ES2625979T3 - Tratamiento de infecciones - Google Patents

Abstract

Un factor A de aglutinación de proteína de unión al fibrinógeno recombinante (ClfA) o fragmento del mismo que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión al fibrinógeno, con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID nº. 1 a 3 o una secuencia aminoacídica al menos un 90 % idéntica a las SEQ ID nº. 1 a 3, donde el residuo aminoacídico D321 está sustituido con tirosina (D321Y) y P336 e Y338 está sustituido con serina o alanina para dar como resultado rClfA D321Y P336S Y338A o rClfA D321Y P336 A Y338S y la proteína recombinante tiene capacidad reducida o carece de la capacidad de unirse no covalentemente al fibrinógeno en comparación con la proteína no mutada o fragmento de la misma, estimula una mayor respuesta inmune a las infecciones por Staphylococci que la proteína ClfA de tipo silvestre.

Description

Tratamiento de infecciones

5 INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a una variante del factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento de la misma, donde se altera la capacidad para unir fibrinógeno en comparación con la proteína no mutada o fragmento de la misma. La presente invención también se refiere a vacunas antigénicas

10 microbianas mejoradas, composiciones farmacéuticas, composiciones inmunógenas y anticuerpos que comprenden la variante del factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento de la misma, y su uso en el tratamiento de infecciones microbianas de origen estafilocócico.

La resistencia a múltiples fármacos (MDR por sus siglas en inglés) es un problema creciente entre bacterias gram

15 positivas, particularmente en hospitales. El uso generalizado de antibióticos y otros agentes para tratar infecciones bacterianas ha conducido al rápido desarrollo de bacterias resistentes a los agentes y muchas bacterias tienen resistencia a múltiples fármacos. Por lo tanto, existe ahora la necesidad de proporcionar terapias mejoradas para tratar estas infecciones resistentes a fármacos.

20 Los estafilococos son bacterias gram positivas de forma esférica, normalmente dispuestas en racimos irregulares parecidos a uvas. Algunos son miembros de la flora normal de la piel y las membranas mucosas de los seres humanos, otros causan supuración, formación de abscesos, una diversidad de infecciones piógenas e incluso septicemia mortal. Los estafilococos patógenos suelen hemolizar la sangre, coagular el plasma y producir una diversidad de enzimas y toxinas extracelulares.

25 El género Staphylococcus tiene al menos 30 especies. Las tres principales especies de importancia clínica son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, y Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus es positivo a coagulasa, lo que lo diferencia de las demás especies. S. aureus es un patógeno importante para los seres humanos. Casi todas las personas tienen algún tipo de infección por S. aureus a lo largo de su vida, que varía

30 en gravedad desde la intoxicación alimentaria o infecciones cutáneas menores hasta infecciones graves que amenazan la vida. Los estafilococos negativos a coagulasa son flora humana normal que a veces causan infección, a menudo asociada con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, ancianos e inmunodeprimidos. Aproximadamente el 75 % de las infecciones causadas por estafilococos negativos a coagulasa se deben a S. epidermidis. Las infecciones debidas a Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis, y otras

35 especies son menos comunes. S. saprophyticus es una causa relativamente común de infecciones del tracto urinario en mujeres jóvenes. Los estafilococos producen catalasa, que los diferencia de los estreptococos.

S. lugdunensis también es relevante en un entorno clínico y está presente en aproximadamente el 5 al 10 % de los casos de endocarditis infecciosa.

40 La colonización de S. aureus del cartílago articular, del cual el colágeno es un componente principal, dentro del espacio articular, parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de la artritis séptica. La artritis bacteriana adquirida de forma hematógena sigue siendo un problema médico grave. Esta enfermedad de las articulaciones rápidamente progresiva y altamente destructiva es difícil de erradicar. Típicamente, menos del 50 % de los pacientes infectados se recuperan sin daños graves en las articulaciones. S. aureus es el patógeno

45 predominante aislado de pacientes adultos con osteomielitis hematógena y secundaria.

En los pacientes hospitalizados, las bacterias Staphylococcus, tal como S. aureus, son una causa principal de infección. Las infecciones localizadas iniciales de heridas o dispositivos médicos permanentes pueden conducir a infecciones invasivas más graves tales como septicemia, osteomielitis, mastitis y endocarditis. En las infecciones 50 asociadas con dispositivos médicos, las superficies de plástico y metal pueden quedar recubiertas de proteínas de plasma y matriz del huésped tales como fibrinógeno y fibronectina, poco después de la implantación. Esta capacidad de S. aureus y otras bacterias estafilocócicas para adherirse a estas proteínas es esencial para el inicio de la infección. Los injertos vasculares, los catéteres intravenosos, las válvulas cardiacas artificiales y los dispositivos de asistencia cardiaca son trombogénicos y propensos a la colonización bacteriana. De las bacterias estafilocócicas, S.

55 aureus es generalmente el patógeno más dañino de tales infecciones.

Se ha observado un aumento significativo en aislados de S. aureus que presentan resistencia a la mayoría de los antibióticos actualmente disponibles para tratar infecciones en hospitales en todo el mundo. El desarrollo de la penicilina para combatir S. aureus fue un gran avance en el control y tratamiento de infecciones. 60 Desafortunadamente, surgieron rápidamente organismos resistentes a la penicilina y fue primordial la necesidad de

nuevos antibióticos. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, S. aureus ha podido contrarrestar con βlactamasas, proteínas de unión a la penicilina alteradas y proteínas de la membrana celular mutadas que permiten que la bacteria persista. En consecuencia, han surgido S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) y organismos resistentes a múltiples fármacos que se han instalado firmemente en hospitales y hogares de ancianos de todo el

5 mundo (Chambers, H.F., Clin Microbiol Rev, 1:173, 1988; y Mulligan, M.E., et al., Am J Med, 94:313, 1993). Hoy en día, casi la mitad de las cepas estafilocócicas que causan infecciones nosocomiales son resistentes a todos los antibióticos, excepto a la vancomicina, y parece ser solo cuestión de tiempo que la vancomicina también se vuelva ineficaz.

10 Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad muy fuerte y rápidamente creciente de agentes terapéuticos para tratar infecciones de estafilococos tales como S. aureus, que son eficaces contra cepas resistentes a antibióticos de las bacterias.

En patógenos grampositivos, tales como Staphylococcus, Streptococci y Enterococci, las proteínas, denominadas

15 adhesinas, median estas infecciones, por ejemplo promoviendo la colonización, la unión a coágulos sanguíneos y tejido traumatizado. Estas adhesinas superficiales microbianas específicas se denominan MSCRAMM (componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas de matriz adhesiva) (Patti, J., et al., Ann Rev Microbiol, 48: 585617, 1994; Patti, J. y Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6: 752-758, 1994). Los MSCRAMM reconocen y se unen específicamente a componentes de matriz extracelular (ECM), tales como fibronectina, fibrinógeno, colágeno y

20 elastina. Estos MSCRAMM se encuentran en muchos patógenos grampositivos y sus secuencias aminoacídicas están relacionadas, tienen un diseño modular similar y organización del dominio de unión común.

Los MSCRAMM sobre la superficie de la célula bacteriana y los ligandos dentro del tejido huésped interactúan de una forma de llave y cerradura dando como resultado la adherencia de bacterias al huésped. La adhesión es a

25 menudo necesaria para la supervivencia bacteriana y ayuda a las bacterias evadir los mecanismos de defensa del huésped y los desafíos de los antibióticos. Una vez que las bacterias se han adherido y han colonizado con éxito tejidos del huésped, su fisiología se altera drásticamente y los componentes perjudiciales tales como toxinas y enzimas, se secretan. Además, las bacterias adherentes a menudo producen una biopelícula y rápidamente se vuelven resistentes al efecto destructivo de la mayoría de los antibióticos.

30 Una bacteria puede expresar MSCRAMM que reconocen una diversidad de proteínas de matriz. Los sitios de unión a ligandos en MSCRAMM parecen estar definidos por tramos contiguos relativamente cortos de secuencias de aminoácidos (motivos). Debido a que un motivo similar se puede encontrar en varias especies diferentes de bacterias, parece que estos motivos funcionales se someten a la transferencia entre especies (Patti y Hook, Cur

35 Opin Cell Biol, 6: 752-758, 1994). Además, un único MSCRAMM a veces puede unirse a varios ligandos de ECM.

Los MSCRAMM pueden mediar la infección por la unión a proteínas, incluyendo fibrinógeno (Fg) y/o fibronectina (Fn), etc. El fibrinógeno y la fibronectina son proteínas que se encuentran en el plasma sanguíneo y desempeñan un papel clave en la hemostasia y la coagulación.

40 El fibrinógeno está compuesto por seis cadenas polipeptídicas, dos Aα, dos Bβ y dos cadenas γ. La parte C-terminal de la cadena γ es biológicamente importante e interactúa con la integrina plaquetaria durante la adherencia y agregación plaquetarias. Es esta región contra la que también se dirige el Staphylococcus aureus, dando como resultado la aglutinación celular dependiente del fibrinógeno y la adherencia tisular.

45 Staphylococcus aureus tiene varias proteínas expresadas en superficie que estimulan la activación y la agregación de plaquetas. Las proteínas MSCRAMM de Staphylococcus aureus incluyen, pero sin limitación, las siguientes:

• Factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno; 50 • Factor B de aglutinación (ClfB) de la proteína de unión al fibrinógeno;

•

Proteína A de unión a fibronectina-fibrinógeno (FnBPA);

•

Proteína B de unión a fibronectina-fibrinógeno (FnBPB);

•

Proteínas de superficie de S. aureus SasA, SasG, SasK, etc.

55 La Tabla 1 a continuación expone sucintamente una selección de diversas proteínas de superficie ancladas a la pared celular de Staphylococcus aureus.

TABLA 1

Proteína de superficie

aaa Ligando(s)b Motivoc Sortasad

Proteína A (Spa)

508 Inmunoglobulina, factor von Willebrand, TNFRe LPETG A

Proteína A de unión a fibronectina (FnbpA);

1.018 Fibronectina, fibrinógeno, elastina LPETG A

Proteína B de unión a fibronectina (FnbpB);

914 Fibronectina, fibrinógeno, elastina LPETG A

Factor A de aglutinación (ClfA)

933 Fibrinógeno, factor I de complemento LPDTG A

Factor B de aglutinación (ClfB)

913 Fibrinógeno, citoqueratina 10 LPETG A

Adhesión de colágeno (Cna)

1.183 Colágeno LPKTG A

SdrC

947 Desconocido LPETG A

SdrD

1.315 Desconocido LPETG A

SdrE

1.166 Desconocido LPETG A

Pls

1.637 Desconocido LPDTG A

SasA

2.261 Desconocido LPDTG A

SasB

937 Desconocido LPDTG A

SasC

2.186 Desconocido LPNTG A

SasD

241 Desconocido LPAAG A

SasE/IsdA

354 Hemof LPKTG A

SasF

637 Desconocido LPKAG A

SasG/Aap

1.117 Desconocidog LPKTG A

SasH

308 Desconocido LPKTG A

SasI/HarA/IsdH

895 Haptoglobina LPKTG A

SasJ/IsdB

645 Hemoglobina, hemo LPQTG A

SasK

211 Desconocido LPKTG A

IsdC

227 Hemo NPQTN B

aaa, longitud de proteína en aminoácidos. bComponente(s) molecular(es) reconocido(s) y unido(s) por proteína. cMotivo consenso reconocido por sortasa y presente en la señal de clasificación de la pared celular C-terminal. dSortasa para la cual la proteína de superficie de pared celular es un sustrato.eTNFR, receptor del factor de necrosis tumoral ftambién se une a proteínas en células epiteliales descamadas. Promueve la resistencia a los lípidos bactericidas y a la lactoferrinagtambién se une a las células epiteliales nasales descamadas. Implicado en la formación de biopelícula.

El factor A de aglutinación (ClfA) fue la primera adhesina de S. aureus de unión a la cadena γ de fibrinógeno identificada. El factor A de aglutinación (ClfA) es una superficie situada en la proteína de Staphylococcus 5 aureus. ClfA es un importante factor de virulencia de S. aureus. Contribuye a la patogénesis de la artritis séptica y la endocarditis. ClfA contiene un dominio A N-terminal de 520 aminoácidos (la región de unión a fibrinógeno), que comprende tres subdominios plegados por separado N1, N2 y N3. El dominio A va seguido de una región de repetición de dipéptido de serina-aspartato y una región que abarca la pared y la membrana celular, que contiene el motivo LPDTG para el anclaje promocionado por sortasa a la pared celular. ClfA está presente en prácticamente 10 todas las cepas de S. aureus (Peacock SJ, Moore CE, Justice A, Kantzanou M, Story L, Mackie K, O'Neill G, Day NPJ (2002) Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus. Infect Immun 70: 4987-4996). Se une al extremo C de la cadena γ de fibrinógeno, y es así capaz de inducir la aglutinación de bacterias en la solución de fibrinógeno (McDevitt D, Nanavaty T, House-Pompeo K, Bell E, Turner N, McEntire L, Foster T, Höök M (1997) Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor 15 (ClfA) and fibrinogen. Eur J Biochem 247:416-424 y McDevitt D, Francois P, Vaudaux P, Foster TJ (1994) Molecular

characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 11: 237-248).

