no presente documento, previne ou reduz uma doença ou condição associada com um organismo estafilocócico num indivíduo, ou previne ou reduz um ou mais dos sintomas associados com um organismo estafilocócico num indivíduo. Numa forma de realização, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em doença por S. aureus invasiva, sepse ou estado de portador.

Numa forma de realização, a resposta imunitária induzida compreende a geração de anticorpos que têm atividade opsonofagocítica (OPA) contra S. aureus. Numa forma de realização, a resposta imunitária induzida compreende a geração de títulos mais elevados de anticorpos opsonofagocíticos específicos para S. aureus, em comparação com aqueles observados em indivíduos não imunizados. Numa forma de realização, o título opsonofagocítico é de pelo menos 1:20.

Numa forma de realização, o S. aureus contra o qual a resposta imunitária é induzida é MSRA. Numa forma de realização, o S. aureus contra o qual a resposta imunitária é induzida é MSSA. Numa forma de realização, o S. aureus contra o qual a resposta imunitária é induzida é VRSA. Numa forma de realização, o S. aureus contra o qual a resposta imunitária é induzida é VISA.

Numa forma de realização, a divulgação proporciona um método para prevenir uma infeção estafilocócica num indivíduo submetido a um procedimento cirúrgico, o método compreendendo a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer das composições imunogénicas como descritas no presente documento ao indivíduo antes do procedimento cirúrgico. O procedimento cirúrgico pode ser um procedimento cirúrgico eletivo ou um procedimento cirúrgico não eletivo. Numa forma de realização, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico cardiotorácico. Numa forma de realização, o indivíduo é um ser humano, animal veterinário ou um animal de pecuária.

Numa forma de realização, a divulgação proporciona um método para conferir imunidade passiva a um indivíduo que compreende as etapas de (1) gerar uma preparação de anticorpos utilizando as composições imunogénicas da invenção; e (2) administrar a preparação de anticorpos ao indivíduo para conferir imunidade passiva.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra as várias formas de ClfA recombinante e divulga as SEQ ID NOs: 125 e 127-129, respetivamente, em ordem de aparecimento. A Figura 2 ilustra as etapas de clonagem utilizadas para a construção de pLP1179 para a expressão de ClfA. A Figura 3 ilustra o vetor de expressão T7Clf A(Ni23) Y338A, PLP1179. A Figura 4 ilustra a estrutura de repetição dos polissacáridos de CP5 e CP8.

As Figuras 5A e 5B ilustram perfis de massa molecular de CP5 (A) e CP8 (B) produzidos em diferentes pHs de caldos. As Figuras 6A e 6B ilustram perfis de massa molecular de CP5 (A) e CP8 (B) produzidos em diferentes temperaturas. A Figura 7 demonstra a correlação da massa molecular de CP5 e CP8 purificadas com o tempo de tratamento para hidrólise ácida leve.

As Figuras 8A-8E ilustram o alinhamento de ClfA entre várias estirpes de S. aureus (SEQ ID NOs: 62, 64, 68, 84, 70, 104, 66, 78, 86, 88, 90, 72, 74, 76, 80, 94, 82, 92, 96, 98, 100, 102, 106 e 108, respetivamente, em ordem de aparecimento). A Figura 9 ilustra a árvore filogenética de ClfA.

As Figuras 10A-10E ilustram o alinhamento de ClfB entre várias estirpes de S. aureus (SEQ ID NOs: 26, 28, 32, 18, 54, 34, 36, 30, 16, 20, 22, 24, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58 e 60, respetivamente, em ordem de aparecimento). A Figura 11 ilustra a árvore filogenética de ClfB. A Figura 12 ilustra o alinhamento de MntC entre várias estirpes de S. aureus (SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 4, 6, 14 e 12, respetivamente, em ordem de aparecimento). A Figura 13 demonstra que os anticorpos de coelho policlonais anti-ClfA reduzem as contagens de colónias de S. aureus 659-018 num modelo murino de sepse. A Figura 14 demonstra que a imunização ativa com ClfA reduz a colonização do coração por S. aureus PFESA0003 no modelo de coelho de endocardite infeciosa.

As Figuras 15A e 15B demonstra que a imunização com MntC reduz S. aureus no sangue. A: estirpe PFESA0237 de S. aureus; B: estirpe PFESA0266 de S. aureus. A Figura 16 demonstra que a formulação imunogénica conjugada de S. aureus CP5-CRMig7 exibe consistentemente proteção num modelo murino de pielonefrite. A Figura 17 demonstra que a vacinação com formulação imunogénica conjugada de CP8-CRMi97 reduz a morte num modelo de sepse. A Figura 18 mostra unidades formadoras de colónias (CFU) recuperadas em rins depois do desafio com S. aureus PFESA0266 em ratinhos vacinados com CP5-CRM de alta massa molecular (HMW), CP5-CRM de baixa massa molecular (LMW) ou PP5-CRM de controlo. A Figura 19 mostra uma comparação de titulos de OPA (geomédia) a partir de soro obtido de ratinhos vacinados com formulações diferentes de conjugado de polissacárido (CP5-CRM de alta massa molecular (HMW), CP5-CRM de baixa massa molecular (LMW) ) . Os grupos consistiram em 5 a 9 ratinhos. A Figura 20 demonstra o título de OPA para soro de primata não humano antes (semanaO, símbolos não preenchidos) e 2 semanas depois (semana2, símbolos preenchidos) da vacinação com diferentes combinações de antigénios de S. aureus. A vacina de 3 antigénios (3Ag) era composta por três antigénios e a vacina de 4 antigénios (4Ag) era composta por quatro antigénios. Cada formulação tem dois conjugados de CP e 1 ou 2 péptidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes de os presentes métodos e metodologia de tratamento serem descritos, deve ser compreendido que esta invenção não se limita a métodos particulares e condições experimentais descritos, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Deve ser compreendido também que a terminologia utilizada no presente documento tem propósito de descrever formas de realização particulares apenas, e não pretende ser limitante.

Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou teste da invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

Os termos utilizados no presente documento têm os significados reconhecidos pelos peritos na especialidade, contudo, para conveniência e integridade, termos particulares e os seus significados são estabelecidos abaixo.

Conforme utilizado na presente memória descritiva e reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as respetivas referências plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, referências a "o método" incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descrito no presente documento e/ou que se tornarão evidentes para os peritos na especialidade após leitura desta divulgação e assim por diante. 0 termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de um intervalo estatisticamente significativo de um valor. Tal intervalo pode estar entre uma ordem de grandeza, tipicamente entre 20 %, mais tipicamente ainda dentro de 10 % e, ainda mais tipicamente dentro de 5 % de um determinado valor ou intervalo. A variação permissivel englobada pelo termo "cerca de" ou "aproximadamente" depende dos sistemas particulares em estudo, e pode ser prontamente discernível por um perito na especialidade. Sempre que um intervalo for recitado neste pedido, todos os números inteiros dentro do intervalo também estão contemplados como uma forma de realização da invenção.

Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como um hidrato de carbono, polinucleótido, lipido, polipéptido, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antigénio, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme é utilizado no presente documento, a menos que indicado de outra forma pelo contexto, o termo destina-se a englobar, não só anticorpos policlonais e monoclonais intactos, mas também anticorpos manipulados (por exemplo, quiméricos, humanizados e/ou derivatizados para alterar as funções efetoras, estabilidade e outras atividades biológicas) e fragmentos dos mesmos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , anticorpos de cadeia simples (ScFv) e de domínio, incluindo anticorpos de tubarão e camelídeo) e proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos desde que exibam a atividade biológica desejada) e fragmentos de anticorpo como descritos no presente documento, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antigénio. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgG, IgA ou IgM (ou subclasses das mesmas) e o anticorpo não tem de ser de uma classe particular. Dependendo da sequência de aminoácidos do anticorpo do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2 nos seres humanos. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respetivamente. As estruturas da subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. "Fragmentos de anticorpo" compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção preferentemente retém pelo menos uma, preferentemente a maioria ou todas, das funções normalmente associadas com aquela porção quando presente num anticorpo intacto. 0 termo "antigénio" refere-se, no geral, a uma molécula biológica, normalmente uma proteína, péptido, polissacárido, lípido ou conjugado que contém pelo menos um epítopo ao qual um anticorpo cognato se pode ligar de forma seletiva; ou, em alguns casos, a uma substância imunogénica que pode estimular a produção de anticorpos ou respostas de células T, ou ambas, num animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas para um animal. A resposta imunitária pode ser gerada contra a molécula intacta, ou contra uma ou mais várias porções da molécula (por exemplo, um epítopo ou hapteno) . 0 termo pode ser utilizado para referir-se a uma molécula individual ou a uma população homogénea ou heterogénea de moléculas de antigénio. Um antigénio é reconhecido por anticorpos, recetores de células T ou outros elementos de imunidade celular e/ou humoral específica. 0 termo "antigénio" inclui todos os epítopos antigénicos relacionados. Os epítopos de um dado antigénio podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Por exemplo, os epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando concorrentemente grandes números de péptidos em suportes sólidos, os péptidos correspondendo a porções da molécula proteica, e submetendo os péptidos a reação com anticorpos enquanto os péptidos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, no documento de patente U.S. N.° 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De forma semelhante, epítopos conformacionais podem ser identificados por determinação da conformação espacial de aminoácidos como através de, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja-se, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Adicionalmente, para os propósitos da presente invenção, um "antigénio" também pode ser utilizado para referir-se a uma proteína que inclui modificações, como eliminações, adições e substituições (geralmente conservativas por natureza, mas podem ser não conservativas), em relação à sequência nativa, desde que a proteína mantenha a capacidade para desencadear uma resposta imunitária. Estas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagénese sítio dirigida, ou através de procedimentos sintéticos particulares, ou através de uma abordagem de manipulação genética, ou podem ser acidentais, como através de mutações de hospedeiros, que produzem os antigénios. Adicionalmente, o antigénio pode ser derivado, obtido ou isolado a partir de um micróbio, por exemplo, uma bactéria, ou pode ser um organismo completo. De forma semelhante, um oligonucleótido ou polinucleótido, que expressa um antigénio, como nas aplicações de imunização com ácidos nucleicos, também está incluído na definição. Os antigénios sintéticos também estão incluídos, por exemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes e outros antigénios recombinantes ou derivados de forma sintética (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Suíça, 28 Jun. - 3 Jul., 1998) . O termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que potência a resposta imunitária frente a um antigénio como adicionalmente descrito e exemplificado no presente documento. "Bacteremia" é uma presença transitória de bactérias no sangue. Uma bacteremia pode progredir para septicemia, ou sepse, que poderia ser considerada uma infeção e é a presença persistente de bactérias no sangue com sinais/sintomas clínicos associados. Nem todas as bactérias são capazes de sobreviver no sangue. Aquelas que têm os atributos genéticos especiais que proporcionam essa capacidade. Igualmente, os fatores do hospedeiro desempenham igualmente um papel importante. "Polissacárido capsular" ou "polissacárido de cápsula" refere-se à cápsula de polissacáridos que é externa à parede celular de maioria dos isolados de estafilococos. Por exemplo, S. aureus inclui um componente da parede celular composto por um complexo de peptidoglicano, que permite ao organismo sobreviver sob condições osmóticas desfavoráveis e também inclui um ácido teicoico único ligado ao peptidoglicano. Externamente à parede celular, uma fina cápsula de polissacáridos reveste a maioria dos isolados de S. aureus. Esta cápsula serologicamente distinta pode ser utilizada para estabelecer o serotipo de vários isolados de S. aureus. Foi demonstrado que muitos dos isolados clinicamente significativos incluem dois tipos capsulares: serotipo 5 (CP5) e serotipo 8 (CP8). As estruturas de CP5 e CP8 são mostradas esquematicamente na Figura 4.

Como utilizado no presente documento, "conjugados" compreende um polissacárido de cápsula normalmente de um intervalo desejado de massa molecular e uma proteína transportadora, em que o polissacárido de cápsula está conjugado com a proteína transportadora. Os conjugados podem ou não conter alguma quantidade de polissacárido de cápsula livre. Como utilizado no presente documento, "polissacárido de cápsula livre" refere-se a um polissacárido de cápsula que está associado de forma não covalente com (ou seja, ligado de forma não covalente a, adsorvido a, ou aprisionado em ou com) o polissacárido capsular-proteina transportadora conjugados. Os termos "polissacárido de cápsula livre", "polissacárido livre" e "sacárido livre" podem ser utilizados indistintamente e destinam-se a transmitir o mesmo significado. Independentemente da natureza da molécula transportadora, ela pode ser conjugada com o polissacárido capsular diretamente ou através de um ligante. Como utilizado no presente documento, "conjugar", "conjugado" e "conjugando" refere-se a um processo pelo qual um polissacárido capsular bacteriano é covalentemente ligado à molécula transportadora. A conjugação potência a imunogenicidade do polissacárido capsular bacteriano. A conjugação pode ser realizada de acordo com os métodos descritos abaixo ou por processos conhecidos na técnica.

Como descrito acima, a presente divulgação refere-se a conjugados que compreende polissacáridos capsulares de serotipo 5 (CP5) de S. aureus conjugados com proteínas transportadoras e conjugados que compreendem polissacáridos capsulares de serotipo 8 (CP8) de S. aureus conjugados com proteínas transportadoras. Uma forma de realização da divulgação proporciona conjugados que compreendem um polissacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus conjugado com uma proteína transportadora em que: o polissacárido capsular de tipo 5 tem uma massa molecular de entre 50 kDa e 800 kDa; o polissacárido capsular de tipo 8 tem uma massa molecular de entre 50 e 700 kDa; os conjugados imunogénicos têm massas moleculares de entre cerca de 1000 kDa e cerca de 5000 kDa; e os conjugados compreendem menos do que cerca de 30 % de polissacárido livre em relação ao polissacárido total. Numa forma de realização, os conjugados compreendem menos de cerca de 25 %, cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, ou cerca de 5 % de polissacárido livre em relação ao polissacárido total. Numa forma de realização, o polissacárido de tipo 5 ou 8 tem uma massa molecular entre 20 kDa e 1000 kDa.

Numa forma de realização, o conjugado tem uma massa molecular de entre cerca de 50 kDa e cerca de 5000 kDa. Numa forma de realização, o conjugado tem uma massa molecular de entre cerca de 200 kDa e cerca de 5000 kDa. Numa forma de realização, o conjugado imunogénico tem uma massa molecular de entre cerca de 400 kDa e cerca de 2500 kDa. Numa forma de realização, o conjugado imunogénico tem uma massa molecular de entre cerca de 500 kDa e cerca de 2500 kDa. Numa forma de realização, o conjugado imunogénico tem uma massa molecular de entre cerca de 600 kDa e cerca de 2800 kDa. Numa forma de realização, o conjugado imunogénico tem uma massa molecular de entre cerca de 700 kDa e cerca de 2700 kDa. Numa forma de realização, o conjugado imunogénico tem uma massa molecular de entre cerca de 1000 kDa e cerca de 2000 kDa; entre cerca de 1800 kDa e cerca de 2500 kDa; entre cerca de 1100 kDa e cerca de 2200 kDa; entre cerca de 1900 kDa e cerca de 2700 kDa; entre cerca de 1200 kDa e cerca de 2400 kDa; entre cerca de 1700 kDa e cerca de 2600 kDa; entre cerca de 1300 kDa e cerca de 2600 kDa; entre cerca de 1600 kDa e cerca de 3000 kDa.

Consequentemente, numa forma de realização, a proteína transportadora dentro do conjugado imunogénico da invenção é CRM197, e a CRM197 está covalentemente ligada ao polissacárido capsular através de uma ligação de carbamato, uma ligação de amida ou ambas. O número de resíduos de lisina na proteína transportadora que se torna conjugado com um polissacárido capsular pode ser caracterizado como um intervalo de Usinas conjugadas. Por exemplo, numa dada composição imunogénica, a CRM197 pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. Outra forma de expressar este parâmetro é que 12 % a 40 % de lisinas de CRM197 estão covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. Em algumas formas de realização, a porção de CRM197 do polissacárido covalentemente ligada a CRM197 compreende 5 a 22 lisinas covalentemente ligadas ao polissacárido. Em algumas formas de realização, a porção de CRM197 do polissacárido covalentemente ligada a CRM197 compreende 5 a 23 lisinas covalentemente ligadas ao polissacárido. Em algumas formas de realização, a porção de CRM197 do polissacárido covalentemente ligada à proteína transportadora compreende 8 a 15 lisinas covalentemente ligadas ao polissacárido. Em algumas formas de realização, a porção de CRM197 do polissacárido covalentemente ligada à proteína transportadora compreende 8 a 12 lisinas covalentemente ligadas ao polissacárido. Por exemplo, numa dada composição imunogénica, a CRM197 pode compreender 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. Outra forma de expressar este parâmetro é que 40 % a 60 % de lisinas de CRM197 estão covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. Em algumas formas de realização, a CRM197 compreende 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas a CP8. Outra forma de expressar este parâmetro é que 12 % a 40 % de lisinas de CRM197 estão covalentemente ligadas a CP8. Em algumas formas de realização, a CRM197 compreende 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas a CP5. Outra forma de expressar este parâmetro é que 40 % a 60 % de lisinas de CRM197 estão covalentemente ligadas a CP5.

Conforme discutido acima, o número de resíduos de lisina na proteína transportadora conjugado com um polissacárido capsular pode ser caracterizado como um intervalo de lisinas conjugadas, que pode ser expresso como uma razão molar. Por exemplo, a razão molar de lisinas conjugadas para CRMi97 no conjugado imunogénico de CP8 pode ser entre cerca de 18:1 a cerca de 22:1. Numa forma de realização, o intervalo de razão molar de lisinas conjugadas para CRMi97 no conjugado imunogénico de CP8 pode ser entre cerca de 15:1 a cerca de 25:1. Em algumas formas de realização, o intervalo de razão molar de lisinas conjugadas para CRM797 no conjugado imunogénico de CP8 pode ser entre cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 18:1; cerca de 10:1 a cerca de 16:1; cerca de 8:1 a cerca de 14:1; cerca de 6:1 a cerca de 12:1; cerca de 4:1 a cerca de 10:1; cerca de 20:1 a cerca de 26:1; cerca de 22:1 a cerca de 28:1; cerca de 24:1 a cerca de 30:1; cerca de 26:1 a cerca de 32:1; cerca de 28:1 a cerca de 34:1; cerca de 30:1 a cerca de 36:1; cerca de 5:1 a cerca de 10:1; cerca de 5:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; ou cerca de 10:1 a cerca de 30:1. Igualmente, a razão molar de lisinas conjugadas para CRMi97 no conjugado imunogénico de CP5 pode ser entre cerca de 3:1 e 25:1. Numa forma de realização, o intervalo de razão molar de lisinas conjugadas para CRMi97 no conjugado imunogénico de CP5 pode ser entre cerca de 5:1 a cerca de 20:1. Numa forma de realização, o intervalo de razão molar de lisinas conjugadas para CRMi97 no conjugado imunogénico de CP5 pode ser entre cerca de 4:1 a cerca de 20:1; cerca de 6:1 a cerca de 20:1; cerca de 7:1 a cerca de 20:1; cerca de 8:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; cerca de 11:1 a cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 20:1; cerca de 13:1 a cerca de 20:1; cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 15:1 a cerca de 20:1; cerca de 16:1 a cerca de 20:1; cerca de 17:1 a cerca de 20:1; cerca de 18:1 a cerca de 20:1; cerca de 5:1 a cerca de 18:1; cerca de 7:1 a cerca de 16:1 ou cerca de 9:1 a cerca de 14:1.

Outra forma de expressar o número de resíduos de lisina na proteína transportadora conjugado com o polissacárido capsular pode ser como um intervalo de lisinas conjugadas. Por exemplo, num dado conjugado imunogénico de CP8, a CRMi97 pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. De forma alternativa, este parâmetro pode ser expresso como uma percentagem. Por exemplo, num dado conjugado imunogénico de CP8, a percentagem de lisinas conjugadas pode ser entre 10 % a 50 %. Em algumas formas de realização, 20 a 50 % de lisinas podem estar covalentemente ligadas a CP8. Ainda alternativamente, 30 % a 50 % das lisinas de CRMi97 podem estar covalentemente ligadas a CP8; 10 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 10 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 20 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 25 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 30 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 10 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 15 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 20 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 25 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 10 % a 15 % das lisinas de CRMi97 ou 10 % a 12 % das lisinas de CRMi97 estão covalentemente ligadas a CP8. Igualmente, num dado conjugado imunogénico de CP5, a CRMi97 pode compreender 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacárido capsular. De forma alternativa, este parâmetro pode ser expresso como uma percentagem. Por exemplo, num dado conjugado imunogénico de CP5, a percentagem de lisinas conjugadas pode ser entre 40 % a 60 %. Em algumas formas de realização, 40 % a 60 % de lisinas podem estar covalentemente ligadas a CP5. Ainda alternativamente, 30 % a 50 % das lisinas de CRMi97 podem estar covalentemente ligadas a CP5; 20 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 10 % a 30 % das lisinas de CRMi97; 50 % a 70 % das lisinas de CRMi97; 35 % a 65 % das lisinas de CRMi97; 30 % a 60 % das lisinas de CRMi97; 25 % a 55 % das lisinas de CRMi97; 20 % a 50 % das lisinas de CRMi97; 15 % a 45 % das lisinas de CRMi97; 10 % a 40 % das lisinas de CRMi97; 40 % a 70 % das lisinas de CRM797; ou 45 % a 75 % das lisinas de CRMi97 estão covalentemente ligadas a CP5. A frequência de ligação da cadeia de polissacáridos capsulares a uma lisina na molécula transportadora é outro parâmetro para a caracterização de conjugados de polissacáridos capsulares. Por exemplo, numa forma de realização, pelo menos uma ligação covalente entre CRMi97 e o polissacárido ocorre pelo menos para cada 5 a 10 unidades de repetição de sacárido do polissacárido capsular. Noutra forma de realização, existe pelo menos uma ligação covalente entre CRM 797 e o polissacárido capsular para cada 5 a 10 unidades de repetição de sacárido; cada 2 a 7 unidades de repetição de sacárido, cada 3 a 8 unidades de repetição de sacárido; cada 4 a 9 unidades de repetição de sacárido; cada 6 a 11 unidades de repetição de sacárido; cada 7 a 12 unidades de repetição de sacárido; cada 8 a 13 unidades de repetição de sacárido; cada 9 a 14 unidades de repetição de sacárido; cada 10 a 15 unidades de repetição de sacárido; cada 2 a 6 unidades de repetição de sacárido, cada 3 a 7 unidades de repetição de sacárido; cada 4 a 8 unidades de repetição de sacárido; cada 6 a 10 unidades de repetição de sacárido; cada 7 a 11 unidades de repetição de sacárido; cada 8 a 12 unidades de repetição de sacárido; cada 9 a 13 unidades de repetição de sacárido; cada 10 a 14 unidades de repetição de sacárido; cada 10 a 20 unidades de repetição de sacárido; cada 5 a 10 unidades de repetição de sacárido do polissacárido capsular. Noutra forma de realização, pelo menos uma ligação entre CRMi97 e o polissacárido capsular ocorre para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 unidades de repetição de sacárido do polissacárido capsular. A ativação quimica dos polissacáridos e subsequente conjugação com a proteína transportadora podem ser conseguidas através de meios convencionais. Veja-se, por exemplo, documentos de Patente U.S. n.°s 4.673.574 e 4.902.506. Outros métodos de ativação e conjugação podem ser utilizados alternativamente. "Proteína transportadora" ou "transportador proteico" como utilizados no presente documento, referem-se a qualquer molécula proteica que possa ser conjugada com um antigénio (como os polissacáridos capsulares) contra o qual é desejada uma resposta imunitária. A conjugação de um antigénio como um polissacárido a uma proteína transportadora pode tornar o antigénio imunogénico. Proteínas transportadoras são preferentemente proteínas que são não tóxicas e não reatogénicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. Exemplos de proteínas transportadoras são toxinas, toxoides ou qualquer material de reação cruzada mutante (CRM197) da toxina do tétano, difteria, tosse convulsa, espécies de Pseudomonas, E. coli, espécies de Staphylococcus e espécies de Streptococcus. As proteínas transportadoras devem ser passíveis a procedimentos de conjugação padrão. Numa forma de realização particular da presente invenção, CRM197 é utilizada como a proteína transportadora. CRM197 (Wyeth/Pfizer, Sanford, NC) é uma variante não tóxica (ou seja, toxoide) da toxina da difteria isolada a partir de culturas da estirpe Cl (βι97) de Corynebacterium diphtheria cultivadas em meio à base de casaminoácidos e extrato de levedura. CRM197 é purificada através de ultrafiltração, precipitação por sulfato de amónio e cromatografia de permuta iónica. Uma cultura de estirpe C7 (197) de Corynebacterium diphtheriae, que produz a proteína CRM197, foi depositada com a Coleção Americana de Culturas Tipo (American Type Culture Collection), Rockville, Maryland e foi-lhe atribuído o número de acesso ATCC 53281. Outros toxoides da difteria são também adequados para utilização como proteínas transportadoras.

Outras proteínas transportadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas tais como toxoide do tétano, toxoide da tosse convulsa, toxoide da cólera (por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251), E. coli LT, E. coli ST e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Podem também ser utilizadas proteínas de membrana externa bacterianas tais como o complexo c proteico de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína A de superfície pneumocócica (PspA), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), enterotoxina de C. difficile (toxina A) e citotoxina (toxina B) ou proteína D de Haemophilus influenzae também podem ser utilizadas. Outras proteínas, como ovalbumina, a hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou derivado proteico purificado da tuberculina (PPD) podem também ser utilizadas como proteínas portadoras.

Após a conjugação do polissacárido capsular com a proteína transportadora, os conjugados proteína-polissacárido são purificados (enriquecidos relativamente à quantidade de conjugado polissacárido-proteína) através de uma variedade de técnicas. Estas técnicas incluem, por exemplo, operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia de coluna e filtração de profundidade. Vejam-se os exemplos abaixo.

Depois dos conjugados individuais serem purificados, podem ser combinados para formular uma composição imunogénica da presente invenção, que pode ser utilizada, por exemplo, numa vacina. A formulação da composição imunogénica da presente invenção pode ser alcançada utilizando métodos reconhecidos na técnica.

Observa-se que, nesta divulgação, termos como "compreende", "compreendido", "compreendendo", "contém", "contendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído aos mesmos na lei de patentes U.S.; por exemplo, podem significar "inclui", "incluido", "incluindo" e semelhantes. Tais termos referem-se à inclusão de ingredientes particulares ou conjunto de ingredientes sem excluir quaisquer outros ingredientes. Termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm o significado atribuído aos mesmos na lei de patentes U.S., por exemplo, permitem a inclusão de ingredientes ou etapas adicionais que não prejudicam das características inovadoras ou básicas da invenção, isto é, os mesmos excluem ingredientes ou etapas não citados adicionais que se desviem das características inovadoras ou básicas da invenção, e os mesmos excluem ingredientes ou etapas da técnica anterior, como documentos na técnica que são citados no presente documento, especialmente, uma vez que é um objetivo deste documento definir as formas de realização que são patenteáveis, por exemplo, inovadoras, não óbvias, inventivas, em relação à técnica anterior, por exemplo, em relação a documentos citados no presente documento. E, os termos "consiste em" e "consistindo em" têm o significado atribuído aos mesmos na lei de patentes U.S.; nomeadamente, que estes termos são fechados. Consequentemente, estes termos referem-se à inclusão de um ingrediente particular ou conjunto de ingredientes e à exclusão de todos os outros ingredientes.

Uma "substituição de aminoácido conservativa" refere-se à substituição de um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma proteína com outros resíduos de aminoácidos tendo propriedades físicas e/ou químicas semelhantes. Substitutos de um aminoácido dentro da sequência podem ser selecionadas de entre outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos que contêm estruturas de anel aromático são fenilalanina, triptofano e tirosina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos com carga positiva (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos com carga negativa (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Não se espera que tais alterações afetem a massa molecular aparente como determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida, ou ponto isoelétrico. Substituições particularmente preferidas são: Arg por Lys e vice-versa de modo que é mantida uma carga positiva; Asp por Glu e vice-versa de modo que é mantida uma carga negativa; Thr por Ser de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Asn por Gin de modo que um NH2 livre possa ser mantido. "Fragmento" refere-se a proteinas onde apenas dominios especificos de uma proteina maior são incluidos. Por exemplo, as proteinas de ClfA e ClfB contêm até 8 dominios cada se as sequências de sinal forem incluídas. Um polipéptido que corresponde aos dominios N1N2N3, N2N3, N1N2, Nl, N2 ou N3 são cada considerados como sendo fragmentos de ClfA ou ClfB. "Fragmento" também se refere a uma proteina ou polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 4 residuos de aminoácidos (preferentemente, pelo menos 10 residuos de aminoácidos, pelo menos 15 residuos de aminoácidos, pelo menos 20 residuos de aminoácidos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, pelo menos 40 residuos de aminoácidos, pelo menos 50 residuos de aminoácidos, pelo menos 60 residuos de aminoácidos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos, pelo menos 80 residuos de aminoácidos, pelo menos 90 residuos de aminoácidos, pelo menos 100 residuos de aminoácidos, pelo menos 125 residuos de aminoácidos, ou pelo menos 150 residuos de aminoácidos) da sequência de aminoácidos de uma proteina ou polipéptido ou um ácido nucleico parental que compreende uma sequência de nucleótidos de pelo menos 10 pares de bases (preferentemente pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases) da sequência de nucleótidos do ácido nucleico parental. "Atividade funcional" de um anticorpo ou "anticorpo funcional" como utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo que, no minimo, se pode ligar especificamente a um antigénio. Funções adicionais são conhecidas na técnica e podem incluir componentes adicionais do sistema imunitário que realizam a eliminação ou morte de agentes patogénicos como através de opsonização, ADCC ou citotoxicidade mediada pelo complemento. Depois da ligação ao antigénio, quaisquer funções do anticorpo subsequentes podem ser mediadas através da região Fc do anticorpo. O ensaio opsonofagocítico (OPA) de anticorpos é um ensaio in vitro desenhado para medir in vitro a morte assistida por complemento de Ig de bactérias com células efetoras (glóbulos brancos), imitando assim um processo biológico. A ligação de anticorpo também pode inibir diretamente a função biológica do antigénio ao qual se liga, por exemplo, anticorpos que se ligam a ClfA podem neutralizar a sua função enzimática. Em algumas formas de realização, um "anticorpo funcional" refere-se a um anticorpo que é funcional tal como medido pela morte de bactérias num modelo de eficácia animal ou num ensaio de morte opsonofagocitica que demonstra que os anticorpos matam as bactérias. A massa molecular dos polissacáridos capsulares de S. aureus é uma consideração para utilização em composições imunogénicas. Por exemplo, polissacáridos capsulares de elevada massa molecular podem ser capazes de induzir determinadas respostas imunitárias de anticorpos devido a uma valência mais elevada dos epitopos presentes na superfície antigénica. O isolamento de "polissacáridos capsulares de elevada massa molecular" é contemplada para utilização nas composições e métodos da presente invenção. Por exemplo, numa forma de realização da invenção, é contemplado o isolamento de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 5 que variam em tamanho desde 70 kDa até 300 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de um polissacárido capsular de elevada massa molecular de tipo 5 que varia desde 90 kDa até 250 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de um polissacárido capsular de elevada massa molecular de tipo 5 que varia desde 90 kDa até 150 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de um polissacárido capsular de elevada massa molecular de tipo 5 que varia desde 90 kDa até 140 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de um polissacárido capsular de elevada massa molecular de tipo 5 que varia desde 80 kDa até 120 kDa de massa molecular. Outros intervalos do polissacárido capsular de serotipo 5 de elevada massa molecular que pode ser isolado e purificado pelos métodos da presente invenção incluem intervalos de peso de cerca de 70 kDa até cerca de 100 kDa de massa molecular; 70 kDa até 110 kDa de massa molecular; 70 kDa até 120 kDa de massa molecular; 70 kDa até 130 kDa de massa molecular; 70 kDa até 140 kDa de massa molecular; 70 kDa até 150 kDa de massa molecular; 70 kDa até 160 kDa de massa molecular; 80 kDa até 110 kDa de massa molecular; 80 kDa até 120 kDa de massa molecular; 80 kDa até 130 kDa de massa molecular; 80 kDa até 140 kDa de massa molecular; 80 kDa até 150 kDa de massa molecular; 80 kDa até 160 kDa de massa molecular; 90 kDa até 110 kDa de massa molecular; 90 kDa até 120 kDa de massa molecular; 90 kDa até 130 kDa de massa molecular; 90 kDa até 140 kDa de massa molecular; 90 kDa até 150 kDa de massa molecular; 90 kDa até 160 kDa de massa molecular; 100 kDa até 120 kDa de massa molecular; 100 kDa até 130 kDa de massa molecular; 100 kDa até 140 kDa de massa molecular; 100 kDa até 150 kDa de massa molecular; 100 kDa até 160 kDa de massa molecular e intervalos de massa molecular desejados semelhantes.

