DE68920335T2 - In vitro-verpackungsvorrichtung um dna-fragmente von 95-kb zu klonen. - Google Patents
In vitro-verpackungsvorrichtung um dna-fragmente von 95-kb zu klonen.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf ein System zum Klonieren von DNA-Fragmenten und genauer auf ein in-vitro"headful"-Verpacken des P1-Bakteriophagen und das Klonieren bis 95 kb großer DNA- Fragmente. Die Verstärkung klonierter DNA kann ebenfalls kontrolliert werden.
- Die Technologie rekombinanter DNA hat es möglich gemacht, DNA- Fragmente aus den Chromosomen hoher Eukaryonten (Pflanzen und Tiere) mittels Vektoren, die in Bakterien vermehrt werden können, wie etwa Escherichia coli (E. coli), zu klonieren und zu verstärken.
- Falls DNA direkt in Bakterien eingeführt werden soll, die für diese Aufnahme kompetent gemacht worden sind, dann muß die DNA verhältnismäßig klein sein (weniger als 20 kb), da die Wirksamkeit der DNA-Aufnahme in die Zellen dramatisch abnimmt, wenn die Größe der DNA über 20 kb zunimmt. Demgemäß sind alternative Zuführungswege gesucht worden, um große DNA in Bakterien einzuführen. Die Technik des Verpackens von Bakteriophagen-Vektor- DNA in Virusteilchen wurde entwickelt, um diesem Bedürfnis zu entsprechen. Sie hat den Vorteil des Zuführens der verpackten DNA in Zellen durch Infektion mit einer Wirksankeit von nahezu eins. Bruning et al., Gene 4, 85-107 (1978) und Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 4242-4246 (1978), zogen aus der invitro-Verpackungsreaktion von Lambda-Bakteriophagen Nutzen, die von Sternberg et al., Gene 1, 255-280 (1975), zum Verpacken großer Inserts entwickelt wurde, welche in Cosmidvektoren kloniert waren, die Fusionen eines Plasmids und einer Lambda-Bakteriophagen-cos-Stelle sind. Die cos-Stelle liefert das Erkennungselement, das zum Auslösen des DNA-Verpackens in einen Lambda-Bakteriophagenkopf benötigt wird.
- Der Hauptnachteil der in-vitro-Verpackungsreaktion des Lambda- Bakteriophagen ist, daß der Lambda-Bakteriophagenkopf nicht mehr als 49,5 kb DNA unterbringen kann. Somit kann unter der Annahme, daß der cos-Vektor selbst etwa 2 kb groß ist, nicht mehr als 47 kb klonierbare DNA in den Vektor eingeführt und in den Lambda- Bakteriophagenkopf verpackt werden. (Murray, Lambda II 236, 395- 432, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1986).
- Dementsprechend kann der Lambda-Phage nicht zum Klonieren von größeren Genen als 50 kb verwendet werden und das Kartieren von DNA-Chromosomensegmenten, die mehrere Megabasen groß sind, durch "Walking"- oder "Jumping"-Vorschriften ist in Anbetracht der Einschränkungen des Lambda-Bakteriophagensystems schwierig. Die Forscher haben zwei Systeme als mögliche Werkzeuge zum Klonieren großer DNA-Fragmente erforscht: Phagensysteme mit Kopfgrößen größer als der Lambda-Bakteriophage und Hefeklonierungsvektoren.
- Rao et al., J. Mol. Biol. 185, 565-578 (1985), zeigten, daß T4- DNA (etwa 165 Kilobasen) in vitro in T4-Bakteriophagenköpfe verpackt werden kann. Die Wirksamkeit dieser Reaktion beträgt 10&sup4;-10&sup5; plaquebildende Einheiten (PFU) je Mikrogramm zugesetzter T4-DNA. Black, Gene 46, 97-101 (1986), zeigte jedoch, daß Anstrengungen zum Verpacken von verschiedenen Arten Vektor-DNA in T4-Köpfe und Isolieren dieser DNA auf die Injektion in geeignete Bakterien folgend nicht wirksamer als 10²-10³ PFU je Mikrogramm zugesetzter DNA war. Blacks Ergebnis legt nahe, daß es schwierig sein kann, das T4-Verpackungssystem zum Erzeugen einer vollständigen Bank von 150 kb-Inserts eines komplexen Genoms, wie etwa das von Säugerzellen (d.h. das Äquivalent von etwa 20000 Inserts mit 150 kb), zu verwenden. Ein zweites und vielleicht schwierigeres Problem ist die Abwesenheit eines Klonierungsvektors, der aus der Fähigkeit der T4-Verpackung, große DNA- Fragmente zu klonieren und verstärken, Nutzen ziehen kann. Da sehr wenig über die T4-Sequenzen bekannt ist, die zum Auslösen des T4-Verpackens benötigt werden, kann es tatsächlich schwierig sein, einen derartigen Vektor aufzubauen.
- Burke et al., Science 236, 806-812 (1987), konnten große Segmente von Säuger-DNA als Mikrochromosomen in Hefe klonieren. Die zu insertierende DNA wird in einen Vektor kloniert, der ein Hefevermehrendes Element, ein Hefe-teilendes Element oder Zentromer und Hefe-Telomere enthält und die sich daraus ergebende chimäre DNA wird durch direkte DNA-Transformation in Hefe eingeführt. Minichromosomen mit größeren DNA-Inserts als 100 kb wurden nachgewiesen. Es gibt mit diesem System zwei Probleme. Zuerst werden Hefeklone mit DNA-Inserts sehr unwirksam erzeugt; bei den vorstehend beschriebenen Versuchen wurden etwa 300 Klone je Mikrogramm Insert-DNA erzeugt. Sobald zweitens Klone mit DNA-Inserts zur Verfügung stehen, ist es schwierig, die Insert-DNA zu untersuchen und zu isolieren. In transformierten Hefezellen stellen Minichromosomen weniger als 1:200 der gesamten DNA der Zelle dar und können folglich nur durch DNA-Hybridisierungstechniken nachgewiesen werden. Weiterhin können die Inserts innerhalb jeder transformierten Zelle nicht verstärkt werden. Segmente des Inserts können durch Subklonieren in Plasmide und Zurückholen in Bakterien gewonnen werden.
- Ein weiteres System von Interesse wird von Gaitanaies et al., Gene 46, 1-11 (1986) beschrieben. Ein Lambda-Vektor wird beschrieben, in den DNA inseriert werden kann, die anschließend in Zellen injiziert werden kann. Die injizierte DNA wird in den Zellen entweder als eine Kopie je Zelle im Wirtschromosom eingeschlossen oder außerhalb der Chromosomen zu mehrfachen Kopien je Zelle erhalten. Obschon dieser Vektor weniger als 30 kb DNA aufnehmen kann, kann die DNA-Menge in dem integrierten Prophagen durch homologe Rekombination mit einer zweiten infizierenden Lambda-Chimäre, deren Insert mit dem in dem integrierten Prophagen überlappt, bedeutend erhöht werden. Auf diese Weise kann das Segment der benachbarten DNA in jedem Prophagen auf mehr als 100 kb erhöht und anschließend durch Auslösen des extrachromosalen Zustands des Vektors verstärkt werden. Um dies zu bewerkstelligen, muß man jedoch wenigstens mehrere benachbarte und sich überlappende, kleinere DNA-Segmente kloniert haben und ein mühsames Verfahren zu ihrem Aneinanderreihen durch Rekombination durchführen. Weiterhin ist es schwierig, das große DNA-Insert zu isolieren, sobald es einmal aufgebaut ist, da es zu groß ist, um in ein Lambda-Virusteilchen verpackt zu werden. Die direkte Isolierung der DNA in ihrem extrachromosomalen Zustand kann wegen ihrer großen Größe ebenfalls schwierig sein.
- Kürzlich gab Blumenthal, Focus, Seite 41-64, Bd. 11, Nr. 3 (Sommer 1989) einen Überblick über einige der Schwierigkeiten, die das Klonieren und die Restriktion methylierter DNA in E. coli betreffen. Die auf Seite 45 vorgeschlagene Abhilfe ist, daß ein derartiges Klonieren (methylierter DNA) in einem Wirt ausgeführt werden sollte, dem die drei bekannten methylierungsabhängigen Restriktionssysteme einschließlich beider Bestandteile des McrB-Systems fehlen.
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum in-vitro-"headful"-Verpacken und Klonieren bis 95 kb großer Fremd-DNA-Fragmente, welches das
- (a) Modifizieren von Vektor-DNA durch Inserieren eines stuffer- Fragments, wobei das "headful"-Verpacken beendet wird, in eine ein stumpfes Ende erzeugende Stelle, die einer Bakteriophage-P1-Pac-Stelle nahe liegt, worin das stuffer-Fragment in der Weise ausgerichtet ist, daß sich die das stumpfe Ende erzeugende Stelle etwa zwei Kilobasen von einer pac-Stelle in Richtung des Uhrzeigerlaufs befindet;
- (b) Verdauen des Produkts aus Schritt (a) unter Erzeugen zweier Vektorarme, von denen jeder (i) ein stumpfes Ende, (ii) ein weiteres Ende, das mit dem Fremd-DNA-Fragment verträglich ist, das kloniert werden soll, und (iii) eine loxP-Stelle enthält;
- (c) Ligieren der Fremd-DNA an das Produkt von Schritt (b) ohne Erzeugen von Konkatemeren;
- (d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) mit zur pac-Spaltung befähigtem Extrakt und Kopf-Schwanz-fähiger Extrakt, wobei das Verhältnis von großen Köpfen zu kleinen Köpfen im Kopf-Schwanz-Extrakt mindestens 5:1 beträgt;
- (e) Infizieren eines Cre&spplus;-Bakterienstammes mit dem Produkt von Schritt (d) und das
- (f) Gewinnen der klonierten DNA umfaßt.
- Diese Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Klonieren und Steuern der Verstärkung von DNA-Fragmenten, welches das
- (a) Inserieren eines exogenen DNA-Fragments in den Vektor der Ansprüche 12 oder 13;
- (b) Zusammenbringen des Produkts von Schritt (a) mit zur pac- Spaltung befähigtem Extrakt und Kopf-Schwanz-fähigem Extrakt;
- (c) Infizieren eines gramnegativen Cre&spplus;-Bakterienstammes mit dem Produkt von Schritt (b);
- (d) Dereprimieren des lacIq-Repressors durch Hinzufügen von IPTG zu dem Produkt von Schritt (c) und
- (e) Isolieren der klonierten und verstärkten DNA
- umfaßt.
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung zum Klonieren bis zu 95 kb großer Fremd-DNA-Fragmente brauchbare Vektoren.
- Lysogene zum Herstellen zur pac-Spaltung befähigter Extrakte und Kopf-Schwanz-fähiger Extrakte stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
- BS591, NS2974 und NS3145 bezeichnete, gramnegative Cre&spplus;-Bakterienstämme wurden zum infiziert und transformiert werden durch die Vektoren dieser Erfindung besonders aufgebaut. BS591 besitzt kein lacIq-Repressorgen. Andererseits besitzen NS2974 und NS3145 ein lacIq-Repressorgen und können auf diese Weise, sobald sie transformiert sind, den lac-Promotor reprimieren bis IPTG zugesetzt wird.
- Figur 1 veranschaulicht allgemein das P1-Bakteriophagen-Klonierungs- und -Verstärkungssystem.
- Figur 2 stellt die Karte der P1-Gene und die zur Erfindung gehörenden Elemente dar.
- Figur 3 veranschaulicht den Aufbau der Vektoren der vorliegenden Erfindung.
- Figur 4 veranschaulicht den Aufbau der Vektoren pNS582tet14 und pNS582tet15Ad10.
- Figur 5A veranschaulicht, daß das 600 bp-delta-3-pac-Fragment an beiden Enden mit gamma³²P-dATP markiert war.
- Figur 5B veranschaulicht die pac-Spaltungsaktivität der pcp&spplus;- Verpackungsextrakte.
- Figur 6A veranschaulicht die Trennung der pNS358-DNA, wenn Cre- Rekombinase darauf einwirkt.
- Figur 6B veranschaulicht, daß auf Vektor-DNA in transformierten BS591-Bakterien Cre einwirkt.
- Figur 7A veranschaulicht die Verstärkung von Plasmid pNS364. Fig. 7B veranschaulicht die Erweiterung des Plasmids pNS364, welches das kan-R-Gen, ein P1-Plasmid-Replikon und ein lytisches P1-Replikon enthält.
- Figur 8A-8C und 9A-9B veranschaulichen die Isolierung und Charakterisierung der verpackten pNS358-DNA und des E. coli-Inserts, das sie enthält.
- Figur 10 veranschaulicht die Isolierung größenfraktionierter Human-Insert-DNA durch Sucrosegradienten.
- Figur 11 veranschaulicht die Isolierung und Charakterisierung der verpackten pNS582tet14-DNA und Human-DNA-Inserts, welche sie enthält.
- Figur 12 veranschaulicht die Ligierungsprodukte, die erzeugt werden, wenn Human-DNA-Inserts entweder mit pNS582tet14-Vektor- DNA oder den Armen von pNS582tet14Ad10-Vektor-DNA ligiert wird.
- Figur 13A veranschaulicht die Isolierung und Charakterisierung der verpackten pNS582tet14Ad10-DNA und Human-DNA-Inserts, welche sie enthält. Die DNA-Banden wurden durch Ethidiumbromid-Anfärbung nachgewiesen.
- Figur 13B ist dasselbe wie 13A, außer daß die Banden durch Hybridisierung mit einer Human-Genom-DNA-Sonde nachgewiesen wurden.
- Die folgenden, sich auf die Erfindung beziehenden Bakterien und Plasmide sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
- pNS20 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 67666 zuerkannt.
- pNS42 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 67667 zuerkannt.
- BS591 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 53760 zuerkannt.
- NS2961 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 67665 zuerkannt.
- NS2962 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 67664 zuerkannt.
- NS2974 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 53759 zuerkannt.
- NS3208 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 68073 zuerkannt.
- NS3210 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 68074 zuerkannt.
- NS3145 wurde die ATCC Zugangsnummer Nr. 68072 zuerkannt.
- Der Ausdruck pac ist ein allgemeiner Name, der sich auf die zum Auslösen der DNA-Verpackung benötigte Stelle bezieht.
- Der zur pac-Spaltung befähigte Extrakt enthält die zum Spalten der pac-Stelle und damit Auslösen des Verpackens notwendigen Erkennungsproteine.
- Der Kopf-Schwanz-fähige Extrakt enthält die zum Verpacken der klonierten DNA in ein Virusteilchen benötigten Köpfe und Schwänze.
- Der Ausdruck Konkatemer bedeutet ein DNA-Molekül, das aus sich wiederholenden, in einer Kopf-Schwanz-Stellung angeordneten Einheiten besteht.
- Der Ausdruck stuffer-Fragment bezieht sich auf ein DNA-Fragment, das an einer einzigen Stelle in die Vektor-DNA inseriert wird und innerhalb deren das "headful"-Verpacken beendet wird.
- Die Ausdrücke Bakteriophage und Phage werden hierin untereinander austauschbar verwendet.
- Das hierin beschriebene Klonierungssystem benützt ein in-vitro- "headful"-Verpackungssystem zum Klonieren bis zu 95 kb großer Fremd-DNA-Fragmente, welches das Isolieren von DNA-Fragmenten gestattet, die wenigstens zwei Mal so groß wie diejenigen sind, die durch Lambda-Cosmid-Klonieren erhalten werden können. Dieses erhöhte Kloniervermögen besitzt den folgenden Nutzen:
- (1) Gene im Größenbereich von 45-95 kb und besonders im Größenbereich von 70-95 kb können nun direkt kloniert werden und Gene im Größenbereich von 25-45 kb können leichter kloniert werden.
