DE3020528A1 - Plasmide, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Description

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Plasmide, ihre Herstellung und Verwendung

Die Erfindung betrifft Plasmidvektoren, ihre Herstellung und Verwendung, insbesondere Plasmidvektoren, die so angepaßt sind, daß sie eingefügte DNS-Fragmente aufnehmen und übertragen (transcribe).

Der genetische Gehalt der meisten Organismen liegt in Form von RNS vor. Diese genetische Information wird durch eine komplexe Reihe von Reaktionen ausgedrückt, die die Transcription der DNS in RNS und die anschliessende Umwandlung (Translation) der RNS in Protein einschließen.

In Bakterienzellen sind Transcription und Translation eng verknüpft. Die Menge eines gegebenen Proteins wird durch den Umfang der stattfindenden Transcription geregelt. Das Tryptophan-Operon und seine Regelung und Kontrolle ist ein gutes Beispiel hierfür. Bakterien synthetisieren Tryptophan durch eine Reihe von biochemischen Reaktionen, an denen fünf Enzyme beteiligt sind. Die genetische Information zur Bildung dieser Enzyme ist so organisiert, daß die einzelnen Gene im Genom aufeinanderfolgen und alle von einer einzigen Stelle, dem Operator, gesteuert werden. Die Regulierung der Transcription verläuft nach einem Rückkbpplungsprinzip (feed-back principle), d.h. in Gegenwart von Tryptophan ist das Operon blockiert oder unterdrückt, während es in Abwesenheit von Tryptophan wieder freigelassen wird. Im freigelassenen Zustand wird Transcription am Promoter (einem Bereich von DNS nahe dem Operator mit hoher Affinität zu RNS-Polymerase) ausgelöst; sie verläuft über den Operator in die Strukturgene des Operons.

Eukariotische DNS-Fragmente können bekanntlich in

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bakterielle Plasmide eingefügt werden (siehe beispielsweise Roychoudhury, R., et al, Nucleic Acids Research 3 (1976) 863-877) und R.H. Scheller et al, Science 196 (1977) 177-180). Es ist jedoch offensichtlich, daß eingeführte eukariotische Promotersequenzen von Bakterienzellen, beispielsweise von E. coli-RNS-Polymerase, in vivo schlecht erkannt werden. Zwar wurde berichtet, daß es möglich war, Bakterienmutationen durch DNS-Fragmente aus Hefe zu ergänzen, jedoch war das Ausmaß, in dem das geklonte Gen ausgedrückt (expressed) wurde, gering, so daß langsam wachsende Bakterien gebildet wurden (siehe beispielsweise J. Carbon et al, Recombinant Molecules: Impact on Science and Society (1977) 355-378, Raven Press, New York).

Ebenso fand die Transcription von geklönter Mäuse-Mitochondrien-DNS in E. coli vom falschen Strang aus statt (siehe beispielsweise W.M. Brown et al "Cell" 7 (1976) 517-530).

Die Struktur der Plasmidvektoren gemäß der Erfindung basiert auf der Schaffung einer Einfügungsstelle, insbesondere einer Stelle Hind III, für ein gewähltes eukaryotisches DNS-Fragment. Diese Einfügungsstelle ist einem bakteriellen Promoter, z.B. einem trp-Promoter, benachbart, so daß die Transcription und Translation des DNS-Fragments durch den Promoter reguliert werden. Die Plasmide gemäß der Erfindung werden im allgemeinen ebenfalls in dem der Einfügungsstelle unmittelbar folgenden Bereich mit dem Gen für Tetracyclin-Resistenz vorgesehen, so daß nach der Einfügung der gewählten DNS an der Einfügungsstelle die durch den Promoter gesteuerte Transcription und Translation der eingefügten DNS, in einfacher Weise bestätigt werden kann, da, wenn sie stattgefunden hat, die Tetracyclin-Resistenz erhalten bleibt und - in den meisten Fällen -, wenn sie nicht stattgefunden hat, die Tetra-

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cyclin-Resistenz zerstört ist.

In einer Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Plasmid gerichtet, das eine Einfügungsstelle für ein eukaryotisches DNS-Fragment in Nachbarstellung zu einem bakteriellen Promoter und stromabwärts von einer Bindungsstelle eines prokaryotischen Ribosoms und Initiator-Kodons aufweist, so daß der bakterielle Promoter die Transcription und Übertragung (Translation) eines eingefügten DNS-Fragments steuert und reguliert.

Ein solches Plasmid kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das darin besteht, daß man einen bakteriellen Promoter in ein isoliertes Plasmid klont, die Lage einer vorgesehenen Einfügungsstelle bestimmt und die Einfügungsstelle bildet, wenn sie nicht bereits

vorhanden ist. .

Ein solcher Plasmidvektor kann unter Verwendung eines Plasmids hergestellt werden, indem man zelluläre DNS mit einem speziellen Restriktionsenzym digeriert, ein den Promoter enthaltendes Fragment isoliert und das Fragment in ein geeignetes bakterielles Plasmid klont.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein solches Plasmid, in das an der Einfügungsstelle ein eukaryotisches DNS-Fragment eingefügt worden ist.

Das eukaryotische DNS-Fragment kann nach bekannten Verfahren in das hergestellte Plasmid eingefügt werden.

Als Beispiel der Plasmide gemäß der Erfindung sei das Plasmid genannt, dessen Eigenschaften schematisch in Fig. 1 dargestellt sind, nämlich eine Moleküllänge von 6750 bp, eine Hind HI-Stelle, eine Barn HI-Stelle bei 346 bp von der Hind Ill-Stelle, eine SaI I-Stelle bei 275 bp von der Barn HI-Stelle, eine Hpa I-Stelle bei 4230 bp von der SaI I-Stelle und 1950 bp von der Hind

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Ill-Stelle, und das Plasmid hat den trp-Promoter, das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp, der sich zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III-Stelle erstreckt, und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 4800 bp zwischen der Hind HI-Stelle und der Hpa I-Stelle.

Wiederum als Beispiel sei nachstehend ein Verfahren zur Herstellung dieses hier als pEH5 bezeichneten Plasmids beschrieben.

a) Isolierung des Hind III TrpE-Fraqments

Dieses Fragment kann entweder durch Hind III (EC3.1.23.21)-Digestion von DNS aus den meisten Stämmen von E. coli, z.B. E. coli Stamm W3110, oder durch Hind III-Digestion des Plasmids pRHl/trpE erhalten werden. pRHl selbst wurde durch Eco RI (EC3.1.4.32)-Digestion von E. coli-Plasrniden pDS1118 und pML2, Verbinden (ligation) der hierbei erhaltenen Fragmente und Auswahl hinsichtlich Resistenz gegen Ampicillin und Kanamycin erhalten. Hind III-Digestion von pRHI und Verbinden mit Hind Ill-digerierter DNS vom Stamm E.coli W3110 und anschließende Umwandlung in den Stamm W3110 trp oE\7l und Kultivierung in Abwesenheit von Tryptophan ergab pRHl/trpE.

b) Klonen des Hind III trpE-Fraqments

Das in der vorstehend beschriebenen .Weise erhaltene Fragment Hind III trpE wurde an ein Fragment, das durch Hind III-Restriktion des Plasmids pBR322 erhalten worden war (siehe beispielsweise F. Bolivar et al "Gene" 2 (1977) 95-113), kovalent gebunden. Die gebundene DNS wurde zur Umwandlung von E. coli W3110 trp oE^l verwendet, und Kolonien wurden für Resistenz gegen Ampicillin und Tryptophan-Ergänzung (complementation) ausgewählt. Es zeigte sich, daß die erhaltenen Plasmide in Abhängigkeit von der Orientierung der Fragmente

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während des Verbindens zu zwei Typen gehörten. Diese beiden Plasmide, die hier als pEH3 und pEH4 bezeichnet werden, sind in Fig. 2 bzw. Fig. 3 dargestellt. Das Plasmid pEH3 wurde auf der Grundlage seiner Resistenz gegen Tetracyclin ausgewählt und für die nächste Stufe der Herstellung der Plasmide gemäß der Erfindung verwendet. Das Plasmid pEH3 hat die folgenden Kennzahlen:

Moleküllänge 9 866 bp: eine Hind-III-Stelle; eine Barn I-Stel-Ie 346 bp von Hind III; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Barn I-Stelle und eine Eco RI-Stelle 3709 bp von Sal I; eine zweite Hind Ill-Stelle 31 bp von Eco RI; eine Hpa I-Stelle 305 bp von der zweiten Hind HI-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 1950 bp von der ersten Hind HI-Stelle; das Plasmid enthält den trp-Promoter, das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hpa I- und der ersten Hind HI-Stelle; das Gen für Resistenz gegen Tetracyclin folgt unmittelbar der ersten Hind HI-Stelle, und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt im Teil 3709 bp zwischen der Sal I- und der Eco RI-Stelle.

c) Entfernung der der Eco RI-Stelle in pEH3 nächstliegenden Hind HI-Stelle

pEH3 wurde mit Eco RI digeriert, wobei lineare Moleküle gebildet wurden, die mit Exonuclease III (EC 3.1.4.27) und dann mit Sl-Nuclease (EC 3.1.4.-) zur Entfernung der in 5'-Stellung herausragenden Enden (Tails) und zur Bildung stumpfer Enden digeriert wurden. Dann wurden die linearen Moleküle mit T4-induzierter DNS-Ligase (EC 6.5.1.1) verbunden, und das hierbei, erhaltene Plasmid wurde zur ümwandlung des Stamms trp oE^M verwendet und für trp-Ergänzung (complementatxon) und Ampicillin-Resistenz ausgewählt, wobei das als pEH5 bezeichnete (in Fig. 1 dargestellte) Plasmid gemäß der Erfindung erhalten wurde.

Das Plasmid pEH4 hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen: Moleküllänge 9866 pb; eine Barn I-Stelle

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346 bp von der Hind Ill-Stelle; eine Sal I-Stelle , 275 bp von Bam I; eine Eco RI-Stelle 3709 bp von der SaI I-Stelle; eine zweite Hind HI-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1950 bp von der zweiten Hind Ill-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 305 bp von der ersten Hind Ill-Stelle. Das Plasmid enthält den trp-Promoter, , das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hind Ill-Stelle und der ersten Hpa I-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz folgt unmittelbar der ersten Hind Ill-Stelle, und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt in dem Teil von 3709 bp zwischen der SaI I-Stelle und der Eco RI-Stelle.

Das Plasmid wird als pEH4 bezeichnet. pEH4 kann in ähnlicher Weise wie pEH3 hergestellt werden, außer daß die Auswahl auf der Grundlage seiner Tetracyclin-Empfindlichkeit erfolgt.

Wie bereits erwähnt, liegt ein besonderer. Nutzen der Plasmide gemäß der Erfindung darin, daß sie eine ein— deutig definierte Stelle aufweisen, die sich für die Einführung eines gewünschten eukaryotischen DNS-Fragments eignet, und daß die Plasmide eine solche Struktur haben, daß die Transcription der eingeführten DNS durch den Promoter, insbesondere einen trp-Promoter, in Verbindung mit der definierten Einführungsstelle, beispielsweise der Hind Ill-Stelle des Plasmids pEH5 (in Fig. 1 dargestellt), gesteuert und reguliert wird. Dieses Plasmid stellt daher ein wertvolles endgültiges Zwischenprodukt dar, aus dem Plasmide, an deren Einführungsstelle, beispielsweise an der Hind Ill-Stelle, genetische Information in Form von in geeigneter Weise modifizierter DNS, die darauf abgestellt ist, ein gewünschtes Polypeptidprodukt zu bilden, eingeführt worden ist, hergestellt werden können.

