NL8003171A - Plasmidevectoren, de bereiding en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

£ * 7.0. 586

Pla smid ev e ct or en, de bereiding en toepassing daarvan

De uitvinding heeft betrekking op plasmidevectoren, de bereiding en toepassing daarvan; meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op plasmidevectoren die zijn aangepast cm ingebrachte DM fragmenten te ontvangen en te transcriberen.

5 De genetische inhoud van de meeste organismen bestaat in DM vorm.

Deze genetische informatie wordt tot expressie gebracht door een complexe reeks van reacties waarbij transcriptie van DM in RNA is betrokken met aansluitende translatie van het RNA in proteïne. In b act er i ecellen zijn de transcriptie en translatie nauw gekoppeld. De hoeveelheden van een be-10 paald proteïne wordt geregeld door de omvang van de plaatsvindende transcriptie. De tryptofaanoperon en de regeling daarvan is hiervan een goed voorbeeld. Bacteriën synthetiseren tryptof aan via een reeks biochemische reacties waarin vijf enzymen zijn betrokken. De genetische informatie ter vorming van deze enzymen is zodanig georganiseerd dat de individuele 15 genen elkaar in het genoom opvolgen en allen vanuit een enkele plaats, de operator, worden bestuurd.

De regeling van de transcriptie geschiedt via het terugkoppelings-principe, d.w.z. in de aanwezigheid van tryptofaan, wordt het operon geblokkeerd of gerepresseerd, terwijl het in afwezigheid van tryptofaan 20 wordt gederepresseerd. In deze toestand wordt de transcriptie ingeleid bij de promotor (een gebied van DM bij de operator met een sterke affiniteit voor RITA polymerase) en verloopt via de operator in de strukturele genen van het operon.

Het is bekend dat eukaryotische DM-fragmenten ingebracht kunnen 25 worden in bacteriële plasmiden (zie bij voorbeeld R. Roychoudhury, et. al, (1976), Nucleic Acids Research, 3» 863-877; en R.H. Scheller, et al, (1977),Science, 196, 177-1Ö0). Het is echter duidelijk dat ingevoerde eukaryotische promotorvolgorden slecht door de bacteriële cellen worden erkend, bij voorbeeld door E. coli RNA polymerase in vivo. Hoewel is 30 vermeld dat het mogelijk is geweest bacteriële mutaties te complementeren door DNA fragmenten uit gist, was aldus de mate van espressie van het gedoneerde gen gering en leverde langzaam groeiende bacteriën (zie bij voorbeeld J. Carbon, et al, (1977)» Recombinant Molecules; Impact on Science and Society, Raven Press, New York, 355-378).

35 Op soortgelijke wijze vond een gedoneerde muis mitochondrische 800 3 1 71 -2- DM transcriptie in E. coli uit de verkeerde streng plaats (zie "bij voorbeeld W.M. Bro-wn, et al. (1976), Cell, 7, 517-530).

De struktuur van de plasmidevectoren volgens de uitvinding is gebaseerd op het voorzien van een insertieplaats, in het bijzonder een 5 Hind III plaats, voor een gekozen eukaryotisch DNA-fragment welke insertieplaats grenst aan een bacteriele promotor, bij voorbeeld een trp premotor, zodat de transcriptie en translatie van het DM-fragment door de promotor worden geregeld, De plasmiden worden in het algemeen tevens in het gebied onmiddellijk na de insertieplaats voorzien met het gen 10 voor tetracycline resistentie, zodat na insertie van het gekozen DMA op de insertieplaats, de transcriptie en translatie van het ingebrachte DNA geregeld door de promotor geschikt kan worden bevestigd, aangezien, wanneer dit heeft plaatsgevonden de tetracyclineresistentie wordt gehandhaafd, en in de meeste gevallen, wanneer dit niet het geval is, de tetra-15 cycline-resistentie wordt vernietigd.

Een uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft betrekking op een plasmide met een insertieplaats voor de eukaryotisch DM fragment grenzend aan de bacteriele promotor en stroomafwaarts van een prokaryoti-sche ribosoom bindingsplaats en. een inleider codon, zodanig dat de bac-20 teriële promotor de transcriptie en translatie van het ingebracht DM-fragment bestuurt.

Een dergelijke plasmide kan worden bereid volgens een werkwijze omvattende het doneren van een bacteriele promotor in een geïsoleerd plasmide, het bepalen van de positie van een beoogde insertieplaats en 25 het voorzien van de insertieplaats, indien deze niet reeds aanwezig is.

Een dergelijke plasmidevector kan worden geproduceerd onder toepassing van een dergelijk plasmide door cellulair DM af te breken met een specifiek restrictie-enzym, een promotor bevattend fragment te isoleren en het. fragment te doneren in een geschikt bacteriele plasmide.

30 In een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een dergelijk plasmide waarin bij de insertieplaats een eukaryotisch DM-fragment is ingebracht. Het eukaryotische DM-fragment kan in het geprepareerde plasmide worden ingebracht volgens bekende technieken.

Als toelichtend voorbeeld heeft een van de huidige plasmiden de 35 eigenschappen die schematisch in fig. 1 van de tekeningen zijn voorgesteld, d.w.z. een moleculaire lengte van 6J50 bp, een Hind III plaats, een Bam Hl plaats 356 bp van de Hind III plaats, een Sal I plaats 275 bp 800 3 1 71 a * -3- van de Bam, HI plaats, een Hpa I plaats k230 "bp van de Sal I plaats en 1950 bp van de Hind III plaats, -waarbij het plasmide de trp promotor, het E-gen en een deel van het D-gen in een stuk van 1950 bp dat zich uitstrekt tussen de Hpa I plaats en de Hind III plaats en het gen voor 5 de ampicilline resistentie in het stuk van W00 bp tussen de Hind III plaats en de Hpa I plaats heeft.

Wederom ter toelichting diene dat dit plasmide, dat hierin wordt aangeduid als pEH5, als volgt kan worden geproduceerd: (a) Isolering van het Hind III trpE fragment ^ Dit fragment kan worden verkregen hetzij door Hind III (EC3.1.23.

21) afbraak van DNA uit de meeste stammen van E. coli, bij voorbeeld E. coli stam W3100, of door Hind III afbraak van het plasmide pEH1/trpE. pRH1 was zelf verkregen door Eco Ri (EC3.1.^.32) afbraak van E. coli plasmiden pDS11l8 en pML2, ligatie of samenbinding van de aldus 15 verkregen fragmenten en selectie op ampicilline- en kanamycine-resisten-tie. Hind afbraak van pRHI en ligatie met Hind III afgebroken DNA uit stam E. coli W3100, gevolgd door transformatie in stam W3100 trp oE 7 1 en kweek in afwezigheid van tryptofaan, produceerde pRH1/trpE.

(b) Het doneren van het Hind III trpE fragment 20 Het Hind III trpE fragment, als boven beschreven verkregen, werd covalent liggend aan een fragment verkregen door Hind III restrictie (doorsnijding) van het plasmide pBR322 (zie bij voorbeeld Bolivar, F., et al» (197T)j Gene, 2, 95-113). Het geligeerde DM werd toegepast voor het transformeren van E. coli W3100 trp oE 7 1 kolonies geselecteerd 25 op ampicilline-resistentie en tryptofaan complement er ing. De verkregen plasmiden bleken uit twee typen te bestaan, afhankelijk van de oriëntatie van de fragmenten gedurende het ligeren; deze twee plasmiden, hierna aangeduid als pEH3 en pEH^, worden geïllustreerd in resp. figuren 2 en 3 van de tekeningen. Het plasmide pEH3 werd gekozen op basis van zijn 30 tetracycline resistentie en toegepast voor de volgende trap van de pro-duktie van de huidige plasmiden. Het plasmide pEH3 heeft de volgende eigens chappen:

Een moleculaire lengte van 9866 bp; een Hind III plaats; een Bam I plaats 3b6 bp van de Hind III; een Sal I plaats 275 bp van de 35 Bam I; een Eco RI plaats 3709 bp van de Sal I; een tweede Hind III plaats 31 bp van de Eco RI; een Hpa I plaats 305 bp van de tweede Hind III; een tweede Hpa I plaats 3250 bp van de eerste Hpa I en 1950 van de eerste 800 3 1 71 -k~

Hind III, waarbij het plasmide de trp promotor, het E-gen en een deel van het D-gen in een stuk van 1950 bp tussen de tweede 5pa I en de eerste Hind III plaatsen heeft; waarbij het gen voor de tetracycline onmidellijk de eerste Hind III plaats en het gen voor de ampicilline-resisten-5 tie in het stuk 3709 bp tussen de Sal I en de Eco RI plaatsen volgt.

(c) Deletie van de Hind III plaats naburig aan de Eco RI plaats in pEH3 pEH3 werd met' Eco RI afgebroken ter vorming van lineaire moleculen die werden afgebroken met exonuclease III (EC 3.1 Λ.27) en daarna met 10 S1 nuclease (EC 3.1Λ.-) ter verwijdering van de 5’-uitstekende staarten en ter vorming van stompe uiteinden. Daarna werden de lineaire moleculen verbonden met Tl-geïnduceerde DNA ligasen (EC 6.5.1.1.) en het aldus verkregen plasmide werd toegepast voor het transformeren van de trp oE <7 1 stam, geselecteerd op trp complementering en ampicilline resistentie, 15 teneinde, het plasmide volgens de uitvinding te verkrijgen, aangeduid als pEH5 (geïllustreerd in fig. 1).

Het plasmide pEHU heeft de volgende kenmerken:

Een moleculaire lengte van de 9366 bp; een Bam I plaats 3½ bp van de Hind III; een Sal I plaats 275 bp van de Bam I; een Eco RI plaats 20 3709 bp van de Sal I; een tweede Hind III plaats 31 van de Eco R1; een t

Hpa I plaats 1950 van de tweede Hind III plaats; een tweede Hpa I plaats 3250 bp van de eerste Hpa I en 305 bp van de eerste Hind III, waarbij het plasmide de trp promotor, het E-gen en het deel van het D-gen in het stuk van 1950 bp tussen de tweede Hind III en de eerste Hpa plaats 25 heeft; en het gen voor de tetracycline-resistentie onmiddellijk de eerst Hind III plaats en het gen voor de ampicilline-resistent in het stuk van 3709 bp tussen de Sal I en de Eco RI plaatsen volgt, waarbij het plasmide wordt aangeduid als pEHil· kan op soortgelijke wijze als pEH3 worden gevormd, met uitzondering dat de keuze tot stand wordt gebracht op basis 30 van de tetracyclinegevoeligheid daarvan.

Als bovenvermeld zijn de huidige plasmiden bijzonder bruikbaar omdat zij een duidelijk gedefinieerde plaats hebben die geschikt is voor insertie van een gewenst eukaryotisch DNA-fragment en dat de struktuur van het plasmide zodanig is dat de transcriptie van het ingevoerde DNA 35 wordt bestuurd door de promotor, in het bijzonder een trp promotor, verbonden met de gedefinieerde insertieplaats, bij voorbeeld de Hind III plaats van het plasmide pEH5 (geïllustreerd in de bijgaande fig 1).

800 3 1 71 è * -5-

Dit plasmide stelt derhalve een waardevol tussenprodukt voor waaruit plasmiden kunnen worden geproduceerd waarin "bij de insertieplaats, hij voorbeeld de Hind III plaats, genetische informatie is ingebracht in de vorm van een geschikt gemodificeerd DNA ontworpen ter vorming van een 5 gewenst polypeptide produkt.