- (2) Techniken des Chromosomen-"walking" und "jumping" können um wenigstens den Faktor zwei beschleunigt werden und sollten wegen der verringerten Zahl angrenzender Segmente, die miteinander verknüpft werden müssen, genauer sein.
- (3) Das Klonierungssystem der Erfindung ist als Mittel zum wirksamen Zuführen von DNA an Bakterien nützlich, die sonst DNA nicht gut aus Lösung aufnehmen.
- Insbesondere umfaßt das "headful"-Verpackungssystem dieser Erfindung zum Klonieren bis zu 95 kb großer Fremd-DNA-Fragmente das
- (a) Modifizieren von Vektor-DNA durch Inserieren eines stuffer- Fragments, in eine ein stumpfes Ende erzeugende Stelle, die einer pac-Stelle nahe liegt;
- (b) Verdauen des Produkts aus Schritt (a) unter Erzeugen zweier Vektorarme, von denen jeder (i) ein stumpfes Ende, (ii) ein weiteres Ende, das mit dem Fremd-DNA-Fragment verträglich ist, das kloniert werden soll, und (iii) eine loxP-Stelle enthält;
- (c) Ligieren der Fremd-DNA an das Produkt von Schritt (b) ohne Erzeugen von Konkatemeren;
- (d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) mit zur pac-Spaltung befähigtem Extrakt und Kopf-Schwanz-fähiger Extrakt, wobei das Verhältnis von großen Köpfen zu kleinen Köpfen im Kopf- Schwanz-Extrakt mindestens 5:1 beträgt;
- (e) Infizieren eines Cre&spplus;-Bakterienstammes mit dem Produkt von Schritt (d) und das
- (f) Gewinnen der klonierten DNA.
- Obschon sich viele hierin beschriebene Elemente auf das P1- Bakteriophagen-Klonierungssystem beziehen, erkennt der Fachmann, daß mit Ausnahme der zum DNA-Verpacken benötigten Bestandteile (pac und Verpackungsextrakte) viele der nachstehend erörterten Elemente, wie etwa das lox-Cre-Rekombinationssystem, Plasmid- Replikon und ein Multikopien- oder lytisches Replikon, sich auf die Isolierung der verpackten DNA beziehen und zum Isolieren von DNA in Bakterien wie etwa E. coli mit anderen Klonierungssystemen, z.B. Bakteriophage, Hefe usw., verwendet werden können.
- Bakteriophagen, die zum Ausüben der Erfindung geeignet sind, müssen ein großes Fassungsvermögen des Kopfes besitzen und die zum DNA-Verpacken notwendigen Elemente müssen definiert sein. Zum Beispiel sind für die Phagen P22 und T1, die das "headful"- Verpacken benützen, die notwendigen Verpackungselemente definiert. P22 und T1 besitzen jedoch kein sehr großes Fassungsvermögen des Kopfes. Andererseits sind für den Phagen T4, der ein großes Fassungsvermögen des Kopfes besitzt, die notwendigen Verpackungselemente nicht definiert.
- Die zum DNA-Verpacken (d.h. ein in-vitro-"headful"-Verpackungssystem) notwendigen Elemente sind die folgenden:
- (1) eine einzige Stelle, pac, die durch Erkennungsproteine gespalten wird; es ist der zur pac-Spaltung befähigte Extrakt, der die zum Spalten der pac-Stelle notwendigen Erkennungsproteine enthält; und
- (2) leere Phagenköpfe, in welche die DNA verpackt wird, bis der Kopf vollständig gefüllt worden ist, dann wird ein Spaltungsereignis ausgelöst (der "headful"-Schnitt), der die verpackte DNA von den restlichen Bestandteilen trennt; es ist der Kopf- Schwanz-fähige Extrakt, der die zum Verpacken der klonierten DNA in das Virusteilchen benötigten Köpfe und Schwänze enthält.
- Obschon das Auslösen des Verpackens ortsspezifisch ist (die Spaltung der pac-Stelle löst das Verpacken aus), ist das Beenden des Verpackens nicht ortsspezifisch. Mit anderen Worten wird keine einzige Stelle erkannt, da das Verpacken an jedem Punkt, an dem der Kopf gefüllt worden ist, beendet wird.
- Im Fall von P1 ist das bei der Verpackungsreaktion während des Lebenszyklus des Virus verwendete DNA-Substrat ein Konkatemer, das aus einzelnen, Kopf-Schwanz-weise angeordneten Einheiten des P1-Chromosoms besteht. Das "headful"-Verpacken mittels entweder des Phagen P1 oder irgendeines anderen Phagen ist ein Vier- Schritt-Verfahren: (1) im ersten Schritt wird eine einzige Stelle, pac, erkannt und durch die pac-Erkennungsproteine (PRP) gespalten; (2) DNA auf einer Seite der Spaltung wird in einen leeren Phagenkopf verpackt, bis der Kopf vollständig gefüllt worden ist; (3) ein zweites Spaltungsereignis wird anschließend ausgelöst (der "headful"-Schnitt), das die verpackte DNA vom Rest des Konkatemers abtrennt, und (4) Auslösung einer zweiten Runde DNA-Verpackens von dem durch den vorherigen "headful"- Schnitt erzeugten freien Ende aus -- daher der Ausdruck fortschreitendes "headful"-Schneiden. Falls jedoch kein Konkatemer erzeugt wird, dann tritt kein fortschreitendes "headful"-Verpacken auf. Sternberg et al., J. Mol. Biol. 194, 469-479 (1987) haben das Klonieren einer 161 bp-Sequenz beschrieben, die eine vollständig funktionsfähige pac-Stelle enthält. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, daß pac-Erkennung und Spaltung in Abwesenheit von Phagenköpfen und -schwänzen auftreten können und durch Mutanten im P1-Gen 9 nicht-funktionsfähig gemacht werden (siehe Figur 2).
- Die Enden der verpackten P1-DNA enthalten keine komplementären einzelsträngigen Sequenzen wie die Enden der verpackten Lambda- Bakteriophagen-DNA und nachdem P1-DNA in ein Bakterium injiziert worden ist, erfolgt demzufolge seine Cyclisierung nicht durch Strangpaarung sondern vielmehr durch Rekombination zwischen homologen Sequenzen, die an den Molekülenden vorhanden sind. Wegen dieses Umstandes muß jeder Vektor, der das P1-Verpacken benützt, und schließlich jeder Mechanismus des "headful"-Verpackens, ein Mittel zum Cyclisieren der linearen verpackten DNA durch Rekombination vorsehen. Bei dieser Erfindung wurde das Cyclisieren durch Einbauen von loxP-Stellen in den Vektor und Verwenden von Cre-Rekombinase zum Cyclisieren der DNA nach der Injektion in gramnegative cre&spplus;-Bakterienstämme bewerkstelligt (siehe unten).
- P1 erzeugt zwei Größen Köpfe, einen großen Kopf, der 105-110 kb DNA aufnehmen kann und einen kleineren Kopf, der nicht mehr als 45 kb DNA aufnehmen kann. Normalerweise beträgt das Verhältnis von großen zu kleinen Köpfen bei einer Wildtyp-P1-Infektion 10:1, jedoch ist bei der zum Herstellen einiger hierin beschriebener Verpackungslysate verwendeten cm-2-Mutante von P1 das Kopfgrößenverhältnis 1:1. Das aus der cm-Mutanten von P1 hergestellte Kopf-Schwanz-Verpackungslysat enthielt das übliche Verhältnis großer zu kleiner Köpfe, das etwa 10:1 betrug. Dies ist das zum Herstellen von Kopf-Schwanz-Verpackungen bevorzugte Lysat. Um das DNA-Verpacken ausschließlich in die großen Phagenköpfe sicherzustellen, muß die DNA größer sein als diejenige, welche von den kleinen Köpfen aufgenommen werden kann.
- Es wird allgemein gewunscht, daß ein großer Überschuß großer Köpfe besteht. Das Verhältnis großer Köpfe zu kleinen Köpfen sollte jedoch nicht unter ein Verhältnis von etwa 5:1 fallen.
- Dies ist ein ortsspezifisches Rekombinationssystem, das aus einer 34 bp-Stelle oder DNA-Sequenz (loxP), an der eine Rekombination sehr wirkungsvoll erfolgt, und einem Proteinenzym (Cre) besteht, das mit der Stelle in Berührung steht und die Rekombination fördert. Abremski et al., Cell, 32, 1301-1311 (1983), zeigten, daß die Rekombination zwischen loxP-Stellen auf superhelicaler, einen Einzelstrangbruch enthaltender kreisförmiger oder linearer DNA in Anwesenheit von Cre auftrat. Im P1-Lebenszyklus kann Cre die Rekombination zwischen loxP-Stellen fördern, die etwa 100 kb auseinanderliegen. Das cre-Gen ist in einen Lambda-Vektor kloniert worden, der Cre exprimiert, wenn er als Lambda-p1:cre-Prophage im E. coli-Chromosom vorliegt. Sternberg et al., J. Mol. Biol. 187, 197-212, 1986, beschreiben die Mutante pHR103, die das funktionelle cre-Gen enthält, aus welchem der Prophage aufgebaut wurde.
- Viele der hier beschriebenen Elemente, wie etwa das lox-Cre- Rekombinationssystem, das P1-Plasmid-Replikon und das lytische P1-Replikon sind auch kürzlich im einzelnen in Übersicht dargestellt worden (Yarmolinski & Sternberg, The Bacteriophage, Bacteriophage P1, Kapitel 9, 1988, Plenum Publishing Corporation, 233 Spring St., New York, NY). Eine P1-Genkarte und das loxP-Cre-Rekombinationssystem, das P1-Plasmidreplikon, das lytische P1-Replikon und die pac-Stelle werden in Figur 2 dargestellt.
- Der Bakteriophage P1 kann seine DNA in eine Vielfalt gramnegativer Bakterien aufnehmen und injizieren, die sonst DNA nicht wirksam aufnehmen können. Eine Tabelle von Bakterienstämmen, in die P1-Virionen aufgenommen und injiziert werden können, wird in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 P1-Wirtsbereich Bakterium P1-DNA-Injektion P1-Phagen-Produktion Escherichia coli K12,C,B Shigella dysenteriae Shigella flexneri Salmonella typhimurium Salmonella typhi & abony Klebsielle aerogenes Klebsielle pneumoniae Citrobacter freundii Serratia marcescens Enterobacter aerogenes Enterobacter liquefaciens & cloacae Erwinia carotovora Erwinia amylovora Yersinia pestis & pseudotuberculosis Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas amyloderamosa Flavobacterium sp. M64 Argobacterium tumefaciens Acetobacter suboxydans Alcaligenes faecalis Myxococcus xanthus
- Ebenfalls tabelliert ist die Fähigkeit von P1 zum Produzieren von Bakteriophagen in diesen Stämmen. Mit der Fähigkeit, DNA in vitro in P1-Phagen zu verpacken, sollte es möglich sein, DNA aus einem dieser Bakterien direkt in einen Verpackungsvektor zu klonieren, diese DNA in P1-Virionen zu verpacken und sie anschließend in diese Bakterien, die zur P1-Injektion befähigt sind, zurück zu injizieren. Dies kann alles ohne Replizieren des DNA-Inserts in E. coli durchgeführt werden, was sie das Methylierungsmuster verlieren ließe, das sie vor den Restriktionsenzymen schützt, wenn sie in ihren Ursprungswirt eintritt.
- Die E. coli-Stämme DH5 delta-lacU169, W3350, NS439, N99, JM101, JM109, 594 und YMC oder Derivate derselben können als Wirte für Plasmide und den Phagen P1 dienen. DH5 delta-lacU169 wurde von Dr. Michael Berman, Litton Bionetics, erhalten und war ein DH5- Derivat, eine DH1-Variante, die von Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983), beschrieben wurde. BS591 war DH5 delta-lacU169 (nachfolgend DH5 genannt) mit einem Lambda-imm434-P1-Prophagen, der aus einer pRH103-Mutante aufgebaut war, die das Cre-Gen enthielt. Die pRH103-Mutante wurde von Sternberg et al. in J. Mol. Biol. 187, 197-212 (1986), beschrieben. BS591 enthält kein lacIq-Repressorgen und es besitzt den Genotyp recA&supmin; hsdM&spplus; hsdR&supmin; mcrA&spplus; mcrB&spplus;. JM101 und JM109 wurden von New England Biolabs, Beverly, MA 01915 erhalten und wurden von Yanish-Perron et al. in Gene 33, 102-119 (1985), beschrieben. NS2974 war JM109 und besitzt einen Lambda-imm434-P1-Prophagen, der ein funktionelles Cre-Gen und einen lacIq-Repressor enthält. Der Genotyp von NS2974 ist recA&supmin; hsdM&spplus; hsdR&supmin; mcrAB&spplus; (mcrA&spplus;, mcrB&spplus;). Die Stämme 594 und W3350 wurden von Campbell et al., Carnegie Institute of Wash. Yearbook 57, 386 (1987), beschrieben; YMC wurde von Dennert et al., J. Mol. Biol. 33, 322-329 (1968), beschrieben, N99 wurde von Shimada et al., J. Mol. Biol. 93, 483-503 (1972), beschrieben. Der Genotyp von N99 ist recD&spplus; hsdR&spplus; hsdM&spplus; mcrA&spplus; mcrB&spplus;. NS439 war der Stamm YMC mit einer trpE 5947-Mutation. NS3067 war NS439 und besitzt einen Lambda-imm434-P1-Prophagen mit einem funktionellen cre-Gen. Medien (d.h. L-Brühe und L-amp-Agar) zum Bakterienwachstum wurden in Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972) beschrieben.
- NS3145 wurde ausgehend von Stamm NM554 (von New England Biolabs erhalten) aufgebaut. NM554 besitzt den Genotyp recA&supmin; hsdM&spplus; hsdR&supmin; mcrA&supmin; mcrB&supmin;. Ein F'lacIq-Plasmid wurde zuerst in diesen Stamm durch in Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972) beschriebenes konjugatives Paaren transferiert und der sich daraus ergebende Stamm (NS3100) wurde anschließend mit dem Lambda-Immunität-434- P1-Cre-enthaltenden Prophagen injiziert. Lysogene wurden wie in Sternberg, Virology, Seite 129-142, Bd. 96 (1979), beschrieben ausgewählt und eines dieser Lysogene wurde NS3145 bezeichnet.
- Die Manipulation des P1-Phagen (P1 Bakteriophage, P1) einschließlich der Herstellung von Phagenlysaten, das Herstellen genetischer Phagenkreuzungen, Ausführen von Phagenkomplementierungstests und das Zustandebringen der Phagenlysogenierung wurden von Sternberg et al. in J. Mol. Biol. 187, 197-212 (1986), und von Sternberg et al. in J. Mol. Biol. 194, 453-468 (1987), beschrieben.