Die Herstellung der erforderlichen DNS, ihre Modifizie-

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rung zur Einfügung und die Einfügungsmethoden sowie die anschließenden Verfahren zur Herstellung von Proteinen sind allgemein bekannt und werden nachstehend kurz als Beispiele beschrieben.

1) Bildung der einzufügenden PNS

DNS für die Einfügung kann nach verschiedenen Methoden gebildet werden. Beispielsweise können Oligonucleotide verschiedener Länge nach bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise Hsiung et al "Nucleic Acids Research 6 (1979) 1371-1385).

Mehrere Oligonucleotide können als Folge ihrer spezifischen Basenpaarungseigenschaften zu längeren doppelsträngigen Molekülen zusammengesetzt werden. Die dieses Molekül bildenden Oligonucleotide können durch das Enzym DNS-Ligase verbunden (ligated) werden.

Als Alternative können DNS-Moleküle mit der gewünschten genetischen Spezifität durch Verwendung des Enzyms umgekehrte (reverse) Transcriptase unter Verwendung von RNS mit der gewünschten Spezifität als Matrize oder Schablone synthetisiert werden. Die RNS kann aus Zellen nach bekannten Methoden isoliert werden.

2) Vorbereitung der PNS für die Einfügung

Die DNS kann für die Einfügung in das Plasmid nach einer Vielzahl von Methoden modifiziert, werden. Beispielsweise kann DNS, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, am 3'-Terminus jedes Doppelstrangs mit Hilfe des Enzyms Terminaltransferase (EC 2.7.7.31) verlängert werden, wobei eine homopolymere einsträngige Verlängerung gebildet wird. Der 3'-Terminus des Hind-III-digerierten Plasmids kann in ähnlicher Weise verlängert werden. Wenn die Verlängerung der gebildeten DNS (dA) und des Plasmids (dT) ist oder umgekehrt oder wenn die Verlängerung der gebildeten DNS

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(dG) und die des Plasmids (dC) ist oder umgekehrt, können die DNS für die Einfügung und das Plasmid durch diese einsträngigen Verlängerungen so hybridisiert werden, daß kreisrunde Moleküle gebildet werden, in denen die gebildete DNS an der Hind Ill-Stelle des Plasmids eingefügt ist. Solche Plasmide können verwendet werden, um Zellen von E. coli und nach bekannten Methoden ausgewählte Kolonien der Transformantien umzuwandeln (siehe beispielsweise D. Glover, New Techniques in Biophysics and Cell Biology (herausgegeben von R.H. Pain und B.J. Smith) 8 (1976) 125-145 (Wiley, New York). Als Alternative können die Enden der in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten DNS mit dem Enzym DNS-Ligase zu kurzen doppelsträngigen DNS-Molekülen verbunden werden (Hind III-Bindeglieder (linkers), erhältlich von Collaborative Research, Waltham, Mass., U.S.A.), die die vom Restriktionsenzym Hind III erkannte Sequenz enthalten. Durch Digerierung dieser Moleküle mit diesem Enzym anschließend an die Verknüpfung (Ligation) werden Hind III-Termini an den Enden der vorbereiteten DNS gebildet. Die vorbereitete DNS kann dann anschließend an die Digerierung mit Hind III nach bekannten Methoden in das Plasmid eingefügt werden.

3) Herstellung des Peptids

Die bekannten Arbeitsmechanismen bakterieller Promoter führen zusammen mit den vorstehenden Daten zu der Schlußfolgerung, daß bei offenem Operator das Kopieren (transcription) vom Promoter von trpE und trpD über die Hind HI-Stelle und in Bereiche des Genoms jenseits der Hind HI-Stelle erfolgt. Die Übertragung des Transkriptionsprodukts ergibt ein mit dem D-Gen verknüpftes Durchlese(read-through)-Polypeptid (falls nicht ein Terminationskodon in die Einfügung einverleibt ist).

Das gebildete Polypeptid kann nach bekannten Methoden

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identifiziert werden, beispielsweise durch Übertragen des Plasmids auf einen Stamm, der Minizellen bildet (siehe beispielsweise R.B. Meagher "Cell" 10 (1977) 521-536), in denen die Polypeptidprodukte von Plasmidgenomen leicht zu unterscheiden sind, oder durch immunologische Methoden (siehe beispielsweise S. Broome und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75 (1978) 2746-2749).

Das Durchlese-Polypeptid (read-through) kann nach bekannten Methoden gereinigt und das gewünschte Polypeptidprodukt durch Digestion des Polypeptids mit Hilfe spezieller chemischer oder enzymatischer Mittel gebildet werden.

Das Plasmid pEH5 gemäß der Erfindung kann auch als Quelle von DNS verwendet werden, aus der eine weitere Reihe von Plasmidvektoren,' die sog. "pWT"-Reihe, aufgebaut werden kann'.

Das Plasmid pEH5 kann mit der Restriktions-Endonuclease Hinf I (EC 3.1.23.22) behandelt werden, wobei daraus ein Fragment von etwa 497 bp erhalten wird, das den kompletten Tryptophanpromoter, die führende Sequenz (leader sequence) und die ersten sieben Aminosäuren des trpE enthält. Das so erhaltene Hinf I-Fragment kann dann in die Hind HI-Stelle des bekannten Plasmids pBR322 geklont werden. Dieses Klonen kann vorgenommen werden, indem die Hinf I-Enden des Fragments mit DNS-Polymeriase I (EC.2.7.7.7) behandelt und die DNS-gefüllten Hinf I-Fragmente der Einwirkung von Hind III-Bindegliedern (linkers) in Gegenwart von DNS-Ligase und Hind III-Restriktions-Endonuclease in dieser Reihenfolge unterworfen werden, wobei das Fragment mit den "klebrigen Enden" Hind III erhalten wird.

Anschließend kann das Hinf I-Fragment in das Plasmid pBR322 durch Hind III-Restriktion des pBR322 und Ver-

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binden des begrenzten (restricted) Plasmids mit dem Hinf I-Fragment geklont werden.

Das Hinf I-Fragment wird in die Hind HI-Stelle von pBR322 in einer der vorstehend im Zusammenhang mit pEH3 und 4 beschriebenen beiden Orientierungen eingefügt.

Eine dieser Orientierungen, bei denen der trp-Promoter in Richtung der tet-Gene kopiert (transcribed) wird, wird durch Restriktionsenzym-Analyse einzelner Klone ausgewählt. (Die Sequenz von pBR322 ist bekannt; siehe beispielsweise J.G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology XLIl (1978) 77-90. Die Sequenz des trp-Promoter/Operator ist ebenfalls bekannt; siehe beispielsweise G.N. Bennett et al, J.Mol. Biol. 121 (1978) 113-137, und F. Lee et al, J.Mol. Biol. 121 (1978) 193-217).

Das erhaltene Plasmid wird hier als pWTlOl bezeichnet; seine Struktur ist in Fig. 4 dargestellt. Dieses Plasmid hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:

Moleküllänge 4874 bp; eine Eco RI-Stelle; eine Hind III-Stelle 31 pb von der Eco RI-Stelle; eine Hpa-Stelle 313 bp von der Hind HI-Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine B_am I-Stelle 346 bp von der zweiten Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle

.25 2958 bp von der SaI I-Stelle und 752 bp von der Eco RI-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistönz erstreckt sich vom Bereich der Hpal-Stelle bis über die SaI I-Stelle hinaus; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons umfasst den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des Ε-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der zweiten Hind HI-Stelle.

Auf Grund seiner vorstehend beschriebenen Bildung hat das Plasmid pWTlOl zwei Hind HI-Stellen, und zwar eine

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an jedem Ende des eingefügten Hinf I-Fragments aus dem ursprünglichen pEH5.

Um sicherzustellen, daß die eingefügte DNS dem Trypto-r phan-Promoter benachbart ist, ist es motwendig, daß die Hind Ill-Stelle oberhalb (stromaufwärts) des Tryptophan-Promoters entfernt wird. Dies kann erreicht werden durch Restriktion des Plasmids pWTlOl mit der Restriktionsendonuclease Eco RI, Digestion mit Exonuclease III und Sl, Behandlung mit DNS-Polymerase I (zur Füllung etwaiger asymmetrischer Enden, die durch Sl-Nuclease-Digestion gebildet worden sind) und Verknüpfen (ligation) der freien Enden des Plasmids unter Bildung eines hier als pWTlll bezeichneten Derivats von pWTlOl, das nur eine Hind HI-Stelle, und zwar stromabwärts vom trp-Promoter aufweist.

Die Erfindung umfasst demgemäß außerdem ein Plasmid pWTlll, das so ausgebildet ist, daß es eingefügte DNS an der Hind HI-Stelle aufnimmt, wobei die DNS erhalten wird, die unter dem direkten Einfluß des trp-Promoters steht. Kopieren und Übertragen (transcription and translation) der eingefügten DNS lassen sich leicht bestätigen, da das Plasmid nach (downstream) dem eingefügten Fragment das Gen für Tetracyclin-Resistenz enthält, so daß das Kopieren (transcription) durch die eingefügte DNS über das tet-r-Gen weiter verläuft, das Tetracyclin-Resistenz erzeugt, die nicht erzeugt wird, wenn die Transkription über die eingefügte DNS nicht stattfindet.

In Abhängigkeit von der Natur des DNS-Fragments, dessen Einfügung gewünscht wird, ist es notwendig, richtige Phaseneinstellung (phasing) im Plasmid, die derjenigen der einzufügenden DNS gleicht, sicherzustellen. So enthält durch umgekehrte (reverse) Transkription aus m-RNS gebildete doppelsträngige c-DNS, wenn sie vollständig ist, normalerweise eine Länge von Nucleotiden

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als führenden Rereich (leader region) vor der Proteinsequenz. Aus diesem Grunde wird die Umwandlung (translation) des Proteins als Teil eines verschmolzenen Polypeptide in einem Plasmid, z.B. pWTlll (an der Hind Ill-Stelle geklont), von der Zahl der Nucleotide im Leader abhängig, d.h. unvollständige umgekehrte.Transkription kann die Leadersequenz reduzieren und so den Leserahmen (reading frame) verändern. Aus diesem Grunde ist der Aufbau von Expressionsplasmiden, die für alle drei Leserahmen zu übersetzen (translate) vermögen, wichtig.

Das Plasmid pWTlll gestattet die Übersetzung (translation) von an der Hind HI-Stelle eingefügter DNS als verschmolzenes Polypeptid nur in einem Leserahmen (dies gilt nicht, wenn die eingefügte DNS ihre eigene, funktioneile Rxbosomenbindungsstelle hat) . Die. Übertragung (translation) beginnt mit den ersten sieben Aminosäuren von trpE, gefolgt von zwei Aminosäuren aus der Hind III-Linker-DNS und würde dann in die eingefügte Sequenz weiter fortschreiten. Wenn keine Stopkodone in dieser Sequenz vorhanden wären, würde die Translation am ersten Stopkodon im Tetracyclinbereich enden.