Algemeen uitgedrukt zijn de bereiding van het vereiste DM, de modificatie daarvan voor insertie- en insertieprocedures, alsmede de aansluitende processen voor proteïne produktie bekend en kunnen worden samengevat en toegelicht als volgt:

10 (I) De bron van het in te brengen DNA

DMA voor insertie kan door een reeks van procedures worden verkregen. Bij voorbeeld kunnen oligonucleotiden van verschillende lengten warden gesynthetiseerd volgens bekende procedures (zie bij voorbeeld Hsiung et al (1979)* Nucleic Acids Research, 6_, 1372-1385).

15 Verschillende oligonucleotiden kunnen als gevolg van de speci fieke base paringseigenschappen daarvan worden verzameld, in langere moleculen met dubbele strengen. De component oligonucleotiden van dit molecuul kunnen worden samengevoegd (geligeerd) door het enzym DM ligase.

Naar keuze kunnen DNA moleculen met de gewenste genetische spe-20 cificiteit worden gesynthetiseerd door toepassing van het enzym rever-sibele transcripties, waarbij RNA van de gewenste specificiteit als matrijs wordt gebruikt. Het RNA kan volgens bekende procedures worden geïsoleerd uit cellen.

(2) Bereiding van het DNA voor insertie 25 DNA kan voor insertie in het plasmide door een reeks van proce dures worden gemodificeerd. Bij voorbeeld kan DNA, als bovenbeschreven bereid bij de 3' eindplaats van elk van de dubbele strengen worden verlengd door middel van het enzym terminale transferase (EX 2.7*7.31) waarbij een homopolymere enkel-strengige verhoging wordt gegeven. De 3’ 30 eindplaats van het Hind III afgebroken plasmide kan op soortgelijke wijze worden verlengd. Indien de verlenging van het geprepareerde DNA (dA)^ en van het plasmide (dT)^ of vice versa is, of indien de verlenging van het geprepareerde DNA (dG)Q en van het plasmide (dC)^ of vice versa is, dan kunnen het DNA voor insertie en het plasmide zodanig wor-35 den gehybridizeerd door deze een-strengige verlengingen dat cirkelvormige moleculen worden gevormd waar het geprepareerde DNA wordt ingebracht bij de Hind III plaats van het plasmide. Dergelijke plasmiden kunnen worden 800 3 1 71 -6- toegepast voor het transformeren van E. coli cellen en koloniën van de transfarmanten geselecteerd volgens tekende procedure (zie bij voorbeeld D. Glover, New Techniques in Biophysics en Cell Biology, (Eds.Pain, R.H., en B.J. Smith), 8, 125-1^+5) (Wiley, New York, 1976).

5 Naar keuze kunnen de uiteinden van het als bovenbeschreven gepre pareerde DNA worden geligeerd met het enzym DNA ligase tot korte dubbel-strengige DNA moleculen (Hind III, "linkers", verkregen van Collaborative Research, Waltham Mass., U.S.A.) die de volgorde bevatten die door het restrict ie., enzym Hind III wordt herkend. Het afbreken van 10 deze moleculen met dit enzym na de ligatie, zal Hind III termini bij de uiteinden van het geprepareerde DNA vormen. Het geprepareerde DNA kan daarna worden ingebracht in een piasmi de na afbraak met Hind III volgens bekende procedures.

(3) Bereiding van peptide 15 De bekende werkingsmechanismen van de bacteriële promotors teza men met de bovenaangegeven gegevens leiden tot de conclusie, dat wanneer de operator open is, de transcriptie vanaf de promotor zal voortgaan vanaf trpE en trpB via de Hind III plaats en in de gebieden van het genoom, voorbij de Hind III plaats. De translatie van het trans-20 criptieprodukt zal een afgelezen polypeptide geven gekoppeld aan het D-gen (tenzij een beëindigings codon in de insertieplaats wordt opgenomen). Het geproduceerde polypeptide kan volgens bekende methoden worden geïdentificeerd, bij voorbeeld door het plasmide over te dragen naar een stam die minicellen produceert (zie bij voorbeeld R.B. Meagher (1977)» 25 Cell, 10, 521-536), waarin de polypeptide produkten van plasmide genomen gemakkelijk worden onderscheiden of door immunologische procedures (zie bij voorbeeld S. Broom, en W. Gilert, (1978), Proc. Natl. Acad.

Sci. S.A., 75, 27^-27^9).

Het afgelezen polypeptide kan worden gezuiverd volgens bekende 30 procedures en het gewenste polypeptideprodukt door afbraak van het polypeptide met specifieke chemische of enzymatische middelen worden gevormd.

Het plasmide pEH5 volgens de uitvinding kan tevens worden toegepast als bron voor DNA waaruit een verdere reeks van plasmidevectoren 35 kan worden geconstrueerd, de z.g. "pWT" reeks.

Het plasmide pEH5 kan worden behandeld met het restrictie endonuclease Hinf I (EC 3.1.23.22) teneinde daaruit een fragment van bij 8003 1 71 «ί * -7- benadering ^97 "bp te verkrijgen dat de volledige tryptofaan premotor, de "leader” sequentie en de eerste zeven aminozuren van het trp E bevat.

Het aldus verkregen Hinf I fragment kan worden gedoneerd in de Hind III plaats van het bekende plasmide pBR322. Dit doneren kan worden uitge-5 voerd door de Hinf I uiteinden van het fragment te behandelen met DNA polymerase I (EC.2.7.7.7) en de DM gevulde Hinf I fragmenten achtereenvolgens te onderwerpen aan de inwerking van Hind III "linker" in aanwezigheid van DM ligase en Hind III restrictie endonuclease waarbij het fragment met Hind III "kleverige uiteinden" wordt geleverd.

10 Daarna kan. het Hinf I fragment worden gedoneerd in het plas mide pBE322 door Hind III restrictie van het pBR322 en ligatie van het met het Hinf I fragment doorgesneden plasmide.

Het Hinf I fragment zal in de Hind III plaats van pBR322 in een van de twee oriëntaties als bovenbeschreven in verband met pEH3 en k 15 worden ingebracht. Een hiervan waarin de trp premotor wordt getranscribeerd in de richting van de tet-genen wordt gekozen door restrictie enzymanalyse van de individuele clonen (de volgorde van pBR322 is bekend (zie bij voorbeeld J.G. Sutcliffe, Golf Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, (1978), XL11, 77-90. De volgorde van de trp 20 promotor/operator is tevens bekend (zie bij voorbeeld G.N. Bennett, et al., (1978), J. Mol. Biol., 121, 113-137 F. Lee et al., J. Mol. Biol.

(1978), 121, 193-217).

Het verkregen plasmide wordt aangeduid als pWT101, waarvan de struktuur wordt geïllustreerd in fig. U van de tekeningen. De plasmide 25 heeft de volgende eigenschappen:

Een moleculaire lengte van L87U bp; een Eco RI plaats, een Hind III plaats 21 bp van de Eco RI; een Hpa plaats 313 bp van de Hind III een tweede Eind III plaats 199 bp van de Hpa I; een Bam I plaats k3è bp van de tweede Hind III; een Sal I plaats 275 bp van de Bam I; een Pst I

30 plaats 29^8 bp van de Sal I en 752 bp van de Eco RI; waarbij het gen voor de tetracycline resistentie zich uitstrekt uit het gebied van de Hpa I plaats tot voorbij de Sal I plaats; en het gen voor de ampicilline-resistentie in het gebied van de Pst I plaats en het gedoneerde stuk van de trp operon het gebied tussen de promotor en het eerste stuk van het 35 E-gen tussen de Hpa I en de tweede Hind III plaats omvat.

Krachtens de als boven geïllustreerde vorming daarvan, heeft het plasmide pWT101 twee Hind III plaatsen, êén aan elk uiteinde van het 8003 1 71 -8- ingebrachte Hinf I fragment vanaf het oorspronkelijke ρΕΞ5.

Teneinde te garanderen dat ingebracht DNA grenzend aan de tryp-tofaan promotor wordt geplaatst is het noodzakelijk de Hind III plaats stroomopwaarts van de tryptofaan-promotor weg te nemen en dit kan worden 5 bereikt door doorsnijden van het plasmide pWT101 met het restrictie endonuclease Eco RI, afbraak met exonuclease III en S1, behandeling met DM polymerase I (voor het opvullen van eventuele asymmetrische uiteinden geproduceerd door de S1 nuclease afbraak) en ligatie van de vrije einden van het plasmide onder vorming van een derivaat van pWT101, hier 10 aangeduid pWT 111, dat slechts éên Hind III plaats heeft en wel stroomafwaarts van de trp-prcmotor.

Aldus heeft de uitvinding tevens betrekking op een plasmide pWT111, ingesteld om insertie DM op de Hind III plaats te ontvangen, hetgeen er toe leidt dat het DM onder de directe invloed van de trp 15 promotor is. Transcriptie en translatie van het insertie DM kan gemakkelijk worden bevestigd aangezien het plasmide stroomafwaarts van het ingebrachte fragment het gen voor de tetracycline-resistentie bevat zodat transcriptie via het ingebrachte DM voortgaat via het tet-r gen dat de tetracycline resistentie levert, die niet wordt verkregen indien 20 de transcriptie via het ingebrachte DM niet plaatsvindt.

Afhankelijk van de aard van het DM fragment dat men wenst in te brengen, is het noodzakelijk een correctie fasering te verzekeren in het plasmide dat aangepast is aan dat van het in te brengen DM. Aldus bevat dubbelstrengige cDM bereid door omgekeerde transcriptie uit 25 mRNA, indien volledig, normaal een stuk nucleotiden als "leader" gebied voorafgaande aan de proteïne volgorde. Als gevolg hiervan zal de translatie van het proteïne als deel van een gecondenseerd polypeptide in een plasmide, zoals pWT111 (ingecloneerd bij de Hind III plaats) afhankelijk worden van het aantal nucleotiden in het "leader" gebied, d.w.z. een on-30 volledige omgekeerde transcriptie kan de volgorde van het "leader" gebied verminderen, waardoor het leesframe wordt gewijzigd. Cm deze redenen is de opbouw van expressie plasmiden die in staat zijn voor alle drie leesframes een translatie uit te voeren essentieel.

Plasmide pWT111 laat slechts translatie van DNA ingebracht bij 35 de Hind III plaats als een gecondenseerd polypeptide in éên leesframe toe (indien het ingebracht DNA zijn eigen functionele ribisoom bindings-plaats heeft, dan is dit niet van toepassing). De translatie begint met 800 3 1 71 -9- de eerste 7 aminozuren van trpE, gevolgd door 2 aminozuren vanaf het Hind III "linker" MA en zal dan voortgaan in de ingébrachte volgorde. Indien in deze volgorde geen stopcodons aanwezig waren zou de translatie worden beëindigd bij de eerste stopcodon in het tetracycline gebied.

5 De nucleotide volgorde over de Hind III plaats van pBR322 toont aan dat voor pWE111 het eerste stopcodon 26 nucleotiden stroomafwaarts van de Hind III plaats is. Om de fasering vanaf de Hind III plaats van pWT111 te wijzigen kan het plasmide worden doorgesneden met Hind III, de 5'-verlengingen gevuld met DM polymerase I en Hind III "linker” DM ge-10 ligeerd. Doorsnijden met Hind III ter verwijdering van overmaat "linker" en ter produktie van "kleverige uiteinden", en het opnieuw ligeren produceerde "pWT121". Deze procedure voegt 14 bp van DM toe en verandert het leesframe vanaf de nieuwe Hind III plaats (de oude plaats is nu onvolledig) met plus êên nucleotide.

