RU2707922C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707922C1 RU2707922C1 RU2019120109A RU2019120109A RU2707922C1 RU 2707922 C1 RU2707922 C1 RU 2707922C1 RU 2019120109 A RU2019120109 A RU 2019120109A RU 2019120109 A RU2019120109 A RU 2019120109A RU 2707922 C1 RU2707922 C1 RU 2707922C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- p36gp12
- protein
- escherichia coli
- recombinant protein
- pqe
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 23
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000013596 biotechnological substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710086578 Chaperone protein gp12 Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 101710102575 Pre-neck appendage protein Proteins 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 6
- 101000870242 Bacillus phage Nf Tail knob protein gp9 Proteins 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 101001014639 Enterobacteria phage T4 Tail fiber assembly helper protein Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 101800002729 p12 Proteins 0.000 description 3
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 241000701539 T4virus Species 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 101150062912 cct3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108700004370 poly-gamma-methylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению в клетках Escherichia coli гибридного белка, и может быть использовано для очистки биотехнологических субстанций от бактериальных липополисахаридов. Получают гибридный белок P36GP12, состоящий из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного белка коротких хвостовых нитей изолята Т4-подобного бактериофага. Сконструирована плазмида pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках штамма Escherichia coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57, полученного трансформацией клеток Escherichia coli DH5αF' сконструированной плазмидой. Изобретение позволяет получить рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии и предназначена для получения рекомбинантного белка P36GP12 на основе белка хвостовых нитей Т4-подобного бактериофага, генетической конструкции, содержащей ген, кодирующий рекомбинантный белок P36GP12 и ген, кодирующий белок-шаперон этого белка, и обеспечивающей синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli и штамма бактерий Escherichia coli - продуцента рекомбинантного белка P36GP12.
Рекомбинантный белок P36GP12 может быть использован для удаления бактериальных липополисахаридов (ЛПС), в том числе эндотоксинов, при производстве биотехнологических препаратов, а также для селективного удаления бактерий и их фрагментов из жидкостей, предназначенных для инъекций, инфузий и других типов введения в том случае, когда фильтрация не позволяет добиться результата удаления бактерий и их фрагментов.
Частью производства биотехнологических субстанции для инъекционного введения является подготовка специализированных белков (антител, факторов роста, цитокинов, вакцин). В общемировой практике для продукции этих белков используются рекомбинантные штаммы Е. coli в качестве продуцентов, на поверхности которых присутствуют липополисахариды. Липополисахариды являются токсичными и смертельно опасными для организма человека, вызывая при высокой концентрации различные патологии. Поэтому при получении рекомбинантных белков необходимо очищать конечный продукт от эндотоксинов до уровня, ниже требуемого фармакопеей.
Бактериальные эндотоксины или липополисахариды - это обязательный компонент клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов, который содержится в количестве 1 миллион молекул липополисахарида на 1 клетку E. coli [1]. Эндотоксины являются токсичными для организма человека, и поэтому существуют допустимые нормы содержания эндотоксинов в фармацевтических продуктах, которые вводятся в организм человека инъекционно. Например, фармакопея Российской федерации регламентирует максимальный уровень содержания эндотоксинов при применении инъекционных лекарственных средств и биологических продуктов в размере 5 единиц эндотоксина (EU/ЕЭ) на кг массы тела в течение часа при внутривенном введении [2].
Бактериофаги рода Myoviridae, специфичные к бактерии Escherichia coli, в частности фаги рода Т4-подобных, являются одними из самых изученных фагов. Известно, что в геноме таких фагов есть открытые рамки трансляции, которые кодируют белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон. В нативном вирионе фага белок коротких хвостовых нитей обеспечивает необратимое связывание с бактерией. Связывание возможно из-за сродства белка коротких хвостовых нитей к липополисахаридам бактериальной стенки. Белок-шаперон позволяет гомотримеру белка коротких хвостовых нитей принимать нативную переплетающуюся конформацию, необходимую для осуществления связывания липополисахаридов [3]. Таким образом, короткие хвостовые белки бактериофагов Escherichia coli могут с высоким сродством связываться с липополисахаридами Escherichia coli.
На данный момент существуют разные подходы для очистки от эндотоксинов. При очистке фармацевтических продуктов используют хроматографию, в основном аффинную, а также различные варианты ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации [1, 4]. Используемые в настоящее время в фармацевтическом производстве протоколы хроматографической очистки являются, как правило, узкоспециализированными, например, в случае использования L-гистидина, в результате чего для каждого белка со своей аминокислотной последовательностью требуется трудоемкая оптимизация протокола очистки [5]. Это же относится и к хроматографическому удалению липополисахаридов [6].