Die Nucleotidsequenz über die Hind HI-Stelle von pBR322 zeigt, daß für pWTlll das erste Stopkodon 26 Nucleotide hinter (downstream) der Hind HI-Stelle liegt.

Zur Änderung der Phaseneinstellung (phasing) von der Hind HI-Stelle des pWTlll kann das Plasmid mit Hind III begrenzt werden, die 5'-Verlängerungen können mit DNS-Polymerase I gefüllt und die Hind III-Linker-DNS verbunden werden. Begrenzung (Restriktion) mit Hind III zur Entfernung von überschüssigem Bindeglied (linker) und Bildung "klebriger Enden" und erneutes Verbinden ergibt "pWT121". Durch diese Maßnahme werden 14 bp

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DNS angefügt und der Leserahmen von der neuen Hind III-Stelle aus (die alte Stelle ist nun unvollständig) um plus ein Nucleotid verändert.

Der dritte Leserahmen (reading frame), d.h. pWTlll plus 2 Nucleotide, wurde durch Wiederholung der gleichen Reihe von Reaktionen an pWT121 erhalten. Das hierbei erhaltene Plasmid wird als "pWT131" bezeichnet.

Die Struktur der Plasmide pWTlll, pWT121 und pWT131 ist in Fig. 5 dargestellt. Die Struktur kann weiter wie folgt definiert werden:

pWTlll

Moleküllänge 4823 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Barn I-Stelle 34€ bp von der Hind Ill-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Barn I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz erstreckt sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis über die SaI I-Stelle hinaus; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons umfasst den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des Ε-Gens zwischen den Jlpa I- und Hind HI-Stellen.

pWT121

Moleküllänge 4837 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 206 bp von der Hpa I-Stelle; eine Barn I-Stelle 353 bp von der Hind HI-Stelle; im übrigen wie pWTlll.

pWT 131

Moleküllänge 4851 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 213 bp von der Hpa I-Stelle; eine Barn I-Stelle 360 bp von der Hind HI-Stelle; im übrigen wie pWTlll.

Rings um die Hind HI-Stelle von pWT 111, 121 und 131 liegen die folgenden Sequenzen vor:

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ρVTIl1

Hind III-Stelle

5' ATG,CAA,ACA,CAA,AAA,CCG,ACT₅ ¹CCAjAGC,TTT,AAT,GCG,GT. . ·3'

ρWT 121

Hind III— Stelle

ATG,CAA,ACA,CAA,AAA,CCG,ACT,CCAjAGC,TCC,AAG,CTT,GGA,GCT,-TTAjATGjC...3'

ρ WT 131

Hind ΙΙΙ-Ste lie

5' ... AAA,CCGjACT,CCA,AGC,TCC,AAG,CTG,CAA,GCT,TGG,AGC,TTG,-GAG,CTTjTAA,TG...3'

(Der Einfachheit halber zeigen die vorstehenden Sequenzen nur einen Strang der DNS.)

Die Wirksamkeit der Plasmide pWTlll, 121 und 131 als Vektoren für eingefügte DNS veranschaulichen die Ergebnisse, die durch Einfügung eines synthetischen Geflügelpestvirus-Gens (FPV) (siehe beispielsweise britische Patentanmeldung 80 10777 und Emtage et .al, Nature 283 (1980) 171-174) in pWT121, in diesem Fall das Plasmid mit richtiger Phase, erhalten wurden.

Das vorstehend genannte synthetische FPV-s-Gen kann wie folgt in pWT 121 geklont werden?

Das Plasmid pWT121 wurde mit Hind III begrenzt (restricted) und mit alkalischer Phosphatase (EC 3.1.3.1) behandelt, um die 5·-Phosphatgruppen zu entfernen. Hind TII-Bindeglieder (linkers) wurden mit den Enden

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des synthetischen FPV-Gens verbunden, das dann mit Hind III-Restriktions-Endonuclease zur Bildung klebriger Hind III-Enden behandelt wurde. Das in dieser Weise behandelte Geflügelpestvirus-Gen und das der Restriktion mit Hind III unterworfene pWT121 wurden dann verknüpft, wobei das Plasmid pWT121/FPV erhalten wurde. Es ist auch möglich, das synthetische FPV-Gen in pBR322 zu klonen und dann in bekannter Weise in pWT121 zu überführen.

Die allgemeine Struktur des Plasmids pWT121/FPV ist in Fig. 6 dargestellt. Die Struktur kann weiter wie folgt definiert werden:

Moleküllänge 6532 bp; eine Hind Ill-Stelle; eine Sma I-Stelle 365 bp von der Hind HI-Stelle; eine Eco RI-Stelle 910 bp von der Sma I-Stelle; eine zweite Hind HI-Stelle 460 bp von der Eco RI-Stelle; eine Barn HI-Stelle 353 bp von der zweiten Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Barn HI-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1045 bp von der Pst I-Stelle und 206 bp von der ersten Hind HI-Stelle; das synthetische FPV-Gen in dem Teil 1735 bp zwischen der ersten und der zweiten Hind III-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz erstreckt sich von der zweiten Hind HI-Stelle bis jenseits der Barn HI-Stelle und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt im Bereich der Pst I-Stelle.

In Abhängigkeit von der Orientierung des FPV-Gens erwies sich das Plasmid als Tetracyclin-resistent (wie in Fig. 6 dargestellt) oder, mit dem FPV-Gen in umgekehrter Orientierung, als Tetracyclin-empfindlich.

Umgewandelte Kolonien von E. coli, die die pWT121/FPV-Plasmide mit dem Hämagglutinxn (HA)-Gen jeweils in einer Orientierung enthielten, wurden für FPV-HA-Antigen dem Screening unterworfen. Es wurde gefunden, daß Tetracyclin-resistente Kolonien FPV-HA-Antigen ausdrück-

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ten (expressed), eine Bestätigung der richtigen Einfügung des synthetischen FPV-Gens. Die Kolonien mit dem FPV-Gen in der in Fig. 6 dargestellten Orientierung zeigten Tetracyclin-Resistenz, und die Kolonien mit umgekehrter Orientierung waren Tetracyclin-empfindlich. Im ersteren Fall erfolgte die Expression des HA-Antigens unter trp-Regulierung.

Die FPV-HA-Antigen-Expression kann wie folgt bestätigt werden:

Kolonien von E. coli, die das vorstehend beschriebene Tetracyclin-resistente pWT121/FPV-Plasmid enthielten, wurden dem Screening zur Auswahl des FPV-HA-Antigens unter Anwendung einer immunologischen Festphasenmethode unterworfen (siehe beispielsweise S. Broome und W. GiI-bert, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75 (1978) 2746-2749). Kurz gesagt, kleine Kulturen einzelner Kolonien wurden gezüchtet, isoliert und unter Verwendung von Lysozym und des nichtionogenen Tensids "Triton X-IOO" (Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol) lysiert.

Etwa vorhandene HA-Sequenzen wurden an ein mit FPV-HA-spezifischem IgG beschichtetes Polystyrolrohr gebunden.

125 Das gebundene Antigen wurde dann mit 1-IgG von hoher spezifischer Aktivität spezifisch markiert.

Immunreaktivität wurde in allen Kolonien, in die ein FPV-HA-Gen eingefügt war, nachgewiesen. Die Kolonien, die nur das ursprüngliche pWT121-Plasmi-d enthielten, zeigten keine Aktivität (siehe die folgende Tabelle).

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RadioJTTimuntest von FPV-HA in Lysaten von Bakterien, die pWT121/FPV-Plasmide enthalten.

Kolonie Nr.	HA-Gehalt (ng/50 ^jI)	Phenotyp	Einfügung (Insert)
2	>20	Tcr	A
5	0	Tcr	-
6	>20	Tcr	A
8	0	Tcr	-
11	>20	Tcr	A
13	0	Tcr	-
Ik	0	Tcr	-
15	> 20	Tcr	A
16	>20	Tcr	A

Wie bereits erwähnt, wurde Immunreaktivität in allen Kolonien nachgewiesen, die ein eingefügtes FPV-HA-Gen

(A) enthielten. Die Kolonien, die nur das ursprüngliche pWT121-Plasmid enthielten, zeigten keine Aktivität.

Im Falle der sog. pWT-Reihe von Expressionsplasmiden besteht ebenso wie bei pBR322 die Möglichkeit, daß diese normalerweise Mobilisations-minus (mob~)-Plasmide unter geeigneten Bedingungen mobilisiert (d.h. von einem Bakterium auf ein anderes übertragen) werd.en können. Kürzlich wurde nachgewiesen (siehe beispielsweise A.J. Twigg und D.J. Sherratt, Nature 283 (1980) 216-218), daß, obwohl die DNS-Kodierung für die Proteine mit CoI El-Mobilität bei pBR 322 fehlt, dieses Protein dennoch Mobilität durch Transkomplementation induzieren kann, wenn es in der gleichen Zelle an einem verträglichen Plasmid wie Col K vorhanden ist.

Es wurde gezeigt, daß die Stelle der Bindung des Mobili-

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tätsproteins (bzw. der Proteine) an die Plasmid-DNS die sog. "nic-Steile" oder "transfer origin" ist (siehe beispielsweise G.J. Warren et al, Nature 274 (1978) 259-261). In pBR322 beispielsweise liegt (maps) diese Stelle im 622 bp Hae II B-Fragment. Mutationen im Mobilitätsgen sind mob~. Sie können jedoch unter der Annahme eines trans-wirkenden Proteins durch mob CoI Ei-Derivate oder verwandte Plasmide ergänzt werden.

(Plasmide vom CoI El-Typ sind nicht-konjugativ, werden jedoch mobilisiert, wenn ein Geschlechtsfaktor, z.B. ein F^f- oder R-Faktor, in die Zelle eingeführt wird. Die Mobilisierung eines Plasmids, das nie⁴", aber mob~ ist, z.B. pBR322, erfordert daher die Anwesenheit von zwei anderen Plasmiden, nämlich eines Geschlechtsfaktors und eines verträglichen Plasmids vom CoI El-Typ, das mob ist.)

Die nic-Stelle ist speziell für die Mobilisierung erforderlich, und Plasmide, denen diese Steile fehlt, können nicht ergänzt werden.

Obwohl somit pBR322 und die Plasmide der pWT-Reihe nicht alle Mobilitätsgene enthalten, enthalten sie sämtlich die nic-Stelle und können somit zur Erteilung der Mobilität ergänzt werden. Um sicherere, nicht-mobile Vektoren herzustellen, ist es zweckmäßig, die nic-Stelle zu entfernen. Dies kann beispielsweise durch Entfernung eines Hae II-Fragments erreicht werden.

Die nic-Stelle kann aus den Plasmiden pWT 111, 121 und 131 wie folgt entfernt werden:

Eine Betrachtung der Hae II-Restriktionskarten (maps) der vorstehend genannten Plasmide zeigt, daß nur zwei Fragmente (B und H) entfernt werden können und dennoch die Ampicillin- und Tetracyclin-Gene, den Tryptophanpromoter und das Original der Kopie (origin of replication) zurücklassen. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 13 verwiesen.