El análisis estructural tridimensional de ClfA y las proteínas de unión a fibrinógeno relacionadas SdrG y ClfB ha

revelado que el dominio A de unión a ligando en todas estas proteínas relacionadas está compuesto por tres 20 subdominios N1, N2 y N3, siendo los residuos 221-559 correspondientes a las Regiones N2-N3 el truncamiento más

pequeño que conserva la capacidad de unirse al fibrinógeno. Se ha encontrado que los residuos de aminoácidos 532 a 538 corresponden a la región peptídica de retención de ClfA. Cada subdominio comprende nueve cadenas β que forman un nuevo pliegue de tipo IgG. El sitio de unión al péptido de la cadena γ del fibrinógeno en estas proteínas está situado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3. Se ha encontrado que existe una similitud

5 estructural significativa entre la estructura tridimensional de estas proteínas, esto se debe a una o más de la secuencia de aminoácidos relacionada, un diseño modular similar y una organización de dominio de unión común.

La expresión de ClfA en S. aureus dificulta la fagocitosis tanto por los macrófagos como por los neutrófilos (Palmqvist N, Patti JM, Tarkowski A, Josefsson E (2004) Expression of staphylococcal clumping factor A impedes 10 macrophage phagocytosis. Microb Infect 6:188-195 and Higgins J, Loughman A, van Kessel KPM, van Strijp JAG, Foster TJ (2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes. FEMS Microbiol Lett 258: 290-296). En los neutrófilos esto se debe tanto a un mecanismo dependiente del fibrinógeno como a un mecanismo independiente del fibrinógeno. Por el contrario, las plaquetas se activan por bacterias que expresan ClfA a través de su interacción con GPIIb/IIIa que conduce a la agregación. Esto se ejecuta 15 más eficientemente cuando el fibrinógeno está presente, pero también hay una ruta independiente del fibrinógeno para la activación plaquetaria (Loughman A, Fitzgerald JR, Brennan MP, Higgins J, Downer R, Cox D, Foster TJ (2005) Roles of fibrinogen, immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A. Mol Microbiol 57: 804-818 y O'Brien L, Kerrigan SW, Kaw G., Hogan M., Penadés J., Litt D., Fitzgerald D.J., Foster T.J. & Cox D. (2002) Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation

20 by Staphylococcus aureus: roles for the clumping factors ClfA and ClfB, the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A. Mol Microbiol 44, 1033-1044).

ClfA es un factor de virulencia para la inducción de artritis séptica en ratones (Josefsson E., Hartford O., O'Brien L, Patti JM, Foster T (2001) Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with 25 clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 184: 1572-1580). Además, la eliminación de ClfA junto con otra proteína de unión al fibrinógeno ClfB protegió contra la inflamación sistémica en las primeras etapas de la infección (Palmqvist N, Foster T, Fitzgerald R, Josefsson E, Tarkowski A (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. J Inf Dis

191: 791-798).

30 La proteína de unión al fibrinógeno de Staphylococcus aureus ClfA se ha aislado y caracterizado y es el objeto de, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 6.008.341 y 6.177.084. ClfA y ClfB tienen una organización estructural (tridimensional) idéntica y aproximadamente un 27 % de identidad de aminoácidos. FnBPA tiene aproximadamente un 25 % de identidad de aminoácidos con respecto a ClfA. Josefsson E, et al (2008) "Fibrinogen

35 Binding Sites P336 and Y338 of Clumping Factor A Are Crucial for Staphylococcus aureus Virulence". PLoS ONE 3(5): e2206 estudian ClfA en el que P336 e Y338 únicamente se cambiaron a serina y alanina respectivamente.

En la actualidad no hay vacunas basadas en MSCRAMM aprobadas ni en el mercado. Veronate®, un grupo de inmunoglobulina humana estafilocócica seleccionada por donante intravenosa (IGIV), dirigida contra ClfA y SdrG,

40 tuvo un mal rendimiento en ensayos clínicos de fase III y se retiró de los ensayos. Actualmente se está reevaluando determinar si es un tratamiento viable para infecciones estafilocócicas. Por lo tanto, teniendo en cuenta la prevalencia de la resistencia a múltiples fármacos en bacterias gram positivas y la falta de terapias y vacunas con éxito para estas bacterias resistentes a múltiples fármacos, las terapias alternativas que pueden tratar con tales infecciones bacterianas sin el uso de antibióticos serán de valor significativo.

45 Además, una mejora en la eficacia sobre cualquier tratamiento o vacunas conocidos será de particular importancia, especialmente en un entorno clínico.

Por lo tanto, la presente invención está dirigida a proporcionar un factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión 50 a fibrinógeno recombinante mejorado, idealmente para su uso en la terapia de infecciones bacterianas.

ESTADO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un factor A de aglutinación de proteína de unión

55 al fibrinógeno recombinante (ClfA) o fragmento del mismo que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión al fibrinógeno, con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID n.º 1 a 3 o una secuencia aminoacídica al menos un 90 % idéntica a las SEQ ID Nos. 1 a 3, donde el residuo aminoacídico D321 está sustituido con tirosina (D321Y) y P336 e Y338 está sustituido con serina o alanina para dar como resultado rClfA D321Y P336S Y338A o rClfA D321Y P336 A Y338S Y338S y la proteína recombinante tiene

60 capacidad reducida o carece de la capacidad de unirse no covalentemente al fibrinógeno en comparación con la

proteína no mutada o fragmento de la misma, estimula una mayor respuesta inmune a las infecciones por Staphylococci que la proteína ClfA de tipo silvestre. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una proteína de unión al fibrinógeno recombinante, o fragmento de la misma, de la invención para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones microbianas, incluyendo sepsis, artritis séptica y/o endocarditis,

5 preferentemente causadas por Staphylocci.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona el uso de la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección microbiana, preferentemente causada por Staphylocci.

10 De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico, una proteína de fusión, un vector de expresión o una célula huésped que expresa la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención.

15 De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona una vacuna que comprende la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención.

De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo contra la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención, preferentemente en forma de suero hiperinmune.

20 De acuerdo con un séptimo aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica inmunógena que comprende la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

25 De acuerdo con un octavo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunógena que comprende la etapa de añadir el excipiente farmacéuticamente aceptable a la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

30 En esta memoria descriptiva, se entenderá que los términos "adhesina", "MSCRAMM" y la expresión "proteínas ancladas a la pared celular" son intercambiables e incluyen todas las proteínas de unión al ligando derivadas de microbios. Idealmente, estas proteínas se unen a fibrinógeno, hemo o hemoglobina, haptoglobina-hemoglobina, hemina, colágeno y otros de dichos ligandos. La expresión proteínas "tipo MSCRAMM" pretenden incluir proteínas o

35 adhesinas que tienen secuencias de aminoácidos relacionadas, un diseño modular similar y/o una organización del dominio de unión común/similar a dichas proteínas MSCRAMM, tales como proteínas de Isd. Idealmente, las proteínas de tipo MSCRAMM tienen una organización de dominio de unión/diseño modular similar. Adicionalmente, las proteínas de tipo MSCRAMM pueden tener al menos un 50 %, preferentemente un 60 %, preferentemente un 75 %, más preferentemente un 85 %, aún más preferentemente un 95 %, aún más preferentemente un 99 % o más de

40 identidad de secuencia de aminoácidos con las proteínas MSCRAMM. Cualquier referencia en el presente documento a MSCRAMM se entenderá que es intercambiable con el factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión a fibrinógeno recombinante.

También se entenderá que cualquiera de los porcentajes de identidades u homologías a los que se hace referencia 45 en la memoria descriptiva se determinan usando los procedimientos convencionales disponibles en toda la longitud de la secuencia.

El término "microorganismo", "microbio", "microbiano" o similar, incluye, pero sin limitación, organismos que incluyen bacterias, hongos, virus, levaduras y/o mohos.

50 La expresión "cantidad inmunológicamente eficaz" incluye las cantidades que son capaces de estimular una respuesta de linfocitos B y/o linfocitos T.

Se entenderá que el factor A de aglutinación de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante mejorado, o 55 fragmento del mismo, de la invención tiene una capacidad reducida o carece de la capacidad para unirse no covalentemente al fibrinógeno en comparación con la proteína de tipo silvestre o no mutada.

También se entenderá que el fragmento del factor A de aglutinación de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante tiene sustancialmente la misma actividad inmunógena que la proteína de longitud completa. De esta 60 manera, el fragmento es capaz de provocar una respuesta inmune similar a la de la proteína de longitud completa.

También se entenderá que el factor A de aglutinación de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo, está mutado o alterado, es decir, experimenta una sustitución, inserción, deleción o adición de nucleótidos o aminoácidos en el residuo de interés, o adyacente al residuo de interés. El término "adyacente"

5 pretende incluir un residuo de aminoácido inmediatamente adyacente o a una distancia de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en cualquier lado (N o C-terminal) al aminoácido de interés.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, el factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de la reivindicación 1 tiene capacidad reducida o carece de la

10 capacidad para unirse no covalentemente al fibrinógeno.

La unión al fibrinógeno se puede medir fácilmente usando técnicas convencionales usadas en los Ejemplos. Se ha encontrado que la variante del factor de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de la invención tiene una capacidad alterada para unirse al fibrinógeno en comparación con

15 una proteína no mutada o de tipo silvestre o fragmento de la misma.

Se ha establecido que los residuos aminoacídicos 221 a 559, que incluyen las regiones N2 y N3, de ClfA desempeñan un papel importante en la unión al fibrinógeno y son la región de unión al fibrinógeno mínima. Se ha encontrado inesperadamente que la mutación de residuos de aminoácidos en esta región da como resultado una

20 proteína expresada que puede reconocerse por las defensas inmunitarias del huésped pero carece de unión al fibrinógeno y, por lo tanto, reduce la virulencia asociada. Esta región (el dominio de unión al fibrinógeno de 339 aminoácidos) de ClfA tiene una estructura tridimensional específica, un denominado pliegue de IgG de la variante DE, y es el truncamiento de unión a Fg mínimo que si se altera (a través de sustitución o deleción, etc.) puede proporcionar una terapia mejorada.

25 La alteración para dar como resultado la pérdida de la actividad de unión al fibrinógeno puede tener lugar por sustitución, adición o inserción o deleción en los nucleótidos o los aminoácidos. Idealmente, la sustitución afecta negativamente a la estructura tridimensional (por ejemplo. del denominado pliegue de IgG de la variante DE) de la proteína o fragmento de modo que ya no puede unirse al fibrinógeno. Idealmente, la sustitución de nucleótidos o

30 aminoácidos reduce la interacción no covalente con fibrinógeno, preferentemente impidiendo la unión del ligando al bolsillo hidrófobo que separa N2 y N3 de la Región A de la proteína de unión al fibrinógeno. Como alternativa, la región del péptido de retención correspondiente a los aminoácidos 532 a 538 puede alterarse por sustitución o suprimirse para evitar la unión al ligando. Adicionalmente, puede usarse un truncamiento/fragmento que carece de la región peptídica de retención y, opcionalmente, el resto de los residuos de la proteína C-terminal, es decir, que

35 carece de los residuos aminoacídicos 532 a 559. El sitio de unión al péptido de la cadena γ del fibrinógeno está situado en un surco hidrófobo en la unión entre N2 y N3 de ClfA. Por lo tanto, las sustituciones o deleciones mencionadas anteriormente están diseñadas para alterar la interacción proteínas MSCRAMM-ligando y prevenir la unión no covalente de ClfA al fibrinógeno.

40 Por lo tanto, se ha encontrado que al alterar el factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de esta manera, es posible proporcionar una proteína de unión al ligando sin la capacidad de unirse a su ligando, lo que estimula una mayor respuesta inmune tras la inmunización que la proteína de tipo silvestre. Esto reduce la inflamación sistémica, disminuyendo así la virulencia microbiana. En consecuencia, este ClfA de unión al ligando alterado o proteína tipo ClfA que carece de la capacidad de unirse a su ligando, se

45 puede utilizar ventajosamente en el tratamiento de las infecciones microbianas.

