CH653705A5 - Plasmides comportant un site d'introduction pour un fragment d'adn eucaryote, leur preparation et leur utilisation. - Google Patents

Description

La présente invention concerne donc un plasmide possédant un site d'insertion pour un fragment d'ADN eucaryote voisin d'un promoteur bactérien et en aval d'un ribosome procaryote liant le site et le codon initiateur de telle façon que le promoteur bactérien règle ou 20 maîtrise la transcription et la traduction d'un fragment d'ADN inséré ou introduit.

Un tel plasmide peut être préparé par la mise en œuvre d'un procédé caractérisé en ce que l'on clone un promoteur bactérien dans un plasmide isolé, on détermine la position d'un site d'insertion 25 voulu et on réalise le site d'insertion s'il n'est pas déjà présent.

Ce plasmide peut être produit par la digestion de l'ADN cellulaire avec une enzyme de restriction spécifique, l'isolement du fragment contenant le promoteur et le clonage du fragment dans un plasmide bactérien approprié.

30 L'invention est également relative à un plasmide dans lequel est introduit ou inséré un fragment d'ADN eucaryote au site d'insertion ou d'introduction.

Le fragment d'ADN eucaryote peut être introduit ou inséré dans le plasmide préparé par des techniques connues.

35 A des fins illustratives, l'un des plasmides concernés est celui qui possède les caractéristiques représentées graphiquement sur la fig. 1 des dessins annexés, à savoir une longueur moléculaire de 6750 bp, un site Hind III, un site Barn HI à 346 bp à partir du site Hind III, un site Sai I à 275 bp à partir du site Barn HI, un site Hpa I à 40 4230 bp à partir du site Sai I et à 1950 bp du site Hind III, le plasmide possédant le promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie de 1950 bp s'étendant entre le site Hpa I et le site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la partie de 4800 bp entre le site Hind III et le site Hpa I.

45 Ici encore, à des fins illustratives, ce plasmide, appelé dans le présent mémoire pEH5, peut être produit de la manière suivante:

a) Isolement du fragment Hind III trpE

On peut obtenir ce fragment soit par la digestion à l'Hind III so (EC3.1.23.21) de l'ADN de la plupart des souches d'i?, coli, par exemple la souche d'i?, coli W3110, soit par la digestion à l'Hind III du plasmide pRHl/trpE. Le pRHl fut lui-même obtenu par digestion à l'Eco RI (EC3.1.4.32) de plasmides d'E. coli pDSl 118 et pML2, liaison des fragments ainsi obtenus et sélection pour la résis-55 tance à l'ampicilline et à la kanamycine. La digestion à l'Hind III du pRHI et la liaison avec de l'ADN de souche d'E. coli W3110 digéré à l'Hind III, suivies de la transformation en souche W3110 trpoEVl et de la culture en l'absence de tryptophane, ont produit le pRHl/trpE.

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b) Clonage du fragment Hind III trpE

Le fragment Hind III trpE, obtenu de la manière décrite ci-dessus, était lié de manière covalente à un fragment obtenu par restriction à l'Hind III du plasmide pBR322 [voir, par exemple, Bolivar 65 F. et coll. (1977), «Gene», 2, 95-113], On a utilisé l'ADN lié pour transformer E. coli W3110 trpoEVl et des colonies choisies pour leur résistance à l'ampicilline et la complémentation tryptophanique. On a constaté que les plasmides obtenus étaient de deux types, dé

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pendant de l'orientation des fragments au cours de la liaison; ces deux plasmides, appelés dans le présent mémoire pEH3 et pEH4,

sont illustrés sur les fig. 2 et 3, respectivement, des dessins ci-annexés. On a choisi le plasmide pEH3 sur la base de sa résistance à la tétracycline et on l'a utilisé pour l'étape suivante de la production des plasmides qui font l'objet de la présente invention. Le plasmide pEH3 possède les caractéristiques qui suivent: une longueur moléculaire de 9866 bp; un site Hind III; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I et un site Eco RI à 3709 bp du Sai I; un second site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa I à 305 bp du second Hind III; un second site Hpa I à 3250 bp du premier Hpa I et à 1950 bp du premier Hind III, le plasmide possédant un promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie à 1950 bp entre le second site Hpa I et le premier site Hind III ; le gène pour la résistance à la tétracycline suivant immédiatement le premier site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la partie à 3709 bp entre le site Sai I et le site Eco RI.

c) Suppression du site Hind III proximal du site Eco RI dans pEH3

On a provoqué la digestion du pEH3 avec l'Eco RI de manière à engendrer des molécules linéaires dont on a provoqué la digestion avec de l'exonucléase III (EC 3.1.4.27) et ensuite avec la SI nucléase (EC 3.1.4.-) de manière à enlever les queues faisant saillie en 5' et à produire des extrémités émoussées. Ensuite, on a lié les molécules linéaires avec de l'ADN ligase induite au T4 (EC 6.5.1.1) et on a utilisé le plasmide ainsi obtenu pour transformer la souche trpoEVl et on l'a choisi pour la complémentation au trp et la résistance à l'ampicilline afin d'obtenir le plasmide suivant la présente invention auquel on se réfère sous l'appellation de pEH5 (illustré sur la fig. 1).

Le plasmide pEH4 possède les caractéristiques suivantes: une longueur moléculaire de 9866 bp; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Eco RI à 3709 bp du Sai I; un second site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa I à 1950 bp du second site Hind III; un second site Hpa I à 3250 bp du premier Hpa I et à 305 bp du premier Hind III, le plasmide possédant le promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie à 1950 bp entre le second site Hind III et le premier site Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline suivant immédiatement le premier site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la partie à 3709 bp entre le site Sai I et le site Eco RI, le plasmide étant appelé pEH4. Le pEH4 peut être produit d'une manière similaire à celle utilisée pour la production du pEH3, sauf que le choix s'effectue sur base de sa sensibilité à la tétracycline.

Comme on l'a mentionné plus haut, une utilité particulière des plasmides suivant l'invention réside dans le fait qu'ils possèdent un site nettement défini convenant à l'introduction d'un fragment d'ADN eucaryote souhaité et que leur structure est telle que la transcription de l'ADN introduit est réglée par le promoteur, en particulier un promoteur trp, associé au site d'introduction défini, par exemple le site Hind III du plasmide pEH5 (illustré sur la fig. 1 des dessins annexés). Ce plasmide représente, par conséquent, un intermédiaire final de valeur à partir duquel on peut produire des plasmides dans lesquels est introduit au site d'introduction ou d'insertion, par exemple, le site Hind III, une information génétique sous la forale d'un ADN convenablement modifié destiné à produire une substance polypeptidique souhaitée.

En termes généraux, la préparation de l'ADN voulu, la modification de cet ADN en vue de son insertion ou introduction et les procédés d'introduction ou d'insertion, comme aussi les procédés subséquents de production de protéines, sont bien connus et peuvent se résumer et s'illustrer de la manière suivante:

1) Source de l'ADN à introduire

L'ADN pour l'introduction peut être obtenu par mise en œuvre de toute une série de procédés. Par exemple, on peut synthétiser des oligonucléotides de diverses longueurs [voir, par exemple, Hsiung et coll. (1979), «Nucleic Acids Research», 6, 1371-1385],

On peut assembler plusieurs oligonucléotides, par suite de leurs propriétés d'appariement aux bases spécifiques, en molécules plus longues, à double brin. Les oligonucléotides composant cette molécule peuvent être unis (liés) par l'enzyme qu'est l'ADN ligase. 5 Les molécules d'ADN de la spécificité génétique souhaitée peuvent aussi être synthétisées par l'emploi de la transcriptase inverse, en utilisant l'ARN de la spécificité voulue à titre de matrice. On peut isoler l'ARN à partir de cellules par mise en œuvre de procédés connus.

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2) Préparation de l'ADN en vue de son introduction

On peut modifier l'ADN en vue de son introduction dans le plasmide par mise en œuvre de toute une série de procédés. Par exemple, on peut allonger l'ADN préparé de la manière décrite ci-dessus à 15 l'extrémité 3' de chacun des doubles brins à l'aide de la transférase terminale (EC 2.7.7.31) de manière à obtenir une élongation monocaténaire homopolymère. L'extrémité 3' du plasmide digéré à l'Hind III peut être allongée de manière à obtenir une élongation monocaténaire homopolymère. L'extrémité 3' du plasmide digéré à 20 l'Hind III peut être allongée de manière similaire. Si l'élongation de l'ADN préparé est (dA)„ et celle du plasmide est (dT)n ou vice versa, ou si l'élongation de l'ADN préparé est (dG)n et celle du plasmide est (dC)n ou vice versa, alors l'ADN pour l'introduction ou insertion et le plasmide peuvent être hybridés par ces élongations monocaté-25 naires, de manière que soient formées des molécules circulaires où l'ADN préparé est introduit au site Hind III du plasmide. De tels plasmides peuvent être utilisés pour transformer des cellules d'E. coli et des colonies des transformants choisis par mise en œuvre de procédés connus [voir, par exemple, Glover D., «New Techniques in 30 Biophysics and Cell Biology» (Ed. Pain, R.H., et Smith, B.J.), 8, 125-145 (Wiley, New York, 1976)]. Les extrémités de l'ADN préparé de la manière décrite plus haut peuvent aussi être liées à l'enzyme qu'est l'ADN ligase pour raccourcir les molécules d'ADN à double brin (fixateurs d'Hind III que l'on peut se procurer à la société Col-35 laborative Research, Waltham, Mass., EUA), qui contiennent la séquence reconnue par l'enzyme de restriction d'Hind III. La digestion de ces molécules par cette enzyme après la liaison engendre des terminus Hind III aux extrémités de l'ADN préparé. L'ADN préparé peut ensuite être introduit dans la digestion suivante du plasmide à 40 l'aide d'Hind III selon des procédés connus.