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Das Fragment B ist 622 bp und das Fragment H ist 83 bp. Daher fehlt den nic~-Plasmiden (minus B und H) 705 bp. Dies muß natürlich bei der Charakterisierung der nic~- Derivate der vorstehend genannten Plasmide berücksichtigt werden. Beispielsweise liegt in pWTlll (nic~) die Pst I-Stelle 2253 bp von der SaI I-Stelle.

Die nic~-Derivate von pWTlll, 121 und 131 werden als pWT 211, 221 bzw. 231 bezeichnet.

Die erste Stufe bei dieser als Beispiel beschriebenen Entfernungsmethode besteht darin, daß das Plasmid teilweise so digeriert wird, daß jedes Molekül im Durchschnitt zwei- oder dreimal gespalten wird. Die Spaltstücke (digests) werden dann unter Verwendung von T--DNS-Ligase wieder verbunden, und die verbundene DNS wird in E. coli K 12, z.B. HBlOl, transformiert. Die Transformanten werden auf Ampicillin und Tetracyclin unter Verwendung von Minimal-Agarplatten ausgewählt, um trp-Transkription zu induzieren und Tetracyclin-Resistenz sicherzustellen.

Die erhaltenen Kolonien enthalten die rezirkularisierten Ausgangsplasmide sowie Beispiele, denen ein oder beide Hae II-Fragmente fehlen. Die letzteren können durch Screening einzelner Kolonien und Suchen nach Plasmiden, die kleiner sind als das Ausgangsplasmid, identifiziert werden. Voraussichtliche nic~-Derivate können durch Restriktionsenzym-Analyse von gereinigter Plasmid-DNS bestätigt werden.

Anstatt das vorstehend als Beispiel beschriebene Verfahren unter Anwendung teilweiser Restriktionen anzuwenden, die das Screening von vielleicht hunderten von Kolonien erfordern, ist es im allgemeinen einfacher, die nic~-Derivate in der in Fig. 14 dargestellten Weise aufzubauen.

Kurz gesagt, die pWT-Plasmide werden der Restriktion mit

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Pst I und Bam HI unterworfen, und Banden, die den trp p/o-Bereich enthalten, werden von ^olyacrylamidgelen isoliert. Das Plasmid pAT153 (nie") wird der Restriktion mit Pst I und Bam HI unterworfen, und die Bande von 2531 bp wird von einem Polyacrylamidgel isoliert. Die erstgenannten Banden werden einzelnen mit der letztgenannten Bande unter Verwendung von T.-DNS-Ligase verbunden, und das verbundene Material wird zur Transformierung von E. coli HB 101 verwendet. DNS aus Einzelkolonien kann isoliert und ihre Struktur durch Restriktionsenzym-Analyse bestätigt werden, z.B. Hae II-Teilstücke (digests) von pAT153, pWT-Reihe und pWT (nie")-Reihe.

Mit anderen Worten, die nic~-Derivate können aufgebaut werden durch Substitution des Bereichs in den pWT-Plasmiden, der durch die Pst I- und Barn HI-Stellen, die das Original der Kopie enthalten, und die nic-Steile gebunden ist, mit dem entsprechenden Bereich aus pAT153, der ein Entfernungsderivat (deletion derivative) von pBR322 ist und dem das 622 bp Hae II B-Fragment fehlt, und dem benachbarten Fragment 83 bp Hae II H.

Die Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche weiter erläutert.

Herstellung von pEH3, pEH4 und pEH5

Kulturen von E. coli K12, Stamm HBlOl (siehe beispielsweise H. Boyer et al, J. Mol. Biol. 41 (1969) 459-472), die das Plasmid pBR322 enthielten, wurden entweder in L-Medium oder in M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltendem Medium gezüchtet (siehe beispielsweise J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Anhang 1, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1972) 431-435) Bei einem A_finn-Wert von 0,6 wurde Chloramphenicol den Plasmidkulturen bis zu einer Endkonzentration von 150 AJg/ ml zugesetzt, worauf weitere 16 Stunden bei 37°C bebrütet wurde. DNS wurde von den Zell-Lysaten durch Zentrifugie-

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ren in CsCI/Äthidiumbromid-Gradienten isoliert (siehe beispielsweise L. Katz et al,J. Bacteriol. 114 (1973) 577-591 und Wensink et al, Cell 3 (1974) 315-325). Die DNS-Banden wurden durch seitliches Anstechen mit einer 1 ml-Injektionsspritze mit 16 G-Nadel unter Bestrahlung mit UV-Licht von 366 nm Wellenlänge entfernt. Das Äthidiumbromid wurde durch Durchleiten durch das saure Kationenaustauscherharz der Handelsbezeichnung "Dowex AG50" entfernt.

Alle DNS-Lösungen wurden gegen TE-Puffer (10 mM Tris, ImM EDTA, pH 7,5) zur Entfernung von überschüssigem CsCl dialysiert, durch Ausfällung mit Äthanol eingeengt und bei -70⁰C aufbewahrt. Das erhaltene DNS-Gemisch wurde mit Hind III wie folgt grenzdigeriert (limit digested):

2 ,ug pBR322 wurden mit 5 Einheiten Hind III in einem Puffer inkubiert, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM ß-'Mercaptoäthanol und 2 mM Dithiothreit enthielt. Die Inkubation wurde 90 Minuten bei 37°e in einem Volumen von 40 ill vorgenommen. Die Reaktion wurde dann beendet, indem 5 Minuten bei 65°C inkubiert wurde.

Isolierung des Fragments Hind III trp E

20 ng pRHl/trpE wurden mit Hind III grenzdigeriert, der Elektrophorese an l%igen Agarosegelen unterworfen, worauf die Bande, die lineares trpE enthielt, entfernt wurde.

Das trpE-Fragment wurde aus der Gelscheibe durch Elektrophorese in einen Dialysenbeutel isoliert und anschliessend mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Ligation

Die Ligase-Inkubationen enthielten 0,2 ug des trpE-Fragments, 0,4 ug des mit Hind III begrenzten (restricted) pBR322 und 0,1 Einheit T₄~Polynucleotid-Ligase pro 20 ul Reaktionspuffer. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 16°C inkubiert.

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Umwandlung (Transformation)

0,01 ug der angeknüpften DNS wurden zur Umwandlung des Stamms E. coli W3110 trp ο EVl verwendet.

Gegen Ampicillin resistente Rekombinanten, die zur Ergänzung dieser trpE~-Zellen fähig waren, wurden ausgewählt.

1,2 χ 10 amp-r-Kolonien, die in Abwesenheit von Tryptophan wachsen konnten, wurden pro ,ug Plasmid-DNS erhalten.

Fünfzig dieser Kolonien wurden willkürlich ausgewählt und unter Verwendung von Zahnstochern auf Minimal-Agarplatten (siehe beispielsweise J.H. Miller, loc.cit.), die 100 ug/ml Ampicillin und 12,5 ug Tetracyclin enthielten, übertragen. Von den 50 Kolonien wuchsen 31 nach Bebrütung über Nacht, ein Zeichen für die Anwesenheit von Tetracyclin-resistentem Protein in dieser Population.

Plasmid-DNS wurde von repräsentativen Kolonien der Tetracyclin-empfindlichen und -resistenten Gruppen isoliert, und die Hind III-Fragmentgruppierungen wurden durch Gel-Elektrophorese an l%igen Agarosegelen analysiert. Die Plasmid-DNS von allen Ampicillin-resistenten trp⁺-Klonen enthielten die ursprüngliche pBR322-DNS von Mr 2,8 χ 10⁶ (4,361 kb) und das E. coli Hind III trpE-Fragment von Mr 3,5 χ 10 (5,350 kb). Die gebildeten Plasmide wurden den folgenden weiteren Behandlungen unterworfen, um ihre Struktur zu bestätigen.

Orientierung des trpE-Fragments

Eine Folge des erneuten Verbindens von Hind Ill-Spaltstücken (digests) von pBR322 mit dem trpE-Fragment besteht darin, daß das trpE-Fragment in einer von zwei verschiedenen Orientierungen eingefügt werden kann. Es kann so sein, daß die Transkription vom trp-Promoter über das tet-Gen des Plasmids oder vom tet-Gen hinweg verläuft. Die Orientierung des tet-resistenten Plasmids (pEH3) und des tet-empfindlichen Plasmids (pEH4) wurde im Licht (siehe beispielsweise M.E. Bennett et al, Proc.

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Natl. Acad. Sei. U.S.A. 73 X1976) 2351-2355) vorhandener Hpa I-Stellen im trp Ε-Fragment und Barn HI-Stellen in pBR322 bestimmt (siehe beispielweise F. Bolivar et al, loc.cit.). Fig. 7 veranschaulicht die Ergebnisse von Grenzdxgestxonen von Plasmiden pBR322, pEH3 und pEH4 mit entweder Hind III, Hpa I (EC 3.1.23.23) Bam HI (EC 3.1.23. 6) oder einer Kombination dieser Enzyme.

Fig. 7 veranschaulicht ein Agarosegel und zeigt die Restriktions-Endonucleasestellen für Hpa I, Hind III und Bam HI in pEH3 und pEH4 und die Orientierung der geklonten trpE DNS in diesen Plasmiden.

Die Spuren (tracks) a bis j enthalten die folgenden DNS mit Größen in Kilobasenpaaren (kb): (a) PM2 DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Sichtbar sind die Banden 1 bis 6 mit den Größen 5,4, 2,35, 1,05, 0,475, 0,45 bzw. 0,27 kb. (j)^C.I857,S7 DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Sichtbar sind die Banden A bis G mit den Größen 21,79, 9,38, 6,30, 4,20, 2,38, 2,11 bzw. 0,47 kb. (b) Supergedrillte pBR322 DNS. (c) pBR322 mit Hpa I inkubiert, (d) pEH3 mit Hind III digeriert, (e) pEH3 mit Hincl III und Hpa I digeriert. Größe der Banden 4,3, 3,25, 1,95 und 0,30 kb. (f) pBR322 mit Bam HI digeriert, (g) pEH3 mit Bam HI digeriert, (h) pEH4 mit Bam HI und Hpa I digeriert. Die kompletten Fragmente der Digestion (digest fragments) haben Größen von 5,7, 3,25 und 0,67 kb. (i) pEH3 mit Bam HI und Hpa I digeriert. Die kompletten Fragmente der Digestion haben Größen von 4,3, 3,25 und 2,4 kb. Es sind keine Hpa I-Stellen in pBR322 (vgl. die Streifen (lanes) b und c) und keine Barn HI-Stellen in trpE vorhanden (vgl. Bahnen f und g). Bei Restriktion mit Hind III allein ergibt pEH3 sowie auch pEH4 lineare pBR322- und trpE-Fragmente (Bahn d). Doppelte Digestionsspaltstücke (digests) von pEH3 und pEH4 mit Hind III und Hpa I ergeben ebenfalls identische Profile (Bahn e). In diesem Fall wird lineares pBR322

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(4,365 kb) zusammen mit drei anderen Fragmenten von 3250, 1950 und 305 bp regeneriert. Da pBR322 keine Hpa I-Targets aufweist (siehe beispielsweise F. Bolivar et al, loc.cit.), wird geschlossen, daß zwei Hpa I-Targets im trpE-Fragment vorhanden sind. Das eine wurde bereits angegeben; es liegt im Promoterbereich (siehe beispielsweise M.E. Bennett et al, loc.cit.), während die zweite Stelle sich ungefähr 300 bp von einer der Hind III-Steilen befindet.