- Kleinere Plasmid-DNA als 20 kb wurde aus E. coli gemäß (1), dem von Holmes & Quigley in Anal. Biochem. 114, 143-197 (1981) beschriebenen raschen Verfahren (nachstehend als rasche Plasmidherstellung), oder (2) dem von Godson und Vapnek, BMA 299, 516- 522 (1973), beschriebenen Cesiumchlorid-Dichtegradientenverfahren hergestellt. Größere Plasmid-DNA als 20 kb wurde durch das Verfahren von Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), hergestellt. Zell-DNA wurde aus E. coli wie von Sternberg et al., J. Mol. Biol. 194, 469-479 (1987), beschrieben isoliert. Zum Halten der DNA-Größe über 200 kb ließ man V6rsicht walten, um während des Isolierungsverfahrens Scherkräfte zu vermeiden. Die Pulsfeld-Agarosegelelektrophorese wurde wie von Carle et al., Science 232, 65-68 (1986), beschrieben durchgeführt. Die Restriktionsenzymverdauung von DNA und die DNA-Ligierung mit T4-DNA-Ligase sollten wie vom Vertreiber, der in unserem Fall New England Biolabs war, angegeben ausgeführt werden. Alle anderen Verfahren zum Manipulieren von DNA wurden von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Cold Spring Harbor, NY 1982) beschrieben.
- Die menschliche Lymphoblastoidenzellinie 697 (Kaplan et al., BBRC, Seite 1275-1282, Bd. 159 (1989)) wurde als DNA-Quelle verwendet. Diese DNA wurde folgendermaßen hergestellt: in Suspensionskultur wachsende Zellen wurden durch Zentrifugieren (4000 Upm in einem RT6000 Rotor) gesammelt, ein Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und ein zweites Mal mit 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl gewaschen. Die Zellen wurden anschließend in 2 ml des letzteren Puffers erneut suspendiert und die folgenden Bestandteile wurden zugesetzt: Proteinase K zu 1 mg/ml, EDTA zu 120 mM, SDS zu 0,5% und Wasser, um das Volumen auf 4 ml zu bringen. Die Suspension wurde anschließend 2 Stunden bei 50ºC inkubiert und anschließend zuerst mit 4 ml Phenol und anschließend mit 4 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, wobei die wäßrige Schicht jedesmal aufgehoben wurde. Die wäßrige Schicht wurde anschließend gegen 4 Wechsel von jeweils 1 Liter 10 mM Tris-HCl pH 8,0 - 1 mM EDTA bei 4ºC dialysiert. Jeder Wechsel wurde 8 Stunden dialysiert.
- 10 ug dialysierte DNA mit hohem Molekulargewicht wurde 12 Stunden bei 4ºC unter gelindem Rühren in 100 ul 1x Restriktionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl), ohne Mg&spplus;&spplus;, mit Rinderserumalbumin (100 ug/ml) und mit 1-10 Einheiten Restriktionsenzym (BamHI oder Sau3AI) inkubiert. Diese Mg&spplus;&spplus;-arme Inkubation war zum Sicherstellen eines gleichförmigen Mischens der viskosen DNA mit Enzym vor Beginn der Reaktion bestimmt. 10 ul einer 100 mM MgCl&sub2;-Lösung wurden anschließend jedem Reaktionsröhrchen zugesetzt, der Inhalt der Röhrchen wurde mit einer Pipettenspitze gelinde vermischt und die Röhrchen wurden sofort bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden nach 5 Minuten durch Zusetzen von 10 ul einer Lösung von 200 mM EDTA zu den Röhrchen und ihr Abstellen bei 4ºC abgebrochen. Proben von etwa 5 ul wurden jedem Röhrchen entnommen und der Feldinversions-Gelelektrophorese (nachstehend beschrieben) unterzogen, um das Ausmaß der Restriktionsreaktion zu bestimmen. Reaktionen, bei denen wenigstens 50% der DNA auf eine von 30-200 kb reichende Größe verdaut worden waren, wurden weiter an Sucrosegradienten fraktioniert. Die Feldinversions-Elektrophorese wurde zwei Stunden in 1% Agarosegelen aus Tris-borat-EDTA-Puffer (0,089 M Tris-borat, 0,089 Borsäure, 0,002 M EDTA) bei 230 Volt mit einem Vorwärtspuls von 0,6 sec, einem Rückwärtspuls von 0,2 sec und einem Steigfaktor von 20 durchgeführt.
- Fünfunddreißig ml 10-50% Sucrosegradienten wurden wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Cold Spring Harbor, NY 1982) beschrieben hergestellt. Die entsprechenden, vorstehend hergestellten, mit EDTA abgebrochenen Reaktionen wurden oben auf diese Gradienten geschichtet und die Gradienten wurden 15 Stunden bei 20000 Upm in einem SW27 Schwingbecher-Sorvall-Rotor bei 4ºC zentrifugiert. Der Gradient wurde anschließend folgendermaßen in 1 ml-Fraktionen in Gewebekulturschalen mit 24 Näpfchen gesammelt. Das obere Ende des Zentrifugenröhrchens wurde mit Parafilm umhüllt und sorgfältig an einen Ständer geklammert. Der Röhrchenboden wurde mit einer 18er Nadel durchstochen und die Nadel wurde anschließend sachte entfernt. Um den Gradienten zu tropfen beginnen zu lassen, wurde die Parafilmabdeckung mit einer Nadel durchstochen. Die Fließgeschwindigkeit wurde durch den auf das obere Loch ausgeübten Fingerdruck reguliert. Nach Analysieren der DNA-Größe in jeder Gradientenfraktion durch Feldinversions-Gelelektrophorese wurden die entsprechenden Fraktionen zusammengefaßt und anschließend durch n-Butanolextraktion eingeengt. Zuerst wurden die zusammengefaßten Fraktionen dialysiert, indem man sie auf ein VSWP 02500 Filter (Millipore) pipettierte, das auf der Oberfläche eines Puffers aus 10 mM Tris-HCl pH 8,0 - 1 mM EDTA schwamm. Üblicherweise konnten 1- 2 ml Probe in etwa 2 Stunden bei 25ºC vollständig gegen 500 ml Puffer dialysiert werden. Die dialysierten Proben wurden anschließend mit 2 Volumina n-Butanol in einem 2059 Falcon-Röhrchen gemischt und das Gemisch wurde gelinde geschüttelt, bis das Volumen der wäßrigen Phase um das 2-3fache verringert war. Das Röhrchen wurde 2 Minuten bei 2000 Upm zentrifugiert und die obere Butanolphase wurde entfernt. Diese Schritte wurden wiederholt, bis die wäßrige Phase auf etwa 40-50 ul verringert war. Man ließ das restliche Butanol anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur abdampfen und die Proben wurden anschließend zum Entfernen von restlichem Salz auf Filtern 30 Minuten gegen 10 mM Tris-HCl pH 8,0 - 1 mM EDTA dialysiert.
- Eine Analyse Sucrosegradient-fraktionierter, Sau3AI-verdauter, menschlicher DNA durch Feldinversions-Gelelektrophorese wird in Figur 10 dargestellt. Durch Vergleichen der Größe der Fragmente in den verschiedenen Bahnen mit der Größe von 165 kb- und 50 kb- Markern in Bahn M ist es offensichtlich, daß die Fragmente in den Bahnen 6-10 den gewünschten 50-110 kb-Bereich zum Klonieren in die P1-Vektoren umspannten. Bahn T enthielt die ursprüngliche, unfraktionierte Sau3AI-verdaute DNA.
- DNA wurde aus Agarosegelen auf Nitrocellulosemembranen überführt und mit spezifisch markierten DNA-Fragmenten oder Plasmiden gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-507 (1975), das nachfolgend als "Southern-Analyse" bezeichnet wird, untersucht. DNA wurde mittels des Dideoxynucleotidverfahrens von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977) untersucht.
- Fünfhundert Nanogramm DNA wurden mit 1-2 Einheiten Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37ºC in 20 Mikrolitern eines von New England Biolabs (Beverly, MA 01915), von denen das Enzym erworben wurde, angegebenen Puffers verdaut. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 3 Mikrolitern einer Lösung von 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol und 40% (Gew./Vol.) Sucrose, gefolgt von 5 Minuten Erhitzen der Reaktion auf 70ºC abgebrochen. Die Schlitze eines 1%igen Agarosegels (15 x 15 cm), das in einen Tris-Borat-EDTA-Puffer (0,089 M Tris-Borat, 0,089 Borsäure, 0,002 M EDTA) getaucht war, wurden mit den Proben beladen. Die Elektrophorese wurde bei 20 Milliampere (30 Volt) üblicherweise etwa 12 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt, bis die Xylolcyanolbande zwei Drittel des Wegs in das Gel gewandert war. Das Gel wurde anschließend in einer Lösung von 0,5 Mikrogramm/ml Ethidiumbromid 30 Minuten angefärbt und von dem Gel wurde mittels einer UV-Durchlichtquelle (320 nm) und eines Polaroidfilms Typ 57 ein Bild aufgenommen.
- Nachdem die DNA durch Restriktionssysteme wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben verdaut war, wurde sie 5 Minuten auf 70ºC erhitzt. Die Reaktion wurde auf 37ºC gekühlt, mit einer 10 mM Tris-HCl-Lösung pH 8,0 auf 100 Mikroliter gebracht und anschließend mit 0,01 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde 4 Mal mit dem gleichen Volumen Phenol und ein Mal mit dem gleichen Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und die DNA anschließend in 1 M LiCl&sub2; mit 2 Volumina Ethanol 3 Stunden bei -20ºC gefällt.
- Ligierungen wurden in einem Volumen von 20 Mikrolitern, das 6 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 1 mM ATP, 100 Mikrogramm/ml Rinderserumalbumin enthielt, durchgeführt. Bei Reaktionen, welche die Inserierung von Fragmenten in Plasmide umfaßten, die durch Transformation in kompetente Bakterien isoliert werden sollten, wurden 100 ng verdaute Vektor-DNA und 100-400 ng Insertfragment verwendet. Bei Reaktionen, die Plasmidvektoren umfaßten, welche durch in-vitro-"headful"-Verpacken isoliert werden sollten, wurden 500 ng Vektor-DNA und 1-2 Mikrogramm Insertfragment verwendet. 400 Einheiten T4-Ligase wurden jeder Reaktion zugesetzt und die Reaktionen wurden 20 Stunden bei 16ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden durch 10 Minuten Erhitzen auf 70ºC abgebrochen.
- Wie nachstehend in Beispiel 4 beschrieben ist einer der einzigartigen Aspekte dieser Erfindung die Fähigkeit, Fremd-DNA mit Vektor-DNA zu ligieren, ohne Konkatemere zu erzeugen.
- Die Konkatemererzeugung wurde durch Verdauen der Vektor-DNA an zwei verschiedenen Restriktionsstellen unter Erzeugen zweier Vektorfragmente (Arme) vermieden. Jeder Arm enthält ein Ende, das nicht mit einem DNA-Insert ligieren kann, das nicht an sich selbst ligieren kann und während der Cyclisierung der verpackten DNA nicht isoliert wird. Jeder Arm enthält ein weiteres Ende, das frei mit der zu klonierenden DNA ligieren kann. Nach der Fragmentligierung mit den Armen enthält das sich daraus ergebende Produkt die zu klonierende DNA zwischen den durch die Doppelverdauung erzeugten Vektorarmen liegend. Die Enden dieses Ligierungsprodukts können nicht weiter ligiert werden und somit wird eine Konkatemerbildung verhindert.
- Das Ende, das nicht weiter ligieren kann, wird vorzugsweise durch Spalten einer ein stumpfes Ende erzeugenden Stelle erzeugt, die für die DNA einzigartig ist. Zum Beispiel war im nachfolgenden experimentellen Abschnitt die ein stumpfes Ende erzeugende Stelle eine ScaI-Stelle. Diese ein stumpfes Ende erzeugende Stelle kann natürlich vorkommen oder künstlich geschaffen sein.
- Das Ende, das frei ligieren kann, sollte mit den Insertenden der DNA, mit der es ligiert wird, verträglich sein. Außerdem wird diese Sequenz während der Cyclisierung isoliert, wogegen die einzigartige, ein stumpfes Ende erzeugende Stelle während der Cyclisierung nicht isoliert wird.
- E. coli-Stämme wurden gemäß (1) einem Verfahren von Mandel und Higa, J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970), oder (2) einem Verfahren von Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983) transformiert, wenn eine hohe Wirksamkeit erforderlich war. Transformierte Zellen in einem Volumen von 0,1 ml wurden mit L-Brühe auf 1 ml verdünnt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. 100-200 Mikroliter der Kultur wurden auf L-Agarplatten ausgestrichen, die entweder Kanamycin (25 Mikroliter/ml) oder Ampicillin (150 Mikrogramm/ml) enthielten, und die Platten wurden 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Kolonien wurden anschließend ausgezählt. Amp-R-Transformanten wurden auf Wachstum auf L-Agarplatten mit Kanamycin und umgekehrt getestet.
- Der als pNS358-lyt identifizierte Plasmidvektor wird auch als pNS582 identifiziert. Somit werden die Ausdrücke pNS358-lyt und pNS582 hierin gegenseitig austauschbar verwendet.
- Ein Fließschema, das die verschiedenen Schritte beim Aufbau des Vektors beschreibt, wird in Figur 3 gezeigt. Das Ausgangsplasmid war pBS69. Es war ein 4,9 kb Plasmid, das zwei loxP-Rekombinationsstellen enthielt, die in derselben Richtung angeordnet waren. In Anwesenheit von Cre-Protein erfolgt die Rekombination zwischen diesen Stellen unter Erzeugen zweier DNA-Ringe, die jeweils eine loxP-Stelle und eine der zwei DNA-Regionen zwischen den loxP-Stellen in pBS69 enthalten. Eine dieser ringgeschlossenen Regionen, die nachfolgend die amp-R-Domäne genannt wird, enthielt das Gen, das auf Resistenz gegen den Wirkstoff Ampicillin kodiert und das DNA-Replizierungssystem (Replikon oder Replikationsursprung [ori]) des Plasmids pBR322 (nachfolgend pBR322 ori). Die anderen ringgeschlossenen Regionen zwischen den loxP-Stellen von pBS69 enthielten das Hefegen leu2.
- Die zum Auslösen des DNA-Verpackens notwendigen P1-Sequenzen befanden sich auf einem 161 bp-DNA-Segment (pac-Stelle). Dieses DNA-Segment stellte die P1-Sequenzen dar, die in der von Sternberg et al., J. Mol. Biol. 194, 469-479 (1981), beschriebenen Doppeldeletionsmutante (delta-3 - delta-20) zurückblieben. Delta-3 - delta-20-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI verdaut und ein die 161 bp-pac-Stelle enthaltendes 437 bp- Fragment wurde isoliert und mit der einzigen XhoI-Stelle in der amp-R-Domäne von pBS69-DNA ligiert. Das sich daraus ergebende pBS69-pac-Plasmid enthielt pac, das derart ausgerichtet war, daß das Verpacken gegen die Richtung des Uhrzeigerlaufs erfolgte, wenn das Plasmid wie in Figur 3 gezeichnet wird. Außer pac enthielt das 437 bp-Insert die zwischen den Koordinaten 375 und 651 der pBR322-Karte angeordneten Tetracyclinresistenz-Gensequenzen. Ferner war die in dem 437 bp-Fragment vorliegende und in der Plasmid-DNA zwischen pac und den pBR322-Sequenzen befindliche BamHI-Stelle entfernt. Das Entfernen der BamHI-Stelle stellte sicher, daß das pBS69-pac-Plasmid nur die einzige pBS69-BamHI- Stelle enthielt.