3) Préparation du peptide

Les mécanismes connus de fonctionnement des promoteurs bactériens ensemble avec les données susmentionnées conduisent à la 45 conclusion que lorsque l'opérateur est ouvert, la transcription à partir du promoteur se déroule à partir de trpE et trpD par le site Hind III et dans les régions du génome au-delà du site Hind III. La traduction du produit de la transcription donne un polypeptide lu lié au gène D (à moins qu'un codon de terminaison ne soit incorporé au 50 produit d'insertion). Le polypeptide produit peut être identifié par mise en œuvre de procédés connus, par exemple en transférant le plasmide dans une souche qui produit des minicellules [voir, par exemple, Meagher R.B. (1977), «Cell», 10, 521-536], dans lesquelles les produits polypeptidiques de génomes à plasmides sont aisément 5S distingués, ou par mise en œuvre de procédés immunologiques [voir, par exemple, Broome S. et Gilbert W. (1978), «Proc. Nati. Acad. Sci. USA», 75, 2746-2749].

Le polypeptide lu peut être purifié par mise en œuvre de procédés connus et le produit polypeptidique souhaité peut être engendré par 60 digestion du polypeptide par des moyens enzymatiques ou chimiques spécifiques.

Le plasmide pEH5 selon l'invention peut également être utilisé comme source d'ADN pour construire une autre série de vecteurs de plasmides, appelée la série pWT.

65 On peut traiter le plasmide pEH5 par l'endonucléase de restriction Hinf I (EC 3.1.23.22) afin d'en obtenir un fragment d'approxi-mativement 497 bp contenant le promoteur à tryptophane complet, la séquence directrice et les sept premiers aminoacides du trpE. Le

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fragment d'Hinf I ainsi obtenu peut ensuite être cloné dans le site Hind III du plasmide connu pBR322. Ce clonage peut s'effectuer en traitant les extrémités Hinf I du fragment par de l'ADN polymérase I (EC.2.7.7.7) et en soumettant les fragments d'Hinf I chargés d'ADN à l'action de fixateurs d'Hind III en présence successivement d'ADN ligase et d'endonucléase de restriction d'Hind III, de manière à obtenir le fragment avec des extrémités collantes Hind III.

Ensuite, on peut cloner le fragment Hinf I dans le plasmide pBR322 par restriction d'Hind III du pBR322 et liaison du plasmide ayant subi la restriction au fragment Hinf I.

Le fragment Hinf I peut être introduit dans le site Hind III du pBR322 selon l'une des deux orientations, comme décrit à propos de pEH3 et 4. L'une de ces orientations, conformément à laquelle le promoteur trp est transcrit dans la direction des gènes tet, est choisie par l'analyse à l'enzyme de restriction de clones individuels. [La séquence de pBR322 est connue; voir, par exemple, Sutcliffe J.G., «Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology» (1978), XL11, 77-90. La séquence du promoteur trp/opérateur est également connue, voir, par exemple, Bennett G.N. et coll. (1978), «J. Mol. Biol.», 121,113-137, et Lee F. et coll., «J. Mol. Biol.» (1978), 121, 193-217.]

Le plasmide ainsi obtenu est appelé dans le présent mémoire pWTlOl, dont la structure est illustrée sur la fig. 4 des dessins ci-annexés. Ce plasmide possède les caractéristiques suivantes: une longueur moléculaire de 4874 bp; un site Eco RI; un site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa à 313 bp de l'Hind III; un second site Hind III à 199 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 346 bp du second Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 2958 bp du Sai I et à 752 bp de l'Eco RI; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant à partir de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline étant situé dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le second site Hind III.

En raison de sa production ci-dessus illustrée, le plasmide pWTlOl comporte deux sites Hind III, un à chaque extrémité du fragment Hinf I introduit à partir du pEH5 d'origine.

Afin de garantir que l'ADN introduit soit situé au voisinage du promoteur à tryptophane, il est nécessaire de supprimer le site Hind III en amont du promoteur à tryptophane, et cela peut être réalisé par la restriction du plasmide pWTlOl avec l'endonucléase de restriction Eco RI, digestion avec l'exonucléase III et SI, traitement avec de l'ADN polymérase I (pour remplir n'importe quelles extrémités asymétriques produites par la digestion à la SI nucléase) et liaison des extrémités libres du plasmide pour engendrer un dérivé depWTlOl, appelé dans le présent mémoire pWTlll, qui ne possède qu'un site Hind III et celui en aval du promoteur à trp.

Par conséquent, l'invention concerne également un plasmide pWTlll, adapté à recevoir l'ADN introduit au site Hind III, ce qui a pour résultat que l'ADN est soumis à l'influence directe du promoteur à trp. La transcription et la traduction de l'ADN introduit peuvent être aisément confirmées, étant donné que le plasmide contient, à l'aval du fragment introduit, le gène pour la résistance à la tétracycline, si bien que la transcription à travers l'ADN introduit se déroule par l'intermédiaire du gène tet-r produisant la résistance à la tétracycline qui n'est pas produite si la transcription par l'intermédiaire de l'ADN introduit ne se déroule pas.

En fonction de la nature du fragment d'ADN qu'il est souhaitable d'introduire ou insérer, il est nécessaire d'assurer un phasage correct dans le plasmide apparié avec celui de l'ADN à introduire. Par conséquent, le cADN à double brin, préparé par transcription inverse à partir de mARN, s'il est complet, contient normalement une longueur de nucléotides à titre de région directrice ou d'attaque, préalablement à la séquence protéinique. En raison de cette caractéristique, la traduction de la protéine en tant que partie d'un polypep-5 tide condensé dans un plasmide, tel que pWTl 11 (cloné au site Hind III) devient dépendante du nombre de nucléotides dans le directeur, c'est-à-dire qu'une transcription inverse incomplète peut réduire la séquence directrice en altérant ainsi le châssis de lecture. Pour cette raison, la construction de plasmides d'expression aptes à io traduire pour les trois châssis de lecture est essentielle.

Le plasmide pWTl 11 permet la traduction de l'ADN introduit au site Hind III comme polypeptide condensé dans un châssis de lecture seulement (si l'ADN introduit comporte son propre site de liaison de ribosome fonctionnel, cela ne s'applique pas). La traduc-15 tion commence avec les sept premiers aminoacides de trpE, puis se poursuit par les deux aminoacides de l'ADN fixateur de l'Hind III et se déroule ensuite dans la séquence introduite. S'il n'existait pas de codons non-sens ou d'arrêt dans cette séquence, la traduction se terminerait au premier codon non-sens ou d'arrêt dans la région tétra-20 cyclinique.

La séquence nucléotidique à travers le site Hind III du pBR322 montre que, pour le pWTl 11, le premier codon non-sens est situé 26 nucléotides en aval du site Hind III.

Pour changer le phasage du site Hind III de pWTl 11, le plas-25 mide doit subir une restriction avec Hind III, les élongations 5' char-, gées d'ADN polymérase I et l'ADN fixateur de l'Hind III lié. La restriction avec Hind III, afin d'enlever l'excès de fixateur et de produire des extrémités collantes et la reliaison a produit le pWT121. Ce mode opératoire ajoute 14 bp d'ADN et altère le châssis ou cadre de 30 lecture du nouveau site Hind III (le vieux site est à présent incomplet) de plus un nucléotide.

Le troisième châssis ou cadre de lecture, c'est-à-dire pWTl 11 plus 2 nucléotides, a été obtenu en répétant la même série de réactions sur pWTlOl et le plasmide résultant est appelé dans le présent 35 mémoire pWT 131.

La structure des plasmides pWTl 11, pWT121 et pWT131 est représentée sur la fig. 5 des dessins ci-annexés. La structure peut être encore définie comme suit:

40 pWTlll

Une longueur moléculaire de 4823 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 199 bp du site Hpa I; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 2958 bp du Sai I et à 1045 bp de l'Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline 45 s'étendant de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le site Hind III.

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pWT12I

Une longueur moléculaire de 4837 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 206 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 353 bp de l'Hind III; par ailleurs, comme pour pWTl 11.

55

pWT131

Une longueur moléculaire de 4851 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 213 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 360 bp de l'Hind III; par ailleurs, comme pour pWTl 11.

60 Les séquences autour du site Hind III de pWTlll, 121 et 131 sont comme suit:

pWTlll site

Hind III

5' ATG, CAA, ACA, CAA, AAA, CCG, ACT, CCA, AGC, TTT, AAT, GCG, GT ... 3'

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6

pWT121

site

Hind III

I I

5' ATG, CAA, ACA, CAA, AAA, CCG, ACT, CCA, AGC, TCC, AAG, CTT, GGA, GCT, TTA, ATG, C... 3' pWTBl site

Hind III

i I

5'... AAA, CCG, ACT, CCA, AGC, TCC, AAG, CTG, CAA, GCT, TGG, AGC, TTG, GAG, CTT, TAA, TG ... 3'

(Pour des raisons de commodité, les séquences ci-dessus ne montrent qu'un brin de l'ADN.)

A titre illustrati!", on peut constater l'efficacité des plasmides pWTll 1, 121 et 131 comme vecteurs pour l'ADN introduit, à la lumière des résultats obtenus par l'insertion ou introduction dans le pWT121 du plasmide de la phase correcte dans ce cas, d'un gène du virus de la peste aviaire (FPV) synthétique [voir, par exemple, la demande de brevet anglais N° 80.10777 et Emtage J.S. et coll. (1980), «Nature», 283,171-174],

Le gène du FPV synthétique peut être cloné dans le pWT121 comme suit:

On a soumis le plasmide pWT121 à une restriction avec Hind III et on l'a traité par de la phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1) de manière à enlever les groupes 5'-phosphate. On a lié les fixateurs d'Hind III aux extrémités du gène du FPV synthétique, que l'on a ensuite traité par l'endonucléase de restriction d'Hind III de façon à produire les extrémités collantes Hind III. On a ensuite lié le gène du FPV synthétique ainsi traité et le pWT121 ayant subi la restriction à l'Hind III de façon à obtenir le plasmide pWT121/FPV. On peut aussi cloner le gène du FPV synthétique dans le plasmide pBR322 et le transférer ensuite au pWT121 de manière connue.