15 Het derde leesframe, d.w.z. pWT 111 plus 2 nucleotiden weid ver kregen door dezelfde reeks reacties aan pWT121 te herhalen; het verkregen plasmide wordt aangeduid als "pWT131".

De struktuur van de plasmiden pWT111, pWÏ121 en pWT131 wordt weergegeven in fig. 5 van de tekeningen. De struktuur kan verder als volgt 20 worden gedefinieerd:

pWTHI

Een moleculaire lengte van 4823 bp; een Hpa I plaats; een Hind III plaats 199 bp van Hpa I; een 3am I plaats 346 bp van Hind III; een Sal I plaats 275 bp van Bam I; een Pst I plaats 2958 bp van Sal I en 1045 bp 25 van Hpa I; waarbij het- gen voor de tetracycline resistentie zich uitstrekt uit het gebied van de Hpa I plaats tot buiten de Sal I plaats; het gen voor de ampicilline-resistentie in het gebied van de Pst I plaats en het gedoneerde stuk van de trp operon het gebied tussen de promotor en het eerste stuk van het E-gen tussen de Hpa I en de Hind III plaatsen 30 omvat.

PWT121

Een moleculaire lengte van 4837 bp; een Hpa I plaats; een Hind III plaats 206 bp van Hpa I; een Bam I plaats 353 bp van de Hind III; * anderszins als pWT111.

35 PWT131

Een moleculaire lengte van 4851 bp; een Hpa I plaats, een Hind III plaats 213 bp van de Hpa I; een Bam I plaats 360 bp van de Hind III; «00 3 1 71 . -10- anderszins als pWT111.

De volgorden rond de Hind III plaats van pWT111, 121 en 131 zijn als volgt: •pWTI11

5 ’ Hind III

plaats

5’ ATG, CM, ACA, CM, AM, CCG, ACT, CCA, AGC, TTT, AAT, GCG, GT...3’ pTW121 Hind III

10 plaats 5’ ATG', CM, ACA, CM, AM, CCG, ACT, CCA, AGC, TCC, 'MG, CTT,' GGA, GCT,-TTA, ATG, C...3’

OWT131 Hind III

15 plaats 5’ .. .AM,CCG,ACT,CCA,AGC,TCC,MG,CTG,CjM,GCT,TGG,AGC,TTG,GAG,CTT,TM,-TG...3' (gemakshalve tonen de voornoemde volgorden slechts één streng van het DM).

20 Ter illustratie kan men de effectiviteit van de plasmiden pWT111, 121, 131 als vectoren voor insertie DM waarnemen uit de resultaten verkregen door het ihbrengen in pWT121, het plasmide van de correcte fase in dit geval, van een synthetisch hoender-pestvirus (FPV) gen, (zie hij voorbeeld Britse octrooiaanvrage 80.10777; en Emtage, J.S. et al, 25 (1980), Hature, 283 171-17*0.

Het voomoemde synthetische FPV-gen kan als volgt in pWT121 worden gedoneerd:

Het plasmide pWT121 werd doorgesneden met Hind III en behandeld met alkalifosfatase (EC 3.1.3.1) ter verwijdering van de 5*-fosfaat-30 groepen. Hind III "linkers” werden geligeerd aan de einden van het synthetische FPV-gen, dat daarna werd behandeld met Hind III restrictie endonuclease ter vorming van Hind III kleverige uiteinden. Het aldus behandelde synthetisch FPV-gen en het Hind III doorgesneden pWT121 werden daarna geligeerd en het plasmide pWT12l/FPV verkregen. Haar keuze kan 35 het synthetische FPV-gen worden gedoneerd in plasmide pBR322 en daarna op bekende wijze worden overgedragen aan pWT121.

De algemene struktuur van het plasmide pWT121/FPV wordt geïllustreerd 800 3 1 71 -11- in fig. 6 van de tekeningen. De struktuur kan verder als volgt worden gedefinieerd:

Een moleculaire lengte van 6532 bp; een Hind III plaats; een Sma I plaats 365 bp van de Hind III; een Eco RI plaats 910 bp van de 5 Sma I; een tweede Hind III plaats U60 bp van de Eco EI; een Bam Hl plaats 353 bp van de tweede Hind III; een Sal I plaats 275 bp van de 3am HI; een Pst I van de 29Ö5 bp van de Sal I; een Hpa I plaats 10^5 bp van de Pst I en 206 bp van de eerste Hind III; een synthetische EPV-gen in het stuk van 1735 bp tussen de eerste en de tweede Hind III plaats; waarbij 10 het gen voor de tetracycline resistentie zich uitstrekt vanaf de tweede Hind III plaats tot voorbij de 3am Hl plaats en het gen voor de ampicil-line resistentie in het gebied van de Pst I plaats.

Afhankelijk van de oriëntatie van het EPV-gen bleek het plasmide tetracycline resistent (zoals geïllustreerd in fig. 6) of tetracycline 15 gevoelig te zijn met het PPG in de omgekeerde oriëntatie.

Getransformeerde E. coli koloniën die pWT121/EPV plasmiden met het hemagglutinine (HA) gen in beide oriëntaties bevatten werden onderzocht op FPV-HA antigeen. Gevonden werd dat tetraeycline-resistente koloniën FPV-HA antigeen uitdrukten; hetgeen de correcte insertie van 20 het synthetische FPV-gen bevestigt. De koloniën waarin het FPV-gen was georiënteerd als geïllustreerd in fig. 6 vertoonden tetracycline-resisten-tie en die met omgekeerde oriëntatie waren tetracycline-gevoelig. In het eerste geval was de expressie van het HA antigeen onder trp controle.

EPV-antigeen expressie kan als volgt worden bevestigd: 25 E. coli koloniën die het tetracyeline-resistente pWT121/FPV plasmide als bovenbeschreven bevatten werden onderzocht op EPV-HA antigeen onder toepassing van een vaste fase immunologische methode (zie bij voorbeeld S. Broome, en W. Gilbert, (1978), Proc. ïïatl. Acad. Sci. U.S.A., 75.

27k6-2Jk9). In het kort werden kleine culturen van individuele kolonies 30 geweekt, geoogst en gelyseerd met lysozyme en "Triton X-100" (Triton X-100" is iso-octylfenoxy-polyethoxyethanol, een niet-ionogene was-actieve stof).

Eventuele aanwezige HA-reeksen werden gebonden aan een poly- styreenbuis bekleed met EPV-HA specifiek IgG. Gebonden antigeen werd 125 . . ...

35 daarna specifiek gemerkt met Ι-IgG met hoge specifieke activiteit.

De immunoreactiviteit werd in alle koloniën die een FPV-HA-gen inbrenging bevatten gedetecteerd; koloniën die alleen het hoofd pWT121 «0 0 3171 -12- plasmide bevatten vertoonden geen activiteit (zie tabel A).

Radio-ijnmunoanalvse van FPV-HA in lysaten van bacteriën die pWT12l/FPV nlasmiden bevatten

Kolonie nr. HA gehalte Fenotype Insertie 5 (ng/50 /Ui)

2 >20 Tcr A

5 0 Tcr

6 >20 Tcr A

8 0 Tcr

10 11 >20 Tcr A

13 0 Tcr 1¾ 0 Tcr

15 >20 Tcr A

16 >20 Tcr A

15 Als bovenvermeld werd de immunoreactiviteit gedetecteerd in alle koloniën die een FPV/HA-gen insertie beratten (A); koloniën die alleen het hoofd pWT121 plasmide bevatten vertoonden geen activiteit.

In het geval van de z.g. pWT reeks van expressie plasmiden, zoals bij pBR322, bestaat er de mogelijkheid dat onder bepaalde omstandigheden 20 deze normaal mobiliseringsminus (mob~) plasmiden kunnen worden gemobiliseerd (d.w.z. overgebracht van de ene naar de andere bacterie). Er is onlangs aangetoond (bij voorbeeld A.J. Twigg, en D.J. Sherratt (1980) Hature, 283, 216-218) dat hoewel de DM codering voor de Col E1 mobiliteit sproteïnen uit pBR322 afwezig is, dit proteïne niettemin mobiliteit 25 kan opwekken door trans complementatie wanneer het in dezelfde cel aanwezig is aan een verenigbaar plasmide, zoals Col K.

De bindingsplaats aan het DM-plasmide van de mobiliteitsproteïnen blijkt de z.g. ”nic plaats” of "overdrachtsoorsprong” te zijn (zie bij voorbeeld G.J. Warren et al. (1978) Nature, 27^, 259-261). Bij voorbeeld 30 is in pBR322, deze plaats gelegen in het 622 bp Hae II B fragment.

Mutaties in het mobiliteitsgen zijn mob~. Deze kunnen echter worden gecomplementeerd door mob+ Col E1 derivaten of verwante plasmiden, hetgeen een trans reagerend proteïne inhoudt.

(Co. E1 type plasmiden zijn niet-conjugatief, maar worden ge-35 mobiliseerd wanneer een sex-faktor, zoals een F’ of R factor, m de cel + _ wordt geïntroduceerd. De mobilisatie van een nic , maar mob plasmide, . zoals pBR322, vereist derhalve de aanwezigheid van twee andere plasmiden, 800 3 1 71 -13- viz een sex-faktor en een verenigbaar Col E1 type mob+ plasmide).

De nic plaats is specifiek vereist voor het mobiliseren en plas-miden zonder deze plaats kunnen niet worden gecomplementeerd. Hoewel aldus pBR322 en de pWT reeks plasmiden niet alle mobiliteitsgenen bevat-5 ten bevatten zij allen de nic plaats zodat zij wat mobiliteit betreft kunnen worden gecomplementeerd. Teneinde veiligere, niet-mobiele vectoren te leveren is het gewenst de nic plaats te verwijderen. Dit kan bij voorbeeld worden uitgevoerd door een Hae II fragment weg te laten.

De nic plaats kan uit de plasmiden pWültl, 121 en 131 op de 10- volgende wijze worden verwijderd:

Een beschouwing van de Hae II restrictiepatronen van de voomoem-de plasmiden toont aan dat slechts twee fragmenten (B en H) kunnen worden verwijderd en dat steeds de ampicilline- en tetracycline-genen, de tryptofaan promotor en de oorsprong van de replicatie worden achtergela-15 ten. In dit verband wordt verwezen naar fig. 13 van de tekeningen.

Fragment B is 622 bp en fragment H is 83 bp. Derhalve ontbreekt bij nic" plasmiden (minus B en H) 750 bp. Dit dient uiteraard in aanmerking te worden genomen bij de kenmerking van de nic"* derivaten van de voornoemde plasmiden. In pWT111 (nic”), is bij voorbeeld de Pst I plaats 20 2253 bp van de Sal I plaats.

De nic derivaten van pWT111, 121 en 131 worden resp. pWT211, 221 en 231 genoemd.

De eerste trap in deze illustratieve verwijderingsprocedure is het gedeeltelijk afbreken van het plasmide zodanig dat elk molecuul gemiddeld 25 twee tot driemaal wordt gesplitst. De afgebroken stukken worden dan opnieuw geligeerd met T^DM-ligase en het geligeerde DM getransformeerd in E. coli K 12, bij voorbeeld HB101. Transformanten worden geselecteerd op ampicilline en tetracycline onder toepassing van minimale agar platen voor het induceren van trp transcriptie en het verzekeren van tetra-30 cycline resistentie.