Doppeldigests mit Bam HI und Hpa I wurden verwendet, um die Orientierung des trpE-Fragments und die Lage der zweiten Hpa I-Stelle zu bestimmen. Die gebildeten Fragmente sind in der Bahn h für pEH4 und in der Bahn i für pEH3 gezeigt. Es ist eindeutig, daß diese Plasmide trpE-Fragmente in verschiedenen Orientierungen enthalten. Die Größe des kleinsten Fragments, das von pEH4 abgeleitet ist, läßt sich leichter aus den in Fig. 8 dargestellten Ergebnissen ermitteln. Diese Abbildung zeigt die durch Restriktionsdigests von pEH3, pEH4 und pBR322 mit Sal I (EC 3.1.23.27), Bam HI, Hpa I, Eco RI und Hind III abgeleiteten kleinen Fragmente.

(Fig. 8 veranschaulicht ein 5%iges Acrylamidgel und zeigt niedrigmolekulare DNS-Fragmente aus pBR322, pEH3 und pEH4 nach Digestion mit Hpa I-, Bam HI-, Hind III- und Sal I-Restriktionsendonucleasen. Die Spuren a bis i enthalten Desoxyribonucleinsäuren mit Größen in Basenpaaren (bp): (a, i) PM2 DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Die Banden 1 bis 7 haben die folgenden Größen: 5400, 2350, 1050, 475, 450, 270 bzw. 110 bp. (b) pEH3 mit Bam HI und Hpa I digeriert, (c) pEH4 mit Bam HI und Hpa I digeriert.

Die kleinste Bande wird mit 640 bp geschätzt, (d) pEH3 mit Hind III und Hpa I digeriert. Die kleinste Bande mit 295 bp bestimmt, (e) pBR322 mit Bam HI und Sal I digeriert. Die kleinste Bande mit 275 bp bestimmt, (f) pBR322 mit Hind III und Sal I digeriert. Die kleinste Bande mit 620 bp bestimmt, (g) pBR322 mit Bam HI und Hind III dige-

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riert. Die kleinste Bande mit 350 bp bestimmt, (h) pBR322 mit Eco RI und Hind III digeriert. Die kleinste Bande mit 25 bp bestimmt.)

Aus den vorstehend genannten Ergebnissen wurden die in Fig. 2 und Fig. 3 dargestellten Restriktionsdiagramme (maps) für pEH3 und pEH4 angefertigt. Die Tatsache, daß die zweite Hpa I-Stelle "stromaufwärts" vom trp-Promoter liegt, liegen die bekannten Größen des trpE-Proteins, der Anthranxlatsynthetase und des trpD-Genfragments zugrunde, die im Hind III trp Ε-Fragment enthalten sind. Anthranxlatsynthetase ist ein Protein von 60.000 Dalton (siehe beispielsweise J. Ito et al, J. Bacteriol. 97 (1969) 725-733) (etwa 500 Aminosäuren), während nur etwa 1/6 des trpD-Proteingens (entsprechend etwa 275 pb) durch dieses Hind III-Fragment spezifiziert ist (siehe beispielsweise A.S. Hopkins et al, J.Mol. Biol. 107 (1976) 549-569). Eine DNS-Länge von ungefähr 1800 bp ist somit erforderlich, um diese Polypeptide' zu spezifizieren. Zusätzlich sind 162 Basen in der Leadersequenz am 5'-Ende von trp mRNS und weitere 11 Basen vom Beginn der trp m-RNS zum Hpa I-Target im trp-Promoter vorhanden (siehe beispielsweise F. Lee et al, J. Mol. Biol. 121 (1978) 193-217). Diese insgesamt 1948 bp zwischen Hpa I und Hind III sind in guter Übereinstimmung mit dem Hpa I - Hind III-Abstand von 1950 bp, der durch Gelanalyse ermittelt wurde, und im Einklang mit der Schlußfolgerung, daß die zweite Hpa I-Stelle "stromaufwärts" vom trp-Promoter liegt.

Regulierung der Tetracyclinempfindlichkeit vom trp-Promoter

Ordnet man das kleine Hpa I-Hind III-Fragment "stromaufwärts" vom trp-Promoter an, so zeigt sich zweifelsfrei, daß in der Tetracyclin-resistenten Gruppe von Plasmiden (pEH3) die Transkription vom trp-Promoter zum Tetracyclin-Gen hin gerichtet ist, während im Tetracyclin-empfindlichen Plasmid (pEH4) das Entgegengesetzte der Fall ist.

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Auf dieser Grundlage wäre zu erwarten, daß das Ausdrücken (expression) des Tetracyclingens in pEH3 vom trp-Promoter reguliert und gesteuert wird und daß eine etwaige Einfügung in die Hind HI-Stelle von pBR322 den Tetracyclinpromoter zerstört.

Dies wurde getestet durch Prüfung der Tetracyclin-Resistenz von pEH3 enthaltendem E. coli, das in Gegenwart und Abwesenheit von Tryptophan, d.h. unter Bedingungen gezüchtet wurde, unter denen die trp-Gene entweder gebunden (repressed) oder freigelassen (de-repressed) werden sollten. Das Plasmid pEH3 im Stamm W311O trp ο EyI wurde auf einem Medium gezüchtet, das M9-Salze, Glucose, Casaminosäuren und 5 iig/ml Tetracyclin enthielt. Bei einem A--_oo~Wert von 0,05 wurde die Kultur geteilt. Zu einer Hälfte wurden 200 pg/ml Tryptophan gegeben. Nach Inkubation für eine weitere Stunde wurden die Zellen verdünnt und auf Agarplatten gegeben, die steigende Konzentrationen Tetracyclin enthielten. Die für 1 Stunde auf 200 iig/ml Tryptophan gezüchteten Zellen wurden auf Minimal-Agarplatten, die mit Tryptophan ergänzt waren, gezüchtet.

Die Ergebnisse dieser Reihe von Versuchen sind in Fig. 9 dargestellt.

(Fig. 9 veranschaulicht den Wirkungsgrad des Plattierens des Stamms trp ο Εγ1 und seiner Derivate auf steigende Tetracyclinkonzentrationen.Kulturen des Stamms trp ο Ey 1, der die genannten Plasmide enthielt, wurden in definierten Medien gezüchtet und in der nachstehend beschriebenen Weise behandelt. Die überlebensrate in % wurde relativ zur entsprechenden Platte, die kein Tetracyclin enthielt, bestimmt. Platten, die 80 bis 400 Kolonien enthielten, wurden zur Bestimmung der Überlebenden in % verwendet. Die folgenden Tetracyclinkonzentrationen, die 50% der Zellen abzutöten vermögen, bestimmt durch den Kolonie-Test (EOP 50%), wurden aus der Abbildung gemessen: 12 pg/ml für plasmidfreie Zellen; 4,5 iig/ml für pEH4 enthaltende

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Zellen; 23 pg/ml für pEH3 enthaltende Zellen, die mit 200 pg/ml Tryptophan vorinkubiert waren; 56 pg/ml für pEH3 enthaltende Zellen, die ohne Tryptophan gezüchtet worden waren). Die Anwesenheit von Tryptophan im Medium verursachte eine 2,5fache Verringerung der durch pEH3 vermittelten Resistenz gegen Tetracyclin. Ähnliche Versuche mit pEH4 und mit plasmidfreiem W3110 trp ο E\/1 (wobei das Anfangs-Kulturmedium kein Tetracyclin enthielt) ergaben, daß diese Bakterien für sehr niedrige Konzentrationen von Tetracyclin empfindlich waren.

Die der Eco RI-Stelle von pEH3 nächstliegende Hind III-Stelle wurde wie folgt entfernt, um das Plasmid pEH5 zu bilden:

20 ug des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten pEH3 wurden mit Eco RI digeriert, an perlförmigem vernetzten! Dextrangel der Handelsbezeichnung "Sephadex G-50" in 50 mMvNaCl/0,1 % SDS (Gew./Vol.) gelfiltriert, und der ausgeschlossene DNS-Peak wurde durch Ausfällung mit Äthanol eingeengt und in Wasser gelöst.

Das mit linearem Eco RI digerierte pEH3 wurde mit Exonuclease III bei 20⁰C digeriert. Das Gemisch enthielt 10 pg lineares PJ.asmid, 60 mM Tris pH 8, 0,66 mM 4 mM Dithiothreit und 40 Einheiten von Exonuclease III in einem Gesamtvolumen von 200 pl. 100 ul aliquote Teile (5 pg) wurden nach 5 und 10 Minuten entfernt, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Das mit Exonuclease III behandelte Plasmid (5 pg) wurde zur Bildung stumpfer Enden 15 Minuten bei 30⁰C mit Sl-Nuclease in einem Volumen von 100 pl behandelt. Das Reaktionsgemisch enthielt 150 mM NaCl, 25 mM Natriumacetat pH 4,6, 0,1 mM ZnSO₄, DNS und 2,5 Einheiten s1-Nuclease. Nach der Inkubation wurde das Gemisch mit Phenol und Chloroform extrahiert und dann mit Äthanol gefällt. 3 pg der mit S1 digerierten DNS wurden in einem Endvolumen von 10

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pi mit 1 μΐ T₄ DNS-Ligase (0,3 Einheiten) 16 Stunden bei 15°C und dann 24 Stunden bei 4°C verbunden (ligated).

(Fig. 10 veranschaulicht ein 1%iges Agarosegel und zeigt die Entfernung von Hind III- und Hpa I-Stellen aus pEH3.)

Die Spuren a bis i enthalten die folgenden Desoxyribonucleinsäuren mit Größen in Kilobasenpaaren (kb): (a,i) λ cI857,S7 mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Die Banden A bis F mit Größen von 21,79, 9,38, 6,30 bzw. 4,20 kb waren in Agarose sichtbar, (b) pEH3 mit Hind III digeriert; (c) pEH3 mit Sal I digeriert; (d) zusammengegossene Kolonien mit Hind III digeriert; (e) pEH5 mit Hind III digeriert; (f) pEH5O5 mit Hind III digeriert; (g) pEH5 mit Hpa I digeriert; (h) pEH5O5 mit Hpa I digeriert. )

Herstellung von Plasmiden der pWT-Reihe Bakterien und Plasmide

Die verwendeten Bakterienstämme waren Escherichia coli K12-Derivate; HB1O1 F~ pro leu thi lac Y str^r rk~ mk~ Endo 1~ rec A~ & ED8689 trpR~rk~mg⁺.

Nährmedien und Transformation

Die Kultivierung erfolgte in Medien, die M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthielten (siehe beispielsweise J.H. Miller, loc.cit.), für die Herstellung von Plasmid-DNS und die Testung auf Tetracyclin-Empfindlichkeit. Für Plasmid enthaltende Stämme wurden Antibiotika in geeigneter Konzentration zugesetzt. Die für die Transformation zu verwendenden Zellen wurden in L-Nährmedium gezüchtet.