La structure générale du plasmide pWT121/FPV est illustrée sur la fig. 6 des dessins ci-annexés. La structure peut être plus amplement définie comme suit: une longueur moléculaire de 6532 bp; un site Hind III; un site Sma I à 365 bp de l'Hind III; un site Eco RI à 910 bp du Sma I; un second site Hind III à 460 bp de l'Eco RI; un site Barn HI à 353 bp du second Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn HI; un site Pst I à 2958 bp du Sai I; un site Hpa I à 1045 bp du Pst I et à 206 bp du premier Hind III; le gène du FPV synthétique dans la partie de 1735 bp entre le premier et le second site Hind III; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant du second site Hind III jusqu'au-delà du site Bam HI et le gène pour la résistance à l'ampicilline s'étendant dans la région du site Pst I.

En fonction de l'orientation du gène du FPV, on a constaté que le plasmide était résistant à la tétracycline (comme illustré sur la fig. 6) ou sensible à la tétracycline avec le gène du FPV dans l'orientation inverse.

On a trié des colonies d'E. coli transformées contenant les plasmides pWT121/FPV avec le gène à hémagglutinine (HA) dans chaque orientation pour l'antigène FPV-HA. On a constaté que "les colonies résistant à la tétracycline exprimaient l'antigène FPV-HA, confirmant l'insertion ou introduction correcte du gène du FPV synthétique. Les colonies avec le gène FPV orienté comme illustré sur la fig. 6 manifestaient une résistance à la tétracycline et celles avec l'orientation inverse étaient sensibles à la tétracycline. Dans le premier cas, l'expression de l'antigène HA était sous maîtrise trp.

On peut confirmer l'expression de l'antigène FPV-HA comme suit:

On a trié des colonies d'E. coli contenant le plasmide pWT121/FPV résistant à la tétracycline décrit plus haut pour l'antigène FPV-HA en utilisant une méthode immunologique à phase solide [voir, par exemple, Broome S. et Gilbert W., (1978), «Proc. Nati. Acad. Sci. EUA», 75, 2746-2749]. En bref, on a fait croître de petites cultures de colonies individuelles, on les a récoltées et lysées en utilisant de la lysozyme et du Triton X-100 qui est la marque de fabrique d'un produit à base d'isooctylphénoxypolyéthoxyéthanol, à savoir un détergent non ionique.

15 N'importe quelles séquences HA présentes furent liées à un tube de polystyrène revêtu de IgG spécifique vis-à-vis du FPV-HA. On a ensuite spécifiquement marqué l'antigène lié avec du 125I-IgG à haute activité spécifique.

On a décelé une réactivité immune dans toutes les colonies conteso nant un gène FPV-HA introduit; les colonies ne contenant que le plasmide pWT121 apparenté n'ont pas manifesté d'activité (voir tableau).

Radio-imimmotitrage du FPV-HA dans des lysats de bactéries contenant des plasmides pWT121jFPV

Colonie N°

Teneur en HA (ng/50 ni)

Phénotype

Produit introduit

2

>20

Tcr

A

5

0

Tcr

—

6

>20

Tcr

A

8

0

Tcr

—

11

>20

Tcr

A

13

0

Tcr

—

14

0

Tcr

—

15

>20

Tcr

A

16

>20

Tcr

A

Comme indiqué plus haut, on a décelé une réactivité immune dans toutes les colonies contenant un gène FPV-HA introduit (A), les colonies ne contenant que le plasmide pWT121 apparenté ne manifestant aucune activité.

4S Dans le cas de la série dite pWT de plasmides d'expression, comme avec pBR322, existe la possibilité que, dans les conditions appropriées, ces plasmides normalement à mobilisation moins (mob~) peuvent être mobilisés (c'est-à-dire transférés d'une bactérie à une autre). Il a été récemment montré [voir, par exemple, Twigg 50 A.J. et Sherratt D.J. (1980), «Nature», 283, 216-218], que bien que le codage d'ADN pour la ou les protéines à mobilité Col El fût absent du pBR322, cette protéine pouvait néanmoins induire la mobilité par transcomplémentation lorsqu'elle était présente dans la même cellule sur un plasmide compatible tel que Col K. 55 Le site de liaison au plasmide d'ADN de la ou des protéines de mobilité s'est révélé être le site appelé site nie ou origine de transfert [voir, par exemple, Warren G.J. et coll. (1978), «Nature», 274, 259-261], Par exemple, dans pBR322, ce site se situe dans le fragment Hae II B à 622 bp. Les mutations dans le gène de mobilité sont 60 mob-. Cependant, elles peuvent être complémentées par des dérivés Col El mob+ ou des plasmides apparentés, impliquant une protéine à transaction.

Les plasmides du type Col El sont non conjugatifs, mais sont mobilisés lorsqu'un facteur de sexe, comme un facteur F' ou R, est 65 introduit dans la cellule. La mobilisation d'un plasmide nic+ mais mob", tel que pBR322, exige par conséquent la présence de deux autres plasmides, à savoir un facteur de sexe et un plasmide mob+ du type Col El compatible.

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Le site nie est spécifiquement nécessaire à la mobilisation et des plasmides moins ce site ne peuvent pas être complémentés.

Ainsi, bien que le pBR322 et les plasmides de la série pWT ne contiennent pas la totalité des gènes de mobilité, ils contiennent tous le site nie et peuvent, par conséquent, être complémentés pour la mobilité. Afin de produire des vecteurs plus sûrs, non mobiles, il est souhaitable d'enlever le site nie. Par exemple, cela peut s'effectuer en supprimant un fragment Hae II.

Le site nie peut être enlevé des plasmides pWTl 11,121 et 131 de la manière suivante :

La considération des zones de restriction d'Hae II des plasmides ci-dessus indique que seulement deux fragments (B et H) peuvent être enlevés et laissent encore subsister les gènes ampicillinique et té-tracyclinique, le promoteur à tryptophane et l'origine de la réplica-tion. Il faut se référer à cet égard à la fig. 13 des dessins ci-annexés.

Le fragment B est 622 bp et le fragment H est 83 bp. Par conséquent, dans les plasmides nie" (moins B et H) il manque 705 bp. Il faut bien évidemment tenir compte de ce fait pour la caractérisation des dérivés nie" des plasmides susmentionnés. Par exemple, dans le pWTl 11 (nie-), le site Pst I est à 2253 bp du site Sai I.

Les dérivés nie" de pWTll 1, 121 et 131 sont respectivement appelés pWT 211, 221 et 231.

La première étape de ce procédé d'enlèvement illustratif consiste à faire partiellement digérer le plasmide de manière que chaque molécule soit clivée, en moyenne, deux ou trois fois. Les produits de digestion sont ensuite reliés en utilisant de l'ADN ligase T4 et l'ADN lié est transformé en E. coli K 12, par exemple HB 101. Les transformants sont choisis sur l'ampicilline et la tétracycline en utilisant des plaques de gélose minimales pour induire la transcription trp et assurer la résistance à la tétracycline.

Les colonies résultantes contiennent les plasmides de départ re-circularisés, comme aussi des exemples manquant de l'un ou les deux fragments Hae II. Ces derniers peuvent être identifiés en triant des colonies uniques et en cherchant des plasmides plus petits que le plasmide parent. Des dérivés nie" prospectifs peuvent être confirmés par analyse enzymatique de l'ADN du plasmide purifié.

Au lieu d'utiliser le procédé illustratif ci-dessus impliquant des restrictions partielles nécessitant le triage de peut-être des centaines de colonies, il est généralement plus commode de construire des dérivés nie", comme représenté sur la fig. 14 des dessins ci-annexés.

En bref, les pWT plasmides sont soumis à restriction avec Pst I et Bam HI et des bandes contenant la région trp p/o sont isolées à partir de gels polyacrylamidiques. Le plasmide pAT153 (nie-) est soumis à restriction avec Pst I et Bam HI et la bande de 2531 bp est isolée d'un gel polyacrylamidique. Les premières bandes sont individuellement liées à la dernière bande en utilisant de l'ADN ligase T4 et la matière liée est utilisée pour transformer E. coli HB 101.

L'ADN de colonies uniques peut être isolé et sa structure peut être confirmée par analyse enzymatique de restriction, par exemple des produits de digestion d'Hae II de pAT153, série pWT et série pWT (nie-).

En d'autres termes, les dérivés nie- peuvent être construits en substituant la région dans les pWT plasmides liés par les sites Pst I et Barn HI contenant l'origine de la réplication et le site nie par la région correspondante à partir de pAT153, qui est un dérivé de suppression de pBR322 et qui manque le fragment Hae II B de 622 bp et qui avoisine le fragment Hae II H de 83 bp.

Ce qui suit illustre davantage encore la présente invention:

Préparation de pEH3, pEH4 et pEH5

On a fait croître des cultures de souche K12 d'i?. coli HB 101 [voir, par exemple, Boyer H. et coll. (1969), «J. Mol. Biol.», 41, 459-472] contenant le plasmide pBR322 soit dans un bouillon L, soit dans des milieux à base de sels M9, de glucose, de casamino acides [voir, par exemple, Miller J.H., «Experiments in Molecular Gene-tics, Appendix 1 », Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1972), 431-435]. A un Aô00 de 0,6, on a ajouté du chloramphénicol aux cultures de plasmides jusqu'à une concentration finale de 150 ng/ml et on a poursuivi l'incubation pendant 16 h à 37° C. On a isolé l'ADN de lysats de cellules par centrifugation dans des gradients de CsCl/bromure d'éthidium [voir, par exemple, Katz L. et coll. (1973), «J. Bacteriol.», 114, 577-591 ; et Wensink P.C. et coll. (1974), s «Cell», 3, 315-325], On a enlevé des bandes d'ADN par ponction latérale avec une seringue de 1 ml et une aiguille 16 G sous illumination à l'aide de lumière ultraviolette de 366 nm et on a enlevé le bromure d'éthidium par passage à travers du Dowex AG50 (marque enregistrée d'une résine échangeuse de cations acide).

io On a dialysé toutes les solutions d'ADN vis-à-vis d'un tampon TE (10 mM de Tris, 1 mM d'EDTA de pH 7,5), de façon à enlever l'excès de CsCl, on les a concentrées par précipitation à l'éthanol et conservées à — 70° C. Le mélange d'ADN obtenu a subi une digestion limite avec Hind III, comme suit: on a incubé 2 \ig de pBR322 15 avec 5 unités d'Hind III dans un tampon contenant 50 mM de Tris-HC1 de pH 7,5, 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 5 mM de ß-mercaptoéthanol et 2 mM de dithiothréitol. On a procédé à l'incubation à 37° C pendant 90 min dans un volume de 40 ni. On a ensuite terminé la réaction par une incubation de 5 min à 65° C.