De verkregen koloniën zullen de weer tot cirkels gevormde uit-gangsplasmiden bevatten, alsmede voorbeelden die een of beiden van de Hae II fragmenten missen. De laatste kunnen worden geïdentificeerd door enkele koloniën te onderzoeken en te zoeken naar plasmiden die kleiner 35 zijn dan het parenterale plasmide. Te verwachten nic” derivaten kunnen worden bevestigd door restrictie enzymanalyse van gezuiverd plasmide DM. In plaats van toepassing van dévoornoemde illustratieve procedure 800 3 1 71 -1b- waarin deelrestricties betrokken zijn die bet noodzakelijk maken eventueel honderden koloniën te onderzoeken, is het in het algemeen geschikter de nie~ derivaten te construeren als geschetst in fig. 1H van de tekeningen.

5 In het kort worden de pWT plasmiden doorgesneden met Pst I

en Bam Hl en banden die het trp p/o gebied bevatten worden uit polyacryl-aaidegels geïsoleerd. Het plasmide pAT153 (nic”) wordt doorgesneden met Pst I en Bam Hl en de band van 2351 bp geïsoleerd uit een polyacryl-amidegel. De eerste banden zijn individueel geligeerd met de laatste 10 band onder toepassing van T^DNA ligase, waarbij het geligeerde materiaal wordt toegepast voor het transformeren van E. coli Η B 101. DNA uit enkele kolonies kan worden geïsoleerd en de struktuur ervan bevestigd door restrictie enzymanalyse, bij voorbeeld Hae II afbraakprodukten van pAT153, pWT reeks en pWT (nic**).

15 Met andere woorden kunnen de nic” derivaten worden geconstrueerd door het gebied in de pWT plasmiden begrensd door de Pst I en Bam Hl plaatsen die de oorsprong van replicatie bevatten en de nic plaats met het corresponderende gebied van pAT153 te substitueren, die een döletie-derivaat van pBR322 is en waarin het 622 bp Hae II B fragment en het na-20 burige 83 bp Hae II H fragment ontbreken.

Hierna volgt een verdere illustratie van de uitvinding.

De bereiding van pEH3, ρΕΗί en pEH5

Culturen van E. coli K12 stam HB101 (zie bij voorbeeld H. Boyer, et al. (1969)» J· Mol. Biol., U1, ^59-^72) die het plasmide pBR322 be-25 vatten worden gekweekt hetzij in L-vloeistof of in M9 zouten, glucose, casaminozuren medium (zie bij voorbeeld J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Appendix I, Colg Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1972), ^31-^35)· Bij een AgQQ van 0,6 werd chlooramphenicol toegevoegd aan de plasmide culturen tot een eindconcentratie van 150 ,ug/ml en de incubatie gedurende 16 uur bij 37°C voortgezet. DNA werd geïsoleerd door cel lysaten door centrifugeren in CsCl/ethidium bromide gradiënten (zie bij voorbeeld L. Katz et al., (1073), J. Bacterid, 11U, 577-591 ; en P.C. Wensink et al, (197*0, Cell, 3, 315-325F). DNA banden werden verwijderd door zijwaarts insteken met een 1 ml spuit en 16 G naald onder verlich-35 ting met 366 nm u.v. licht terwijl ethidiumbramide werd verwijderd door passage door Dowex AG50 (zure kation uitwisselbars).

Alle DNA oplossingen werden gedialyseerd tegen TE buffer 800 3 1 71 -15- (10 mM Tris, 1 mid EDTA pH Ts5) ter 'verwijdering van overmaat CsCl, geconcentreerd door ethanol neerslag en opgeslagen hij -70°C. Het verkregen DM mengsel werd beperkt afgebroken met Hind III als volgt: 2 yUg pBR322 werd geïncubeerd met 5 eenheden Hind III in een 5 buffer die 50 mM tris-HCl pH 7,5, 50 mM UaCl, 10 mM MigCl^, 5 mM 0-mercap-to—ethanol en 2 mM dithiotreitol bevatte. De incubering vond plaats bij 37°C gedurende 90 min in een volume van 40 ^ul. De reactie werd daarna beëindigd door een 5 min incubatie bij 65°C.

Isolering van het Hind III trn E fragment 10 20 ^ug prHl/trpE werd onder doorsnijden afgebroken met Hind III, geëlektroforeseerd over \% agarose gelen waarbij de band die het lineaire trpE bevatte werd verwijderd. Het trpE fragment werd teruggewonnen uit de gel schijf door elektroforese in een dialysezak, gevolgd door fenolextraktie en ethanolneerslag.

15 Digeren

Ligase incubaties bevatten 0,2 yUg van het trpE fragment, 0,4 yUg van Hind III doorgesneden pBR322 en 0,1 eenheden van polynucleotide ligase per 20 ^ul reactiebuffer. Het reactiemengsel werd gedurende 4 uur bij 16°C geincübeerd.

20 Transformatie 0,01 ^ug van het geligeerde MA werd toegepast ter omzetting van de E. coli W3110 trp oE7 1 stam.

Anrpicilline-resistente recombinanten die in staat waren deze 4 trpE cellen te complementeren werden gekozen. 1.2 x 10 amp-r kolonies 25 die in staat waren te groeien in afwezigheid van tryptofaan werden verkregen per ^ug plasmide DM.

Vijftig van deze koloniën werden willekeurig geselecteerd en overgebracht met tandenstokers op minimale agarplaten (zie bij voorbeeld J.H. Miller, loc. cit), die 100 ^ug/ml ampicilline en 12,5 yUg/ml tetra-30 cycline bevatten. Een en dertig van de vijftig kolonies groeiden gedurende overnachtse incubering, hetgeen de aanwezigheid van een tetra-cycline-resistent proteïne in deze populatie aangeeft.

Plasmide DM werd uit representatieve koloniën van de tetracycline-gevoelige resistente groepen geïsoleerd en de Hind III fragment patronen 35 geanalyseerd door gelelektroforesë aan agarose gelen. Plasmide DM uit alle ampicillineresistente, trp+ clonen bevatte het hoofd pBR322 DM van Mr 2,8 x 10 (4,361 kb) en het E. coli Hind III trpE fragment van enn s 1 71 -16-

Mr 3,5 x 10° (5*350 kb). De geproduceerde plasmiden werden onderworpen aan de volgende verdere procedures ter bevestiging van de struktuur daarvan.

Oriëntatie van trpE fragment 5 Een conseqpentie van het opnieuw ligeren van Hind III brokstukken vanpBR322 met het trpE fragment is dat het trpE fragment in een van twee verschillende oriëntaties kan worden ingebracht. Deze kan zodanig zijn dat de transcriptie vanaf de trp promotor voortgaat via het tet— gen van het plasmide of weg van. het tet-gen. De oriëntatie van het tet-10 resistente plasmide (pEH3) en het tet-gevoelige plasmide (pRHU) werd bepaald in het licht (zie bij voorbeeld M.E. Bennett, et al, (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. Ü.S.A., 73. 2351-2355) van bestaande Hpa I plaatsen in het trpE fragment en Bam Hl plaatsen in pBR322 (zie bij voorbeeld F. Bolivar et al, Loc. cit). Fig. 7 van de tekening illustreert de re-15 sultaten van door snij-afbraak van plasmiden pBR322, pEH3 en pEH5 met hetzij Hind III, Hpa I (EC 3.1.23.23), Bam HI (EC 3.1.23.6) of een combinatie van deze enzymen.

Bijgaande fig. 7 illustreert een agarose gel dat de restrictie endonuclease plaatsen voor Hpa I, Hind III en Bam HI in pEH3 en pEHl* en 20 de oriëntatie van het gedoneerde trpE DNA in deze plasmiden aantoont.

Sparen a-j bevatten de volgende DNA's met afmetingen in kilobase paren (kb): - (1) PM2 DNA afgebroken met Hind III als maatsignaleerders. Zichtbare banden zijn 1-6 met een afmeting van resp. 5,1*, 2,35» 1,05, 0,1*75, 0,1*5 en 0,27 kb. (j) ^ c.I857,s7 DNA afgebroken met Hind III 25 als maatsignaleerder. Zichtbare banden zijn A-G met een afmeting van resp. 21,79, 9,38, 6,30, 1*,20, 2,38, 2,11 en 0,1*7 kb.

(b) super-gespiraliseerde pBR322 DNA . (c) pBR322 gelncubeerd met Hpa I.

(d) pEH3 afgebroken met Hind III. (e) pEH3 afgebroken met Hind III en Hpa I. De banden meten 1*,3, 3,25, 1,85 en 0,30 kn (f) pBR322 afgebroken 30 met Bam Hl. (g) pEH3 afgebroken met Bam Hl. (h) pEHl* afgebroken met Bam Hl en Hpa I. Complete afbraakfragmenten meten 5,7, 3,25 en 0,67 kb.

(i) pEH3 afgebroken met Bam Hl en Hpa I. Complete afbraakfragmenten meten U,3, 3,25 en 2,1* kb. Er zijn geen Hpa I plaatsen in pBR322 (vergelijk kolommen b en c) en geen Bam Hl plaatsen in trpE (vergelijk kolom-35 men f en g). Wanneer gesplitst met Hind III alleen, geven zowel pEH3 als pEHl* lineaire pBR322 en trpE fragmenten (kolcm d). Dubbele brokstukken van pEH3 en pEHl* met Hind III en Hpa I geven tevens identieke profielen 800 3 1 71 -17- (kolom e). In dit geval wordt lineair pBR322 (U.360 kb) geregenereerd tezamen met drie andere fragmenten van 3250, 1950 en 305 bp. Aangezien pBR322 geen Hpa I targets beeft (zie bij voorbeeld F. Bolivar, et al, loc cit) wordt geconcludeerd dat er geen twee Hpa I targets in bet 5 trpE fragment zijn. Eén is reeds gerapporteerd en ligt in bet promotor-gebied (zie bij voorbeeld M.E. Bennett, et al, loc cit), de tweede plaats is bij benadering 30Q bp van één van de Hind III plaatsen.

Dubbel afbreken met Bam Hl en Hpa I werd toegepast ter bepaling van de oriëntatie van bet trpE fragment en de positie van de tweede 10 Hpa I plaats. De geproduceerde fragmenten worden weergegeven in kolom b voor pEïïU en in kolom i voor pEH3. Het is duidelijk dat deze plasmiden trpE fragmenten in verschillende oriëntaties bevatten. De afmeting van bet kleinste fragment afgeleid van pEHU wordt gemakkelijker geschat uit de resultaten geïllustreerd in fig. 6 van de tekening. Deze figuur toont 15 de kleine fragmenten afgeleid door restrictie afbreken van pEH3, pEHU en pBR322 met Sal I (EC 3.1.23.27), Bam Hl, Hpa I, Eco RI en Hind III.

(Bijgaande figuur 8 illustreert een 5%'s acrylamidegel die laag-moleculaire DM-fragmenten uit pBR322, pEH3 en pEH4 weergeeft na afbraak met Hpa I, Bam HI, Hind III en Sal I restrictie endonucleasen. De spo-20 ren a-i bevatten de volgende DNA's met afmetingen in base paren (bp): -(a,l) PM2 DHA afgebroken met Hind III als maatsignaleerders. Banden 1-7 hebben resp. een afmeting van 5^00, 2350, 1050, ^75, ^50, 270 en 110 bp.