Conforme discutido acima, a massa molecular dos polissacáridos capsulares de S. aureus é uma consideração para utilização em composições imunogénicas. Por exemplo, polissacáridos capsulares de elevada massa molecular podem ser capazes de induzir determinadas respostas imunitárias de anticorpos devido a uma valência mais elevada dos epitopos presentes na superfície antigénica. Numa forma de realização da invenção, é contemplado o isolamento e purificação de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 8 que variam desde 7 0 kDa até 300 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 8 que variam desde 90 kDa até 250 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 8 que variam desde 90 kDa até 150 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 8 que variam desde 90 kDa até 120 kDa de massa molecular. Numa forma de realização, é contemplado o isolamento e purificação de polissacáridos de elevada massa molecular de tipo 8 que variam desde 80 kDa até 120 kDa de massa molecular. Outros intervalos de polissacáridos capsulares de serotipo 8 de elevada massa molecular que podem ser isolados e purificados pelos métodos da presente invenção incluem gamas de peso de cerca de 70 kDa até cerca de 100 kDa de massa molecular; 70 kDa até 110 kDa de massa molecular; 70 kDa até 120 kDa de massa molecular; 70 kDa até 130 kDa de massa molecular; 70 kDa até 140 kDa de massa molecular; 70 kDa até 150 kDa de massa molecular; 70 kDa até 160 kDa de massa molecular; 80 kDa até 110 kDa de massa molecular; 80 kDa até 120 kDa de massa molecular; 80 kDa até 130 kDa de massa molecular; 80 kDa até 140 kDa de massa molecular; 80 kDa até 150 kDa de massa molecular; 80 kDa até 160 kDa de massa molecular; 90 kDa até 110 kDa de massa molecular; 90 kDa até 120 kDa de massa molecular; 90 kDa até 130 kDa de massa molecular; 90 kDa até 140 kDa de massa molecular; 90 kDa até 150 kDa de massa molecular; 90 kDa até 160 kDa de massa molecular; 100 kDa até 120 kDa de massa molecular; 100 kDa até 130 kDa de massa molecular; 100 kDa até 140 kDa de massa molecular; 100 kDa até 150 kDa de massa molecular; 100 kDa até 160 kDa de massa molecular e intervalos de massa molecular desejados semelhantes.

Uma "resposta imunitária" frente a uma composição imunogénica é o desenvolvimento, num individuo, de uma resposta imunitária humoral e/ou mediada por células frente a moléculas presentes na composição de interesse (por exemplo, um antigénio, como uma proteína ou polissacárido). Para os propósitos da presente invenção, uma "resposta imunitária humoral" é uma resposta imunitária mediada por anticorpos e envolve a geração de anticorpos com afinidade para os antigénios presentes nas composições imunogénicas da invenção, enquanto uma "resposta imunitária mediada por células" é uma mediada por linfócitos T e/ou outros glóbulos brancos. Uma "resposta imunitária mediada por células" é uma desencadeada pela apresentação de epítopos antigénicos em associação com moléculas de Classe I ou Classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) . Isto ativa células T helper CD4+ específicas de antigénio ou células de linfócito T citotóxicas CD8+ ("CTLs"). As CTLs têm especificidade para antigénios de péptido ou lipido que são apresentados em associação com proteínas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ou CD1 e expressas nas superfícies celulares. As CTLs ajudam a induzir e promover a destruição intracelular de micróbios intracelulares, ou a lise de células infetadas com tais micróbios. Outro aspeto da imunidade celular envolve uma resposta especifica de antigénio por parte das células T auxiliares. As células T helpers atuam para ajudar a estimular a função, e focalizar a atividade, de células efetoras não especificas contra células exibindo antigénios peptidicos em conjunto com moléculas de MHC clássicas ou não clássicas na sua superficie. Uma "resposta imunitária mediada por células" também se refere à produção de citocinas, quimiocinas e outras tais moléculas produzidas a partir de células T ativadas e/ou outros glóbulos brancos, o que inclui aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+. A capacidade de um antigénio ou composição particular para estimular uma resposta imunitária mediada por células pode ser determinada por inúmeros ensaios, como por ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócitos), ensaios celulares citotóxicos de CTL, ao examinar linfócitos T específicos para o antigeno num individuo sensibilizado, ou ao medir a produção de citocinas por células T em resposta à reestimulação com antigénio. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. 0 termo "imunogénico" refere-se à capacidade de um antigénio ou uma vacina desencadear uma resposta imunitária, seja humoral ou mediada por células, ou ambas.

Uma "quantidade imunogénica" ou uma "quantidade imunologicamente eficaz" ou "dose", cada uma das quais é utilizada indistintamente no presente documento, refere-se geralmente à quantidade de antigénio ou composição imunogénica suficiente para desencadear uma resposta imunitária, seja uma resposta celular (células T) ou humoral (células B ou anticorpos), ou ambos, como medido por ensaios padrão conhecidos para um perito na especialidade . A quantidade de um conjugado particular numa composição é geralmente calculada com base no polissacárido total, conjugado e não conjugado para esse conjugado. Por exemplo, um conjugado de CP5 com 20 % de polissacárido livre terá cerca de 80 mcg de polissacárido CP5 conjugado e cerca de 20 mcg de polissacárido CP5 não conjugado numa dose de polissacárido CP5 de 100 mcg. A contribuição proteica para o conjugado normalmente não é considerada quando se calcula a dose de um conjugado. A quantidade de conjugado pode variar dependendo do serotipo estafilocócico. No geral, cada dose compreenderá 0,01 a 100 mcg de polissacárido, particularmente 0,1 a 10 mcg, e mais particularmente 1 a 10 mcg. A "quantidade imunogénica" dos diferentes componentes de polissacárido na composição imunogénica, podem divergir e cada pode compreende 0,01 mcg, 0,1 mcg, 0,25 mcg, 0,5 mcg, 1 mcg, 2 mcg, 3 mcg, 4 mcg, 5 mcg, 6 mcg, 7 mcg, 8 mcg, 9 mcg, 10 mcg, 15 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg ou cerca de 100 mcg de qualquer antigénio de polissacárido particular.

Noutra forma de realização, a "quantidade imunogénica" dos componentes de proteína na composição imunogénica, pode variar desde cerca de 10 mcg até cerca de 300 mcg para cada antigénio de proteína. Numa forma de realização particular, a "quantidade imunogénica" dos componentes de proteína na composição imunogénica, pode variar desde cerca de 20 mcg até cerca de 200 mcg para cada antigénio de proteína. A "quantidade imunogénica" dos diferentes componentes de proteína na composição imunogénica pode divergir, e cada compreender 10 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg, 100 mcg, 125 mcg, 150 mcg, 175 mcg ou cerca de 200 mcg de qualquer antigénio de proteína particular. A eficácia de um antigénio como um imunogénio pode ser medida através da medição dos niveis de atividade de células B medindo os niveis de anticorpos circulantes específicos para o antigénio no soro utilizando imunoensaios, ensaios de imunoprecipitação, ensaios funcionais de anticorpos, como ensaio opsónico in vitro e muitos outros ensaios conhecidos na técnica. Outra medição da eficácia de um antigénio como um imunogénio de células T pode ser efetuada por ensaios de proliferação, ensaios citolíticos, como ensaios de libertação de crómio para medir a capacidade de uma célula T para lisar a sua célula alvo específica. Adicionalmente, na presente invenção, uma "quantidade imunogénica" também pode ser definida pela medição dos níveis séricos de anticorpo específico para antigénio induzidos depois da administração do antigénio, ou medindo a capacidade dos anticorpos assim induzidos para potenciar a capacidade opsonofagocítica de glóbulos brancos particulares, conforme descrito no presente documento. 0 nível de proteção da resposta imunitária pode ser medido desafiando o hospedeiro imunizado com o antigénio que foi injetado. Por exemplo, se o antigénio frente ao qual é desejada uma resposta imunitária for uma bactéria, o nível de proteção induzido pela "quantidade imunogénica" do antigénio pode ser medido através da deteção da percentagem de sobrevivência ou da percentagem de mortalidade depois do desafio dos animais com as células bacterianas. Numa forma de realização, a quantidade de proteção pode ser medida através da medição de pelo menos um sintoma associado com a infeção bacteriana, por exemplo, uma febre associada com a infeção. A quantidade de cada dos antigénios na vacina ou composições imunogénicas multiantigénio ou multicomponente, variará em relação a cada dos outros componentes e pode ser determinada por métodos conhecidos para o perito na especialidade. Tais métodos incluiriam, por exemplo, procedimentos para medir a imunogenicidade e/ou eficácia in vi vo. 0 termo "composição imunogénica" refere-se a qualquer composição farmacêutica que contém um antigénio, por exemplo, um microrganismo, ou um componente do mesmo, cuja composição pode ser utilizada para desencadear uma resposta imunitária num indivíduo. As composições imunogénicas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar um ser humano suscetível a uma infeção por S. aureus, pela administração das composições imunogénicas através de uma via sistémica transdérmica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.) ou subcutânea; aplicação através de um penso transdérmico ou outro dispositivo de administração transdérmica; ou através da administração mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório ou genitourinário. Numa forma de realização, a administração intranasal é utilizada para o tratamento ou prevenção do transporte nasofaríngeo de S. aureus, como tal atenuando a infeção no seu estádio mais precoce. Numa forma de realização, a composição imunogénica pode ser utilizada no fabrico de uma vacina ou no desencadeamento de anticorpos policlonais ou monoclonais que poderiam ser utilizados para proteger ou tratar passivamente um animal.

Podem ser determinadas quantidades ótimas de componentes para uma composição imunogénica particular através de estudos padrão envolvendo observação de respostas imunitárias adequadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

Numa forma de realização da presente invenção, a composição imunogénica de S. aureus compreende um fragmento de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), um polissacárido capsular de tipo 5 isolado, conjugado com CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 isolado, conjugado com CRM197. Noutra forma de realização, a composição imunogénica de S. aureus é uma formulação estéril (líquida, liofilizada, vacina de ADN, preparação intradérmica) de fragmento de fator de aglutinação (ClfA) de S. aureus recombinante (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), fragmento de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus recombinante (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), um polissacárido capsular de tipo 5 isolado, conjugado com CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 isolado, conjugado com CRM197. Numa forma de realização da presente invenção, a composição imunogénica de S. aureus compreende um fragmento de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), proteína de ligação a ferro MntC de S. aureus, um polissacárido capsular de tipo 5 isolado, conjugado com CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 isolado, conjugado com CRM197. Numa forma de realização, a composição imunogénica de S. aureus é uma formulação estéril (líquida, liofilizada, vacina de ADN, preparação intradérmica) de fragmento de fator de aglutinação (ClfA) de S. aureus recombinante (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), fragmento de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus recombinante (N1N2N3, ou combinações dos mesmos), proteína de ligação a ferro MntC de S. aureus, um polissacárido capsular de tipo 5 isolado, conjugado com CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 isolado, conjugado com CRM197.

As composições imunogénicas da presente invenção podem compreender, adicionalmente, um ou mais "imunomoduladores" adicionais, que são agentes que perturbam ou alteram o sistema imunitário, de modo que é observada a regulação positiva ou regulação negativa da imunidade humoral e/ou mediada por células. Numa forma de realização particular, a regulação positiva dos ramos humoral e/ou mediado por células do sistema imunitário é preferida. Exemplos de determinados imunomoduladores incluem, por exemplo, um adjuvante ou citocina, ou ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália) , descrito no documento de Patente U.S. N.° 5.254.339, entre outros. Exemplos não limitantes de adjuvantes que podem ser utilizados na vacina da presente invenção incluem o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alúmen, géis minerais como gel de hidróxido de alumínio, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo como, por exemplo, adjuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero em bloco (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adjuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A ou outra fração de saponina, monofosforil lípido A e adjuvante de lípido-amina Avridine. Exemplos não limitantes de emulsões de óleo em água úteis na vacina da invenção incluem formulações SEAM62 e SEAM 1/2 modificadas. SEAM62 modificada é uma emulsão de óleo em água contendo 5 % (v/v) de esqualeno (Sigma) , 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7 % (v/v) de detergente polissorbato ® 80 (ICI Surfactants), 2,5 % (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 pg/ml de colesterol e 0,5 % (v/v) de lecitina. SEAM 1/2 modificada é uma emulsão de óleo em água compreendendo 5 % (v/v) de esqualeno, 1 % (v/v) detergente SPAN® 85, 0,7 % (v/v) de detergente polissorbato 80, 2,5 % (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A e 50 pg/ml de colesterol. Outros "imunomoduladores" que podem ser incluídos na vacina incluem, por exemplo, uma ou mais interleucinas, interferoes, ou outras citocinas ou quimiocinas conhecidas. Numa forma de realização, o adjuvante pode ser um derivado de ciclodextrina ou um polímero polianiónico, como aqueles descritos nos documentos de patente U.S. números 6.165.995 e 6.610.310, respetivamente. Deve ser entendido que o imunomodulador e/ou adjuvante a ser utilizado dependerá do indivíduo ao qual a vacina ou composição imunogénica será administrada, da via de injeção e do número de injeções a serem dadas. "Doença invasiva" de S. aureus é o isolamento de bactérias a partir de um sítio normalmente estéril, onde existem sinais/sintomas clínicos de doença associados. Sítios corporais normalmente estéreis incluem o sangue, LCR, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido articular/sinovial, osso, sítios corporais internos (gânglio linfático, cérebro, coração, fígado, baço, fluido vítreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros sítios normalmente estéreis. As condições clínicas que caracterizam as doenças invasivas incluem bacteremia, pneumonia, celulite, osteomielite, endocardite, choque séptico e outras. 0 termo "isolado" significa que o material é removido a partir do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ocorre naturalmente ou a partir do seu organismo hospedeiro se se trata de uma entidade recombinante, ou tomado a partir de um ambiente para um ambiente diferente). Por exemplo, um polissacárido, proteína ou péptido capsular "isolado" é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte celular ou tecidual a partir da qual a proteína é derivada, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados, ou de outra forma presentes numa mistura como parte de uma reação química. Na presente invenção, as proteínas ou polissacáridos podem ser isolados a partir da célula bacteriana ou a partir de detritos celulares, de modo que são proporcionados numa forma útil no fabrico de uma composição imunogénica. 0 termo "isolado" ou "isolamento" pode incluir purificar, ou purificação, incluindo por exemplo, os métodos de purificação das proteínas ou polissacáridos capsulares, conforme descrito no presente documento. A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um polipéptido/proteína nas quais o polipéptido/proteína é separado a partir dos componentes celulares das células a partir das quais é isolado ou produzido de forma recombinante. Assim, um polissacárido, proteína ou péptido capsular que é substancialmente livre de material celular inclui preparações do polissacárido, proteína ou péptido capsular tendo menos de cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2,5 % ou 1 %, (em peso seco) de proteína ou polissacárido ou outro material celular contaminante. Quando o polipéptido/proteina é produzido de forma recombinante, ele é também, de forma preferível, substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de 20 %, 10 % ou 5 % do volume da preparação de proteína. Quando o polipéptido/proteina ou polissacárido é produzido por síntese química, é, de forma preferível, substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, é separado dos precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína ou polissacárido. Consequentemente, tais preparações do polipéptido/proteina ou polissacárido têm menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (em peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do fragmento de polipéptido/proteina ou polissacárido de interesse.

Uma "substituição de aminoácido não conservativa" refere-se à substituição de um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma proteína com outros resíduos de aminoácidos tendo propriedades físicas e/ou químicas diferentes, utilizando as características definidas acima. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um transportador aprovado por uma agência reguladora de um governo federal, estadual ou outra agência reguladora, ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, incluindo seres humanos bem como mamíferos não humanos. O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética. Água, soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas podem ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malta, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhante. A composição, se for desejado, pode também conter quantidades mínimas de agentes humectantes, de volume, agentes emulsionantes e/ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem adquirir a forma de soluções, suspensões, emulsão, formulações de libertação sustentada e semelhantes. Exemplos de veículos farmaceuticamente adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. A formulação deverá adaptar-se ao modo de administração.

Os termos "proteína", "polipéptido" e "péptido" referem-se a um polímero de resíduos de aminoácidos e não se limitam a um comprimento mínimo do produto. Assim, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros e semelhantes, são incluídos dentro da definição. Tanto as proteínas de comprimento completo como os fragmentos das mesmas são englobados pela definição. Os termos também incluem modificações, como eliminações, adições e substituições (geralmente conservativas por natureza, mas que podem ser não conservativas), em relação a uma sequência nativa, preferentemente de modo que a proteína mantenha a capacidade de desencadear uma resposta imunitária num animal ao qual a proteína é administrada. Também estão incluídas modificações pós-expressão, por exemplo, glicosilação, acetilação, lipidação, fosforilação e semelhantes.

Uma resposta imunitária "protetora" refere-se à capacidade de uma composição imunogénica de desencadear uma resposta imunitária, seja humoral ou mediada por células, que serve para proteger o indivíduo de uma infeção. A proteção proporcionada não tem de ser absoluta, isto é, a infeção não tem de ser totalmente prevenida ou erradicada, se existe uma melhoria estatisticamente significativa em comparação com uma população de indivíduos de controlo, por exemplo, animais infetados não administrados com a vacina ou composição imunogénica. A proteção pode estar limitada à mitigação da gravidade ou rapidez do aparecimento dos sintomas de infeção. Geralmente, uma "resposta imunitária protetora" incluiria a indução de um aumento dos niveis de anticorpos específicos para um antigénio particular em pelo menos 50 % dos indivíduos, incluindo algum nível de respostas de anticorpos funcionais mensuráveis frente a cada antigénio. Em situações particulares, uma "resposta imunitária protetora" poderia incluir a indução de um aumento de duas vezes dos níveis de anticorpos ou um aumento de quatro vezes dos níveis de anticorpos específicos para um antigénio particular em pelo menos 50 % dos indivíduos, incluindo algum nível de respostas de anticorpos funcionais mensuráveis frente a cada antigénio. Em determinadas formas de realização, os anticorpos opsonizantes correlacionam-se com uma resposta imunitária protetora. Assim, a resposta imunitária protetora pode ser testada através da medição da percentagem de diminuição na contagem bacteriana num ensaio de opsonofagocitose, por exemplo, aqueles descritos abaixo. Preferentemente, existe uma diminuição na contagem bacteriana de pelo menos 10 %, 25 %, 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. O termo "recombinante", conforme utilizado no presente documento, refere-se simplesmente a qualquer proteína, polipéptido ou célula que expressa um gene de interesse que é produzido por métodos de engenharia genética. O termo "recombinante", conforme utilizando no presente documento, em relação a uma proteína ou polipéptido, significa um polipéptido produzido por expressão de um polinucleótido recombinante. As proteínas utilizadas nas composições imunogénicas da invenção podem ser isoladas a partir de uma fonte natural ou produzidas por métodos de engenharia genética, tais como, por exemplo, ClfA recombinante, ClfB recombinante ou MntC recombinante. "Recombinante", como utilizado no presente documento, descreve adicionalmente uma molécula de ácido nucleico que, em virtude da sua origem ou manipulação, não está associada com a totalidade ou uma porção do polinucleótido com o qual está associada na natureza. 0 termo "recombinante", conforme utilizado em relação a uma célula hospedeira, significa uma célula hospedeira na qual um polinucleótido recombinante foi introduzido.

ClfA recombinante (rClfA) e ClfB recombinante (rClfB), conforme utilizado no presente documento, refere-se a formas de ClfA e ClfB para utilização nas composições imunogénicas da invenção. Numa forma de realização, rClfA é um fragmento de ClfA que compreende um ou mais dos domínios N, por exemplo, N1N2N3, N2N3, N2 ou N3 e é referido no presente documento como "ClfA recombinante" ou "rClfA". Numa forma de realização, rClfB é um fragmento de ClfB que compreende um ou mais dos domínios N de ClfB, por exemplo, N1N2N3, N2N3, N2 ou N3 e é referido no presente documento como "ClfB recombinante" ou "rClfB". 0 termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, ave, peixe, réptil, ou qualquer outro animal. 0 termo "indivíduo" também inclui seres humanos. 0 termo "indivíduo" também inclui animais domésticos. Exemplos não limitantes de animais domésticos incluem: cães, gatos, porcos, coelhos, ratos, ratinhos gerbilos, hamsters, porquinhos-da-índia, furões, aves, serpentes, lagartos, peixes, tartarugas e rãs. 0 termo "indivíduo" também inclui animais de pecuária. Exemplos não limitantes de animais de pecuária incluem: alpaca, bisão, camelo, bovinos, cervideos, porcos, cavalos, lamas, mulas, burros, ovelhas, cabras, coelhos, renas, iaques, galinhas, gansos e perus.

Como utilizado no presente documento, "tratamento" (incluindo variações do mesmo, por exemplo, "tratar" ou "tratado") refere-se a qualquer um ou mais dos seguintes: (i) a prevenção da infeção ou reinfeção, como numa vacina tradicional, (ii) a redução da gravidade de, ou na eliminação de sintomas, e (iii) a eliminação substancial ou completa do agente patogénico ou distúrbio em questão. Como tal, o tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da infeção) ou terapeuticamente (depois da infeção). Na presente invenção, podem ser utilizados os tratamentos profiláticos ou terapêuticos. De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, são proporcionadas composições e métodos que tratam, incluindo imunizam profilática e/ou terapeuticamente, um animal hospedeiro contra uma infeção microbiana (por exemplo, uma bactéria como uma espécie de Staphylococcus). Os métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terapêutica a um individuo. Os métodos da presente invenção também podem ser praticados em indivíduos para aplicações de investigação biomédica.

Os termos "vacina" ou "composição vacinai", que são usados indistintamente, referem-se a composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma composição imunogénica que induz uma resposta imunitária num animal. Descrição geral A presente invenção refere-se a composições imunogénicas que compreendem pelo menos três antigénios como definido nas reivindicações anexas. Os antigénios podem ser isolados a partir do organismo utilizando procedimentos de isolamento bioquímicos, ou podem ser produzidos sinteticamente ou por meios recombinantes. Os antigénios podem ser polipéptidos, ou polissacáridos, ou uma combinação dos mesmos. Estas composições imunogénicas podem ser utilizadas no fabrico de uma vacina para imunizar os indivíduos contra infeções causadas por um organismo estafilocócico. Os componentes adeguados para utilização nestas composições são descritos em maior detalhe abaixo. Composições imunogénicas estafilocócicas S. aureus é o agente causal de uma ampla variedade de doenças humanas gue variam desde infeções cutâneas superficiais até condições potencialmente mortais como pneumonia, sepse e endocardite. Veja-se Lowy N. Eng. J. Med. 339:580-532(1998). Em casos de doença invasiva, o S. aureus pode ser isolado a partir de sitios corporais normalmente estéreis incluindo sangue, fluido espinal cerebral CSF, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido articular/sinovial, osso, sitios corporais internos (gânglio linfático, cérebro, coração, figado, baço, fluido vitreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros sitios normalmente estéreis. Isto pode conduzir a condições clinicas potencialmente mortais como bacteremia, pneumonia, celulite, osteomielite, endocardite e choque séptico. Pacientes adultos, idosos e pediátricos têm um maior risco de contrair infeções por S. aureus.

Formas de realização da presente divulgação descrevem antigénios selecionados em composições imunogénicas incluindo um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, um fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado e proteína MntC de S. aureus recombinante. A seguir, os antigénios foram caracterizados em composições imunogénicas como uma série de combinações, para demonstrar que combinações específicas proporcionam respostas imunitárias que podem ser superiores às produzidas utilizando componentes individuais para composições imunogénicas. Consequentemente, uma combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora. Uma segunda combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora. Uma terceira combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, uma proteína MntC de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora. Uma quarta combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, uma proteína MntC de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora. Em algumas formas de realização, as combinações anteriores compreendem adicionalmente pelo menos um dos seguintes antigénios: EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, KnkA, SdrC, SdrD, SdrE, 0pp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa- hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação a fibronectina (fnbA), proteína B de ligação a fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e as suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador Ni ABC, RAP, autolisina, recetores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína de ligação óssea II, precursor de aureolisina (AUR)/Seppl, Cna, e fragmentos dos mesmos como M55, TSST-1, mecA, exopolissacárido de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina Cl e nova autolisina.

Estudos epidemiológicos de surtos de S. aureus indicam que a evolução de S. aureus é clonal por natureza, onde um clone simples que adquiriu um genotipo bem-sucedido se disseminou rapidamente e provocou muitas das infeções. Como tal, a evolução é considerada como sendo clonal. 0 genoma bacteriano está compreendido por um genoma nuclear de espécies maior e mais estável e um conjunto mais diversificado de genes acessórios. Veja-se Feil et al., Nature Reviews: Microbiology 2:483-495 (2004). Os genes nucleares estão ubiquitariamente presentes em todos os clones da espécie, e os genes acessórios não estão necessariamente presentes em qualquer clone dado. Considerando o S. aureus, um estudo utilizando um microarranjo de ADN que representa mais de 90 % do genoma de S. aureus verificou que 78 % dos genes no genoma eram comuns a todos os S. aureus representando assim o "núcleo da espécie" e os restantes 22 % são os "genes acessórios". Os genes acessórios compreendem material genético dispensável muito do qual codifica fatores de virulência, proteínas que medeiam a resistência a antibióticos e genes que codificam proteínas para interagir com um ambiente de hospedeiro particular. Veja-se Fitzgerald et al., PNAS 98:8821-8826 (2001); Feil et al., Nature Reviews: Microbiology 2:483-495 (2004). No geral, os genes nucleares são de evolução mais lenta e os genes acessórios são polimórficos. Veja-se Kuhn et al., J. Bact. 188:169-178 (2006) . Como tal, genes nucleares apropriadamente selecionados proporcionam antigénios alvo melhores para utilização em composições imunogénicas para prevenir a infeção.

Antigénios expressos na superfície a partir de isolados causadores de doença de tipos clonais de S. aureus oferecem uma fonte para antigénios capazes de induzir a imunidade e anticorpos funcionais. Ao nível macromolecular (seja sequência de aminoácidos ou polissacáridos) , as formas conservadas do antigénio, expressas por diferentes isolados de doença, podem ser escolhidas para permitir uma ampla reatividade cruzada de anticorpos contra aquelas estirpes que podem possuir variações antigénicas do alvo vacinai.

Uma consideração importante para incluir um antigénio nas composições imunogénicas muitiantigénio descritas no presente documento consiste em se o antigénio demonstrou eficácia quando administrado como uma composição imunogénica ao proporcionar proteção num ou mais modelos animais de infeção bacteriana. Existem numerosos modelos animais para várias doenças provocadas por S. aureus. Cada destes modelos tem pontos fortes e fracos. A eliminação humana de infeções bacterianas pode proceder através de morte opsónica que é mediada depois da captação de fagócitos. Existem muitos exemplos convincentes para isto a partir de estudos utilizando antigénios de polissacáridos Gram-positivos, como polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae e polissacárido capsular de S. aureus. Veja-se Lee et al., Crit. Rev. Micro. 29:333-349 (2003) . Existe menos evidência para a atividade opsónica induzida por antigénios de proteinas Gram-positivas. A captação de fagócitos foi observada, mas a morte direta tem sido mais dificil de demonstrar. Foi mostrado que os anticorpos monoclonais contra proteinas conferem proteção contra o desafio com S. aureus nos modelos animais de infeção; e mecanismos diferentes da morte opsonofagocitica podem explicar a proteção observada. A indução de anticorpos tendo uma atividade funcional mensurável, como atividade opsonofagocitica (OPA) é um indicador de se um antigénio particular é útil para inclusão nas composições imunogénicas da presente invenção. Outros indicadores incluem, mas não estão limitados a, expressão antigénica na superfície celular durante a expressão in vivo conforme medida utilizando anticorpos específicos de antigénios ou a capacidade dos anticorpos para inibir/neutralizar a função antigénica.

Espécies/estirpes O tipo de qualquer estirpe de doença ou hospitalar particular é útil para determinar a origem, relação clonal e monitorização da epidemiologia dos surtos. Estão disponíveis numerosos métodos para tipificar as estirpes de S. aureus. A definição prática clássica para uma espécie bacteriana é um grupo de estirpes que são caracterizadas por mais de 70 % de hibridação genómica (hibridação genómica de ADN-ADN de DDH) mais de 97 % de identidade de sequência génica de ARN ribossomal 16S. Veja-se Vandamme et al., Microbiol. Rev. 60:407-438 (1996). A tipificação de bacteriófagos (BT) é um método de tipificação de estirpes de S. aureus com base na sua suscetibilidade à lise por determinados tipos de fagos. Veja-se Blair et al., Buli. W.H.O. 24:771-784 (1961). Este método mais antigo sofre de uma carência de reprodutibilidade entre os laboratórios e uma incapacidade de tipificar 15-20 % dos isolados. Composições imunogénicas de antigénio único frente a multiantigénio

Surge a questão de se a composição imunogénica ótima para proteger contra a infeção pelas estirpes de S. aureus predominantes deveria estar composta por um único componente ou múltiplos componentes. Numerosos estudos mostraram que as composições imunogénicas com base num único componente de proteína ou hidrato de carbono podem oferecer alguma proteção contra o desafio com uma estirpe de S. aureus que expressa aquele componente em determinados modelos animais. De forma importante, também foi demonstrado que a proteção contra um único antigénio pode ser dependente da estirpe selecionada.

As proteínas de superfície como adesinas foram investigadas como vacinas de componente único. Por exemplo, ratinhos imunizados com o ClfA de S. aureus desenvolvem uma artrite menos grave do que os ratinhos com uma proteína de controlo. Veja-se Josefsson et al., J. Infect. Dis. 184:1572-1580 (2001). Fragmentos da adesina de ligação a colagénio (cna) conferiram proteção num modelo de sepse em ratinho. Veja-se Nilsson, et al., J. Clin. Invest., 101:2640-2649 (1998). A imunização de ratinhos com o domínio A de ClfB poderia reduzir a colonização nasal num modelo de ratinho. Veja-se Schaffer et al., Infect. Immun. 74:2145-2153 (2006).

Uma das catorze proteínas de sequestro de ferro de S. aureus conhecida como IsdB tem sido investigada numa formulação imunogénica monovalente para proteção contra a infeção por S. aureus. Esta proteína mostrou um bom efeito protetor em ratinhos e uma boa imunogenicidade em primatas não humanos. Veja-se Kuklin et al., Infect. Immun. 74:2215-2223 (2006).

Devido ao vasto potencial do S. aureus para evoluir ou substituir diferentes proteínas para desempenhar funções iguais ou semelhantes, a formulação imunogénica ótima para proteção da maioria dos indivíduos da maioria das doenças provocadas por S. aureus é uma formulação multiantigénio compreendendo 2 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, etc.) antigénios adequadamente selecionados e apresentados numa formulação imunogénica. Em determinadas formas de realização, uma composição imunogénica da divulgação compreende três ou mais antigénios selecionados a partir de um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e uma proteína MntC de S. aureus isolada. Em determinadas formas de realização, uma composição imunogénica da divulgação compreende quatro ou mais antigénios selecionados a partir de um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e uma proteína MntC de S. aureus isolada. Em determinadas formas de realização, uma composição imunogénica da invenção compreende um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora, um polissacárido capsular de tipo 8 (CP8) de S. aureus isolado, conjugado com uma proteína transportadora e uma proteína MntC de 5. aureus isolada como antigénios.

Adj uvantes

Composições imunogénicas como descritas no presente documento também compreendem, em determinadas formas de realização, um ou mais adjuvantes. Um adjuvante é uma substância que potência a resposta imunitária quando administrado em conjunto com um imunogénio ou antigénio. Uma série de citocinas ou linfocinas foram mostradas como tendo atividade imunomoduladora e são, portanto, úteis como adjuvantes, incluindo, mas não limitadas a, interleucinas Ι-a, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e as suas formas mutantes); os interferões-α, β e γ; fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.078.996 e Número de Acesso ATCC 39900); fator de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF); fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF); e os fatores de necrose tumoral oí e β. Ainda outros adjuvantes que são úteis com as composições imunogénicas descritas no presente documento incluem quimiocinas, incluindo sem limitação, MCP-1, ΜΙΡ-Ια, MIP-1 β e RANTES; moléculas de adesão, como selectina, por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina; moléculas idênticas a mucina, por exemplo, CD34, GlyCAM-1 e MadCAM-1; um membro da familia das integrinas como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e pl50.95; um membro da superfamilia das imunoglobulinas como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; moléculas coestimuladoras como B7-1, B7-2, CD40 e CD40L; fatores de crescimento incluindo fator de crescimento vascular, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento epidérmico, PDGF, BL-1, e fator de crescimento endotelial vascular; moléculas recetoras incluindo Fas, recetor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 e DR6; e Caspase (ICE).

Adjuvantes adequados utilizados para potenciar uma resposta imunitária incluem adicionalmente, sem limitação, MPL™ (monofosforil lipido A 3-O-desacilado, Corixa,

Hamilton, MT), que é descrito no documento de Patente U.S. N. ° 4.912.094. Também são adequados para utilização como adjuvantes análogos de lipido A sintéticos ou compostos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que estão disponíveis de Corixa (Hamilton, MT) e que são descritos no documento de Patente dos Estados Unidos N.° 6.113.918. Um tal AGP é 2-desoxi-4-O-fosfοηο-3-Ο-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)- 3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido de 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino] etilo, que também é conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC52 9) . Este adjuvante 52 9 é formulado como uma forma aquosa (AF) ou como uma emulsão estável (SE).