- Das Tn903-Kanamycinresistenzgen (kan-R) wurde als 1,3 kb-AccI- Fragment aus Plasmid puc4K isoliert, das von PL-Biochemicals (Milwaukee, WI) erworben wurde. pBS69-pac-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut, welches diese DNA einmal innerhalb des Hefe-leu2-Gens spaltete. Gleiche Mengen (100 ng) dieser verdauten Plasmid-DNA und des kan-R-Genfragments wurden in 20 Mikrolitern gemischt und über Nacht bei 16ºC ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zum Transformieren des Bakterienstamms DH5 verwendet und kan-R, amp-R-Transformanten wurden selektiert. Analysen rascher Plasmidherstellungen, die aus diesen Transformanten gemacht wurden, zeigten an, daß sie alle das kan-R-Gen an der ClaI-Stelle von pBS69-pac enthielten. Das zu allen nachfolgenden Manipulationen ausgewählte Plasmid, nachfolgend pNS20 genannt, enthielt das kan-R-Fragment, das derart ausgerichtet war, daß die Richtung der kan-Transkription gegen die Richtung des Uhrzeigerlaufs war (Figur 3). Die von loxP-Stellen flankierte Region, welche dieses kan-R-Gen enthielt, wird nachfolgend als kan-R-Domäne bezeichnet.
- Das P1-Plasmidreplikon und die Teilungsregion sind zum Erhalten des P1-Prophagen als extrachromosomales Element in Einzelkopie in einer Population lysogener Zellen verantwortlich. Es enthält ein Replikationsgen (repP), das ein Protein kodiert, welches als Ursprungssequenz in der DNA zum Auslösen einer einzigen Replikationsrunde je Zellteilungszyklus wirkt. In dem Replikon sind ferner zwei Gene, parA und parB, zugegen, die an einer Stelle, parS, die Replikationsprodukte bei der Zellteilung zuverlässig in Tochterzellen teilen.
- Ein 7 kb-KpnI-DNA-Fragment, das sich zwischen den Koordinaten 59 und 66 (Figur 2) der P1-Karte befand, wurde nach Verdauen der DNA aus dem P1-Phagen mit KpnI isoliert. Es wurde in die einzige KpnI-Stelle von pNS20 ligiert und seine Anwesenheit in dem Plasmid wurde durch Analysieren von Restriktionsenzymverdautem rascher Plasmidherstellungen bestätigt. Der zur weiteren Manipulation ausgewählte besondere Aufbau wurde pNS150 bezeichnet und enthielt die in dem Plasmid gegen die Richtung des Uhrzeigerlaufs ausgerichtete P1-DNA von den Kartenkoordinaten 59 bis 66. Das 7 kb-P1-Insert enthielt nicht nur das Plasmidreplikationssystem, sondern auch sein Teilungssystem (Yarmolinsky und Sternberg in "The Bacteriophages", Kapitel 9, 1988).
- Zwei 31-Basen-Oligodeoxynucleotide mit komplementären Sequenzen wurden durch das Phosphoroamiditverfahren synthetisiert. 10 Mikrogramm jedes Oligonucleotids in einem Volumen von 100 Mikrolitern (10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8,0, 1 mM EDTA) wurden miteinander 10 Minuten bei 70ºC gepaart.
- Das sich daraus ergebende doppelsträngige Fragment wird nachstehend dargestellt:
- Dieses DNA-Fragment enthielt von links nach rechts die folgenden Restriktionsendonukleasestellen: XbaI (X) - AGATCT; NotI (N) - CGCCGGCG; SalI (Sa) - CAGCTG; SnaBI (Sn) ATGCAT. Keine dieser Stellen war in der DNA von pNS150 vorhanden. Das Fragment enthielt auch einzelsträngige GATC-Enden, die zu den durch BamHI- Verdauung erzeugten Enden komplementär waren. Da die Nucleotide 3' zu den GATC-Enden des Fragments verschieden waren, regenerierte die Ligierung dieses Fragments mit DNA mit BamHI-Enden eine BamHI-Stelle auf einer Seite des Inserts, aber nicht auf der anderen. Das Fragment wurde mit BamHI-gespaltener pNS150-DNA ligiert und die Anwesenheit des Inserts wurde durch die Fähigkeit des Plasmids, nur einmal durch jedes der fünf Restriktionsenzyme BamHI, XbaI, NotI, SalI und SnaB1 gespalten zu werden, bestätigt. Der zur weiteren Manipulation ausgewählte besondere Aufbau wurde pNS358 bezeichnet und besaß den entgegen der Richtung des Uhrzeigerlaufs angeordneten Polylinker von BamHI bis SnaBI (Figur 3).
- Das vegetative oder lytische P1-Replikon kann DNA in hoher Kopienzahl innerhalb 30 Minuten nach der Prophagendereprimierung replizieren. Dieses Replikon besteht aus einem Transkriptionspromotor P53 und einem stromabwärts gelegenen repL-Gen, dessen Produkt auf eine Ursprungssequenz unter Fördern der Replikation einwirkt. Das Replikon wird durch den Phagen-c1-Repressor negativ gesteuert, welcher an P53 bindet und die Transkription des repL-Gens verhindert.
- Das lytische P1-Replikon wurde als 1,9 kb-AsuII-Fragment (Koordinaten 53-55 der P1-Karte) kloniert, in dem der normale P53- Promotor durch den lac-Promotor ersetzt wurde. Somit wurde das lytische P1-Replikon unter die Kontrolle des lac-Promotors gestellt. Der lac-Promotor wiederum wird durch den lacIq-Repressor kontrolliert. In Anwesenheit von IPTG (Isopropyl-beta-D- galactosid) wird der lacIq-Repressor dereprimiert und das Replikon wird funktionsfähig. Das lac-Promotor-regulierte lytische P1-Replikon wurde als PvuII-HpaI-Fragment aus dem Plasmid pNS42 isoliert und mit SnaBI-verdauter pNS358-DNA ligiert, um das pNS358-lyt-Plasmid zu erzeugen. Das Replikon (Koordinaten 53-55 der P1-Karte) war in dem Plasmid entgegen der Richtung des Uhrzeigerlaufs angeordnet.
- Somit betrifft diese Erfindung in einem weiteren Aspekt das Kontrollieren der Verstärkung klonierter DNA mittels eines lac- Promotors, der unter der Kontrolle eines lacIq-Repressors steht, bis IPTG zum Dereprimieren des Repressors zugesetzt wird.
- Ein Fließschema, das die verschiedenen Schritte beim Aufbau der vorstehenden beiden Vektoren beschreibt, wird in Fig. 4 dargestellt. Zum Herstellen von pNS582tet14 wurde DNA aus dem Plasmid pNS582 (Fig. 3) mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut, von denen beide die DNA in der Polylinker-Klonierungsstelle von pNS582 spalten. Zur selben Zeit wurde DNA aus dem Plasmid pBR322 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NdeI verdaut, welches das Tetracyclinresistenzgen (tet-R) von pBR322 vom Rest des Plasmids abspaltet. Das tet-R-Gen liegt auf einem 2,3 kb-DNA-Fragment vor. Beide DNA-Verdauungen wurden als nächstes mit dATP, dTTP, dGTP und dCTP und mit DNA-Polymerase I-Klenow- Fragment (Boehringer-Mannheim) wie bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Cold Spring Harbor, NY 1982) beschrieben inkubiert, um die durch die vorstehend beschriebenen Restriktionsenzymspaltungsreaktionen erzeugten einzelsträngigen Enden auf zufüllen. Die Restriktionsenzyme und das Klenow-Fragment wurden durch 15 Minuten Erhitzen der letzten Reaktion auf 70ºC inaktiviert. Gleiche Mengen (500 ng) der beiden verdauten und aufgefüllten Plasmid-DNA wurden in 20 ul Ligierungspuffer wie vorstehend beschrieben gemischt und über Nacht bei 16ºC in Anwesenheit von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zum Transformieren des Bakterienstamms DH5 verwendet und kanR-, amp-R-, tet-R-Transformanten wurden selektiert. Analysen rascher Plasmidherstellungen, die aus diesen Transformanten gemacht wurden, zeigten, daß sie das zwischen der BamHI- und SalI-Stelle der Polylinker-Klonierungsstelle der pNS582-DNA inserierte tet-R-Genfragment enthielten. In dem Klonierungsverfahren wurden die letzten beiden Stellen zerstört und DNA-Sequenzen zwischen ihnen (einschließlich der einzigen NotI- und XbaI-Stellen) wurden entfernt. Das tet-R-Gen enthielt eine BamHI-Stelle und eine SalI- Stelle innerhalb seiner Kodierungsregion. In pNS582tet14-DNA sind diese Stellen einzigartig und das Klonieren von DNA in diese Stellen unterbricht das tet-R-Gen. Diese Klone werden leicht erkannt, weil sie Tetracyclin-empfindlich sind.
- Zum Herstellen von pNS582tet14Ad10 wurde pNS582tet14-DNA mit dem Restriktionsenzym ScaI verdaut, das es einmal in dem amp-R-Gen spaltet. Zur selben Zeit wurde Adenovirus-DNA (Sigma) mit den Restriktionsenzymen ScaI und BamHI unter Erzeugen eines ScaI- BamHI-Fragments von ungefähr 10 kb verdaut. Die letzte Verdauung wurde mit den vier Deoxynucleotidtriphosphaten und Klenow-Fragment (vorstehend beschrieben) inkubiert, um die durch BamHI erzeugten einzelsträngigen Enden (ScaI-Verdauung erzeugt natürlich stumpfe Enden) auf zufüllen. Gleiche Mengen (500 ng) der beiden verdauten DNA wurden in 20 ul vorstehend beschriebenem Ligierungspuffer gemischt und über Nacht bei 16ºC ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des Bakterienstamms DH5 verwendet und kan-R-, tet-R-, amp-S-Transformanten wurden selektiert. Analysen rascher Plasmidherstellungen, die aus 10 dieser Transformanten gemacht wurden, zeigten, daß eine Transformante, die ungefähr 10,6 Kb eines ScaI-BamHI-Fragments aus Adenovirus- DNA enthielt, das in die ScaI-Stelle von pNS582tet14-DNA kloniert war. Die Ausrichtung dieses Fragments im Vektor ist solcherart, daß sein ScaI-Ende der pac-Stelle näher lag (Fig. 4). Da-die Ligierung eines aufgefüllten BamHI-Endes mit einem ScaI- Ende eine DNA-Sequenz erzeugt, die durch keines der beiden Enzyme gespalten werden kann, enthielt pNS528tet14Ad10-DNA nur eine einzelne ScaI-Stelle.
- Der Zweck des Adenovirus-Fragments war, ein großes (> 5 kb) DNA- Fragment bereitzustellen, in dem das "headful"-Verpacken beendet werden konnte. In seiner Abwesenheit wird das Beenden eines "headful"-Verpackens einer kurzen Region mit 400 Basenpaaren zwischen der dem ampR-Gen näheren loxP-Stelle und der ScaI- Stelle innerhalb des ampR-Gens zugewiesen, ein Umstand, der das Klonieren von Inserts in Abwesenheit einer Konkatemerisierung ernsthaft begrenzte. Das Adenovirus-Fragment wird stuffer-Fragment genannt, da es in die Vektor-DNA gefüllt wird, um einfach mehr DNA zur Beendigung des Verpackens zu liefern. Die Stelle, in die das stuffer-Fragment kloniert wird, wird während der Cyclisierung verpackter DNA nicht isoliert.
- Außerdem kann jede DNA als stuffer-Fragment verwendet werden, es muß keine Adenovirus-DNA sein. Einige Erwägungen, die in die Wahl der stuffer-Fragment-DNA eingehen, schließen ein: (1) die Leichtigkeit, mit der das stuffer-Fragment in die ein stumpfes Ende erzeugende Stelle der Vektor-DNA inseriert werden kann, so daß diese Stelle in der Vektor-DNA einzigartig bleibt und der pac-Stelle näher ist, und (2) die Quelle der DNA, die als stuffer-Fragment dient, sollte leicht erhältlich sein. Zum Beispiel ist Adenovirus-DNA im Handel erhältlich.
- Die Größe des stuffer-Fragments kann von etwa 5 kb bis etwa 20 kb in Abhängigkeit von der Größe der DNA, die in dem Klonierungsverfahren isoliert werden soll, schwanken. Die Größe des stuffer-Fragments bestimmt den Größenbereich der DNA innerhalb von 5-10 kb, die isoliert wird.
- Falls zum Beispiel die Anfangspopulation der DNA-Moleküle von unterschiedlicher Größe ist und die Größe der zu isolierenden DNA etwa 90-95 kb beträgt, dann sollte die bevorzugte Größe des stuffer-Fragments verhältnismäßig klein sein. Gleichzeitig ist die Klonierungswirksamkeit niedrig, weil es nur wenige DNA- Moleküle in dem engen Größenbereich (90-95 kb) gibt, die kloniert werden können. Tatsächlich kann das stuffer-Fragment gänzlich weggelassen werden, falls die Insert-DNA groß genug ist, um das Verpacken innerhalb der vorgenannten Region mit 400 Basenpaaren enden zu lassen.
- Falls die Größe der zu isolierenden DNA etwa 70-85 kb beträgt, dann sollte das stuffer-Fragment etwa 10 kb groß sein. Falls die Größe der zu isolierenden DNA etwa 60-75 kb beträgt, sollte die bevorzugte Größe des stuffer-Fragments etwa 20 kb betragen.
- Der zum Aufbauen lysogener Bakterien (Lysogene) zur Herstellung von P1-Verpackungsextrakten verwendete Phage war die Vierfach- Mutante P1rm&supmin;cm-2c1.100 9.16 oder P1rm&supmin;cm-2c1.100 10.1. Die Eigenschaften der einzelnen Mutationen und der Grund für ihren Einbau in den endgültigen Phagen werden nachstehend erörtert.
- (a) c1.100. Diese zuerst von Rosner, Virology, 48, 679-689 (1972) beschriebene Mutation macht den Phagen-c1-Repressor temperaturempfindlich. Somit wachsen diesen P1-Prophagen enthaltende Lysogene normalerweise bei Temperaturen unter 33ºC, werden aber bei höheren Temperaturen zum Eintreten in den lytischen Cyclus und Erzeugen von Phagen veranlaßt. Falls zum Beispiel die Temperatur der Kultur von 33ºC auf 40ºC erhöht wird und die Kultur bei dieser Temperatur gehalten wird, beginnt die Zellysis innerhalb 50 Minuten nach der Verschiebung aufzutreten und es werden etwa 100 Phagen/Zelle freigesetzt.
- (b) rm&supmin;. Diese zuerst von Glover et al., Genet. Res., 4, 480- 482 (1963), beschriebene Mutation macht das Restriktions- und Modifizierungssystem des Virus inaktiv. Sie wurde in den hier verwendeten Phagen eingebaut, so daß aus induzierten P1-Lysogenen hergestellte Extrakte keine Restriktionsendonukleaseaktivität enthielten, die zugesetzte DNA zerstören könnte, bevor sie verpackt wird.
- (c) cm-2. Diese Mutation wird in Iida und Arber, Mol. Gen. Genet., 153, 259-269 (1977) beschrieben und ist eine grobe Chromosomenanordnung, in der ein Tn9-Transposon mit seinem Chloramphenicol-Resistenzgen (cm-R) an der Koordinate 24 der P1- Karte inseriert wurde und ein Teil der P1-DNA zwischen den Kartenkoordinaten 24 und 33 mit 10 kb entfernt wurde. Die Mutation macht den Phagen teilweise Lysis-gestört, so daß auf die Induktion eines Lysogens folgend Bakterien zu späteren Zeiten geerntet werden können, als dies sonst möglich ist. Eine weitere Eigenschaft dieser Mutanten ist, daß sie mehr kleinköpfige Phagenvarianten als Wildtyp-P1 produziert.