(b) pEH3 afgebroken met Bam Hl en Hpa I. (c) pEH^ afgebroken met Bam Hl en Hpa I. Kleinste band geschat op 6U0 bp. (d) pEH3 afgebroken met 25 Hind III en Hpa I. Kleinste band geschat als 295 bp. (e) pBR322 afgebroken met Bam Hl en Sal I. Kleinste band geschat op 275 bp. (f) pBR322 afgebroken met Hind III en Sal I. Kleinste band geschat op 620 bp.

(g) pBR322 afgebroken met Bam ΞΙ en Hind III. Kleinste band geschat op 35Ο bp. (h) pBR322 afgebroken met Eco RI en Hind III. Kleinste band ge-30 schat op 25 bp).

Uit de voornoemde resultaten zijn de doorsnijpatronen voor pEH3 en pEHl· geïllustreerd in figuren 2 en 3 van de tekeningen geconstrueerd. Dat de tweede Hpa I plaats "stroomopwaarts" van de trp promotor ligt is gebaseerd op de bekende afmetingen van het trpE proteïne, anthranilaat 35 synthetase, en het trpD-genfragment aanwezig in het Hind III trpE fragment. Anthranilaat synthetase is een proteïne van 60.000 dalton (zie bij voorbeeld J. Ito et al (1969)» J. Bacteriol, 97» 725-733), (bij be- 800 3 1 71 -18- nadering JOO aminozuren), terwijl slechts ongeveer 1/6 van het trpD proteïnegen (equivalent aan ca. 275 fcp) wordt gespecificeerd door dit Hind III fragment (zie bij voorbeeld A.S. Hopkins, et al (1976) J. Mol Biol., 107, 5^9-569). Aldus is een DM lengte van bij benadering 1800 bp 5 vereist om deze polypeptiden te specificeren. Tevens zijn er 162 basen in de "leader sequentie" bij het 5' -einde van trp mRNA en een verdere 11 basen vanaf de start van trp mBHA tot het Hpa I target in de trp promotor (zie bij voorbeeld F. Lee, et al, (1978), J. Mol. Biol. 121, 193-217)· Dit totaal van 19W3 bp tussen Hpa I en Hind III is in goede 10 overeenstemming met de Hpa I - Hind III afstand van 1950 bp afgeleid uit gelanalyse en komt overeen met de conclusie dat de tweede Hpa I plaats "stroomopwaarts" van de trp promotor is.

Regeling van de tetracyclinegevoeligheid van de trp promotor

De plaatsing van het kleine Hpa I - Hind III fragment "stroom-15 opwaarts" van de trp promotor geeft ondubbelzinnig aan dat in de tetra-cyclineresistente groep van plasmiden (pEH3), de transcriptie van de trp premotor gericht is naar het tetracycline-gen, terwijl in het tetra-cycline-gevoelige plasmide (pEHl·) het tegengestelde van kracht is. Op deze basis zou men verwachten dat de expressie van het tetracycline-gen 20 pEH3 wordt bestuurd vanaf de trp premotor en dat een eventuele insertie in de Hind III plaats van pBR322 de tetracycline promotor vernietigt.

Dit is getest door onderzoek van de tetracycline resistentie van E. coli die pEH3, gekweekt al of niet in aanwezigheid van tryptofaan, d.w.z. onder omstandigheden waarin de trp genen hetzij worden gerepres-25 seerd of gederepresseerd, bevatten. Plasmiden pEH3 in stam W3110 trp 0 E 7 1 werd gekweekt in een medium dat M9 zouten, glucose, casamino-zuren en 5 ^ug/ml tetracycline bevatte. Bij een AgQQ van 0,05 werd de kweek gesplitst en 200 microgram/ml tryptofaan aan de ene helft toegevoegd. Na incubatie gedurende een verder uur werden de cellen verdund en 30 op agar platen gebracht die toenemende concentraties tetracyclinen bevatten. De cellen die gedurende een uur op 200 microgram/ml tryptofaan waren gegroeid werden gegroeid op minimale agarplaten gesuppleerd met tryptofaan.

De resultaten van deze reeks experimenten worden geïllustreerd 35 in fig. 9 van de tekeningen.

(Fig. 9 illustreert de doelmatigheid van het kweken op platen van de trp o E w 1 stam en derivaten daarvan bij toenemende concentraties 800 3 1 71 -19- van tetracycline. Cultures van de trp o E <7 1 stam, die de aangegeven plasmiden bevatten, -werden gekweekt in vastgelegde media en als hierna beschreven behandeld. Het percentage overleving werd bepaald ten opzichte van de passende plaat die geen tetracycline bevatte. Platen die 5 80-400 kolonies bevatten werden toegepast ter bepaling van het percentage overlevenden. De volgende tetracycline concentraties, in staat 50% van de cellen als bepaald door de analyse van de kolonie te doden (EOP 50%), werden uit de figuur gemeten: 12 yUg/ml voor de piasmide-vrije cellen; b,5 yUg/ml voor pEH^ bevattende cellen; 23 yUg/ml voor pEH3-bevattende 10 cellen van te voren geïncubeerd met 200 yUg/ml tryptofaan, 56 yUg/ml voor pEH3-bevattende cellen gekweekt zonder tryptofaan).

De aanwezigheid'van tryptofaan in het medium veroorzaakte een 2,5-voudige afname van de tetracycline-resistentie tot stand gebracht door pEH3. Soortgelijke experimenten met pEEA en met plasmide-vrij 15 W3110 trp o E 7 1 (waarin het begin groeimedium geen tetracycline bevatte) toonden aan dat deze bacteriën zeer gevoelig waren ten opzichte van zeer lage concentraties tetracycline.

De Hind III plaats proximaal ten opzichte van de Eco RI plaats van pEH3 werd als volgt gedeleerd ter vorming van het plasmide pEH5· 20 20 ^ug pEH3 als bovenbeschreven bereid werd afgebroken met Eco RI, gel gefiltreerd over Sephadex G-5Ö (verknoopt dextrangel) in 50 mM HaCl/0,\% W/V SDS en de geëxcludeerde DM-piek geconcentreerd door ethanol precipitatie en opgelost in water.

Het lineaire Eco RI afgebroken pEH3 werd afgebroken met exonuclease 25 III bij 20°C. Het mengsel bevatte 10 yUg lineair plasmide, 60 mM Iris pH 8, 0,66 mM MgClg, b mM dithiotreitol en bö eenheden exonuclease III in een totaal volume van 200 yUl. 100 yUl aliquots (5 yUg) werden na 5 en 10 min verwijderd, geëxtraheerd met een fenol en chloroform en neergeslagen met ethanol.

30 Exonuclease III behandeld plasmide (5 yUg) werd behandeld met S1 nuclease gedurende 15 min. bij 30°C in een volume van 100 micrometer ter vorming van stompe uiteinden. Het reactiemengsel bevatte 150 mM IfaCl, 25 mM natriumacetaat pH H,6, 0,1 mM ZnSO^, DM en 2,5 eenheden S1 nuclease. Ha de incubatie werd het mengsel geëxtraheerd met fenol en chloro-35 form en daarna neergeslagen met ethanol. 3 yUg van het S1 afgebroken DM werden geligeerd in een eindvolume van 10 ^ul met 1 yUl DM ligase (0,8 eenheden) gedurende 16 uur bij 15°C en daarna gedurende 2k uur bij Λ· 800 3 1 71 -20- (Fig. 10 ran de bijgaande tekeningen illustreert een 1$'s agarose gel die deletie van Hind III en Hpa I plaatsen vanuit pEH3 weergeeft).

De sporen ari bevatten de volgende DNA's met afmetingen in kb paren (kb): (a,i) λ cl857,S7 afgebroken met Hind III als maat-5 signaleerders. Banden zichtbaar in agarose zijn A-F met een afmeting van resp. 21,78, 9*38, 6,30 en ii-,20 kb; (b) pEH3 afgebroken met Hind III; (c) pEH3 afgebroken met Sal I; (d) samengevoegde kolonies afgebroken met Hind III (e) pEH5 afgebroken met Hind III, (f) pEH505 afgebroken met Hind III, (g) pEH5 afgebroken met 10 Hpa I; (b) pEH505 afgebroken met Hpa I).

Bereiding van plasmiden van de pWT reeks Bacteriën en plasmiden

De bacteriële stammen die werden toegepast waren beide Escherichia ooli K12 derivaten; HN101 F” pro leu thi lac Y strr rk” mk~ 15 Endo Γ ree A~ & ED8689 trpR" rk~ mk+.

Media en transformatie

Cultures werden gekweekt in M9 zouten, glucose, casaminozuren medium (zie bij voorbeeld J.H. Miller, loc cit), voor plasmide DNA preparaten en tetracycline gevoeligheidsbeproeving. Voor plasmiden-be-20 vattende stammen werden antibiotica in een passende concentratie toegevoegd. De voor de transformatie gebruikte cellen werden gekweekt in L-voedingsvloeistof.

Bij de gehele tetracycline gevoeligheidstest werden de cellen op platen aangebracht van M9, glucose, cas aminozuren en minimale agar ge-25 suppleerd met tetracycline (0-80 ^ug/ml), 30-indoolacrylzuur (20 ^ug/ml) of tryptofaan (100 ^ug/ml), waar aangegeven.

Het gevoelige transformatieprotocol was dat van Glover (loc cit).

De cellen werden aangebracht op platen van hetzij voedingsagar nr. 2 gesuppleerd met ampicilline (100 ^ug/ml) of op M9, glucose, cas aminozuren, 30 minimaal agar gesuppleerd met ampicilline (100 ^ug/ml) of tetracycline (10 ^ug/ml).

Bereiding van plasmide DNA

Plasmide DNA werd bereid als beschreven voor pEH5 als boven of door fenol/chloroform extracties van helder gemaakte lysaten, gevolgd 35 ....

door isopropanol precipitatie van het DNA en uitexndelijke hersuspende- ring in TE buffer (10 mM tris HC1 pH 7,5, 1 mM EDTA).

800 3 1 71 -21-

Enzym reacties

Restrictie endonuclease afbreking: DM restrictie afbreking werden uitgevoerd in hetzij een hoog of laag zoutbuffersystean bij 37°C gedurende 2 uur, waarbij het reactie-5 volume varieerde van 10 tot 200 yul en de hoeveelheid toegevoegd enzym van 1 tot 20 eenheden per jag plasmide DM. Bam Hl, Eco EI, Hha I (EC 3.1.23.19) Hind III en Pst_ I (EC 3.1.23.31) afbraaiproeven werden uitgevoerd in 10 mM !Eris-HCl 7» 5, 10 mM IfeCl^, 50 mM HaHCl, 1 mM dithio-threitol, 100 ^ug/ml gelatine. Voor Hpa I afbraakproeven verschilde het 10 reactiemengsel slechts doordat 50 mM liaCl was vervangen door 5 mM Ha Cl. Hinf I werkte even goed in beide reactiemengsels.

Waar plasmide DM niet bereid door de caesiumchloride/ethidium-bromide methode werd afgebroken, bevatte het reactiemengsel tevens ribonuclease type I-A (verhit gedurende 10 min tot 95°0 ter verwijdering 15 van eventuele DMase activiteit) in een hoeveelheid van 50 ^ug/ml, ter verwijdering van RM dat bij zuivering met het DM tezamen neersloeg.

Alle reacties werden beëindigd door verhitting tot 65°C gedurende 5 min.