Ainda outros adjuvantes incluem péptidos de muramilo, como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn- glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsões de óleo em água, como MF59 (documento de patente U.S. N.° 6.299.884) (contendo Esqualeno a 5 %, polissorbato 80 a O, 5 %, e Span 85 a 0,5 % (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formulados em partículas submicrométricas utilizando um microfluidizador como o microfluidizador Model 110Y (Micro fluidics, Newton, MA)) e SAF (contendo Esqualeno a 10 %, polissorbato 80 a 0,4 %, polímero em bloco Pluronic L121 a 5 %, e thr-MDP, sejam microfluidizados numa emulsão submicrométrica ou submetidos a vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior); adjuvante incompleto de Freund (IFA); sais de aluminio (alúmen), tais como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridine; L121/esqualeno; D-láctido-poliláctido/glicósido; polióis plurónicos; Bordetella morta; saponinas, como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrito no documento de Patente U.S. N.° 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited,

Parkville, Austrália), descrito no documento de Patente U.S. N.° 5.254.339 e complexos imunoestimulantes (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; lipopolissacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos como oligonucleótidos contendo um motivo CpG (por exemplo, documento de patente U.S. N.° 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Áustria), descrito nos documentos de Patente Europeia N.°s 1.296.713 e 1.326.634; uma toxina da tosse convulsa (PT) ou mutante da mesma, uma toxina da cólera ou mutante da mesma (por exemplo, os documentos de Patente U.S. N.°s 7.285.281, 7.332.174, 7.361.355 e 7.384.640); ou uma toxina termolábil de E. coli (LT) ou mutante da mesma, particularmente LT-K63, LT-R72 (por exemplo, os documentos de Patente U.S. N.°s 6.149.919, 7.115.730 e 7.291.588). Antigénios candidatos:

ClfA: organização de domínios O fator de aglutinação A (ClfA) é uma proteina de superfície de S. aureus associada com a ligação às proteínas da matriz do hospedeiro através de um sitio de ligação a f ibrinogénio. O ClfA é um membro de uma família de proteínas que contêm o motivo LPXTG no terminal carboxilo (SEQ ID NO: 125) que permite que a proteína se torne covalentemente ligada à superfície celular. O ClfA também pertence a outra família de proteínas (Componentes da Superfície Microbiana que Reconhecem Moléculas de Matriz Adesivas, ou MSCRAMMs) que estão associadas com a ligação a proteínas dos hospedeiros como fibrinogénio (ligado por ClfA), as proteínas de ligação a fibronectina (FnbA e FnbB), a proteína de ligação a colagénio (Cna) e outras. Estas proteínas partilham todas a sequência de sinal do terminal amino que medeia o transporte para a superfície celular. As MSCRAMMs também incluem um domínio A que é a região funcional que contém o sítio ativo para a ligação a ligando (por exemplo, fibrinogénio, fibronectina, elastina, queratina). O domínio A é seguido por uma região composta por repetições de serina aspartato (repetição SD) , que se acredita abranger a camada de peptidoglicano. A repetição SD é seguida por uma região gue abrange a membrana que inclui o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para ligação covalente da proteina ao peptidoglicano. 0 Cif A é descrito no documento de Patente U.S. N.° 6.008.341. A região de ligação a ligando de ClfA que compreende N1N2N3 do domínio A (Figura 1) abrange os aminoácidos 40-559. Os domínios N de ClfA foram atribuídos como se segue: NI engloba os resíduos 45-220; N2 engloba os resíduos 229-369 e N3 engloba os resíduos 370-559. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002) . Para facilidade de referência, os domínios N1N2N3 podem ser referidos como N123, igualmente N2N3 podem ser referidos como N23. Nas

preparações de N1N2N3 recombinantes, verificou-se que o domínio NI era sensível à protease e é facilmente clivado ou hidrolisado para deixar ο N2N3 como um fragmento recombinante de ligação a ligando estável. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). A estrutura cristalina do fragmento N2N3 de ligação a fibrinogénio do domínio A de ClfA, revelou que ambos N2 e N3 são dominados por cadeias beta antiparalelas. Além das cadeias beta antiparalelas, o domínio N2 contém uma hélice alfa de volta única e duas hélices 3io e o domínio N3 contém três hélices 3io. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). O alinhamento das sequências de N2 e N3 revela apenas 13 % de identidade de sequência e 36 % de semelhança de sequência ao longo dos seus comprimentos. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). As topologias dos domínios N2 e N3 são semelhantes à dobra de

IgG clássica e foram propostas como sendo variantes inovadoras da dobra de IgG. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002).

Sequência de ClfA O gene para a proteína A do fator de aglutinação, designado ClfA, foi clonado, sequenciado e analisado em detalhe ao nível molecular (McDevitt et ai., Mol.

Microbiol. 11: 237-248 (1994); McDevitt et al., Mol.

Microbiol. 16:895-907 (1995)). Os identificadores de sequência para as sequências de aminoácidos de ClfA de 111 isolados causadores de doença de S. aureus são mostrados no Quadro 10. A sequência de aminoácidos do ClfA de tipo selvagem de comprimento completo (incluindo a sequência de sinal) a partir da estirpe PFESA0237 de S. aureus, é mostrada na SEQ ID NO: 130. Esta sequência mostra uma tirosina na posição 338, que é alterada para uma alanina na forma mutada de ClfA. O gene de comprimento completo que codifica o ClfA de tipo selvagem a partir da estirpe PFESA0237 de 5. aureus, que compreende a região N123, a região de repetição e a região de ancoragem é mostrado na SEQ ID NO: 131. A sequência de aminoácidos das formas mutadas Y338A de ClfA é mostrada na SEQ ID NO: 123. Contudo, deve ser notado que a alteração de uma tirosina para uma alanina, que ocorre no ClfA de tipo selvagem na posição 338 da SEQ ID NO: 130, e que é designada como Y338A, é mostrada na forma mutada de ClfA, na SEQ ID NO: 123 na posição 310. Adicionalmente, a forma mutada de ClfA mostrada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 123 é a forma madura de ClfA sem a sequência de sinal, sendo assim responsável pela diferença na posição desta mutação entre a SEQ ID NO: 130 e a SEQ ID NO: 123.

ClfB: organização de domínios O ClfB é uma proteína de S. aureus que tem atividade de ligação a fibrinógeno e leva o S. aureus a formar agregados na presença de plasma. O ClfB é uma proteína MSCRAMM e apresenta a organização de domínios característica de MSCRAMM incluindo um domínio A que é a região funcional que contém o sítio ativo para a ligação a ligando (por exemplo, fibrinogénio, fibronectina, elastina, queratina). O domínio A é seguido por uma região composta por repetições de serina aspartato (repetição SD) , que se acredita abranger a camada de peptidoglicano. A repetição SD é seguida por uma região que abrange a membrana que inclui o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para ligação covalente da proteina ao peptidoglicano. 0 ClfB é descrito no documento WO 99/27109 e no documento de Patente U.S. 6.680.195. A organização interna do dominio A N-terminal de ClfB é muito semelhante à organização conforme encontrada em ClfA. O dominio A é composto por três subdomínios Nl, N2 e N3. A região de ligação a ligando de ClfB que compreende N1N2N3 do dominio A (Figura 1) abrange os aminoácidos 44-585. Para facilidade de referência, os domínios N1N2N3 podem ser referidos como N123, igualmente N2N3 podem ser referidos como N23. Os domínios N de ClfB foram atribuídos como se segue: Nl engloba os resíduos 44-197; N2 engloba os resíduos 198-375 e N3 engloba os resíduos 375-585. No ClfA, verificou-se que a estrutura cristalina do domínio A tem uma versão única da dobra de imunoglobulina e por analogia a mesma pode ser especulada como sendo o caso para ClfB. Veja-se Deivanayagam et al., EMBO J. 21:6660-6672 (2002).

Mesmo que a organização dos domínios A de ClfB e ClfA seja semelhante, a identidade de sequência é apenas de 26 %. Veja-se Ni Eidhin et al., Mol. Microbiol. 30:245-257 (2002) .

Sequência de ClfB O gene que codifica ClfB é classificado como um gene de adesão nuclear. As sequências de ClfB a partir de 92 estirpes de S. aureus associadas com múltiplos estados de doença estão resumidas na Figura 11. Sequências adicionais foram obtidas a partir de GenBank.

Outras MSCRAMMS

Outras MSCRAMMS podem ser consideradas para utilização numa composição imunogénica da presente invenção. Por exemplo, as proteínas de repetição de serina-aspartato (Sdr), SdrC, SdrD e SdrE estão relacionadas quanto à sequência primária e organização estrutural com as proteínas de ClfA e ClfB e estão localizadas na superfície celular. As proteínas SdrC, SdrD e SdrE são proteínas associadas à parede celular, tendo uma sequência de sinal no terminal N e um motivo LPXTG (SEQ ID NO:125), domínio hidrofóbico e resíduos com carga positiva no terminal C. Cada um também tem uma repetição SD contendo uma região R de comprimento suficiente para permitir, em conjunto com os motivos B, uma expressão suficiente da região A do domínio de ligação a ligando na superfície celular. Com a região A das proteínas SdrC, SdrD e SdrE localizadas na superfície celular, as proteínas podem interagir com proteínas no plasma, com a matriz extracelular ou com moléculas na superfície das células hospedeiras. As proteínas Sdr partilham alguma semelhança de sequência de aminoácidos limitada com ClfA e ClfB. Como ClfA e ClfB, SdrC, SdrD e SdrE também exibem ligação a ligando dependente de catiões de proteínas da matriz extracelular.

Os genes sdr estão intimamente ligados e organizados em tandem. As proteínas Sdr (de SdrC, SdrD, SdrE, ClfA e ClfB) compreendem caracteristicamente uma região A onde existe uma sequência de aminoácidos altamente conservada que pode ser utilizada para derivar um motivo TYTFTDYVD (SEQ ID NO: 126) de consenso. 0 motivo exibe uma ligeira variação entre as diferentes proteínas. Esta variação, em conjunto com a sequência de consenso do motivo é descrita no documento de patente U.S. 6.680.195. Nas proteínas CifSdr, este motivo está altamente conservado. O motivo pode ser utilizado em composições imunogénicas para conferir imunidade de amplo espectro contra infeções bacterianas, e também pode ser utilizado como um antigénio na produção de anticorpos monoclonais e policlonais. Um tal anticorpo pode ser utilizado para conferir imunidade passiva de amplo espectro.

As proteínas Sdr diferem de ClfA e ClfB por terem duas a cinco sequências repetidas de resíduos 110-113 adicionais (motivos B) localizadas entre a região A e a região R. Cada motivo B contém uma ansa de mão EF de ligação a Ca de consenso, normalmente encontrada nas proteinas eucarióticas. A integridade estrutural de uma proteína recombinante compreendendo as cinco repetições B de SdrD foi mostrada por análise de fluorescência bisANS como sendo dependente de Ca2+, sugerindo que as mãos EF são funcionais. Quando Ca2+ foi removido, a estrutura colapsou para uma conformação não dobrada. A estrutura original foi restaurada por adição de Ca2+. Os domínios R do terminal C das proteínas Sdr contêm resíduos SD 132-170. Estes são seguidos por regiões de ancoragem à parede conservadas característica de muitas proteínas de superfície de bactérias Gram positivas.

Nas proteínas Sdr e Cif este motivo B está altamente conservado enquanto uma versão degenerada ocorre em MSCRAMMS de ligação à fibronectina, bem como na proteína Cna de ligação a colagénio. Os motivos B, em conjunto com as regiões R, são necessários para apresentação do domínio de ligação a ligando em alguma distância a partir da superfície celular. Os motivos B repetidos são um denominador comum do subgrupo de proteínas de repetição SD descritas no presente documento. Estes motivos são encontrados em diferentes números nas três proteínas Sdr da estirpe PFESA0237. Existem claras distinções entre os motivos B individuais. As unidades mais conservadas são aquelas localizadas adjacentes às regiões R (SdrC B2, SdrD B5 e SdrE B3) . Eles diferem do resto em vários sítios, especialmente na metade C-terminal. Um detalhe estrutural notável é que as repetições B adjacentes são sempre separadas por um resíduo de prolina presente na região C-terminal, mas uma prolina nunca ocorre entre as últimas repetições B e a região R. Em vez disso, este ligante é caracterizado por uma extensão ácida curta. Estas diferenças são uma evidência de que as unidades de extremidade têm um papel estrutural ou funcional diferente em comparação com os outros motivos B. Os motivos B N-terminais de SdrD e SdrE afastaram-se dos outros, e existem numerosas alterações de aminoácidos, incluindo pequenas inserções e eliminações enquanto os motivos B internos restantes são mais altamente conservados. Note-se que cada das três proteínas Sdr tem pelo menos um motivo B de cada tipo.

Os domínios R do terminal C das proteínas Sdr contêm resíduos SD 132-170. Estes são seguidos por regiões de ancoragem à parede conservadas característica de muitas proteínas de superfície de bactérias Gram positivas.

Outras moléculas SdrD candidatas podem ser derivadas a partir de várias espécies de organismos para utilização numa composição imunogénica da invenção, algumas das quais incluem a seguinte SdrD de S. aureus: estirpe USA300 FPR3757 (número de acesso de proteína SAUSA300 0547); estirpe NCTC8325 (número de acesso de proteína SAOUHSC 00545); estirpe MW2 (número de acesso de proteína MW0517); estirpe MSSA476 (número de acesso de proteína SAS0520; e estirpe Mu50 (número de acesso de proteína SAV0562). MSCRAMMS adicionais que podem ser consideradas para utilização numa composição imunogénica da presente invenção incluem EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN e KnkA. Estas MSCRAMMS são descritas no documento WO 02/102829. MSCRAMMS adicionais, identificadas pelo n.° de acesso do GenBank, incluem NP_373261.1, NP_373371.1, NP_374246.1, NP_374248.1, NP_374841.1, NP_374866.1, NP_375140.1, NP_375614.1, NP_375615.1, NP_375707.1, NP_375765.1 e NP_375773.1.

Polissacáridos capsulares de tipo 5 e tipo 8

Microrganismos estafilocócicos capazes de causar doença invasiva também são, geralmente, capazes de produzir um polissacárido capsular (CP) que encapsula a bactéria e potência a sua resistência frente à eliminação pelo sistema imunitário inato do hospedeiro. 0 CP serve para ocultar a célula bacteriana numa cápsula protetora que torna as bactérias resistentes à fagocitose e à morte intracelular. Bactérias que carecem de uma cápsula são mais suscetíveis à fagocitose. Os polissacáridos capsulares são frequentemente um fator de virulência importante para muitos agentes patogénicos bacterianos, incluindo Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e estreptococos do Grupo B. 0 polissacárido capsular pode ser utilizado para estabelecer o serotipo de uma espécie particular de bactéria. A tipificação é normalmente alcançada por reação com um antissoro ou anticorpo monoclonal especifico gerado para uma estrutura específica ou característica epitópica única do polissacárido capsular. As bactérias encapsuladas tendem a crescer em colónias de aspeto liso enquanto colónias de bactérias que perderam a sua cápsula têm um aspeto irregular. As colónias que produzem um aspeto mucoide são conhecidas como Fortemente Encapsuladas. Os tipos 1 e 2 de S. aureus são fortemente encapsulados e raramente estão associados com doença. A maioria dos isolados clínicos de S. aureus são encapsulados com os serotipos 5 ou 8. Os polissacáridos capsulares de tipo 5 (CP5) e de tipo 8 (CP8) têm unidades de repetição de trissacárido compostas por ácido N-acetil manosaminurónico, N-acetil L-fucosamida e N-acetil D-fucosamina. Veja-se Fournier, J.M. et al., Infect. Immun. 45:97-93 (1984) e Moreau, M., et al., Carbohydrate Res. 201:285-297 (1990). Os dois CPs, que têm os mesmos açúcares, mas diferem quanto às ligações de açúcar e nos sítios de O-acetilação para produzir padrões sorologicamente distintos de imunorreatividade.

Em algumas formas de realização, os polissacáridos capsulares de serotipo 5 e/ou 8 da invenção são 0-acetilados. Em algumas formas de realização, o grau de 0- acetilação do polissacárido ou oligossacárido capsular de tipo 5 é 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %. 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % ou 80-90 %. Em algumas formas de realização, o grau de O-acetilação do polissacárido ou oligossacárido capsular de tipo 8 é 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %. 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % ou 80-90 %. Em algumas formas de realização, 0 grau de O-acetilação dos polissacáridos ou oligossacáridos capsulares de tipo 5 e tipo 8 é 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % ou 80-90 %. O grau de O-acetilação do polissacárido ou oligossacárido pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por RMN de protões (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 ou WO 00/56357). Outro método comummente utilizado é descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261.

Em algumas formas de realização, os polissacáridos capsulares de serotipo 5 e/ou 8 da invenção são utilizados para gerar anticorpos que são funcionais tal como medido pela morte de bactérias num modelo de eficácia animal ou num ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra que os anticorpos matam as bactérias. Tal funcionalidade pode não ser observada utilizando um ensaio que monitoriza apenas a geração de anticorpos, que não é indicativa da importância da O-acetilação na eficácia.

Epidemiologia capsular A associação de serotipos capsulares particulares com doença é possível através da monitorização dos isolados clínicos. Dos oito serotipos diferentes de S. aureus identificados (Karakawa e Vann (1982)) apenas os serotipos 1 e 2 são fortemente encapsulados, e estes são raramente encapsulados. Veja-se Capsular Polysaccharides of Staphylococcus aureus, p. 285-293, em J.B. Robbins, J.C. Hill e J.C. Sadoff (ed.), Seminars in infectious disease, vol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme Stratton, Inc. New York). Pesquisas mostraram que aproximadamente 85-90 % dos isolados clínicos de S. aureus expressam CP5 ou CP8 (Arbeit RD, et al., Diaqn. Microbiol. Infect. Dis. (1984) Abr;2 (2) :85-91; Karakawa WW, et al., J. Clin. Microbiol. (1985) Set;22 (3) : 445-7; Essawi T, et al., Trop. Med. Int. Health. (1998) Jul;3(7):576-83; Na'was T, et al., J. Clin. Microbiol. (1998) 36(2):414-20). A maioria das estirpes CP5 e CP8 não tipificáveis são geneticamente do tipo 5 ou tipo 8 contendo mutações no lócus cap5/8 (Cocchiaro, Gomez et al., (2006), Mol. Microbiol. Fev. 59(3):948-960). A capsulação para algumas estirpes é perdida rapidamente depois de algumas passagens in vitro, o que se deve a um efeito repressivo da concentração elevada de fosfato nos meios utilizados no diagnóstico clínico na produção da cápsula. Também foi relatado que os isolados não capsulados recuperam a expressão capsular depois da passagem por vacas. Veja-se Opdebeck, J.P. et al., J. Med. Microbiol. 19:275-278 (1985). Algumas estirpes não tipificáveis tornam-se positivas para a cápsula sob condições de crescimento apropriadas.

Estrutura de CP5 e CP8 A unidade de repetição de ambos CP5 e CP8 está composta por ácido 2-acetamido-2-desoxi-D-manurónico, 2-acetamido-2-desoxi-L-fucose e 2-acetamido-2-desoxi-D-fucose. Veja-se C. Jones et al., Carbohydr. Res. 340:1097-1106 (2005). Embora CP5 e CP8 tenham a mesma composição de açúcares, foram demonstrados como sendo imunologicamente diferentes. Diferem quanto às ligações glicosídicas e sítio de O-acetilação de ácido urónico. A N-acetilação incompleta dependente da estirpe de um dos resíduos de FucNAc foi observada. Veja-se Tzianabos et al., PNAS V98: 9365 (2001).

Polissacárido capsular de S. aureus numa composição imunogénica A massa molecular dos polissacáridos capsulares de S. aureus é uma consideração importante para utilização em composições imunogénicas. Polissacáridos capsulares de elevada massa molecular são capazes de induzir determinadas respostas imunitárias de anticorpos devido a uma valência mais elevada dos epitopos presentes na superfície antigénica. Os métodos descritos no presente documento proporcionam o isolamento e purificação de polissacáridos capsulares de tipo 5 e tipo 8 de massa molecular muito mais elevada do que estava anteriormente disponível. MntC/SitC/proteina de ligação a saliva

MntC/SitC/proteina de ligação a saliva é uma proteína de transportador ABC e tem homólogos em S. epidermidis e S. aureus. É referida na presente invenção como MntC. Esta proteína é uma lipoproteína de 32 kDa e está localizada na parede celular bacteriana. Veja-se Sellman et al. e Cockayne et al., Infect. Immun. 66: 3767(1998). No S. epidermidis, é um componente de um operão regulado por ferro. Mostra uma homologia considerável com ambas adesinas incluindo FimA de S. parasanguis, e com lipoproteínas de uma família de transportadores ABC com funções de transporte de ferro provadas ou putativas. (Veja-se o Quadro 12 para estirpes de S. aureus e sequências.)

Proteína MntC de S. aureus 0 homólogo de S. aureus de MntC é conhecido como proteína de ligação a saliva e foi divulgado no documento de Pat. U.S. N.° 5.801.234 e pode ser incluído numa composição imunogénica da invenção. A sequência proteica para o homólogo de S. aureus de MntC/SitC/Proteína de ligação a saliva é encontrada no número de acesso do GenBank número NP_371155 para a estirpe Mu50. (também conhecido como SAV0631). O identificador de sequência é SEQ ID NO: 119. O número de acesso para a sequência de nucleótidos para o genoma completo da estirpe Mu50 é NC_002758.2 (coordenadas 704988-705917).

Proteína SitC de S. epidermidis O homólogo de S. epidermidis de MntC/SitC/proteína de ligação a saliva é conhecido como SitC e foi divulgado em Sellman et al., (Sellman et al., Infect. Immun. outubro de 2005; 73(10): 6591-6600). A seguência proteica para o homólogo de S. epidermidis de MntC/SitC/Proteína de ligação a saliva é encontrada no número de acesso do GenBank número YP_187886.1. (também conhecido como SERP0290). O identificador de seguência é SEQ ID NO: 121. O número de acesso para a sequência de nucleótidos para o genoma completo da estirpe RP62A, é NC_002976 (coordenadas 293030-293959). Outras moléculas SitC candidatas podem ser derivadas a partir de várias espécies de organismos para utilização numa composição imunogénica da invenção, algumas das quais são listadas no Quadro 1 abaixo. _Quadro 1_

Proteínas de ligação a ferro de S. aureus

Outro antigénio candidato potencial a ser considerado para utilização nas composições imunogénicas da invenção inclui a proteína de superfície determinante B regulada por ferro (IsdB) de S. aureus. Esta MSCRAMM foi descrita por Mazmanian et al. (Mazmanian, SK et al. Proc. Natl. Acad. Sei., USA 99:2293-2298 (2002)) e foi subsequentemente testada e mostrada como sendo eficaz como um candidato vacinai num modelo murino de infeção e num estudo de imunogenicidade em macaco rhesus por Kuklin, et al. (Kuklin, NA, et al. Infection and Immunity, Vol. 74, N.° 4, 2215-2223, (2006)). Esta molécula IsdB está presente em várias estirpes de S. aureus, incluindo a estirpe MRSA252 (número de acesso de proteína CAG40104.1); estirpe Newman (número de acesso de proteína BAF67312.1); estirpe MSSA476 (número de acesso de proteína CAG42837.1); estirpe Mu3 (número de acesso de proteína BAF78003.1); estirpe RF122 (número de acesso de proteína CAI80681.1).

Antigénios candidatos:

As composições imunogénicas da presente invenção também podem incluir um ou mais dos seguintes antigénios: Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação a fibronectina (fnbA), proteína B de ligação a fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e as suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador Ni ABC, RAP, autolisina, recetores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB) , SBI, Npase, EBP, sialoproteína de ligação óssea II, precursor de aureolisina (AUR)/Seppl, Cna, e fragmentos dos mesmos como M55, TSST-1, mecA, exopolissacárido de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A,

Enterotoxina B, Enterotoxina Cl e nova autolisina. Em determinadas formas de realização da invenção, quando a composição imunogénica compreende determinadas formas de CP5 e/ou CP8, pode não compreender adicionalmente PNAG. Formulações de composição imunogénica

Numa forma de realização, as composições imunogénicas da invenção compreendem adicionalmente pelo menos um adjuvante, um tampão, um crioprotetor, um sal, um catião divalente, um detergente não iónico, um inibidor de oxidação de radicais livres, um diluente ou um veiculo.

As composições imunogénicas da invenção podem compreender adicionalmente um ou mais conservantes para além de uma pluralidade de antigénios de proteínas e conjugados de polissacárido capsular-proteína estafilocócicos. A FDA requer que os produtos biológicos em frascos de dose múltipla (multidose) contenham um conservante, com somente algumas exceções. Produtos de vacina contendo conservantes incluem vacinas contendo cloreto de benzetónio (antrax), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parentérico)), fenol (Pneumo, Tifoide (parentérico), Vaccinia) e timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, gripe, JE, Mening, Pneumo, Raiva). Conservantes aprovados para utilização em fármacos injetáveis incluem, por exemplo, clorobutanol, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, 2-fenoxietanol, cloreto de benzetónio, cloreto de benzalcónio, ácido benzoico, álcool benzílico, fenol, timerosal e nitrato de fenilmercúrio.

As formulações da invenção podem compreender adicionalmente um ou mais de um tampão, um sal, um catião divalente, um detergente não iónico, um crioprotetor como um açúcar, e um antioxidante como um captador de radicais livres ou agente quelante, ou qualquer combinação múltipla dos mesmos. A eleição de qualquer componente, por exemplo, um quelante, pode determinar se é desejável ou não outro componente (por exemplo, um captador). A composição final formulada para administração deve ser estéril e/ou isenta de agentes pirogénicos. 0 perito na especialidade pode determinar empiricamente que combinações destes e de outros componentes serão ótimas para inclusão nas composições imunogénicas contendo conservante da invenção dependendo de uma variedade de fatores tais como as condições de armazenamento e administração particulares requeridas.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compatível com administração parentérica compreende um ou mais tampões fisiologicamente aceitáveis selecionados a partir de, mas não limitados a, Tris (trimetamina) , fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina e succinato. Em determinadas formas de realização, a formulação é tamponada a um intervalo de pH desde cerca de 6,0 até cerca de 9,0, preferentemente desde cerca de 6,4 até cerca de 7,4.

Em determinadas formas de realização, pode ser desejável ajustar o pH da composição ou formulação imunogénica da invenção. O pH de uma formulação da invenção pode ser ajustado utilizando técnicas padrão na técnica. O pH da formulação pode ser ajustado para ser entre 3,0 e 8.0. Em determinadas formas de realização, o pH da formulação pode ser, ou pode ser ajustado para ser, entre 3,0 e 6,0, 4,0 e 6,0, ou 5,0 e 8,0. Noutras formas de realização, o pH da formulação pode ser, ou pode ser ajustado para ser, cerca de 3,0, cerca de 3,5, cerca de 4.0, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,8, cerca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7,0, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0. Em determinadas formas de realização, o pH pode estar, ou pode ser ajustado para estar, num intervalo desde 4,5 até 7,5, ou desde 4,5 até 6,5, desde 5,0 até 5,4, desde 5,4 até 5,5, desde 5,5 até 5,6, desde 5,6 até 5,7, desde 5,7 até 5,8, desde 5,8 até 5,9, desde 5,9 até 6,0, desde 6,0 até 6,1, desde 6,1 até 6,2, desde 6,2 até 6,3, desde 6,3 até 6,5, desde 6,5 até 7,0, desde 7,0 até 7,5 ou desde 7,5 até 8,0. Numa forma de realização especifica, o pH da formulação é cerca de 5,8.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compatível com administração parentérica compreende um ou mais catiões divalentes, incluindo, mas não limitados, a MgCl2, CaCl2 e MnCl2, a uma concentração variando desde cerca de 0,1 mM até cerca de 10 mM, sendo preferida até cerca de 5 mM.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compatível com administração parentérica compreende um ou mais sais, incluindo, mas não limitados a, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio e sulfato de potássio, presentes a uma força iónica que é fisiologicamente aceitável para o indivíduo após administração parentérica e incluídos a uma concentração final para produzir uma força iónica ou osmolaridade selecionadas na formulação final. A força iónica ou osmolaridade finais da formulação serão determinadas através de múltiplos componentes (por exemplo, iões a partir de composto (s) de tamponamento e outros sais não tamponantes. Um sal preferido, NaCl, está presente a partir de um intervalo de até 250 mM, com as concentrações de sal sendo selecionadas para complementar outros componentes (por exemplo, açúcares) de modo que a osmolaridade total final da formulação seja compatível com a administração parentérica (por exemplo, injeção intramuscular ou subcutânea) e promova a estabilidade a longo prazo dos componentes imunogénicos da formulação de composição imunogénica em vários intervalos de temperatura. As formulações isentas de sais irão tolerar intervalos aumentados do um ou mais crioprotetores selecionados para manter os níveis de osmolaridade final desejados.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compatível com administração parentérica compreende um ou mais crioprotetores selecionados a partir de mas não limitados a dissacáridos (por exemplo, lactose, maltose, sacarose ou trealose) e polihidroxi hidrocarbonetos (por exemplo, dulcitol, glicerol, manitol e sorbitol).

Em determinadas formas de realização, a osmolaridade da formulação está num intervalo de desde cerca de 200 mOs/1 até cerca de 800 mOs/1, com um intervalo preferido de desde cerca de 250 mOs/1 até cerca de 500 mOs/1, ou cerca de 300 mOs/1, cerca de 400 mOs/1. Uma formulação isenta de sais pode conter, por exemplo, desde cerca de 5 % até cerca de 25 % de sacarose, e preferivelmente desde cerca de 7 % até cerca de 15 %, ou cerca de 10 % até cerca de 12 % de sacarose. De forma alternativa, uma formulação isenta de sais pode conter, por exemplo, desde cerca de 3 % até cerca de 12 % de sorbitol, e preferivelmente desde cerca de 4 % até cerca de 7 %, ou cerca de 5 % até cerca de 6 % de sorbitol. Se for adicionado um sal tal como cloreto de sódio, então o intervalo eficaz da sacarose ou sorbitol é relativamente diminuído. Esta e outras considerações de osmolalidade e osmolaridade encontram-se bem dentro do âmbito da técnica.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compatível com administração parentérica compreende um ou mais inibidores da oxidação de radicais livres e/ou agentes quelantes. Uma variedade de captadores de radicais livres e quelantes são conhecidos na técnica e são aplicados a formulações e métodos de utilização descritos no presente documento. Exemplos incluem mas não estão limitados a etanol, EDTA, uma combinação de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sódio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA e DTPA e várias combinações de dois ou mais dos compostos acima. Em determinadas formas de realização, pode ser adicionado pelo menos um captador de radicais livres não redutor a uma concentração que potencie eficazmente a estabilidade a longo prazo da formulação. Podem também ser adicionados um ou mais inibidores de radicais livres/quelantes em várias combinações, tal como um captador e um catião divalente. A eleição do quelante irá determinar se é ou não necessária a adição de um captador.

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção que é compativel com administração parentérica compreende um ou mais tensioativos não iónicos, incluindo mas não limitado a ésteres de ácidos gordos de polioxietileno sorbitano, Polissorbato-80 (Tween 80), Polissorbato-60 (Tween 60), Polissorbato-40 (Tween 40) e Polissorbato-20 (Tween 20), éteres alquilicos de polioxietileno, incluindo mas não limitados a Brij 58, Brij 35, bem como outros como Triton X-100; Triton X-114, NP40, Span 85 e a série Pluronic de tensioativos não iónicos (por exemplo, Pluronic 121), sendo componentes preferidos Polissorbato-80 a uma concentração de desde cerca de 0,001 % até cerca de 2 % (sendo preferido até cerca de 0,25 %) ou Polissorbato-40 a uma concentração de desde cerca de 0,001 % até 1 % (sendo preferido até cerca de 0,5 %) .

Em determinadas formas de realização, uma formulação da invenção compreende um ou mais aqentes estabilizantes adicionais adequados para administração parentérica, por exemplo, um agente redutor compreendendo pelo menos um grupo tiol (-SH) (por exemplo, cisteina, N-acetil cisteina, glutationa reduzida, tioglicolato de sódio, tiossulfato, monotioglicerol ou misturas dos mesmos). Alternativa ou opcionalmente, as formulações de composição imunogénica contendo conservante da invenção podem ser adicionalmente estabilizadas através da remoção de oxigénio a partir dos recipientes de armazenamento, protegendo a formulação da luz (por exemplo, ao utilizar recipientes de vidro âmbar).

As formulações de composição imunogénica contendo conservante da invenção podem compreender um ou mais veiculos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, que incluem qualquer excipiente que não induza por si só uma resposta imunitária. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, macromoléculas tais como proteínas, sacáridos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarose (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19:2118), trealose, lactose e agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) . Tais veículos são bem conhecidos pelo perito na especialidade. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são discutidos, por exemplo, em Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, ISBN:0683306472.

As composições da invenção podem estar liofilizadas ou em forma aquosa, isto é, soluções ou suspensões. As formulações líquidas podem vantajosamente ser administradas diretamente a partir da sua forma embalada e são consequentemente ideais para injeção sem a necessidade de reconstituição em meio aquoso conforme necessário de outra forma para as composições liofilizadas da invenção. A administração direta de composições imunogénicas da presente invenção a um indivíduo pode ser alcançada através de administração parentérica (por via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intravenosa, ou no espaço intersticial de um tecido); ou por administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosa. Numa forma de realização preferida, a administração parentérica é através de injeção intramuscular, por exemplo, na coxa ou na parte superior do braço do indivíduo. A injeção pode ser através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica) , mas pode alternativamente ser utilizada injeção isenta de agulhas. Uma dose intramuscular típica é 0,5 ml. As composições da invenção podem ser preparadas em várias formas, por exemplo, para injeção como soluções líquidas ou suspensões. Em determinadas formas de realização, a composição pode ser preparada como um pó ou spray para administração pulmonar, por exemplo, num inalador. Noutras formas de realização, a composição pode ser preparada como um supositório ou pessário, ou para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como uma pulverização, gotas, gel ou pó.