Adicionalmente, se ha encontrado sorprendentemente que la alteración del residuo de aminoácido D321 específico con respecto a tirosina, proporciona una proteína más estable en comparación con otras variantes de proteína. Como se muestra en el Ejemplo 4, la proteína ClfA D321YP336SY338A (mutante triple) es más fácil de purificar que

50 ClfA P336SY338A sin la mutación D321.

Estos hallazgos presentan una nueva y valiosa vacuna/inmunización terapéutica frente a infecciones bacterianas que proporciona mejores resultados cuando se compara con una vacuna o inmunización terapéutica derivada de la proteína de tipo silvestre.

55 ClfA es una proteína de 993 aminoácidos, que comprende un dominio de unión a fibrinógeno de 520 aminoácidos (de los aminoácidos 40 a 559). Este dominio de unión al fibrinógeno es el dominio A del extremo N que comprende las subregiones N1, N2 y N3. Se entenderá que toda la región de fibrinógeno que abarca N1 a N3 desde el aminoácido 40 hasta el aminoácido 559, se puede usar en la invención. Como alternativa, se puede usar un

60 truncamiento de la región N1 a N3, por ejemplo, 221 a 559 (la región mínima de unión al fibrinógeno). Idealmente,

pueden usarse las subregiones N2 y N3, la región mínima de unión al fibrinógeno, que corresponden a los residuos de aminoácidos 221 a 559. Como alternativa, se puede usar un fragmento de estas subregiones.

Se establece que la primera etapa en la unión de un MSCRAMM a su ligando implica una interacción no covalente a

5 través del modelo DLL. Estas son las principales interacciones no covalentes de MSCRAMM con el ligando. Las fases finales en la unión al ligando de MSCRAMM implican interacciones covalentes. El modelo DLL fue elucidado a partir de la estructura tridimensional de SdrG en complejo con su ligando. Ahora se ha demostrado que ClfA actúa por una menor variación del mecanismo de DLL (Ganech et al (2008) "A structural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics". PloS

10 Pathog 4(11); e1000226). El modelo DLL se refiere específicamente a las interacciones no covalentes implicadas en la unión al ligando.

Se ha encontrado que la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de la invención, ha reducido o carece de la capacidad de unirse no covalentemente a su ligando huésped debido a una acoplamiento, bloqueo y retención

15 alterados. Una o más de las etapas de acoplamiento, bloqueo o retención pueden alterarse. Por lo tanto, se postula que, de acuerdo con la invención, la unión no covalente que tiene lugar durante la unión, a través de acoplamiento, bloqueo y retención (DLL), de la proteína MSCRAMM o la proteína tipo MSCRAMM (es decir, ClfA) a su ligando puede ser reducida o puede prevenirse.

20 En relación con los MSCRAMM ClfA/ClfB en particular, se ha encontrado que el dominio de unión al ligando mínimo comprende las subregiones N1 a N3 de la Región A, específicamente las subregiones N2 y N3 que comprenden un pliegue de Ig de la variante Dev-IgG. El pliegue de Ig de la variante Dev-IgG es una nueva variante del motivo de inmunoglobulina también denominada variante DE. Se postula que un bolsillo hidrófobo formado entre los dos dominios DEv-IgG de ClfA/B es el sitio de unión al ligando para la cadena γ de fibrinógeno. Esencialmente, el

25 ligando se une a la ranura hidrófoba que separa N2 y N3. Específicamente, durante la unión al ligando, el componente peptídico desplegado del ligando se inserta en la ranura situada entre los subdominios N2 y N3. El péptido de retención en el extremo C del subdominio N3 experimenta un cambio conformacional e inserta entre dos cadenas beta en el subdominio N2, bloqueando así el ligando en su lugar. De hecho, la sustitución mutagénica de los residuos Tyr256, Pro336, Tyr338 y Lys389 en el factor de aglutinación, que se propone poner en contacto con los

30 residuos terminales 408AGDV411 de la cadena γ de fibrinógeno, dio como resultado proteínas sin ninguna afinidad o notablemente reducida para el fibrinógeno.

Se entenderá que se puede usar la proteína de unión al ligando completa, el dominio de unión al ligando, el dominio de unión al ligando mínimo o un fragmento de la misma. El uso de proteínas truncadas de la proteína de unión al 35 ligando, tal como el dominio de unión al ligando, el dominio de unión al ligando mínimo, o el uso de fragmentos de las mismas es ventajoso para facilitar la fabricación y superación de otros problemas, tales como la escisión no deseada de la proteína. Por ejemplo, el péptido de retención, presente en el dominio de unión al ligando mínimo, puede eliminarse/retirarse o alterarse. Por ejemplo, el péptido de retención en ClfA corresponde a los aminoácidos de la Región A 532 a 538. Estos residuos pueden alterarse, sustituirse o eliminarse/retirarse para evitar que el 40 ligando se una al MSCRAMM a través de DLL. De esta manera se evita la "retención" de DLL del MSCRAMM a su ligando. Esta "retención" se produce por medio de una interacción no covalente. En una realización, el péptido de retención se elimina en su totalidad junto con los residuos de aminoácidos C-terminales de la Región A restantes. De acuerdo con otra realización, la región peptídica de retención solamente se elimina. De acuerdo con otra realización más, la región peptídica de retención experimenta una sustitución aminoacídica para dar como resultado la

45 reducción o prevención de la unión/retención al ligando.

Además, dichas alteraciones en el dominio de unión al ligando pueden tener lugar a nivel de aminoácidos, mediante sustitución o deleción de aminoácidos, utilizando la proteína de longitud completa, el dominio de unión al ligando, el dominio de unión al ligando mínimo o fragmento de los mismos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas 50 o fragmentos de las mismas con homología suficientemente alta a la proteína de unión al ligando. La alta homología como se define en el presente documento se produce cuando al menos el 50 %, preferentemente el 60 %, preferentemente el 70 %, preferentemente el 80 %, más preferentemente el 90 %, aún más preferentemente el 95 %, aún más preferentemente del 95 % al 99 % y aún más preferentemente el 99 % o más de los nucleótidos coinciden en toda la longitud de la secuencia de ADN o cuando se usan en relación con las secuencias

55 aminoacídicas cuando las secuencias aminoacídicas no son idénticas pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estos comentarios sobre la alta homología también pueden estar relacionados con la estructura tridimensional de la proteína, es decir, la organización del dominio de unión modular.

Se entenderá que la proteína de unión al fibrinógeno recombinante puede comprender opcionalmente además una o 60 más sustituciones de residuos de nucleótidos o aminoácidos, mutaciones puntuales, inserciones, deleciones o

adiciones en la región de unión al fibrinógeno.

La elección de residuos se basó en la estructura cristalina de rayos X de ClfA y la observación de que los cambios individuales en la prolina o la tirosina reducían la afinidad de unión. Sorprendentemente, se encontró que esta

5 proteína ClfA mutante (rClfA D321Y P336 S Y338A y rClfA P336 A Y338S) estimuló una respuesta inmune y se puede utilizar en la generación de una vacuna o terapia de anticuerpos mucho más eficaz. Esta sustitución puede tener lugar en la proteína de unión al fibrinógeno de longitud completa, la región de unión al fibrinógeno, la región mínima de unión al fibrinógeno, o un fragmento de la misma.

10 Las siguientes secuencias descritas en la tabla a continuación se pueden usar de acuerdo con la invención.

SEQ ID No

Descripción Longitud Región A

1

Secuencia de aa de longitud completa de rClfA wt (Ejemplo 1) 933 aa -

2

Secuencia de ADN de longitud completa de la Región A de rClfA wt (Ejemplo 1) 1560 nucleótidos N1 a N3

3

Secuencia de aa de longitud completa de la Región A de rClfA wt (Ejemplo 1) 520 aa N1 a N3

4

Región A de rClfAPYI (Ejemplo 1) 520 aa N1 a N3

5

Región A de rClfAPYII (Ejemplo 1) 520 aa N1 a N3

6

Secuencia de aa de longitud completa de la Región A de rClfA wt con residuos de los extremos N y C adicionales1 (Ejemplo 2) 530 aa N1 a N3

7

Región A de rClfAPYI A con residuos de los extremos N y C adicionales1 (Ejemplo 1) 530 aa N1 a N3

8

Región A de rClfAPYII con residuos de los extremos N y C adicionales 530 aa N1 a N3

9

rClfA 221-559 (Ejemplo 2) 339 aa N2 y N3

10

rClfA 221-559 con residuos de los extremos N y C adicionales1 (Ejemplo 2) 349 aa N2 y N3

11

rClfA 221-531 (truncamiento de retención delta) con residuos de los extremos N y C adicionales2 (Ejemplo 2) 321 aa N2 y N33

1 Los residuos de N adicionales (extensión N-terminal (6 x etiqueta His y residuos adicionales) comprenden 6 residuos His seguidos de Gly y Ser. Los residuos C terminales adicionales comprenden Lys seguido de Leu (pueden usarse otros residuos N y C terminales adicionales -dependiendo del cebador usado o las etiquetas N/C terminales requeridas)2 Los residuos de N adicionales (6 x etiqueta His y residuos adicionales) comprenden 6 residuos His seguidos de Gly y Ser. Los residuos C terminales adicionales comprenden Arg seguido de Ser (pueden usarse otros residuos N y C terminales adicionales -dependiendo del cebador usado o las etiquetas N/C terminales requeridas)) 3 sin el péptido de bloqueo correspondiente a los residuos de aa 532 a 538 y los residuos Cterminales de la Región A restantes, es decir, que carecen de los residuos aminoacídicos 532 a 559.

Como alternativa, el fragmento de la proteína de unión al fibrinógeno estafilocócico recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID No: 4 a la SEQ ID No: 11. Las SEQ ID No: 4 y 15 5 corresponden al dominio A de ClfA N1, N2 , N3 solamente, rClfA D321Y P336S Y338A y rClfA P336A Y338S, respectivamente, como se expone sucintamente en la tabla anterior.

También se postula, en base a las sustituciones en la retención que se realizaron en SdrG, que las sustituciones en la retención que son defectuosas en el cambio conformacional o en la complementación de la cadena beta también 20 serán defectuosas en la unión al ligando. Por lo tanto, idealmente, las sustituciones están en los residuos de aminoácidos 532 a 538 que corresponden al péptido de retención y afectan a la capacidad del péptido de experimentar un cambio conformacional, o de unirse al ligando o ambos. Como alternativa, la alteración puede comprender la eliminación de los residuos de aminoácidos 532 a 538 (péptido de retención delta) en conjunto, para dar resultados similares. Adicionalmente, un mutante de truncamiento C-terminal que carece de los residuos

aminoacídicos 532 a 559 (incluyendo los residuos peptídicos de retención) también realizará la unión al ligando.

Sin embargo, también se contemplará que pueden sustituirse otros residuos de aminoácidos distintos de los específicamente citados anteriormente. Por ejemplo, Glu 526, Val 527, Tyr 256 y Lys 389 pueden estar sustituidos 5 para alterar las propiedades de unión al fibrinógeno de la proteína o fragmento de la misma. Por lo tanto, puede contemplarse cualquier sustitución que reduzca la capacidad de unión. Idealmente, tales sustituciones o deleciones afectan al bolsillo hidrófobo y el mecanismo asociado para unir el ligando en la zanja hidrófoba tal como los homólogos Val527 en ClfA y N526 en ClfB. En ClfB, se han estudiado Q235 y N526 para demostrar que reducen la unión. Un estudio similar se realizó con FnBPA, donde se demostró que N304 y F306 son importantes para la unión

10 a Fg. Por lo tanto, las mutaciones en estos residuos de aminoácidos afectarán a la unión al ligando. Por lo tanto, de acuerdo con una realización adicional de este aspecto de la invención, la proteína de unión al fibrinógeno recombinante puede comprender además la sustitución de aminoácidos donde los restos aminoacídicos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 están sustituidos con Ala o Ser.

15 Se entiende que todas las proteínas de la familia Clf-Sdr se unen a ligandos por el modelo DLL. Mediante el modelado de la estructura tridimensional, es posible predecir el péptido de retención y hacer un truncamiento que carezca de este, ya sea en longitud completa (N1 a N3) o el truncamiento de unión a ligando mínimo N2-N3, o un fragmento de los mismos.

20 Se encontró que estas proteínas rClfA de sustitución (ya sean mutantes de deleción, sustituciones o truncamientos) redujeron la virulencia y el desenlace de la enfermedad, y sorprendentemente indujeron menos inflamación sistémica que la proteína de tipo silvestre.

Por lo tanto, se espera que la inmunización con estas proteínas mutantes, basada en las proteínas ensayadas,

25 mejore el nivel de anticuerpos que reconocen tanto la proteína mutante como de tipo silvestre y que proporcionen una respuesta inmune mayor que la proteína de tipo silvestre.