20'

Isolement du fragment Hind III trp E

On a procédé à la digestion limite de 20 |ig de pRHl/trpE avec Hind III, on l'a soumis à électrophorèse sur des gels à 1% d'agarose et on a enlevé la bande contenant le trpE linéaire. On a récupéré le 25 fragment trpE de la tranche de gel par électrophorèse dans une poche à dialyse, cette opération étant suivie d'une extraction au phénol et d'une précipitation à l'éthanol.

Liaison

30 Les incubations à la ligase contenaient 0,2 pg du fragment trpE, 0,4 ng du pBR322 ayant subi une restriction à l'Hind III et 0,1 unité de polynucléotide ligase T4 par 20 ni de tampon de réaction. On a incubé le mélange réactionnel pendant 4 h à 16° C.

35 Transformation

On a utilisé 0,01 fig de l'ADN lié pour transformer la souche d'E. coli W3110 trpoEVl•

On a choisi les recombinants résistant à l'ampicilline capables de complémenter ces cellules trpE-. On a obtenu 1,2 x 104 amp-r colo-40 nies aptes à croître en l'absence de tryptophane par ng d'ADN plas-midique. On a choisi 50 de ces colonies au hasard et on les a transférées en utilisant des cure-dents sur des plaques de gélose minimales (voir, par exemple, Miller J.H., loc. cit.), contenant 100 |ig d'ampi-cilline par millilitre et 12,5 |ig de tétracycline par millilitre. 31 des 50 45 colonies se mirent à croître après incubation jusqu'au lendemain, indiquant la présence d'une protéine de résistance à la tétracycline dans cette population.

On a isolé l'ADN plasmidique à partir de colonies représentatives des groupes sensibles et résistant à la tétracycline et on a analysé 50 les réseaux de fragments d'Hind III par électrophorèse sur des gels à 1% d'agarose. L'ADN plasmidique de tous les clones trp+ résistant à l'ampicilline contenaient le pBR322 ADN apparenté de Mr 2,8 x 106 (4,361 kb) et le fragment d'i?, coli Hind III trpE de Mr 3,5 x 106 (5,350 kb). On a soumis les plasmides produits aux procé-55 dés ultérieurs qui suivent afin d'en confirmer la structure.

Orientation du fragment trpE

Une conséquence de la reliaison des produits de digestion à l'Hind III de pBR322 au fragment trpE est que le fragment trpE 60 peut être introduit selon l'une de deux orientations différentes. Il peut être tel que la transcription à partir du promoteur trp progresse à travers le gène tet du plasmide ou qu'elle s'écarte du gène tet. L'orientation du plasmide résistant au tet (pEH3) et du plasmide sensible au tet (pEH4) a été déterminée dans la lumière [voir, par 65 exemple, Bennett M.E. et coll. (1976), «Proc. Nati. Acad. Sci. EUA», 73, 2351-2355], de sites Hpa I existants dans le fragment trpE et de sites Bam HI dans pBR322 (voir, par exemple, Bolivar F. et coll., loc. cit.). La fig. 7 des dessins ci-annexés illustre les résultats

653 705

8

de digestions limites de plasmides pBR322, pEH3 et pEH4 avec Hind III, Hpa I (EC 3.1.23.23), Bam HI (EC 3.1.23.6) ou une combinaison de ces enzymes.

La fig. 7 qui accompagne le présent mémoire illustre un gel d'agarose montrant des sites d'endonucléase de restriction pour Hpa I, Hind III et Barn HI dans pEH3 et pEH4 et l'orientation du trpE ADN cloné dans ces plasmides. Les pistes a à j contiennent les ADN suivants avec des calibres en paires de kilobases (kb): a) PM2 ADN digéré avec Hind III comme marqueurs de calibre. Les bandes visibles sont 1 à 6 de calibre 5,4, 2,35, 1,05, 0,475, 0,45 et 0,27 kb, respectivement, j) X c.1857, S7 ADN digéré avec Hind III comme marqueurs de calibre. Les bandes visibles sont A à G de calibre 21,79, 9,38, 6,30, 4,20, 2,38, 2,11 et 0,47 kb, respectivement, b) pBR322 ADN superenroulé, c) pBR322 incubé avec Hpa I. d) pEH3 digéré avec Hind III. e) pEH3 digéré avec Hind III et Hpa I. Les bandes mesurent 4,3, 3,25, 1,95 et 0,30 kb. f) pBR322 digéré avec Bam HI. g) pEH3 digéré avec Barn HI. h) pEH4 digéré avec Bam HI et Hpa I. Les fragments de digestion complète mesurent 5,7, 3,25 et 0,67 kb. i) pEH3 digéré avec Bam HI et Hpa I. Les fragments de digestion complète mesurent 4,3, 3,25 et 2,4 kb. Il n'y a pas de sites Hpa I dans pBR322 (comparer voies b et c) et il n'y a pas de sites Barn HI dans trpE (comparer voies f et g). Lorsqu'ils sont soumis à restriction avec Hind III seul, tant pEH3 que pEH4 donnent des fragments de pBR322 et de trpE linéaires (voie d). Les doubles produits de digestion de pEH3 et de pEH4 avec Hind III et Hpa I donnent également des profils identiques (voie e). Dans ce cas, le pBR322 linéaire (4,360 kb) est régénéré en même temps que trois autres fragments de 3250,1950 et 305 bp. Etant donné que le pBR322 n'a pas de cibles Hpa I (voir, par exemple, Bolivar F. et coll., loc. cit.), on en conclut qu'il existe deux cibles Hpa I dans le fragment trpE. L'une a déjà été décrite et se trouve dans la région du promoteur (voir, par exemple, Bennett M.E. et coll., loc. cit.), le second site se trouve approximativement à 300 bp de l'un des sites Hind III.

On a utilisé des produits de double digestion avec Bam HI et Hpa I pour déterminer l'orientation du fragment trpE et la position du second site Hpa I. Les fragments produits sont montrés dans la voie h pour pEH4 et dans la voie i pour pEH3. Il est clair que ces plasmides contiennent des fragments trpE en orientations différentes. Le calibre du fragment le plus petit dérivé de pEH4 est plus aisément estimé à partir des résultats illustrés sur la fig. 8 des dessins ci-annexés. Cette figure représente les petits fragments dérivés par des digestions de restriction de pEH3, pEH4 et pBR322 avec Sai I (EC 3.1.23.27), Bam HI, Hpa I, Eco RI et Hind III.

La fig. 8 des dessins illustre un gel à 5% d'acrylamide montrant des fragments d'ADN à faible poids moléculaire de pBR322, pEH3 et pEH4 après digestion avec des endonucléases de restriction Hpa I, Bam HI, Hind III et Sai I. Les pistes a à i contiennent les ADN suivants avec des calibres en paires de base (bp): a, i) PM2 ADN digéré avec Hind III comme marqueurs de calibre. Les bandes 1 à 7 sont de calibre 5400, 2350, 1050, 475, 450, 270 et 110 bp, respectivement, b) pEH3 digéré avec Bam HI et Hpa I. c) pEH4 digéré avec Bam HI et Hpa I. La bande la plus petite estimée comme 640 bp. d) pEH3 digéré avec Hind III et Hpa I. La bande la plus petite estimée comme 295 bp. e) pBR322 digéré avec Bam HI et Sai I. La bande la plus petite estimée comme 275 bp. f) pBR322 digéré avec Hind III et Sai I. La bande la plus petite estimée comme 620 bp. g) pBR322 digéré avec Bam HI et Hind III. La bande la plus petite estimée comme 350 bp. h) pBR322 digéré avec Eco RI et Hind III. Sa bande la plus petite estimée comme 25 bpy.

A partir des résultats qui précèdent, on a construit les cartes ou zones de restriction pour pEH3 et pEH4 illustrées sur les fig. 2 et 3 des dessins ci-annexés. Que le second site Hpa I se situe en amont du promoteur trp est basé sur les calibres connus de la protéine trpE, de l'anthranilate synthétase et du fragment de gène trpD contenu dans le fragment Hind III trp E. L'anthranilate synthétase est une protéine de 60000 daltons [voir, par exemple, Ito J. et coll. (1969), «J. Bacteriol», 97, 725-733] (approximativement 500 aminoacides),

tandis que seulement environ /& du gène de protéine trpD (équivalant à environ 275 bp) est spécifié par ce fragment Hind III [voir, par exemple, Hopkins A.S. et coll. (1976), «J. Mol. Biol.», 107, 549-569]. Ainsi, une longueur d'ADN d'approximativement 1800 bp est nécessaire pour spécifier ces polypeptides. En outre, il existe 162 bases dans la séquence directrice à l'extrémité 5' du trp m ARN et 11 bases supplémentaires à partir du départ du trp mARN jusqu'à la cible Hpa I dans le promoteur trp [voir, par exemple, Lee F. et coll. (1978), «J. Mol. Biol.», 121, 193-217], Ce total de 1948 bp entre Hpa I et Hind III est en parfait accord avec la distance Hpa I -Hind III de 1950 bp dérivé d'analyse sur gel et est compatible avec la conclusion que le second site Hpa I est en amont par rapport au promoteur trp.