Podem ser determinadas quantidades ótimas de componentes para uma composição imunogénica particular através de estudos padrão envolvendo observação de respostas imunitárias adequadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas. Embalagem e formas farmacêuticas

As composições imunogénicas da invenção podem ser embaladas em forma farmacêutica unitária ou forma farmacêutica múltipla (por exemplo 2 doses, 4 doses, ou mais) . Para as formas farmacêuticas múltiplas, são tipicamente, mas não necessariamente, preferidos frascos em vez de seringas pré-preenchidas. Formatos de dose múltipla adequados incluem, mas não estão limitados a: 2 a 10 doses por recipiente a 0,1 a 2 ml por dose. Em determinadas formas de realização, a dose é uma dose de 0,5 ml. Veja-se, por exemplo, o Pedido de Patente Internacional WO2007/127668.

As composições podem ser apresentadas em frascos ou outros recipientes de armazenamento adequados, ou podem ser apresentadas em dispositivos de administração pré-preenchidos, por exemplo, seringas de componente único ou múltiplo, que podem ser proporcionadas com ou sem agulhas. Uma seringa contém, tipicamente, mas não necessariamente, uma única dose da composição imunogénica contendo conservante da invenção, embora também sejam contempladas seringas de dose múltipla pré-preenchidas. Igualmente, um frasco pode incluir uma única dose mas pode alternativamente incluir doses múltiplas.

Podem ser rotineiramente estabelecidos volumes de dosagem eficazes, mas uma dose típica da composição para injeção tem um volume de 0,5 ml. Em determinadas formas de realização, a dose é formulada para administração a um indivíduo humano. Em determinadas formas de realização, a dose é formulada para administração a um indivíduo humano adulto, jovem adulto, adolescente, criança pequena ou bebé (isto é, não mais de um ano de idade) e pode, em formas de realização preferidas, ser administrada através de injeção.

As composições imunogénicas líquidas da invenção são também adequadas para reconstituir outras composições imunogénicas que são apresentadas sob a forma liofilizada. Quando uma composição imunogénica deve ser utilizada para tal reconstituição extemporânea, a invenção proporciona um kit com dois ou mais frascos, duas ou mais seringas já preenchidas, ou um ou mais de cada, com o conteúdo da seringa sendo utilizado para reconstituir o conteúdo do frasco antes da injeção, ou vice-versa.

De forma alternativa, as composições imunogénicas da presente invenção podem ser liofilizadas e reconstituídas, por exemplo, utilizando um de uma série de métodos para secagem por congelamento bem conhecidos na técnica para formar partículas secas, de forma regular (por exemplo, esféricas), tais como micropéletes ou microesferas, tendo características de partícula tais como tamanhos de diâmetro médios que podem ser selecionadas e controladas variando os métodos exatos utilizados para prepará-las. As composições imunogénicas podem compreender adicionalmente um adjuvante que pode opcionalmente ser preparado com ou contido em partículas secas, de forma regular (por exemplo, esféricas) separadas tais como micropéletes ou microesferas. Em determinadas formas de realização, a presente invenção proporciona adicionalmente um kit de composição imunogénica compreendendo um primeiro componente que inclui uma composição imunogénica seca e estabilizada, opcionalmente, compreendendo ainda um ou mais conservantes da invenção, e um segundo componente compreendendo uma solução aquosa estéril para reconstituição do primeiro componente. Em determinadas formas de realização, a solução aquosa compreende um ou mais conservantes, e pode opcionalmente compreender pelo menos um adjuvante (veja-se, por exemplo, documento W02009/109550).

Ainda noutra forma de realização, é selecionado um recipiente do formato de dose múltipla a partir de um ou mais do grupo que consiste, mas não limitados a, material de vidro de laboratório geral, balões, provetas, cilindros graduados, fermentadores, biorreatores, tubagens, tubos, sacos, potes, frascos, meios de encerramento de frascos (por exemplo, uma rolha de borracha, uma tampa de rosca), ampolas, seringas, seringas de câmara dupla ou múltipla, rolhas de seringas, êmbolos de seringas, tampas de borracha, tampas de plástico, tampas de vidro, cartuchos e canetas descartáveis e semelhantes. 0 recipiente da presente invenção não é limitado por material de fabrico, e inclui materiais como vidro, metais (por exemplo, aço, aço inoxidável, alumínio, etc.) e polímeros (por exemplo, termoplásticos, elastómeros, elastómeros termoplásticos) . Numa forma de realização particular, o recipiente do formato é um frasco de vidro Schott Tipo 1 de 5 ml com uma tampa de butilo. 0 perito na especialidade apreciará que o formato estabelecido acima não é de nenhuma forma uma lista exaustiva, mas serve meramente como orientação para o perito na especialidade relativamente à variedade de formatos disponíveis para a presente invenção. Formatos adicionais contemplados para utilização na presente invenção podem ser encontrados em catálogos publicados a partir de vendedores e fabricantes de equipamento laboratorial tais como a United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.

Avaliação de composições imunogénicas

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona composições que compreendem pelo menos três antigénios a partir de um organismo de S. aureus. Vários testes in vitro são utilizados para avaliar a imunogenicidade das composições imunogénicas da invenção. Por exemplo, um ensaio opsónico in vitro é levado a cabo incubando em conjunto uma mistura de células estafilocócicas, soro inativado termicamente contendo anticorpos específicos para os antigénios em guestão, e uma fonte complementar exógena. A opsonofagocitose procede durante a incubação de células polimorfonucleares (PMN) ou células efetoras diferenciadas como HL60 recém-isoladas e da mistura de anticorpo/complemento/célula estafilocócica. As células bacterianas que são revestidas com anticorpo e complemento são mortas após a opsonofagocitose. Unidades formadoras de colónias (ufc) de bactérias sobreviventes que são recuperadas da opsonofagocitose são determinadas colocando a mistura de ensaio em placas. Os títulos são relatados como o recíproco da diluição mais alta que dá 50 % de morte bacteriana, como determinado por comparação com controlos do ensaio.

Um ensaio de ELISA de células totais também pode ser utilizado para avaliar a imunogenicidade in vitro e exposição superficial do antigénio, em que a estirpe bacteriana de interesse (S. aureus) é revestida numa placa, como uma placa de 96 poços, e soro de teste a partir de um animal imunizado é submetido a reação com as células bacterianas. Se qualquer anticorpo, específico para o antigénio de teste, é reativo com um epítopo exposto na superfície do antigénio, ele pode ser detetado por métodos padrão conhecidos para um perito na especialidade.

Qualquer antigénio que demonstre a atividade in vitro desejada pode depois ser testado num modelo de desafio animal in vivo. Em determinadas formas de realização, as composições imunogénicas são utilizadas na imunização de um animal (por exemplo, um ratinho) por métodos e rotinas de imunização conhecidas para os peritos na especialidade (por exemplo, intranasal, parentérica, oral, retal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, etc.) . Depois da imunização do animal com uma composição imunogénica de Staphylococcus sp. particular, o animal é desafiado com um Staphylococcus sp. e testado quanto à resistência à infeção estafilocócica.

Numa forma de realização, ratinhos isentos de agentes patogénicos são imunizados e desafiados com S. aureus. Por exemplo, os ratinhos são imunizados com uma ou mais doses do antigénio desejado numa composição imunogénica. Subsequentemente, os ratinhos são desafiados com S. aureus e a sobrevivência é monitorizada ao longo do tempo depois do desafio. Métodos de imunização

Também são proporcionados métodos para imunizar um hospedeiro para prevenir a infeção estafilocócica. Numa forma de realização preferida, o hospedeiro é humano. Assim, um hospedeiro ou indivíduo é administrado com uma quantidade imunogénica de uma composição imunogénica descrita no presente documento. Uma quantidade imunogénica de uma composição imunogénica pode ser determinada realizando um estudo de dose-resposta no qual os indivíduos são imunizados com quantidades gradualmente crescentes da composição imunogénica e a resposta imunitária é analisada para determinar a dosagem ótima. Pontos de partida para o estudo podem ser deduzidos a partir de dados de imunização em modelos animais. A quantidade de dosagem pode variar dependendo de condições específicas do indivíduo. A quantidade pode ser determinada em ensaios de rotina através de meios conhecidos para os peritos na especialidade. Em algumas formas de realização, o método de imunização de um hospedeiro para prevenir a infeção, doença ou condição estafilocócica compreende tratamento humano, veterinário, animal ou agrícola. Outra forma de realização proporciona um método de imunização de um hospedeiro para prevenir a infeção, doença ou condição estafilocócica associada com um Staphylococcus sp. num indivíduo, o método compreendendo gerar uma preparação de anticorpo monoclonal ou policlonal a partir da composição imunogénica descrita no presente documento, e utilizar a dita preparação de anticorpo para conferir imunidade passiva ao individuo.

Uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogénica num número apropriado de doses é administrada ao individuo para desencadear uma resposta imunitária. 0 individuo tratado não deverá exibir as manifestações clinicas mais sérias da infeção estafilocócica. A quantidade de dosagem pode variar dependendo de condições especificas do individuo, como idade e peso. Esta quantidade pode ser determinada em ensaios de rotina através de meios conhecidos para os peritos na especialidade.

Numa forma de realização, os pacientes aos quais são administradas composições imunogénicas da invenção mostram uma redução das taxas de transporte de S. aureus. Tal redução no transporte ou um intervalo prolongado de tempo passado como não portador depois da administração de uma composição imunogénica é significativo desde uma perspetiva de necessidade médica. Por exemplo, a redução no transporte global de S. aureus nos portadores pode ser avaliada depois de uma dose de vacina multiantigénio de S. aureus. Por exemplo, 1 dia antes da administração de uma composição imunogénica, um grupo de adultos com idades de 18-50 anos pode ser rastreado quanto ao estado de portador por zaragatoas nasais e de garganta seguidas por cultivo para determinar o seu estado de portadores. A seguir, o grupo pode ser administrado com uma composição imunogénica da invenção com um grupo que recebe um controlo. Zaragatoas nasais e de garganta realizadas semanalmente ao longo de um período de 12 semanas, e mensalmente até 6 meses após a administração da composição imunogénica são realizadas e comparadas com placebo. Um objetivo primário consiste em comparar as taxas de estado de portador em pacientes depois da administração de uma composição imunogénica frente ao placebo em intervalos de 3 meses depois da imunização. Modelos animais de infeção estafilocócica Vários modelos animais são descritos abaixo para utilização na avaliação da eficácia de qualquer uma das composições imunogénicas descritas no presente documento. Modelo de sepse murina (passivo ou ativo)

Modelo de imunização passiva

Ratinhos são imunizados de forma passiva por via intraperitoneal (i.p.) com IgG imune ou anticorpo monoclonal. Os ratinhos são subsequentemente desafiados 24 horas mais tarde com uma dose letal de S. aureus. 0 desafio bacteriano é administrado por via intravenosa (i.v.) ou i.p. assegurando que qualquer sobrevivência podia ser atribuída à interação específica in vivo do anticorpo com a bactéria. A dose do desafio bacteriano é determinada como sendo a dose necessária para alcançar a sepse letal de aproximadamente 20 % dos ratinhos de controlo não imunizados. A avaliação estatística dos estudos de sobrevivência pode ser levada a cabo por análise de Kaplan-Meier.

Modelo de imunização ativa

Neste modelo, ratinhos (por exemplo, ratinhos Swiss Webster) são imunizados de forma ativa por via intraperitoneal (i.p.) ou subcutânea (s.c.) com um antigénio alvo às 0, 3 e 6 semanas (ou outro regime de vacinação apropriadamente espaçado semelhante) e subsequentemente desafiados com S. aureus à semana 8 pela via intravenosa. A dose de desafio bacteriano é calibrada para alcançar aproximadamente 20 % de sobrevivência no grupo de controlo ao longo de um período de 10-14 dias. A avaliação estatística dos estudos de sobrevivência pode ser levada a cabo por análise de Kaplan-Meier.

Modelo de endocardite infeciosa (passivo ou ativo)

Um modelo de imunização passiva para endocardite infeciosa (IE) causada por S. aureus foi previamente utilizado para mostrar que o ClfA pode induzir imunidade protetora. Veja-se Vernachio et ai., Antmicro. Agents & Chemo. 50:511-518 (2006). Neste modelo de IE, coelhos ou ratos são utilizados para estimular infeções clinicas que incluem um cateter venoso central, bacteremia e disseminação hematogénea para órgãos distais. Coelhos ou ratos cateterizados com vegetações da válvula aórtica estéreis são administrados com uma injeção intravenosa única ou múltipla de um anticorpo monoclonal ou policlonal especifico para o antigénio alvo. Subsequentemente, os animais são desafiados por via i.v. com uma estirpe de S. aureus ou S. epidermidis. Posteriormente, depois do desafio, coração, vegetações cardíacas e tecidos adicionais, incluindo rins e sangue são recolhidos e cultivados. A frequência da infeção estafilocócica no tecido cardíaco, rins e sangue é depois medida. Num estudo, quando os animais foram desafiados com MRSE ATCC 35984 ou MRSA 67-0, foram demonstradas diminuições significativas na taxa de infeção utilizando a preparação de anticorpo policlonal ou de anticorpo monoclonal para ClfA. Veja-se Vernachio et al., Antmicro. Agents & Chemo. 50:511-518 (2006) . O modelo de endocardite infeciosa também foi adaptado para estudos de imunização ativa em ambos coelhos e ratos. Coelhos ou ratos são imunizados por via intramuscular ou subcutânea com antigénio alvo e desafiados com S. aureus duas semanas depois através da via intravenosa.

Modelo de pielonefrite

No modelo de pielonefrite, ratinhos são imunizados nas semanas 0, 3 e 6 (ou outro regime de imunização apropriadamente espaçado) com os antigénios alvo. Subsequentemente, os animais são desafiados por via i.p. ou i.v. com S. aureus PFESA0266. Depois de 48 horas, os rins são recolhidos e as UFC bacterianas são enumeradas.

Anticorpos e composições de anticorpo A divulgação proporciona adicionalmente anticorpos e composições de anticorpos que se ligam especifica e seletivamente a um ou mais antigénios de uma composição imunogénica da presente divulgação. Em algumas formas de realização, os anticorpos são gerados após administração a um indivíduo de uma composição imunogénica da presente invenção. Em algumas formas de realização, a divulgação proporciona anticorpos purificados ou isolados direcionados contra um ou mais dos antigénios de uma composição imunogénica da presente invenção. Em algumas formas de realização, os anticorpos da presente divulgação são funcionais conforme medido pela morte de bactérias num modelo de eficácia animal ou através de um ensaio de morte opsonofagocítica. Em algumas formas de realização, os anticorpos da divulgação conferem imunidade passiva a um indivíduo. A presente divulgação proporciona adicionalmente moléculas de polinucleótido que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo da divulgação, e uma célula ou linha celular (como células de hibridoma ou outras linhas celulares manipuladas para produção recombinante de anticorpos) e um animal transgénico que produz um anticorpo ou composição de anticorpo da divulgação, usando técnicas bem conhecidas para os peritos na especialidade.

Anticorpos ou composições de anticorpos da divulgação podem ser utilizados num método de tratar ou prevenir uma infeção, doença ou condição estafilocócica associada com um Staphylococcus sp. num indivíduo, o método compreendendo gerar uma preparação de anticorpo monoclonal ou policlonal, e utilizar o dito anticorpo ou composição de anticorpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Os anticorpos da divulgação podem ser também úteis para métodos de diagnóstico, por exemplo, detetar a presença, ou quantificar os níveis, de um ou mais antigénios das composições imunogénicas da presente divulgação.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos demonstram algumas formas de realização da presente invenção. Contudo, deve ser entendido que estes exemplos são para ilustração apenas e não pretendem ser totalmente definitivos quanto às condições e âmbito da presente invenção. Será apreciado que quando condições de reação tipicas (isto é, temperatura, tempos de reação, etc.) sejam fornecidas, as condições tanto acima como abaixo dos intervalos especificados também podem ser utilizadas, embora, no geral, de forma menos conveniente. Todas as partes e percentagens referidas no presente documento estão numa base em peso e todas as temperaturas são expressas em graus centigrados a menos que especificado o contrário.

Adicionalmente, os seguintes exemplos foram levados a cabo utilizando técnicas padrão, que são bem conhecidas e são de rotina para os peritos na especialidade, exceto quando, de outra forma, descritas em detalhe. Conforme indicado acima, os exemplos seguintes são apresentados a titulo ilustrativo e não devem ser interpretados como, de forma alguma, limitando o âmbito desta invenção.

Exemplo 1: Produção de antigénios ClfA e ClfB 0 fator de aglutinação A (ClfA) e B (ClfB) são proteínas de superfície de S. aureus responsáveis pela ligação a proteínas hospedeiras incluindo fibrinogénio (ClfA, ClfB) e citoqueratina 10 (ClfB) . ClfA e ClfB são membros de uma familia de proteínas que contêm o motivo LPXTG no terminal carboxilo (SEQ ID NO: 125) que permite que a proteina se torne covalentemente ligada à superfície celular. Ambos o ClfA e ClfB pertence à familia de proteínas (Componentes da Superfície Microbiana que

Reconhecem Moléculas de Matriz Adesivas, ou MSCRAMMs) que reconhecem e se ligam a proteínas da matriz extracelular dos hospedeiros como fibrinogénio (ClfA e ClfB), fibronectina (FnbA e FnbB), colagénio (Cna) e outras. Estas proteínas partilham todas a sequência de sinal do terminal amino que medeia o transporte para a superfície celular. As MSCRAMMs também incluem um domínio A que é a região funcional que contém o sítio de ligação a ligando para fibrinogénio, fibronectina, elastina e queratina. 0 domínio A pode ser seguido por uma região composta por repetições de serina - aspartato (repetição SD) , que se acredita abranger a camada de peptidoglicano. A repetição SD é seguida por uma região que abrange a membrana que inclui o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para ligação covalente da proteína ao peptidoglicano.

As regiões de ligação a ligando de ClfA e ClfB que compreendem N1N2N3 do domínio A abrangem os aminoácidos 40-559. Os domínios N de ClfA / ClfB foram atribuídos como se segue: NI engloba os resíduos 45-220; N2 engloba os resíduos 229-369 e N3 engloba os resíduos 370-559. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). Nas preparações de N1N2N3 de ClfA recombinantes, verificou-se que o domínio NI era sensível à protease e é facilmente clivado ou hidrolisado para deixar ο N23 como um fragmento recombinante de ligação a ligando estável. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). De forma semelhante, foi demonstrado que o domínio NI de ClfB é também sensível à protease e poderia ser facilmente clivado pela metaloprotease de S. aureus (McAleese, F. M. et al. J. Biol. Chem. 2001,276, pp. 29969-29978). A estrutura cristalina do fragmento N23 de ligação a fibrinogénio do domínio A de ClfA, revelou que ambos N2 e N3 são dominados por cadeias beta antiparalelas. Além das cadeias beta antiparalelas, o domínio N2 contém uma hélice alfa de volta única e duas hélices 3io e o domínio N3 contém três hélices 3io. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002) . O alinhamento das sequências de N2 e N3 revela apenas 13 % de identidade de sequência e 36 % de semelhança de sequência ao longo dos seus comprimentos. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002). As topologias dos domínios N2 e N3 são semelhantes à dobra de IgG clássica e foram propostas como sendo variantes inovadoras da dobra de IgG. Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002).

Formas recombinantes de ClfA utilizadas nas composições imunogénicas descritas no presente documento são fragmentos de ClfA compreendendo um ou mais dos domínios N, por exemplo, N1N2N3, N2N3 e são referidos no presente documento como "ClfA recombinante" ou "rClfA". Além disso, qualquer rClfA deveria ser um que mantém a estrutura nativa dos domínios N individuais e epítopos críticos mas que não interfere com os processos normais do indivíduo imunizado depois da administração (ou seja, não se liga ao fibrinogénio). Estudos mutacionais mostraram que mutar Y338A (N2) eliminou por completo a ligação do fragmento N23 ao fibrinogénio. (Esta posição Y338A refere-se a uma alteração de uma tirosina para uma alanina na posição 338 na forma imatura da sequência polipeptídica com a sequência líder ainda anexa. Esta alteração pode ser observada na posição 310 na forma madura do polipéptido ClfA mutado de SEQ ID NO: 123 que demonstra uma carência de ligação a fibrinogénio). Veja-se Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002) . Como tal, a mutação Y338A foi adotada para todos os fragmentos de ClfA nos seguintes estudos.

De forma semelhante, formas recombinantes de ClfB utilizadas nas composições imunogénicas descritas no presente documento são fragmentos de ClfB compreendendo um ou mais dos domínios N, por exemplo, N1N2N3, N2N3 e são referidos no presente documento como "ClfB recombinante" ou "rClfB". Além disso, qualquer rClfB deveria ser um que mantém a estrutura nativa dos domínios N individuais e epítopos críticos mas que não interfere com os processos normais do indivíduo imunizado depois da administração (ou seja, não se liga ao fibrinogénio). (Veja-se, por exemplo, Walsh, E.J. et al. Microbiology (2008), 154, 550-558).

ClfA e ClfB: Visão geral da estratégia de clonagem

As diferentes formas de proteína rClfA utilizadas para gerar dados de eficácia pré-clínicos incluem HisClfA (Ni23) ; T7C1ÍA (ni23) ; T7ClfA(N123) ; Y338A; ClfA(N23) e ClfA (N23) Y338A. Veja-se a Figura 1. O gene de ClfA contém a sequência de codificação da região A de S. aureus PFESA0237 correspondente aos resíduos 40-559. A grelha de leitura clonada a partir de S. aureus foi fusionada à etiqueta His e sequências ligantes N-terminais do vetor (MRGSHHHHHHGS SEQ ID NO: 127) juntamente com três sequências de codificação adicionais (KLN) introduzidas no terminal C. (Veja-se abaixo para procedimento detalhado). Proteína expressa a partir deste vetor foi utilizada para todas as experiências onde é referida como HisClf A (Ni23) .

As diferentes formas de rClfA foram derivadas a partir da região A (resíduos 40-559 de ClfA expresso por S. aureus PFESA0237 (fila superior). A HisClfA (Ni23) é expressa utilizando o promotor T5 contido em pQE30 e todas as outras formas são expressas utilizando o sistema de expressão pET baseado em T7.

Duas formas de ClfB (T7C1ÍB N1N2N3 e ClfB N23) foram utilizadas para estudos animais pré-clínicos.

Procedimento de clonagem de ClfA A sequência de codificação de ClfA correspondente aos resíduos de aminoácidos 40-559 da estirpe PFESA0237 de S. aureus foi clonada e a mutação, Y338A, foi introduzida para eliminar a ligação a fibrinogénio. O gene de ClfA mutado foi introduzido num vetor de expressão de ARN polimerase T7, pET9a (Novagen) para proporcionar o plasmídeo, pLP1179. A sequência de ADN da região que compreende o promotor T7 e região de codificação em pLP1179 é a SEQ ID: 124. O vetor de expressão foi transformado em E. coli BLR(DE3) (Novagen) para a produção de ClfA recombinante. A construção de T7ClfA (Ni23) Y338A envolveu várias etapas. Um resumo das etapas de clonagem utilizadas para construir o plasmideo de expressão final, pLP1179 é mostrado na Figura 2. A sequência de ADN de clfA presente em pQEClf40 corresponde aos resíduos de aminoácidos 40-559 de ClfA que foi originalmente clonado no sítio de clonagem BamHI/HindIII de pQE30. Isto cria uma fusão de etiqueta His na extremidade N-terminal de ClfA e a adição de três resíduos no terminal C. A região de codificação de ClfA presente em (AmpR) pQEClf40 foi subclonada no vetor KanR pET 27b (Novagen) para criar pLP1137. Adicionalmente a sequência de ADN de clfA que corresponde aos resíduos de aminoácidos 221-559 foi clonada no sítio de clonagem N de I-HindIII de pET27b para criar pLP1134. A etiqueta His N-terminal de ClfA foi substituída com ο T7 N-terminal por subclonagem do fragmento de ADN BamHI-BlpI a partir de pQEClf40 em pET9a (Novagen) para criar pLP1153. A sequência de codificação de T7ClfA(Ni23) presente em pLP1153 contém 11 resíduos de aminoácidos N-terminais a partir da etiqueta T7 de pET9a seguida por três resíduos de aminoácidos a partir das sequências ligantes mais os três resíduos derivados de ligante C-terminal originalmente presentes em pQE30Clf40. A mutação Y338A foi primeiramente introduzida na sequência de codificação ClfA(N23) de pLP1134 para criar pLP1168. Posteriormente um fragmento de ADN PstI-SnaBI contendo a mutação Y338A a partir de ClfA(N23) de pLP1168 foi substituído em PstI-SnaBI da sequência de codificação de T7ClfA(Ni23) de pLPH53 para criar pLP1171. Um sítio de ligação a ribossoma interno presente na sequência de codificação de T7ClfA(Ni23)Y338A de pLP1171 foi alterado por mutações silenciosas nas posições de ADN 339 e 342 da ORF de T7 rClfA Y338A, alterando-se de G para T e G para A, respetivamente. O plasmideo resultante, pLP1176, foi depois utilizado para remover os três resíduos estranhos, originalmente derivados a partir de pQE30Clf40, entre a etiqueta T7 e o inicio da região de codificação de ClfA. Os três residuos C-terminais derivados de ligante também foram removidos neste momento. 0 rClfA expresso pelo plasmideo resultante, pLP1179 (Figuras 2 e 3), contém apenas os 11 aminoácidos N- terminais fusionados aos residuos 40-559 de ClfA(Ni23) Y338A. A sequência de ADN da região que compreende o promotor T7 e a sequência de codificação de T7 rClfA(Ni23)Y338A de pLP1179 é a SEQ ID NO 124.

Estirpes bacterianas e plasmideos

A cadeia principal do plasmideo pET9a (obtido a partir de Novagen) foi utilizado para a construção de pLP1179, que expressa T7ClfA(Ni23) Y338A a partir de um promotor T7. O plasmideo contém o gene de resistência à canamicina (KanR) para seleção positiva. A estirpe hospedeira de E. coli BL21 (DE3) [F-ompT hsdSB (rB“mB_) gal dcm (DE3) ] (Novagen) foi originalmente utilizada para obter a expressão de T7ClfA(Ni23)Y338A. A designação DE3 indica o lisogene lambda contendo o gene de ARN polimerase T7 sob controlo do promotor lacUV5 (induzivel por IPTG) que é utilizado para expressão induzida de ARN polimerase T7 e subsequente transcrição a partir do promotor T7 proximal à sequência de codificação de Cif Α(Νι23) Y338A presente em pLP 1179. Após receber a informação de que a estirpe hospedeira lisogénica BL21 (DE3) é capaz de induzir um fago litico após fermentações em grande escala, a estirpe hospedeira foi alterada para a estirpe hospedeira recA BLR(DE3) [F-ompT hsdSB (rB~mB~) gal dcm Δ (sri-recA) 306: : TnlO (TcR) (DE3) ] (Novagen).

Produção e purificação de ClfA

Para a produção de ClfA, E. coli BLR(DE3)/pLP1179 foi cultivada em meio definido em modo de processo descontinuo alimentado com glucose em biorreatores. Quando a cultura atingiu uma densidade ótica (ϋΟεοο entre 30-50, a expressão de ClfA foi induzida pela adição de IPTG. A cultura foi colhida entre 3-16 horas após a indução.

As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi recolhida. Depois da adição de sulfato de amónio, o material foi aplicado a uma coluna contendo resina Fenil-Sepharose e eluido. Frações contendo ClfA foram identificadas, submetidas a diálise e carregadas numa coluna de permuta aniónica (Q-Sepharose). Depois da eluição com um gradiente de sal, as frações contendo ClfA foram identificadas, concentradas por ultrafiltração e carregadas numa coluna de exclusão por tamanho (Superdex-75). Frações contendo ClfA foram identificadas e agrupadas. A pureza do ClfA neste ponto foi de cerca de 98 %, conforme medido por SDS-PAGE.

Clonagem e purificação de N1N2N3 de ClfB A sequência de codificação de ClfB correspondente aos residuos de aminoácidos 44-542 foi clonada num vetor de expressão de ARN polimerase T7, pET28a (Novagen) para proporcionar o plasmideo pPX1189. 0 vetor de expressão foi transformado em E. coli BLR(DE3) (Novagen) para a produção de ClfB recombinante. (Veja-se Walsh, et al., Microbiology 154: 550-558 (2008).)

Para a produção de ClfB, E. coli BLR(DE3)/pLP1179 foi cultivada em meio definido em modo de processo descontinuo alimentado com glucose em biorreatores. Quando a cultura atingiu uma densidade ótica (ϋΟεοο) entre 30-50, a expressão de ClfB foi induzida pela adição de IPTG. A cultura foi colhida entre 3-16 horas após a indução.

As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi recolhida. O pH da fração solúvel foi ajustado para cerca de pH 3,2 e as impurezas precipitadas foram removidas. O pH da fração solúvel contendo ClfB foi reajustado para cerca de pH 8,0 e foi submetida a diálise para remover os sais. Depois da adição de sulfato de amónio, o material foi aplicado a uma coluna contendo resina Fenil-Sepharose e eluído. Frações contendo ClfB foram identificadas, submetidas a diálise e carregadas numa coluna de permuta aniónica (Q-Sepharose). Depois da eluição com um gradiente de sal, as frações contendo ClfB foram identificadas, concentradas por ultrafiltração e carregadas numa coluna de exclusão por tamanho (Superdex-75). As frações contendo ClfB foram identificadas e agrupadas. A pureza do ClfB neste ponto foi de cerca de 94 %, conforme medido por SDS-PAGE.

Exemplo 2: Produções de antigénios: MntC de Staph aureus

Clonagem de MntC lipidada de S. aureus

MntC recombinante foi originalmente clonado a partir da estirpe Mu50 de S. aureus. A sequência de codificação de rMntC foi amplificada por PCR a partir do ADN genómico de Mu50 de S. aureus. Dois pares de iniciadores internos foram utilizados para a amplificação (Quadro 2). 0 primeiro par de iniciadores, 5'SA926-MntC a montante (ups) e 3'SA926-MntC a jusante (down), alinham-se com a sequência a montante a jusante da grelha de leitura aberta de rMntC. 0 segundo conjunto de iniciadores alinha-se com a sequência de codificação de rMntC permitindo amplificar a sequência que corresponde aos resíduos de aminoácidos 19-309. Os sítios das enzimas de restrição foram incorporados nas extremidades 5' destes iniciadores para facilitar a clonagem direcional. A PCR foi levada a cabo num Termociclador Peltier (MJ Research Inc., Walthan, MA) com TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase Premix (Takara Bio USA, Madison, WI). O produto de PCR foi purificado por QIAEX II (Qiagen, Valência, CA) , clivado com as endonucleases de restrição apropriadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) e subclonado no vetor de expressão pBADl8Cm acionado pelo promotor araBAD. Este vetor também contém o péptido de sinal da lipoproteína P4 de H. influenza. O produto de PCR MntC foi subclonado em grelha a jusante a partir do péptido de sinal P4 para criar pLP1194. A sequência de ADN da região de codificação de MntC de pLP1194 é mostrada na SEQ ID NO: 120. A MntC expressa a partir de pLP 1194 é uma lipoproteina. O ADN plasmidico recombinante foi sequenciado por ABI PRISM BigDye™ Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a proteína recombinante foi expressa em E. coli BLR (NOVAGEN) para a produção de rMntC lipidada. Produção e purificação de MntC lipidada

Para a produção de MntC lipidada, E. coli BLR/pLP1194 foi cultivada em meio definido em modo de processo descontínuo alimentado com glucose em biorreatores. Quando a cultura atingiu uma densidade ótica (ϋΟεοο) de cerca de 60, a expressão de rMntC foi induzida alterando a alimentação para uma mistura de glucose e arabinose. A cultura foi colhida cerca de 24 horas após a indução.

As células foram rompidas e a fração insolúvel clarificada foi recolhida. MntC lipidada foi encontrada associada com as membranas celulares devido à modificação dos lípidos. A MntC foi extraída a partir da fração de membrana com um detergente (Zwittergent ZW-312). Depois da remoção dos detritos insolúveis, a MntC lipidada foi encontrada na fração solúvel. A fração solúvel foi aplicada a uma coluna contendo uma resina de modo misto e eluida com um sal linear e gradiente de pH. Frações contendo MntC foram identificadas e agrupadas. Sulfato de amónio foi adicionado ao agrupamento e o material foi aplicado a uma coluna contendo Butil-Sepharose e eluído. Frações contendo MntC foram identificadas, dessalinizadas e carregadas numa coluna de permuta catiónica (SP-Sepharose). Depois da eluição com um gradiente de sal, frações contendo rMntC foram identificadas e agrupadas.

Clonagem de MntC não lipidada de S. aureus A sequência de ADN empregue para expressar a rMntC lipidada foi isolada por amplificação por PCR a partir do plasmídeo pLP1194. A sequência resultante corresponde aos resíduos de aminoácidos 19-309 e não contém a sequência de sinal que direciona a secreção e lipidação. A sequência de ADN da região de codificação de rMntC de pLP 1215 é encontrada na SEQ ID NO de ADN: 120.

Para criar pLP1215, MntC foi amplificada por PCR a partir de pLP1194. A sequência de ADN de MntC presente em pLP 1215 corresponde aos resíduos de aminoácidos 19-309 e o primeiro codão para esta construção foi introduzido no iniciador direto utilizado na amplificação do gene. Os iniciadores utilizados para PCR também continham sítios de enzimas de restrição nas extremidades 5' para facilitar a clonagem direcional (Quadro 2). A PCR e purificação do gene amplificado foram levadas a cabo como descrito anteriormente. O produto de PCR purificado foi clivado com as endonucleases de restrição apropriadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) e subclonado no vetor de expressão pET28a acionado pelo promotor T7 (Novagen, Madison, WI). O ADN plasmídico recombinante pLP1215 foi sequenciado por ABI PRISM BigDye™ Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a proteína recombinante foi expressa em E. coli BLR(DE3). ADN plasmídico para pLP1215 foi purificado e utilizado para transformar E. coli HMS174(DE3) para avaliar a expressão proteica.