Se entenderá que la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócico recombinante, o fragmento de la misma, de la invención puede usarse en el tratamiento de infecciones microbianas, preferentemente infecciones estafilocócicas

30 tales como en el tratamiento de sepsis, artritis séptica y/o endocarditis, u otras afecciones o patologías similares.

La región de unión al fibrinógeno de la proteína se altera de manera que ya no se una al fibrinógeno. Como se ha indicado anteriormente, la alteración puede tener lugar a nivel de los nucleótidos o los aminoácidos. Se entenderá que pueden usarse también proteínas o fragmentos de las mismas con homología suficientemente alta a la proteína

35 de unión al fibrinógeno. La alta homología como se define en el presente documento, se produce cuando al menos 90 de los nucleótidos coinciden en toda la longitud de la secuencia de ADN o cuando se usan en relación con las secuencias aminoacídicas cuando las secuencias aminoacídicas no son idénticas pero producen una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividad. Se entenderá que estos comentarios sobre la alta homología también pueden estar relacionados con la estructura tridimensional de la proteína.

40 Se entenderá que se puede usar la proteína de unión al fibrinógeno completa, la región de unión al fibrinógeno, la región mínima de unión al fibrinógeno, o un fragmento de la misma, que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión al fibrinógeno. El uso de proteínas truncadas o fragmentos de las mismas es ventajoso para facilitar la fabricación y superación de otros problemas tales como escisión no deseada de

45 la proteína.

Las ventajas de usar una proteína truncada o fragmento de la misma, que comprende, por ejemplo, uno o más subdominios de la región de unión a ligando-fibrinógeno solamente, se refieren a la capacidad de purificar la proteína a altos rendimientos sin degradación.

50 La región de unión al fibrinógeno de la proteína ClfA, denominada de otro modo como la Región A, comprende 3 subregiones, N1, N2 y N3. Por lo tanto, el fragmento inmunógeno puede comprender las subregiones N1, N2 y/o N3 de la región A ClfA o un fragmento de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, en relación con ClfA, el fragmento puede comprender uno o más de los subdominios de la Región A, N1, N2 o N3. Idealmente, se puede utilizar N2 y N3 ya

55 que este truncamiento es menos probable que experimente proteólisis (se ha puesto en conocimiento un sitio de escisión de proteasa entre N1 y N2 en ClfA y ClfB) y se puede expresar a niveles más altos en E. coli. N2 y N3 son la región mínima de unión al fibrinógeno de las proteínas Clf.

Se ha encontrado inesperadamente que esta proteína de unión al fibrinógeno, truncamiento o fragmento de la 60 misma, sin la capacidad de unirse al fibrinógeno estimula una mayor respuesta inmunitaria tras la inmunización que

la proteína de tipo silvestre que se une al fibrinógeno de la manera normal. Ventajosamente, esta proteína de unión al fibrinógeno alterada no provoca inflamación sistémica cuando se expresa por S. aureus, por lo tanto, se disminuye la virulencia microbiana. En consecuencia, esta proteína alterada que carece de la capacidad para unirse a fibrinógeno se puede utilizar ventajosamente en el tratamiento de infecciones microbianas. También se ha

5 encontrado contrario a las expectativas que el efecto de protección de la proteína de unión al fibrinógeno alterada es mayor que la proteína de tipo silvestre. Se ha encontrado que una composición farmacéutica o vacuna que comprende tal proteína recombinante alterada es más eficaz que una composición farmacéutica o vacuna que comprende la misma proteína recombinante en una forma inalterada (tipo silvestre), tal como ClfA, ClfB, SdrG, etc.

10 Por lo tanto, estos hallazgos presentan una nueva y valiosa vacuna/inmunización terapéutica frente a infecciones bacterianas que proporciona mejores resultados en comparación con la proteína de tipo silvestre cuando se usa también como vacuna/inmunización terapéutica.

Se entenderá que la proteína alterada de la invención, se puede utilizar en la generación de anticuerpos, incluyendo

15 anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados o fragmentos de los mismos, para su uso en el tratamiento de tales infecciones microbianas. Pueden proporcionarse entonces composiciones que incluyen tales anticuerpos, tales como un suero hiperinmune, y estas composiciones pueden usarse en el tratamiento de pacientes infectados con infecciones porStaphylococcus.

20 Por lo tanto, las proteínas o fragmentos activos de las mismas pueden usarse para inhibir la unión de Staphylococci a la matriz extracelular (ECM) y para prevenir/tratar infecciones por Staphylococci en un paciente.

Además, las proteínas o fragmentos activos de las mismas, y anticuerpos para las proteínas son útiles en el tratamiento de infecciones estafilocócicas, para el desarrollo de vacunas para la vacunación activa o pasiva, y

25 cuando se administran como una composición farmacéutica a una herida o un dispositivo médico, tanto las proteínas como los anticuerpos son útiles como agentes bloqueantes para prevenir la infección microbiana. Por ejemplo, estas proteínas o fragmentos de las mismas, pueden usarse en vacunas activas, y los anticuerpos para estas proteínas en vacunas pasivas.

30 Estas vacunas y productos descritos en el presente documento presentan una mejora significativa con respecto a la técnica anterior, que indica el uso general de MSCRAMM para impartir inmunización, pero no indica las vacunas o productos inesperados y mejorados descritos en el presente documento.

La preparación de proteínas, ADN y anticuerpos se conoce bien en la técnica y no se describirá en detalle en el

35 presente documento. Las técnicas convencionales se utilizan idealmente en la generación de estas moléculas. También se entenderá que la invención incluye construcciones de ácido nucleico que contienen la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de interés, células huésped recombinantes que contienen dichas construcciones de ácido nucleico para expresar la proteína de interés, y composiciones inmunógenas.

40 Para la administración, la composición proteica puede dispersarse en una solución salina isotónica estéril u otro adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá que la vacuna puede ser una vacuna de ADN o proteína.

45 La inmunización puede tener lugar mediante la inyección de ADN, proteína o anticuerpos. Como alternativa, se puede administrar un organismo vivo atenuado que incluye y expresa el ADN.

La cantidad de ADN, proteína o anticuerpos que se pueden administrar dependerá de varios factores atenuantes, incluyendo la dependencia de la fuerza del activador, la expresión de la proteína y la inmunogenicidad del gen

50 expresado. Estos pueden alterarse para cada nueva aplicación para obtener la cantidad inmunológicamente eficaz deseada requerida.

También se desvela en el presente documento un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un individuo y/o para tratar a un paciente que tiene una infección microbiana, que comprende administrar al individuo una

55 proteína de unión al fibrinógeno recombinante, o fragmento de la misma de la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, se proporciona una vacuna que comprende una proteína de unión al fibrinógeno recombinante, o fragmento de la misma, de la invención.

60 De acuerdo con una realización aún más preferida de la invención, se proporciona un anticuerpo contra una proteína

de unión al fibrinógeno recombinante, o fragmento de la misma de la invención, preferentemente en forma de suero hiperinmune.

De acuerdo con una realización aún más preferida de la invención, se proporciona una composición farmacéutica 5 inmunógena que comprende una proteína de unión al fibrinógeno recombinante, o fragmento de la misma de la invención, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Idealmente, la proteína de unión a fibrinógeno estafilocócico recombinante o fragmento de la misma se obtiene a partir de S. aureus, S. epidermidis y/o S. lugdunensis.

10 En la memoria descriptiva, los términos "comprenden, comprende, comprendido y que comprende" o cualquier variación de los mismos y los términos "incluyen, incluye, incluido y que incluye", "consisten, consiste, constituido por y que consiste" o cualquier variación de los mismos se consideran como totalmente intercambiables y a todos ellos debería otorgarse la interpretación más amplia posible.

15 La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos. Las figuras 1 a 15 muestran los resultados del Ejemplo 1.

La figura 1 muestra la gravedad de la artritis (A), medida como índice artrítico, y la pérdida de peso (B) en ratones

20 inoculados con la cepa de S. aureus Newman, y los mutantes clfAPYI, clfAPYII, y el mutante nulo clfA. Se inocularon 3,2 x 106 -6,0 x 106 ufc de las cepas de S. aureus. Los datos se presentan como medianas (cuadrados o líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 27 -30, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10, y NclfA = 16 -20. La figura 2 muestra el crecimiento bacteriano en los riñones en ratones 7-8 días después de la inoculación con 3,2 x

25 106-6,0 x 106ufcde la cepade S. aureus Newman, y los mutantes clfAPYI, clfAPYII, y el mutante nulo clfA. Los datos se presentan como ufc por par de riñones. Cuando no se detectó crecimiento, el recuento se puso en el recuento más alto posible según la dilución que se utilizó. Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 26, NclfAPYI = 30, NclfAPYII = 10, y NclfA = 15. La figura 3 muestra la supervivencia de los ratones después de la inoculación con 5,2, 5,1 o 3,3 x 107 ufc de la cepa

30 de S.aureus Newman, el mutante clfAPYI o el mutante nulo clfA, respectivamente. N = 10 por grupo desde el inicio. La figura 4 muestra la supervivencia de los ratones después de la inoculación con 9,4, 7,9, 10,7 o 9,8 x 106 ufc de la cepa de S. aureusLS-1, y los mutantes clfAPYI, clfAPYII o el mutante nulo clfA, respectivamente. N = 15 por grupo desde el inicio. La figura 5 muestra la supervivencia de los ratones inmunizados con BSA, ClfA recombinante o ClfAPY

35 recombinante (es decir, el dominio A de la proteína recombinante ClfAPYI) e inoculados con 2,3 x 107 ufc de S. aureus Newman. N = 15 por grupo desde el inicio. La figura 6 muestra la frecuencia de los ratones artríticos inoculados con 3,2 x 106 -6,0 x 106 ufc de la cepa de S. aureus Newman de tipo silvestre, y los mutantes clfAPYI, clfAPYII, y el mutante nulo clfA. Se agrupan los datos de tres experimentos. NNewman = 27 -30, NClfAPYI = 30, NClfAPYII = 10, y NclfA = 16 -20.

40 La figura 7 muestra la gravedad de la artritis medida como el índice artrítico en ratones inoculados con 5,2, 5,1 o 3,3 x 107 ufc de la cepa de S.aureus Newman de tipo silvestre, el mutante clfAPYI o el mutante nulo clfA, respectivamente. Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 9-10, y NClfA = 0-10. La figura 8 muestra la pérdida de peso en ratones inoculados con 5,2, 5,1 o 3,3 x 107 ufc de la cepa de

45 S.aureus Newman de tipo silvestre, el mutante clfAPYI o el mutante nulo clfA, respectivamente. Los datos se presentan como medianas (línea central), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NNewman = 0-10, NclfAPYI = 9-10, y NclfA = 0-10. La figura 9 muestra la gravedad de la artritis medida como el índice artrítico en los ratones inmunizados con BSA, ClfA recombinante o ClfAPY recombinante (es decir, el dominio A de la proteína recombinante ClfAPYI) e inoculados

50 con 4,0 x 106 ufc de S. aureus Newman. Los datos se presentan como medianas (cuadrados), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 14, NclfAPY = 14, y NclfA = 15 por grupo desde el inicio. La figura 10 ofrece la secuencia nucleotídica y aminoacídica de la proteína del dominio A de ClfA de tipo silvestre (rClfA), dominios N123 solamente, con los residuos destacados que se alteran en los siguientes ejemplos, D321,

55 P336 e Y338 para dar lugar a rClfAPYI y P336 e Y338rClfAPYII (SEQ ID No.3). Es este dominio de proteína A recombinante el que se usó en vacunación en los siguientes ejemplos. La figura 11 muestra una representación ilustrativa de la estructura de las proteínas FnBPA, ClfB, ClfA y SdrG. La Región A es la región de unión al fibrinógeno, S es la secuencia señal, W es el dominio que abarca la pared celular, M es el anclaje de la membrana incluyendo el motivo LPXTG, + representa residuos cargados positivamente y R es

60 la región de repetición. En ClfA, la Región A comprende N123 (no mostrado). La región BCD de FnBPA (y la región

CD más corta de FnBPB -no mostrada) se une a fibronectina. La figura 12 muestra las respuestas a anticuerpo específicas para ClfAPY40-559 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la

5 infección con 2,3 x 107 ufc/ratón de la cepa de S. aureus Newman de tipo silvestre para la inducción de sepsis. Los datos se presentan como medias (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cuadrados), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 13-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15. La figura 13 muestra las respuestas a anticuerpo específicas para ClfA40-559 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559

10 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 2,3 x 107 ufc/ratón de la cepa de S. aureus Newman de tipo silvestre para la inducción de sepsis. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 13-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15. La figura 14 muestra las respuestas a anticuerpo específicas para ClfAPY40-559 recombinante en muestras en

15 suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 4,0 x 106 ufc/ratón de la cepa de S. aureus Newman de tipo silvestre para la inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 14-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15.