Ligaties: 20 Cohesieve eindligaties werden uitgevoerd bij volumes van 10 tot 20 ^ul in 50 mM Tris-HCl pH 7*8, 10 mM MgClg, 20 mM dithio-threitol, 1 mM AIP onder toepassing van 0,01-0,02 eenheden lig as e voor 0,5-3 ^ug DM. De reactiemengsels werden gedurende de nacht bij 15°C ge-incubeerd. Voor stompe eindligaties werd hetzelfde reactiemengsel toege-25 past maar het ligase werd vermeerderd tot 0,2 tot 0,6 eenheden voor 1-3 yUg DM en de incubatie temperatuur werd opgevoerd tot 25°C.

DM polymerase I vulling van 5' verlengstukken: 0,5-3,5 ^ug DM werden gevuld met polymerase in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgClg, 1 mM 8 mercapto-ethanol, 0,1 mM van elk cLATP, 30 dCTP, dGTP, dTTF in een volume van 50 ^ul onder toepassing van 0,25-1,5 eenheden polymerase. Het mengsel werd gedurende 10 min bij 10°C geïncubeerd, waarna een aliquot rechtstreeks kon worden toegepast voor een stcmpe uiteinde ligatie of het totaal met fenol/chloroform geëxtraheerd en daarna met ethanol neergeslagen.

35 Polynucleotide kinabehandeling van Hind III "linker" DM: 2,5 yUg van decamer Hind III "linker" werden behandeld gedurende 60 min bij 37°C met 10 eenheden kinase in 25 mM Tris-HCl pH 7,8, 800 3 1 71 -22- 5 mM MgCl^, 0,125 mM ATP, 25 ^ug/ml runderserum albumine. De 5'-termini werden tevens gemerkt door 100 ^uCi [7- 32p] ATP (3000 Ci/mmol) aan de reactie toe te voegen. De reactie werd beëindigd door toevoeging van SDS tot 0,1# W/V en EDTA aan 100 mM waarbij het totaal werd gechroma-5 tografeerd over een 30 x 0,7 cm kolcm van Sephadex G-50 (SF) in evenwicht gebracht met 50 mM RaCl/0,1# W/V SDS. De uitgesloten fracties werden samengevoegd, met ethanol neergeslagen en opnieuw gesuspendeerd in water tot 50 ^ug/ml.

Bacteriële alkalische fosfatase behandeling van Hind III doorge-10 sneden pBR322: 5-10 ^ug gelineariseerd pBR322 in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1# W/V SDS werden behandeld met 5 /Ug bacteriële alkalische fosfatase gedurende 60 min bij 37 °C.

Dit werd daarna fenol/chloroform geëxtraheerd en de DRA ethanol neergeslagen.

15 Exonuclease III en S1 nuclease afbraak van Eco RI gesplitst pWT101:

De toegepaste omstandigheden waren als beschreven voor het deleren van de Hind III plaats in pEH3, met uitzondering dat aliquots (3,33 ^ug) na 1, 3 en 5 min exonuclease II afbraak werden verwijderd.

20 Bereiding van gelmonsters uit gehele cel-lysaten

Voor "gehele cel-lysis" agarose cellen werd een representatief monster van plasmide bevattende cellen afgeschept van een kweekplaat met een steriele kunststof lus en opnieuw gesuspendeerd in 200 ^ul agarose elektroforese buffer. Hieraan werd 50 yul Ficoll buffer (5# W/V SDS,

25 10# W/V Ficoll (copolymeer van saccharose en epichloorhydrine), 0,06# W/V

broamfenol blauw) toegevoegd en het mengsel geïncubeerd bij 65°C gedurende 30 min voor het lyseren van de cellen en daarna gedurende 1 min gewerveld. Ongeveer Uo ^ul van een dergelijk monster bleek voldoende te zijn voor de plasmide identificatie. Met het DRA aanwezig RRA kon worden 30 verwijderd door hetzij ribonuclease aan 50 ^ug/ml van het monster toe te voegen, gevolgd door een 30 min incubatie bij 37°C, of door direkt door toevoeging aan de agarose gelmatrix tot 1 ^ug/ml. Beide methoden verwijderen de RRA-uitstrijk die zich anders op de gel zou bevinden.

Gel elektroforese 35 Agarose gelen (20 x 15 x 0,5 cm) met een samenstelling van 0,8-1,1+# werden onder gebruikelijke omstandigheden onderzocht. Gelen werden hetzij geëlektroforeseerd bij 10 volt gedurende de nacht of gedurende 800 3 1 71 -23- 3 uur bij 120 volt en daarna gekleurd en gefotografeerd.

Acrylamide gelen (20 x 15 x 0,15 cm) met een samenstelling van 1|-1Q$ werden toegepast voor het identificeren van kleine restrictie fragmenten. Het kleuren en fotograferen werden op dezelfde wijze als 5 voor de agarose gelen uitgevoerd.

Isolering van de tryptofaan •premotor-operator Hinf I fragment en bevestiging van de Hind III linker 6 ^ug/pEH5 werden Hinf I gesplitst en aan elektroforese onderworpen over een 5$ W/Y acrylamidegel, waarna de U97 bp Hinf I tryptofaan 10 promotor-operator en de tezamen migrerende pBR322 band uit de gel werden gesneden en het DNA op bekende wijze werd geëxtraheerd.

De Hinf I uiteinden werden daarna met DNA polymerase I gevuld en de Hind 'III linker daaraan bevestigd-door een stompe einde ligatie in een verhouding van 50 linker fragmenten per Hinf I fragment (dit ver-15 mindert de mogelijkheid dat de Hinf I fragmenten zich zelf ligeren). De kleverige uiteinden werden geproduceerd door het mengsel met Hind III door te snijden, de DNA ethanol werd neergeslagen, opnieuw gesuspendeerd in 50 jVl 50 mM NaCl, 0,1$ W/V SDS, waarbij het totaal werd ge-chromatografeerd over een 50 x 0,7 cm kolom van G150 Sephadex (van te 20 voren in evenwicht gebracht met 50 mM NaCl, 0,1$ W/Y SDS). De uitgesloten piek werd samengevoegd en het DNA ethanol neergeslagen.

Opbouw van'pWTIOI

De volledige E. coli tryptofaan promotor operator leader sequentie en eerste zeven aminozuren van trpE zijn aanwezig in een 25 Hinf I fragment van bij benadering 1+97 bp aanwezig in pEH5.

Het ^97 bp Hinf I fragment werd gedoneerd in de Hind III plaats van pBR322 met behulp van een decameer Hind III linker DNA. Om dit te ondernemen moesten de Hinf I uiteinden eerst worden ingevuld met DNA polymerase I om bevestiging van het linker DNA mogelijk te maken.

30 Het fragment werd daarna geligeerd met bacteriële alkalische fosfatase behandeld, met Hind III doorgesneden, piBR322 en het mengsel toegepast voor het transformeren van E. coli HB101 onder toepassing van een voe-dingsagar ampicilline selectie. In totaal- 582 koloniën werden uit de transformatie verkregen.

35 Het doneren in de Hind III plaats van pBR322 activeert de tetra cycline promotor, waardoor eventuele transformant tetracycline gevoelig wordt gemaakt tenzij het gedoneerde stuk zijn eigen promotor heeft die 800 3 1 71 -2k- getranscribeerd wordt in de tetracycline genen. Aangezien het Hinf I fragment het tryptofaan promotor-operatar gebied bevat, zonder de transformanten die een plasmide bevatten met het fragment in de juiste oriëntatie gedoneerd, d.w.z. waarin wordt getranscribeerd naar de 5 tetracycline-promotor toe, tetracycline-resist ent moeten zijn. Om dit te beproeven werden U8 willekeurige gekozen koloniën uit de ampicilline-tr ans formatie platen uitgezet op M9 cas aminozuren minerale agarplaten gesuppleerd met tetracycline (10 ^ug/ml). Hiervan bleken er 11 tetra-cyclineresistent te zijn hetgeen het verwachte cijfer is aangezien er 10 met twee aanwezige fragmenten een een-op-vier mogelijkheid is de juiste oriëntatie te verkrijgen.

He aanwezigheid van ingebracht DNA werd tevens bevestigd door koloniën van beide stellen platen op te pikken en deze te beproeven tegen een pBR322 blanco door gehele cel agarose gelen te onderzoeken.

15 Volgens deze methoden werden ampicilline-resistente en ampicilline, tetracycline-resistente koloniën, die plasmiden met ingebracht DM bevatten, geïsoleerd. Plasmide DM's werden uit een aantal van deze koloniën bereid voor restrictie endonuclease analyse.

Fig. 11 van de bijgaande tekeningen illustreert de bereiding en 20 kenmerking van pWT101 en kan als volgt worden geïnterpreteerd: (a) pEH5 afgebroken met Hinf I en Hpa I; (b) pEH5 afgebroken met alleen Hinf I; (c) pWT101 afgebroken met Hind III; (d) pWT101 afgebroken met Hind III en Hpa I.

25 Opbouw van pWTI11

De verwijdering van de Hind III plaats·· distaai ten opzichte van de tryptofaan promotor

De distale Hind III plaats werd gedeleerd door Eco RI splitsing, gevolgd door verwijdering van DNA door exonuclease III en SI nuclease 30 afbraak. Een DM polymerase I trap werd tevens opgenomen voor het ligeren teneinde eventuele asymmetrische uiteinden die achtergebleven waren na de S1 nuclease afbraak aan te vullen. De afbraaktijden waren 1, 3 en 5 min. De drie DM mengsels na de Eco EI restrictie, exonuclease III afbraak (1, 3 en 5 min), DM polymerase I invulling en stompe einde ligatie 35 werden toegepast voor het transformeren van. ΞΒ101 cellen. Een dubbele antibiotische selectie werd uitgevoerd door bekleding op M9, casamino-zuren, minimale agar gesuppleerd met ampicilline en tetracycline; de dub- 800 3 1 71 -25- bele selectie verzekert hierbij dat het 0-lactamase en de tetracycline-genen in takt blijven.

Voor een verdere kënmerking van de mogelijke deletanten» werden twee transformanten elk uit de 1 en 15 min fracties en vier uit de 5 3 min fractie geselecteerd.

Kenmerking van de deletant nlasmiden

Geen van de., acht plasmiden produceert een 512 bp fragment wanneer doorgesneden met Eind III en allen migreerden naar een positie boven het h,36 kb fragment van Hind III doorgesneden pWT101. Alle plasmiden 10 worden dubbel afgebroken met Epa en Pst I, waardoor twee fragmenten werden geproduceerd, waarvan de kleinste het betreffende gebied overspant (het gebied van ongeveer de Eco RI plaats in pWT101). De afmetingen van de fragmenten gevormd in pWT101 zijn 3T77 en 1096 bp. Onderzoek heeft duidelijk het feit aangetoond dat het laatste fragment in elk 15 van de gevallen is gedeleerd terwijl de eerste, zoals verwacht, ongewijzigd is gebleven. De hoeveelheden gedeleerd DM variëren van 51 bp in pWT111 (1 min exonuclease III afbraak) tot 361 bp in pWT1l8 (5 min exonuclease III afbraak).

Aangezien van pWT111 de kleinste hoeveelheid DBA is gedeleerd 20 en de tetracycline doelmatigheid van de plaatresultaten aangeeft dat het even efficiënt is als pWT101 bij de transcriptie vanaf de tryptofaan promotor, werd dit als de Eind III cloneringsdrager gekozen ten gebruike voor translatiefase verandering.

Constructie van pWT121 25 Ter verandering van de fasering vanaf de Bind III plaats van pWT111, werd het 5’ verlengstuk gevuld met DEA polymerase I en geligeerd aan Eind III "linker” DEA, doorgesneden met Eind III ter verwijdering van overmaat linker en ter vorming van kleverige uiteinden en daarna opnieuw geligeerd. Dit voegde 11* bp van DEA toe en veranderde het lees-30 frame van de nieuwe Hind III plaats (de oude plaats is nu onvolledig) met plus ëën nucleotide.