Réglage de la sensibilité à la tétracycline du promoteur trp

Le placement du petit fragment Hpa I-Hind III en amont du promoteur trp indique de manière non ambiguë que, dans le groupe des plasmides résistant à la tétracycline (pEH3), la transcription à partir du promoteur trp est dirigée vers le gène tétracyclinique,

tandis que dans le plasmide sensible à la tétracycline (pEH4)

l'opposé est vrai. Sur cette base, on pourrait s'attendre que l'expression du gène tétracyclinique dans pEH3 soit réglée à partir du promoteur trp et que n'importe quelle insertion dans le site Hind III de pBR322 détruise le promoteur tétracyclinique.

Cela a été testé en examinant la résistance à la tétracycline d'E. coli contenant du pEH3 que l'on avait amené à croître en présence et en l'absence de tryptophane, c'est-à-dire dans des conditions où les gènes trp seraient soit réprimés, soit déréprimés. On a fait croître le plasmide pEH3 dans la souche W3110 trpoEVl sur un milieu contenant des sels M9, du glucose, des casaminoacides et 5 pig/ml de tétracycline. A un A600 de 0,05, on a scindé la culture et on a ajouté 200 ng/ml de tryptophane à l'une des moitiés. Après incubation pendant 1 h supplémentaire, on a dilué les cellules et on les a étalées sur des plaques de gélose contenant des concentrations croissantes de tétracycline. Les cellules ayant crû pendant 1 h sur 200 ng/ml de tryptophane ont été amenées à croître sur des plaques de gélose minimales additionnées de tryptophane.

Les résultats de cette série d'expériences sont illustrés sur la fig. 9 des dessins ci-annexés.

La fig. 9 qui accompagne le présent mémoire illustre l'efficacité de l'étalement de la souche trpoEVl et de ses dérivés sur des concentrations croissantes de tétracycline. Les cultures de la souche trpoEVl contenant les plasmides indiqués ont été amenés à croître dans des milieux définis et traitées de la façon décrite ci-dessous. On a déterminé le pour-cent de survie par rapport à la plaque appropriée ne contenant pas de tétracycline. On a utilisé des plaques contenant 80-400 colonies pour déterminer les pourcentages de survivants. On a mesuré les concentrations en tétracycline suivantes, capables de tuer 50% de cellules comme déterminé par titrage sur colonie (EOP 50%), à partir de la figure: 12 ng/ml pour les cellules exemptes de plasmide; 4,5 ng/ml pour les cellules contenant du pEH4; 23 ng/ml pour des cellules contenant du pEH3 prêincubées avec 200 ng/ml de tryptophane; 56 ng/ml pour des cellules contenant du pEH3 que l'on avait fait croître sans tryptophane y. La présence de tryptophane dans le milieu a provoqué une diminution de la résistance à la tétracycline provoquée par pEH3 de 2,5 fois. Des expériences similaires réalisées avec du pEH4 et du W3110 trpoEVl exempt de plasmide (où le milieu de croissance initial ne contenait pas de tétracycline) ont révélé que ces bactéries étaient sensibles à de très faibles concentrations en tétracycline.

Le site Hind III proximal du site Eco RI du pEH3 a été supprimé comme suit afin de produire le plasmide pEH5.

On a provoqué la digestion de 20 ng de pEH3 préparé de la manière décrite plus haut avec de l'Eco RI, on a procédé à une filtra-tion sur du Sephadex G-50 (marque de fabrique d'un gel de dextrane réticulé sous forme de perles) dans 50 mM de NaCl/0,1 % W/V SDS et on a concentré le pic d'ADN exclu par précipitation à l'éthanol et on l'a dissous dans de l'eau.

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l'ADN pouvait être enlevé soit par addition de ribonucléase jusqu'à 50 jig/ml à l'échantillon, suivie d'une incubation de 30 min à 37° C, soit par l'addition directe à la matrice de gel d'agarose jusqu'à 1 |ig/ml. Les deux procédés enlèvent la couche d'ARN qui serait autrement présente sur le gel.

Electrophorèse du gel

On a utilisé des gels d'agarose (20 x 15 x 0,5 cm) de 0,8 à 1,4% dans des conditions classiques. On a soumis les gels à l'électropho-rèse à 40 V jusqu'au lendemain ou à 120 V pendant 3 h et on les a ensuite colorés et photographiés.

On a utilisé des gels d'acrylamide (20 x 15 x 0,15 cm) de 5 à 10% pour identifier de petits fragments de restriction. La coloration et la photographie s'effectuèrent comme pour les gels d'agarose.

Isolement du fragment Hinf I d'opérateur-promoteur tryptophanique et attachement du fixateur d'Hind III

6 (ig de pEH5 furent soumis à une restriction à l'Hinf I et ensuite soumis à une électrophorèse sur un gel d'acrylamide à 5% P/V,

après quoi on a coupé l'opêrateur-promoteur tryptophanique Hinf I à 497 bp et la bande de pBR322 comigrante du gel pour les soumettre ensuite à une extraction à l'ADN de manière connue.

Les extrémités Hinf I furent ensuite chargées d'ADN polymérase I et le fixateur d'Hind III y fut attaché par liaison à extrémités émous-sées à un rapport de 50 fragments de fixateur par fragment d'Hinf I (cela réduit l'éventualité d'autoliaison de fragments d'Hinf I). On a produit des extrémités collantes en soumettant le mélange à une restriction à l'Hind III, on a précipité l'ADN à l'éthanol, on l'a remis en suspension dans 50 [il de 50 mM de NaCl, SDS à 0,1% P/V et on a chromatographié le tout sur une colonne de 50 x 0,7 cm de Sepha-dex G150 (prééquilibrêe avec 50 mM de NaCl, SDS à 0,1% P/V). On a recueilli le pic exclu et on a précipité l'ADN à l'éthanol.

Construction de p WT101

Le promoteur tryptophanique d'E. coli complet, l'opérateur, la séquence directrice et les sept premiers aminoacides de trpE sont contenus sur un fragment d'Hinf I d'approximativement 497 bp présent dans pEH5. On a cloné le fragment d'Hinf I à 497 bp dans le site Hind III de pBR322 à l'aide d'ADN fixateur d'Hind III déca-mère. Cette entreprise signifie que les extrémités Hinf I devaient d'abord être remplies d'ADN polymérase I pour permettre la fixation d'ADN fixateur. On a ensuite lié le fragment à du pBR322 coupé à l'Hind III traité à la phosphatase alcaline bactérienne et on a utilisé le mélange pour transformer HB101 d'E. coli en appliquant une sélection sur gélose nutritive ampicilline. On a obtenu un total de 582 colonies à partir de la transformation.

Le clonage dans le site Hind III de pBR322 inactive le promoteur tétracyclinique, rendant ainsi n'importe quel transformant sensible à la tétracycline, à moins que la pièce clonée ne possède son propre promoteur transcrivant en les gènes tétracycliniques. Etant donné que le fragment d'Hinf I contient la région opérateur-promoteur tryptophanique, les transformants contenant un plasmide avec le fragment cloné dans l'orientation correcte, c'est-à-dire transcrivant vers le promoteur tétracyclinique, doivent être résistants à la tétracycline. Pour tester cette caractéristique, on a piqué 48 colonies choisies au hasard à partir des plaques de transformation d'ampicil-line dans des plaques en gélose minimale avec sels M9 et casaminoa-cides, additionnées de tétracycline (10 ng/ml). Parmi ces 48 colonies, 11 se révêlèrent être résistantes à la tétracycline, ce qui est le chiffre espéré, étant donné qu'avec deux fragments présents, il m'y avait qu'une possibilité sur quatre d'obtention de l'orientation correcte.

La présence d'ADN introduit a également été confirmée en piquant des colonies de deux jeux de plaques et en les testant vis-à-vis d'un témoin à pBR322 en utilisant des gels d'agarose de cellules entières. Par mise en œuvre de ces procédés, on a isolé des colonies résistant à l'ampicilline et résistant à l'ampicilline/tétracycline, qui contenaient des plasmides avec de l'ADN introduit. On a préparé

des ADN plasmidiques à partir d'un certain nombre de ces colonies en vue de l'analyse à l'endonucléase de restriction.

La fig. 11 des dessins ci-annexés illustre la production et la carac-térisation de pWTlOl et peut être interprétée comme suit: s a) pEH5 digéré avec Hinf I et Hpa I

b) pEH5 digéré avec Hinf I seul c) pWTlOl digéré avec Hind III

d) pWTlOl digéré avec Hind III et Hpa I

10 Construction de pWTlll

Enlèvement du site Hind III distal par rapport au promoteur tryptophanique

On a supprimé le site Hind III distal par clivage à l'Eco RI, suivi 15 de l'enlèvement d'ADN par digestion à l'exonucléase III et à la SI nucléase. On a également inclus une étape à l'ADN polymérase I préalablement à la liaison, de manière à remplir n'importe quelles extrémités asymétriques subsistant après la digestion à la SI nucléase.

20 On a choisi des durées de digestion de 1, 3 et 5 min.

En vue de transformer les cellules HB101, on a utilisé les trois mélanges d'ADN après restriction à l'Eco RI, digestion à l'exonucléase III (1, 3 et 5 min), remplissage à l'ADN polymérase I et liaison d'extrémités émoussées. On a utilisé une double sélection an-25 tibiotique par étalage sur gélose minimale avec sels M9 et casami-noacides, additionnée d'ampicilline et de tétracycline, la double sélection garantissant que la ß-lactamase et les gènes tétracycliniques demeurèrent intacts.

Pour une caractêrisation plus poussée des suppresseurs proba-30 bles, on a choisi deux transformants, chacun parmi des fractions de 1 et 5 min, et quatre parmi la fraction de 3 min.