20 La figura 15 muestra las respuestas a anticuerpo específicas para ClfA40-559 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA40-559 recombinante (rClfA), o ClfAPY40-559 recombinante (rClfAPY), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo, que fue un día antes de la infección con 4,0 x 106 ufc/ratón de la cepa de S. aureus Newman de tipo silvestre para la inducción de artritis séptica. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos

25 centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 14-15, NrClfA = 15, y NrClfAPY = 15. La figura 16 del Ejemplo 2 muestra las respuestas a anticuerpos específicas para ClfAPY221-559 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA221-559 recombinante (rClfA221559), o ClfAPY221-559 recombinante (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al

30 80 % (bigotes). NBSA = 15, NrClfA221-559 = 14-15, y NrClfAPY221-559 = 14-15. La figura 17 del Ejemplo 2 muestra las respuestas a anticuerpos específicas para ClfA221-559 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), ClfA221-559 recombinante (rClfA221559), o ClfAPY221-559 recombinante (rClfAPY221-559), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medianas (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cuadrados), e intervalos

35 centrales al 80 % (bigotes). NBSA = 15, NrClfA221-559 = 14-15, y NrClfAPY221-559 = 14-15. La figura 18 del Ejemplo 3 muestra las respuestas a anticuerpos específicas para ClfA221-531 recombinante en muestras en suero de ratones inmunizados con ClfAPY221-531 recombinante (rClfAPY221-531), 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los datos se presentan como medias (líneas centrales), intervalos intercuartiles (cajas), e intervalos centrales al 80 % (bigotes). NrClfA221-531 = 14-15.

40 La figura 19 proporciona la secuencia nucleotídica y aminoacídica de ClfA40-559 D321Y/P336S/Y338A (ClfAPYI). La figura 20 proporciona la secuencia nucleotídica y aminoacídica de ClfA40-559 D321Y/P336S/Y338A, incluyendo la extensión N y C-terminal (ClfAPYI). La figura 21 muestra los resultados del Ejemplo Comparativo 1.

45 EJEMPLOS

Ejemplo 1

Truncamientos de la región A de rClfA que comprenden N1, N2 y 3 (aminoácidos 40-559)

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Los detalles completos de las referencias numéricas entre paréntesis dados en los Ejemplos se proporcionan al final de esta sección. 55

Ratones

Se obtuvieron ratones NMRI de Scanbur BK (Sollentuna, Suecia) y se mantuvieron en la instalación para animales del Departamento de Reumatología de la Universidad de Gotemburgo, Suecia. El comité de ética de 60 experimentación animal de Gotemburgo aprobó los experimentos. Se alojaron hasta 10 animales por jaula con un

ciclo de luz-oscuridad de 12 h, y se alimentaron con comida estándar de laboratorio y agua ad libitum. Los animales tenían de 6 a 16 semanas de edad al comienzo de los experimentos.

Cepas bacterianas

5 Para la infección de animales, se usaron las cepas de tipo silvestre de S. aureus Newman (14) y LS-1 (11) y derivados construidos de las mismas. Los derivados de clfA D321YP336SY338A (clfAPYI) y clfA P336AY338S (clfAPYII) se construyeron en la cepa Newman y se transdujeron a la cepa LS-1 (véase más adelante). Se usaron también los mutantes de deleción Newman mutante clfA2::Tn917 DU5876 (3) y LS-1 mutante clfA2::Tn917 (J.R. Fitzgerald et al.,

10 sin publicar). Las bacterias se cultivaron en placas de agar con sangre durante 48 h, se recogieron y se mantuvieron congeladas a -20 ºC en PBS (solución salina tamponada por sus siglas en inglés) que contenía BSA al 5 % (p/vol) (Sigma Chemicals) y dimetilsulfóxido al 10 % (vol/vol). Antes de la inyección en animales, las suspensiones bacterianas se descongelaron, se lavaron en PBS y se ajustaron a las concentraciones celulares apropiadas. El número de bacterias viables se midió en combinación con cada exposición por cultivo en placas de agar con sangre

15 y colonias de recuento.

Construcción de mutaciones de clfAPYI y clfAPYII en S. aureus Newman y LS-1

En este experimento, se utilizó un truncamiento de región A de ClfA de longitud completa, que comprende N1, N2 y 20 N3, correspondientes a los aminoácidos 40 a 559. En la siguiente descripción y figuras:

•

ClfA también puede denominarse como rClfA 40-559 (SEQ ID NO 3);

•

ClfA D321YP336SY338A también puede denominarse como clfAPYI, rclfAPY o rclfAPYI (es decir, clfAPYI 40-559) (SEQ ID NO 4) (mutante triple); y

25 • ClfA P336AY338S también puede denominarse como clfAPYII, rclfAPYII (es decir, clfAPYII 40-559) (SEQ ID NO 5) (mutante doble).

Un fragmento PstI-BamHI de 1,02 kb de pCF77 PY (Loughman et al., 2005) que contenía las mutaciones P336S y Y338A en clfA se clonó en pBluescriptII SK-(Stratagene). Este plásmido se linealizó con HindIII y se ligó a pTSermC

30 cortado con HindIII (J. Higgins, no publicado) para generar el plásmido pARM, que es un vector lanzadera que es un

E. coli-S. aureus sensible a la temperatura que contiene las sustituciones P336S y Y338A.

Se generó un mutante doble, en el que el orden de las sustituciones se invirtió, produciendo P336A e Y338S. Para generar esto, se generó un plásmido pJH2, análogo a pARM pero que contenía las sustituciones P336A e Y338S. Se

35 usó PCR de cebador de superposición con los mismos cebadores flanqueantes usados para producir pCF77 PY (6), y un par diferente de cebadores mutagénicos superpuestos:

F3: GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG and

R3: CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC

40 (mutaciones en negrita y subrayadas) para generar pCF77 PYII. El fragmento PstI-HindIII de 1,02 kb de este plásmido se usó como se ha descrito anteriormente para generar pJH2, un vector lanzadera de E. coli-S. aureus sensible a la temperatura que contenía las sustituidas P336A e Y338S.

45 Tanto pARM como pJH2 se transfirieron a RN4220 (15) por electroporación y posteriormente se transdujeron usando fago 85 (16) a S. aureus Newman (14) y LS-1 (11). En estas cepas se indujo a los plásmidos a insertarse en el cromosoma y después a eliminarse, dejando las mutaciones en el cromosoma de una proporción de transformantes, generando Newman clfAPYI, Newman c/fAPYII, LS-1 clfAPYI y LS-1 clfAPYII. Se seleccionaron los transformantes para determinar la pérdida del plásmido y una pérdida de la actividad de unión al fibrinógeno. La integridad del gen

50 clfA se verificó por hibridación Southern usando una sonda clfA (datos no mostrados). La expresión de una proteína inmunorreactiva (ClfAPY) se verificó mediante inmunotransferencia Western utilizando un antisuero policlonal de conejo de la región A anti-ClfA (datos no mostrados). Las mutaciones se verificaron por PCR a través de los fragmentos KpnI-BamHI del ADN genómico y secuenciación comercial de los productos. Las aproximadamente 700 bases del gen clfA de la cepa LS-1 que se secuenciaron eran idénticas a las bases correspondientes en el gen

55 Newman clfA de la cepa Newman.

Producción de ClfA y ClfAPY recombinante

Se produjo a partir de pCF40, como se ha descrito anteriormente (17), la región A de ClfA recombinante marcada 60 con His, dominios N123 (aminoácidos 40-559), con una etapa de pulido adicional a través de una columna de

intercambio aniónico. El plásmido pCF77 PY (6) se usó como plantilla para clonar los dominios N123 del clon clfAPYI en pQE30 para generar pCF40PY. Usando este plásmido, también se produjo ClfAPY recombinante por cromatografía de afinidad de níquel y cromatografía de intercambio aniónico, como se describió para rClfA. Los eluatos se dializaron frente a dos cambios de PBS antes de la concentración y la liofilización.

Experimentos de artritis séptica y sepsis

En los experimentos 1-3 todos los ratones (n = 10 por grupo) se infectaron con la cepa Newman para desencadenar artritis. En los experimentos 4 y 5, los ratones se infectaron con la cepa Newman y LS-1, respectivamente, para

10 inducir sepsis (n = 10 por grupo).

Experimento 1 Los ratones se infectaron por inyección intravenosa con 3,5 x 106 ufc/ratón de la cepa S.aureus Newman o con 4,3 x 106ufc/ratón de mutante Newman clfAPYI, ambos en 200 µl de PBS. Se hizo un seguimiento de la artritis clínica y el cambio de peso hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 8, se evaluó el

15 crecimiento de bacterias en los riñones y se midieron los niveles séricos de IL-6 y de IgG total. La sinovitis y la destrucción ósea se estudiaron histológicamente en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

Experimento 2 Los ratones se infectaron con 5,0 x 106 ufc, 6,0 x 106 ufc o 4,3 x 106 ufc de la cepa S.aureus Newman, mutante clfAPYI o Newman clfA::ErmR (mutante nulo clfA), respectivamente. Se hizo un

20 seguimiento de la artritis clínica y el cambio de peso hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 7, se evaluó el crecimiento de bacterias en los riñones y se midieron los niveles séricos de IL-6 y de IgG total. La sinovitis y la destrucción ósea se estudiaron histológicamente en las articulaciones de las patas delanteras y traseras.

Experimento 3 Se infectaron ratones con 4,7 x 106 ufc, 3,2 x 106 ufc, 3,9 x 106 ufc o 4,8 x 106 ufc de la cepa

25 S.aureus Newman, mutante clfAPYI, Newman mutante cIfAPYII o Newman mutante nulo clfA, respectivamente. Se hizo un seguimiento de la artritis clínica y el cambio de peso hasta el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 8 y se evaluó el crecimiento de bacterias en los riñones.

Los resultados de los experimentos 1-3 fueron muy similares, por lo que los datos se agruparon y se presentaron 30 juntos.

En el Experimento 4, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa 5,2 x 107 ufc, 5,1 x 107 ufc o 3,3 x 107 ufc de la cepa S.aureus Newman, mutante clfAPYI o mutante nulo clfA, respectivamente. Se hizo un seguimiento de la mortalidad, el cambio de peso y la artritis clínica hasta el día 10.

35 En el Experimento 5, los ratones se infectaron con 9,4 x 106 ufc, 7,9 x 106 ufc, 10,7 x 106 ufc o 9,8 x 106 ufc de la cepa S.aureus LS-1, LS-1 mutante clfAPYI, LS-1 mutante clfAPYII, o LS-1 mutante nulo clfA, respectivamente. Se hizo un seguimiento de la mortalidad, la artritis clínica y el cambio de peso hasta el día 16.

40 Inyección intraarticular de bacterias

En una articulación de rodilla por ratón se inyectó 2,4 x 104 ufc, 2,4 x 104 ufc, o 3,4 x 104 ufc de la cepa Newman de tipo silvestre, mutante clfAPYI o mutante desactivado clfA, respectivamente, en 20 µl de PBS. N = 10 por grupo. Los ratones se sacrificaron 3 días más tarde, y las articulaciones de la rodilla se recogieron para el examen

45 histopatológico.

Vacunación con ClfA recombinante de tipo silvestre y mutante

Se disolvieron rClfA40-559 purificado, rClfAPY40-559 (es decir, rClfAPYI) o BSA en una solución salina fisiológica y

50 se emulsionaron 1:1 en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories). Se inyectaron doscientos μl de la emulsión que contenía 30 μg (= 0,53 nmol) de proteína por vía subcutánea (sc) el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 30 μg de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante incompleto de Freund se realizó el día 11. La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 21. El día 30 se extrajo la sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas a anticuerpos.

55 El día 31, 14-15 ratones por grupo se infectaron por inyección i.v. de 4,0 x 106 ufc/ratón para la inducción de artritis séptica, o 2,3 x 107 ufc/ratón para la inducción de sepsis. Se hizo un seguimiento de la artritis clínica, el cambio de peso y la mortalidad durante 11 y 15 días, respectivamente. El crecimiento bacteriano en los riñones se evaluó en el experimento de artritis séptica.

Evaluación clínica de ratones infectados

La evaluación clínica se realizó de una manera ciega. Cada miembro fue inspeccionado visualmente. La inspección produjo una puntuación de 0 a 3 (0, sin hinchazón ni eritema; 1, hinchazón y/o eritema leve; 2, hinchazón y/o eritema

5 moderado; 3, hinchazón y/o eritema pronunciado). El índice artrítico se construyó añadiendo las puntuaciones de las cuatro extremidades de un animal. El estado general de cada ratón también se examinó evaluando los signos de inflamación sistémica, es decir, disminución de peso, disminución de la vigilancia y pelaje erizado. En los casos de infección sistémica grave, cuando se determinó que un ratón estaba demasiado enfermo para sobrevivir 24 h más, se sacrificó por dislocación cervical y se consideró muerto debido a la sepsis.