Quadro 2: Iniciadores de MntC. _

Oligonucleótidos sintéticos utilizados para gerar construções de rMntC. Os sitios da endonuclease de restrição estão sublinhados. Os nucleótidos a negrito indicam o primeiro codão para a construção de rMntC não lipidada.

Produção e purificação de rMntC não lipidada

Para a produção de rMntC não lipidada, E. coli HMS174(DE3)/pLP1215 foi cultivada em meio definido em modo de processo descontinuo alimentado com glucose em biorreatores. Quando a cultura atingiu uma densidade ótica (ϋΟεοο) de cerca de 60 a 80, a expressão de rMntC foi induzida pela adição de IPTG. A cultura foi colhida cerca de 24 horas após a indução. As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi recolhida. O lisado foi aplicado a uma coluna contendo uma resina de permuta catiónica (SP-Sepharose) e eluida com um gradiente de sal linear. Frações contendo MntC foram identificadas. Depois da adição de sulfato de amónio, o material foi aplicado a uma coluna contendo resina Fenil-Sepharose e eluido. Depois da eluição, as frações contendo rMntC foram identificadas, agrupadas e dessalinizadas. A pureza de rMntC neste ponto foi de >95 %, conforme medido por SDS-PAGE.

Exemplo 3: Produção de polissacáridos capsulares CP5 e CP8 Neste exemplo, é descrita a produção de vários tamanhos de polissacáridos capsulares de tipo 5 e 8 de S. aureus. As estruturas dos polissacáridos CP5 e CP8 são mostradas na Figura 4. Os métodos descritos no presente documento são eficazes na produção de CP5 e CP8 com massas moleculares que variam desde cerca de 50 kDa a 800 kDa. Com base nas caracteristicas de crescimento e na quantidade de cápsula produzida, a estirpe PFESA0266 foi escolhida para a produção de CP5 enquanto as estirpes PFESA0005 ou PFESA0286 foram utilizadas para a produção de CP8. As cápsulas isoladas a partir das estirpes PFESA0005 e PFESA0286 foram mostradas como sendo idênticas.

Para a produção de polissacáridos capsulares, as estirpes foram cultivadas num meio complexo consistindo principalmente numa fonte de carbono (seja lactose ou sacarose), farinha de soja hidrolisada como a fonte de azoto e metais vestigiais. As estirpes foram cultivadas em biorreatores durante 2 a 5 dias. A purificação de CP5 e CP8 utilizada para a preparação de conjugados foi realizada por dois métodos diferentes que dependem de temperatura elevada e baixo pH para efetuar a libertação da cápsula da célula e reduzir a massa molecular do polissacárido. A massa molecular resultante é dependente do tempo, temperatura e pH da etapa de hidrólise. A caracterização de CP5 e CP8 foi realizada utilizando as técnicas especificadas no Quadro 3. Os polissacáridos capsulares produzidos por este procedimento resultam em polissacáridos puros com baixos niveis de proteína, e NA, peptidoglicanos e contaminantes de TA. Vejam-se os Quadros 4 e 5.

Quadro 3; Ensaios de caracterização para CP5 e CP8 purificados de S. aureus

No primeiro método, após a libertação da cápsula a partir da célula e da redução da massa molecular, a preparação de cápsula é tratada com um cocktail de enzimas (ribonuclease, desoxirribonuclease, lisozima e protease) para digerir as impurezas. Após a incubação, as impurezas residuais são precipitadas pela adição de etanol (concentração final de cerca de 25 %) . Depois da remoção do etanol residual, a solução contendo cápsula foi carregada numa coluna de permuta aniónica (Q-Sepharose) e eluida com um gradiente de sal linear. As frações contendo cápsula foram agrupadas e tratadas com meta-periodato de sódio. Este tratamento resultou na hidrólise oxidativa de contaminante de ácido teicoico residual, mas não afetou o CP5 ou CP8. A reação foi extinta pela adição de etilenoglicol. 0 material foi concentrado e diafiltrado contra díbO para remover quaisquer reagentes residuais e subprodutos. 0 segundo método utilizado para produzir cápsulas não envolveu a utilização de enzimas para digerir as várias impurezas derivadas das células. Neste método, após a libertação da cápsula a partir da célula e da redução da massa molecular, o caldo de fermentação hidrolisado foi clarificado por microfiltração seguida por ultrafiltração e diafiltração. A solução foi tratada com carbono ativado para remover as impurezas. Depois do tratamento com carbono, o material foi tratado com meta-periodato de sódio para oxidar o ácido teicoico residual seguido por extinção com propilenoglicol. 0 material foi concentrado e diafiltrado contra dH20 para remover quaisquer reagentes residuais e subprodutos.

As cápsulas produzidas utilizando qualquer dos métodos resultam em polissacáridos puros com baixos niveis de proteína, contaminantes como ácidos nucleicos e ácido teicoico. Os métodos descritos podem ser utilizados para produzir intervalos desejados dos polissacáridos de elevada massa molecular desejados simplesmente através da variação das condições de hidrólise. Um intervalo particularmente vantajoso de polissacáridos de elevada massa molecular, que varia entre 70 a 150 kDa, é útil no fabrico de composições imunogénicas através da conjugação do polissacárido com uma proteína transportadora.

Exemplos de polissacárido capsular de elevada massa molecular obteníveis pelos métodos descritos no presente documento são mostrados no Quadro 4 abaixo. Lotes de CP5 purificado de massa molecular mais elevada também tinham uma pureza elevada como indicado pela ausência de TA, peptidoglicano e baixa proteína residual. Veja-se o Quadro 4. O intervalo de massas moleculares nestes exemplos abrangeu 132,7 kDa a 800 kDa e os polissacáridos purificados foram altamente O-acetilados, variando desde 90-100 % e 100 % para N-acetilação. Veja-se o Quadro 4.

Exemplos de polissacárido capsular de massa molecular mais baixa obteníveis pelos métodos descritos no presente documento são mostrados no Quadro 5 abaixo. Lotes de CP8 purificado de massa molecular mais baixa tinham uma pureza elevada como indicado pela ausência de ácido teicoico (TA), peptidoglicano e baixa proteina residual. Veja-se o Quadro 5. 0 intervalo de massas moleculares mais baixas nestes exemplos abrangeu 20,4 kDa a 65,1 kDa e os polissacáridos purificados foram altamente O-acetilados, variando desde 75-96 %. Os niveis de contaminação com ácidos nucleicos foram baixos, variando desde 0,5 %-2,45 %. Veja-se o Quadro 5.

Quadro 4: Caracterização de preparações de CP5

Quadro 5: Caracterização de preparações de CP8

Seleção da massa molecular de polissacáridos capsulares

Esta análise cinética demonstra que um amplo intervalo de massas moleculares de polissacáridos capsulares pode ser gerada pelos métodos descritos no presente documento. Inicialmente, polissacáridos maiores foram produzidos pelas células bacterianas e, subsequentemente, um intervalo de massa molecular desejado pode ser selecionado e purificado por manipulação das condições de pH e de calor das etapas de aquecimento e hidrólise. 0 tratamento térmico do caldo de fermentação de S. aureus foi uma etapa de processo entre a fermentação e recuperação de CP. Esta etapa de processo utiliza calor para tratar o caldo de pH ajustado durante um periodo especifico. Os objetivos do tratamento térmico a um pH baixo consistiram em matar as células, inativar as enterotoxinas, libertar polissacárido ligado às células e reduzir a massa molecular até ao tamanho desejado. Entre estes objetivos, a redução da massa molecular foi o mais lento em termos de tempo de processamento necessário para esta etapa. Como tal, os outros objetivos foram inevitavelmente alcançados dentro do tempo de tratamento considerado.

Tratamento térmico

As condições de temperatura e pH para selecionar vários intervalos de massa molecular de polissacáridos capsulares foram determinadas. 0 pH do caldo foi ajustado com ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente, a temperatura do caldo foi aumentada para o valor definido. 0 tempo do tratamento térmico começou assim que a temperatura atingiu o ponto definido. Quando o tempo de tratamento desejado foi alcançado, o caldo foi arrefecido até à temperatura ambiente. Foram obtidas amostras durante o processo para determinar a concentração e massa molecular dos polissacáridos mediante sistemas de HPLC e SEC-MALLS, respetivamente. Os dados de MW foram utilizados na análise cinética. Os perfis de MW foram determinados ao longo do tempo de CP5 a pH 4,0, 4,5 e 5,0 e CP8 a pH 3,5, 4,0 e 5,0. Vejam-se as Figuras 5A e 5B. A cinética da hidrólise ácida suave de polissacáridos foi levada a cabo utilizando CP-5 e CP-8 purificados

obtidos a partir do processo. A solução de polissacárido purificado foi ajustada até ao pH desejado para a experiência com ácido sulfúrico. As amostras foram colocadas num banho de óleo equipado com um sistema de precisão de controlo da temperatura. Cada amostra foi removida num intervalo de tempo predeterminado e foi extinta num balde de gelo. No final da experiência, uma alíquota de tampão Tris 1 M (pH 7,5) foi adicionada à amostra para ajustar o pH de novo para cerca de 7. As amostras foram analisadas por um sistema de SEC-MALLS. Os dados de MW foram utilizados na análise cinética. 0 efeito da temperatura nos perfis de MW de CP5 a pH 4,5 e CP8 a pH 3,5 foi determinado ao longo do tempo. Vejam-se as Figuras 6A e 6B. Este procedimento de hidrólise ácida pode ser implementado utilizando a cultura fermentadora ou num estádio intermediário de purificação ou, como mostrado aqui, utilizando o polissacárido purificado. Outras etapas de redução da massa molecular, como sonicação ou cisalhamento, podem ser implementadas de forma semelhante. Resultados 0 efeito do pH na redução da MW no tratamento térmico é mostrado nas Figuras 5A e 5B para CP-5 e CP-8, respetivamente. Pode ser observado que um pH mais baixo foi mais eficaz na redução do tamanho do polissacárido. Os dados também sugerem que CP-5 foi mais difícil de hidrolisar do que CP-8 ao mesmo pH. Considerando os perfis de CP8, intervalos de massas moleculares entre 300 kDa e 600 kDa podem ser gerados utilizando um pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos. Igualmente, selecionar um pH de 4 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos pode produzir intervalos de massa molecular de polissacárido CP8 entre 250 kDa e 450 kDa. Além disso, selecionar um pH de 3,5 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos pode produzir intervalos de massa molecular de polissacárido CP8 entre 120 kDa e 450 kDa. 0 efeito da temperatura sobre a redução da MW foi levado a cabo utilizando os polissacáridos purificados recuperados a partir do processo de recuperação. Os resultados são mostrados nas Figuras 6A e 6B. Conforme mostrado, quanto mais elevada a temperatura, mais rápida a taxa de hidrólise e mais amplo o intervalo das massas moleculares de polissacárido produzido com o tempo. Utilização de uma temperatura mais baixa, 55 °C frente a 95 °C ao mesmo pH, produz um intervalo mais restrito de massas moleculares de polissacárido.

Adicionalmente, a Figura 7 demonstra a correlação entre a massa molecular de CP5 e CP8 purificadas com o tempo de tratamento para hidrólise ácida leve. 0 polissacárido purificado é o produto final obtido a partir do processo de recuperação anteriormente detalhado. Conforme mostrado na Figura 7, o aumento no tempo de tratamento térmico da estirpe PFESA0266 de S. aureus a pH 4,5 resulta na geração de polissacáridos CP5 de menor massa molecular, enquanto tempos de tratamento térmico mais curtos a pH 4,5 resultam na geração de polissacáridos CP5 de massa molecular mais elevada. 0 tamanho dos polissacáridos CP5 variou desde cerca de 90 kDa até cerca de 220 kDa dependendo da duração de tempo do tratamento térmico a um pH baixo (4,5). Igualmente, o aumento no tempo de tratamento térmico da estirpe PFESA0005 de S. aureus a pH 3,5 resulta na geração de polissacáridos CP8 de menor massa molecular, enquanto tempos de tratamento térmico mais curtos a pH 3,5 resultam na geração de polissacáridos CP8 de massa molecular mais elevada. O tamanho dos polissacáridos CP8 variou desde cerca de 80 kDa até cerca de 220 kDa dependendo da duração de tempo do tratamento térmico a um pH baixo (3,5). A correlação entre o tempo do tratamento térmico a um pH baixo e o tamanho dos polissacáridos CP5 e CP8 purificados, como mostrado neste estudo, permite uma estimativa do tempo de tratamento necessário para produzir polissacárido purificado com um intervalo especificado de massa molecular. É importante indicar que, como demonstrado acima, o intervalo completo de massas moleculares de polissacáridos capsulares para ambos CP5 e CP8 desde 20 kDa até mais do que 800 kDa pode ser produzido, libertado e purificado. Os métodos descritos podem ser utilizados para produzir intervalos específicos de polissacáridos capsulares de elevada massa molecular. Um intervalo particularmente vantajoso de polissacáridos capsulares de tipo 5 e tipo 8 de elevada massa molecular pode ser gerado a partir destes métodos tendo massas moleculares que variam desde 70 até 150 kDa. Veja-se o Quadro 6. Este intervalo de massas moleculares de polissacáridos capsulares é útil no fabrico de composições imunogénicas através da conjugação do polissacárido a uma proteina transportadora. De forma alternativa, esta gama vantajosa de intervalos de polissacáridos capsulares de elevada massa molecular varia desde 80 até 140 kDa de CP5 e CP8. Veja-se o Quadro 6. Outra gama vantajosa de intervalos de polissacáridos capsulares de elevada massa molecular CP5 e CP8 é desde 90 a 130 kDa, ou desde 90 até 120 kDa de CP5 e CP8. Veja-se o Quadro 6. As condições utilizadas para gerar o polissacárido capsular CP5 tendo um intervalo de massa molecular de desde cerca de 100 até 140 kDa são como se segue: 95 °C, pH 4,5 durante 135 minutos. As condições utilizadas para gerar o polissacárido capsular CP8 tendo um intervalo de massa molecular de desde cerca de 80 até 120 kDa são como se segue: 95 °C, pH 3,5 durante 300 minutos.

Quadro 6: Produção de intervalo especifico de CP5 e CP8 de elevada massa molecular

Exemplo 4: Conjugação de pollssacáridos capsulares CP5 e CP8 com CRM197

Este exemplo descreve processos e ensaios de

caracterização utilizados na produção de conjugados de CP5-CRM197 e CP8-CRM197 de S. aureus. Várias quimicas de conjugação foram avaliadas para conjugar polissacáridos capsulares CP5 e CP8 de S. aureus com uma proteína transportadora. A conjugação utilizando PDPH hidrazida de (3-2-piridilditio)-propiónico) resulta na ligação de tio éter covalente e CDI/CDT (1,1-carboildiimidazol/l,1-carboil-di-1,2,4-triazol) resulta num ligante de um carbono ou zero carbonos entre CP e a proteína transportadora. Conjugação de CP com CRM97 por química de conjugação de PDPH A química de conjugação de PDPH é um processo multietapa que envolve a ativação do polissacárido, remoção do grupo protetor de tiol, purificação do intermediário de polissacárido ativado, ativação e purificação da proteína CRM197 e conjugação dos componentes ativados seguido por purificação. Depois da introdução de um ligante que contém grupo tiol ao polissacárido e um grupo haloacetilo à proteína transportadora CRM197, os polissacáridos CP5 e CP8 de S. aureus foram ligados à proteína transportadora através de uma ligação tio éter. Os grupos bromoacetilo foram introduzidos na proteína CRM197 através da reação de grupos amino com o éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético. Para gerar CP tiolado, os grupos de carboxilato ativados com carbodiimida do ácido N- acetilmanosaminourónico em CP foram acoplados ao grupo hidrazida do ligante heterobifuncional de hidrazida reativa com sulfidrilo hidrazida de 3-(2-piridilditio)-propiónico (PDPH). Tióis do CP tiolado com PDPH, gerados por redução com DTT e purificados por SEC numa coluna Sephadex G25, reagiram com grupos bromoacetilo de proteína ativada resultando na ligação de tio éter covalente formada pelo deslocamento de bromo entre CP e a proteína. Grupos bromoacetilo não reagidos foram "capeados" com cloridrato de cisteamina (cloridrato de 2-aminoetanotiol). A mistura de reação foi depois concentrada e diafiltrada. Os grupos bromoacetilo não conjugados restantes foram capeados com cloridrato de cisteamina para assegurar que não eram deixados grupos bromoacetilo reativos depois da conjugação. Isto formou uma ligação covalente entre a extremidade tiol da cisteamina e do grupo acetilo no resíduo de lisina depois do deslocamento de bromo.

Tiolação de polissacárido capsular de S. aureus com PDPH 0 polissacárido foi, em primeiro lugar, ativado por tiolação com PDPH. 0 polissacárido foi misturado com uma solução-mãe recém-preparada de PDPH (250 mg/ml em DMSO), uma solução-mãe de EDAC (90 mg/ml em diH20) , e solução-mãe de tampão MES (0,5 M, pH 4,85) para produzir a solução final de MES a 0,1 M, e 2 e 4 mg de CP/ml mantendo, ao mesmo tempo, a razão de CP:PDPH:EDAC em peso em 1:5:3 para CP 5 e 1:0,6:1,25 para CP 8. Esta mistura foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente e depois submetida a diálise contra um volume de 1000X de H20 destilada utilizando um dispositivo de diálise 3500 MWCO a entre 4o e 8 °C para remover PDPH não reagida. O polissacárido ligado a PDPH foi feito a DTT a 0,2 M e incubado à temperatura ambiente durante 3 horas ou durante a noite a entre 4 e 8 °C. Excesso de DTT, bem como os subprodutos da reação, foram separados do sacárido ativado por SEC utilizando resina Sephadex G25 e água destilada como a fase móvel. As frações foram testadas por ensaio de DTDP quanto aos grupos tiol e as frações positivas a tiol que se eluiram perto do volume morto da coluna foram agrupadas. 0 agrupamento de frações foi testado pelos ensaios de PAHBAH e de O-acetilo para determinar o grau de ativação que é expresso como uma percentagem molar das unidades de repetição contendo um grupo tiol (concentração molar de tióis/concentração molar de unidades de repetição). 0 polissacárido ativado foi liofilizado e armazenado a -25 °C até necessário para conjugação.

Ativação da proteina transportadora

Separadamente, a proteina transportadora foi ativada por bromoacetilação. CRMi97 foi diluída com NaCl 0,9 % tamponado com fosfato a 10 mM, pH 7 (PBS) e depois com NaHCCb a 0,1 M, pH 7,0 utilizando uma solução-mãe de 1 M, até 5 mg/ml. O éster de N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético (BAANS) foi adicionado a uma razão de CRMi97:BAANS de 1:0,25 (p:p) utilizando uma solução-mãe de BAANS de 2 0 mg/ml de DMSO. Esta mistura de reação foi incubada a entre 4 e 8 °C durante 1 hora e depois purificada utilizando SEC em Sephadex G-25. A CRMi97 ativada e purificada foi testada através do ensaio de Lowry para determinar a concentração proteica e depois diluída com PBS até 5 mg/ml. Sacarose foi adicionada até 5 % p/vol como um crioprotetor e a proteína ativada foi congelada e armazenada a -25 °C até necessária para conjugação.

Reação de acoplamento

Uma vez preparado o polissacárido e a proteína transportadora ativada ativados, os dois foram combinados numa reação de conjugação. O polissacárido liofilizado e tiolado foi dissolvido em borato a 0,16 M pH 8,95, misturado com CRMi97 bromoacetilado descongelado e água destilada para formar a solução final de borato a 0,1 M, razão 1:1 p/p de CRMi97:CP e 1 mg/ml de polissacárido para CP8 e 2 mg/ml de polissacárido para CP5. Esta mistura foi incubada à temperatura ambiente durante entre 16 e 24 horas. Os grupos bromoacetilo não reagidos na proteína foram tampados por adição de cloridrato de cisteamina numa razão de CRM197:cisteamina de 1:2 (peso/peso) utilizando uma solução de estoque de 135 mg/ml de cisteamina dissolvida em borato a 0,1 M pH 8,95 e incubada durante 4 horas à temperatura ambiente. O conjugado de polissacárido-CRMi97 de cápsula (conjugado) foi purificado por meio de diafiltração 50 vezes contra NaCl a 0,9% utilizando um ultrafiltro de poli (éter sulfona) de 100K.

Os resultados da reprodutibilidade dos estudos de tiolação CP5 e CP8 com PDPH demonstraram que o grau de ativação do CP5 estava no intervalo de 11 a 19%, o que corresponde a aproximadamente uma molécula de ligante unida por dez unidades de repetição de CP a uma molécula de ligante por cinco unidades de repetição. A ativação de CP8 estava no intervalo de 12 a 16%, o que era muito semelhante à ativação de CP5. A bromoacetilação de resíduos de lisina de CRMi97 foi muito consistente, resultando na ativação de 19 a 25 lisinas das 39 lisinas disponíveis. A reação produziu altos rendimentos de proteína ativada.

Conjugação de CP a CRMj97 por química de conjugação de CDI/CDT CDI e CDT proporcionam um processo de conjugação de uma etapa em que o polissacárido é ativado num ambiente anidro (DMSO) para formar porções de carbamato de imidazol ou triazol com hidroxilos disponíveis e porções de acilimidazol ou aciltriazol com ácidos carboxílicos. A adição de um transportador de proteínas (em DMSO) conduz ao deslocamento nucleofílico do imidazol ou triazol pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilos ativados) e da ligação amida (para ácidos carboxilicos ativados). A solução de reação é diluida 10 vezes numa solução aquosa para remover os grupos de ativação não reagidos e depois purificada por meio de diafiltração.

Ambas as químicas de conjugação produziram CP ligada covalentemente à proteína transportadora, o que foi indicado pela presença do sacárido e da proteína nas frações da cromatografia de exclusão de tamanho e por análise de aminoácidos do conjugado tampado com cloridrato de cisteamina e glicolaldeído. O resumo dos resultados da preparação de vários lotes de conjugados preparados tanto para PDPH como para CDI/CDT para ambos os sorotipos capsulares com tamanho de polissacárido no intervalo de 20 a 40 kDa são apresentados no Quadro 7 abaixo. Não houve diferenças significativas no polissacárido de cápsula livre, razão de CP:Proteína e rendimentos de conjugados gerados por estes dois métodos de conjugação. A antigenicidade da CP conjugada não foi alterada por conjugação como retratado pela linha de precipitina de identidade entre conjugados e CP nativo.

Quadro 7: Caracterização de SA CP5-CRMi97 e CP8-CRM197 _preparados por duas químicas de conjugação_

Conforme é mostrado acima, os métodos aqui descritos podem ser usados para produzir intervalos específicos de polissacáridos de cápsulas de alta massa molecular desejados. 0 objetivo deste estudo foi preparar conjugados de uma gama pré-selecionada de massas moleculares elevados que poderiam ser filtrados e CP purificado para utilização em composições imunogénicas. Neste exemplo, oito lotes onde o polissacárido da cápsula CP5 variou em massa molecular de cerca de 90 kDa a cerca de 120 kDa e a conjugação foi realizada utilizando ativação com triazol (CDT). Veja-se o Quadro 8. As massas moleculares dos conjugados resultantes variou desde 1533 kDa a 2656 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM197 variou de um alto de 22 até um baixo de 15. O polissacárido de cápsula livre variou desde um alto de 18% até um baixo de 11%. Veja-se o Quadro 8.

Quadro 8 conjugados com intervalo de MW pré-selecionado de ____ÇP5 _

O Quadro 9 resume a análise de conjugados de CP8 em que o polissacárido de cápsula CP8 variou em massa molecular de cerca desde 87 kDa até 113 kDa e a química de conjugação de imidazol foi utilizada. As massas moleculares dos conjugados resultantes variou desde 595 kDa a 943 kDa. 0 número de lisinas conjugadas por CRMi97 variou de um alto de 9 até um baixo de 3. 0 polissacárido de cápsula livre variou desde um alto de 6% até um baixo de 2%. Veja-se o Quadro 9.

Quadro 9 conjugados com intervalo de MW pré-selecionado de CP8

Ambas as químicas de conjugação produzem CP ligada covalentemente à proteína transportadora. Não houve diferenças significativas no polissacárido de cápsula livre, razão de CP:Proteína e rendimentos de conjugados gerados por estes dois métodos.

Exemplo 5: Diversidade de sequência de fragmentos de polipéptido Nl, N2 e N3 de Cif A

Neste exemplo, a heterogeneidade da sequência de proteínas dos fragmentos de polipéptido ClfA Nl, N2 e N3 de isolados causadores de doenças obtidos de várias fontes foi avaliada. Genes ClfA foram sequenciados a partir de estirpes de S. aureus associadas a múltiplos estados patológicos. As informações de sequência de estirpes adicionais foram obtidas do GenBank para gerar sequências de estirpes relevantes. 0 Quadro 10 lista diferentes sequências de ClfA. O alinhamento de sequência de proteínas ClfA de diferentes estirpes causadoras de doença de S. aureus é mostrado na Figura 8A-8E. As sequências de proteína foram alinhadas utilizando MUSCLE. Veja-se Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram mostrados utilizando SHOWALIGN. Veja-se Rice, P. et al., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276-277 (2000). Muitas das sequências repetiram várias vezes sem variação. Para maior clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma vez. Veja-se a Figura 8A-8E. Apenas sequências únicas foram incluídas na listagem de sequências. Por exemplo, A sequência de proteína de ClfA_001 foi obtida a partir de múltiplas estirpes diferentes sem qualquer variação. Veja-se a Figura 8A-8E. O número da listagem de sequências para qualquer sequência também pode ser obtido no Quadro 10: Estirpes de ClfA e Listas de sequências. O Quadro 10 lista um exemplo de estirpe que continha essa mesma sequência de proteína ClfA_001. Esta sequência é mostrada na primeira linha do alinhamento na Figura 8A-8E. Este alinhamento de sequências únicas do antigénio ClfA indica que os polimorfismos foram distribuídos em toda a região A (N1-N2-N3) de ClfA. Nalguns casos, para qualquer dada sequência de proteína única de ClfA, mais de uma sequência de nucleótidos, que codifica a mesma proteína, foi descoberta. Apenas a sequência de ADN que ocorre mais frequentemente foi incluída na listagem de sequências e no Quadro 10. Para ClfA, as seguintes sequências são divulgadas no presente documento e não são encontradas no GenBank: ClfA_003, ClfA_005, ClfA_008, ClfA_009, ClfA_013, ClfA_014, ClfA_015, ClfA_016, ClfA_017, ClfA_018, ClfA_019, ClfA_020, ClfA_021, ClfA_022, ClfA_023 e CifA_024.

Quadro 10: Estirpes de CIfA e listagens de sequências

A filogenia das sequências da proteina ClfA foi examinada e uma árvore filogenética foi construida. As sequências foram alinhadas utilizando ClustalW. Veja-se Chenna R, Sugawara H, Koike T, et al. Nucleic Acids

Research. 31(13):3497-3500 (2003). As árvores de junção de vizinho foram tiradas (bootstrapped) 1000 vezes e foram exibidas com MEGA 4.0. Veja-se Tamura K, et al., Molecular Biology & Evolution. 24(8): 1596-1599 (2007). Os valores de bootstrap, indicado nas ramificações, são o número de vezes que a ramificação foi reproduzida em 1.000 ensaios. Os valores inferiores a 500 (50% de reprodutibilidade) são considerados que são mal suportados.

As sequências de Clfa formam uma árvore com 2 ramificações principais. Veja-se a Figura 9. A separação destes dois grupos é muito bem suportada na filogenia. Uma ramificação (superior) inclui 9 sequências que são razoavelmente relacionadas entre si (96-99% de identidade), porém relacionado de forma mais distante com a sequência candidata clfA_011, ao qual são 91-92% idênticos. O segundo grupo, que inclui clfA_011, é mais diversificado e a filogenia neste grupo não é tão bem suportada. Essas sequências de proteínas variam entre 93 e 99% idênticas entre si.

Exemplo 6: Diversidade de sequência de fragmentos de polipéptido Nl, N2 e N3 de ClfB

Neste exemplo, a heterogeneidade de sequência de proteína de fragmentos de polipéptido Nl, N2 e N3 de ClfB de 92 isolados causadores de doença obtidos de várias fontes foi avaliada. Genes ClfB foram sequenciados a partir de estirpes de S. aureus associadas a múltiplos estados patológicos. Veja-se o Quadro 11. As informações de estirpes adicionais foram obtidas do GenBank para gerar sequências adicionais. O alinhamento de sequência de proteínas ClfB de diferentes estirpes causadoras de doença de S. aureus é mostrado na Figura 10A-10E. As sequências de proteína foram alinhadas utilizando MUSCLE. Veja-se Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram mostrados utilizando SHOWALIGN. Veja-se Rice, P. et al., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276-277 (2000). Veja-se a Figura 10A-10E de alinhamento de ClfB. Tal como com ClfA, muitas das sequências repetiram várias vezes sem variação. Para maior clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma vez. Veja-se a Figura 10A-10E. Apenas sequências de ClfB únicas foram incluídas na listagem de sequências. Por exemplo, A sequência de Club_006 foi obtida a partir de múltiplas estirpes diferentes sem qualquer variação. Esta sequência é mostrada na primeira linha do alinhamento na Figura 10A-10E. O número da listagem de sequências para qualquer sequência também pode ser obtido no Quadro 11. Este alinhamento de sequências únicas representativas do antigénio ClfB indica que os polimorfismos foram distribuídos em toda a região A (N1-N2-N3) de ClfB. De modo semelhante a ClfA, para qualquer dada sequência de proteína única de ClfB, mais de uma sequência de nucleótidos que codifica a mesma proteína foi descoberta. Apenas a sequência de ADN que ocorre mais frequentemente foi incluída na listagem de sequências e no Quadro 11. Para ClfB, as seguintes sequências são divulgadas no presente documento e não são encontradas no GenBank: ClfB_001, ClfB_004, ClfB_005, ClfB_010, ClfB_011, ClfB_013, CifB_014, ClfB_015, ClfB_016, ClfB_017, ClfB_018, ClfB_019, ClfB_02 0, ClfB_021, ClfB_022, ClfB_023 e

ClfB_024. A árvore filogenética é mostrada na Figura 11.

Quadro 11: Estirpes de ClfB e listagens de sequências

Exemplo 7: Diversidade de sequência de MntC em clones causadores de doença de S. aureus

Neste exemplo, a heterogeneidade de sequência de proteína de MntC de 104 isolados causadores de doença obtidos de várias fontes foi avaliada. Genes MntC foram sequenciados a partir de estirpes de S. aureus associadas a múltiplos estados patológicos. Veja-se o Quadro 12. As informações de estirpes adicionais foram obtidas do GenBank para gerar sequências de estirpes. O alinhamento de sequência de proteínas MntC de diferentes estirpes causadoras de doença de S. aureus é mostrado na Figura 12A-12B. As sequências de proteína foram alinhadas utilizando MUSCLE. Veja-se Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram mostrados utilizando SHOWALIGN. Veja-se Rice, P. et ai., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276-277 (2000). Veja-se a Figura 12. Tal como com CifA, muitas das sequências repetiram várias vezes sem variação. Para maior clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma vez. Veja-se a Figura 12. Apenas sequências de MntC únicas foram incluídas na listagem de sequências. Por exemplo, A sequência de MntC_001 foi obtida a partir de estirpes diferentes sem qualquer variação. Veja-se a Figura 12. Esta sequência é mostrada na primeira linha do alinhamento na Figura 12. 0 número da listagem de sequências para qualquer sequência também pode ser obtido no Quadro 12. Apenas a sequência de ADN correspondente mais frequente foi incluída na listagem de sequências. Para MntC, as seguintes sequências são divulgadas no presente documento e não são encontradas no GenBank: MntC_002, MntC_006, MntC_007,

MntC_008 e MntC_009.

Quadro 12: Estirpes de MntC e listagens de sequências

Exemplo 8: Expressão de superfície de ClfA, CP5, CP8 e MntC In vivo durante a infeção S. aureus é responsável por causar uma variedade diversa de infeções humanas. Consequentemente, a bactéria deve se adaptar a diferentes nichos ambientais por expressão diferencial dos fatores de virulência necessários para a infeção. A expressão de antigénios alvo foi estudada em três ensaios de roedores in vivo para avaliar sua expressão durante a infeção: um modelo de ferida para medir a expressão do antigeno no local primário da infeção, Um modelo de bacteremia que monitoriza a expressão do antigénio no sangue e um modelo de câmara residente que monitoriza a expressão do antigénio durante condições limitadas de nutrientes/oxigénio. Para todos esses modelos, os roedores foram desafiados com bactérias no local de estudo. Após a infeção, as bactérias foram recolhidas em vários pontos de tempo e a expressão do antigénio (ClfA, CP5, CP8, MntC) foi avaliada utilizando microscopia imunofluorescente (ferida e bacteremia) ou citometria de fluxo (câmara). MATERIAIS E MÉTODOS Expressão em modelo de ferida

As experiências de infeção de feridas consistem em 5 animais/grupo e até 5 grupos para um máximo de 25 animais/experiência. Ratinhos machos C57BL/6 de seis a oito semanas (wk) de idade foram submetidos a cirurgia para incorporar um laço de sutura numa incisão muscular na coxa. Isso proporciona um substrato de corpo estranho para a ligação bacteriana e reduz significativamente a dose infeciosa minima necessária para produzir uma infeção por ferida estafilocócica. Cinco pL de S. aureus ou solução salina estéril foram introduzidos na incisão sob a sutura de tecido profundo de seda 4-0. A pele foi fechada com suturas de Prolene 4-0 ou adesivo cirúrgico (por exemplo, cianoacrilato) . Os animais foram sacrificados em pontos de tempo entre 30 minutos e 10 dias após a infeção e o músculo da coxa excisado, homogeneizado e as bactérias enumeradas. As bactérias à vista da infeção foram analisadas quanto à expressão do antigénio por microscopia confocal imunofluorescente (IF).