- cm ist eine Mutante, die das Tn9-Transposon an den Koordinaten 24 der P1-Karte ohne die damit verbundene 10 kb-Auslassung von P1-DNA enthält.
- (d) am9.16 und am10.1.1. Die P1-Amber-Mutante 10.1 (am) enthält im P1-Gen 10 (siehe Figur 2) eine Nicht-Sinn-Mutation und ist für die gesamte "späte" Phagenproteinsynthese gestört. Sie erzeugt ein normales Maß pac-Spaltungsaktivität. Die P1- Amber-Mutante 9.16 enthält eine Nicht-Sinn-Mutation im P1-Gen 9 und ist für die Erzeugung von pac-Spaltungsaktivität gestört. Sie erzeugt normalerweise Phagenmorphogeneseproteine einschließlich Phagenköpfe und -schwänze. Obschon von aus jeder dieser Mutanten hergestellten Extrakten nicht erwartet wird, daß er DNA in vitro Verpacken kann, sollten beide Extrakte zusammen alle zum Verpacken benötigten Bestandteile besitzen.
- Die P1-Amber-Mutante 131 enthält ferner eine Nicht-Sinn-Mutation im P1-Gen 9 und ist für die Erzeugung von pac-Spaltungsaktivität gestört.
- (e) Die Vierfach-Phagenmutanten wurden in einem Zwei-Schritt- Verfahren aufgebaut. Zuerst wurden die Phagen P1 cm-2 und entweder P1 c1.100 9.16 oder P1 c1.100 10.1 gekreuzt und ein rekombinanter Phage, der die drei Mutationen P1 cm-2 c1.100 9.16 oder P1 cm-2 c1.100 10.1 enthielt, wurde selektiert. Der durch diese Kreuzung produzierte Phage wurde zum Erzeugen von Plaques auf einem Bakterienrasen des Stamms YMC verwendet und einzelne Plaques wurden auf die folgenden drei Eigenschaften durchgemustert: (1) die Fähigkeit, Lysogene zu produzieren, die cm-R waren; (2) Temperaturempfindlichkeit und (3) die Fähigkeit, Plaques auf dem Bakterienstamm YMC aber nicht auf Stamm N99 zu bilden. Der erste Stamm enthielt einen Amber-Suppressor, der letzte hingegen nicht. Zum Bestätigen, daß Rekombinanten der Amber-Mutante die richtige Amber-Mutation enthielten, wurden Komplementierungsversuche mit den Kontrollphagen 9.16 und 10.1 durchgeführt. Amber-Mutanten in demselben Gen ergänzen einander nicht bei der Phagenproduktion, wohl aber diejenigen in verschiedenen Genen wie den Genen 9 und 10. Die Komplementierungstests bestätigten, daß die Amber-Mutationen in den Dreifach-Mutanten die auf der Grundlage des zum Erzeugen dieser Mutanten verwendeten Phagen zu erwarten waren. Die Dreifach-Mutanten wurden als nächstes mit P1rm&supmin; gekreuzt und bei den Vierfach-Mutanten wurden alle Eigenschaften der Dreifach-Mutanten zuzüglich der Unfähigkeit, das Wachstum des Lambda-Phagen einzuschränken, wenn sie als Prophage in irgendeinem E. coli-Stamm vorliegen, nachgewiesen. P1c1.100rm&supmin; cmam131 wurde wie die anderen Vierfach-Mutanten auf gebaut, außer daß die zwei Ausgangsphagen P1cm und P1c1.100am131 waren.
- Die Vierfach-P1-Mutanten wurden zum Lysogenieren von Stamm N99 verwendet und die NS2961 beziehungsweise NS2962 bezeichneten Lysogene für die Mutanten 9.16 und 10.1 wurden zum Herstellen von P1-Extrakten für die in-vitro-Verpackungsreaktion verwendet. Weiterhin können diese P1-Mutanten auch zum Lysogenieren irgendeines Bakterienstamms verwendet werden, der zu ihrer Aufnahme befähigt ist. NS2961 und NS2962 besitzen den Genotyp recD&spplus; hsdR&spplus; hsdM&spplus; mcrA&spplus; mcrB&spplus;.
- Zum Aufbauen der P1-Lysogene NS3205, NS3208 und NS3210 wurde der Bakterienstamm MC1061 (von New England Biolabs erhalten) verwendet, dessen Genotyp recA&spplus; hsdM&spplus; hsdR&supmin; mcrA&supmin; mcrB&supmin; ist. Dieser Stamm wurde durch Transduktion einer recD&supmin;-Mutation, die mit einem benachbarten Tetracyclin-resistenten Gen verknüpft war, wie in Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972) beschrieben, recD&supmin; gemacht. Der sich daraus ergebende Stamm wurde anschließend entweder mit P1c.100cm-2rm&supmin;am9.16 oder P1c1.100cm-2rm&supmin;am10.1 oder P1c1.100cmrm&supmin;am131 unter Erzeugen entweder von NS3205, NS3208 beziehungsweise NS3210 lysogeniert. NS3205, NS3208 und NS3210 besitzen den Genotyp recD&supmin; hsdR&supmin; hsdM&spplus; mcrA&supmin; mcrB&supmin;. Es ist anzumerken, daß P1-Prophagen in NS3205 und NS3208 die cm-2-Mutation besitzen, die nicht nur das T9-Transposon mit seinem cm-R-Gen enthält, sondern auch eine benachbarte Deletion von P1-DNA enthält. Im Gegensatz dazu enthielt NS3210 nur das hier cm bezeichnete Tn9-Transposon. Aus dem NS3210 bezeichneten Lysogen hergestellte Kopf-Schwanz-Verpackungsextrakte enthielten das normale Verhältnis großer Phagenköpfe zu kleinen Köpfen von etwa 10:1. Zum Ausüben der Erfindung sollte das Verhältnis großer Köpfe zu kleinen Köpfen wenigstens etwa 5:1 sein.
- Ein Liter L-Brühe wurde mit einer Kolonie des Bakterienstamms NS2962 beimpft und die Kultur wurde bei 32ºC bis zu einer OD 650 von 0,8 gezüchtet. Die Temperatur der Kultur wurde anschließend rasch auf 42ºC durch ihr Schwenken in einem Wasserbad von 90ºC erhöht und das Wachstum wurde 15 Minuten bei 42ºC unter heftiger Belüftung fortgesetzt. Die Temperatur der Kultur wurde anschließend durch ihr Stellen in ein Wasserbad van 38ºC erniedrigt und die heftige Belüftung wurde weitere 165 min fortgesetzt. Die Bakteriensuspension wurde anschließend rasch in einer Eisanschlämmung auf 4ºC gekühlt und durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 6000 x g in einem Sorvall GSA-Rotor bei 4ºC pelletiert. Das Zellpellet wurde in 2 ml eines Puffers, der aus 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bestand, erneut suspendiert. Die wiedersuspendierten Zellen wurden mit der Mediumspitze eines Branson-Beschallers auf Einstellung 5 fünf 40 Sekunden lange Zeiträume beschallt. Zwischen jedem Beschallungsimpuls wurde die Probe 60 Sekunden auf Eis gestellt. Der beschallte Extrakt wurde anschließend 30 Minuten bei 34000 x g zentrifugiert und der Überstand wurde anschließend in aliquote Mengen von 10 Mikroliter aufgeteilt und gefroren bei -80ºC aufbewahrt. Diese Extrakte waren üblicherweise gegenüber mehreren Kreisläufen des Gefrierens und Auftauens stabil.
- Zum Messen der pac-Spaltung wurde das 600 bp-delta-3-pac-Fragment verwendet, das die pac-stelle an seinem rechten Ende enthielt (Figur 5A; Sternberg und Coulby, J. Mol. Biol. 194, 469- 479 (1987)). Das Fragment wurde an beiden Enden mit gamma³²P-dATP mittels Polynucleotidkinase markiert und anschließend mit verschiedenen aliquoten Mengen des pcp&spplus;-Extrakts inkubiert. Die Reaktion wurde in 15 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 10 Mikrogramm beschallter Kalbsthymus-DNA mit 1 Mikroliter markiertem pac-Fragment (12 Mikrogramm/ml) und entweder keinem Extrakt oder 0,01 bis 1 Mikroliter des pcp&spplus;-Extrakts (3,4 Milligramm Protein/ml) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei 30ºC inkubiert und die Reaktion wurde durch Zusetzen von SDS auf eine Konzentration von 0,2% und 5 Minuten Erhitzen des Gemischs auf 70ºC abgebrochen. Die Reaktionsprodukte wurden durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese analysiert. Die Schlitze eines senkrechten 5%igen Gels wurden mit Proben beladen und die Elektrophorese wurde 4 Stunden bei 150 Volt ausgeführt. Das Gel wurde anschließend getrocknet und über Nacht Kodak XRP-Film ausgesetzt. Die in Figur 5B veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß 1 Mikroliter des Extrakts (Bahn 2) etwa 20% des Fraginents spaltete, wobei zwei neue, in der Bahn ohne zugesetzten Extrakt (Bahn 1) nicht beobachtete Fragmente erzeugt wurden. Eine zehnfache Verdünnung des Extrakts (Bahn 3) verringerte die Menge gespaltenes Fragment nur geringfügig, aber eine zusätzliche zehnfache Extraktverdünnung (Bahn 4) verringerte die Schneidwirksamkeit auf etwa 5%.
- Eine Liter L-Brühe wurde mit einer Bakterienkolonie des Stamms NS2961 beimpft und die Kultur wurde wie vorstehend in (a) beschrieben gezüchtet und induziert. Nach Verschieben der Temperatur auf 42ºC und 15 Minuten Inkubieren der Kultur bei dieser Temperatur wurde die Temperatur wieder auf 38ºC zurückverschoben, gefolgt von einem Inkubationszeitraum von 45 Minuten. Die Kultur wurde in die Hälfte geteilt und die Zellen wurden wie vorstehend in (a) beschrieben pelletiert. Bakterienzellen aus einer Hälfte der Kultur wurden erneut in 1 ml Puffer suspendiert, der 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM PMSF und 5 mM beta-Mercaptoethanol enthielt, und wie vorstehend in (a) beschrieben beschallt. Aliquote Mengen von 100 Mikrolitern wurden direkt bei -80ºC gefroren. Zellen aus der anderen Hälfte der Kultur wurden erneut in 1 ml Lösung aus 50 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,4, 10% Sucrose suspendiert und wurden anschließend zweimal gefroren und aufgetaut. Das Gefrieren wurde in flüssigem Stickstoff durchgeführt und die gefrorenen Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut. Eine 8 mikromolare Lösung Eiweißlysozym (10 Milligramm/ml) wurde den aufgetauten Zellen anschließend zugesetzt und nach 15 Minuten bei 4ºC wurden 200 Mikroliter des für den beschallten htp&spplus;-Extrakt verwendeten Puffers zugesetzt. Nachdem alle Bestandteile 5 Minuten bei 4ºC gelinde gemischt wurden, wurden aliquote Mengen des Extrakts van 100 Mikroliter bei -80ºC gefroren.
- Es ist anzumerken, daß der Bakterienstamm NS2962 einen viel längeren Zeitraum als Stamm NS2961 induziert wurde, bevor die Zellen geerntet wurden. Dies geschah deshalb, weil die 10.1- Amber-Mutation in dem ersten Stamm die Zellysis viel dramatischer als die cm-2-Mutation hemmte, die in beiden Zellinien zugegen war. So lysierte das induzierte NS2962-Lysogen erst 4 Stunden nach der Induktion, wogegen das induzierte NS2961-Lysogen etwa 80-100 Minuten nach der Induktion zu lysieren begann. Man ließ sogar Vorsicht walten, um die induzierten NS2961-Zellen rasch zu kühlen, bevor sie durch Zentrifugieren pelletiert wurden, um das Lysieren der Zellen während des Zentrifugierschritts zu vermeiden.
- Das Extraktherstellungsverfahren mit diesem Stamm wurde modifiziert, da er die cm-2-Mutation nicht enthielt. Eine NS3210- Kultur lysiert etwa 50-60 Minuten nach der Induktion. Somit muß sie viel rascher als induzierte NS2961- oder NS3205-Kulturen verarbeitet werden, um einen funktionsfähigen Kopf-Schwanzfähigen Extrakt zu erhalten. Ein Liter induzierter Zellen wurde wie im vorigen Abschnitt verarbeitet, ausgenommen daß zum Vermeiden der Zellysis während des Zentrifugierschritts, der zum Konzentrieren der Zellen angewendet wird, der Kultur vor dem Zentrifugierschritt ein fünftel Volumen kalte 50%ige Sucroselösung zugesetzt wurde, um die Zellen während des Zentrifugierens zu stabilisieren. Die Zellen wurden in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10% Sucrose erneut suspendiert und aliquote Mengen von 40 ul wurden in konische Eppendorf-Zentrifugenröhrchen von 1,5 ml verteilt, die 4 ul einer Lösung von 10 mg/ml Lysozym enthielten. Der Inhalt der Röhrchen wurde rasch in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Der aus NS3210 hergestellte Kopf-Schwanz-Extrakt enthielt die cm-2-Mutante nicht und enthielt somit das normale Verhältnis großer Phagenköpfe zu kleinen Köpfen von etwa 10:1. Dies ist die bevorzugte Vorschrift zum Herstellen des Kopf-Schwanz-Extrakts.
- Um zu zeigen, daß die hier aufgebauten Vektoren wie erwartet verarbeitet werden, wenn sie in Zellen eingeführt werden, welche die Cre-Rekombinase enthalten, wurde pNS20 und pNS358 in die E. coli-Stämme DH5 und BS591 eingeführt. DH5 enthielt kein funktionsfähiges cre-Gen, wogegen BS591 ein funktionsfähiges cre-Gen enthielt. Die Ergebnisse der Transformation mit amp-R und kan-R werden in Tabelle 2 dargestellt und zeigen, daß Cre die zwei Domänen dieser beiden Plasmide in Zellen wirksam trennte und daß jede Domäne ein Replikon enthalten muß, falls sie isoliert werden soll. (siehe Figur 6A). Tabelle 2 transformierter Stamm Plasmic Replikon in kan-R-Domäne Keines P1-Plasmid
- Als der Stamm BS591 mit pNS20 transformiert wurde, das nur in der amp-R-Domäne ein Replikon trug, war die Wirksamkeit der amp- R-Transformation etwa 1000 Mal höher als die Wirksamkeit der kan-R-Transformation. Die Ergebnisse der Transformation von Stamm DH5 stützen die Schlußfolgerung, das dies der Trennung der zwei Domänen durch Cre-vermittelte Rekombination zwischen loxP- Stellen zuzuschreiben war. In diesem Fall war die Wirksamkeit der amp-R- und kan-R-Transformation mit pNS20 dieselbe. Falls die kan-R-Domäne ein Replikon trug, wie es bei Plasmid pNS358 der Fall war, sind sowohl kan-R- als auch amp-R-Gene gleichermaßen unter den Transformanten von Stamm BS591 vertreten. Weiter waren etwa 20-30% der kan-R-Transformanten von BS591 Ampicillinempfindlich und eine gleiche Zahl amp-R-Transformanten war Kanamycin-empfindlich. Wie erwartet waren alle Transformanten von DH5 (Cre&supmin;) durch pNS358-DNA sowohl amp-R als auch kan-R. Eine Transformationseinheit in diesen Versuchen soll 10&sup6; Transformanten je Mikrogramm verwendeter DNA darstellen.