Examen histológico

El examen histológico de las articulaciones se realizó usando una modificación (8) de un procedimiento descrito previamente (18).

15 Examen bacteriológico de riñones infectados

Los riñones se diseccionaron asépticamente, se mantuvieron en hielo, se homogeneizaron, se diluyeron en serie en PBS y se extendieron en placas de agar con sangre. Después de 24 h de incubación a 37 ºC, se determinó el

20 número de ufc por par de riñones.

Medición de IgG en suero

Los niveles en suero de IgG total se midieron mediante la técnica de inmunodifusión radial (19). Se adquirieron 25 estándar de IgG de cabra anti-ratón y de IgG de ratón en Southern Biotech, Birmingham, AL.

Anticuerpos específicos -ELISA

Se obtuvieron muestras en suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. 30 La respuesta a anticuerpos específica en suero contra rClfA y rClfAPY se midió mediante ELISA. Las microplacas

(96 pocillos, Nunc) se recubrieron con 5 μg/ml de proteína recombinante en PBS. El agente bloqueante, las

muestras en suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa se diluyeron en PBS. El ensayo se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras en suero se diluyeron 1:20000, y la respuesta a anticuerpos se supervisó según una absorbancia a 405 nm.

35 En una segunda realización, para obtener una medida más precisa de las respuestas a anticuerpo específicas en los diferentes grupos de inmunización, se determinaron las respuestas en varias diluciones en suero. Por lo tanto, todas las muestras de suero se diluyeron 1:5000, 1:20000, 1:80000 y 1:320000, y la respuesta a anticuerpos se supervisó según una absorbancia a 405 nm.

40 Análisis de IL-6 -Se detectó IL-6 en suero mediante un procedimiento descrito previamente (20).

Análisis estadístico

45 La evaluación estadística se realizó utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró que P<0,05 era significativo. Los datos se ponen en conocimiento como medianas, intervalos intercuartiles e intervalos centrales al 80 %, a menos que se indique otra cosa.

RESULTADOS

50 El intercambio de aminoácidos necesarios para la unión de ClfA al fibrinógeno dificulta el desarrollo de artritis séptica y sepsis

Se alteraron los aminoácidos (D321, P336 y/o Y338) que se sabe que son necesarios para la unión al fibrinógeno

55 por ClfA mediante intercambio alélico para crear mutantes de las cepas Newman y LS1 que expresen una proteína de ClfA que no se una al fibrinógeno en la superficie celular. El nivel de expresión e integridad de la proteína se midió mediante transferencia Western, que estableció que había una buena expresión de las proteínas mutantes en la superficie bacteriana y la proteína expresada era del tamaño correcto.

60 Se investigó la capacidad de Newman de tipo silvestre y Newman clfA D321Y, P336S Y338A (clfAPYI) para provocar

artritis séptica. Se indujo artritis séptica mediante inoculación intravenosa de 3,5 x 106 a 5,0 x 106 unidades formadoras de colonias (ufc) y 3,2 x 106 a 6,0 x 106 ufc de Newman de tipo silvestre y el mutante clfAPYI, respectivamente. El desarrollo de la artritis se estudió clínicamente durante 7 días. El mutante clfAPYI provocó significativamente menos artritis grave que la cepa de tipo silvestre durante todo el periodo experimental (P > 0,001,

5 figura 1 A). La frecuencia de artritis fue inferior para Newman clfAPYI en la mayor parte de los puntos temporales (figura 6).

De forma inesperada, parece que la nueva composición de aminoácidos en la molécula ClfAPYI se adapta a la interacción con una defensa anti-bacteriana huésped. Para comprobar esta posibilidad, se hizo una nueva

10 construcción donde se sustituyeron P336 e Y338 (clfA P336A Y338S: clfAPYII) por diferentes aminoácidos. A los ratones que se les inocularon 3,9 x 106 ufc de Newman clfAPYII desarrollaron artritis en la misma escasa medida que el mutante clfAPYI (figura 1 A), y con una frecuencia similar (figura 6). Este resultado sugiere claramente que la pérdida de unión al fibrinógeno es responsable del nivel reducido de artritis.

15 Es posible que ClfA esté implicado en el desarrollo de la artritis por mecanismos que no implican la unión al fibrinógeno. Para probar esto, un mutante de deleción ClfA que carecía de la proteína ClfA se comparó con los mutantes que expresaban la proteína modificada de ClfA que no se unía al fibrinógeno. Sin embargo, los ratones que se infectaron con 4,3 x 106 a 4,8 x 106 ufc del mutante nulo clfA desarrollaron artritis de una manera no diferente de los ratones infectados con los mutantes clfAPYI y clfAPYII (figura 1 A). La frecuencia de la artritis también era

20 indistinguible (figura 6).

Las articulaciones infectadas también se investigaron histológicamente. La sinovitis en ratones infectados con Newman clfAPYI era significativamente más leve que en los ratones infectados de tipo silvestre tanto en el experimento 1 como 2 (P = 0,02 y 0,001, respectivamente). La destrucción ósea, una causa principal de secuelas en

25 la artritis séptica humana, estuvo casi ausente en las muestras infectadas con Newman clfAPYI (Experimento 2, P = 0,001). La sinovitis y la destrucción ósea inducida por el mutante nulo Newman clfA eran también menos pronunciadas en comparación con los ratones infectados con Newman de tipo silvestre (P = 0,003 y 0,006, respectivamente), pero algo más graves que en el grupo Newman clfAPYI, aunque no significativamente.

30 A continuación, se analizaron las consecuencias metabólicas de las mutaciones clfA para el proceso infeccioso. Los ratones infectados con la cepa de tipo silvestre Newman perdieron hasta aproximadamente el 30 % de su peso corporal durante el período experimental. Los ratones que se infectaron con los mutantes deficientes en unión al fibrinógeno Newman clfAPYI y Newman clfAPYII apenas perdieron peso en absoluto (P > 0,0001 frente a tipo silvestre). Por el contrario, el mutante nulo Newman clfA tuvo un efecto intermedio sobre la pérdida de peso,

35 causando significativamente menos que la cepa de tipo silvestre, pero significativamente más que las cepas mutantes clfAPYI y clfAPYII (P ≤ 0,02 en la mayor parte de los casos, figura 1 B).

Se analizaron los niveles séricos de IL-6, una medida de la respuesta inflamatoria sistémica, el día 7-8 de la infección. El patrón de la expresión de IL-6 fue similar a los cambios de peso. Newman de tipo silvestre provocó altos

40 niveles de IL-6 en suero (4,8 (2,8, 5,7) ng/ml), el mutante Newman clfAPYI provocó considerablemente menos IL-6 (0,2 (0,07, 2,4) ng/ml, P < 0,0001), mientras que el mutante nulo Newman clfA dio lugar a una respuesta intermedia (2,5 (1,3, 3,2) ng/ml) con diferencias significativas tanto para el grupo de tipo silvestre como el mutante clfAPYI (P = 0,009 y P = 0,008, respectivamente) (media, intervalo intercuartil).

45 El crecimiento de bacterias en los riñones fue significativamente mayor en los ratones infectados con Newman de tipo silvestre, en comparación con ambos de los mutantes Newman clfAPY como el mutante nulo Newman clfA (P < 0,0001, P = 0,011, y P = 0,005, respectivamente; figura 2). Los ratones infectados con el mutante nulo Newman clfA tuvieron significativamente más crecimiento bacteriano en los riñones que los ratones infectados con Newman clfAPYI (P = 0,0005, figura 2).

50 La IgG total en sueros se midió en los ratones el día 7-8 de la infección. Hubo un aumento significativamente menor de los niveles de IgG tanto en los grupos infectados con mutante Newman clfAPYI como el mutante nulo Newman clfA en comparación con los ratones infectados con la cepa de tipo silvestre (3,1 (1,2, 4,9); 2,3 (1,0, 2,6); y 6,4 (5,0, 11,0), respectivamente (mediana, intervalo intercuartil); P ≤ 0,0003). No hubo diferencias significativas entre

55 los dos grupos mutantes.

La mortalidad fue del 17 % en los ratones infectados con Newman de tipo silvestre, del 0 % en los grupos de mutantes Newman clfAPYI y clfAPYII, y del 30 % en el grupo de mutante nulo Newman clfA. Hubo diferencias significativas en la mortalidad entre los grupos de tipo silvestre y clfAPYI, y entre los grupos del mutante clfAPYI y el

60 mutante nulo clfA (P < 0,05 y P < 0,01, respectivamente).

Parece que los signos directos e indirectos de inflamación sistémica son más bajos en ratones infectados con S.aureus que expresan ClfA que es deficiente en la unión al fibrinógeno. De forma inesperada, la cepa que carecía de expresión de ClfA indujo por completo más inflamación sistémica que una cepa de expresión del mutante ClfAPY.

5 La sepsis se indujo en los ratones aumentando la dosis de inoculación de S. aureus. Los ratones se infectaron con 5,2 x 107 ufc de Newman de tipo silvestre, 5,1 x 107 ufc del mutante Newman clfAPYI y 3,3 x 107 ufc del mutante nulo Newman clfA. En 5 días, todos los ratones infectados con el tipo silvestre murieron, pero solo un ratón del mutante clfAPYI de cada diez murió después de 10 días de la infección (P < 0,0001, figura 3). Los ratones infectados

10 con el mutante nulo clfA también sobrevivieron un tiempo significativamente más corto que los ratones infectados con el mutante clfAPYI (P < 0,0001, figura 3). En este experimento, los ratones estimulados con el mutante nulo clfA desarrollaron significativamente más artritis que el grupo de mutante clfAPYI, mientras que al mismo tiempo, perdieron significativamente más peso (figura 7 y 8). Por lo tanto, por analogía con las medidas de la inflamación sistémica en los experimentos de artritis séptica, la supervivencia de los ratones se prolonga si se expresa la

15 molécula de ClfA, siempre que carezca de propiedades de unión al fibrinógeno.

Inyección de bacterias en las articulaciones

Para probar si la reacción inflamatoria en la articulación es dependiente de la unión al fibrinógeno, se inyectaron

20 Newman de tipo silvestre, Newman clfAPYI o Newman clfA nulo directamente en una articulación de la rodilla de los ratones, pasando así al compartimento sistémico. La sinovitis, incluyendo la infiltración polimorfonuclear de la cavidad articular, y la destrucción ósea se estudiaron por histología 3 días después. Los ratones recibieron 2,4 x 104 ufc de tipo silvestre, 2,4 x 104 ufc del mutante nulo clfA, o 3,4 x 104 ufc del mutante clfAPYI en una rodilla. La sinovitis y el índice histológico de infiltración polimorfonuclear en la cavidad articular fue de 0,25 (0, 3,0) para las

25 rodillas infectadas con tipo silvestre, 2,38 (0,25, 3,0) para el mutante nulo clfA y 0,25 (0, 0,25) para el mutante clfAPYI (media, intervalo intercuartil). El índice histológico para la destrucción del hueso fue de 0 (0, 1,0) para el tipo silvestre, 1,0 (0, 1,0) para el mutante nulo clfA, y 0 (0, 0) para el mutante clfAPYI (media, intervalo intercuartil; P = 0,01 entre el mutante clfAPYI y el mutante nulo clfA). Dado que el mutante clfAPYI provocó muy poca sinovitis y destrucción, a pesar de que se administró el 42 % más de esa cepa a los ratones que las otras

30 cepas, se concluye que la unión al fibrinógeno promovida por ClfA es necesaria para la respuesta inflamatoria máxima dentro de la articulación. De nuevo, la ausencia de expresión de ClfA mejoró la inflamación en comparación con el mutante ClfA con deficiente unión al fibrinógeno.

Mutación PY en la cepa LS-1

35 Para determinar si la capacidad de ClfA para unirse a fibrinógeno afecta a la virulencia de otras cepas de S.aureus, las mutaciones clfAPYI, clfAPYII y la mutación nula clfA se transdujeron en la cepa de S. aureus de expresión de TSST-1 LS-1. Los ratones se sometieron a una prueba de provocación con 9,4 x 106 ufc de LS-1 de tipo silvestre, 7,9 x 106 ufc de LS-1 clfAPYI, 10,7 x 106 ufc de LS-1 clfAPYII, o 9,4 x 106 ufc del mutante nulo LS

40 1 clfA. La sepsis se estudió siguiendo la tasa de supervivencia. Después de 16 días, solo el 40 % de los ratones sometidos a prueba de provocación con la cepa de tipo silvestre estaban vivos, mientras que el 90 % de los ratones sometidos a prueba de provocación con los grupos de mutante clfAPYI y mutante nulo clfA y el 80 % de los ratones infectados con el mutante clfAPYII estaban vivos (figura 4). Los mutantes clfAPYI y el mutante nulo clfA de LS-1 eran significativamente menos virulentos (P = 0,014, P = 0,05 y P = 0,03, respectivamente).