Expressão em modelo de bacteremia

Os grupos de 10 ratinhos CD-I ou Balb/C de quatro semanas de idade foram imunizados com 1 pg de proteina ou conjugado de CP por injeção subcutânea em nas semanas 0, 3 e 6. Os animais foram sangrados nas semanas 0 e 8 seguidos por um desafio intraperitoneal com S. aureus cultivado até a fase logarítmica tardia na TSB. Três horas após o desafio, os animais foram sacrificados e o sangue recolhido para microscopia confocal IF.

Expressão no Modelo de Tubagem de Diálise de Habitação

Os isolados de S. aureus foram cultivados durante a noite em placas de TSA a 37 °C. As bactérias foram raspadas a partir das placas e ressuspensas em PBS estéril e a ΟΌβοο ajustada para 1, aproximadamente 109 unidades formadoras de colónias (ufc) /ml. As bactérias foram diluídas para uma concentração de 103 ufc/ml e inoculadas em tubos de diálise. Uma alíquota da suspensão foi semeada em placa para determinar o número real de ufc. A tubulação de diálise com MWCO de 3,5 kDa foi preparada para o implante por esterilização em etanol a 70% durante 30 minutos seguido de enxaguamento extenso em água estéril e depois solução salina estéril. Uma alíquota de 2 ml da suspensão bacteriana foi transferida para o tubo de diálise, O saco foi fechado com um nó, e depois enxaguou-se extensivamente com solução salina estéril. Os ratos Sprague Dawley machos (6 semanas de idade) foram anestesiados e uma incisão de 2-3 cm feita ao longo da linha média dorsal. Foram criados bolsos no local da incisão separando suavemente a pele do tecido subjacente. O tubo foi implantado nos bolsos e a pele foi fechada usando grampos cirúrgicos. Após 24 h, os ratos foram sacrificados, o tubo removido e as bactérias recuperadas para análise de citometria de fluxo.

Microscopia imunofluorescente (IF) 0 sangue de 5 ratinhos foi agrupado em citrato de sódio gelado, pH 7,0 (concentração final, 0,4%). As células eucarióticas foram lisadas com NP-40 a 1% (Pierce Biotechnology). As bactérias foram lavadas com PBS e incubadas durante a noite a 4 °C com soro imune ou pré-imune de coelho (1: 100) e detetadas com anticorpo conjugado de cabra-a-coelho ALEXA488 (1:250, Invitrogen). As bactérias marcadas foram secas numa lâmina de microscópio e uma lamela foi montada com meio Vectashield HardSet (Vector Laboratories, Inc.). As imagens foram obtidas com um microscópio confocal espetral Leica TCS SL (Leica Microsystems).

Análise de citometria de fluxo

Os isolados de S. aureus cresceram como descrito no procedimento do modelo de tubulação de diálise em ratos. Aproximadamente 107 células bacterianas foram bloqueadas em tampão de coloração (solução de sal equilibrada de Hank com 10% de soro de cabra) durante 1 hora em gelo. As células bacterianas foram centrifugadas durante 5 minutos a 10.000 rpm, o sobrenadante foi removido e as células incubadas com anticorpo de ratinho ou anticorpo de controlo de isotipo durante 30 minutos em gelo. As células foram então lavadas e coradas com IgG anti-ratinho de cabra conjugada com FITC (Jackson ImmunoResearch) em gelo durante 30 minutos. As bactérias foram lavadas com tampão de coloração, fixadas com 2% de paraformaldeido e os dados adquiridos e analisados utilizando o citómetro de fluxo FACS Caliber e o software Cell quest (Becton, Dickinson e Co.). Um total de 30.000 eventos foram coletados para cada amostra.

Quadro 13a; Perfis de expressão de antigénios em isolados _do tipo 5 de CP de S. aureus.

Quadro 13c. Expressão de antigénios de S. aureus na tubagem de diálise de habitação. Frequência de células positivas (% _do total)_

Resultados

Uma combinação de dezanove isolados de S. aureus foi testada quanto à expressão de ClfA, CP5, CP8 ou MntC na superfície celular de S. aureus durante a infeção (Quadro 13a, 13b e 13c) . Esses isolados incluíram recentes linhagens clinicamente relevantes e eram diversos conforme monitorizado pelo MLST. A expressão de antigénio foi dependente da estirpe, ponto de tempo e modelo de infeção. A variação na expressão do antigénio entre isolados em diferentes ambientes in vivo (circulação sanguínea versus ferida) suporta a utilização de uma composição imunogénica de vários antigénios para induzir ampla cobertura de isolados estafilococos em várias infeções diferentes. Os antigénios foram expressos em superfície dentro das primeiras 24 horas da infeção e, portanto, são componentes válidos para uma composição imunogénica anti-estafilococos. Os antigénios de proteínas ClfA e MntC foram acessíveis para coloração na presença de expressão de cápsula indicando que a presença de cápsula não mascara as proteínas de anticorpos direcionados contra elas. A maioria dos isolados de tipo 8 testados não expressou CP no sangue até pontos de tempo tardios pós-desafio (> 4 horas) (veja-se o Quadro 13a-c). Estes resultados demonstram que em CP de S. aureus é regulado diferencialmente dependendo do microambiente in vivo, isto é, local de infeção. Esses resultados podem explicar os resultados de eficácia inconsistentes relatados para conjugados CP8 em modelos animais.

Os resultados de expressão in vivo sugerem que nenhuma formulação imunogénica de antigénio único proporcionará ampla cobertura contra a maioria das infeções por S. aureus. Existe uma grande diversidade de fenótipos de expressão por estirpes individuais dentro de microambientes in vivo. Como tal, uma composição imunogénica que consiste em mais de um antigénio é necessária para prevenir a doença de S. aureus.

Exemplo 9: Imunogenicidade de formulações muiti-antigénio contendo os conjugados ClfA, CP5- e CP8-CRM197

Neste exemplo, avaliou-se a imunogenicidade de combinações de ClfA, CP5-CRM197 e CP8-CRM197. A. Formulação de composição imunogénica de bi-antigénio (CP5-CRM197/CP8-CRM197) - efeito da dose nas respostas de anticorpos anti-capsulares em coelho

Neste exemplo, o efeito de dose sobre a imunogenicidade da formulação imunogénica combinada de CP5-CRM197 e CP8-CRM197 em coelhos foi avaliado. Os coelhos foram imunizados na semana 0, 3 e 6 com conjugado bivalente mais 125 pg de A1P04 administrado por injeção subcutânea. As doses avaliadas neste estudo foram 0,1 pg, 1 pg ou 10 pg cada um de CP5-CRMig7 e CP8-CRM197 (doses combinadas finais CP-CRM197 de 0,2 pg, 2 pg e 20 pg) . A dose do conjugado reflete o componente total de polissacárido do conjugado de proteína e polissacárido. Os coelhos foram sangrados na semana 0, 3, 6 e 8. ELISA foi realizada em soros agrupados e individuais. Os títulos de anticorpos de ponto final foram determinados como a diluição reciproca a 0,1 de OD405. A análise estatística foi realizada em titulos de 8 semanas individuais. Os resultados demonstraram que os maiores titulos de anticorpos específicos CP5 e CP8 de 5 X 105 para CP5 e 1 X 106 para CP8 foram induzidos por vacinação de coelhos com formulação imunogénica bivalente a 1 pg de dose de CP de cada componente (Dados não mostrados). B. Formulação de tri-antigénio (CP5-CRM197 + CP8-CRM197 + rClfA) -estudo de intervalo de dose de ClfA com dose fixa (1 pg) de cada conjugado em coelhos O efeito de uma combinação de conjugados rClfA e CP5 e CP8 na resposta imune a cada componente foi testado. Três grupos foram imunizados com CP5-CRMig7 + CP8-CRM197 de S. aureus bivalente (dose de 1 pg de cada conjugado) combinado com T7-C1ÍA (N1N2N3) em três doses diferentes 1, 10 e 100 pg. O grupo de controlo foi imunizado com CP5 não conjugado e CP8 (50 pg cada) combinado com 100 pg de T7-ClfA (N1N2N3). Cada composição imunogénica foi formulada com 500 pg de adjuvante AIPO4. As composições imunogénicas foram administradas por injeção subcutânea no pescoço. Os coelhos foram sangrados na semana 0, 6 e 8. O ELISA foi realizado em soros agrupados e individuais e os titulos de anticorpos de ponto final foram determinados como a diluição reciproca a 0,1 OD405 .

Os resultados mostraram que o aumento da quantidade de rClfA quando combinado com o conjugado bivalente não afetou as respostas de anticorpos capsulares. Os niveis de anticorpos para ambos os sorotipos capsulares estavam na mesma faixa que em coelhos imunizados apenas com o conjugado bivalente (dados não mostrados). Os niveis de anticorpos para CP5 e CP8 foram 2,5 vezes mais baixos a 10 (103 K) e 100 pg (106 K) de dose em comparação com 1 pg de dose de rClfA (273 K) . Houve um efeito de reforço após a segunda e terceira injeção. A formulação imunogénica de polissacárido bivalente não conjugado (CP5 + CP8, 50 pg cada) combinada com 100 pg de rClfA não induziu anticorpos específicos do CP. A resposta de anticorpos específicos do rClfA também não foi muito afetada pela dose, onde os títulos estavam entre 1 X 105 e 1 X 106 após três doses para doses de 1, 10 e 100 pg (Dados não mostrados) . Também os níveis de resposta anti-ClfA alcançados quando administrados com polissacáridos CP5 e CP8 conjugados ou não conjugados foram semelhantes.

Exemplo 10: Formulação de tri-antigénio -Imunogenicidade em coelhos com alta pré-imunização de títulos de anticorpo CP5, CP8 e CifA. A composição imunogénica estafilocócica é direcionada para populações adultas que possuem anticorpos pré-existentes para componentes de superfície de S. aureus.

Para estudar o efeito de anticorpos pré-existentes para componentes de formulação imunogénica na resposta à formulação imunogénica, selecionamos coelhos com títulos elevados de títulos de anticorpos anti-CP5, anti-CP8 e anti-ClfA naturalmente adquiridos. Dois grupos de coelhos (n = 6/7) foram imunizados na semana 0, 3 e 6 com formulação imunogénica de tri-antigénio (CP5-CRMi97 (1 pg) e CP8-CRM197 d pg) e T7-C1ÍA (N1N2N3) Y338A (10pg)). Um grupo foi imunizado com a composição imunogénica formulada com 500 pg de AIPO4 como adjuvante e o segundo grupo foi imunizado com uma formulação de composição imunogénica contendo nenhum adjuvante. As composições imunogénicas foram administradas por injeção subcutânea. Os coelhos foram sangrados na semana 0, 3, 6 e 8. Os títulos de anticorpo para CP5, CP8 e rClfA foram determinados por ELISA como títulos de anticorpos de ponto final em soros agrupados e individuais (determinado como a diluição recíproca a 0,1 OD405) .

Os resultados mostraram que os coelhos com títulos de anticorpos pré-existentes induzidos por infeção natural responderam à formulação imunogénica trivalente com aumento dos níveis de anticorpos para todos os componentes de formulação imunogénica CP5, CP8 e rClfA. Um aumento dos níveis de anticorpo para cada antigénio entre 5 vezes e 10 vezes foi mostrado mesmo em animais com títulos de anticorpos de lxlO6. A presença do adjuvante na formulação imunogénica resultou em títulos de anticorpos mais elevados em comparação com o grupo imunizado sem adjuvante (Dados não apresentados).

Exemplo 11: Efeito do adjuvante nas respostas aos componentes de polissacáridos da cápsula A. Efeito de Duas Doses Diferentes de A1P04 em Resposta a Composição Imunogénica de CP5-CRMi97/CP8-CRMx97 bivalente em Coelhos O efeito de dose do adjuvante A1P04 nas respostas anti CP5 e CP8 em coelhos foi estudado. Os coelhos foram imunizados na semana 0, 3 e 6 com S. aureus CP5-CRM197 + CP8-CRM197 bivalente (1 pg de dose de cada conjugado) . Um grupo (n = 5/grupo) foi imunizado com uma composição imunogénica formulada com 125 pg e um 2o grupo com 500 pg de A1P04 como adjuvante. As composições imunogénicas foram administradas por injeção subcutânea no pescoço. Os coelhos foram sangrados na semana 0, 6 e 8 e anticorpos anti- capsulares foram determinados por meio de ELISA como títulos de anticorpos de ponto final determinados como a diluição recíproca a 0,1 OD405. Os resultados indicaram que não houve diferença nas respostas de anticorpos específicos de CP8 em coelhos imunizados com 125 pg ou 500 pg de A1P04. A formulação com 125 pg de adjuvante deu respostas de anticorpos CP5 mais elevadas. Também, todos os coelhos no grupo de 125 pg responderam com respostas de anticorpos CP5 mais elevadas, enquanto que no grupo adjuvante de 500 pg, havia dois coelhos com pouca resposta à formulação. B. Efeito de A1P04 sobre a imunogenicidade da formulação de tri-antigénio

Coelhos (NZW, n=6/7 coelhos por grupo) foram imunizados na semana 0, 3 e 6 com formulação de tri- antigénio compreendida de CP5-CRMi97 (1 pg) e CP8-CRM197 (1 pg) e T7-ClfA (N1N2N3) Y338A (10 pg) . Um grupo de coelhos foi imunizado com formulação imunogénica com 500 pg de AIPO4, um segundo grupo foi formulado sem adjuvante, o terceiro grupo foi imunizado na semana 0 com formulação imunogénica com 500 pg de A1P04 e nas semanas 3 e 6 com formulação imunogénica sem adjuvante. As formulações imunogénicas foram administradas por injeção subcutânea, os coelhos foram sangrados na semana 0, 3, 6 e 8 e os soros foram avaliados por ELISA especifico de antigénio. Os resultados mostraram que a presença de adjuvante na formulação imunogénica não teve efeito sobre as respostas anti-CP5 ou anti-CP8 em coelhos (dados não mostrados). Os titulos GMT de Abs para ambas as cápsulas foram comparáveis. No entanto, houve um efeito adjuvante sobre a resposta especifica de anticorpo de ClfA mostrada em grupos imunizados com adjuvante presente nas três vacinas. O segundo e terceiro impulsos com formulação imunogénica que não contém AlP04nos coelhos preparados com o adjuvante que contém a formulação imunogénica proporcionaram respostas de ClfA mais altas em comparação com o grupo sem adjuvante. Exemplos 12-29: Avaliação pré-clinica de S. aureus ClfA, MntC, CP5-CRM197 e CP8-CRM197: São descritos abaixo nos exemplos 12 a 29 os resultados da avaliação pré-clinica dos conjugados CP5 e CP8, ClfA e MntC. Os exemplos demonstram a eficácia desses antigénios em modelos de animais pré-clinicos. Os exemplos também demonstram que os anticorpos gerados pelos conjugados CP, ClfA e MntC têm atividade funcional em ensaios in vitro.

Duas quimicas diferentes foram utilizadas para conjugar CP a CRMi97, mas nenhuma diferença foi observada na eficácia dos conjugados preparados pelos diferentes métodos. Mostrou-se que a O-acetilação dos polissacáridos capsulares impacta a produção de anticorpos funcionais. Avaliação de uma composição imunogénica combinada que compreende CP5-CRMi97, CP8-CRM197 e ClfA não mostrou interferência nos niveis de anticorpo especifico (Ab) a cada componente da formulação imunogénica.

Materiais e Métodos ELISA

Placas de microtitulação de ELISA Maxisorp (Nalge Nunc International, Rochester, NY) foram revestidas 18 horas a 4 °C ou durante 90 min a 37 °C com 1 pg/ml de antigénio ClfA em PBS pH 7,5. As placas foram lavadas cinco vezes em PBST (IX PBS, polissorbato 20 a 0,1%) e bloqueadas leite magro a 1% (p/v) em PBS, com polissorbato 20 a 0,05% durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST e diluidas em série (3 vezes) e antissoros de coelho da semana 3, 6 e 8 individuais foram adicionados às placas e incubados ou durante a noite a 4°C ou durante 2 h a 37°C. As placas foram lavadas e os anticorpos primários ligados foram detetados com IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (diluição 1: 1000) em PBST. As placas foram incubadas durante 1 h a 37 °C, depois lavadas e desenvolvidas com solução de substrato ABTS-peroxidase, (KPL, Inc., Gaithersburg, MD), à temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. A reação foi parada pela adição de uma solução de SDS a 1% (v/v). A absorvância foi medida a 405 nm num leitor de placas automatizado (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA). Os títulos de anticorpos foram expressos como o recíproco da maior diluição no soro com um valor de absorvância de 0,1. O teste t de Student utilizando o software JMP (SAS Institute, Cary, NC) foi utilizado para determinar diferenças em títulos de anticorpos entre os diferentes grupos. Uma probabilidade de menos de 0,05 foi considerada como indicando uma diferença estatisticamente significante. Modelo murino de sepse 0 modelo murino de sepse imita a doença surgida no sangue. Para imunização passiva, Grupos de 15 ratinhos

Swiss-Webster foram tratados intraperitonealmente (i.p.) com IgG. Vinte e quatro horas depois, os ratinhos foram desafiados com S. aureus 659-018 através de uma única injeção intravenosa (i.v.) (0,1 ml) através da veia da cauda. Todos os animais foram seguidos durante 14 a 15 dias, em cujo ponto todos os ratinhos restantes foram sacrificados.

Para imunização ativa, os ratinhos foram imunizados com antigénio em 0, 2 e 4 semanas e desafiados na semana 6 por via intravenosa com S. aureus.

Modelo de endocardite de coelho por imunização ativa

Coelhos adultos New Zealand White foram imunizados por via intramuscular 4 vezes com 25 pg de antigénio. Um dia após a cirurgia, os animais são desafiados i.v. com um bolus de S. aureus e o número de unidades formadoras de colónias (ufc) no tecido cardíaco são determinadas 24 horas após o desafio.

Bacteremia murina

Um modelo de bacteremia de 3 horas foi utilizado para determinar o efeito da vacinação sobre o número de bactérias no início da infeção. Os ratinhos foram imunizados na semana 0, 3 e 6 com antigénio seguido de desafio i.p. com S. aureus na semana 8. Os animais foram exsanguinados 3 horas mais tarde e diluições em série de sangue foram plaqueadas para enumerar a bactéria.

Modelo murino de pielonefrite O modelo murino de pielonefrite imita a disseminação de S. aureus por bacteremia. Grupos de 10 camundongos CD-I femininos de quatro semanas de idade foram imunizados a 0, 3 e 6 semanas com antigénio. Os ratinhos foram desafiados por injeção i.p. de S. aureus. Quarenta e oito horas após o desafio, os ratinhos foram sacrificados e as bactérias foram enumeradas no rim e no sangue.

Modelo de rato de endocardite 0 modelo de rato de endocardite imita a endocardite humana em que a colonização ocorre após uma infeção transmitida pelo sangue leva à colonização de tecido cardiaco danificado. Cinco ratos Sprague-Dawley machos de 5 semanas de idade (Charles River, Kingston, NY) foram imunizados nas semanas 0, 2 e 4 com 1 pg de conjugado de CP5-CRM197 formulado com 100 pg de AIPO4. Os animais foram sangrados antes da vacinação na semana 0 e no final da semana 5. Setenta e duas horas mais tarde, um cateter (tubo PE-10) foi colocado cirurgicamente através da artéria carótida no ventriculo esquerdo do coração. A colocação do cateter resulta na formação de uma vegetação estéril para a qual os estaf ilococos podem unir após a infeção. Para prevenir a infeção resultante do procedimento cirúrgico, os animais foram tratados com o antibiótico Baytril (5 mg/kg) no momento da cirurgia e 8 horas após a cirurgia. Quarenta e oito horas após a cirurgia, os ratos foram desafiados com PFESA0266 (aproximadamente 4 x 108 ufc) ou SA315 (aproximadamente 1 x 109 ufc) por meio de injeção intraperitoneal. Quarenta e oito horas após o desafio, os ratos foram sacrificados e os corações e rins removidos e colocados em 3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) . Os órgãos foram então homogeneizados com um homogeneizador de tecido (Kinematica AG, Luzernerstrasse, Alemanha) e trazidos a 10 ml com PBS. Os homogenatos foram então diluídos em série e plaqueados para enumeração bacteriana.

Monitorização de anticorpos funcionais utilizando ensaios de morte opsonofagocítica Células efetoras diferenciadas de uma linha celular (por exemplo, HL60s) ou células polimorfonucleares (PMNs) isoladas de sangue humano doador utilizando solução LYMPHOLYTE®-poly (Cedarlane laboratories limited, Ontário, Canadá) de acordo com o protocolo do fabricante podem ser utilizadas para este ensaio. As células efetoras foram ressuspensas em tampão de ensaio (meio de Eagle modificado contendo 1% de albumina de soro bovino) a uma concentração de aproximadamente 2 X 107 células/ml e colocadas em incubadora a 31° C até estar pronto para a utilização. A estirpe de S. aureus PFESA0266 cresceu durante a noite em placas de agar de soja tripticas. As células bacterianas foram raspadas, lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de ensaio contendo 5% de glicerol a uma ΟΌθοο = 1, que é igual a uma concentração de aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Aliquotas de um ml de suspensão bacteriana foram congeladas e armazenadas a -40 °C até serem prontas para utilizar. A suspensão bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concentração de 106 ufc/ml em tampão de ensaio e colocada sobre gelo. O ensaio foi realizado utilizando uma placa de polipropileno estéril de 96 poços profundos de 1 ml. Foram preparadas diluições em série de duas vezes de amostras de anticorpos (50 μΐ) e seguidas pela adição de 300 μΐ de tampão de ensaio à mistura de anticorpos. As bactérias foram adicionadas (50 μΐ) às placas e colocadas num agitador rotativo a 4 °C durante 30 minutos. A etapa de opsonização foi seguida pela adição de 50 μΐ de complemento humano (1% de concentração final). Finalmente, adicionaram-se 50 μΐ de células efetoras (concentração de 107 células/ml) à placa e a suspensão foi misturada por pipetagem repetida. Uma alíquota de 50 μΐ da suspensão foi diluída em série 10 vezes em solução esterilizada de 1% de saponina, submetida a vórtice para minimizar o aglomerado bacteriano e revestida em agar tríptico de soja em duplicado. A placa de ensaio foi incubada a 37 °C durante 1 hora com mistura contínua utilizando agitador de estilo rotisserie. No final da incubação, uma alíquota de suspensão de 50 μΐ foi diluída em série 10 vezes em solução esterilizada de 1% de saponina, misturada por meio de vórtice para minimizar o aglomerado bacteriano e revestida em agar tríptico de soja em duplicado. A percentagem de morte foi calculada determinando a proporção do número de ufc sobrevivendo aos 60 minutos em poços com bactérias, anticorpos, complemento e células efetoras para o número de ufc sobrevivendo em tubos sem anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células efetoras. Controlos contendo bactérias, complemento e os soros foram incluídos para se ajustarem a qualquer redução na UFC devido à aglomeração.

Adsorção de complemento

Soro de doadores humanos adsorvidos contra estirpes de S. aureus PFESA0266, PFESA0286 e PFESA0270 pode ser usado como fonte de complemento no ensaio. As estirpes de S. aureus foram cultivados durante a noite em placas de TSA a 37 °C. As células foram raspadas a partir das placas e ressuspensas em PBS estéril. As células bacterianas foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C e o sedimento celular foi ressuspenso em soro humano para adsorção. O soro foi incubado com bactérias num nutator a 4 C durante 30 minutos. As células foram centrifugadas, o soro foi transferido para outro tubo contendo bactérias e a etapa de adsorção repetida novamente durante 30 minutos. Finalmente, as células foram centrifugadas e o soro passou através de um filtro de 0,2 mícron antes de 0,5 ml de alíquotas terem sido congeladas em azoto líquido. Método II -OPA utilizando células HL-60 Células HL-60 foram diferenciadas de acordo com S. Romero-Steiner, et al., Clin Diagn Lab Immunol 4 (4) (1997), pp. 415-422. As células HL-60 recolhidas foram ressuspensas em tampão de ensaio (meio de Eagle modificado contendo 1% de albumina de soro bovino) a uma de aproximadamente 108 células/ml e colocadas em incubadora a 37°C até estar pronto para a utilização. S. aureus cresceu durante a noite em placas de agar de soja trípticas. As células bacterianas foram raspadas, lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de ensaio contendo 5% de glicerol a uma Οϋδοο = 1, que é igual a aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Aliquotas de um ml de suspensão bacteriana foram congeladas e armazenadas a -40 °C até serem prontas para utilizar. A suspensão bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concentração de 106 ufc/ml em tampão de ensaio e colocada sobre gelo. O ensaio foi realizado utilizando uma placa de polipropileno estéril de 96 poços profundos de 1 ml. Foram preparadas diluições em série de duas vezes de amostras de anticorpos monoclonais (25 μΐ) e seguidas pela adição de 150 μΐ de tampão de ensaio à suspensão de anticorpos. As bactérias foram adicionadas (25 μΐ) às placas e colocadas num agitador rotativo a 4 °C durante 30 minutos, seguido da adição de 25 μΐ de complemento humano (1% de concentração final). Finalmente, adicionaram-se 25 μΐ de células HL-60(107 células/ml) à placa e a suspensão foi misturada por pipetagem repetida. Uma aliquota de 25 μΐ da suspensão foi diluida em série 10 vezes em solução esterilizada de 1% de saponina, misturada por meio de vórtice para minimizar o aglomerado bacteriano e revestida em agar triptico de soja em duplicado. A placa de ensaio foi incubada a 37 °C durante 1 hora com mistura continua utilizando agitador de estilo rotisserie. No final da incubação, uma aliquota de suspensão de 25 μΐ foi diluida em série 10 vezes em solução esterilizada de 1% de saponina, misturada por meio de vórtice e revestida em agar triptico de soja em duplicado. A percentagem de morte foi calculada determinando a proporção do número de ufc sobrevivendo aos 60 minutos em poços com bactérias, anticorpos, complemento e células HL-60 para o número de ufc sobrevivendo em tubos sem anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células HL-60. Controlos contendo bactérias, complemento e mAb foram incluídos para se ajustarem a qualquer redução na UFC devido à aglomeração. Exemplo 12: Demonstração de um efeito protetor por ClfA em modelos animais in vivo

Para avaliar se os anticorpos policlonais de coelhos induzidos contra ClfA foram capazes de reduzir a contagem de colónias de S. aureus em um modelo de sepse de murino, IgG policlonal anti-ClfA de coelho purificado foi utilizada em duas doses (0,8 mg e 1,6 mg) num estudo de imunização passiva (Figura 13). A estirpe de desafio de S. aureus foi um isolado clinico recente, 659-018. Ambas as dosagens de anticorpos resultaram numa redução significativa da contagem de colónias bacterianas no modelo de sepse de murino (p = 0,0134 para a dose de 1,8 mg e p = 0,0013 para a dose de 0,8 mg) . Esta experiência foi repetida com isolados adicionais de S. aureus com resultados semelhantes (dados não mostrados).

Exemplo 13: Imunização ativa com ClfA Redução da colonização do coração por S. Aureus A imunização ativa de coelhos com ClfA resultou em proteção no modelo de endocardite de coelho. Encontramos uma redução de 3-4 log em ufc S. aureus recuperado de vegetações cardíacas para animais imunizados com ClfA em comparação com animais imunizados de controlo negativo (PBS ou AIPO4) (Figura 14).

Exemplo 14: Efeito protetor do MntC em modelos animais in vivo A imunização ativa com o MntC mostrou proteção consistente de camundongos em pontos de tempo precoce após o desafio de S. aureus. Contagem bacteriana no sangue de ratinhos que recebem i.p. 0 desafio de S. aureus foi significativamente reduzido em comparação com os controlos imunizados com PBS (Figuras 15A e 15B) . Quatro dos seis estudos individuais mostraram uma redução significativa no sangue de ufc/ml em animais imunizados. A proteção mediada pela imunização de MntC foi demonstrada utilizando 2 estirpes de desafio de S. aureus diferentes, PFESA0237 (Figura 15A) e PFESA0266 (Figura 15B) .

Exemplo 15: Proteção de conjugados de CP5 em modelo murino de plelonefrite

Os conjugados de CP5 foram avaliados quanto à sua capacidade de proteger ratinhos num modelo de pielonefrite de imunização ativa. A Figura 16 mostra os resultados de diversos estudos. Contagem bacteriana no sangue de ratinhos que recebem i.p. 0 desafio de S. aureus foi significativamente reduzido em comparação com os controlos imunizados com PBS (Figura 16). seis de seis estudos individuais mostraram uma redução significativa nos rins de ufc/ml em animais imunizados. Os dados mostraram redução consistente da colonização renal após imunização ativa com conjugado CP5.

Exemplo 16: Conjugados de CP5 preparados por meio de diferentes químicas de conjugação protegem os ratinhos contra infeções experimentais

Estudos de imunização ativa no modelo de pielonefrite murina foram realizados utilizando o conjugado de CP5 preparado pela química PDPH ou CDT. Os métodos para conjugar CP5 ou CP8 a CRM197 foram descritos acima. Os resultados mostraram que ambos os conjugados reduzem significativamente a colonização em ratinhos em comparação com os animais simulados imunizados (Quadro 14).

Quadro 14: Efeito de conjugação de CDT versus PDPH em _modelo de pielonefrite_

Exemplo 17: Proteção de conjugado de CP5 em modelo de rato de endocardite

Quatro estudos foram conduzidos com o conjugado de PDPH CP5-CRM197 e um conjugado não relacionado (PP5-CRMi97) a uma dose de 1 pg. Os conjugados de CP5 reduziram significativamente a colonização no coração e nos rins em 2 das 3 experiências, em que a estirpe de desafio 5 foi PFESA0266 (Quadro 15). No terceiro estudo, 0 titulo anti-CP5 do titulo médio geométrico (GMT) foi o mais baixo das três experiências, mas foi apenas um pouco menor do que o titulo na experiência anterior (51.000 vs. 67.000).

Quadro 15: Imunização de CP5-CRMi97 reduz as ufc em modelo de rato de endocardite

Exemplo 18: Conjugados de CP5-CRM197 num modelo de pielonefrite

Os estudos iniciais que investigaram a eficácia dos conjugados foram realizados com CP5 de 25 kDa MW. As melhorias no processo de fermentação resultaram na produção do polissacarídeo de alta MW, que foi conjugado com o portador de proteína e testado lado a lado com o conjugado CP5 de 25 kDa. Conjugados compreendendo CP com MW de 25 kDa (baixa MW) e 300 kDa (alta MW) foram preparados utilizando a química de conjugação de CDT e avaliados no modelo de pielonefrite murina. Três doses (0,01, 0,1 e 1 pg) dos conjugados HMW foram testadas e comparadas com o controlo LMW CP5-CRM197 e um conjugado não relacionado (PP5-CRMi97) a 1 pg de dose. Os resultados mostraram uma redução significativa na UFC de S. aureus PFESA0266 recuperada dos rins com uma dose de 1 pg. Não houve diferença estatística entre a proteção contra conjugados preparados com tamanho diferente CP5 na dose de 1 pg (Quadro 16).

As doses mais baixas (0,01 pg e 0,1 pg) do conjugado não conseguiram provocar uma resposta imune suficiente para reduzir significativamente a infeção. A experiência foi repetida utilizando um procedimento de imunização e desafio idêntico. Na experiência repetida, apenas a dose de 1 pg de LMW CP5-CRM197 resultou numa redução significativa na colonização (p = 0,01). A dose de 1 pg de HMW CP5-CRMi97 reduziu a ufc nos rins, contudo a redução não foi estatisticamente significativa (p = 0,056).

Quadro 16. Proteção de conjugados de CP5 num modelo de ratinho de pielonefrite.

Exemplo 19: A O-acetilação de polissacárido é importante para a indução da resposta de anticorpos protetores à formulação imunogénica do conjugado CP5

Para avaliar a importância da O-acetilação do CP5, o CP5 nativo foi de-O-acetilado (dOAc) e conjugado com CRM197 (dOAc-CRMigv) utilizando a química da conjugação de PDPH. A eficácia do conjugado dOAcCP-CRMi97 foi comparada lado a lado com CP5-CRM197 num modelo de pielonef rite murina. Os resultados mostraram que o conjugado que não possui grupos O-acetilo (dOAc CP5-CRMi97) não é eficaz neste modelo, como demonstrado por nenhuma alteração significativa na colonização bacteriana nos rins. Estes dados (Quadro 17) indicam que a O-acetilação foi importante para a elicitação de anticorpos funcionais contra CP5.

Quadro 17: A imunização com o CP5-CRM197 de-O-acetilado não proteae os ratinhos da colonização do rim

Exemplo 20: A imunização com CP8-Conjugado reduz a morte num modelo de sepse A eficácia do conjugado CP8-CRM197 foi avaliada no modelo de sepse murina após o desafio com S. aureus PFESA0268 (Tipo 8) . Os ratinhos Swiss Webster (n = 30) foram imunizados ativamente por injeção subcutânea com 1 pg de CP8-CRM197 e solução salina ambos formulados com 100 pg de AIPO4. 0 estudo mostrou uma redução significativa da sepse (p=0,0308) em comparação com ratinhos imunizados com AIPO4 sozinho. Veja-se a Figura 17.