- Der physikalische Beweis für die Trennung der DNA von pNS358 in BS591 (Figur 6B) kam aus der Restriktionsanalyse der raschen Plasmidherstellung von DNA, die aus den Transformanten von BS591 und DHT stammte. Alle DNA wurden mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut und die Zahl der sich daraus ergebenden Fragmente wurde durch Agarosegelelektrophorese und Southern-Hybridisierung bestimmt. Aus den amp-R kan-R-Transformanten von DH5 (Bahn 1) stammende Plasmid-DNA war vom ursprünglichen pNS358-Plasmid ununterscheidbar. Sie enthielten beide die erwarteten 3 XhoI- fragmente. Im Gegensatz dazu enthielt Plasmid-DNA aus amp-R, kan-S-Transformanten von BS591 DNA mit nur einer einzigen XhoI- Stelle (Bahn 2), während Plasmid-DNA aus kan-R, amp-S-Transformanten von BS591 zwei XhoI-Fragmente (Bahn 3) enthielt. Plasmid-DNA aus amp-R kan-R-Transformanten (Bahn 4) von BS591 enthielt alle drei Arten DNA, d.h. wie pNS358 die amp-R-Domäne- Plasmid-DNA mit einer einzigen XhoI-Stelle und kan-R-Domäne- Plasmid-DNA mit zwei XhoI-Stellen. Wie erwartet wurde Plasmid- DNA mit nur der kan-R-Domäne von pNS358 in viel geringeren Mengen (d.h. die DNA-Banden waren viel dünner) als entweder pNS358-DNA oder amp-R-Plasmid-DNA isoliert. Das P1-Plasmid- Replikon in der kan-R-Domäne replizierte DNA in einer viel niedrigeren Kopienzahl als das pBR322-Replikon in der amp-R- Domäne.
- Fünf Mikrogramm BamHI-verdaute pNS358-DNA (100 Mikrogramm/ml) wurden über Nacht unter Erzeugen von Konkatemeren ligiert, die in der Größe von 50 kb bis 150 kb reichten. Dreißig ng dieser DNA wurden mit 0,2 Mikroliter des pcp&spplus;-Extrakts wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben inkubiert, außer daß der Inkubationszeitraum 60 und nicht 15 Minuten betrug. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden der Reaktion 2 Mikroliter eines Puffers, der 6 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15 mM ATP, 16 mM MgCl&sub2;, 60 mM Spermidin, 60 mM Putrescin und 30 mM beta-Mercaptoethanol enthielt, zusammen mit 8 Mikrolitern des gefrorenen und auf getauten htp&spplus;- Extrakts zugesetzt. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde weitere 60 Minuten bei 30ºC inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurde die Reaktion mit TMG (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;, 0,1% Gelatine) auf 150 Mikroliter verdünnt und DNaseI wurde auf eine Konzentration von 10 Mikrogramm/ml unter Zerstören aller unverpackter DNA zugesetzt. Fünf Milliliter der vorstehenden Verpackungsreaktion wurden 10&sup8; Bakterienzellen des Stamms BS591 zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 30ºC inkubiert, um die Phagenaufnahme erfolgen zu lassen. Die sich daraus ergebenden infizierten Zellen wurden mit L-Brühe auf 2 ml verdünnt und 1 Stunde bei 37ºC gezüchtet, durch Zentrifugieren pelletiert und anschließend auf L-amp-Agarplatten ausgestrichen. Nach der Inkubation über Nacht enthielten die Platten 2208 Kolonien. Dies entsprach einer Verpackungswirksamkeit von 2 x 10&sup6; verpackten DNA-Molekülen/Mikrogramm zugesetzter Vektor-DNA. Falls der zum Bestimmen des verpackten Vektors verwendete Bakterienstamm DH5 (Cre&supmin;) war, nahm die Zahl der nachgewiesenen amp-R-Kolonien um etwa das 40-fache ab, was zeigte, daß eine Cre-vermittelte Rekombination zwischen loxP-Stellen zum Cyclisieren der injizierten linearen DNA erforderlich war. Wenn einer der beiden Extrakte bei der Verpackungsreaktion ausgelassen wurde, dann wurden keine amp-R-Kolonien nachgewiesen, was zeigte, daß beide Extrakte zum Verpacken benötigt wurden. Falls der beschallte htp+-Extrakt anstatt des gefrorenen und aufgetauten htp&spplus; verwendet wurde, war die Verpackungswirksamkeit unverändert. Da sich jedoch der beschallte Extrakt als viel weniger stabil als der gefrorene und aufgetaute Extrakt erwies, wurde bei allen nachfolgenden Versuchen der gefrorene und aufgetaute Extrakt eingesetzt. Schließlich zeigte die Analyse der amp-R-Kolonien, daß 50% (25/50) ebenfalls kan-R waren, was anzeigte, daß häufig beide Antibiotikaresistenz-Domänen von pNS358 verpackt wurden.
- Einhundert Mikroliter einer Über-Nacht-Bakterienkultur (2-3 x 10&sup9; Zellen/ml) wurden mit einer aliquoten Menge eines Phagenlysats oder einer in-vitro-Verpackungsreaktion 10 Minuten bei 30ºC inkubiert. Falls Phagen bestimmt werden sollten, wurden 3,0 ml geschmolzener L-Top-Agar (0,7% Agar) den infizierten Zellen bei 55ºC zugesetzt und das Gemisch wurde auf einer L-Agarplatte ausgestrichen. Nachdem man den Top-Agar 5 Minuten bei Raumtemperatur verfestigen ließ, wurden die Platten 16 Stunden bei 37ºC inkubiert und die Plaques wurden gezählt. Falls Antibiotikaresistente Zelle bestimmt werden sollten, wurden die infizierten Zellen auf antibiotikahaltige L-Agarplatten ausgestrichen und diese Platten wurden 16 Stunden bei 37ºC inkubiert.
- Isolierung exogener, in pNS358-DNA klonierter DNA-Fragmente auf die in-vitro-Verpackung und Transformation von Cre&spplus;-Zellen folgend
- Plasmide mit klonierten Inserts von E. Coli-DNA wurden auf zwei Wegen isoliert: (1) Plasmid-DNA wurde aus 1 Liter Zellen, die über Nacht auf 2-3 x 10&sup9; Zellen/ml angewachsen waren, durch die Alkali-Lysisvorschrift von Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), und durch Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Äquilibriumszentrifugieren isoliert, welches von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Cold Spring Harbor, NY 1982) beschrieben wurde. Nachdem die DNA aus dem Gradienten entfernt war, wurde er vier Mal mit Cesiumchlorid-gesättigtem Isopropanol gegen 1 Liter einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA-Lösung 5 Stunden bei 4ºC dialysiert, zwei Mal mit Phenol extrahiert und anschließend mit 2 Volumina Ethanol in 1 M LiCl&sub2; gefällt. (2) Das Plasmid mit dem klonierten DNA-Insert wurde aus transformierten Zellen in Phagenteilchen durch Infizieren dieser Zellen mit dem P1-Phagen isoliert. Die infizierte P1-DNA rekombinierte mit dem der Zelle innewohnenden Plasmid durch ein Cre-vermitteltes Rekombinationsverfahren, das loxP-Stellen auf beiden DNA umfaßte. Dieses Ereignis brachte eine P1-pac-Stelle in Nachbarschaft zu dem klonierten Plasmid-Insert und gestattete dadurch sein Verpacken in Phagenteilchen. Einhundert Mikroliter einer Über-Nacht-Kultur aus transformierten Zellen (etwa 2 x 10&sup8; Zellen) wurden mit 6 x 10&sup8; P1-Phagen 10 Minuten bei 30ºC inkubiert und wurden anschließend mit L-Brühe auf 5 ml verdünnt. Die infizierten Zellen wurden bei 37ºC heftig geschüttelt, bis Zellysis beobachtet wurde (etwa 90 Minuten). Die Zahl der Phagen, die das klonierte Fragment zusammen mit der kan-R-Domäne von pNS358 enthielten, wurde durch Infizieren von BS591 mit einer aliquoten Menge des Lysats und anschließend Messen der Zahl der erzeugten kan-R-Zellen bestimmt. Plaquebildende Phagen in dem Lysat wurden wie zuvor beschrieben gemessen. Üblicherweise betrug das Verhältnis von kan-R-Phagen zu plaquebildenden Phagen in diesen Lysaten etwa 0,1-1%.
- Verstärkung eines Plasmids, das ein kan-R-Gen, ein P1-Plasmid- Replikon und ein lytisches P1-Replikon, pNS364, enthält.
- Die Struktur dieses Plasmids wird in Figur 7A veranschaulicht. Wir verwendeten es hier zum veranschaulichen, daß ein kloniertes Multikopien-Replikon, wie etwa das lytische P1-Replikon, das durch den lac-Gen-Promotor gesteuert wird, zum leichten Verstärken der Plasmidkopienzahl in der Zelle verwendet werden kann. Der Stamm JM109 (lacIq) wurde mit pNS364-DNA transformiert und die transformierten Zellen wurden in L-Brühe gezüchtet. Unter diesen Bedingungen wurde erwartet, daß das Plasmid durch das Plasmidreplikon in einer Kopie je Zellchromosom erhalten wird. Wenn IPTG dem Medium zugesetzt wurde, wurde der lacIq-Repressor inaktiviert, wodurch auf diese Weise der lac-Promotor und das lytische P1-Replikon aktiviert wurden. Sechzig ml einer JMI09-Kultur (pNS364) wurden zu einer Dichte von 5 x 10&sup7; Zellen/ml bei 37ºC in L-Brühe gezüchtet und anschließend in 8 aliquote Mengen von jeweils 5 ml aufgeteilt. Eine aliquote Menge wurde weitere 3 Stunden bei 37ºC in L-Brühe gezüchtet, während jede der anderen sieben aliquoten Mengen 3 Stunden mit in der Konzentration von 10 mikromolar bis 1 mM reichendem IPTG in L- Brühe gezüchtet wurde. Die gesamte Zell-DNA wurde aus jeder Kultur isoliert, mit dem Restriktionsenzym BamHI (das pNS364 in zwei Fragmente spaltete) verdaut und durch Southern-Hybridisierung analysiert. Die Ergebnisse (Figur 6B) zeigten, daß wenn sich die Konzentration von IPTG im Medium erhöhte, sich die Plasmakopienzahl erhöhte. Bei 1 mM IPTG war die Kopienzahl des Plasmids 30-40 höher als die Kopienzahl des Plasmids in Medium, dem IPTG fehlte (vergleiche Bahn 1 und 8).
- Zwei Mikrogramm pNS358 wurden entweder mit BamH-I oder NotI- Restriktionsenzymen verdaut. Jedes dieser Enzyme spaltete die Vektor-DNA einmal in der Polylinker-Klonierungsstelle. Die gespaltenen DNA wurden anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die erneute Ligierung der gespaltenen Enden in der nachfolgenden Ligierungsreaktion zu verhindern. Die Quelle für die Insert-DNA war der E. coli-Stamm W3350 und die isolierte DNA war größer als 200 kb. Vor dem Inserieren irgendwelcher DNA in dem Vektor wurde sie entweder mit Sau3aI auf eine Durchschnittsgröße von 20-50 kb oder mit dem Restriktionsenzym NotI bis zur Vollständigkeit verdaut. Ungefähr gleiche Mengen (200 ng) Vektor-DNA und E. coli-DNA (BamHI-verdauter Vektor mit Sau3aI-verdauter E. coli-DNA oder NotI-verdauter Vektor und NotI-verdaute E. coli-DNA) wurden in einem Volumen von 20 Mikrolitern gemischt und über Nacht ligiert. Ein Mikroliter dieses Ligierungsgemischs wurden wie im vorigen, betitelten Abschnitt beschrieben verpackt und zum Transformieren des E. coli-Stamms BS591 durch Infizierung wie im "Nachweis des DNA-Verpackens durch pcp&spplus;- und htp&spplus;-Extrakte" betitelten, vorherigen Abschnitt beschrieben verwendet. Die sich daraus ergebenden transformierten Bakterien wurden als in Tabelle 3 dargestellte kan-R-Kolonien nachgewiesen. Tabelle 3 In-vitro-Verpacken von pNS358 - E. coli-DNA der in-vitro-Verpackungsreaktion zugesetzte DNA Kanamycin-resistente Kolonien je ug Vektor-DNA Sau3aI-Inserts Ligase Ligase AP = mit alkalischer Phosphatase behandelte DNA-Fragmente
- Die Wirksamkeit des Verpackens BamHI- oder NotI-verdauter Vektor-DNA, die nicht mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, betrug etwa 2 x 10&sup6; verpackte DNA-Moleküle/Mikrogramm zugesetzter Vektor-DNA. Die Behandlung der Vektor-DNA mit alkalischer Phosphatase verringerte die Isolierung von DNA nach dem Verpacken um etwa das 100- bis 200-fache, aber Sau3aI- oder NotI-verdaute E. coli-DNA kann der Ligierungsreaktion zum teilweisen Ausgleichen dieses Verlusts zugesetzt werden. Die Interpretation dieser Ergebnisse war die, daß die phosphatasebehandelte Vektor-DNA nicht mit großen Konkatemeren ligiert werden kann und demzufolge nicht wirksam verpackt werden kann. Das Zusetzen von E. coli-DNA-Inserts zu der Vektor-DNA gestattete ihr, eine Größe zu erreichen, die verpackt werden kann. In Abhängigkeit von der besonderen Verpackungsreaktion waren 50-90% der kan-R-Kolonien amp-S, was zeigte, daß ihnen die amp-R-Domäne von pNS358 fehlte.
- Die Plasmid-DNA in jeder der aus den 10 getrennten Kolonien gezüchteten Kulturen, die durch Verpacken der in pNS358 inserierten Sau3aI-verdauten E. coli-DNA erzeugt wurden, wurde durch das Alkaliverfahren von Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), isoliert und durch Restriktionsenzymverdauung analysiert. Die DNA von zwei der Plasmide war mit der kan-R- Domäne von pNS358-DNA identisch, aber der Rest enthielt wesentlich mehr DNA als in dem Vektor zugegen war, einschließlich vieler neuer Restriktionsfragmente. Verdauungen des Vektors (Bahn 3) und von fünf Vektor-Sau3aI-Chimären (Bahnen 4-8) mit den Restriktionsenzymen BalII, XhoI, PvuII und EcoV werden in Figur 8A dargestellt. Es schien, das in den Bahnen 4-8 erkannte neue DNA-Fragmente aus der Insertion von E. coli-Sau3aI-Fragmenten herrühren. Bahn 1 und 2 von Figur 8A enthielt DNA-Größenmarker. Das größte isolierte Plasmid hatte 38-40 kb. Die Pulsfeld- Gelanalyse zeigte, daß es zwei NotI-Fragmente mit 22 kb und 17 kb enthielt (Figur 8B, Bahn 3). Bahn 1 enthielt verpackte Vektor-DNA und Bahn 2 enthielt eine zweite mit NotI verdaute Sau3aI-Chimäre. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die meisten, wenn nicht alle Sau3aI-Inserts in kleinköpfige (P1S) Teilchen verpackt waren, deren Fassungsvermögen nicht größer als 40 kb ist.