Inmunización con proteínas ClfA recombinantes

Se estudió el efecto de la vacunación con la proteína del dominio ClfA A recombinante de tipo silvestre (rClfA) y la proteína ClfAPYI mutante (rClfAPY) tanto en el modelo de artritis séptica como en el modelo de sepsis. Los ratones

50 se sensibilizaron y luego se reforzaron dos veces con la proteína de control BSA, rClfA o rClfAPY, y posteriormente se infectaron con 4,0 x 106 ufc de la cepa de S. aureus Newman para inducir artritis séptica, o con 2,3 x 107 ufc de la cepa Newman para inducir sepsis. La inmunización con rClfAPY (es decir, el dominio de la proteína A ClfAPYI recombinante) protegió significativamente contra la muerte séptica en comparación con los ratones control (P = 0,01, figura 5), mientras que la inmunización con rClfA no logró una protección significativa. Un día antes de la infección

55 bacteriana hubo una respuesta a anticuerpos en suero específica mucho más alta tanto para rClfAPY como rClfA en ratones inmunizados con rClfAPY (A405 = 0,39 (0,33, 0,56) y 0,71 (0,52, 0,81) en comparación con ratones inmunizados con rClfA (A405 = 0,13 (0,07, 0,17) y 0,15 (0,10, 0,24), P < 0,0001 en ambas comparaciones (mediana, intervalo intercuartil)). Los animales inmunizados de control tenían solo niveles de fondo (A405 nm = 0 y 0,01 (0, 0,01) (mediana, intervalo intercuartil)). Los ratones inmunizados que debían ser infectados con la dosis bacteriana artrítica

60 inferior tenían respuestas a anticuerpos similares a rClfA y rClfAPY como los ratones en los que se indujo la sepsis

(datos no mostrados). La inmunización tanto con rClfA como con rClfAPY protegió contra el desarrollo de la artritis, aunque la protección no fue significativa (figura 9).

Durante el día 5 a 9 después de la infección, la pérdida de peso se redujo significativamente en los ratones 5 inmunizados con rClfAPY y rClfA, en comparación con los ratones control (datos no mostrados).

Se observó una tendencia a la disminución del crecimiento bacteriano en riñones de ratones inmunizados con rClfAPY o rClfA el día 11 después de la infección (BSA: 38 (3, 436); rClfAPY: 7 (2, 17); rClfA: 10 (7, 54) x 107 ufc/par de riñones).

10 Para obtener una medida más precisa de las respuestas a anticuerpo específicas en los diferentes grupos de inmunización, se determinaron las respuestas en varias diluciones en suero (la segunda realización). Los datos muestran que eran muy probables valores más altos de anticuerpos específicos en sueros de ratones inmunizados con rClfAPY con respecto a los antígenos de tipo silvestre rClfAPY y rClfA, tanto en los ratones que se iban a

15 infectar con la dosis bacteriana séptica y artrítica, respectivamente, como en los sueros de ratones inmunizados con rClfA de tipo silvestre, puesto que hubo respuestas a anticuerpos significativamente más altas medidas como la absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPY en cada dilución en suero en todas las comparaciones (P <0,0001 a P = 0,008, figura 12-15). La inmunización con BSA provocó solo una respuesta a anticuerpos de fondo.

20 CONCLUSIÓN

Los resultados sugieren claramente que la interacción ClfA-fibrinógeno es crucial para la virulencia bacteriana y el desenlace de la enfermedad. La capacidad de ClfA de unirse al fibrinógeno se asoció a una mayor virulencia en cuanto a la capacidad de causar muerte séptica. En ambas cepas estafilocócicas ensayadas, un mutante clfAPY

25 indujo menos muerte séptica que el tipo silvestre. Además, la gravedad de la artritis se redujo en gran medida en ratones infectados con el mutante clfAPY de no unión al fibrinógeno.

Un mecanismo probable para la promoción de la virulencia por la interacción fibrinógeno-superficie celular bacteriana es la inhibición de la fagocitosis de los neutrófilos (5). Los neutrófilos son cruciales para la defensa del 30 huésped en la fase temprana de la infección por S. aureus (13). Sin neutrófilos, el crecimiento bacteriano aumenta de manera pronunciada en la sangre y los riñones, y la frecuencia de la artritis y la mortalidad aumenta. La inhibición mediada por el fibrinógeno de la fagocitosis de neutrófilos por ClfA podría explicar, al menos en parte, la virulencia más pronunciada de S. aureus de tipo silvestre en comparación con los mutantes clfAPY. La unión del fibrinógeno a ClfA podría disminuir la opsonofagocitosis por neutrófilos al reducir la deposición de opsonina o el acceso a las

35 opsoninas por los receptores de neutrófilos. Como alternativa, el fibrinógeno unido podría bloquear la unión de un factor huésped protector desconocido a S. aureus. Otra opción es que la interacción fibrinógeno-ClfA promueva el paso bacteriano de los vasos sanguíneos al tejido o promueva la colonización en los tejidos.

Inesperadamente, nuestros datos también muestran que el mutante nulo ClfA era más virulento que las cepas

40 mutantes clfAPY. Posiblemente, la proteína ClfA tiene funciones in vivo además de la interacción con el fibrinógeno. Esta interacción es claramente desventajosa para el huésped como se muestra en este estudio. Otras funciones de ClfA no están actualmente bien correlacionadas, pero la agregación plaquetaria no dependiente de fibrinógeno ejercida por ClfA podría dar como resultado la captura de grandes cantidades de S. aureus en circulación con la posterior eliminación de los complejos plaquetarios bacterianos a través del sistema reticuloendotelial. Dicha

45 eliminación mediada por la agregación plaquetaria de estafilococos se produciría fácilmente en las cepas mutadas de tipo silvestre y de clfAPY, pero no en la desactivación de clfA. Mientras que en la cepa de tipo silvestre la interacción del fibrinógeno podría eclipsar los demás eventos, en los mutantes clfAPY, tal eliminación bacteriana podría ser harto beneficiosa para el huésped.

50 El mutante desactivado clfA protegía contra la muerte séptica en la misma medida que la mutación clfAPY en la cepa de S. aureus LS-1, pero protegía menos, en todo caso, en la cepa Newman. El impacto global de la expresión de ClfA sobre la virulencia bacteriana podría diferir entre diferentes cepas de S. aureus dependiendo del nivel de expresión y la presencia de otros factores de virulencia.

55 La cuestión de si el mutante clfAPY muestra igual o menor virulencia una vez en la cavidad articular es de cierta importancia teniendo en cuenta que en el líquido sinovial inflamado el fibrinógeno y la fibrina son abundantes. Los datos sugieren que el mutante clfAPY es menos destructivo para el cartílago y el hueso.

El efecto protector del mutante D321P336Y338 de no unión al fibrinógeno del dominio A de ClfA recombinante era 60 mayor que para rClfA de tipo silvestre. La inmunización con ClfAPY indujo muy probablemente una mejor respuesta

inmune ya que se provocaron respuestas a anticuerpos específicos más altas frente tanto al inmunógeno como a la proteína ClfA de tipo silvestre. Más importante aún, indujo una mayor respuesta inmune protectora frente a la muerte séptica que ClfA de tipo silvestre.

5 En conclusión, estos resultados muestran que rClfAPY es una mejor vacuna candidata que ClfA recombinante de tipo silvestre. Se cree que la unión de fibrinógeno por medio de la proteína ClfA de tipo silvestre durante la fase de inmunización disminuye la presentación de antígenos debido a la ocultación de importantes epítopos en la molécula de ClfA y, por los tanto, altera la producción de anticuerpos específicos.

10 Ejemplo 2

Truncamiento de la región A de rClfA que comprende N2 y N3 (rClfA 221-559)

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

15 Se siguieron los protocolos descritos en el Ejemplo 1 en este ejemplo, que utilizaron

• rClfA 221-559 (es decir, truncamiento de la región A de ClfA que comprende N2 y N3 correspondiente a los

aminoácidos 220-559) 20 • rClfAPYI221-559; y

• BSA.

Había 15 ratones NMRI hembra por grupo de 8 semanas de edad al inicio de los experimentos. En este Ejemplo, las construcciones utilizadas para la inmunización fueron truncamiento de ClfA de tipo silvestre/N2N3 nativo,

25 truncamiento de ClfA N2N3 con la mutación PYI como se define en el Ejemplo 1. Se usó BSA como control.

Vacunación con ClfA recombinante de tipo silvestre y mutante

Los ratones se inmunizaron con rClfA 221-559, rClfAPYI 221-559 o BSA de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1.

30 El rClf A221-559 purificado, rClfAPYI221-559 (es decir, los sub-dominios N2 y N3 de la proteína A recombinante ClfAPYI) o BSA se disolvieron en PBS y se emulsionaron 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron s.c. doscientos μl de la emulsión que contenía 30 μg (= 0,79 nmol) de proteína el día 0. La primera inmunización de refuerzo con 30 μg de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante incompleto de Freund se realizó el día 12.

35 La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 22. El día 31 se extrajeron las muestras de sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas a anticuerpos.

Anticuerpos específicos -ELISA

40 Se obtuvieron muestras en suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. La respuesta a anticuerpos específica en suero contra rClfA221-559 y rClfAPYI221-559 se midió mediante ELISA. Las microplacas (96 pocillos, Nunc) se recubrieron con 5 μg/ml de proteína recombinante en PBS. El agente bloqueante, las muestras en suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina-proxidasa se diluyeron en PBS. El análisis se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras de suero se diluyeron 1:5000,

45 1:20000, 1:80000 y 1:320000, y la respuesta a anticuerpos se supervisó según una absorbancia a 405 nm.

RESULTADOS:

RESPUESTA A ANTICUERPOS ESPECÍFICA:

50 La respuesta a anticuerpos se midió por la absorbancia en un análisis ELISA, según el Ejemplo 1, con cuatro diluciones en suero diferentes. Los datos obtenidos fueron muy similares a los datos del Ejemplo 1.

Se encontró que la inmunización con rClfAPYI221-559 muy probablemente dio lugar a títulos más altos de

55 anticuerpos específicos tanto para rClfA221-559 nativo como rClfAPYI221-559, en comparación con la inmunización rClfA221-599 nativa, ya que había respuestas a anticuerpos significativamente más altas medidas como la absorbancia en ratones inmunizados con rClfAPYI221-559 en cada dilución en suero en todas las comparaciones, excepto una (P = 0,001 a 0,025, véanse las figuras 16 y 17). La inmunización con BSA provocó solo los niveles de fondo de la respuesta a anticuerpos.

CONCLUSIÓN

Se encontró que la inmunización con una proteína rClfAPYI221-559 dio lugar a respuestas a anticuerpos significativamente más altas tanto para el inmunógeno como para la proteína ClfA de tipo silvestre, que la 5 inmunización con la proteína nativa.

En base a estos hallazgos, se concluye que la inmunización con DPY, independientemente de si la proteína DPY comprende los aminoácidos 40 a 550 como en el Ejemplo 1 o los aminoácidos 221 a 559 como en el Ejemplo 2, induce una mejor respuesta inmune que la inmunización con ClfA nativo del tamaño correspondiente.

Ejemplo 3

Truncamiento de la región A de ClfA (truncamiento de retención δ/delta)

15 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:

Se siguieron los protocolos descritos en el Ejemplo 1 en este ejemplo, que utilizaron la siguiente construcción:

• rClfA 221-531 (es decir, truncamiento de la región A de rClfA que comprendía los aminoácidos N2 y N3 220-559 20 pero sin los aminoácidos peptídicos de retención 532-538 y los posteriores residuos ricos en prolina.

Había 15 ratones NMRI hembra en el grupo de 8 semanas de edad al inicio del experimento. En este Ejemplo, se usó la construcción anterior para la inmunización. Los ratones se inmunizaron con el truncamiento anterior de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1.

Vacunación con ClfA recombinante de tipo silvestre y mutante

Se disolvió rClfA221-531 purificado en PBS y se emulsificó 1:1 en adyuvante completo de Freund. Se inyectaron s.c. doscientos μl de la emulsión que contenía 0,79 nmol de proteína el día 0. La primera inmunización de refuerzo con

30 0,79 nmol de proteína en solución salina fisiológica en adyuvante incompleto de Freund se realizó el día 12. La segunda inmunización de refuerzo se hizo el día 22. El día 31 se extrajo la sangre a los ratones y se congelaron los sueros para un análisis posterior de las respuestas a anticuerpos.