Известны способы очистки белковых препаратов от эндотоксинов с использованием ионообменной хроматографии, аффинных сорбентов с иммобилизованными L-гистидином, поли-L-лизином, поли-(γ-метил-L-глутаматом) или полимиксином В, гель-фильтрации, ультрафильтрации, центрифугирования в градиенте сахарозы и фазовое разделение тритоном Х-114. Эти способы используются в продуктах таких компаний как «ToxinEraser» (полимиксин В), «Pierce High Capacity Resin» (поли-L-лизин) и «EndoBind-R» (S1 пептид). Однако вышеназванные способы во многих случаях не являются универсальными и обладают серьезными недостатками, например, во время очистки сильно уменьшается выход конечного целевого продукта. Применимость этих способов для очистки белковых субстанций от ЛПС сильно зависит от свойств целевого белка, поэтому для каждого конкретного продукта необходимо подбирать наиболее эффективную методику очистки.
Известен рекомбинантный белок, разработанный на основе хвостового белка изолята бактериофага Т4, который связывается с липополисахаридами Escherichia coli и используется в качестве активного вещества в сорбенте. Очистка с помощью данного белка в составе сорбента дает минимальные потери и высокую степень очистки, однако этот сорбент обладает высокой стоимостью и усложненной логистикой (заявка DE 10228133, опубл. 24.06.2002).
Наиболее ближайшими к заявляемой группе изобретений - прототипом, являются рекомбинантная плазмидная ДНК pT4g57g12, кодирующая белок р12 Т4-подобного фага, штамм бактерий Escherichia coli Е. coli BL21 (DE3) - продуцент рекомбинантного белка р12 и рекомбинантный белок р12 Т4-подобного бактериофага, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli [7].
Недостатками прототипа являются дороговизна и недоступность используемого для получения целевого продукта оборудования и реагентов.
Задачей заявляемого изобретения является получение рекомбинантного белка P36GP12, который обладает способностью связывать липополисахариды Escherichia coli.
Техническим результатом является создание плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57, рекомбинантного штамма Escherichia coli, несущего в себе данную конструкцию и рекомбинантного белка P36GP12, обладающего способностью связывать липополисахариды Escherichia coli.
Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, которая содержит ген, кодирующий белок-шаперон gp57 и ген, кодирующий белок коротких хвостовых нитей gp12 изолята Т4-подобного бактериофага, обладающего высоким сродством к бактериальным липополисахаридам Escherichia coli.
Поставленная задача решается также путем получения рекомбинантного штамма Escherichia coli, несущего в себе плазмиду pQE-30_P36GP12_GP57, который обеспечивает синтез рекомбинантного белка P36GP12, обладающего способностью связывать липополисахариды Escherichia coli.
Поставленная задача решается также путем получения рекомбинантного белка P36GP12, обладающего способностью связывать липополисахариды Escherichia coli.
Сущность группы изобретений заключается в следующем:
Методами генетической инженерии получают плазмидную ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, несущую гены, кодирующие рекомбинантный белок P36GP12, содержащий N-концевой олигопептид MRGSHHHHHHGSAN, а также рекомбинантный белок P36GP57, выполняющий роль шаперона для приобретения рекомбинантным белком P36GP12 нативной конформации.
Последовательность ДНК, кодирующую оба белка, получают на основе геномной ДНК изолята Т4-подобного бактериофага.
Исходным генетическим материалом для конструирования целевых плазмид служат следующие генно-инженерные исходные конструкции:
а) Плазмидная ДНК pQE-30 (QIAGEN, Германия);
б) Геномная фаговая ДНК изолята Р36 Т4-подобного бактериофага, содержащая гены, кодирующие рекомбинантный белок P36GP12 и его белок-шаперон P36GP57.
Олигонуклеотидные последовательности для конструирования плазмидной ДНК, содержащей ген, кодирующий рекомбинантный белок P36GP12 (в направлении 5' - 3'):
1. PH36_gp12_dir:
5' АТС ACG GAT CCG САА АСА АТА СТА ТТА АСС ATG ТАА AAG ACG ATG С 3'
2. PH36_gp12_rev:
5' AGT ТАА ТТТ СТС СТС ТТА ТТА GCG САС ССТ ТАТ GAT ATA GTT ТАА TGC 3'
3. PH36_gp57_dir:
5' GTG CGC ТАА ТАА GAG GAG AAA ТТА ACT ATG ТСС AAT CAG CAT GAA С 3'
4. PH36_gp57_rev:
5' СТА ATT AAG CTT ATT AAG CCT CCG TGA TCA GTT СТА CTT CCT CTT С 3'
Далее получают ДНК-фрагмент, кодирующий рекомбинантный белок P36GP12 и его белок-шаперон с нативной геномной ДНК изолята Р36 Т4-подобного бактериофага следующим образом:
1. С использованием геномной ДНК изолята Р36 Т4-подобного бактериофага в качестве матрицы и олигонуклеотидов PH36_gp12_dir и PH36_gp12_rev, соответствующих началу и концу гена короткого хвостового белка, проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации фрагмента, кодирующего белок коротких хвостовых нитей. Продукты ПЦР разделяют электрофоретически, фрагмент геля с нуклеотидными последовательностями рассчитанной длины вырезают, из фрагмента геля элюируют ДНК-фрагмент, кодирующий белок коротких хвостовых нитей, любым доступным образом, например, с использованием набора GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Аналогично с помощью олигонуклеотидов PH36_gp57_dir и PH36_gp57_rev получают ДНК-фрагмент, кодирующий белок-шаперон бактериофага Р36.