Caractêrisation des plasmides suppresseurs

Aucun des huit plasmides ne produit de fragment 512 bp lors-35 qu'il est coupé à l'Hind III, et tous migrent vers une position au-dessus du fragment 4,36 kb de pWTlOl restreint à l'Hind III. Tous les plasmides ont été soumis à une double digestion avec Hpa I et Pst I, de manière à engendrer deux fragments, dont le plus petit recouvre la zone concernée (la région autour du site Eco RI dans 40 pWTlOl). Les calibres des fragments engendrés dans pWTlOl sont de 3777 et de 1096 bp. L'examen illustre clairement le fait que le dernier fragment avait été supprimé dans chaque cas, tandis que le premier fragment, ainsi qu'on l'espérait, demeurait inaltéré. La plage de suppression d'ADN variait de 51 bp dans pWTl 11 (diges-45 tion de I min à l'exonucléase III) à 361 bp dans pWT118 (digestion de 5 min à l'exonucléase III).

Etant donné que pWTl 11 comportait la quantité d'ADN supprimée la moins élevée de lui-même et que les résultats d'étalement pour la détermination de l'efficience de la tétracycline indiquent que so c'est un produit aussi efficace que pWTlOl pour la transcription à partir du promoteur tryptophanique, on l'a choisi comme véhicule de clonage d'Hind III à utiliser pour le changement de la phase de traduction.

55 Construction depWT121

En vue de changer le phasage du site Hind III de pWTl 11, on a rempli l'élongation 5' d'ADN polymérase I et on l'a liée sur un ADN fixateur d'Hind III, puis on l'a soumis à restriction avec de l'Hind III de manière à enlever l'excès de fixateur et à produire des 60 extrémités collantes, puis on l'a relié. Cela a ajouté 14 bp d'ADN et a modifié le châssis de lecture à partir du nouveau site Hind III (le vieux site est à présent incomplet) de plus d'un nucléotide.

Construction depWT131 65 Le troisième châssis de lecture, c'est-à-dire pWTl 11 plus deux nucléotides, a été obtenu en répétant la même série de réactions sur ce plasmide ayant subi un changement de phase. Ces plasmides, tels que pWTl 11, produiraient de petits polypeptides qui provoquent

9

653705

On a provoqué la digestion du pEH3 digéré à l'Eco RI avec de l'exonucléase III à 20e G. Le mélange contenait 10 ng de plasmide linéaire, 60 mM de Tris de pH 8, 0,66 mM de MgCl2, 4 mM de di-thiothréitol et 40 unités d'exonucléase III dans un volume total de 200 [il. On a prélevé des fractions aliquotes de 100 (il (5(ig) après 5 et 10 min, on les a extraites à l'aide de phénol et de chloroforme et on les a précipitées à l'éthanol.

On a traité le plasmide (5 |ig) traité à l'exonucléase III par de la SI nucléase pendant 15 min à 30°C dans un volume de 100 (il afin de produire des extrémités émoussées. Le milieu réactionnel contenait 150 mM de NaCl, 25 mM d'acétate de sodium de pH 4,6, 0,1 mM de ZnS04, de l'ADN et 2,5 unités de SI nucléase. Après l'incubation, on a extrait le mélange par du phénol et du chloroforme et on l'a ensuite précipité à l'éthanol. On a lié 3 |ig de l'ADN digéré au SI dans un volume final de 10 (il avec 1 (il d'ADN ligase T4 (0,8 unité) à 15° C pendant 16 h et ensuite à 4°C pendant 24 h.

La fig. 10 des dessins annexés illustre un gel à 1% d'agarose montrant la suppression des sites Hind III et Hpa I de pEH3.

Les pistes a à i contiennent les ADN suivants avec des dimensions ou calibres en paires de kilobases (kb) : a, i) X cI857, S7 digéré avec Hind III comme marqueurs de calibre. Les bandes visibles dans l'agarose sont A à F d'un calibre de 21,79, 9,38, 6,30 et 4,20 kb, respectivement. b) pEH3 digéré avec Hind III. c) pEH3 digéré avec Sai I. d) Colonies réunies digérées avec Hind III. e) pEH5 digéré avec Hind III. 0 pEH505 digéré avec Hind III. g) pEH5 digéré avec Hpa I. h) pEH505 digéré avec Hpa I.

Préparation de plasmides de la série pWT Bactéries et plasmides

Les souches bactériennes utilisées étaient toutes deux des dérivés K12 à'Escherichia coli; HBIOI F" pro leu thi lac Y strr rk" mk~ Endo 1 ~ ree A" et ED8689 trpR~rk"mk+.

Milieux et transformation

On a fait croître les cultures dans un milieu à sels M9, glucose et casaminoacides (voir, par exemple, Miller J.H., loc. cit.), pour des préparations d'ADN plasmidique et l'essai de la sensibilité à la tétracycline. Pour des souches plasmidifères, on a ajouté des antibiotiques à la concentration appropriée. On a fait croître les cellules à utiliser pour la transformation dans du bouillon L. Au cours de la totalité de l'essai de la sensibilité à la tétracycline, on a étalé les cellules sur de la gélose minimale avec sels M9, glucose et casaminoacides, additionnée de tétracycline (0 à 80 pg/mï), d'acide 3ß-indole acrylique (20 (ig/ml) ou de tryptophane (10 (ig/ml) lorsque cela se révéla approprié.

La procédure de transformation suivie était celle de Glover (loc. cit.). On a étalé des cellules sur de la gélose nutritive N° 2 additionnée d'ampicilline (100 (ig/ml) ou sur de la gélose minimale avec sels M9, glucose et casaminoacides, additionnée d'ampicilline (100 (ig/ml) ou de tétracycline (10 (ig/ml).

Préparation de l'ADN plasmidique

On a préparé l'ADN plasmidique ou plasmide ADN soit de la manière décrite à propos de pEH5 ci-dessus, soit par des extractions au phénol/chloroforme de lysats limpidifiés, suivies d'une précipitation à l'isopropanol de l'ADN et d'une remise en suspension finale dans du tampon TE (10 mM de Tris-HCl de pH 7,5,1 mM d'EDTA).

Réactions enzymatiques

Produits de digestion à l'endonucléase de restriction: On a réalisé des produits de digestion de restriction d'ADN dans un système tampon à teneur élevée ou faible en sel à 37° C pendant 2 h, le volume réactionnel variant de 10 à 200 (il et la quantité d'enzyme ajoutée variant de 1 à 20 unités/jig d'ADN plasmidique. On a réalisé des produits de digestion de Bam HI, Eco RI, Hha I (EC 3.1.23.19), Hind III et Pst I (EC 3.1.23.31) dans 10 mM deTris-HCl de pH 7,5, 10 mM

de MgCl2, 50 mM de NaCl, 1 mM de dithiothréitol, 100 |ig/ml de gélatine. Pour les produits de digestion d'Hpa I, le mélange réactionnel ne différait seulement que par le fait du remplacement de 50 mM de NaCl par 5 mM de NaCl. L'Hinf I travailla également bien dans les deux mélanges de réaction.

Lorsque l'on a provoqué la digestion d'ADN plasmidique non préparé par le procédé au chlorure de césium/bromure d'éthidium, le mélange réactionnel contenait également de la ribonucléase I-A (traitée à chaud pendant 10 min à 95° C pour enlever toute activité d'ADNase) à 50 |ig/ml, en vue d'enlever l'ARN ayant coprécipité avec l'ADN lors de la purification.

Toutes les réactions furent terminées par chauffage jusqu'à 65° C pendant 5 min.

Liaisons: On a réalisé des liaisons d'extrémité cohésives à des volumes de 10 à 20 (il dans 50 mM de Tris-HCl de pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 20 mM de dithiothréitol, 1 mM d'ATP, en utilisant 0,01 à 0,02 U de ligase pour 0,5 à 3 (ig d'ADN. On a incubé les milieux réactionnels jusqu'au lendemain à 15°C. Pour des liaisons d'extrémités émoussées, on a utilisé les mêmes mélanges réactionnels, mais on a élevé la proportion de ligase jusqu'à 0,2 à 0,6 unité pour 1 à 3 ng d'ADN et on a amené la température d'incubation jusqu'à 25° C.

Chargement des élongations 5' à l'ADN polymérase I: On a chargé 0,5 à 3,5 |ig d'ADN de polymérase dans 50 mM de Tris-HCl de pH 7,8,10 mM de MgCl2, 1 mM de P-mercaptoéthanol, 0,1 mM chaque fois de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dans un volume de 50 (il en utilisant 0,25 à 1,5 U de polymérase. On a incubé le mélange pendant 10 min à 10°C, après quoi on pouvait en utiliser une partie aliquote directement pour la liaison d'extrémités émoussées ou bien on a soumis le tout à une extraction au phénol/chloroforme pour le précipiter ensuite à l'éthanol.

Polynuclêotide kinasage de l'ADN fixateur d'Hind III: On a kinasé 2,5 (ig de fixateur d'Hind III décamère pendant 60 min à 37°C avec 10 U de kinase dans 25 mM de Tris-HCl de pH 7,8, 5 mM de MgCl2, 0,125 mM d'ATP, 25 ng/ml d'albumine de sérum bovin. On a également marqué les terminaisons ou extrémités 5' en ajoutant 100 nCi de [y—32P]ATP (3000 Ci/mM) au mélange réactionnel. On a achevé la réaction par l'addition de SDS à raison de 0,1% P/V et d'EDTA jusqu'à 10 mM et on a ensuite chromatogra-phié le tout sur une colonne de 30 x 0,7 cm de Sephadex G-50 (SF) équilibrée dans 50 mM de NaCl/SDS à 0,1 % P/V. On a réuni les fractions exclues, on les a précipitées à l'éthanol et on les a remises en suspension dans de l'eau jusqu'à 50 ng/ml.

Traitement du pBR322 restreint à l'Hind III par de la phosphatase alcaline bactérienne: On a traité 5 à 10 ng de pBR322 linéarisé dans 20 mM de Tris-HCl de pH 7,5, SDS 0,1% B/V par 5 ng de phosphatase alcaline bactérienne pendant 60 min à 37° C. On a ensuite extrait le produit obtenu au phénol/chloroforme et on a précipité l'ADN à l'éthanol.