Während der gesamten Testung auf Empfindlichkeit für Tetracyclin wurden die Zellen auf 119-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten plattiert, die, wo angegeben, mit Tetracyclin (0 bis 30 pg/ml), 3ß-Indolacrylsäure (20 ug/ml) oder Tryptophan (100 pg/ml) ergänzt waren.

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Die Transformation erfolgte nach dem Protokoll von Glover (loc.cit.)· Die Zellen wurden entweder auf Nähragar Nr. 2, das mit Ampicillin (100 jug/ml) ergänzt war, oder auf M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten, die mit Ampicillin (100 pg/ml) oder Tetracyclin (10 iig/ml) ergänzt waren, plattiert.

Herstellung von Plasmid-DNS

Die Herstellung der Plasmid-DNS erfolgte entweder in der vorstehend für pEH5 beschriebenen Weise oder durch Extraktionen der geklärten Lysate mit Phenol / Chloroform, anschließende Ausfällung der DNS mit Isopropanol und abschließende erneute Suspendierung in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 inM EDTA).

Enzymreaktionen
Restriktions-Endonuclease-Digestionen (digests)

DNS-Restriktionsdigestionen wurden entweder in einem salzreichen oder salzarmen Puffersystem 2 Stunden bei 37 C durchgeführt, wobei das Volumen des Reaktionsgemisches von 10 bis 200 ^aI und die Menge des zugesetztem Enzyms von 1 bis 20 Einheiten pro ^ug Plasmid-DNS variierten.

Bam HI-, Eco RI-, Hha I- (EC 3.1.23.19), Hind III- und Pst I- (EC 3.1.23.31) Digestionen wurden in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit und 100 pg/ml Gelatine durchgeführt. Für Hpa-I-Digestionen unterschied sich das Reaktionsgemisch nur darin, daß 50 mM NaCl durch 5 mM NaCl ersetzt wurden. Hinf I arbeitete in beiden Reaktionsgemischen gleich gut.

Wenn Plasmid-DNS, die nicht nach dem Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Verfahren hergestellt worden war, digeriert wurde, enthielt das Reaktionsgemisch auch Ribonuclease vom Typ I-A (zur Entfernung von etwaiger DNSase-Aktivität 10 Minuten bei 95°C wärmebehandelt) in einer Menge von 50 jug/mi, um die RNS zu entfernen, die bei der Reinigung gleichzeitig mit der DNS ausgefällt wurde.

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Alle Reaktionen wurden beendet, indem 5 Minuten auf 65°C erhitzt wurde.

Verbindungen (Ligations)

Kohäsive Endverbindungen wurden bei Volumina von 10 bis 20 pl in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₃, 20 mM Dithiothreit, 1 mM ATP unter Verwendung von 0,01 bis 0,2 Einheiten Ligase für 0,5 bis 3 jag DNS vorgenommen. Die Reaktionsgemische wurden über Nacht bei 15°C inkubiert. Für Verbindungen von stumpfen Enden wurde das gleiche Reaktionsgemisch verwendet, jedoch wurde die Ligase auf 0,2 bis 0,6 Einheiten für 1 bis 3 ug DNS und die Inkubationstemperatur auf 25⁰C erhöht.

Füllung von 5'-Verlängerungen (extensions) mit DNS-Po Iy mer as e I

0,5 bis 3,5 ng DNS wurden Polymerase-gefüllt in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₃, 1 mM ß-Mercaptoäthanol, je 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP in einem Volumen von 50 p.1 unter Verwendung von 0,25 bis 1,5 Einheiten Polymerase. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 1O°C inkubiert, worauf ein aliquoter Teil direkt zur Verbindung stumpfer Enden verwendet oder das Ganze mit Phenol / Chloroform extrahiert und dann mit Äthanol gefällt werden konnte.

Polynucleotid-Kinasebehandlung von Hind III-linker-DNS

2,5 ug Decamer-Hind III-Bindeglied (linker) wurden der Kinasebehandlung für 60 Minuten bei 37°C mit 10 Einheiten Kinase in 25 mM Tris-HCl pH 7,8, 5 mM MgCl₃, 0,125 mM ATP, 25 ug/ml Rinderserumalbumin unterworfen. Die 5'-Termini wurden ferner durch Zusatz von 100 pCi /J- Pj ATP (3000 Ci/mMol) zum Reaktionsgemisch markiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von SDS zu 0,1% (Gew./Vol.) und EDTA zu mM beendet und das ganze an einer 30 χ 0,7 cm großen Säule des Ionenaustauschers der Handelsbezeichnung "Sephadex G-50" (SF), der in 50 mM NaCl/0,1% SDS (Gew./ Vol.) äquilibriert war, chromatograplixert. Die ausgeschlos-

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senen Fraktionen wurden vereinigt, mit Äthanol gefällt und erneut in Wasser bis 50 ug/ml suspendiert.

Behandlung von pBR322 mit Restriktion an Hind III mit bakterieller alkalischer Phosphatase: 5 bis 1Oyug linearisiertes pBR322 in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, O,1% (Gew./Vol.) SDS wurden mit 5 ug bakterieller alkalischer Phosphatase 60 Minuten bei 37°C behandelt. Das Gemisch wurde dann mit Phenol / Chloroform extrahiert und die DNS mit Äthanol ausgefällt.

Digestion von mit Eco RI begrenztem (restricted) pWT101 mit Exonuclease III und Sl-Nuclease:

Die angewandten Bedingungen waren die gleichen, wie sie für die Entfernung der Hind HI-Stelle in pEH3 beschrieben wurden, außer daß aliquote Teile (3,33 pg) nach 1, 3 und 5 Minuten Digestion mit Exonuclease III entfernt wurden.

Herstellung von Gelproben aus ganzen Zell-Lysaten

Für "Ganzzellenlysis"-Agarosegele wurde eine repräsentative Probe von Plasmid enthaltenden Zellen von der Kulturplatte unter Verwendung einer sterilen Kunststoffschleife abgestreift und erneut in 200 μΐ Agarose-Elektrophoresepuffer suspendiert. Zur Suspension wurden 50 ul "Ficoll"-Puffer (5% (Gew./Vol.) SDS, 10% (Gew./Vol.) Ficoll (Copolymerisat von Saccharose und Epichlorhydrin) und 0,06% (Gew./Vol.) Bromphenolblau) gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 65 C inkubiert, um die Zellen zu lysieren, und dann 1 Minute verwirbelt ("vortexed"). Etwa 40 pl einer solchen Probe erwiesen sich als ausreichend für die Identifizierung des Plasmids. RNS, die mit der DNS vorhanden war, konnte entfernt werden, indem entweder Ribonuclease mit 50 pg/ml zur Probe gegeben und anschliessend 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde, oder indem die Probe direkt zu 1 ug/ml der Agarosegelmatrix gegeben wurde.Durch beide Methoden wird die RNS-Schmiere (smear) entfernt, die sonst auf dem Gel vorhanden sein würde.

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Gel-Εlektrophorero

Agarosegele (20 χ 15 χ 0,5 cm) mit der Zusammensetzung 0,8 bis 1,4% (of 0,8 to 1,4% composition) wurden unter üblichen Bedingungen behandelt. Die Gele wurden der Elektrophorese entweder über Nacht bei 40 V oder 3 Stunden bei 120 V unterworfen und dann gefärbt und photographiert.

Acrylamidgele (20 χ 15 χ 0,15 cm) der Zusammensetzung 5 bis 10% wurden verwendet, um kleine Restriktionsfragmente zu identifizieren. Anfärben und Photographieren wurden in der gleichen Weise wie bei den Agarosegelen vorgenommen.

Isolierung des Tryptophanpromoter-Operator Hinf I-Fragments und Anfügen des Hind III-Bindegliedes (linker)

6 ug pEH5 wurden der Restriktion an Hinf I und der Elektrophorese an einem 5%igen (Gew./Vol.) Acrylamidgel unterworfen, worauf der 497 bp-Hinf I-Tryptophanpromoter-Operator und die mitwandernde pBR322-Bande vom Gel abgeschnitten wurden und die DNS in bekannter Weise extrahiert wurde·

Die Hinf I-Enden wurden dann mit DNS-Polymerase I gefüllt und Hind III-Bindeglieder (linker) durch Stumpfend-Verbindung im Verhältnis von 50 Bindegliedfragmenten pro Hinf I-Fragment an sie angesetzt (dies verringert die Möglichkeit der Selbstbindung von Hinf I-Fragmenten). Klebrige Enden wurden durch Restriktion des Gemisches mit Hind III gebildet; die DNS wurde mit Äthanol ausgefällt und erneut in 50 ul 50 mM NaCl und 0,1% (Gew./Vol.) SDS suspendiert. Das Ganze wurde an einer 50 χ 0,7 cm großen Säule des Ionenaustauschers "G150 Sephadex" (vorher mit 50 mM NaCl und 0,1% (Gew./Vol.) SDS ins Gleichgewicht gebracht) chromatographiert. Der ausgeschlossene Peak wurde zusammengegossen, und die DNS wurde mit Äthanol ausgefällt.

Aufbau von pWTiO1

Die vollständige Sequenz von E.coli-Tryptophanpromoter, Operator und Leader und die ersten sieben Aminosäuren von

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trpE sind auf einem Hinf I-Fragment von etwa 497 bp, das in pEH5 vorhanden ist, enthalten.Das Hinf I-Fragment mit 497 bp wurde in die Hind Ill-Stelle von pBR322 mit Hilfe von Decamer-Hind III-linker-DNS geklont. Die Durchführung dieser Maßnahme bedeutete, daß die Hinf I-Enden zuerst mit DNS-Polymerase I gefüllt werden mußten, um die Bindeglied-DNS anfügen zu können. Das Fragment wurde dann mit Hind HI-Schnitt pBR322, der mit bakterieller Alkaliphosphatase behandelt worden war, verbunden und das Gemisch zur Umwandlung von E. coli HB101 unter Anwendung einer Auswahl mit Hilfe von Nähragar-Ampicillin verwendet. Insgesamt 5 82 Kolonien wurden aus der Umwandlung erhalten.

Durch Klonen in die Hind HI-Stelle von pBR322 wird der Tetracyclin-Promoter inaktiviert, wodurch ein etwaiger Transformant Tetracyclin-empfindlich gemacht wird, wenn nicht das geklonte Stück seinen eigenen Promoter hat, der in die Tatracyclin-Gene umschreibt. Da das Hinf I-Fragment den Tryptophan-Promoter-Operator-Bereich enthält, sollten Transformanten, die in Plasmid mit dem in richtiger Orientierung geklonten Fragment enthalten, d.h. zum Tetracyclinpromoter hin transkribieren, resistent gegen Tetracyclin sein. Um dies zu testen, wurden 48 willkürlich von den Ampicillin-Transformationsplatten gewählte Kolonien auf M9-Salze und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten, die mit Tetracyclin (10 jug/ml) ergänzt worden waren, herausgestochen. Hiervon erwiesen sich elf als Tetracyclin-resistent. Dies ist die erwartete Zahl, da mit zwei anwesenden Fragmenten die Möglichkeit, die richtige Orientierung zu erhalten, eine von vier betrug. Die Anwesenheit von eingefügter DNS wurde auch bestätigt, indem Kolonien von beiden Gruppen von Platten entnommen und gegen eine pBR322-Kontrolle unter Verwendung ganzzelliger Agarose-Gele getestet wurden. Nach diesen Methoden wurden gegen Ampicillin und gegen Ampicillin und Tetracyclin resistente Kolonien isoliert, die Plasmide mit eingefügter DNS enthielten. Plasmid-Desoxyribonucleinsäuren wurden aus einer Anzahl dieser Kolonien für die

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Restriktions-Endonuclease-Analyse hergestellt.