2. По матрице полученных ДНК-фрагментов проводят объединяющую ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов PH36_gp12_dir и PH36_gp57_rev. Полученный объединенный ДНК-фрагмент GP12_GP57, кодирующий белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, очищают электрофорезом в агарозном геле и элюируют из геля. Для подготовки фрагмента к реакции лигирования объединенный ДНК-фрагмент подвергают гидролизу эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII по сайтам, по которым будет проходить лигирование объединенного фрагмента и плазмиды pQE-30. Продукты гидролиза также подвергаются очистке с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле и последующему элюированию ДНК из геля.
Далее осуществляют сборку плазмидной ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, содержащей гены белка коротких хвостовых нитей бактериофага Р36 и его белок-шаперон, следующим образом:
1. Плазмидную ДНК pQE-30 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII. Для предотвращения самолигирования проводят дефосфорилирование свободных концов гидролизованной плазмидной ДНК с помощью щелочной фосфатазы (Invitrogen, США). Проводят очистку с помощью агарозного геля и последующую элюцию плазмидной ДНК из геля.
2. ДНК-фрагмент GP12_GP57, гидролизованный эндонуклеазами BamHI и HindIII и очищенный электрофорезом в агарозном геле, а также гидролизованный теми же эндонуклеазами фрагмент плазмидной ДНК pQE-30 с дефосфорилированными "липкими" концами подвергают реакции лигирования с использованием фермента ДНК-лигазы бактериофага Т4. В результате получают плазмидную ДНК pQE-30_P36GP12_GP57.
Полученная рекомбинантная плазмида pQE-30_P36GP12_GP57, кодирующая рекомбинантный белок P36GP12 и его белок-шаперон P36GP57, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 3,4 МДа и размер 5132 п.о.;
- кодирует рекомбинантные белки P36GP57 - белок-шаперон и P36GP12 - белок коротких хвостовых нитей бактериофага Р36.
- состоит из следующих элементов:
а) промоторная система транскрипции-трансляции бактериофага Т5, синтетический сайт связывания рибосом RBSII, два терминатора транскрипции: t0 терминатор фага лямбда и Т1 терминатор из rrnB оперона бактерии Е. coli и сайт инициации репликации ColE1;
б) генетические маркеры: AMPr - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток Escherichia coli к ампициллину;
в) искусственный ген, кодирующий рекомбинантный белок P36GP12, включающий N-концевой олигопептид MRGSHHHHHHGSAN и белок коротких хвостовых нитей gp12 изолята Р36 Т4-подобного бактериофага в одной рамке трансляции, а также белок-шаперон gp57, содержащий свой сайт связывания рибосом.
г) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: EcoRI (89), BamHI (146), HpaI (1462), Acc65I (1835), KpnI (1839), HindIII (1859), BglI (4261).
Физическая карта плазмиды представлена на фиг. 1
Трансформация культуры плазмидной ДНК и наработка рекомбинантного белка P36GP12
Клетки E. coli DH5αF' трансформируют сконструированной плазмидой pQE-30_P36GP12_GP57 и культивируют в течение ночи. Ночную культуру переносят в свежую среду LB с ампициллином (50 мкг/мл). Синтез белка индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 1 мМ, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста (OD600=0,6-0,8). Индуцированные клетки инкубируют 4 часа при 30°С и качании со скоростью 180 об/мин, после чего биомассу отделяют центрифугированием при 6000 g.
Морфологические признаки рекомбинантного штамма Е. coli, трансформированного плазмидной ДНК pQE-30_P36GP12_GP57 и способного продуцировать рекомбинантный белок P36GP12. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде LB или 2xYT - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6.8 до 7.0.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57.
Штамм E. coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 обеспечивает индуцируемый изопропилтиогалактозидом синтез рекомбинантного белка P36GP12 с уровнем экспрессии более 20% суммарного клеточного белка. Уровень экспрессии определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси-G250 с использованием программного обеспечения Image Lab Ver. 3.0, поставляемого с прибором GelDocXR+(Bio-Rad).
Полученный штамм депонирован в Коллекции Экстремофильных Микроорганизмов и Типовых Культур ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (КЭМТК ИХБФМ СО РАН), под регистрационным номером №974 в Международной федерации коллекций культур (WDCM/WFCC).
Лизат индуцированных клеток Е. coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 используют для очистки рекомбинантного белка P36GP12 с помощью аффинной хроматографии. В результате получают рекомбинантный белок P36GP12, представляющий собой рекомбинантный хвостовой белок изолята Т4-подобного бактериофага. Данный белок имеет молекулярную массу в нативной тримерной форме около 160 кДа, состоит из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного белка gp12 бактериофага Р36, обладающего способностью связывать бактериальные липополисахариды Е. coli. Рекомбинантный белок P36GP12 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представленную на фиг. 3, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, представленной на фиг. 2.
Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57 и штамм-продуцент E. coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающие продукцию в бактериальных клетках Е. coli нативного рекомбинантного белка P36GP12, который представляет собой белок коротких хвостовых нитей P36GP12 изолята Р36 Т4-подобного бактериофага, состоящего из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного гена белка коротких хвостовых нитей gp12, который с высоким сродством связывается с эндотоксинами бактериальных клеток Е. coli.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами, представленными на фигурах 1-6:
Фиг. 1. Общая схема структурной организации плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57 (физическая карта), где: p36gp12 - ген, кодирующий рекомбинантный белок P36GP12, p36gp57 - ген, кодирующий белок-шаперон рекомбинантного белка P36GP12, Т5 - промотор фага Т5, AmpR-ген устойчивости к ампициллину; CmR - ген устойчивости к хлорамфениколу, указаны сайты рестрикции для эндонуклеаз BamHI и HindIII.
Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57, кодирующая рекомбинантный белок P36GP12, состоящий из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного белка gp12 и белок-шаперон gp57.
Фиг. 3. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка P36GP12, состоящая из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного белка gp12.
Фиг. 4 Электрофореграмма в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) фракций разрушенных клеток DH5αF', несущих плазмиду pQE-30_P36GP12_GP57, в 10%-ном ПААГ, где дорожки: 1 - набор белков с известной молекулярной массой Spectra (Thermo Fisher scientific, США), 2 - растворимая цитоплазматическая фракция без прогрева, 3 - нерастворимая цитоплазматическая фракция без прогрева; 4 - растворимая цитоплазматическая фракция, прогретая при 95°С в лизирующем буфере, содержащем 2% додецилсульфат натрия (ДСН); 5 - нерастворимая цитоплазматическая фракция, прогретая при 95°С в лизирующем буфере, содержащем 2% ДСН. Стрелками указаны тримерная форма (160 кДа) и мономерная форма (55 кДа) хвостового белка P36GP12.
Фиг. 5 А. Электрофоретический анализ в 10%-ном ПААГ фракций, полученых при хроматографической очистке рекомбинантного белка P36GP12: 1 - набор белков с известной молекулярной массой Spectra (Thermo Fisher scientific, США); 2 - растворимая цитоплазматическая фракция до хроматографического разделения и концентрирования; 3 - проскок колонки, содержащей Ni-NTA-сорбент; 4 - фракция белков, элюированная с колонки 25 мМ раствором имидазола; 5 - фракция белков, элюированная с колонки 300 мМ раствором имидазола после концентрирования на фильтре Amicon 30 kDa (Millipore). Стрелкой указан полученный рекомбинантный белок P36GP12 в тримерной форме.
Фиг. 5 Б. Электрофоретический анализ в 10%-ном ПААГ раствора рекомбинантного белка P36GP12, сконцентрированного до концентрации 1-3 мг/мл: 1 - фракция белков, элюированная с колонки 300 мМ раствором имидазола, прогретая при 95°С в лизирующем буфере, содержащем 2% ДСН; 2 - фракция белков, элюированная с колонки 300 мМ раствором имидазола без прогрева.
Фиг. 5 В. Перенос на нитроцеллюлозную мембрану очищенного препарата рекомбинантного белка P36GP12: 1 - фракция, прогретая при 95°С в лизирующем буфере, содержащем 2% ДСН; 2 - фракция без прогрева; 3 - набор белков с известной молекулярной массой Spectra (Thermo Fisher scientific, США). Стрелками указаны молекулярные массы стандарта 52 кДа, 130 кДа и 180 кДа.
Фиг. 5 Г. Вестерн-блот анализ очищенного препарата рекомбинантного белка P36GP12: 1 - фракция, прогретая при 95°С в лизирующем буфере, содержащем 2% ДСН; 2 - фракция без прогрева. Стрелками указаны тримерная форма (160 кДа) и мономерная форма (55 кДа) рекомбинантного белка P36GP12.
Фиг. 6 А. Хроматограмма элюции рекомбинантного белка P36GP12 с колонки при гель-фильтрации.
Фиг. 6 Б. Хроматограмма элюции рекомбинантного белка P36GP12 с колонки при ионообменной хроматографии.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления.
Пример 1. Получение фрагментов ДНК, кодирующих белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон.
В качестве источника генов, кодирующих белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, используют геномную ДНК изолята Т4-подобного бактериофага. Амплификацию генов, кодирующих полноразмерные белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, проводят с помощью ПЦР, используя в качестве ДНК-зависимой ДНК-полимеразы высокоточную ДНК-полимеразу Phusion (BioLabs, Англия). Используя олигонуклеотидные последовательности, частично комплементарные генам белков коротких хвостовых нитей и его белку-шаперону, PH36_gp12_dir: 5' АТС ACG GAT CCG CAA АСА ATA СТА ТТА ACC ATG ТАА AAG ACG ATG С 3' и PH36_gp12_rev: 5' AGT TAA TTT СТС СТС ТТА TTA GCG CAC CCT TAT GAT ATA GTT TAA TGC 3', PH36_gp57_dir: 5' GTG CGC TAA TAA GAG GAG AAA TTA ACT ATG ТСС AAT CAG CAT GAA С 3' и PH36_gp57_rev: 5' СТА ATT AAG CTT ATT AAG CCT CCG TGA TCA GTT СТА CTT CCT CTT С 3' соответственно, получают фрагменты ДНК, кодирующие белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон и сайты, необходимые для узнавания эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII. ПЦР проводят в амплификаторе (Bio Rad, США). Условия проведения реакции: предварительная денатурация - 2 минуты при 94°С; 30 циклов: 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 50°С, 50 секунд при 72°С; заключительное инкубирование - 10 минут при 72°С. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, вырезают участки геля, содержащие фрагменты ДНК размером около 1431 п.о. и 258 п.о. для гена белка коротких хвостовых нитей и его белка-шаперона, соответственно. Из вырезанных участков геля элюируют ДНК-фрагменты набором GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для подтверждения гомогенности полученные ДНК-фрагменты анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.