Opbouw van pWT131

Het derde leesframe, d.w. z. pWT111 plus 2 nucleotiden, werd verkregen door dezelfde reeks reacties aan deze fase veranderde plasmide 35 te herhalen. Deze plasmiden, zoals pWT111, zullen kleine polypeptiden produceren die beginnen bij de start van trpE en eindigen bij de stop codons (verschillende in elk van de gevallen) die voorafgaan aan de 800 3 1 71 -26- tetracycline-genen. Vanwege de veranderingen in het leesframe hebben echter alle polypeptiden verschillende C-eindstandige aminozuur-volgorden hoewel de H-eindstandige produkten dezelfde zijn.

Fig. 12 van de bijgaande tekeningen illustreert de veranderingen 5 die plaatsvinden gedurende de faseverandering van pWT111 naar pWT131.

De figuur kan als volgt worden geïnterpreteerd: (a) pWT111 afgebroken met Hha I; (b) pWT121 afgebroken met Hha I; (c) pWT13t afgebroken met Hha I.

Bereiding van uWT121/FPV en analyse van gen-expressie van • FPV-Ha antigeen 10 yiig pWT121 werden onder doorsnijden afgebroken met Hind III.

De verkregen 5r eindstandige fosfaten van de vectoren werden verwijderd door behandeling met 20 ,ug bacteriële alkalische fosfatase gedurende 4 C Λ / 5 30 min. bij 37°C in een 25 ^ul incubatie mengsel dat 10 mM Iris HC1 pH 7,5 en 0,1$ W/V SDS bevatte. Ha fenol extractie en ethanol neerslag werden 0,2 ^ug DHA geligeerd aan ^ Uo ng FPV-Ha gen in een 20 ^ul in-cubatiemengsel dat 50 mM Tris HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl^, 20 mM dithio-threitol (DTT), 1 mM AIP en 0,02 eenheden T^ ligase (Hew England Biolabs) 20 bevatte. Ha overnachtse incubatie bij 15°C werden de mengsels verdund tot 100 met TCM (10 mM Iris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl^, 10 mM MgC^) en toegepast, voor het transformeren van 200 ^ul Cad^-behandelde E. coli K12 ΞΒ101 volgens een bekende procedure. De transformanten die na een kweek gedurende 16 uur bij 37°C op L-agar plus 100 ^ug/ml carbenicilline 25 (pyopeen, α-carboxybenzylpenicilline) aanwezig waren werden onderzocht op tetracycline-resistentie door aanbrengen op agarplaten die M9 zouten, glucose en casaminozuren, carbenicilline en tetracycline (10 ^ug/ml) bevatten.

Analyse van gen-expressie 30 Vloeibare cultures (5 ml) van de individuele koloniën werden ge kweekt in M9 medium gesuppleerd met β-indool acrylzuur (20 ^ug/ml) of tryptofaan (100 ^ug/ml), waar aangegeven. Cellen werden door centrifugeren geoogst, gesuspendeerd in 0,3 ml koud 25$ W/V saccharose/50 mM Iris pH 8 en gelncubeerd met 0,1 ml lysozym (10 mg/ml). Ha 5 min intervallen werden 35 0,1 ml 0,5M EDTA en dan een 0,5 ml ijsgekoelde Triton-oplossing toege voegd (Triton-oplossing is 60 mM EDIA, 50 mM Tris pH 8 en 0,1$ V/V Triton X-100). Dit lysaat wordt toegepast voor een antigeen analyse zonder 800 3 1 71 -27- verdere behandeling♦ HA-antigeen analyses werden uitgevoerd in polystyreen kweekbuizen (Hunc Ho. 1^10) onder toepassing van een antilichaam sandwich-techniek. Konijnen anti-EPV HA werd gezuiverd door ammoniumsulfaatprecipitatie 5 en DEAE-cellulose chromatografie voorafgaande aan het gebruik en ge- 125 ...

merkt met I . Buizen werden gedurende 10 min bij kamertemperatuur bekleed met 50 microliter 0,2 M HaiïCO^ pH 9 die 60 microgram/ml gezuiverd niet-gemerkt IgG bevatten, gewassen met 3 x 1 ml aliquots wasbuffer en daarna geïncubeerd bij kamertemperatuur met hetzij bekende hoeveelheden 10 (0,5-5 ng) gebroken EPV of met de bacteriële lysaten. Ha 2 uur werden de buizen gewassen met k x 1 ml aliquots wasbuffer en tenslotte bij 1+°C gedurende 16 uur met 50 ,ul wasbuffer geïncubeerd die 200.000 cpm 125 ï-anti HA bevatte. De buizen werden opnieuw gewassen en geteld m een Packard 1$ -teller. Aanwezig antigeen werd kwantitatief bepaald uit 15 standaard .krommen in verhouding tot de radio-activiteit gebonden aan de hoeveelheid aanwezig EPV.

Bereiding van nic~ derivaten

De restrictie van de drie fase-veranderde pWT plasmiden en pAD?153 met zowel Bam EI als Pst I genereert twee fragmenten uit elk plasmide.

PO

Dit wordt geïllustreerd in fig. 1 h- van de bijgaande tekeningen.

pAT153 produceert fragmenten van 1129 bp en 2529 bp, waarbij het grotere fragment de oorsprong bevat, maar met weglating van de nic plaats.

De pWT plasmiden produceren allen hetzelfde 3233 bp fragment dat 25 de oorspronkelijk nic plaats bevat, maar verschillende kleinere fragmenten die de trp blanco elementen bevat, waarbij de verschillen ontstaan uit de fase veranderingswijzigingen bij de Hind III plaats.

De plasmiden werden doorgesneden met Pst I en Bam Hl, aan elek-troforese onderworpen over een 3s5/«'s acrylamidegel en de pAT153 2529 bp, 30 pWT111 1590 bp, pWT121 160U bp en pWT131 1618 bp banden uitgesneden en teruggewonnen uit het acrylamide. De pAT153 band werd daarna onafhankelijk geligeerd aan de drie pWT banden en de ligatie mengsels toegepast voor het transformeren van E. coli HB1Q1 cellen geselecteerd op voedings-agar dat carbenicilline in een hoeveelheid van 100 ^ug/ml bevatte.

35 Aangezien het pAT153 fragment niet in staat is op zich zelf resistentie ten opzichte van ampieilline en tetracycline te verlenen en de pWT fragmenten een oorsprong missen, verzekert de selectie op carbenicilline dat 800 3 1 71 -28- de verkregen recombinantmoleculen deze twee fragmenten moeten bevatten. Plasmide DM's werden bereid uit een aantal van de koloniën die groeiden op de transformatieplaten en deze werden toegepast voor het bevestigen van de aanwezigheid van de gewenste plasmiden door restrictie-analyse.

5 De volgende enzym afbraken werden uitgevoerd:

Pst I en Bam Hl afbraak voor het vormen van de geligeerde fragmenten:

Onder verwijzing naar fig. 15 van de tekeningen, zijn sporen b, c en d afbraakprodukten van nic" derivaten van pWT131, 121 en 111.

^ Spoor a is een afbraakprodukt van pWT131 en spoorde een afbraakprodukt van pA3?153. Het is duidelijk uit de gel dat alle drie nic~ trp plasmiden het pAT153 2529 bp fragment hebben verworven, maar nog steeds de oorspronkelijke trp blanco fragmenten bevatten.

Hind III afbraak ter demonstratie dat de trp p/o bestuurde 15 expressie plaatsen nog steeds functioneel is: in fig. 16 van de tekeningen zijn de sporen a, b, c en d resp. de afbraakprodukten van pWT231, 221, 211 en 131. Alle drie nic~ derivaten zijn doorgesneden met Hind III en kleiner dan pWT131 veroorzaakt door de afwezigheid van de twee Hae II fragmenten.

20 Hae II afbraak ter demonstratie dat Hae II B en H fragmenten uit het pBR322 gebied van de plasmiden afwezig zijn: Onder verwijzing naar fig. 7 van de tekeningen zijn de sporen a-f afbraakprodukten van pBR322, pAI153, pWT231, 221, 211 en 131. Alle vier nic~ plasmiden (sporen b-e) missen twee Hae II fragmenten, het 622 bp Hae II B en het 25 82 bp Hae II H fragment van pBR322.

800 3 1 71

Claims (33)

1. Plasmide met een insertieplaats voor een eukaryotisch DMA fragment grenzend aan een bacteriële promotor en stroomafwaarts van een prokaryotis che ribosoombindingsplaats en inleidercodon zodanig dat de bacteriële promotor de transcriptie en de translatie ran een ingébracht

5 DNA-fragment bestuurt.

2. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire lengte van 9866 bp; een bam I plaats 3k6 bp van de Hind III; een Sal I plaats 275 bp van de Bam I; een Eco RI plaats 3709 bp van de Sal I; een tweede Hind III plaats 31 bp van de Eco BI; een Hpa'I plaats 305 bp 10 van de tweede Hind III; een tweede Hpa I plaats 3250 bp van de eerste Hpa I en 1950 bp van de eerste Hind III, waarbij bet plasmide de trp-promotor, bet E-gen en een deel van bet D-gen in bet stuk van 1950 bp tussen de tweede Hpa I en de eerste Hind III plaatsen beeft; bet gen voor tetracyclineresistentie onmiddellijk volgt op de eerste Hind III 15 plaats en bet gen voor de ampicilline-resistentie in het stuk van 3709 bp tussen de Sal I en de Eco HI plaatsen is, welk plasmide wordt aangeduid als ρΞΗ3.

3. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire lengte van 9866 bp; een Bam I plaats van 3½ bp van de Hind III; een

20 Sal I plaats 275 bp van de Bam I; een Eco RI plaats 3709 bp van de Sal I; een tweede Hind III plaats 31 bp van de Eco RI; een Hpa I plaats 1950 bp van de tweede Hind III plaats; een tweede Hpa I plaats 3250 bp van de eerste Hpa I en 305 bp van de eerste Hind III, welk plasmide de trp promotor, bet E-gen en een deel van het D-gen. in bet deel van 25 1905 bp tussen de tweede Hind III en de eerste Hpa I plaatsen beeft; bet gen voor tetracycline-resitentie onmiddellijk volgt op de eerste Hind III plaats en bet gen voor de ampicilline-resistentie in bet stuk van 3709 bp tussen de Sal I en de Eco RI plaatsen is, welk plasmide wordt aangeduid als pEHU. 30 k. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire lengte van 6750 bp; een Hind III plaats; een Bam Hl plaats 3^6 bp van de Hind III plaats; een Sal I plaats 275 bp van de Bam Hl plaats; een Hpa I plaats U230 bp van de Sal I plaats en 1950 bp van de Hind III plaats; welk plasmide de trp promotor, het E-gen en een deel van bet

35 D-gen in bet stuk van 1950 bp dat zich uitstrekt tussen de Hpa I plaats 800 3 1 71 -30- en de Hind III plaats heeft en het gen voor de ampicilline-resistentie in. het stuk van ^800 hp tussen de Hind III plaats en de Hpa I plaats is, welk plasmide wordt aangeduid als pEH5.

5. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire 5 lengte van W7^ hp; een Eco RI plaats; een Hind III plaats 31 hp van de Eco RI; een Hpa I plaats 313 hp van de Hind III; een tweede Hind III plaats 199 hp van de Hpa I; een Bam I plaats 3^6 hp van de tweede Hind III; een Sal I plaats 275 hp van de Bam I; een Pst I plaats 2958 hp van de Sal I en 752 hp van de Eco RI; waarbij het gen voor 10 tetracycline-resistentie zich uitstrekt vanaf het gehied van de Hpa I plaats tot voorbij de Sal I plaats; en het gen voor de ampicilline-resistentie in het gehied van Pst I plaats en het gedoneerde deel van de trp operon het gehied tussen de promotor en het eerste stuk van de E-gen tussen de Hpa I en de tweede Hind III plaats omvat, welk plasmide 15 wordt aangeduid als pWT101.

6. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire lengte van U823 hp; een Hpa I plaats; een Hind III plaats 199 hp van de Hpa I; een Bam I plaats 3hè hp van de Hind III; een Sal I plaats 275 hp van de Bam I; een Pst I plaats 2958 hp van de Sal I en 10^5 hp 20 van de Hpa I; waarbij het gen voor de tetracycline-resistentie zich uitstrekt van het gehied van de Hpa I plaats tot voorbij de Sal I plaats; het gen voor de ampicilline-resistentie in het gehied van de Pst I plaats en het gedoneerde stuk van de trp operon het gehied omvat tussen de promotor en het eerste stuk van het E-gen tussen de Hpa I en 25 de Hind III plaatsen, welk plasmide wordt aangeduid als pWT111.

7. Plasmide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een moleculaire lengte van U837 hp; een Hpa I plaats; een Hind III plaats 206 hp van de Hpa I; een Bam I plaats 353 hp van de Hind III; een Sal I plaats 275 hp van de Bam I; een Pst I plaats 2958 hp van de Sal I en 10^5 hp van de

30 Hpa I; waarbij het gen voor de tetracycline-resistentie zich uitstrekt vanaf het gehied van de Hpa I plaats tot voorbij de Sal I plaats; het gen voor de ampicilline-resistentie in het gehied van de Pst I plaats en het gedoneerde stuk van de trp operon het gebied tussen de promotor en het eerste stuk van het E-gen tussen de Hpa I en de Hind III plaatsen 35 omvat; welk plasmide wordt aangeduid als pWT121 en de fasering met 1 hp van pWT111 is gewijzigd.

8. Plasmide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat deze een mole- 800 3 1 71 -31- culaire lengte heeft van WS51 "bp; een Ena I plaats; een Hind III plaats 213 hp van de Epa I; een ham I plaats 360 van de Hind III; een Sal I plaats 275 hp van de Bam I; een Pst I plaats 2958 hp van de Sal I en 10^5 hp van de Hpa I; waarbij het gen voor de tetraeycline-resistentie 5 zich uitstrekt vanaf het gebied van de Hpa I plaats tot buiten de Sal I plaats; het gen voor de ampicilline-resistentie in het gebied van de Pst I plaats en. het gedoneerde deel van de trp-operon het gebied tussen de promotor en het eerste stuk van het E-gen tussen Hpa I en de Hind III plaatsen omvat, welk plasmide wordt aangeduid als pWT131 en de fasering 10 met 2 bp van pWT111 is veranderd.

9. Plasmide volgens conclusies 1-8, in wezen als hierin beschreven.

10. Een nic~ derivaat van het plasmide volgens conclusies 1-9.

11. Een. nic” derivaat volgens conclusie 10 in wezen als hierin beschreven.

12. Werkvijze voor het produceren van een plasmide volgens conclu sies 1-9, met het kenmerk, dat een bacteriële promotor in een geïsoleerde plasmide wordt gedoneerd, de positie van een beoogde insertieplaats wordt bepaald en de insertieplaats wordt voorzien indien deze nog niet aanwezig is.

13. Werkwijze volgens conclusie 12 voor het produceren van pEH3 volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een wild-type stam. van E.coli wordt afgebroken met restrictie endonuclease Hind III, het aldus verkregen fragment wordt geligeerd aan het lineaire molecuul verkregen door doorsnijden van het plastmide pBR322 met restrictie endonuclease Hind III, 25 trp o E 7 1 E. coli wordt getransformeerd met het verkregen plasmide en die E. coli koloniën worden geselecteerd die tetraeycline-resistentie en tryptofaan complement er ing vertonen ter verkrijging van het plasmide pEH3. 1 il·. Werkwijze volgens conclusie 12 voor de produktie van pEHil· volgens 30 conclusie 3» met het kenmerk, dat een wildtype stam van E. coli wordt afgebroken met restrictie-endonuclease Hind III, het aldus verkregen fragment wordt geligeerd aan het lineaire molecuul verkregen door restrictie van het plasmide pBR322 met restrictie endonuclease Hind III, trpoE 7 1 E. coli met het verkregen plasmide wordt getransformeerd en 35 die E. coli koloniën worden geselecteerd die tetracycline-gevoeligheid en tryptofaan-complementering vertonen ter verkrijging van het plasmide pEHU,

15. Werkwijze volgens conclusie 12 voor het produceren van pEH5 8003 1 71 -32- volgens conclusie U, met het kenmerk, dat pEH3 wordt gesplitst met restrictie endonuclease Eco RI, het lineaire molecuul met exonuclease III en S1 nuclease wordt afgebroken, behandeld met DNA polymerase I, het lineaire molecuul met DM ligase wordt geligeerd, trpoE <? 1 E. coli 5 wordt getransformeerd met het verkregen plasmide en die koloniën worden geselecteerd die tryptofaan complementering en ampicilline-resistentie vertonen ter verkrijging van het plasmide pEH5 wordt verkregen.

16. Werkwijze volgens conclusie 12 voor het produceren van pWT101 volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat pEH5 wordt gesplitst met ^ restrictie endonuclease Hinf I ter verkrijging van een fragment dat de complete tryptofaan promotor bevat en het fragment wordt gedoneerd in de Hind III plaats van het plasmide pBR322 waarbij de Hinf I uiteinden van het fragment met DM polymerase I worden behandeld, het fragment wordt behandeld met Hind III "linkers" in aanwezigheid van DM ligase, 15 ... het gelogeerde molecuul wordt behandeld met Hind III restrictie endonuclease ter vorming van een lineair molecuul met Hind III kleverige uiteinden, dit lineaire molecuul wordt geligeerd in de Hind III plaats van het plasmide pBE322, E. coli K12 HB101 wordt getransformeerd met de verkregen plasmiden en die E. coli koloniën worden geselecteerd die 20 ampicilline-resistentie vertonen ter verkrijging van het plasmide pWT101. 17· Werkwijze volgens conclusie 12 voor het produceren van pWT111 volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat pWT101 wordt gesplitst door restrictie endonuclease Eco RI, het lineaire molecuul wordt afgebroken met exonuclease III en S1 nuclease, behandeld met DNA polymerase I, het 25 lineaire opnieuw wordt geligeerd, E. coli K12 HB101 wordt getransformeerd met de verkregen plasmiden en die E. coli koloniën worden geselecteerd die ampicilline resistentie vertonen ter verkrijging van het plasmide pWT111.

18. Werkwijze volgens conclusie 12, voor het produceren van pWT121 30 volgens conclusie 7, met bet kenmerk, dat pWT111 wordt gesplitst met restrictie endonuclease Hind III, het lineaire molecuul wordt behandeld met DNA polymerase I, geligeerd met Hind III "linker" DNA, gesplitst met restrictie endonuclease Hind III, het lineaire molecuul opnieuw wordt geligeerd, E. coli K12 HB101 met de verkregen plasmiden wordt ge-35 transformeerd en die 13. coli koloniën worden geselecteerd die ampicilline resistentie vertonen ter verkrijging van het plasmide pWT121.

19. Werkwijze volgens conclusie 12 voor het produceren van pWT131 800 3 1 71 -33- volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat pWT121 wordt gesplitst met restrictie-endonuclease Eind III, het lineaire molecuul -wordt behandeld met DM polymerase I, geligeerd met Hind III "linker" DM, gesplitst met restrictie endonuclease Hind III, het lineaire molecuul·opnieuw wordt 5 geligeerd, E. coli K12 ΗΒ1Ό1 wordt getransformeerd met de verkregen plasmiden en die E. coli koloniën worden geselecteerd die ampicilline-resistentie vertonen ter verkrijging van het plasmide pWT131.

20. Werkwijze volgens conclusies 12-19s in wezen zoals hierin beschreven.

21. Werkwijze voor het produceren van een nic~ derivaat volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat hetzij de nic plaats uit een plasmide wordt verwijderd of een plasmide zodanig wordt gemaakt dat de nic plaats niet aanwezig is.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, in wezen als hierin beschreven.

23. Plasmide volgens conclusies 1-11, verkregen volgens een werkwijze van een der conclusies 12-22. 2b. Plasmide volgens conclusies 1-10 of 23, waarin aan de insertie-plaats een eukaryotisch DM fragment is ingebracht.

25· Plasmide pWT121/FPV volgens conclusie 2b, gekenmerkt door een 20 moleculaire lengte van 6532 bp; een Hind III plaats; een Sma I plaats 365 "bp van de Hind III; een Eco BI plaats 910 bp van de Sma I; een tweede Hind III plaats b60 bp van de Eco EI; een Bam Hl plaats 353 bp van de tweede Hind III; een Sal I plaats' 275 "bp van de Bam Hl; een Pst I plaats 2958 bp van de Sal I; een Epa I plaats 10^5 bp van de 25 Pst I en 206 bp van de eerste Hind III; het EPY-hemagglutine gen in het stuk 1735 bp tussen de eerste en de tweede Hind III plaatsen is; waarbij het gen voor de tetracycline-resistentie zich uitstrekt vanaf de tweede Hind III plaats tot voorbij de Bam Hl plaats en het gen voor de ampicilline-resistentie in het gebied van de Pst I plaats is.

25. Plasmide volgens conclusie 2b of 25 in wezen zoals hierin be schreven.

27. Werkwijze voor het produceren van een plasmide volgens conclusie 2b, met het kenmerk, dat een eukaryotisch DM fragment op de in-sertieplaats van een plasmide volgens conclusies 1-11 of 23 wordt inge- 35 bracht.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, voor het produceren van het plasmide pWT121/FPV volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het plasmide 800 3 1 71 -3U- pWT121 wordt gesplitst met restrictie-endonuclease Hind III en het lineaire molecuul naar keuze wordt behandeld met alkalische fosfatase, Hind III "linkers” worden geligeerd aan de uiteinden van het FPV-gen dat dan wordt behandeld met restrictie-endonuclease Hind III, waarbij 5 het behandelde FPV-gen wordt geligeerd aan het lineaire molecuul afgeleid van pWT121 door Hind III restrictie.

29· Werkwijze volgens conclusie 27 5 in wezen als hierin beschreven.

30. Plasmide volgens conclusies 2^-26 bereid volgens de werkwijze van conclusies 27-29.

31. Transformeerbare cel waarin is ingebracht een plasmide als be schreven in conclusies 2k-2é of 30.

32. Werkwijze voor het transformeren van een transformeerbare cel met het kenmerk, dat daarin een plasmide volgens conclusies 2k-2é of 30 wordt ingebracht. 15 33- Toepassing van een plasmide volgens conclusies 1-11, 23-26 of 30. 3^. Toepassing van een cel volgens conclusie 31.

35. Werkwijze voor de expressie van een proteïne, met het kenmerk, dat een cel volgens conclusie 31 wordt gekweekt. 800 3 1 71