Fig. 11 veranschaulicht die Herstellung und Charakterisierung von pWTiO1 und kann wie folgt ausgewertet werden:

a) pEH5 mit Hinf I und Hpa I digeriert; b) pEH5 mit Hinf I allein digeriert;

c) pWTiO1 mit Hind III digeriert;

d) pWT1O1 mit Hind III und Hpa I digeriert.

Aufbau von ρWT111

Entfernung der dem Tryptophan-Promoter distalen Hind HI-Stelle

Die distale Hind III-Steile wurde durch Spaltung mit Eco RI und anschließender Entfernung von DNS durch Digestion mit Exonuclease III und Sl-Nuclease entfernt. Eine Behandlungsstufe mit DNS-Polymerase I wurde vor dem Verbinden (ligation) ebenfalls einbezogen, um etwaige asymmetrische Enden, die nach der Digestion mit Sl-Nuclease verblieben, auszufüllen.

Digestionszeiten von 1,3 und 5 Minuten wurden gewählt. Die drei DNS-Gemische nach der Restriktion mit Eco RI, Digestion mit Exonuclease III (1, 3 und 5 Minuten), Ausfüllung mit DNS-Polymerase I und Verbindung der stumpfen Enden wurden verwendet, um HB101-Zellen umzuwandeln. Eine doppelte antibiotische Auswahl wurde durch Plattieren auf M9-Salze und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten, die mit Ampicillin-und Tetracyclin ergänzt waren getroffen- Die doppelte Auswahl stellte sicher, daß die ß-Lactamase- und Tetracyclin-Gene intakt blieben.

Zur weiteren Charakterisierung der wahrscheinlichen entfernenden Plasmide (deletants) wurden je zwei Transformanten aus den nach 1 und 5 Minuten erhaltenen Fraktionen und vier aus der nach 3 Minuten erhaltenen Fraktion ausgewählt.

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Charakterisierung der entfernenden Plasmide

Keines der acht Plasmide bildet ein Fragment mit 512 bp, wenn es mit Hind III abgeschnitten wird, und alle wandern zu einer Lage oberhalb des Fragments aus 4,36 kb von pWT1O1 nach Restriktion mit Hind III. Alle Plasmide wurden doppelt mit Hpa I und Pstl digeriert und bildeten so zwei Fragmente, wobei das kleinere dieser Fragmente den in Frage kommenden Bereich überspannt (den Bereich um die Eco RI-Stelle in pWT1O1). Die Größen der in pWTiO1 gebildeten Fragmente betragen 3777 und 1096 bp. Eine Prüfung veranschaulicht eindeutig die Tatsache, daß das letztgenannte Fragment in jedem Fall entfernt ("deleted into") worden war, während das erstere, wie erwartet, unverändert geblieben war. Die Mengen von entfernter DNS reichen von 51 bp in pWT111 (Digestion für 1 Minute mit Exonuclease III) bis 361 bp in pWTi18 (Digestion mit Exonuclease III für 5 Minuten).

Da aus pWT111 die geringste Menge DNS entfernt worden war und der Tetracyclin-Wirkungsgrad von Plattierungs-■ ergebnissen zeigt, daß es bei der Transkription vom Tryptophan-Promoter ebenso wirksam ist wie pWTiO1, wurde es als Hind III-Klonungsvehikel gewählt, das für die Änderung der Translationsphase zu verwenden ist.

Aufbau von pWT121

Um die Phaseneinstellung (phasing) von der Hind HI-Stelle von pWT111 zu verändern, wurde die 5'-Verlängerung mit DNS-Polymerase I ausgefüllt und an Hind III-Linker-INS gebunden, der Restriktion mit Hind III unterworfen, um überschüssiges Bindeglied (linker) zu entfernen und klebrige Enden zu bilden und dann erneut gebunden. Hierdurch wurden 14 bp von DNS zugefügt und der Leserahmen von der neuen Hind HI-Stelle (die alte Stelle ist nun unvollständig) um plus ein Nucleotid verändert.

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Aufbau von pWTi31

Der dritte Leserahmen, d.h. pWT111 plus 2 Nucleotide, wurde durch Wiederholung der gleichen Reihe von Reaktionen an diesem phasenveränderten Plasmid erhalten. Diese Plasmide würden ebenso wie pWT111 kleine Polypeptide bilden, die beim Beginn von trpE anfangen und an den Stopkodonen (in jedem Fall verschiedene), die den Tetracyclin-Genen vorausgehen, enden. Auf Grund der Veränderungen im Leserahmen haben jedoch die Polypeptide sämtlich verschiedene C-endständige Aminosäuresequenzen, obwohl die N-endständigen Aminosäuresequenzen die gleichen sind.

Fig. 12 veranschaulicht die Veränderungen, die während der Phasenänderung von pWT111 zu pWT131 stattfinden. Diese Abbildung kann wie folgt gedeutet werden:

a) pWT111 mit Hha I digeriert;

b) pWTi21 mit Hha I digeriert;

c) pWT131 mit Hha I digeriert.

Herstellung von pWT121/FPV und Testung der Gen-Expression des FPV-HA-Antigens

10 ug pWTi21 wurden mit Hind III grenzdigeriert. Die erhaltenen 5'-endständigen Phosphate der Vektoren wurden durch Behandlung mit 20 ug bakterieller Alkaliphosphatase für 30 Minuten bei 37°C bei einer 25 iil-Inkubation, die 20 mM Tris HCl pH 7,5 und 0,1% (Gew./Vol.) SDS enthielt, entfernt. Nach Extraktion mit Phenol und .Fällung mit Äthanol wurden 0,2 jug DNS an etwa 40 ng FPV-HA-Gen in einer 20 ul-Inkubation gebunden, die 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM ATP und 0,02 Einheiten T₄~DNS-Ligase (New England Biolabs) enthielt. Nach Inkubation über Nacht bei 15°C wurden die Gemische mit TCM (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂) auf 100 ml verdünnt und zum Transfer von mit 200 pl, CaCl₂ behandeltem E. coli k12 HB101 nach einer bekannten Methode verwendet. Die nach 16-stündigem Züchten bei 37°C

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auf L-Agar plus 100 ug/ml Carbenicillin (Pyopen,cC-Carboxybenzylpenicillin) vorhandenen Transformanten wurden auf Resistenz gegen Tetracyclin getestet, indem sie auf Agarplatten, die M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren plus Carbenicillin und Tetracyclin (10 ug/ml) enthielten, aufgebracht wurden.

Testung der Gen-Expression

Flüssige Kulturen (5 ml) einzelner Kolonien wurden in M9-Medium gezüchtet, das, wo angegeben, mit ß-Indolacrylsäure (20 ^ug/ml) oder Tryptophan (100 »ig/ml) ergänzt war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren isoliert, in 0,3 ml kalter 25% (Gew./Vol.) Saccharose/50 mM Tris pH 8 suspendiert und mit 0,1 ml Lysozym (10 mg/ml) inkubiert. In Abständen von 5 Minuten wurden 0,1 ml 0,5 M EDTA und dann 0,5 ml eisgekühlte "Triton"-Lösung zugesetzt. (Die "Triton"-Lösung enthält 60 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8 und 0,1% (Vol./Vol.) "Triton X-100".) Dieses Lysat wurde ohne weitere Behandlung zur Antigen-Testung verwendet.

Die HA-Antigen-Tests wurden in Kulturröhrchen aus PoIystyrol (Nunc Nr. 1410) unter Anwendung einer Antikörper-Sandwich-Methode durchgeführt. Kaninchen-Anti-FPV HA wurde vor dem Gebrauch durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Chromatographxe an DEAE-Cellulose gereinigt und mit 125

J markiert. Die Röhrchen wurden 10 Minuten bei Ra umtemperatur mit 50 jül 0,2M NaHCO₃ pH 9, das 60 pg/ml gereinigtes, nicht markiertes IgG enthielt, abgedeckt, dreimal mit aliquoten Teilen von je 1 ml Waschpuffer gewaschen und dann bei Raumtemperatur entweder mit bekannten Mengen (0,5-5 ng) zerrissenem FPV oder mit den bakteriellen Lysaten inkubiert. Nach 2 Stunden wurden die Röhrchen viermal mit aliquoten Teilen von je 1 ml Waschpuffer gewaschen und abschließend 16 Stunden bei 4 C mit 50 ul

1 ?R

Waschpuffer, der 200.000 cpm ' J-Anti-HA enthielt, inkubiert. Die Röhrchen wurden erneut gewaschen und in einem Packard-/-Zähler gezählt. Das vorhandene Antigen

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wurde aus Standardkurven, die die an die Menge von vorhandenem FPV gebundene Radioaktivität betrafen, quantitativ bestimmt.

Herstellung von nie -Derivaten

Durch Restriktion der drei phasenveränderten pWT-Plasmide und pAT153 sowohl mit Bam HI als auch Pst I werden zwei ι Fragmente aus jedem Plasmid gebildet. Dies ist in Fig. 14 veranschaulicht.

pAT153 bildet Fragmente von 1129 bp und 2529 bp, wobei das letztere größere Fragment das Original enthält, jedoch die nic-Stelle aus ihm entfernt worden ist.

Die pWT-Plasmide bilden sämtlich das gleiche 3233 bp-Fragment, das das Original und die nic-Stelle enthält, aber verschiedene kleinere Fragmente, die die trp-Kontrollelemente enthalten; die Unterschiede ergeben sich aus den Phasenwechsel-Veränderungen an der Hind HI-Stelle.

Die Plasmide wurden der Restriktion mit Pst I und Bam HI und der Elektrophorese an einem 3,5%igen Acrylamidgel unterworfen. Die Banden pATi53 2529 bp, pWTi11 1590 bp, : pWTi21 1604 bp und pWT131 1618 bp wurden ausgeschnitten und aus dem Acrylamid isoliert. Die pAT153-Bande wurde dann unabhängig an die drei pWT-Banden gebunden, und die Ligationsgemische wurden zur Transformation vor E. coli HB1O1-Zellen durch Selektion auf Nähr-Agar, das Carbenicillin in einer Menge von 100yug/ml enthielt, verwendet. Da das pAT153-Fragment nicht in der Lage ist, von sich aus Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin zu verleihen und den pWT-Fragmenten ein Original (origin) fehlt, stellt die Auswahl auf Carbenicillin sicher, daß die erhaltenen rekombinierenden Moleküle diese beiden Fragmente enthalten müssen. Plasmid-Desoxyribonucleinsäuren wurden aus einer Anzahl der Kolonien hergestellt, die auf den Transformationsplatten wuchsen, und diese wurden zur Bestätigung der Anwesenheit der gewünschten Plasmide

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durch Restriktionsanalyse verwendet.