- Die kürzlich von Smith et al., Science 236, 1448-1453, beschriebene NotI-Restriktionskarte von E. coli-DNA zeigt, daß die NotI- Verdauung von E. coli-DNA fünf DNA-Fragmente erzeugt, die durch das in-vitro-P1-Verpackungssystem dieser Erfindung verpackt werden können. Diese Fragmente sind 20 kb, 40 kb, 43 kb (zwei Fragmente dieser Größe) und 95 kb groß. Nach Inserieren von NotI-Fragmenten in pNS358-DNA und ihrem Klonieren in BS591- Bakterien wie für Sau3aI-Inserts beschrieben, wurde die Plasmid- DNA aus 5 Klonen untersucht. Die DNA von zwei der klonierten Plasmide enthielt nur die kan-R-Domäne von pNSS358. Als die DNA aus den anderen drei klonierten Plasmiden mit NotI verdaut wurde, wurde von ihnen gezeigt, daß sie außer der kan-R-Domäne des Vektors größere NotI-Fragmente als 30 kb mit sich führten. Die Größe dieser NotI-Inserts in diesen DNA wurde durch Pulsgelelektrophorese genauer bestimmt. Eines der Plasmide (Figur 8B, Bahn 11) enthielt ein NotI-Insert, das mit einem 40 kb-Marker in dem Gel wanderte, während die anderen beiden (Figur 8B, Bahn 9 und 10) Inserts enthielten, die wenig über einem 42,5 kb Marker wandern. Alle drei Klone enthielten ein 12 kb-NotI-Fragment, das der kan-R-Domäne des Vektors entsprach. Die DNA eines der Klone, die ein 43 kb-Insert (Bahn 10) enthielten, enthielt auch ein 6 kb-NotI-Fragment, dessen-Ursprung unklar war, da kein derartiges E. coli-Fragment beschrieben worden ist. Verdauung der in Bahn 10 dargestellten Plasmid-DNA mit BglII und XhoI statt mit NotI erzeugte eine Fragmentfamilie, deren Gesamtgröße 60 kb überschreitet, was die auf der NotI-Verdauung beruhende Größenabschätzung (Figur 8C, Bahn 2) bestätigt. Auf der Grundlage ihrer großen Größe müssen die drei Plasmide mit NotI-Inserts durch die großen P1-Köpfe (P1B) verpackt worden sein.
- Die Gene des E. coli-Tryptophanbiosynthese-Operons sind auf einem 95 kb-NotI-Fragment von E. coli-DNA vorhanden und wurden verwendet, um zu zeigen, daß ein Fragment dieser Größe in vitro in P1-Köpfe verpackt werden kann. Phagen, die sich aus der Verpackungsreaktion mittels NotI-verdauter E. coli-DNA ergaben, wurden zum Infizieren des trp&supmin;-Stamms NS3067 aus einen Lambda- P1:cre-Prophagen enthaltender E. coli verwendet. Die sich daraus ergebenden kan-R-Bakterien wurden isoliert und getestet, um zu bestimmen, ob sie auf Minimalagar in Abwesenheit von Tryptophan wachsen können. Zwei von 50 getesteten wuchsen. Die Plasmid-DNA wurde aus einem der Positiven Klone isoliert und durch Ethidiumbromidanfärbung (Figur 9A, Bahnen 3-4) oder durch Southern- Analyse von Pulsfeldgelen (Figur 9A, Bahnen 5-6) wurde gezeigt, daß sie ein 95 kb-E. coli-NotI-Fragment enthielten, das mit einer E. coli-trpE-Gensonde hybridisierte. Die Bahnen 3 und 5 enthielten die durch NotI verdaute Plasmid-DNA und die Bahnen 4 und 6 enthielten mit NotI verdaute E. coli-DNA. Als das Pulsfeldgel mit kan-R-Gen-DNA untersucht wurde, trat ein 12 kb-DNA- Fragment in der Bahn auf (Bahn 7), welches die trp-Plasmid-DNA enthielt, aber nicht in der Bahn (Bahn 8), die E. coli-DNA enthielt. Dieses Fragment entsprach der kan-R-Domäne von pNS358- DNA. Verdauung des trp-Plasmids und von E. coli-DNA (Figur 9B) mit einer Vielfalt von Restriktionsenzymen (BglII-XhoI, Bahn 1 und 2, HindIII, Bahn 3 und 4, SmaI, Bahn 5 und 6), gefolgt von Southern-Analyse mittels der trp-Plasmid-DNA als Sonde zeigte, daß die Plasmid-DNA viele Fragmente enthielt, die in der Größe mit echten E. coli-DNA-Fragmenten identisch waren. Bahn 1, 3 und 5 enthielt E. coli-DNA und Bahn 2, 4 und 6 enthielt trp-Plasmid- DNA. Wo Fragmente in den E. coli-Bahnen zugegen waren und in den Plasmid-Bahnen nicht oder umgekehrt, zeigt dies entweder, daß sie von dem Vektor stammten oder daß sie eine Verbindung zwischen Vektor und E. coli-DNA darstellten. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, daß das P1-Verpackungssystem bis zu 107 kb DNA (das 95 kb NotI-Insert zuzüglich der 12 kb-Plasmid- kan-R-Domäne) und daß der Vektor diese DNA verläßlich als extrachromosomales Plasmid repliziert.
- Zwei Mikrogramm pNS358-lyt-DNA wurden mit BamHI oder NotI verdaut und zum Klonieren von Sau3aI- beziehungsweise NotI-Fragmenten von E. coli-DNA wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Auf das in-vitro-Verpacken der Vektor-DNA mit den Sau3aI- oder NotI- Fragmentinserts wie in Beispiel 1 folgend wurde die verpackte chimäre DNA in Stamm NS2974 injiziert und kan-R-Transformanten wurden selektiert. Die DNA einzelner kan-R-Transformanten wurde wie in Beispiel 1 und im Abschnitt "Isolierung exogener, in pNS358-DNA klonierter DNA-Fragmente auf das in-vitro-Verpacken und Transformieren von Cre&spplus;-Zellen folgend" (S. 27-28), beschrieben isoliert und von ihr wurde durch Restriktionsenzymverdauung und Southern-Hybridisierungsanalye gezeigt, daß sie E. coli- Inserts enthielt. Zum Bestimmen, ob die Vektor-Insert-DNA durch das lytische Replikon in dem Vektor verstärkt werden kann, wurde eine Kultur des Bakterienstamms NS2974, der ein chimäres Plasmid enthielt, in die Hälfte geteilt und 3 Stunden entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM IPTG gezüchtet. Am Ende des Wachstumszeitraums wurde die gesamte Zell-DNA aus jeder der beiden Kulturen isoliert und die Plasmidkopienzahl wurde wie für das Plasmid pNS364 im vorstehenden, "Verstärkung eines ein kan- R-Gen, ein P1-Plasmid-Replikon und ein lytisches P1-Replikon enthaltenden Plasmids, pNS364" betitelten Abschnitt beschrieben gemessen. DNA aus der mit IPTG gezüchteten Kultur enthielt 20-30 Mal mehr Vektor-Insert-Plasmid-DNA als die aus der ohne IPTG gezüchteten Kultur isolierte DNA. Dieses Ergebnis wurde durch Isolieren superhelicaler, ringgeschlossener DNA aus den beiden Kulturen mittels CsCl-Ethidiumbromid-Äquilibriumsdichtegradienten bestätigt.
- Zum Bestimmen, ob die zum Klonieren von Escherichia coli-DNA- Fragmenten verwendeten Elemente des P1-Klonierungssystems (pNS5- 82, NS2961, NS2962 und BS591) zum wirkungsvollen Klonieren größenselektierter DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht aus einer Säuger-DNA-Quelle verwendet werden können, wurden die in Figur 10 dargestellten DNA-Fragmente mit BamHI-verdauter, mit alkalischer Phosphatase behandelter pNS582tet14-DNA ligiert. pNS582tet14-DNA wurde hier statt pNS582-DNA verwendet, weil sie die Analyse des Klonierungsverfahrens vereinfachte. Statt durch Isolieren und Verdauen von Plasmid-DNA mit pNS582tet14-DNA als Vektor zu bestimmen, ob eine besondere Transformante ein Insert enthielt, wurde die Transformantenfraktion mit Inserts einfach durch Bestimmen des Anteils kan-R-Zellen die tet-S waren, ermittelt. Ein dem in Tabelle 3 beschriebenen ähnlicher Versuch wurde ausgeführt, außer daß die größenselektierte Human-DNA statt der Escherichia coli-DNA verwendet wurde. Weniger als 2% der kan-R-Transformanten waren tet-S. Es schien, daß die niedrige Klonierungswirksamkeit der Human-DNA verglichen mit der bakteriellen DNA der Restriktion durch das Bakterien-mcr-AB- System zuzuschreiben war. Wie von Woodcock et al., Nucl. Acids Res. 16, S. 4465-4482 (1988), und Raleigh et al., Nucl. Acids Res. 16, S. 1563-1575 (1988), gezeigt, erkennt das mcrAB-System Methyl-CpG (MeCpG) enthaltende DNA als fremd und baut sie ab. Da das CpG-Basenpaar in Säuger- und Pflanzen-DNA häufig Methylcytosin enthält, wird diese methylierte DNA in einem mcrA&spplus; mcrB&spplus;- Empfänger-Bakterienstamm (wie etwa BS591) verdaut, bevor sie isoliert wird. Weiterhin besitzen Human-DNA-Fragmente, die isoliert werden, für die DNA-Sequenzen, in denen MeCpG unterrepräsentiert ist, wahrscheinlich eine große Vorliebe. Um diesen Punkt abzuhandeln, wurde der Empfängerstamm BS591 durch NS3145 ersetzt. Wie BS591 enthält der Stamm NS3145 ein konstitutiv exprimiertes P1-cre-Rekombinasegen zur Cyclisierung der injizierten linearen Vektor-DNA, ist aber anders als BS591 mcaA&supmin; und mcrB&supmin;. NS3145 enthält ferner ein F'lacIq-Plasmid, welches das lytische P1-Replikon in dem Vektor hemmt, bis IPTG zugesetzt wird (siehe Beispiel 2). Wenn NS3145 anstelle von BS591 verwendet wurde, erhöhte sich die Transformantenhäufigkeit von < 2% auf etwa 20-30%. Diese Häufigkeit war immer noch bedeutend niedriger als diejenige, die erhalten wurde, wenn Bakterien-DNA- Fragmente kloniert wurden. Diese Beobachtung könnte erklärt werden, wenn der Abbau MeCpG-haltiger DNA nicht nur in der mcrA&spplus;, mcrB&spplus;-Empfängerzellinie, sondern auch in Verpackungsextrakten erfolgte, welche aus mcrA&spplus;, mcrB&spplus;-Bakterien wie etwa NS2961 und NS2962 hergestellt wurden. NS2961 und NS2962 (NS3205 beziehungsweise NS3208) ähnliche Bakterienstämme wurden aufgebaut, außer daß sie mcrA&supmin;- und mcrB&supmin;- und recD&supmin;-Mutationen enthielten. Das recD-Gen erzeugt eine Hauptnuklease aus Escherichia coli, Exonuklease V. Wenn aus NS3205 und NS3208 hergestellte Verpackungsextrakte zum Verpacken von Ligierungsreaktionen wie den in Tabelle 3 beschriebenen, die BamHI-verdaute pNS582tet14-DNA und größenselektierte Sau3AI-verdaute Human-DNA-Fragmente enthielten, verwendet wurden und die sich daraus ergebenden Transformanten in NS3145 isoliert wurden, waren bis zu 60-80% der kan-R-Transformanten tet-S. Wenn im Gegensatz dazu die zum Herstellen der Verpackungsextrakte verwendeten Bakterienstämme recD&spplus; außer mcrA&spplus; und mcrB&spplus; waren, wurden tet-S-Transformanten mit keiner höheren Wirksamkeit (20-30%) als mit NS2961&supmin; und NS2962-Extrakten isoliert. Es wurde aus diesen Untersuchungen geschlossen, daß das mcrAB-System, das in beiden Verpackungsextrakten und in dem Cre&spplus;- Empfänger-Bakterienstamm zugegen war, das Klonieren von Human- DNA-Fragmenten durch Abbauen der DNA-Fragmente störte.
- Während die Verwendung von mcrA&supmin;, mcrB&supmin;-Bakterienstämmen zum Herstellen von Verpackungsextrakten und der Empfänger-Bakterienstämme, in welche die verpackte DNA injiziert wurde, zur Erzeugung eines hohen Prozentsatzes kan-R-Transformanten führte, die klonierte Human-DNA-Fragmente enthielten, zeigte die Analyse der Plasmid-DNA in diesen Transformanten, daß viele Transformanten klonierte Human-Fragmente enthielten, die kleiner waren, als auf der Grundlage der Größe der Ausgangspopulation der DNA erwartet. Zum Beispiel enthielten in einem Versuch, bei dem die Ausgangspopulation der Fragmente etwa 30 kb bis 80 kb groß war, die meisten isolierten Plasmide klonierte Fragmente im Bereich von 30-40 kb. Figur 11 zeigt die Ergebnisse für aus 12 kan-R, tet-S-Transformanten isolierte Plasmid-DNA. Diese DNA (Bahnen 2- 13) wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, nachdem sie durch die Restriktionsenzyme BglII und XhoI verdaut wurden. Mittels Lambda-Phagen-DNA-Größenstandards (Bahn 14) kann die Menge Human-DNA in jedem Plasmid durch Aufsummieren der Größe aller Fragmente in irgendeiner Bahn und anschließend Subtrahieren der Größe der kan-R-Domäne der pNS582tet14-Vektor-DNA (etwa 15 kb) bestimmt werden. Auf der Grundlage einer derartigen Analyse besaßen nur 3 von 48 untersuchten Plasmiden größere Inserts als 50 kb. Bahn 1 von Figur 11 enthielt BglII-XhoI-Verdautes eines Plasmids, das nur die kan-R-Domäne von pNS582 enthielt.
- Es wurde angenommen, daß die größeren Human-Fragmente aus zwei Gründen aus den isolierten Klonen ausgeschlossen waren: 1) Das Verhältnis großer zu kleiner P1-Köpfe betrug in dem in diesen Versuchen verwendeten Kopf-Schwanz-fähigen Extrakt 1:1. Dieses niedrige Verhältnis großer zu kleiner Köpfe (unter normalen Bedingungen ist es 10:1) war auf die in Stamm NS3205 vorhandene cm-2-Mutation zurückzuführen. Vermutlich verminderte der verringerte Anteil großer Köpfe in diesem Extrakt die Isolierung eines Vektors mit größeren klonierten Fragmenten. Überdies wurde dieser Effekt wahrscheinlich verschlimmert, weil kleinere DNA- Fragmente in irgendeiner Fragmentpopulation eher kloniert werden, da sie weniger als die großen Fragmente einem Brechen unterliegen. 2) Ein zweiter möglicher Grund für die bevorzugte Isolierung kleiner klonierter Fragmente ist auf die Natur der Ligierungsreaktionen, die das Substrat für das "headful"-P1-Verpacken erzeugen, und auf die Natur des nachstehend erörterten "headful"-Verpackungsverfahrens selbst zurückzuführen. Somit müssen Ligierungsreaktionen nicht in einem großen Überschuß Vektor-DNA durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß die zu klonierenden Fragmente mit Vektor-DNA statt mit anderen Fragmenten ligieren. Falls letzteres erfolgen sollte, würden DNA-Segmente, die aus verschiedenen Teilen des Genoms stammen, das kloniert werden soll, verbunden werden, ein Umstand, der falsche Genomkarten erzeugen würde. Falls Ligierungsreaktionen in einem größeren Vektorüberschuß bei verhältnismäßig hohen DNA-Konzentrationen (> 10 ug/ml) durchgeführt werden, werden Konkatemere erzeugt, die abwechselnd aus Vektor und Insert-DNA bestehen. Ein Beispiel eines derartigen Konkatemers, das erzeugt wird, wenn BamHI-verdaute, mit alkalischer Phosphatase behandelte pNS582tet14-DNA mit Sau3AI-verdauter Human-DNA ligiert wird, ist in Figur 12A dargestellt. Wenn dieses Konkatemer durch das "headful"-P1-Verpackungssystem verpackt wird, wird das Verpacken von einer pac-Stelle in einem der Vektormoleküle ausgelöst und ist nicht abgeschlossen, bis ein Kopf voll DNA (110-115 kb) in einen leeren P1-Kopf aufgenommen ist. Die Folge eines derartigen Verpackungsverfahrens ist, daß mehr als eine Kopie Vektor-DNA und mehr als ein Human-DNA-Fragment in einen einzelnen Phagenkopf verpackt werden kann, insbesondere wenn die mit der Vektor- DNA ligierten Fragmente bezüglich der Größe des vollen P1-Kopfes klein sind (Figur 12A). Dies bedeutet, daß die kleineren Human- DNA-Fragmente nicht nur in kleine P1-Köpfe verpackt werden können, sondern auch in große P1-Köpfe als Teil eines größeren Konkatemers verpackt werden können. Wenn diese verpackte Konkatemer-DNA in den Stamm NS3145 injiziert wird, werden alle durch loxP-Stellen flankierten DNA-Segmente cyclisiert und isoliert. In diesen eingeschlossen sind kan-R-Domänen-Plasmidmoleküle ohne Inserts und kan-R-Domänen-Plasmide mit kleinen Human- DNA-Inserts (Figur 12A).