Exemplo 21: Avaliação do Conjugado Nativo e Tratado com Base CP8 no Modelo de Bacteremia Murina

A importância dos grupos O-acetilo presentes no CP8 nativo antes da conjugação para indução de respostas de anticorpos funcionais foi avaliada para o conjugado CP8. O polissacárido CP8 foi de-O-acetilado sob condições básicas suaves e tanto a RMN quanto a Cromatografia iónica (IC) confirmaram a ausência de O-acetilação no CP8 de-O-Ac - CRM197. 0 modelo de bacteremia murina foi utilizado para avaliar a eficácia do CP8 nativo versus tratado com base para CRM197. Os grupos de ratinhos BALB/c fêmeas (15/grupo) foram imunizados nas semanas 0, 3 e 6, com 1 pg de CP8 de-O-Ac - CRM197 ou 1 pg de CP8 O-Ac - CRM197. Formulações imunogénicas foram formuladas com 22 pg de AIPO4. Os animais foram desafiados com S. aureus PFESA0003. Três horas após o desafio, os ratinhos foram sacrificados e as bactérias foram enumeradas no sangue. Os dados mostraram que houve uma redução estatisticamente significativa (p = 0,0362) na UFC bacteriana recuperada do sangue de animais imunizados com conjugado CP8 nativo não tratado conforme determinado pelo teste t de student (Quadro 18). Nos animais que foram imunizados com conjugado CP8 tratado com base, as ufc bacterianas recuperadas do sangue foi semelhante ao grupo controlo salino.

Quadro 18: O conjugado CP8-CRM197 reduz a bacteremia S. _aureus PFESA0003 em ratinhos._

Exemplo 22: Confirmação da Importância da O-Acetilação como Epitopo Funcional de CP5 por OPA Utilizando MAbs com especificidades conhecidas

Anticorpos monoclonais d CP5 com especificidades para CP5 OAc+ (CP5-7-1), CP5 OAc+/- (CP5-5-1) e CP5 OAc- (CP5-6- 1) foram avaliados para atividade de destruição de OP contra a estirpe de tipo 5 PFESA0266 (Quadro 19). MAb CP8- 3-1 específico para CP8 OAc+ foi utilizado como controlo negativo. Os resultados mostraram que o mAb CP5-7-1 (CP5 OAc + específico) medeia a destruição de ambas as estirpes de tipo 5 testadas. Também o mAb CP5-5-1 que reconhece os epítopos compartilhados por ambos os CP5 OAc + e a destruição mediada pelo CP5 OAc da estirpe PFESA0266. 0 MAb especifico para os epítopos presentes no CP5 OAc-polissacárido não mediou a destruição da estirpe PFESA0266. Estes resultados indicam que os epítopos de O-acetilo no CP5 estão envolvidos na atividade funcional de anticorpos específicos do CP5.

Quadro 19 Os mAbs específicos para CP5 O-Acetilado (+) e CP5 0- e de-O-Acetilados (+ /) são Opsónicos contra S. aureus PFESA0266 (Tipo 5).

Os dados relatados como percentagem de destruição foram calculados determinando a proporção do número de ufc sobrevivendo aos 60 minutos em poços com bactérias, anticorpos, complemento e células HL-60 para o número de ufc sobrevivendo em poços sem anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células HL-60.

Exemplo 23: Atividade opsónlca de anticorpos de ratinho induzidos por conjugados de CP5 de alta e baixa MW

Os soros de ratinhos (n = 5) com títulos de ELISA de CP5 elevados de 1 pg de grupos de alta massa molecular e de baixa massa molecular do Exemplo 18 foram comparados para a atividade opsónica utilizando S. aureus PFESA0266. Os resultados do OPA mostraram que ambos os conjugados provocaram anticorpos opsónicos em ratinhos (Quadro 20). Houve uma tendência observada para conjugados de alta MW provocar anticorpos opsónicos de maior titulo. Dados mostrados como % de destruição ±SEM para 5 soros de ratinho individuais. Anticorpos precisam ser funcionais tal como medido pela destruição de bactérias num modelo de eficácia animal ou através de um ensaio de destruição opsonofagocitica que demonstra que os anticorpos destroem as bactérias. A destruição funcional pode não ser demonstrada utilizando um ensaio que monitoriza apenas a geração de anticorpos, que não é indicativa da importância dos conjugados de alta massa molecular na eficácia.

Quadro 20: Ambos os conjugados de CP5 de LMW e HMW elicitam anticorpos

opsónicos

Exemplo 24: Atividade Opsónica de soros de Ratinhos Imunizados com Conjugados de CP8 Nativos e Quimicamente Modificados

Os soros do ratinho selecionados (n = 5) com altos titulos de CP8 do estudo no Exemplo 21 foram comparados para a atividade opsónica utilizando a estirpe PFESA0005. Os resultados de OPA (Quadro 21) mostram que apenas os conjugados preparados pela conjugação de CP8 nativo provocaram anticorpos opsónicos em ratinhos. Vale ressaltar que o conjugado de OAc CP8 foi imunogénico em ratinhos, mas os anticorpos induzidos não foram opsónicos neste ensaio.

Os títulos de OPA são relatados como recíprocos de diluição em que 40% de destruição foram observados. Anticorpos precisam ser funcionais tal como medido pela destruição de bactérias num modelo de eficácia animal ou através de um ensaio de destruição opsonofagocítica que demonstra que os anticorpos destroem as bactérias. A destruição funcional pode não ser demonstrada utilizando um ensaio que monitoriza apenas a geração de anticorpos, que não é indicativa da importância da O-acetilação na eficácia.

Quadro 21. Atividade opsónica de CP8 nativo versus de-O-Ac CP8-CRM197

Exemplo 25: Destruição de estirpes de Tipo 8 por Antissoro de primata não humano Conjugado CP8 é inibida pela adição de CP8 nativo

Para confirmar a especificidade da atividade de destruição nos soros de primatas não humanos imunizados com conjugado CP8, foi realizado um ensaio na presença de CP8 nativo. O método OP II foi utilizado com as seguintes modificações. Foram preparadas diluições em série de duas vezes de amostras de anticorpos (25 μΐ) e seguidas pela adição de 150 μΐ (competidor Pnl4) ou 125 μΐ (competidor de CP8) de tampão de ensaio à suspensão de anticorpos. O competidor foi polissacárido CP8 purificado (CP8 poly) e o polissacárido pneumocócico não relacionado (Pn 14 poly) foi utilizado como controlo. Os polissacáridos foram adicionados (50 pg) à suspensão de anticorpo e a placa foi incubada a 4 °C durante 30 minutos com mistura final. Após a incubação com polissacáridos, As bactérias foram adicionadas (25 μΐ) às placas e colocadas num agitador rotativo a 4 °C durante 30 minutos, seguido da adição de 25 μΐ de complemento humano (1% de concentração final) . Os resultados (Quadro 22) mostraram que a presença de CP8 nativo na mistura de reação inibiu a destruição opsonofagocitica de S. aureus Tipo 8 Estes resultados confirmam que a destruição opsonofagocitica por soro imune foi mediada pelo Abs especifico da cápsula.

Quadro 22. A adição de polissacárido de CP 8 inibe a destruição opsonofagocitica de S. aureus por soros imunes.

Exemplo 26: Anticorpos adquiridos naturalmente para destruição opsonofagocitica mediato de CifA de S. Aureus

Os seres humanos na população são naturalmente expostos a S. aureus e, portanto, têm anticorpos preexistentes contra a bactéria em sua circulação. Purificou-se por afinidade anticorpos anti-ClfA de soro humano e avaliou-se se os anticorpos poderiam mediar a destruição opsónica. Verificou-se que os anticorpos para ClfA são opsónicos para o polissacárido capsular de 5. aureus (dados não apresentados). A estirpe PFESA0266 cresceu durante a noite em caldo Columbia com 2% de NaCl. As bactérias foram opsonizadas com IgG humana purificada por afinidade de ClfA ou IgG humana purificada por afinidade de antigénio irrelevante (controlo negativo, proteina SCP estreptocócica) e a atividade opsónica foi testada. As células HL-60 diferenciadas foram utilizadas no ensaio opsonofagocitico numa razão efetor/alvo de 100: 1.

Como um controlo adicional, um mAb CP5 foi incluído na experiência para demonstrar a presença de CP5 na superfície. Os resultados são a média de duas experiências independentes. Os anticorpos específicos de ClfA e CP5 mediaram a destruição opsónica e os anticorpos específicos de SCP (controlo negativo) não tiveram atividade neste ensaio.

Exemplo 27: O conjugado CP5-CRMi97 elicita anticorpos opsónicos em primatas não humanos (NHP)

Para comparar a funcionalidade dos conjugados de CP5-CRM197 de alta massa molecular versus baixa massa molecular em NHP, Grupos de cinco macacos foram imunizados com doses de 2 e 20 pg dos conjugados com ou sem adjuvante AIPO4. Os macacos receberam a primeira e segunda vacinação nos dias 0 e 28, respetivamente. Os sangramentos a partir do dia 0, 14, 28 e 42 foram testados quanto à atividade de OP. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro 23. O conjugado HMW de 20 pg tinha os maiores títulos de OP em comparação com outros grupos. Também, A frequência de macacos OP positivos foi maior em ambas as doses dos grupos de alta MW do que para os grupos de baixa MW correspondentes. Esses resultados demonstram que há uma tendência para que o conjugado HMW CP5-CRMi97 obtenha melhores respostas OP do que o conjugado LMW CP5 em NHP.

Quadro 23. OPA de soro de NHP após imunização com _conjugados de CP5.

Exemplo 28: Os conjugados de polissacáridos de cápsulas compreendendo polissacáridos de alta massa molecular mostram imunogenicidade melhorada em comparação com conjugados que compõem polissacáridos de baixa massa molecular.

Estudos de primatas não humanos (NHP) foram conduzidos para avaliar a imunogenicidade de diferentes formulações conjugadas de cápsulas. Duas formulações foram testadas em dois niveis de dosagem diferentes (2 e 20 pg). A primeira formulação foi composta por um polissacárido de alta massa molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado a CRM197. A segunda formulação continha um polissacárido de baixa massa molecular (HMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado a CRM197. Os grupos de cinco primatas foram vacinados com uma dose única de vacina e os títulos imunológicos foram monitorizados antes da vacinação e duas semanas após a vacinação. Os títulos de OPA foram definidos como a diluição do soro necessário para destruir 40% da estirpe de S. aureus PFESA0266 em um teste OPA. Os títulos de anticorpo também foram monitorizados por meio de ELISA. A atividade melhorada foi observada para a vacina de HMW em comparação com a de formulação LMW (Quadro 24), evidenciada por um aumento de dez vezes nos títulos de anticorpos para a vacina de HMW em comparação com a vacina de LMW. A taxa de resposta da OPA para os NHP que receberam a vacina de HMW também foi maior (80% em comparação com 40%) .

Quadro 24. A imunogenicidade aumentada é observada para as vacinas conjugadas de polissacárido de HMW em comparação com a vacina conjugada de polissacárido de LMW.

Exemplo 29: Respostas de anticorpos de formulação bi-antigénio (CP5-CRMi 97 e ClfA) em primatas não humanos

Para avaliar a resposta imune a uma dose única de duas composições imunogénicas de antigénio (CP5-CRMi97 e ClfA) em NHP, grupos de cinco macacos foram imunizados com diferentes doses dos dois antigénios sem a adição de A1P04. Os sangramentos dos dias 0, 14 e 28 foram testados quanto à atividade opsnofagocítica (OP) e títulos de ELISA e os resultados encontram-se resumidos no Quadro 24. Os resultados mostraram que a atividade OP foi consistentemente observada com animais imunizados com CP5, em comparação com um grupo simulado de CP5. No geral, 0 grupo de 100 pg tinha os maiores titulos de ELISA e OP em comparação com outros grupos. Não houve atividade de destruição de OP observada com soros do grupo sozinho de ClfA. Não foi observada interferência nos grupos que receberam doses ascendentes de ClfA ou CP5. Veja-se o Quadro 25.

Quadro 25: Resultados de OPA do estudo de imunização Bi-

Valente em NHP

Modelos de animais demonstram o potencial de antigénios de polissacáridos de cápsulas CP5 e CP8 de S. aureus

Tanto os conjugados CP5-CRMi97 como CP8-CRM197 induziram respostas de anticorpos específicos para sorotipos capsulares em ratinhos, ratos, coelhos e primatas não humanos (NHP). Os anticorpos induzidos por conjugado foram funcionais no ensaio de destruição por opsonofagocitose funcional in vitro. Os dados foram gerados para demonstrar que a O-acetilação é importante para a elicitação de anticorpos protetores para CP5 e CP8, e que os grupos 0-acetilo fazem parte de um epítopo reconhecido por OPA + mAbs contra CP5. Os MAbs que reconhecem o CP5 nativo que é O-acetilado são funcionais na OPA e mediam a destruição das bactérias. Anticorpos funcionais induzidos pelo conjugado de CP8 em ratinhos e coelhos que mediaram a destruição da estirpe Tipo 8 na OPA. A especificidade da morte por anticorpos policlonais ou monoclonais foi confirmada pela abolição da destruição após a adição do polissacárido nativo homólogo ao ensaio. Vários modelos de imunização ativa foram utilizados para mostrar a eficácia pré-clinica dos conjugados CP5- e CP8-CRM197. 0 conjugado de CP5 mostrou eficácia consistente no modelo de pielonefrite murina e no modelo de endocardite de ratos. A importância da 0-acetilação do CP5 foi confirmada no modelo de pielonefrite murina, onde o CP5 de-O-acetilado conjugado com o CRM197 não conseguiu proteger os animais contra a infeção experimental. A combinação dos conjugados numa formulação bi-antigénica induziu anticorpos para ambas as cápsulas CP5 e CP8 e não houve interferência nos níveis de anticorpos específicos induzidos em comparação com imunizações de antigénio único. A combinação de conjugados e ClfA em uma formulação de tri-antigénio induziu altos níveis de CP5, CP8 e ClfA, e não houve interferência nas respostas de anticorpos induzidas contra qualquer antigénio presente na combinação. As composições imunogénicas do tri-antigénio induziram respostas de anticorpos (Ab) capazes de serem reforçadas para os três componentes em coelhos com títulos pré-imunes elevados.

Esses resultados sugerem que conjugados CP5 e CP8 com CRMi 97 devem ser incluídos como componentes de formulação imunogénica de uma composição imunogénica protetora de S. aureus.

Exemplo 30: Requerimento de diferentes antigénios para proteger de múltiplas doenças possiveis de S. aureus S. aureus causa uma ampla gama de infeções que vão desde infeções de pele relativamente suaves até infeções mais graves e invasivas, como endocardite, fasciite necrotizante, osteomielite, artrite séptica e pneumonia. Cada um desses locais in vivo é único e as bactérias provavelmente respondem às diferenças nos estímulos ambientais, alterando seus perfis de expressão do antigénio aos mais adequados para a estirpe individual a colonizar, crescer e, finalmente, causar doenças. Conforme exemplificado no Exemplo 12, as estirpes de S. aureus mostram diversidade de expressão de antígeno in vivo. Uma composição imunogénica de vários componentes composta por diferentes antigénios é mais provável proteger contra a diversa manifestação da doença causada por S. aureus.

ClfA mostrou proteger nos modelos de endocardite e sepse de roedores. ClfB foi relatado como importante na colonização nasal de S. aureus. MntC protegeu ratinhos num modelo murino de bacteremia. 0 conjugado CP5 protegido em pielonefrite e endocardite, e o conjugado CP8 protegido em modelos de pielonefrite e sepse de roedores. Esses resultados demonstram que uma vacina de vários componentes contendo esses antigénios irá proteger contra múltiplos tipos de doença de S. aureus.

Os modelos animais in vivo aproximam-se do curso de uma infeção real e ajudam a elucidar quais antigénios podem ser úteis na proteção de uma determinada doença. 0 Quadro 26 resume os resultados de inúmeras experiências realizadas em vários modelos in vivo. Os resultados são relatados em cada bloco como quatro números separados por uma barra, Por exemplo ClfA num modelo de sepse tem números 27/1/3/31. 0 primeiro número representa o número de experiências em que a imunização de ClfA produziu um resultado positivo estatisticamente significativo de proteção. 0 segundo número representa o número de experiências em que a imunização de ClfA produziu um resultado positivo de proteção que tende para significância, mas não foi estatisticamente significativo. 0 terceiro número representa o número de experiências em que a imunização de ClfA produziu um resultado negativo, mas não foi estatisticamente significativo. 0 quarto número é o número total de experiências realizadas. A soma dos três primeiros números deve ser igual ao quarto número.

Quadro 26. Sumário da proteção em modelos animais para antigenos de S. aureus____

Exemplo 31: Teste de várias composições imunogénicas de múltiplos antigenos in vitro e in vivo Várias formulações imunogénicas estafilocócicas de múltiplos antigénios que contêm três, quatro ou cinco antigénios selecionados dos seguintes polipéptidos e/ou polissacáridos são testados quanto à imunogenicidade e eficácia em vários modelos in vivo: ClfA, ClfB, MntC, CP5 e CP8. As composições imunogénicas são como segue: (1) uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a CRMi97 e um polissacárido capsular de tipo 8 de 5. aureus isolado conjugado a CRMi97; (2) Uma segunda combinação proporciona fator de aglutinação A (ClfA), fator de aglutinação B (ClfB), uma MntC isolada, um polissacárido capsular estafilocócico CP5 conjugado com CRM197 e um polissacárido capsular estaf ilocócico CP8 conjugado com CRM197; (3) uma terceira combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado ou uma proteina de Mntc de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a CRM197; isolado (4) uma quarta combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a CRM197; (5) uma quinta combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado, uma proteina MntC de S. aureus isolada, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a CRM197 e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a CRM197; e (6) uma sexta combinação proporciona uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado e uma proteina de Mntc de S. aureus isolada. rClfA e rClfB são preparados e purificados conforme descrito no Exemplo 1. MntC é preparado e purificado conforme descrito no Exemplo 2. Os CP5 e CP8 isolados são preparados e purificados conforme descrito no Exemplo 3 e são conjugados com CRMi97 conforme descrito no Exemplo 4.

Mais particularmente, os procedimentos descritos nos Exemplos anteriores acima são utilizados para medir imunogenicidade e eficácia. Estudos são feitos para determinar se cada um dos três, quatro ou cinco componentes, quando administrados sozinhos, ou juntamente, induzem uma resposta imune. Estes mesmos estudos são utilizados para determinar se a presença ou não de um dos quatro ou cinco componentes interfere com a capacidade de qualquer um dos outros três ou quatro componentes para induzir uma resposta imune. Além disso, os estudos são feitos para determinar se os quatro ou cinco componentes quando testados sozinhos, ou quando testados em conjunto, irão conferir proteção em qualquer um ou mais dos modelos de animais descritos acima. Os quatro ou cinco componentes são administrados como uma dose única ou como doses múltiplas para um animal, por exemplo, ratinhos, ratos, coelhos ou primatas não humanos, conforme indicado nos exemplos anteriores acima. Os animais são sangrados e o soro recolhido e testado quanto à presença de anticorpos para cada um dos quatro ou cinco componentes. A presença de anticorpos específicos do antigénio é medida por qualquer imunoensaio conhecido pelos peritos na especialidade, por exemplo, um ELISA (veja-se Exemplos 11-29) ou uma transferência de Western (veja-se Exemplo 1) é utilizado para avaliar a presença ou ausência de anticorpos específicos de antigénio. Além disso, um ensaio opsonofagocítico é utilizado para determinar se os anticorpos específicos do antigénio são eficazes para mediar a destruição dos organismos estafilocócicos por células fagociticas (veja-se exemplos 11-29). A eficácia in vivo também é avaliada utilizando qualquer um ou mais estudos de animais descritos acima, tais como, mas não limitados a, o modelo de tubagem de habitação; o modelo murino de bacteremia; o modelo de infeção de ferida; o modelo murino de pielonefrite; 0 modelo de endocardite de ratos e o modelo de sepse murina (veja-se exemplos 11-30).

Exemplo 32: As combinações de antlgénlos de S. Aureus geram anticorpos em primatas não humanos que aumentam a destruição da estirpe de S. Aureus Pfe5-1.

Eficácia melhorada, conforme medido utilizando o ensaio de OPA, foi observado utilizando combinações de antigénios. Um estudo de primatas não humanos foi realizado onde grupos de 3-10 macacos foram imunizados com vacinas multi-componente. Os animais receberam uma única dose de vacina e os títulos de OPA foram monitorizados no dia 0 e duas semanas após a vacinação. Os títulos de OPA foram definidos como a diluição do soro necessário para destruir 50% da estirpe de S. aureus Pfe5-1 em um teste OPA. A atividade melhorada foi vista para uma combinação de 4 antigénios em comparação com uma formulação de vacina de antigénio 3 (p = 0,0272; Figura 18).

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> ANDERSON, ANNALIESA PAVLIAK, VILIAM JANSEN, KATHRIN UTE DODGE, INGRID LEA BAKER, STEVEN MORRIS NANRA, JASDEEP SINGH MURPHY, ELLEN GREEN, BRUCE ARTHUR RUPPEN, MARK EDWARD TIMOFEYEVA, YEKATERINA

<12 0> COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS DE ANTIGÉNIOS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS <130> AM102183 <140> <141> <160> 131 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 927 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 1 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac cagaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg aaagtttatc tgaagaaacg aagaaagata tctttggtga agtgtacaca 840 gattcaatcg gtaaagaagg cactaaaggt gactcttact acaaaatgat gaaatcaaat 900 attgaaactg tacacggaag catgaaa 927

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<210> 5 <211> 936 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <400> 5 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac agtaaagaca aatttaatga cattccaaaa 600 gaacaacgtg ccatgattac aagtgaaggt gccttcaagt acttctcaaa acaatacggt 660 attacaccag gttatatttg ggaaattaac actgaaaaac aaggtacacc tgaacaaatg 720 agacaagcta ttgagtttgt taaaaagcac aaattaaaac acttattagt agaaacaagt 780 gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 840 gtgtacacag attcaatcgg taaagaaggc actaaaggtg actcttacta caaaatgatg 900 aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaa 936

<210> 6 <211> 312 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 6

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<210> 8 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8

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<210> 10 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 10

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Ser Vai Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys 260 265 270

Asp ile Phe Gly Glu Vai Tyr Thr Asp Ser ile Gly Lys Glu Gly Thr 275 280 285

Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Vai 290 295 300

His Gly Ser Met Lys 305

<210> 11 <211> 927 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 11 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcatattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg aaagtttatc tgaagaaacg aagaaagata tctttggtga agtgtacaca 840 gattcaatcg gtaaagaagg cactaaaggt gactcttact acaaaatgat gaaatcaaat 900 attgatactg tacacggaag catgaaa 927

<210> 12 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 12

Met Lys Lys Leu vai Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu vai Ala 15 10 15

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Lys Lys Vai Ile Ala Vai Ser Lys Asp Vai Lys Pro Ile Tyr Leu Asn 115 120 125

Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asp Lys Gin Asp Pro His Ala Trp Leu Ser 130 135 140

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Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Asp Thr vai 290 295 300

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<210> 13 <211> 927 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 13 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acrttccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg aaagtttatc tgaagaaacg aagaaagata tctttggtga agtgtacaca 840 gattcaatcg gtaaagaagg cactaaaggt gactcttact acaaaatgat gaaatcaaat 900 attgatactg tacacggaag catgaaa 927 <210> 14 <211> 309

<212> PRT <213> Staphylococcus aureus <22 0> <221 > MOD_RES <222> (195)..(195) <223> Qualquer aminoácido <4 0 0> 14

Met Lys Lys Leu vai Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu vai Ala 15 10 15

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<210> 15 <211> 1626 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 15 ttgaaaaaaa gaattgatta tttgtcgaat aagcagaata agtattcgat tagacgtttt 60 acagtaggta ccacatcagt aatagtaggg gcaacgatac tatttgggat aggcaatcat 120 caagcacaag cttcagaaca atcgaacgat acaacgcaat cttcgaaaaa taatgcaagt 180 gcagattccg aaaaaaacaa tacgatagaa acacctcaat taaatacaac ggctaatgat 240 acatctgata ttagtgcaaa cacaaacagt gcgaatgtag atagcacagc aaaaccaatg 300 tctacacaaa cgagcaatac cactacaaca gagccagctt caacaaatga aacacctcac 360 ccgacggcaa ttaaagatca agcaactgct gcaaaaatgc aagatcaaac tgttcctcaa 420 gaagcaaatt ctcaagtaga taataaaaca acgaatgatg ctaatagcat agcaacaaac 480 agtgagctta aaaatcctca aacattagat ttaccacaat catcaccaca aacgatttcc 540 aatgcgcaag gaactagtaa accaagtgtt agaacgagag ctgtacgtag tcttgcagtt 600 actgaacctg tagtaaatgc tgctgatgct aaaggtacaa atgtaaatgg tcaagttacg 660 gcaagtgatt tcaagttaga aaagactaca tttgacccta accaaagtgg taacacattt 720 atggcggcaa attttaaagt ggcagggaaa gtgaaatcag gggattattt tacagcgaag 780 ttaccagata gtgtaactgg taatggagat gtggattact ctaactcgaa taatacgatg 840 ccaattgcag atattaaaag tacgaatggc gatgttgtag ctaaagcaac atatgatatc 900 ttgactaaga cgtatacatt tgtctttaca gattatgtaa atgataaaga aaatattaac 960 ggacaatttt cattaccatt atttacagac agagcaaagg cacctaaatc aggaacatat 1020 gatgcaaata ttaatattgc ggatgaaatg tttaataata aaattactta taactatagt 1080 tcaccaattg caggaattga taagccaaat ggcgcgaaca tttcttctca aattattggt 1140 gtagatacag cttcaggtca aaacacatac aagcaaacgg tatttgttaa ccctaagcaa 1200 cgagttttag gtaatacgtg ggtgtatatt aaaggttacc aagataaaat cgaagaaagt 1260 agcggtaaag taagtgctac agatacaaaa ctgagaattt ttgaagtgaa tgatacatct 1320 aaattatcag atagctacta tgcagaccca aatgactcta accttaaaga agtaactgat 1380 caatttaaag ataaaatttc atacaaatac gataacgtag caagtattaa ttttggtgat 1440 ataaataaaa cgtatgtcgt tttagtcgaa ggtcattatg ataatactgg taaaaacttg 1500 aaaacacagg ttattcaaga aaatattgac ccagcgacag gtaaagatta cagtattttc 1560 ggttggaata atgagaatgt tgtacgttat ggaggcggaa gtgctgatgg tgattcagca 1620 gtaaat 1626 <210> 16 <211> 542

<212> PRT <213> Staphylococcus aureus <4 Ο 0> 16

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<210> 17 <211> 1626 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 17 ttgaaaaaaa gaattgatta tttgtcgaat aagcagaata agtattcgat tagacgtttt 60 acagtaggta ccacatcagt aatagtaggg gcaactatac tatttgggat aggcaatcat 120 caagcacaag cttcagaaca atcgaacgat acaacgcaat cttcgaaaaa taatgcaagt 180 gcagattccg aaaaaaacaa tacgatagaa acacctcaat taaatacaac ggctaatgat 240 acatctgata ttagtgcaaa cacaaacagt gcgaatgtag atagcacagc aaaaacaatg 300 tctacacaaa cgagcaatac cactacaaca gagccagctt caacaaatga aacacctcaa 360 ccgacggcaa ttaaagatca agcaactgct gcaaaaatgc aagatcaaac tgttcctcaa 420 gaagcaaatt ctcaagtaga taataaaaca acgaatgatg ctaataacat agcaacaaac 480 agtgagctta aaaatcctca aacattagat ttaccacaat catcaccaca aacgatttcc 540 aatgcgcaag gaactagtaa accaagtgtt agaacgagag ctgtacgtag tcttgcagtt 600 gctgaacctg tagtaaatgc tgctgatgct aaaggtacaa atgtaaatga taaagttacg 660 gcaagtgatt tcaagttaga aaagactgca tttgacccta accaaagtgg taacacattt 720 atggcggcaa attttaaagt gactggacaa gtgaaatcag gggattattt tacagcgaag 780 ttaccagata gtgtaactgg taatggagac gtggattact ctaattcaaa taatacgatg 840 ccaattgcag acattaaaag tacgaatggc gatgttgtag ctaaagcaac atatgatatc 900 ttgactaaga cgtatacatt tgtctttaca gattatgtaa atgataaaga aaatattaac 960 ggacaatttt cattaccttt atttacagac cgagcaaagg cacctaaatc aggaacatat 1020 gatgcaaata ttaatattgc ggatgaaatg tttgataata aaattactta taactatagt 1080 tcgccaattg caggaattga taagccaaat ggcgcgaaca tttcttctca aattattggt 1140 gtagatacag cttcaggtca aaacacatac aagcaaacgg tatttgttaa ccctaagcaa 1200 cgagttttag gtaatacgtg ggtgtatatt aaaggttacc aagataaaat cgaagaaagt 1260 agcggtaaag taagtgctac agatacaaaa ctgagaattt ttgaagtgaa tgatacatct 1320 aaattatcag atagctacta tgcagaccca aatgactcta accttaaaga agtgactggt 1380 gagtttaaag ataaaatttc atacaaatac gataacgtag caagtattaa ttttggtgat 1440 ataaataaaa cgtatgttgt attagtggaa ggtcactatg ataatactgg taaaaacttg 1500 aaaacacagg ttattcaaga aaatattgac ccagcgacag gtaaagacta cagtattttc 1560 ggttggaata atgagaatgt tgtacgttat ggaggcggaa gtgctgatgg tgattcagca 1620 gtaaat 1626 <210> 18 <211> 542

<212> PRT <213> Staphylococcus aureus <4 Ο 0> 18

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<212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 20

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<210> 110 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador sintético <4 0 0> 110 aaaatattgg agataccaat attttaggtt g 31

<210> 111 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador sintético <4 0 0> 111 tttcttggat ccggtactgg tggtaaacaa agcagtg 37

<210> 112 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador sintético <4 0 0> 112 tttcttgcat gcttatttca tgcttccgtg tacagtttc 39

<210> 113 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador sintético <4 0 0> 113 tttcttccat gggtactggt ggtaaacaaa gcag 34

<210> 114 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador sintético <4 0 0> 114 tttcttgctc agcattattt catgcttccg tgtacag 37

<210> 115 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <4 0 0> 115

Vai Lys Lys lie Leu Ala Leu Ala lie Ala Phe Leu lie lie Leu Ala 15 10 15

Ala Cys Gly Asn His Ser Asn His Glu His His Ser His Glu Gly Lys 20 25 30

Leu Lys Val Vai Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Vai Lys Arg 35 40 45

Val Gly Gly Asn Lys val Asp val His Ser ile val Pro val Gly Gin 50 55 60

Asp Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Ala Leu Thr 65 70 75 80

Asp Ala Asp Val Val Phe Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn 85 90 95

Gly Trp Phe Glu Lys Ala Leu Asp Gin Ala Gly Lys Ser Thr Lys Asp 100 105 110

Lys Asn Val Ile Ala Ala Ser Asn Asn Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn 115 120 125

Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asn Lys Gin Asp Pro His Ala Trp Leu Ser 130 135 140

Leu Glu Asn Gly ile Lys Tyr val Lys Thr ile Gin Lys Ser Leu Glu 145 150 155 160

His His Asp Lys Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Glu Lys Gin Gly Asn Ala 165 170 175

Tyr ile Ser Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Asp Ser Lys Asn Lys Phe 180 185 190

Asp Asp Ile Pro Lys Asn Gin Arg Ala Met Met Thr Ser Glu Gly Ala 195 200 205

Phe Lys Tyr Phe Ala Gin Gin Phe Asp Vai Lys Pro Gly Tyr Ile Trp 210 215 220

Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gin Gly Thr Pro Gly Gin Met Lys Gin Ala 225 230 235 240 ile Lys Phe vai Lys Asp Asn His Leu Lys His Leu Leu vai Glu Thr 245 250 255

Ser Vai Asp Lys Lys Ala Met Gin ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys 260 265 270

Asp ile Tyr Gly Glu vai Phe Thr Asp Ser ile Gly Lys Ala Gly Thr 275 280 285

Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Asp Thr Ile 290 295 300

His Gly Ser Met Lys 305

<210> 116 <211> 930 <212> ADN <213> Staphylococcus epidermidis <4 0 0> 116 gtgaaaaaaa ttctcgcttt agcaatagca tttttaatta tccttgccgc atgtgggaat 60 cacagtaacc atgaacatca ctcacatgaa ggaaaattaa aagttgtaac tacaaactct 120 attctctatg acatggttaa acgtgtcggt ggaaataagg tcgatgttca tagcatcgtt 180 ccagtaggac aagatccaca tgaatatgag gttaaaccta aagatattaa agcattaaca 240 gatgctgacg ttgtatttta taatggttta aacctagaaa ctggaaatgg ttggtttgaa 300 aaagcacttg accaagcagg aaaatcaaca aaagataaaa atgtgatagc agcatcaaat 360 aatgttaaac caatatactt aaatggtgag gaaggtaaca aaaacaaaca agatccacat 420 gcatggttaa gtttagagaa tggaattaaa tacgtaaaaa caatacaaaa atcactagaa 480 catcatgata aaaaagataa gtctacatat gaaaaacaag ggaatgcata tatatcaaaa 540 ttagaagaac ttaataaaga tagtaaaaat aaatttgatg acatacccaa aaatcaacgt 600 gccatgatga caagtgaagg tgcatttaaa tattttgctc aacaattcga tgttaaacca 660 ggttatattt gggagataaa cacagaaaaa caaggtacac ctggtcaaat gaaacaagcc 720 attaaatttg ttaaagataa tcatttaaaa catttattag tcgaaacaag cgtagataaa 780 aaagctatgc aaagtttatc agaagaaact aagaaagata tttatggtga agtatttacc 840 gactctatag gtaaggcagg tactaaaggt gactcatact ataaaatgat gaaatctaat 900 attgatacaa tacatggtag tatgaaataa 930