Пример 2. Получение объединенного ДНК-фрагмента, кодирующего белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон.
Отдельные ДНК-фрагменты, кодирующие белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, далее используют в объединяющей полимеразной цепной реакции (синтез с помощью удлинения за счет перекрывающихся концов), которая позволяет наработать единый ДНК-фрагмент. Для этого готовят две реакционные смеси. Первая смесь состоит из ДНК-полимеразу Phusion, буфера для проведения реакции, 0,4 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), матрицы в виде 10 нг ДНК каждого ДНК-фрагмента. Вторая смесь содержит ДНК-полимеразу Phusion, буфер для проведения реакции, 0,4 мМ каждого дНТФ, 0,6 мМ специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили по следующему протоколу: предварительно выдерживают пробирки с первой смесью при 94°С в течение 5 минут, далее в течение 10 циклов 30 секунд при 94°С, 2 минуты при 60°С, 3 минуты при 72°С, затем инкубируют при 10°С в течение 10 минут и в это время добавляют равный объем второй смеси, после чего в течение 35 циклов выдерживают при 94°С 30 секунд, при 58°С 30 секунд, при 72°С 2 минуты, затем следует заключительное инкубирование - 10 минут при 72°С. Затем полученные ПЦР-продукты разделяли в течение часа в 1%-ном агарозном геле и вырезают участки, содержащие ДНК-фрагменты размером примерно 1689 п.о. Из вырезанных участков элюируют объединенные ДНК-фрагменты, кодирующие белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, и анализируют чистоту ДНК-фрагментов с помощью электрофоретического разделения 1%-ном агарозном геле.
Пример 3. Способ конструирования плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57.
Плазмидную ДНК pQE-30 и объединенный ДНК-фрагмент, кодирующий белок коротких хвостовых нитей и его белок-шаперон, подвергают гидролизу, используя эндонуклеазы рестрикции BamHI и HindIII, для образования липких концов. Для этого готовят две реакционных смеси, первая из которых содержит плазмидную ДНК pQE-30, 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол и по 5 ед. активности ферментов BamHI и HindIII, а вторая --объединенный ДНК-фрагмент и те же компоненты буфера и ферменты. Полученные реакционные смеси инкубируют при 37°С в течение часа. Далее продукты реакции гидролиза электрофоретически разделяют в 1%-ном агарозном геле и вырезают участки, приблизительно равные молекулярной массе линеаризованного вектора pQE-30 (3425 п.о.), либо объединенного фрагмента (1707 п.о.). Затем ДНК элюируют из геля с использованием набора GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию лигирования проводят с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 и буфера (Fermentas, Литва), предоставленного производителем, при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма DH5αF' Е. coli. С помощью полимеразной цепной реакции и олигонуклеотидов PH36_gp12_dir и PH36_gp57_rev отбирают клоны, содержащие вставку рассчитанного размера (1707 п.о.). Схема (физическая карта) полученной плазмидной ДНК pQE-30_P36GP12_GP57 представлена на фиг. 1.
Пример 4. Получение штамма-продуцента рекомбинантного белка P36GP12 Т4-подобного бактериофага
Полученной плазмидной ДНК pQE-30_P36GP12_GP57 трансформируют клетки Е. coli штамма DH5αF', и инкубируют при 37°С в течение ночи. Ночную культуру переносят в свежую среду LB в отношении объемов 1:50 и с добавлением ампициллина (50 мкг/мл). Синтез мРНК с плазмидной ДНК индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида (ИПТГ) до концентрации 1 мМ, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста (OD600=0,6-0,8). Индуцированную культуру инкубируют при 30°С в течение 6 часов для наработки рекомбинантного белка. Далее клетки осаждают центрифугированием при 6000g в течение 10 минут.
Пример 5. Получение и очистка рекомбинантного белка P36GP12.
Рекомбинантный белок P36GP12 получают из растворимой цитоплазматической фракции индуцированных клеток Е. coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 в результате аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Qiagen, Германия). Индуцированные клетки Е. coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 осаждают центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в 1/10 объема буфера PBS, содержащего 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 KH2PO4, и разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора в течение 15 мин импульсами мощностью 500 Вт и продолжительностью 20 сек с перерывами 20 сек между импульсами. Полученную суспензию центрифугируют при 16000 g в течение 10 минут, после чего переносят в чистую пробирку супернатант, представляющий собой раствор цитоплазматических белков, а осадок растворяют в PBS. Полученные клеточные фракции анализируют электрофорезом в 10% полиакриламидном геле по Лэммли с предварительным прогреванием проб при 95°С либо без прогревания.