Anticuerpos específicos -ELISA

35 Se obtuvieron muestras en suero de ratones inmunizados 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los niveles en suero de los anticuerpos específicos se midieron por ELISA. Las microplacas (96 pocillos; Nunc) se recubrieron con 4,6 µg/ml de proteína rClfA221-531 que era equimolar a 5 µg/ml de rClfA221-559 y rClfAPYI221-559 de los Ejemplos 1 y 2. El agente bloqueante, las muestras en suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidina

40 proxidasa se diluyeron en PBS. El análisis se realizó de acuerdo con una descripción anterior (8). Todas las muestras de suero se diluyeron 1:5000, 1:20000, 1:80000 y 1:320000, y la respuesta a anticuerpos se controló según una absorbancia a 405 nm.

RESULTADOS:

45 La respuesta a anticuerpos se midió por la absorbancia en un análisis ELISA, según el Ejemplo 1. Se encontró que la inmunización con ClfA221-531 dio lugar a una respuesta inmune, medida como una repuesta a anticuerpos específica (figura 18).

50 CONCLUSIÓN:

Se encontró que el fragmento rClfA221-531 también funciona bien como un inmunógeno, ya que el antígeno provoca una respuesta a anticuerpo específica.

55 EJEMPLO 4 -Purificación de proteínas

Proteínas ClfA ensayadas y protocolo

• ClfA de tipo silvestre de longitud completa 60 • ClfA D321YP336SY338A (mutante triple) (es decir, clfAPYI 40-559) (SEQ ID NO 4)

• ClfAPYI sin la sustitución D321Y (es decir, ClfAP336SY338A)

Las proteínas recombinantes marcadas con his descritas anteriormente se purificaron mediante cromatografía de

5 afinidad de quelato de níquel inmovilizada. La expresión se indujo por la adición de IPTG 1 mM a células con crecimiento exponencial. Después de 3 h de inducción, las células se recolectaron por centrifugación y se suspendieron de nuevo en 30 ml de tampón de unión (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, imidazol 20 mM, pH 7,9) que contenía inhibidores de proteasa (sin EDTA completa, Roche). Las células se lisaron en una célula de presión de French y el lisado se eliminó por centrifugación a alta velocidad seguido por filtración. Se cargó una columna HiTrap

10 Chelating HP (GE Healthcare) con Ni2+ 150 mM y se equilibró con tampón de unión. El lisado aclarado se aplicó a la columna y después se lavó la columna con tampón de unión. La proteína unida se eluyó con un gradiente lineal continuo de imidazol (5 -100 mM) en NaCl 0,5 M, Tris -HCl 20 mM (pH 7,9).

Las muestras se analizaron por SDS-PAGE (mostrado en las figuras 21A y 21B) y las fracciones que contenían la

15 proteína del peso molecular correcto se agruparon y se dializaron contra PBS durante 16 h a 4 ºC. Después de la diálisis, las proteínas se analizaron por SDS-PAGE para evaluar la integridad (figura 21C).

Resultados

20 Los resultados se muestran en la figura 21, donde

A. Purificación de ClfA wt (1) y el mutante triple (2). Las proteínas son puras y no se aprecia descomposición.

B. Purificación de ClfAPYI sin la sustitución D321Y. Se aprecia la descomposición del producto proteico.

C. Tras diálisis durante una noche a 4 ºC, 10 µl de mutante triple (1) o ClfAPYI sin la sustitución D321Y (2) (10 µM). 25 Esta figura muestra que el mutante triple (1) no se descompone.

Conclusión

Observando la descomposición de las proteínas durante la purificación, se encontró que el ClfA D321YP336SY338A

30 (mutante triple) proporciona una proteína más estable que el ClfAPYI sin la sustitución D321Y (es decir, ClfAP336SY338A). Por lo tanto, estos resultados muestran que la proteína del ClfA D321YP336SY338A (mutante triple) es más fácil de purificar cuando está presente la mutación D321. Por lo tanto, la presencia de la mutación D321 conduce a una proteína con mayor estabilidad.

35 REFERENCIAS

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40 2. McDevitt D, Nanavaty T, House-Pompeo K, Bell E, Turner N, McEntire L, Foster T, Höök M (1997) Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor (ClfA) and fibrinogen. Eur J Biochem 247:416-424.

3. McDevitt D, Francois P, Vaudaux P, Foster TJ (1994) Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 11:237-248.

45 4. Palmqvist N, Patti JM, Tarkowski A, Josefsson E (2004) Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis. Microb Infect 6:188-195.

5.

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6.

Loughman A, Fitzgerald JR, Brennan MP, Higgins J, Downer R, Cox D, Foster TJ (2005) Roles of fibrinogen,

50 immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A. Mol Microbiol 57:804-818.

7. O'Brien L, Kerrigan SW, Kaw G., Hogan M., Penadés J., Litt D., Fitzgerald D.J., Foster T.J. & Cox D. (2002) Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus: roles for the clumping factors ClfA and ClfB, the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A. Mol Microbiol 44, 1033-1044.

55 8. Josefsson E., Hartford O., O'Brien L, Patti JM, Foster T (2001) Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 184:1572-1580.

9. Palmqvist N, Foster T, Fitzgerald R, Josefsson E, Tarkowski A (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogenbinding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. J Inf Dis 191:791

798. 60 10. Deivanayagam CCS, Wann ER, Chen W, Carson M, Rajashankar KR, Höök M, Narayana SVL (2002) A novel

variant of the immunoglobulin fold in surface adhesins of Staphylococcus aureus: crystal structure of the fibrinogenbinding MSCRAMM, clumping factor A. The EMBO Journal 21:6660-6672.

11. Bremell T, Lange S, Yacoub A, Ryden C, Tarkowski A (1991) Experimental Staphylococcus aureus arthritis in mice. Infect Immun 59:2615-2623.

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13. Verdrengh M, Tarkowski A (1997) Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infect Immun 65:2517-2521.

14. Duthie ES, Lorenz LL (1952) Staphylococcal coagulase: mode of action and antigenicity. J Gen Microbiol 6:9510 107.

15.

Kreiswirth BN, Löfdahl S, Betley MJ, O'Reilly M, Schlievert PM, Bergdoll MS, Novick RP (1983) The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature 305:709-712.

16.

Foster TJ (1998) in Methods in Microbiology Vol. 27: Bacterial Pathogenesis, eds. Williams P, Ketley J, Salmond G (Academic Press, London), pp 433-454.

15 17. O'Connell DP, Nanavaty T, McDevitt D, Gurusiddappa S, Höök M, Foster TJ (1998) The fibrinogen-binding MSCRAMM (clumping factor) of Staphylococcus aureus has a Ca2++-dependent inhibitory site. J Biol Chem 273:6821-6829.

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20 19. Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF (1965) Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry 2:235-254.

20. Bremell T, Abdelnour A, Tarkowski A (1992) Histopathological and serological progression of experimental Staphylococcus aureus arthritis. Infect Immun 60:2976-2985.

25 LISTA DE SECUENCIAS

<110> The Provost Fellows and Scholars of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth Near Dublin

<120> Tratamiento de infecciones microbianas 30 <130> 31757WO

<150> IE 2009/0549

<151> 2009-07-16

<160> 11

<170> PatentIn versión 3.3 35 <210> 1

<211> 933

<212> PRT

<213> Artificial

40 <220>

<223> Secuencia de proteína de longitud completa del ClfA (tipo silvestre) recombinante

<400> 1

<210> 2

<211> 1560

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Regiones del dominio del ClfA A recombinante (tipo silvestre) N1 N2 N3

<220> 5 <221> CDS

<222> (1)..(1560)

<400> 2

<210> 3

<211> 520

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

10 <400> 3

<210> 4

<211> 520

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Regiones del dominio del ClfA A N1 N2 N3 con alteraciones (ClfA D321Y P336S Y338A)

10 <400> 4

<210> 5

<211> 520

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Regiones del dominio del ClfA A N1 N2 N3 con alteraciones (ClfA P336A Y338S)

10 <400> 5

<210> 6

<211> 530

<212> PRT 5 <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región A del rClfA wt con residuos del extremo N y C adicionales

10 <400> 6

<210> 7

<211> 530

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región de rClfAPYI A wt con residuos del extremo N y C adicionales

<400> 7

<210> 8

<211> 530

<212> PRT 5 <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Región de rClfAPYII A wt con residuos del extremo N y C adicionales

10 <400> 8

<210> 9

<211> 339

<212> PRT 5 <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Residuos de rClfA 221-559

10 <400> 9

<210> 10

<211> 349

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

5 <220>

<223> Residuos de rClfA 221 a 559 con residuos del extremo N y C adicionales

<400> 10

<210> 11

<211> 321

<212> PRT 5 <213> ARTIFICIAL

<220>

<223> residuos de rClfA de 221 a 531 con residuos en los extremos N y C adicionales (truncamiento de retención

delta) -6 residuos his N-terminales, residuos N terminales Gly y Ser, y 2 residuos C-terminales (lys/leu) obtenidos a 10 partir del cebador en torno a los residuos aminoacídicos 221 a

<400> 11

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un factor A de aglutinación de proteína de unión al fibrinógeno recombinante (ClfA) o fragmento del mismo que comprende al menos los residuos de aminoácidos 221 a 531 de la región de unión al fibrinógeno, con la 5 secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID nº. 1 a 3 o una secuencia aminoacídica al menos un 90 % idéntica a las SEQ ID nº. 1 a 3, donde el residuo aminoacídico D321 está sustituido con tirosina (D321Y) y P336 e Y338 está sustituido con serina o alanina para dar como resultado rClfA D321Y P336S Y338A o rClfA D321Y P336 A Y338S y la proteína recombinante tiene capacidad reducida o carece de la capacidad de unirse no covalentemente al fibrinógeno en comparación con la proteína no mutada o fragmento de la misma, estimula una

   10 mayor respuesta inmune a las infecciones por Staphylococci que la proteína ClfA de tipo silvestre.
2. 2. El factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde la infección es una infección por Staphylococcus aureus.

   15 3. El factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión a fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la infección es una sepsis, artritis séptica y/o endocarditis.
3. 4. La proteína de unión al fibrinógeno recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 20 a 3, que comprende un fragmento de la región de unión al fibrinógeno seleccionada de:

   a.

   subregiones N123, que abarcan los residuos aminoacídicos 40 a 559 de la región de unión al fibrinógeno (Región A);

   b.

   subregiones N23, que abarcan los residuos aminoacídicos 221 a 559 de la región de unión al fibrinógeno (Región

   25 A); y/o

   c. una subregión N3, que abarca los residuos aminoacídicos 369 a 559 de la región de unión al fibrinógeno (Región A).

   30 5. La proteína de unión al fibrinógeno recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID nº. 4 a 11 o una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a las SEQ ID nº. 4 a 11.
4. 6. La proteína de unión al fibrinógeno recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

   35 a 5, donde los residuos aminoacídicos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Glu526 y/o Val527 están sustituidos con uno de entre Ala o Ser.
5. 7. La proteína de unión al fibrinógeno recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

   a 5 que comprende al menos una sustitución de residuos de aminoácidos en los residuos de aminoácidos Tyr256, 40 Pro336, Tyr338, Lys389, Glu526 y/o Val527.
6. 8. El factor A de aglutinación (ClfA) de proteína de unión a fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones microbianas.

7. 9.

   El factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 en el tratamiento o profilaxis de infecciones por Staphylococci.

8. 10.

   El factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del

   50 mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 en el tratamiento o profilaxis de la sepsis, artritis séptica y/o endocarditis.
9. 11. El factor A de aglutinación (ClfA) de la proteína de unión al fibrinógeno recombinante o fragmento del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la proteína recombinante estimula una

   55 mayor respuesta inmune a las infecciones por Staphylococci, incluyendo sepsis, artritis séptica y/o endocarditis, que la proteína ClfA de tipo silvestre, y tiene una mayor estabilidad en comparación con rClfA P336S Y338A.
10. 12. Uso de la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 7, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una infección por 60 Staphylococci.
11. 13. Una construcción de ácido nucleico, una proteína de fusión, un vector de expresión o una célula huésped que expresa la proteína recombinante, o fragmento de los mismos, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

    5 14. Una vacuna que comprende la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. 15. Un anticuerpo contra la proteína recombinante, o fragmento del mismo, de acuerdo con cualquiera de

    las reivindicaciones 1 a 7, preferentemente en forma de suero hiperinmune. 10

13. 16.

    Una composición farmacéutica inmunógena que comprende la proteína recombinante, o fragmento de la misma, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

14. 17.

    Un procedimiento para preparar la composición inmunógena de la reivindicación 16, que comprende la

    15 etapa de añadir el excipiente farmacéuticamente aceptable a la proteína recombinante, o fragmento del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.