<210> 117 <211> 510 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 117

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Ala Ser Glu Gin Ser 15 10 15

Asn Asp Thr Thr Gin Ser Ser Lys Asn Asn Ala Ser Ala Asp Ser Glu 20 25 30

Lys Asn Asn Met Ile Glu Thr Pro Gin Leu Asn Thr Thr Ala Asn Asp 35 40 45

Thr Ser Asp Ile Ser Ala Asn Thr Asn Ser Ala Asn Vai Asp Ser Thr 50 55 60

Thr Lys Pro Met Ser Thr Gin Thr ser Asn Thr Thr Thr Thr Glu Pro 65 70 75 80

Ala Ser Thr Asn Glu Thr Pro Gin Pro Thr Ala Ile Lys Asn Gin Ala 85 90 95

Thr Ala Ala Lys Met Gin Asp Gin Thr Vai Pro Gin Glu Ala Asn Ser 100 105 110

Gin Vai Asp Asn Lys Thr Thr Asn Asp Ala Asn Ser Ile Ala Thr Asn 115 120 125

Ser Glu Leu Lys Asn Ser Gin Thr Leu Asp Leu Pro Gin Ser Ser Pro 130 135 140

Gin Thr Ile Ser Asn Ala Gin Gly Thr Ser Lys Pro Ser Vai Arg Thr 145 150 155 160

Arg Ala Vai Arg Ser Leu Ala Vai Ala Glu Pro Vai Vai Asn Ala Ala 165 170 175

Asp Ala Lys Gly Thr Asn vai Asn Asp Lys vai Thr Ala ser Asn Phe 180 185 190

Lys Leu Glu Lys Thr Thr Phe Asp Pro Asn Gin Ser Gly Asn Thr Phe 195 200 205

Met Ala Ala Asn Phe Thr Vai Thr Asp Lys Vai Lys Ser Gly Asp Tyr 210 215 220

Phe Thr Ala Lys Leu Pro Asp Ser Leu Thr Gly Asn Gly Asp Vai Asp 225 230 235 240

Tyr Ser Asn Ser Asn Asn Thr Met Pro Ile Ala Asp Ile Lys Ser Thr 245 250 255

Asn Gly Asp Vai Vai Ala Lys Ala Thr Tyr Asp Ile Leu Thr Lys Thr 260 265 " 270

Tyr Thr Phe Vai Phe Thr Asp Tyr Vai Asn Asn Lys Glu Asn Ile Asn 275 280 285

Gly Gin Phe Ser Leu Pro Leu Phe Thr Asp Arg Ala Lys Ala Pro Lys 290 295 300

Ser Gly Thr Tyr Asp Ala Asn ile Asn ile Ala Asp Glu Met Phe Asn 305 310 315 320

Asn Lys Ile Thr Tyr Asn Tyr Ser Ser Pro Ile Ala Gly Ile Asp Lys 325 330 335

Pro Asn Gly Ala Asn Ile Ser Ser Gin Ile Ile Gly Vai Asp Thr Ala 340 345 350

Ser Gly Gin Asn Thr Tyr Lys Gin Thr Vai Phe Vai Asn Pro Lys Gin 355 360 365

Arg Vai Leu Gly Asn Thr Trp Vai Tyr Ile Lys Gly Tyr Gin Asp Lys 370 375 380

Ile Glu Glu Ser Ser Gly Lys Vai Ser Ala Thr Asp Thr Lys Leu Arg 385 390 395 400 ile Phe Glu vai Asn Asp Thr ser Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Tyr Ala 405 410 415

Asp Pro Asn Asp Ser Asn Leu Lys Glu vai Thr Asp Gin Phe Lys Asn 420 425 430

Arg Ile Tyr Tyr Glu His Pro Asn Vai Ala Ser Ile Lys Phe Gly Asp 435 440 445

Ile Thr Lys Thr Tyr Vai Vai Leu Vai Glu Gly His Tyr Asp Asn Thr 450 455 460

Gly Lys Asn Leu Lys Thr Gin Vai Ile Gin Glu Asn Vai Asp Pro Vai 465 470 475 480

Thr Asn Arg Asp Tyr Ser ile Phe Gly Trp Asn Asn Glu Asn vai vai 485 490 495

Arg Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Ser Ala Vai Asn 500 505 510

<210> 118 <211> 1533 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 Ο 0> 118 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtgcttcag aãcaatcgaa cgatacaacg 60 caatcttcga aaaataatgc aagtgcagat tccgaaaaaa acaatatgat agaaacacct 120 caattaaata caacggctaa tgatacatct gatattagtg caaacacaaa cagtgcgaat 180 gtagatagca caacaaaacc aatgtctaca caaacgagca ataccactac aacagagcca 240 gcttcaacaa atgaaacacc tcaaccgacg gcaattaaaa atcaagcaac tgctgcaaaa 300 atgcaagatc aaactgttcc tcaagaagca aattctcaag tagataataa aacaacgaat 360 gatgctaata gcatagcaac aaacagtgag cttaaaaatt ctcaaacatt agatttacca 420 caatcatcac cacaaacgat ttccaatgcg caaggaacta gtaaaccaag tgttagaacg 480 agagctgtac gtagtttagc tgttgctgaa ccggtagtaa atgctgctga tgctaaaggt 540 acaaatgtaa atgataaagt tacggcaagt aatttcaagt tagaaaagac tacatttgac 600 cctaatcaaa gtggtaacac atttatggcg gcaaatttta cagtgacaga taaagtgaaa 660 tcaggggatt attttacagc gaagttacca gatagtttaa ctggtaatgg agacgtggat 720 tattctaatt caaataatac gatgccaatt gcagacatta aaagtacgaa tggcgatgtt 780 gtagctaaag caacatatga tatcttgact aagacgtata catttgtctt tacagattat 840 gtaaataata aagaaaatat taacggacaa ttttcattac ctttatttac agaccgagca 900 aaggcaccta aatcaggaac atatgatgcg aatattaata ttgcggatga aatgtttaat 960 aataaaatta cttataacta tagttcgcca attgcaggaa ttgataaacc aaatggcgcg 1020 aacatttctt ctcaaattat tggtgtagat acagcttcag gtcaaaacac atacaagcaa 1080 acagtatttg ttaaccctaa gcaacgagtt ttaggtaata cgtgggtgta tattaaaggc 1140 taccaagata aaatcgaaga aagtagcggt aaagtaagtg ctacagatac aaaactgaga 1200 atttttgaag tgaatgatac atctaaatta tcagatagct actatgcaga tccaaatgac 1260 tctaacctta aagaagtaac agaccaattt aaaaatagaa tctattatga gcatccaaat 1320 gtagctagta ttaaatttgg tgatattact aaaacatatg tagtattagt agaagggcat 1380 tacgacaata caggtaagaa cttaaaaact caggttattc aagaaaatgt tgatcctgta 1440 acaaatagag actacagtat tttcggttgg aataatgaga atgttgtacg ttatggtggt 1500 ggaagtgctg atggtgattc agcagtaaat taa 1533

<210> 119 <211> 292 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <4 Ο 0> 119

Met Gly Thr Gly Gly Lys Gin ser ser Asp Lys Ser Asn Gly Lys Leu 15 10 15

Lys Vai Vai Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Ala Lys Asn Vai 20 25 30

Gly Gly Asp Asn Vai Asp Ile His Ser Ile Vai Pro Vai Gly Gin Asp 35 40 45

Pro His Glu Tyr Glu Vai Lys Pro Lys Asp lie Lys Lys Leu Thr Asp 50 55 60

Ala Asp Vai lie Leu Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn Gly 65 70 75 80

Trp Phe Glu Lys Ala Leu Glu Gin Ala Gly Lys ser Leu Lys Asp Lys 85 90 95

Lys val ile Ala Vai Ser Lys Asp Vai Lys Pro ile Tyr Leu Asn Gly 100 105 110

Glu Glu Gly Asn Lys Asp Lys Gin Asp Pro His Ala Trp Leu Ser Leu 115 120 125

Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gin Gin Thr Phe Ile Asp 130 135 140

Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gin Gly Asn Lys Tyr 145 150 155 160 ile Ala Gin Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe Asn 165 170 175

Asp ile Pro Lys Glu Gin Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly Ala Phe 180 185 190

Lys Tyr Phe Ser Lys Gin Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile Trp Glu 195 200 205 ile Asn Thr Glu Lys Gin Gly Thr Pro Glu Gin Met Arg Gin Ala ile 210 215 220

Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr Ser 225 230 235 240 val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu ser Glu Glu Thr Lys Lys Asp 245 250 255 ile Phe Gly Glu val Tyr Thr Asp Ser ile Gly Lys Glu Gly Thr Lys 260 265 270

Glv Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Val His 275 280 285

Gly Ser Met Lys 290

<210> 120 <211> 879 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 120 atgggtactg gtggtaaaca aagcagtgat aagtcaaatg gcaaattaaa agtagtaacg 60 acgaattcaa ttttatatga tatggctaaa aatgttggtg gagacaacgt cgatattcat 120 agtattgtac ctgttggtca agatcctcat gaatatgaag ttaaacctaa agatattaaa 180 aagttaactg acgctgacgt tattttatac aacggattaa atttagagac tggtaacggt 240 tggtttgaaa aagccttaga acaggctggt aaatcattaa aagataaaaa agttatcgca 300 gtatcaaaag atgttaaacc tatctattta aacggtgaag aaggcaacaa agataaacaa 360 gatccacacg catggttaag tttagataat ggtattaaat acgtaaaaac aattcaacaa 420 acatttatcg ataacgacaa aaaacataaa gcagattatg aaaagcaagg taacaaatac 480 attgctcaat tggaaaaatt aaataatgac agtaaagaca aatttaatga cattccaaaa 540 gaacaacgtg ccatgattac aagtgaaggt gccttcaagt acttctcaaa acaatacggt 600 attacaccag gttatatttg ggaaattaac actgaaaaac aaggtacacc tgaacaaatg 660 agacaagcta ttgagtttgt taaaaagcac aaattaaaac acttattagt agaaacaagt 720 gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 780 gtgtacacag attcaatcgg taaagaaggc actaaaggtg actcttacta caaaatgatg 840 aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaataa 879

<210> 121 <211> 292 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 121

Met Gly Asn His Ser Asn His Glu His His Ser His Glu Gly Lys Leu 15 10 15

Lys Vai Vai Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Vai Lys Arg Vai 20 25 30

Gly Gly Asn Lys Vai Asp Vai His Ser Ile Vai Pro Vai Gly Gin Asp 35 40 45

Pro His Glu Tyr Glu vai Lys Pro Lys Asp ile Lys Ala Leu Thr Asp 50 55 60

Ala Asp Vai Vai Phe Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn Gly 65 70 75 80

Trp Phe Glu Lys Ala Leu Asp Gin Ala Gly Lys Ser Thr Lys Asp Lys 85 90 95

Asn Vai Ile Ala Ala Ser Asn Asn Vai Lys Pro Ile Tyr Leu Asn Gly 100 105 110

Glu Glu Gly Asn Lys Asn Lys Gin Asp Pro His Ala Trp Leu Ser Leu 115 120 ' " 125

Glu Asn Gly Ile Lys Tyr Vai Lys Thr Ile Gin Lys Ser Leu Glu His 130 135 140

His Asp Lys Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Glu Lys Gin Gly Asn Ala Tyr 145 150 155 160 ile Ser Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Asp Ser Lys Asn Lys Phe Asp 165 170 175

Asp Ile Pro Lys Asn Gin Arg Ala Met Met Thr Ser Glu Gly Ala Phe 180 185 190

Lys Tyr Phe Ala Gin Gin Phe Asp Vai Lys Pro Gly Tyr Ile Trp Glu 195 200 205

Ile Asn Thr Glu Lys Gin Gly Thr Pro Gly Gin Met Lys Gin Ala Ile 210 215 220

Lys Phe Vai Lys Asp Asn His Leu Lys His Leu Leu vai Glu Thr ser 225 230 235 240

Vai Asp Lys Lys Ala Met Gin Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys Asp 245 250 255 ile Tyr Gly Glu vai Phe Thr Asp Ser ile Gly Lys Glu Gly Thr Lys 260 265 270

Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn ile Asp Thr ile His 275 280 285

Gly Ser Met Lys 290

<210> 122 <211> 879 <212> ADN <213> Staphylococcus epidermidis <4 0 0> 122 atggggaatc acagtaacca tgaacatcac tcacatgaag gaaaattaaa agttgtaact 60 acaaactcta ttctctatga catggttaaa cgtgtcggtg gaaataaggt cgatgttcat 120 agcatcgttc cagtaggaca agatccacat gaatatgagg ttaaacctaa agatattaaa 180 gcattaacag atgctgacgt tgtattttat aatggtttaa acctagaaac tggaaatggt 240 tggtttgaaa aagcacttga ccaagcagga aaatcaacaa aagataaaaa tgtgatagca 300 gcatcaaata atgttaaacc aatatactta aatggtgagg aaggtaacaa aaacaaacaa 360 gatccacatg catggttaag tttagagaat ggaattaaat acgtaaaaac aatacaaaaa 420 tcactagaac atcatgataa aaaagataag tctacatatg aaaaacaagg gaatgcatat 480 atatcaaaat tagaagaact taataaagat agtaaaaata aãtttgatga catacccaaa 540 aatcaacgtg ccatgatgac aagtgaaggt gcatttaaat attttgctca acaattcgat 600 gttaaaccag gttatatttg ggagataaac acagaaaaac aaggtacacc tggtcaaatg 660 aaacaagcca ttaaatttgt taaagataat catttaaaac atttattagt cgaaacaagc 720 gtagataaaa aagctatgca aagtttatca gaagaaacta agaaagatat ttatggtgaa 780 gtatttaccg actctatagg taaggaaggt actaaaggtg actcatacta taaaatgatg 840 aaatctaata ttgatacaat acatggtagt atgaaataa 879

<210> 123 <211> 531 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 123

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Ser Glu Asn ser vai 15 10 15

Thr Gin Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser 20 25 30

Ser vai ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn vai ser Asp Thr 35 40 45

Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Vai Ala Gin Asn 50 55 60

Pro Ala Gin Gin Glu Thr Thr Gin Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr 65 70 75 80

Glu Glu Thr Pro Vai Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gin 85 90 95

Ala Asn Thr Pro Ala Thr Thr Gin Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu 100 105 110

Leu Val Asn Gin Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr 115 120 125

Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gin Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val 130 135 140

Ser Thr Thr Gin Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu 145 150 155 160

Ser Ala Pro Gin Ser Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp Val Val Asn Gin 165 170 175

Ala Val Asn Thr Ser Ala Pro Arg Met Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala 180 185 190

Vai Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp iTe Thr Asn Gin Leu 195 200 205

Thr Asn Vai Thr Vai Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Vai Tyr Pro His 210 215 220

Gin Ala Gly Tyr Vai Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Vai Pro Asn Ser 225 230 235 240

Ala Vai Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr Vai Pro Lys Glu Leu Asn 245 250 255

Leu Asn Gly Vai Thr Ser Thr Ala Lys Vai Pro Pro Ile Met Ala Gly 260 265 270

Asp Gin Vai Leu Ala Asn Gly Vai Ile Asp Ser Asp Gly Asn Vai Ile 275 280 285

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Vai Asn Thr Lys Asp Asp Vai Lys Ala Thr 290 295 300

Leu Thr Met Pro Ala Ala Ile Asp Pro Glu Asn Vai Lys Lys Thr Gly 305 310 315 320

Asn Vai Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys Thr 325 330 335

Vai Leu Vai Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser Ile 340 345 350

Lys Gly Thr Ile Asp Gin Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg Gin 355 360 365

Thr Ile Tyr Vai Asn Pro Ser Gly Asp Asn Vai Ile Ala Pro Vai Leu 370 375 380

Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp ser Asn Ala Leu ile Asp Gin 385 390 395 400

Gin Asn Thr ser ile Lys Vai Tyr Lys vai Asp Asn Ala Ala Asp Leu 405 410 415

Ser Glu Ser Tyr Phe vai Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp vai Thr Asn 420 425 430

Ser Vai Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gin Tyr Lys Vai Glu Phe 435 440 445

Asn Thr Pro Asp Asp Gin Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Vai Vai Vai Asn 450 455 460

Gly His ile Asp Pro Asn ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg ser Thr 465 470 475 480

Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp 485 490 495

Asn Glu vai Ala Phe Asn Asn Gly ser Gly ser Gly Asp Gly ile Asp 500 505 510

Lys Pro Vai Vai Pro Glu Gin Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro 515 520 525 ile Pro Glu 530

<210> 124 <211> 1596 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 124 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtagtgaaa atagtgttac gcaatctgat 60 agcgcaagta acgaaagcaa aagtaatgat tcaagtagcg ttagtgctgc acctaaaaca 120 gacgacacaa acgtgagtga tactaaaaca tcgtcaaaca ctaataatgg cgaaacgagt 180 gtggcgcaaa atccagcaca acaggaaacg acacaatcat catcaacaaa tgcaactacg 240 gaagaaacgc cggtaactgg tgaagctact actacgacaa cgaatcaagc taatacaccg 300 gcaacaactc aatcaagcaa tacaaatgct gaagaattag tgaatcaaac aagtaatgaa 360 acgactttta atgatactaa tacagtatca tctgtaaatt cacctcaaaa ttctacaaat 420 gcggaaaatg tttcaacaac gcaagatact tcaactgaag caacaccttc aaacaatgaa 480 tcagctccac agagtacaga tgcaagtaat aaagatgtag ttaatcaagc ggttaataca 540 agtgcgccta gaatgagagc atttagttta gcggcagtag ctgcagatgc accggcagct 600 ggcacagata ttacgaatca gttgacgaat gtgacagttg gtattgactc tggtacgact 660 gtgtatccac accaagcagg ttatgtcaaa ctgaattatg gtttttcagt gcctaattct 720 gctgttaaag gtgacacatt caaaataact gtacctaaag aattaaactt aaatggtgta 780 acttcaactg ctaaagtgcc accaattatg gctggagatc aagtattggc aaatggtgta 840 atcgatagtg atggtaatgt tatttataca tttacagact atgtaaatac taaagatgat 900 gtaaaagcaa ctttgaccat gcccgctgct attgaccctg aaaatgttaa aaagacaggt 960 aatgtgacat tggctactgg cataggtagt acaacagcaa acaaaacagt attagtagat 1020 tatgaaaaat atggtaagtt ttataactta tctattaaag gtacaattga ccaaatcgat 1080 aaaacaaata atacgtatcg tcagacaatt tatgtcaatc caagtggaga taacgttatt 1140 gcgccggttt taacaggtaa tttaaaacca aatacggata gtaatgcatt aatagatcag 1200 caaaatacaa gtattaaagt atataaagta gataatgcag ctgatttatc tgaaagttac 1260 tttgtgaatc cagaaaactt tgaggatgtc actaatagtg tgaatattac attcccaaat 1320 ccaaatcaat ataaagtaga gtttaatacg cctgatgatc aaattacaac accgtatata 1380 gtagttgtta atggtcatat tgatccgaat agcaaaggtg atttagcttt acgttcaact 1440 ttatatgggt ataactcgaa tataatttgg cgctctatgt catgggacaa cgaagtagca 1500 tttaataacg gatcaggttc tggtgacggt atcgataaac cagttgttcc tgaacaacct 1560 gatgagcctg gtgaaattga accaattcca gagtag 1596

<210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <22 0> <221 > MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Qualquer aminoácido <4 0 0> 125

Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5

<210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <4 0 0> 126

Thr Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Vai Asp 1 5

<210> 127 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <4 Ο 0> 127

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 15 10

<210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <4 0 0> 128

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Gly Ser 1 5 10

<210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido sintético <4 0 0> 129

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly 1 5 10

<210> 130 <211> 933 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <4 Ο 0> 130

Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile 15 10 15

Gly Val Ala Ser Vai Leu Vai Gly Thr Leu ile Gly Phe Gly Leu Leu 20 25 30

Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gin Ser Asp 35 40 45

Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala 50 55 60

Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80

Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gin Asn Pro Ala Gin Gin 85 90 95

Glu Thr Thr Gin Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro 100 105 110

Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gin Ala Asn Thr Pro 115 120 125

Ala Thr Thr Gin Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gin 130 135 140

Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val 145 150 155 160

Asn Ser Pro Gin Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gin 165 170 175

Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gin 180 185 190

Ser Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp Val Val Asn Gin Ala Val Asn Thr 195 200 205

Ser Ala Pro Arg Met Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala Vai Ala Ala Asp 210 215 220

Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gin Leu Thr Asn Vai Thr 225 230 235 240 val Gly ile Asp ser Gly Thr Thr vai Tyr Pro His Gin Ala Gly Tyr 245 250 255

Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly 260 265 270

Asp Thr Phe Lys ile Thr Val Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val 275 280 285

Thr ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala Gly Asp Gin Val Leu 290 295 300

Ala Asn Gly Val lie Asp Ser Asp Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr 305 310 315 320

Asp Tyr val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala Thr Leu Thr Met Pro 325 330 335

Ala Tyr ile Asp Pro Glu Asn Val Lys Lys Thr Gly Asn Val Thr Leu 340 345 350

Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys Thr Val Leu Val Asp 355 360 365

Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser Ile Lys Gly Thr Ile 370 375 380

Asp Gin ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg Gin Thr ile Tyr val 385 390 395 400

Asn Pro Ser Gly Asp Asn val ile Ala Pro Val Leu Thr Gly Asn Leu 405 410 415

Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu ile Asp Gin Gin Asn Thr Ser 420 425 430

Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala Asp Leu Ser Glu Ser Tyr 435 440 445

Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp val Thr Asn Ser Val Asn Ile 450 455 460

Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gin Tyr Lys Val Glu Phe Asn Thr Pro Asp 465 470 475 480

Asp Gin lie Thr Thr Pro Tyr lie vai vai vai Asn Gly His lie Asp 485 490 495

Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr 500 505 510

Asn ser Asn lie lie Trp Arg ser Met Ser Trp Asp Asn Glu vai Ala 515 520 525

Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly lie Asp Lys Pro vai vai 530 535 540

Pro Glu Gin Pro Asp Glu Pro Gly Glu lie Glu Pro lie Pro Glu Asp 545 550 555 560

Ser Asp Ser Asp Pro Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp 565 570 575

Ser Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Thr ser Asp Ser Gly Ser Asp 580 585 590

Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp 595 600 605

Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala ser Asp Ser Asp Ser Asp 610 615 620

Asn Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 625 630 635 640

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 645 650 655

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 660 665 670

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 675 680 685

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 690 695 700

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 705 710 715 720

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 725 730 735

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 740 745 750

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala 755 760 765

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 770 775 780

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 785 790 795 800

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp 805 810 815

Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp 820 825 830

Ser Asp Ser Asp Ser Ala ser Asp Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asp 835 840 845

Ser Ser ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asn ser Asp Ser Glu 850 855 860

Ser Gly Ser Asn Asn Asn Vai Vai Pro Pro Asn Ser Pro Lys Asn Gly 865 870 875 880

Thr Asn Ala Ser Asn Lys Asn Glu Ala Lys Asp Ser Lys Glu Pro Leu 885 890 895

Pro Asp Thr Gly Ser Glu Asp Glu Ala Asn Thr Ser Leu lie Trp Gly 900 905 910

Leu Leu Ala ser lie Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Arg Lys Lys Glu 915 920 925

Asn Lys Asp Lys Lys 930

<210> 131 <211> 2802 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <4 0 0> 131 atgaatatga agaaaaaaga aaaacacgca attcggaaaa aatcgattgg cgtggcttca 60 gtgcttgtag gtacgttaat cggttttgga ctactcagca gtaaagaagc agatgcaagt 120 gaaaatagtg ttacgcaatc tgatagcgca agtaacgaaa gcaaaagtaa tgattcaagt 180 agcgttagtg ctgcacctaa aacagacgac acaaacgtga gtgatactaa aacatcgtca 240 aacactaata atggcgaaac gagtgtggcg caaaatccag cacaacagga aacgacacaa 300 tcatcatcaa caaatgcaac tacggaagaa acgccggtaa ctggtgaagc tactactacg 360 acaacgaatc aagctaatac accggcaaca actcaatcaa gcaatacaaa tgcggaggaa 420 ttagtgaatc aaacaagtaa tgaaacgact tttaatgata ctaatacagt atcatctgta 480 aattcacctc aaaattctac aaatgcggaa aatgtttcaa caacgcaaga tacttcaact 540 gaagcaacac cttcaaacaa tgaatcagct ccacagagta cagatgcaag taataaagat 600 gtagttaatc aagcggttaa tacaagtgcg cctagaatga gagcatttag tttagcggca 660 gtagctgcag atgcaccggc agctggcaca gatattacga atcagttgac gaatgtgaca 720 gttggtattg actctggtac gactgtgtat ccgcaccaag caggttatgt caaactgaat 780 tatggttttt cagtgcctaa ttctgctgtt aaaggtgaca cattcaaaat aactgtacct 840 aaagaattaa acttaaatgg tgtaacttca actgctaaag tgccaccaat tatggctgga 900 gatcaagtat tggcaaatgg tgtaatcgat agtgatggta atgttattta tacatttaca 960 gactatgtaa atactaaaga tgatgtaaaa gcaactttga ccatgcccgc ttatattgac 1020 cctgaaaatg ttaaaaagac aggtaatgtg acattggcta ctggcatagg tagtacaaca 1080 gcaaacaaaa cagtattagt agattatgaa aaatatggta agttttataa cttatctatt 1140 aaaggtacaa ttgaccaaat cgataaaaca aataatacgt atcgtcagac aatttatgtc 1200 aatccaagtg gagataacgt tattgcgccg gttttaacag gtaatttaaa accaaatacg 1260 gatagtaatg cattaataga tcagcaaaat acaagtatta aagtatataa agtagataat 1320 gcagctgatt tatctgaaag ttactttgtg aatccagaaa actttgagga tgtcactaat 1380 agtgtgaata ttacattccc aaatccaaat caatataaag tagagtttaa tacgcctgat 1440 gatcaaatta caacaccgta tatagtagtt gttaatggtc atattgatcc gaatagcaaa 1500 ggtgatttag ctttacgttc aactttatat gggtataact cgaatataat ttggcgctct 1560 atgtcatggg acaacgaagt agcatttaat aacggatcag gttctggtga cggtatcgat 1620 aaaccagttg ttcctgaaca acctgatgag cctggtgaaa ttgaaccaat tccagaggat 1680 tcagattctg acccaggttc agattctggc agcgattcta attcagatag cggttcagat 1740 tcgggtagtg attctacatc agatagtggt tcagattcag cgagtgattc agattcagca 1800 agtgattcag actcagcgag tgattcagat tcagcaagcg attccgactc agcgagcgat 1860 tccgactcag acaatgactc ggattcagat agcgattctg actcagacag tgactcagat 1920 tccgacagtg actcagattc agatagcgat tctgactcag acagtgactc agattcagat 1980 agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg attccgactc agacagcgat 2040 tctgactccg acagtgattc cgactcagac agcgattcag attccgacag tgattccgac 2100 tcagatagcg attccgactc agatagcgac tcagattcag acagcgattc agattcagac 2160 agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg actcagattc cgacagtgac 2220 tcggattcag atagcgattc agattccgac agtgactcag attccgacag tgactcagac 2280 tcagacagtg attcggattc agcgagtgat tcggattcag atagtgattc cgactccgac 2340 agtgactcgg attcagatag cgactcagac tcggatagcg actcggattc agatagcgat 2400 tcggactcag atagcgattc agaatcagac agcgattcag aatcagacag cgattcagat 2460 tcagacagcg actcagacag tgactcagat tcagatagtg actcggattc agcgagtgat 2520 tcagactcag gtagtgactc cgattcatca "agtgattccg actcagaaag tgattcaaat 2580 agcgattccg agtcaggttc taacaataat gtagttccgc ctaattcacc taaaaatggt 2640 actaatgctt ctaataaaaa tgaggctaaa gatagtaaag aaccattacc agatacaggt 2700 tctgaagatg aagcaaatac gtcactaatt tggggattat tagcatcaat aggttcatta 2760 ctacttttca gaagaaaaaa agaaaataaa gataagaaat aa 2802

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 61219134 A [0001] • WO 2007113222 A [0004] • US 4708871 A[0041] • US 4673574 A [0052] • US 4902506 A [0052] • WO 2004083251 A [0055] • US 5254339 A [0073] [0100] • US 6165995 A [0073] • US 6610310 B [0073] • US 5723127 A [0098] • US 5078996 A [0098] • US 4912094 A [0099] • US 6113918 A [0099] • US 6299884 B [0100] • US 5057540 A [0100] • US 6207646 B [0100] • EP 1296713 A [0100] • EP 1326634 A [0100] • US 7285281 B [0100] • US 7332174 B [0100] • US 7361355 B [0100] • US 7384640 B [0100] • US 6149919 A [0100] • US 7115730 B [0100] • US 7291588 B [0100] • US 6008341 A [0101] • WO 9927109 A [0104] • US 6680195 B [0104] [0108] • WO 02102829 A [0113] • WO 05033148 A [0118] • WO 0056357 A [0118] • US 5801234 A [0124] • WO 2007127668 A [0145] • WO 2009109550 A [0148]

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Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma composição imunogénica que compreende: um polipéptido de fator de aglutinação A (ClfA) de S. aureus isolado, um polissacárido capsular de tipo 5 de S. aureus isolado, conjugado com CRMi97 e um polissacárido capsular de tipo 8 de S. aureus isolado, conjugado com CRMi97, em que o polissacárido de tipo 5 é um polissacárido capsular de elevada massa molecular de entre 70 e 300 kDa, e em que o polissacárido capsular de tipo 8 é um polissacárido capsular de elevada massa molecular de entre 70 e 300 kDa.
2. 2. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacárido capsular de tipo 5 de elevada massa molecular tem uma massa molecular de entre 70 e 150 kDa.
3. 3. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o polissacárido capsular de tipo 8 de elevada massa molecular tem uma massa molecular de entre 70 e 150 kDa.
4. 4. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, que compreende adicionalmente uma proteina MntC de S. aureus isolada.
5. 5. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, que compreende adicionalmente um polipéptido de fator de aglutinação B (ClfB) de S. aureus isolado.
6. 6. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o polipéptido de ClfA é um fragmento polipeptidico que compreende o dominio de ligação de fibrinogénio de ClfA.
7. 7. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 6, em que o fragmento polipeptídico de ClfA é um dominio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios Nl, N2 e N3 de ClfA ou em que o fragmento polipeptídico de ClfA é um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios N2 e N3 de ClfA.
8. 8. A composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7 em que o polipéptido de ClfB é um fragmento polipeptídico que compreende o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfB.
9. 9. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 8, em que o fragmento polipeptídico de ClfB é um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios Nl, N2 e N3 de ClfB ou em que o fragmento polipeptídico de ClfB é um domínio de ligação de fibrinogénio que compreende os domínios N2 e N3 de ClfB.
10. 10. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-9, em que o domínio de ligação de fibrinogénio de ClfA se liga ao fibrinogénio a um nível reduzido em comparação com a ligação observada ao fibrinogénio com o domínio de ligação de fibrinogénio nativo de ClfA.
11. 11. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 10, em que o polipéptido de ClfA tem uma substituição de aminoácidos num ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 ou Ile 387.
12. 12. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 11, em que a substituição de aminoácidos é para Ala ou Ser.
13. 13. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 12, em que o Tyr 338 é substituído por Ala.
14. 14. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-13, em que o polissacárido de tipo 5 é entre 10 % e 100 % O-acetilado, entre 50 e 100 % 0- acetilado ou entre 75 % e 100 % O-acetilado.
15. 15. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-14, em que o polissacárido de tipo 8 é entre 10 % e 100 % O-acetilado, entre 50 e 100 % 0- acetilado, ou entre 75 % e 100 % O-acetilado.
16. 16. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 4-15, em que a proteína MntC de S. aureus é uma proteína lipidada.
17. 17. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 4-15, em que a proteína MntC de S. aureus é uma proteína não lipidada.
18. 18. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-17, que compreende adicionalmente um adj uvante.
19. 19. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-18, que compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.
20. 20. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-19, que compreende adicionalmente um antigénio selecionado a partir do grupo que consiste em Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi, FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação a fibronectina (fnbA), proteína B de ligação a fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e as suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, recetores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína de ligação óssea II, precursor de aureolisina (AUR)/Seppl, Cna, e fragmentos dos mesmos como M55, TSST-1, mecA, exopolissacárido de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina Cl e nova autolisina.
21. 21. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-20 para utilização num método de induzir uma resposta imunitária contra Staphylococcus aureus.
22. 22. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 21, em que a resposta imunitária previne ou reduz uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em doença por S. aureus invasiva, sepse e estado de portador.
23. 23. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 21-22, em que a resposta imune induzida compreende a geração de anticorpos que têm atividade opsonofagocítica (OPA) contra S. aureus.
24. 24. A composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-20, para utilização num método para conferir imunidade passiva a um indivíduo que compreende as etapas de (1) gerar uma preparação de anticorpos utilizando as ditas composições imunogénicas; e (2) administrar a dita preparação de anticorpos ao indivíduo para conferir imunidade passiva.