Digestion à l'exonucléase III et à la SI nucléase de pWTlOl restreint à l'Eco RI:

Les conditions utilisées étaient telles que décrites à propos de la suppression du site Hind III dans pEH3, à l'exception que l'on a enlevé des parties aliquotes (3,33 ng) après 1, 3 et 5 min de digestion à l'exonucléase III.

Préparation d'échantillons de gel à partir de lysats de cellules entières

Pour des gels d'agarose de lyse de cellules entières, on a prélevé un échantillon représentatif de cellules contenant des plasmides d'une plaque de culture en utilisant une boucle stérile en matière plastique et on l'a remis en suspension dans 200 ni de tampon d'élec-trophorèse à l'agarose. A ce produit, on a ajouté 50 ni de tampon Ficoll [SDS à 5% P/V, Ficoll à 10% P/V (copolymère de saccharose et d'épichlorhydrine), bleu de bromophénol à 0,06% P/V] et on a incubé le mélange à 65'C pendant 30 min de façon à lyser les cellules et on les a ensuite soumises à un tourbillonnement avec vortex pendant 1 min. On a constaté qu'environ 40 ni d'un tel échantillon suffisaient à l'identification des plasmides. L'ARN présent avec s

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l'initiation au départ du trpE et la terminaison à des codons non-sens (différents dans chaque cas) précédant les gènes tétracycliniques. Cependant, en raison des changements dans les châssis de lecture, les polypeptides possèdent tous des séquences d'aminoacides terminaux-C différentes, bien que les séquences terminales-N soient les mêmes.

La fig. 12 des dessins annexés illustre les changements qui se produisent au cours du changement de phases de pWTl 11 à pWT131. Cette figure peut être interprétée comme suit:

a) pWTl 11 digéré avec Hha I

b) pWT121 digéré avec Hha I

c) pWT131 digéré avec Hha I

Préparation de pWT121/FPV et titrage de l'expression de gène de l'antigène FPV-HA

On a soumis 10 ng de pWT121 à une digestion limite avec Hind III. On a enlevé les phosphates terminaux 5' résultants des vecteurs par traitement avec 20 ng de phosphatase alcaline bactérienne pendant 30 min à 37° C dans 25 jil d'un milieu d'incubation contenant 20 mM de Tris-HCl de pH 7,5 et du SDS à 0,1 % P/V. Après extraction au phénol et précipitation à l'éthanol, on a lié 0,2 ng d'ADN à environ 40 ng de gène FPV-HA dans 20 ml d'un milieu d'incubation contenant 50 mM de Tris-HCl de pH 7,5,10 mM de MgCl2, 20 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM d'ATP et 0,02 U d'ADN ligase T4 (New England Biolabs). Après incubation jusqu'au lendemain à 15° C, on a dilué les mélanges jusqu'à 100 ni avec du TCM (10 mM de Tris-HCl de pH 7,5,10 mM de CaCl2, 10 mM de MgCl2) et on les a utilisés pour transfecter 200 ni d'HBlOl d'E. coli K12 traité au CaCl2 selon un procédé connu. Les transformants présents après croissance pendant 16 h à 37° C sur gélose L plus 100 ng/ml de carbénicilline (Pyopène, a-carboxybenzylpénicilline) ont été testés quant à la résistance à la tétracycline par piquage sur des plaques de gélose contenant des sels M9, du glucose et des casaminoacides, plus de la carbénicilline et de la tétracycline (10 ng/ml).

Titrage de l'expression de gène

Etaient indiquées des cultures liquides (5 ml) de colonies individuelles que l'on avait fait croître sur du milieu M9 complété d'acide ß-indolacrylique (20 ng/ml) ou de tryptophane (100 |ig/ml). On a recueilli les cellules par centrifugation, on les a mises en suspension dans 0,3 ml de saccharose à 25% P/V/50 mM de Tris de pH 8 et on les a incubées avec 0,1 ml de lysozyme (10 mg/ml). A des intervalles de 5 min, on a ajouté 0,1 ml d'EDTA 0,5M et ensuite 0,5 ml d'une solution glacée de Triton (la solution de Triton était constituée de 60 mM d'EDTA, 50 mM de Tris à pH 8 et 0,1% V/V de Triton X-100). On a utilisé ce lysat pour le titrage de l'antigène sans autre traitement.

On a réalisé des titrages d'antigène HA dans des tubes de culture en polystyrène (Nunc N° 1410) en utilisant une technique de sandwich d'anticorps. On a purifié de l'anti-FPV-HA de lapin par précipitation au sulfate d'ammonium et Chromatographie sur DEAE-cellulose avant son emploi et on l'a marqué à l'125I. On a enduit des tubes de 50 ni de NaHC03 0,2M de pH 9 contenant 60 ng/ml de IgG non marqué et purifié, pendant 10 min à la température ambiante, on les a lavés avec des fractions aliquotes de 3 x 1 ml d'un tampon de lavage et on les a ensuite incubés à la température ambiante soit avec des quantités connues (0,5-5 ng) de FPV rompu, soit avec les lysats bactériens. Après 2 h, on a lavé les tubes avec des fractions aliquotes de 4 x 1 ml de tampon de lavage et on les a finalement incubés à 4°C pendant 16 h avec 50 ni de tampon de lavage contenant 200 000 cpm d'12SI-anti-HA. On a de nouveau lavé les tubes et on a procédé au comptage dans un compteur y de Packard. 5 On a établi la quantité d'antigène présent à partir de courbes standards donnant la radioactivité liée à la quantité de FPV présente.

Préparation de dérivés nic~

La restriction des trois pWT plasmides ayant subi un change-îo ment de phase et de pAT153 avec à la fois Bam HI et Pst I engendre deux fragments à partir de chaque plasmide. Cela est illustré sur la fig. 14 des dessins annexés au présent mémoire.

pAT153 produit des fragments de 1129 bp et de 2529 bp, le dernier fragment plus gros contenant l'origine, mais ayant le site nie 15 supprimé.

Les pWT plasmides produisent tous le même fragment de 3233 bp contenant l'origine et le site nie, mais des fragments plus petits différents contenant les éléments de réglage de trp, les différences provenant des altérations de changement de phase sur le site 20 Hind III.

On a soumis les plasmides à une restriction avec Pst I et Bam HI, puis on les a soumis à une électrophorèse sur un gel à 3,5% d'acrylamide et on a découpé les bandes de pAT153 de 2529 bp, de pWTl 11 de 1590 bp, de pWT121 de 1604 bp et de pWT131 de 25 1618 bp et on les a récupérées à partir de l'acrylamide. On a lié la bande de pAT153 indépendamment aux trois bandes de pWT et on a utilisé les mélanges issus de la liaison pour transformer des cellules d'£. coli HB101 subissant une sélection sur de la gélose nutritive contenant de la carbénicilline à 100 ng/ml. Etant donné que le frag-30 ment de pATl 53 est incapable de conférer une résistance à l'ampicilline et à la tétracycline de par lui-même et que les fragments de pWT manquent une origine, la sélection sur la carbénicilline assure que les molécules de recombinant obtenues contiennent ces deux fragments. On a préparé des ADN plasmidiques à partir d'un certain nombre 35 de colonies que l'on avait fait croître sur les plaques de transformation et on les a utilisés pour confirmer la présence des plasmides souhaités par analyse à restriction.

On a réalisé les produits de digestion enzymatique suivants:

Digestion avec Pst I et Barn HI pour engendrer les fragments 40 liés: en se référant à la fig. 15 des dessins annexés au présent mémoire, les pistes b, c et d sont des produits de digestion de dérivés nie- de pWT131„ 121 et 111, respectivement. La piste a est un produit de digestion de pWT131 et la piste e est un produit de digestion de pAT153. Ainsi qu'il ressort de toute évidence du gel, les trois 45 plasmides trp nie" ont acquis le fragment pAT153 à 2529 bp, tout en conservant les fragments de réglage de trp d'origine.

La digestion à l'Hind III démontre que le site d'expression de trp p/o réglé est encore fonctionnel: en se référant à la fig. 16 des dessins annexés, on voit que les pistes a, b, c et d sont des produits de diges-50 tion depWT231, 221, 211 et 131, respectivement. Les trois dérivés nie" subissent une restriction avec Hind III et sont plus petits que pWT131 en raison de l'absence des deux fragments Hae II.

La digestion à l'Hae II montre que les fragments Hae II B et H de la région pBR322 des plasmides sont absents : en se référant à la 55 fig. 17 des dessins annexés, on voit que les pistes a à f sont des produits de digestion de pBR322, pAT153, pWT231, 221, 211 et 131 respectivement. Les quatre plasmides nie" (pistes b à e) manquent deux fragments Hae II, les fragments Hae II B à 622 bp et Hae II H à 82 bp de pBR322.

6 feuilles dessins

Claims (25)

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1. Plasmide, caractérisé en ce qu'il comporte un site d'introduction pour un fragment à ADN eucaryote voisin d'un promoteur bactérien et en aval d'un site liant le ribosome procaryote, et un codon initiateur tel que le promoteur bactérien maîtrise ou règle la transcription et la traduction d'un fragment d'ADN introduit.

2. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une Ion- . gueur moléculaire de 9866 bp; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Eco RI à 3709 bp du Sai I; un second site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa I à 305 bp du second Hind III; un second site Hpa I à 3250 bp du premier Hpa I et à 1950 bp du premier Hind III, le plasmide possédant le promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie de 1950 bp entre le second site Hpa I et le premier site Hind III; le gène pour la résistance à la tétracycline suivant immédiatement le premier site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la partie de 3709 bp entre le site Sai I et le site Eco RI, le plasmide étant appelé pEH3.