Die folgenden Enzym-Digestionen wurden durchgeführt:

Pst I- und Bam HI-Digestion zur Bildung der gebundenen (ligated) Fragmente: In Fig. 15 sind die Spuren b, c und d Digests von nic~-Derivaten von pWT131, 121 bzw. 111. Die Spur a ist ein Digest von pWT131 und die Spur e ein Digest von pAT153. Wie aus dem Gel ersichtlich ist, haben alle drei nie" trp-Plasmide das pAT153-Fragment von 2529 bp erworben, jedoch halten sie dennoch die ursprünglichen trp-Kontrollfragmente zurück.

Hind III-Digestion zum Nachweis, daß die trp p/o-kontrollierte Expressionsstelle noch funktionell ist: In Fig. sind die Spuren a, b, c und d Digests von pWT231, 221, 211 bzw. 131. Alle drei nic~-Derivate unterliegen der Restriktion mit Hind III und sind als Folge des Fehlens der beiden Hae II-Fragmente kleiner als pWT131.

Hae II-Digestion zum Nachweis, daß die Hae II B- und -H-Fragmente aus dem pBR322-Bereich der Plasmide fehlen: In Fig. 17 sind die Spuren a bis f Digests von pBR322, pAT153, pWT231, 221, 211 bzw. 131. Allen vier nic~- Plasmiden (Spuren b bis e) fehlen zwei Hae II-Fragmente, nämlich das Hae II B-Fragment von 622 bp und das Hae II Η-Fragment von 82 bp von pBR322.

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Iff-

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Claims (25)

VON KREISLER SCXONWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler+ 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF D-5000 KÖLN 1 , 29. Mai 1980 AvK/Ax G.D. Searle & Co., Skokie, Illinois 60076 (U.S.A. Patentansprüche

1. Plasmid mit einer Einfügungsstelle für ein eukaryotisches DNS-Fragment in Nachbarstellung zu einem bakteriell len Promoter und hinter (downstream) einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle und einem Initiatorkodon in einer solchen Weise daß der bakterielle Promoter die Transkription und Translation eines eingefügten DNS-Fragments reguliert und steuert.

2. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 9866 bp; eine Barn I-Stelle 346 bp von der Hind IH-Steile; eine SaI I-Stelle 2 75 bp von der Barn I-Stelle; eine Eco RI-Stelle 3709 bp von der SaI I-Stelle; eine zweite Hind IH-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 305 bp von der zweiten Hind HI-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 1950 bp von der ersten Hind IH-Stelle, wobei das Plasmid den trp-Promotei;, das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hpa I-Stelle und der ersten Hind IH-Stelle enthält; das Gen für Tetracyclin-Resistenz unmittelbar der ersten Hind IH-Stelle folgt und das Gen für

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Telefon: (0221) 131041 - Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Korn

ORIGINAL INSPECTED

Ampicillinresistenz im Teil von 3709 bp zwischen der SaI I-Stelle und der Eco-RI-Stelle liegt und das Plasmid als pEH3 bezeichnet wird.

3. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 9866 bp; eine Barn I-Stelle 346 bp von der Hind Ill-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der _: Barn I-Stelle; eine Eco RI-Stelle 3709 bp von der SaI I-SteHe; eine zweite Hind Ill-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1950 bp von der zweiten Hind Ill-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 305 bp von der ersten Hind Ill-Stelle, wobei das Plasmid den trp-Promoter, das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hind HI-Stelle und der ersten Hpa-I-Steile enthält; das Gen für Tetracyclin-Resistenz unmittelbar der ersten Hind HI-Stelle folgt und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 3709 bp zwischen der Sal I- und der Eco-RI-Stelle liegt und das Plasmid alsä pL ' bezeichnet wird.

4. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch sine Moleküllänge von 6750 bp; eine Hind-III-Steile; eine Barn HI-Stelle 346 bp von der Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle bp von der Barn HI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 4230 bp von der SaI I-Stelle und 1950 bp von der Hind Ill-Stel-Ie, wobei das Plasmid den trp-Promoter, das Ε-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp enthält, der sich zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III-Stelle erstreckt, und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 4800 bp zwischen der Hind Ill-Stelle und der Hpa I-Stelle liegt und das Plasmid als pEH5 bezeichnet v*ird.

5. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4874 bp; eine Eco RI-Stelle; eine Hind III-Steile 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 313 bp von der Hind III-Steile; eine zweite Hind Ill-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine

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Bam I-Stelle 346 bp von der zweiten Hind Ill-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 752 bp von der Eco RI-Stelle, wobei sich das Gen für Tetracyclin-Resistenz vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der Sal-I-Stelle erstreckt; das Gen für Arnpicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle liegt land der geklonte Teil des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der zweiten Hind III-Stelle umfaßt und das Plasmid als pWTiO1 bezeichnet wird.

6. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4823 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind HI-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Barn I-Stelle 346 bp von der Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle; wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der SaI I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des Ε-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III-Stelle umfasst, und das Plasmid als pWTi11 bezeichnet wird.

7. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4837 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind-III-Stelle 206 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 353 bp von der Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der SaI I-Stelle erstreckt; das Gen für AmpicillinResistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons den

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Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des Ε-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind Ill-Stelle umfasst und das Plasmid als pWT12l bezeichnet wird und die Phaseneinstellung (phasing) um 1 bp gegenüber pWT111 geändert ist.

8. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine" Moleküllänge von 4851 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind HI-Stelle 213 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 360 bp von der Hind HI-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Barn I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der SaI I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und dem geklonten Teil des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des Ε-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III-Stelle umfaßt und das Plasmid als pWT131 bezeichnet wird und die Phaseneinstellung um 2 bp gegenüber pWT111 geändert ist.

9. Ein nic~-Derivat eines Plasmids nach Anspruch 1 bis 8.

10. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids nach Anspruch

1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen bakteriellen Promoter in ein isoliertes Plasmid klont, die Lage

der vorgesehenen Einfügungsstelle bestimmt und die Einfügungsstelle schafft, wenn sie nicht bereits vorhanden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pEH3 nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wildstamm von E. coli mit Restriktionsendonuclease Hind III digeriert, das hierbei erhaltene Fragment mit dem linearen Molekül verbindet, das durch die Restriktion des Plasmids pBR322 mit der Restriktionsendonuclease Hind III erhalten worden ist, trpoExy 1 E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und diejenigen Kolonien

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von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Tetracyclin und Tryptophan-Komplementierung zeigen, wobei das Plasmid pEH3 erhalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pEH4 nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wildstamm von E. coli mit Restriktionsendonuclease Hind III digeriert, das hierbei erhaltene Fragment mit dem linearen Molekül verbindet, das durch die Restriktion ί des Plasmids pBR322 mit der Restriktions-Endonuclease Hind III erhalten worden ist. trpoEyi E. coli mit dem erhaltenen Plasmid verbindet und solche Kolonien von E. coli auswählt, die Empfindlichkeit für Tetracyclin und Tryptophan-Ergänzung (complementation) zeigen, um das Plasmid pEH4 zu erhalten.

13. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pEH5 nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man pEH3 mit Restriktions-Endonuclease Eco RI behandelt, das lineare Molekül mit Exonuclease III und Sl-Nuclease digeriert, mit DNS-Polymerase I behandelt, das lineare Molekül mit DNS-Ligase verbindet, trpoEyi E. coli mit dem erhaltenen Plasmid umwandelt und diejenigen Kolonien auswählt, die Tryptophan-Ergänzung (complementation) und Ampicillin- Resistenz zeigen, um das Plasmid pEH5 zu erhalten.

14. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pWTiO1 nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pEH5 mit Restriktions-Endonucl'ease Hinf I vornimmt und hierbei ein Fragment enthält, das den vollständigen Tryptophan-Promoter enthält, und das Fragment in die Hind HI-Stelle des Plasmids pBR322 klont, indem

man die Hinf I-Enden des Fragments mit DNS-Polymerase I behandelt, das Fragment mit Hind III-Bindegliedern (linkers) in Gegenwart von DNS-Ligase behandelt, das angeknüpfte Molekül mit Hind III-Restriktions-Endonuclease behandelt und hierbei ein lineares Molekül mit klebrigen Hind III-Enden bildet, das lineare Molekül in die Hind HI-Stelle des Plasmids pBR322 einbindet,

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E. coli K 12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, und hierbei das Plasmid pWT1O1 erhält.

15. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pWT111 nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWTiO1 mit Restriktions-Endonuclease Eco RI vornimmt, das lineare Molekül mit Exonuclease III und Sl-Nuclease digeriert, mit DNS-Polymerase I behandelt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K12 HB1O1 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, wobei man das Plasmid pWT111 erhält.

16. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pWT121 gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWTi11 mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül mit DNS-Polymerase I behandelt, mit Hind III-linker-DNS einbindet, eine Restriktion mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K 12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, wobei man das Plasmid pWT121 erhält.

17. Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von pWT131 gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWTi21 mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül mit DNS-Polymerase I behandelt, mit Hind III-linker-DNS verbindet, Restriktion mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K12 HB1O1 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert, diejnigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, und hierbei das Plasmid PWT131 erhält. ■ -- -

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18. Verfahren zur Herstellung eines nic~-Derivats nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder die nic-Stelle von einem Plasmid entfernt oder ein Plasmid so aufbaut, daß die nic-Stelle nicht vorhanden ist.

19. Plasmid nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß an der Einfügungsstelle ein eukaryotisches DNS-Fragment eingefügt worden ist.

20. Plasmid pWT121/FPV nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 6532 bp; eine Hind III-Stelle; eine Sma I-Stelle 365 bp von der Hind HI-Stelle; eine Eco RI-Stelle 910 bp von der Sma I-Stelle; eine zweite Hind HI-Stelle 460 bp von der Eco RI-Stelle, eine Barn HI-Stelle 353 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine SaI I-Stelle 275 bp von der Barn HI-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der SaI I-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1045 bp von der Pst I-Stelle und 206 bp von der ersten Hind HI-Stelle; wobeIVdas FPV-Hämagglutiningen im Teil von 1735 bp zwischen der ersten und der zweiten Hind HI-Stelle liegt; das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich von der zweiten Hind III-Stelle bis jenseits der Barn HI-Stelle erstreckt und das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle liegt.

21. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein eukaryotisches DNS-Fragment an der Einfügungsstelle eines Plasmids nach Anspruch 1 bis 9 einfügt.

22. Verfahren nach Anspruch 21 zur Herstellung des Plasmids pWT121/FPV nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Restriktion des Plasmids pWT121 mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt und das lineare Molekül wahlweise mit Alkaliphosphatase behandelt, Hind III-Bindeglieder (linkers) mit den Enden des FPV-Gens verbindet, das dann mit Restriktions-Endonuclease Hind III behandelt wdjrd, und das behandelte FPV-Gen mit dem

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aus pWT121 durch Hind III-Restriktion erhaltenen linearen Molekül verbindet.

23. Umwandelbare Zelle, in die in Pläsmid nach Anspruch 19 oder 20 eingefügt worden ist.

24. Verfahren zur Umwandlung (transformation) einer umwandelbaren Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid nach Anspruch 19 oder 20 in die Zelle einfügt.

25. Verfahren zur Expression eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle nach Anspruch 23 kultiviert.

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