- Zum Überwinden dieser Probleme wurden an dem Klonierungssystem zwei Änderungen durchgeführt. Zuerst wurde der Bakterienstamm NS3205 bei der Herstellung des Kopf-Schwanz-fähigen Extrakts durch NS3210 ersetzt. Da der erstere die cm-Mutation enthielt, erzeugte er 5-10 Mal mehr große P1-Köpfe als kleine P1-Köpfe. Sowohl die am131-Mutation in NS3210 als auch die am9,16-Mutation in NS3205 erzeugten einen Pacase-gestörten Phänotyp. Eine zweite Modifizierung an dem Klonierungssystem umfaßte das Ändern des Wegs, auf dem die Vektor-DNA verarbeitet wurde, bevor sie mit Insert-DNA ligiert wurde. Bei diesem Weg wurden während der Ligierungsreaktion keine Konkatemeren erzeugt. Um aus diesem Weg Nutzen zu ziehen, wurde die pNS582tet14-Vektor-DNA wie vorstehend beschrieben modifiziert, indem ein stuffer-Fragment von etwa 10 kb (10,6 kb) aus Adenovirus-DNA in die einzige ScaI- Stelle in der amp-R-Domäne des Vektors so inseriert wurde, daß in das Endprodukt (pNS582tet14Ad10) etwa 10-11 kb stuffer-DNA- Fragment zwischen die ScaI-Stelle und einer näher zum Plasmid- Replikon gelegene loxP-Stelle inseriert wurden (Figur 4). Die Größe zu klonierende DNA lag im Bereich von 60 kb bis etwa 90 kb. Das stuffer-Fragment wurde in eine Stelle inseriert, die während der Cyclisierung nicht isoliert wurde. Das modifizierte Ligationsverfahren bestand aus dem Spalten von pNS582tet14Ad10- DNA mit ScaI und BamHI und Behandeln des Produkts mit alkalischer Phosphatase. Zwei Vektor-Fragmente (Arme) wurden durch dieses Verfahren erzeugt, die mit den Sau3AI-verdauten, größenselektierten Human-DNA-Fragmenten an ihren BamHI-Enden ligieren konnten, aber nicht an jede DNA in der Reaktion an ihren ein stumpfes Ende erzeugenden Stellen, den ScaI-Enden, ligieren konnten. Der letzte Umstand verhinderte die Bildung von Konkatemeren und führte zu ligierten Produkten, die aus Human-DNA- Fragmenten bestanden, die zwischen den beiden Vektorarmen (Figur 12B) lagen. Der kürzere Vektorarm enthielt die pac-Stelle, aus der das Verpacken gestartet wird, und beide Vektorarme enthielten loxP-Stellen. Die Größe der Insert-DNA in der in Figur 12B dargestellten Struktur bestimmte, ob das Insert isoliert wird. Falls das Insert weniger als 70 kb groß ist, gibt es nicht genug DNA zwischen pac und dem Molekülende zum Auffüllen des Kopfs und das Verpacken wird abgebrochen. Falls das Insert größer als 95 kb ist, wird der Kopf gefüllt, bevor die entferntere loxP-Stelle verpackt worden ist und die verpackte DNA wird nicht isoliert, weil sie nicht recyclisieren kann, nachdem sie in den Cre&spplus;-Empfänger-Bakterienstamm, NS3145, injiziert ist. Der Größenbereich der DNA, die mit Vektorarmen verpackungsfähig ist, entspricht der Größe der DNA zwischen der entfernten loxP-Stelle und dem rechten Ende des ligierten Moleküls (Figur 12B), nämlich der Größe des Adenovirus-stuffer-Fragments.
- Unter Verwenden von Extrakten, die aus den Zellinien NS3208 und NS3210 stammen, dem pNs582tet14Ad10-Vektor, Empfänger-Stamm NS3145 und größenselektierter Human-DNA-Fragmente im 60-90 kb- Bereich (Fraktionen 6-9, Figur 10) wurden kan-R-Transformanten erzeugt, von denen fast alle (> 80%) Human-DNA-Inserts enthielten, die im 70-90 kb-Größenbereich lagen. Figur 13 zeigt die DNA aus einigen Klonen mit Inserts (Bahnen 1-6; 10-13), die auf BalII- und XhoI-Verdauung und Agarose-Gelelektrophorese folgte. Als Kontrolle wurde ferner verdaute kan-R-Domänen-DNA ohne ein Insert (Bahn 7) und ein HindIII-verdauter λ-DNA-Marker (23 kb, 9 kb, 6 kb, 4,3 kb, 2,3 kb und 2,0 kb) (Bahn 8) gezeigt. Die DNA in Figur 13 wurde durch Ethidiumbromidanfärben und die in Figur 13B durch Hybridisierung mit einer Human-Gesamtgenom-DNA- Sonde nach Southern-Überführung sichtbar gemacht. Das letztere Verfahren wies etwa 1/2 - 2/3 der Human-DNA-Fragmente nach. Da kleinere Fragmente als 70 kb in diesem Klonierungsverfahren isoliert wurden, schien es, daß die Notwendigkeit, den P1-Kopf vollständig zu füllen, nicht zwingend ist.
Claims (29)
1. Verfahren zum in-vitro-"headful"-Verpacken und Klonieren
bis 95 kb großer Fremd-DNA-Fragmente, umfassend:
(a) Modifizieren von Vektor-DNA durch Inserieren eines Stuffer-
Fragments, innerhalb dessen das "headful"-Verpacken beendet
wird, in eine ein stumpfes Ende erzeugende Stelle, die
einer Bakteriophage-P1-pac-Stelle nahe liegt, worin das
Stuffer-Fragment in der Weise ausgerichtet ist, daß sich
die das stumpfe Ende erzeugende Stelle etwa zwei Kilobasen
von einer pac-Stelle in Richtung des Uhrzeigerlaufs
befindet;
(b) Verdauen des Produkts aus Schritt (a) unter Erzeugen zweier
Vektorarme, von denen jeder (i) ein stumpfes Ende, (ii) ein
weiteres Ende, das mit dem Fremd-DNA-Fragment verträglich
ist, das kloniert werden soll, und (iii) eine loxP-Stelle
enthält;
(c) Ligieren der Fremd-DNA an das Produkt von Schritt (b) ohne
Erzeugen von Konkatemeren;
(d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) mit zur pac-Spaltung
befähigtem Extrakt und Kopf-Schwanz-fähigem Extrakt, wobei
das Verhältnis von großen Köpfen zu kleinen Köpfen im Kopf-
Schwanz-Extrakt mindestens 5:1 beträgt;
(e) Infizieren eines Cre&spplus;-Bakterienstammes mit dem Produkt von
Schritt (d) und
(f) Gewinnen der klonierten DNA.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das
Stuffer-Fragment eine Größe im Bereich von 5 kb bis 20 kb besitzt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem das
Stuffer-Fragment das ScaI-BamHI-Fragment mit 10 kb aus Adenovirus-DNA ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das System zum
invitro-"headful"-Verpacken aus
(i) zur pac-Spaltung befähigtem Extrakt, der aus einem NS3208
(ATCC 68073) bezeichneten Bakterienstamm hergestellt wurde,
und
(ii) Kopf-Schwanz-fähigem Extrakt, der aus einem NS3210 (ATCC
68074) bezeichneten Bakterienstamm hergestellt wurde,
besteht.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der
Cre&spplus;-Bakterienstamm einen lacIq-Repressor besitzt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem IPTG zum
Dereprimieren des lacIq-Repressors zugesetzt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die klonierte DNA
der Größe nach ausgewählt ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem der
Cre&spplus;-Bakterienstamm der NS3145 (ATCC 68072) bezeichnete Stamm ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Produkt von
Schritt (e) verstärkt und anschließend isoliert wird.
10. Vektor zum Klonieren von bis zu 95 kb großen Fremd-DNA-
Fragmenten in einem in Anspruch 1 definierten System zum
invitro-"headful"-Verpacken.
11. Vektor zum Klonieren von DNA-Fragmenten, der die folgende
Sequenz umfaßt:
BakteriophageP1-Bakteriophage-loxP-Stelle - Ampicillinresistenzgen mit einer ScaI-Stelle - pBR322 ori - P1-
pac - P1-Bakteriophage-loxP-Stelle - Tetracyclinresistenzgen mit
einer BamHI-Stelle und einer Sall-Stelle, welche die in einer
Polylinker-Klonierungsstelle vorhandene BamHI- und SalI-Stelle
ersetzen - lytisches P1-Bakteriophagenreplikon, das unter
Kontrolle eines lac-Promotor steht - Kanamycinresistenzgen - P1-
Bakteriophage-Plasmidreplikon, worin die Sequenz in der Weise
zirkularisiert ist, daß das P1-Bakteriophage-Plasmidreplikon an
die erste P1-Bakteriophage-loxP-Stelle gebunden ist, so daß die
Sequenz entgegen der Richtung des Uhrzeigerlaufs gelesen wird.
12. Vektor gemäß Anspruch 11, worin ein DNA-Stuffer-Fragment in
die ScaI-Stelle des Ampicillinresistenzgens kloniert ist.
13. Vektor gemäß Anspruch 12, worin das in die ScaI-Stelle
klonierte DNA-Fragment eine Größe im Bereich von 5 bis 20
Kilobasen hat.
14. Vektor gemäß Anspruch 13, worin ein ScaI-BamHI-Fragment mit
10 kb aus Adenovirus-DNA in die ScaI-Stelle des
Ampicillinresistenzgens inseriert wird.
15. Bakterienstamm, der mit dem Phagenmutanten P1 c1.100 cm-2
rm&supmin; am 10.1 lysogenisiert wurde, mit dem Genotyp recD&supmin; hsdR&supmin; hsdM&spplus;
mcrA&supmin; mcrB&supmin;, wobei der Stamm zum Herstellen zur pac-Spaltung
befähigten Extrakts zum Klonieren von DNA-Fragmenten verwendet
wird.
16. Bakterienstamm gemäß Anspruch 15, der als NS3208 (ATCC
68073) bezeichnet wird.
17. Bakterienstamm, der mit dem Phagenmutanten P1 c1.100 cm rm&supmin;
am 131 lysogenisiert wurde, mit dem Genotyp recD&supmin; hsdR&supmin; hsdM&spplus;
mcrA&supmin; mcrB&supmin;, wobei der Stamm zum Herstellen Kopf-Schwanz-fähigen
Extrakts mit einem Verhältnis Phagen mit großen Köpfen zu Phagen
mit kleinen Köpfen von etwa 10:1 verwendet wird und der Extrakt
zum Klonieren von DNA-Fragmenten verwendet wird.
18. Bakterienstamm gemäß Anspruch 17, der als NS3210 (ATCC
68074) bezeichnet wird.
19. Bakterienstamm, der mit dem Phagenmutanten P1 c1.100 cm-2
rm&supmin; am 9.16 lysogenisiert wurde, mit dem Genotyp recD&supmin; hsdR&supmin; hsdM&spplus;
mcrA&supmin; mcrB&supmin;, wobei der Stamm zum Herstellen Kopf-Schwanz-fähigen
Extrakts zum Klonieren von DNA-Fragmenten verwendet wird.
20. Bakterienstamm gemäß Anspruch 19, der als NS3205 bezeichnet
wird.
21. Cre&spplus;-Bakterienstamm mit einem lacIq-Repressor, wobei der
Stamm den Genotyp recA&supmin; hsdM&spplus; hsdR&supmin; mcrA&supmin; mcrB&supmin; besitzt.
22. Bakterienstamm gemäß Anspruch 21 mit der Bezeichnung NS3145
(ATCC 68072).
23. Verfahren zum in-vitro-P1-Bakteriophagenverpacken der DNA
des Vektors von Anspruch 11 mit einem darin inserierten exogenen
DNA-Fragment, welches das Zusammenbringen der DNA des
fragmenthaltigen Vektors mit zur pac-Spaltung befähigtem Extrakt und
Kopf-Schwanz-fähigem Extrakt umfaßt, wobei das Fragment eine
Größe von 95 kb oder weniger besitzt.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei der zur pac-Spaltung
befähigte Extrakt aus dem NS2962 (ATCC 67664) oder NS3208 (ATCC
68073) bezeichneten Bakterienstamm hergestellt ist.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei der Kopf-Schwanz-fähige
Extrakt aus dem NS2961 (ATCC 67665) oder NS3210 (ATCC 68074)
bezeichneten Bakterienstamm hergestellt ist.
26. Verfahren zum Klonieren und Steuern der Verstärkung von
DNA-Fragmenten, umfassend:
(a) Inserieren eines exogenen DNA-Fragments in den Vektor der
Ansprüche 12 oder 13;
(b) Zusammenbringen des Produkts von Schritt (a) mit zur pac-
Spaltung befähigtem Extrakt und Kopf-Schwanz-fähigem
Extrakt;
(c) Infizieren eines grämnegativen Cre&spplus;-Bakterienstammes mit
einem lacIq-Repressor mit dem Produkt von Schritt (b);
(d) Dereprimieren des lacIq-Repressors durch Hinzufügen von
IPTG zu dem Produkt von Schritt (c) und
(e) Isolieren der klonierten und verstärkten DNA.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei der Cre&spplus;-Bakterienstamm
der NS2974 (ATCC 53759) oder NS3145 (ATCC 68072) bezeichnete
Stamm ist.
28. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei der zur pac-Spaltung
befähigte Extrakt aus dem NS2962 (ATCC 67664) oder NS3208 (ATCC
68073) bezeichneten Bakterienstamm hergestellt ist.
29. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei der Kopf-Schwanz-fähige
Extrakt aus dem NS2961 (ATCC 67665) oder NS3210 (ATCC 68074)
bezeichneten Bakterienstamm hergestellt ist.
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| NO920704D0 (no) | 1992-02-21 |
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