Электрофореграмма фракций разрушенных клеток DH5αF', несущих плазмиду pQE-30_P36GP12_GP57, в 10%-ном ПААГ представлена на фиг. 4. Результаты анализа демонстрируют, что в растворимой цитоплазматической фракции культуры DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 содержится белок, по электрофоретической подвижности соответствующий рекомбинантному белку P36GP12 в форме тримера с расчетной молекулярной массой около 160 кДа (дорожка 2). В результате прогревания белок P36GP12 переходит в мономерную форму с молекулярной массой около 55 кДа (дорожка 4).
На хроматографическую колонку, содержащую 4 мл Ni-NTA агарозы (Qiagen, Германия) и уравновешенную буфером А, содержащим 50 мМ Na-фосфатный буфер рН 8.0, 300 мМ NaCl, 5 мМ Трис-HCl, наносят 20 мл раствора, представляющего собой фракцию растворимых цитоплазматических белков индуцированных клеток. Нанесение производят со скоростью потока 1 мл/мин. Колонку промывают 20 мл буфера А, после чего проводят элюцию неспецифически сорбирующихся белков Е. coli 20 мл буфера А, содержащего дополнительно 25 мМ имидазола. Рекомбинантный белок элюируют 10 мл буфера А, содержащего 300 мМ имидазола. Полученные белковые фракции диализуют против 150 мМ NaCl, Трис-HCl рН 7.5 (две смены по 18 ч при 5°С) и анализируют электрофорезом в 10% полиакриламидном геле по Лэммли.
На фиг. 5 А представлен очищенный на хроматографической колонке рекомбинантный белок P36GP12, содержащийся в тримерной форме (дорожка 5). Далее с помощью фильтра Amicon ultra-4 (Millipore) с порогом отсечения 50 кДа, концентрируют раствор белка P36GP12 до концентрации 0,5-3 мг/мл.
Электрофореграмма белка P36GP12 после концентрирования представлена на фиг. 5 Б. Рекомбинантный белок P36GP12 находится в тримерной форме с молекулярной массой 160 кДа (дорожка 2), однако при нагревании при 95°С в присутствии додецилсульфата натрия переходит в мономерную форму (дорожка 1).
Наличие гексагистидиновой последовательности в полученном рекомбинантном белке подтверждают вестерн-блот анализом. Для этого образец, содержащий около 2 мкг рекомбинантного белка P36GP12, разделяют в 10% полиакриламидном геле с предварительным прогреванием при 95°С, либо без прогревания, переносят на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса при напряжении 80 В в течение 4 часов. Мембрану окрашивают кислым раствором красителя Ponseau S (Понсо С) в течение 15 мин. Результат представлен на фиг. 5 В. Рекомбинантный белок P36GP12 находится в тримерной форме (дорожка 2), либо в мономерной форме (дорожка 1).
Вестерн-блот анализ проводят следующим образом. На первой стадии окрашенную нитроцеллюлозную мембрану, содержащую белок P36GP12 в тримерной и мономерной форме, а также белковый маркер молекулярных масс, блокируют инкубированием при 37°С в течение 1 часа в 4% суспензии нежирного сухого молока, разведенной в PBS с добавлением детергента Твин-20 (PBS-твин). Далее мембрану инкубируют с мышиным моноклональным антителом 6x-His Tag Monoclonal Antibody (Thermo Fisher scientific, США), разведенном в 10000 раз в буфере PBS-твин в течение 1 часа при 37°С на орбитальной шейкерной платформе. После трехкратной серии пятиминутных промывок в буфере PBS-твин мембрану инкубируют в течение 1 часа при 37°С на орбитальной шейкерной платформе в растворе, содержащем в разведении 1/5000 антитела козы против полной молекулы антител мыши Anti-Mouse IgG (whole molecule) antibody produced in goat, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma-Aldrich, США). После трехкратной серии пятиминутных промывок в буфере PBS-твин мембрану трижды промывают буфером для щелочной фосфатазы (АР-буфер, состав: 100 мМ Трис рН 9.5; 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0.1% Твин 20). Образовавшиеся иммунные комплексы выявляют в результате инкубации мембраны в АР-буфере, содержащем красители nitro blue tetrazolium (NBT) и 4-бром-5-хлор-индолилфосфат (BCIP) в конечной концентрации 170 мкг/мл и 330 мкг/мл, соответственно.
Результат вестерн-блот анализа подтверждает, что как тримерная, так и мономерная форма белка содержат гексагистидиновый олигопептид. В совокупности с молекулярной тримерной и мономерной форм белка, оцененной по подвижности в геле, а также с тем обстоятельством, что при нагревании в присутствии додецилсульфата натрия молекулярная масса белка уменьшается приблизительно в 3 раза, можно заключить, что анализируемый белок представляет собой целевой рекомбинантный белок P36GP12.
Пример 6. Проверка способности белка P36GP12 связываться с декстран-содержащими полимерами.