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REVENDICATIONS

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3. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une longueur moléculaire de 9866 bp; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I ; un site Eco RI à 3709 bp du Sai I ; un second site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa I à 1950 bp du second site Hind III ; un second site Hpa I à 3250 bp du premier Hpa I et à 305 bp du premier Hind III, le plasmide possédant le promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie de 1950 bp entre le second site Hind III et le premier site Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline suivant immédiatement le premier site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la partie de 3709 tp entre le site Sai I et le site Eco RI, le plasmide étant appelé pEH4.

4. Plasmide suivant la revendication 1, possédant une longueur moléculaire de 6750 bp; un site Hind III; un site Barn HI à 346 bp du site Hind III; un site Sai I à 275 bp du site Barn HI; un site Hpa I à 4230 bp du site Sai I et à 1950 bp du site Hind III; le plasmide possédant le promoteur trp, le gène E et une partie du gène D dans la partie de 1950 bp s'étendant entre le site Hpa I et le site Hind III et le gène pour la résistance à l'ampicilline de 4800 bp entre le site Hind III et le site Hpa I, le plasmide étant appelé pEH5.

5. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une longueur moléculaire de 4874 bp; un site Eco RI; un site Hind III à 31 bp de l'Eco RI; un site Hpa I à 313 bp de l'Hind III; un second site Hind III à 199 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 346 bp du second Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 2958 bp du Sai I et à 752 bp de l'Eco RI; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site

Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le second site Hind III, le plasmide étant appelé pWTlOl.

6. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une longueur moléculaire de 4823 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 199 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 346 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 2958 bp du Sai I et à 1045 bp de l'Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant à partir de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le site Hind III, le plasmide étant appelé pWTl 11.

7. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une longueur moléculaire de 4837 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 206 bp de l'Hpa I; un site Barn I à 353 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 3958 bp du Sai I et à 1045 bp de l'Hpa I; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant à partir de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le site Hind III, le plasmide étant appelé pWT121 et le phasage étant changé de 1 bp à partir de pWTl 11.

8. Plasmide suivant la revendication 1, caractérisé par une longueur moléculaire de 4851 bp; un site Hpa I; un site Hind III à 213 bp de l'Hpa I ; un site Barn I à 360 bp de l'Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn I; un site Pst I à 2958 bp du Sai I et à 1045 bp de l'Hpa I ; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant à partir de la région du site Hpa I jusqu'au-delà du site Sai I; le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I et la partie clonée de l'opéron trp comprenant la région entre le promoteur et la première partie du gène E entre le site Hpa I et le site Hind III, le plasmide étant appelé pWT131 et le phasage étant changé de 2 bp à partir du pWTl 11.

9. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est dépourvu du site origine de transfert ou site nie, le plasmide étant appelé nie".

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10. Plasmide, caractérisé en ce qu'il comporte un fragment à ADN eucaryote voisin d'un promoteur bactérien et en aval d'un site liant le ribosome procaryote et un codon initiateur tel que le promoteur bactérien maîtrise ou règle la transcription et la traduction du fragment d'ADN introduit.

11. Plasmide pWT121/FPV suivant la revendication 10, possédant une longueur moléculaire de 6532 bp; un site Hind III; un site Sma I à 365 bp du Hind III; un site Eco RI à 910 bp du Sma I; un second site Hind III à 460 bp de l'Eco RI; un site Barn HI à 353 bp du second Hind III; un site Sai I à 275 bp du Barn HI; un site Pst I à 2958 bp du Sai I; un site Hpa I à 1045 bp du Pst I et à 206 bp du premier Hind III; le gène de FPV hémagglutinine dans la partie de 1735 bp entre le premier et le second sites Hind III; le gène pour la résistance à la tétracycline s'étendant du second site Hind III jus-qu'au-delà du site Bam HI et le gène pour la résistance à l'ampicilline dans la région du site Pst I.

12. Plasmide pWT121/FPV suivant l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il est dépourvu du site origine de transfert ou site nie, le plasmide étant appelé nie".

13. Procédé de production d'un plasmide suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on clone un promoteur bactérien en un plasmide isolé, on détermine la position d'un site d'introduction voulu et on réalise le site d'introduction s'il n'est déjà pas présent.

14. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pEH3 suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'on digère une souche de E. coli de type sauvage avec de l'endonucléase de restriction Hind III, on lie le fragment ainsi obtenu à la molécule linéaire obtenue par la restriction du plasmide pBR322 avec l'endonucléase de restriction Hind III, on transforme le trpoEVl E. coli avec le plasmide résultant et on choisit les colonies de E. coli présentant une résistance à la tétracycline et une complémentation tryptopliani-que pour obtenir le plasmide pEH3.

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15. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pEH4 suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'on digère une souche de E. coli du type sauvage avec l'endonucléase de restriction Hind III, on lie le fragment ainsi obtenu à la molécule linéaire obtenue par la restriction du plasmide pBR322 avec l'endonucléase de restriction Hind III, on transforme trpoVl E. coli avec le plasmide résultant et on choisit les colonies d'E. coli présentant une sensibilité à la tétracycline et une complémentation tryptophanique pour obtenir le plasmide pEH4.

16. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pEH5 suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'on restreint pEH3 avec l'endonucléase de restriction Eco RI, on digère la molécule linéaire avec de l'exonucléase III et de la SI nucléase, on opère un traitement avec de l'ADN Polymerase I, on lie la molécule linéaire à de l'ADN ligase, on transforme trpoEV 1 E. coli avec le plasmide résultant et on choisit les colonies faisant preuve d'une complémentation tryptophanique et d'une résistance à l'ampicilline de façon à obtenir le plasmide pEH5.

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17. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pWTlOl suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'on restreint pEH5 avec l'endonucléase de restriction Hinf I de façon à obtenir un fragment contenant un promoteur tryptophanique complet et on clone le fragment dans le site Hind III du plasmide pBR322 comprenant le traitement des extrémités Hinf I du fragment par de l'ADN polymérase I, on traite le fragment par des fixateurs de Hind III en présence d'ADN ligase, on traite la molécule liée par de l'endonucléase de restriction Hind III de façon à produire une molécule linéaire possédant des extrémités collantes Hind III, on lie la molécule linéaire dans le site Hind III du plasmide pBR322, on transforme E. coli K12 HB101 avec les plasmides résultants et on choisit les colonies d'i?, coli faisant preuve d'une résistance à l'ampicilline de façon à obtenir le plasmide pWTlOl.

18. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pWTll suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on restreint pWTlOl avec de l'endonucléase de restriction Eco RI, on digère la molécule linéaire avec de l'exonucléase III et de la SI nu-cléase, on traite par de l'ADN polymérase I, on relie la molécule linéaire, on transforme E. coli K12 HB101 par les plasmides résultants et on choisit les colonies d'il, coli qui présentent une résistance à l'ampicilline de façon à obtenir le plasmide pWTl 11.

19. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pWT121 suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'on restreint pWTl 11 avec de l'endonucléase de restriction Hind III, on traite la molécule linéaire par de l'ADN polymérase I, on lie avec de l'ADN fixateur de Hind III, on restreint avec de l'endonucléase de restriction Hind III, on relie la molécule linéaire, on transforme

E. coli K12 HB101 avec les plasmides résultants et on choisit les colonies d'i?. coli présentant une résistance à l'ampicilline, de façon à obtenir le plasmide pWT121.

20. Procédé suivant la revendication 13 pour la production de pWT131 suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'on restreint pWT121 avec l'endonucléase de restriction Hind III, on traite la molécule linéaire par de l'ADN polymérase I, on lie avec de l'ADN fixateur de Hind III, on restreint avec de l'endonucléase de restriction Hind III, on relie la molécule linéaire, on transforme

E. coli K12 HB101 avec les plasmides résultants et on choisit les colonies d'E. coli qui présentent une résistance à l'ampicilline de façon à obtenir le plasmide pWT131.

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21. Procédé de production d'un plasmide suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'on introduit un fragment d'ADN eucaryote au site d'introduction d'un plasmide suivant l'une des revendications 1 à 9.

22. Procédé suivant la revendication 21 pour la production du plasmide pWT121/FPV suivant la revendication 11, dans lequel le plasmide pWT121 est restreint avec de l'endonucléase de restriction Hind III et la molécule linéaire est éventuellement traitée par une Phosphatase alcaline, des fixateurs de Hind III sont liés aux extrémités du gène FPV qui est ensuite traité par de l'endonucléase de restriction Hind III, et le gène FPV traité est lié à la molécule linéaire dérivée de pWT121 par restriction au Hind III.

23. Procédé suivant la revendication 13 pour la production d'un plasmide suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'on enlève le site nie d'un plasmide ou on construit un plasmide de telle manière que le site nie ne soit pas présent.

24. Procédé suivant la revendication 21 pour la production d'un plasmide suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on enlève le site nie d'un plasmide ou on construit un plasmide de telle manière que le site nie ne soit pas présent.

25. Utilisation d'un plasmide suivant la revendication 10, pour la transformation d'une cellule transformable.

De manière similaire, la transcription de l'ADN mitochondrien de souris cloné dans E. coli s'opéra à partir du mauvais brin [voir, par exemple, Brown W.M. et coll. (1976), «Cell», 7, 517-530].

La structure des plasmides conformes à la présente invention est fondée sur la réalisation d'un site d'insertion ou d'introduction, en particulier un site Hind III, pour un fragment d'ADN eucaryote choisi, lequel site d'insertion est voisin d'un promoteur bactérien, 5 par exemple un promoteur trp, si bien que la transcription et la traduction du fragment d'ADN sont réglées par le promoteur. Les plasmides concernés sont généralement également fournis dans la région qui suit immédiatement le site d'insertion, avec le gène pour la résistance à la tétracycline, si bien qu'après insertion de l'ADN io choisi au site d'insertion, la transcription et la traduction de l'ADN inséré ou introduit, réglées par le promoteur, peuvent commodément être confirmées, étant donné que lorsqu'elle s'est produite, la résistance à la tétracycline est conservée et que, dans la plupart des cas, lorsqu'elle ne s'est pas produite, la résistance à la tétracycline est 15 détruite.