Рекомбинантный белок P36GP12, растворенный до концентрации 1 мг/мл в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5 при 22°С, используют в качестве тестового образца при проведении гель-фильтрации с использованием колонки "Superdex 200 Increase 10/300 GL" (GE Healthcare) диаметром 10 мм и длиной 300 мм и хроматографа AKTA Explorer 100 (GE Healthcare). В петлю объемом 500 мкл вносят 1 мл исследуемого образца. Хроматографию проводят при 22°С и скорости потока 0,4 мл/мин, используя в качестве системного буфера буфер, содержащий 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5 при 22°С. Объем элюции после введения пробы из петли на колонку составляет 26,4 мл. Полученную в результате хроматограмму (фиг. 6 А) регистрируют и с помощью программного обеспечения Unicorn 5 интегрируют сигнал, детектируемый при длине волны 280 нм. Полученное значение составляет 40±4 mAU*мл, где mAU - относительная единица оптической плотности, используемая в данном хроматографе.
Далее рекомбинантный белок P36GP12, растворенный до концентрации 1 мг/мл в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 9,0 при 22°С, используют в качестве тестового образца при проведении ионообменной хроматографии с использованием колонки "POROS HQ20 4.6/100" (GE Healthcare) диаметром 4.6 мм и длиной 100 мми хроматографа AKTA Explorer 100 (GE Healthcare). В петлю объемом 500 мкл вносят 1 мл исследуемого образца. Хроматографию проводят при 22°С и скорости потока 0.4 мл/мин, используя в качестве буфера А, буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl, рН 9,0 при 22°С, а в качестве буфера Б, буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН 9,0 при 22°С. Элюция достигается градиентом от 0 до 100% буфера Б за 10 объемов колонки. Полученную в результате хроматограмму (фиг. 6 Б) регистрируют и с помощью программного обеспечения Unicorn 5 интегрируют сигнал, детектируемый при длине волны 280 нм. Полученное значение составляет 1000±100 mAU*мл, где mAU - относительная единица оптической плотности, используемая в данном хроматографе.
Сопоставляя интегральную оптическую плотность элюата на выходе колонки, полученную в результате гель-фильтрации, с интегральной оптической плотностью элюата на выходе с колонки, полученную в результате ионообменной хроматографии, регистрируют достоверное различие, которое достигает 10-30 раз. Это различие свидетельствует о том, что в случае гель-фильтрации наблюдается аффинное взаимодействие белка P36GP12 с хроматографической матрицей, представляющей собой декстран, сшитый с агарозой, то есть полимер, состоящий из звеньев глюкозы и галактозы. Наличие такого взаимодействия свидетельствует о наличии у белка P36GP12 свойства связываться с липополисахаридами, присущего адгезинам бактериофагов.
Рекомбинантный белок P36GP12 может быть использован для очистки биотехнологических субстанций от бактериальных липополисахаридов.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Petsch D., Anspach F. В. Endotoxin removal from protein solutions // J. Biotechnol. - 2000. - T. 76, №2-3. - C. 97-119.
2. Статья ОФС.1.2.4.0006.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) XIV.
3. Anspach F. В. Endotoxin removal by affinity sorbents // J. Biochem Biophys. Methods. - 2001. - T. 49, №1-3. - C. 665-81.
4. 
Lopes A., Mazzola P., Rangel-Yagui C, Penna Т., Pessoa A. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. // J. Pharm Pharm. Sci. - 2007. - T. 10, №3. - C. 388-404.
5. Matsumae H., Minobe S., Kindan K., Watanabe Т., Sato Т., Tosa T. Specific removal of endotoxin from protein solutions by immobilized histidine // Biotechnol Appl Biochem. - 1990. - T. 12, №2. - C. 129-40.
6. Riede I. Receptor specificity of the short tail fibres (gp12) of T-even type Escherichia coli phages // Mol. Gen Genet. - 1987. - T. 206, №1. - С. 110-5.
7. Burda M. R, Miller S Folding of coliphage T4 short tail fiber in vitro. Analysing the role of a bacteriophage-encoded chaperone // Eur J Biochem. - 1999. - №265. - C. 771-8.
Claims (6)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12, имеющая молекулярную массу 3,4 МДа и размер 5132 п.о. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой плазмиды, приведенной на фиг. 1:
- фрагмент плазмидной ДНК pQE-30 (QIAgen) размером 3425 п.о., линеаризованную по BamHI и HindIII сайтам и включающую сайт инициации репликации ColE1,
- фрагмент размером 1431 п.о., кодирующий олигопептид MRGSHHHHHHGSAN, и уникальные сайты рестрикции BamHI (146), HindIII (1859);
- BamHI и HindIII - фрагмент размером 1707 п.о., кодирующий рекомбинантный белок коротких хвостовых нитей, причем нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pQE-30_P36GP12_GP57, кодирующая N-концевой олигопептид MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерный белок коротких хвостовых нитей, с SEQ ID NO: 1, представлена на фиг. 2.
2. Штамм бактерий Escherichia coli DH5αF'/pQE-30_P36GP12_GP57 - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, полученный трансформацией клеток Escherichia coli DH5αF' плазмидной ДНК pQE-30_P36GP12_GP57 по п. 1.
3. Рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli, имеющий молекулярную массу около 160 кДа и состоящий из N-концевого олигопептида MRGSHHHHHHGSAN и полноразмерного белка коротких хвостовых нитей изолята Т4-подобного бактериофага, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представленную на фиг. 3, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, представленной на фиг. 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120109A RU2707922C1 (ru) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019120109A RU2707922C1 (ru) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2707922C1 true RU2707922C1 (ru) | 2019-12-02 |
Family
ID=68836509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019120109A RU2707922C1 (ru) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2707922C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2801848C1 (ru) * | 2022-06-10 | 2023-08-16 | Общество с ограниченной ответственностью "ТРАНСГЕН" | Генетическая конструкция, адаптированная для доставки гена SMN1 человека с помощью аденоассоциированного вируса серотипа 2 для обеспечения нейроспецифичной экспрессии |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3238742A1 (en) * | 2009-06-22 | 2017-11-01 | Wyeth LLC | Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens |
-
2019
- 2019-06-27 RU RU2019120109A patent/RU2707922C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3238742A1 (en) * | 2009-06-22 | 2017-11-01 | Wyeth LLC | Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BURDA M.R. et al. Folding of coliphage T4 short tail fiber in vitro. Analysing the role of a bacteriophage-encoded chaperone, Eur. J. Biochem., 1999, v.265, n.2, p.771-778. * |
| BURDA M.R. et al. Folding of coliphage T4 short tail fiber in vitro. Analysing the role of a bacteriophage-encoded chaperone, Eur. J. Biochem., 1999, v.265, n.2, p.771-778. БД "UniProtKB", последовательность A0A482MK04 9CAUD, размещена 05.06.2019. * |
| БД "UniProtKB", последовательность A0A482MK04 9CAUD, размещена 05.06.2019 * |
| БОКОВАЯ О.В. и др. Получение рекомбинантных эндотоксин-связывающих белков бактериофагов, Биотехнология - медицине будущего, Материалы всероссийской конференции с международным участием, Новосибирск, 24-26 июля, 2017 г., Новосибирск, ООО "Офсет-ТМ", 2017, 130 c. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2801848C1 (ru) * | 2022-06-10 | 2023-08-16 | Общество с ограниченной ответственностью "ТРАНСГЕН" | Генетическая конструкция, адаптированная для доставки гена SMN1 человека с помощью аденоассоциированного вируса серотипа 2 для обеспечения нейроспецифичной экспрессии |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11939604B2 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| Casjens et al. | Bacteriophage lambda: Early pioneer and still relevant | |
| US9394344B2 (en) | Compositions and methods for the display of proteins on the surface of bacteria and their derived vesicles and uses thereof | |
| US9523101B2 (en) | Protein and nucleic acid delivery vehicles, components and mechanisms thereof | |
| US20090298706A1 (en) | Method for cell surface displaying of target proteins using bacillus anthracis exosporium | |
| CH653705A5 (fr) | Plasmides comportant un site d'introduction pour un fragment d'adn eucaryote, leur preparation et leur utilisation. | |
| Jarchow et al. | Identification of potential substrate proteins for the periplasmic Escherichia coli chaperone Skp | |
| JPH11511983A (ja) | 細胞表面における物質の付着およびディスプレイに関連する材料および方法 | |
| JPH07502640A (ja) | シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び膜固定配列をコードする組換えｄｎａ配列 | |
| Tao et al. | Highly effective soluble and bacteriophage T4 nanoparticle plague vaccines against Yersinia pestis | |
| Zhu et al. | Preparation of a bacteriophage T4-based prokaryotic-eukaryotic hybrid viral vector for delivery of large cargos of genes and proteins into human cells | |
| RU2707922C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-30_P36GP12_GP57, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка P36GP12 в клетках Escherichia coli, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка P36GP12, рекомбинантный белок P36GP12, обладающий способностью связывать липополисахариды Escherichia coli | |
| KR100690948B1 (ko) | 대장균의 외막 단백질을 이용한 목적 단백질의 미생물표면발현 방법 | |
| CN105624082B (zh) | 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用 | |
| CN111448320B (zh) | 细胞膜穿透肽 | |
| Wang et al. | Cloning of the J gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor | |
| Savinov et al. | Search for ligand of N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl dipeptide using its peptide mimetic | |
| CA3143699A1 (en) | Method for producing a modified bacteriophage without genome modification | |
| RU2653750C1 (ru) | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli | |
| JPH02500640A (ja) | 所定のポリペプチドと糖に対して親和性のタンパク質とをコードする核酸配列を含む組換体ｄｎａにより形質転換された宿主生物中で該ポリペプチドを製造する方法。応用、特にワクチン組成物の製造への応用 | |
| CN116376948B (zh) | 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 | |
| Mouratou et al. | Application of Affitins for Affinity Purification of Proteins | |
| EP2582797A1 (en) | A method of producing bacteriophages | |
| Brown | Multivalent display using hybrid virus nanoparticles | |
| Kay et al. | Production of Vaccines Using Biological Conjugation |