JPH05503626A - ９５ｋｂの大きさのｄｎａ断片をクローニングするための生体外ヘッドフルパッケージング系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２２、Ｎ５３２０５という呼称の請求の範囲第２１項に記載の細菌株。

１０．１で溶原化された細菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするためｐ ａＣ開裂堪能抽出物を調製するのに用いられる細菌株。

２４、　Ｎ５２９６２という呼称の請求の範囲第２３項に記載の細菌株。

２５、遺伝子型ｒｅｃＤ　”　ｈｓｄＲ”　ｈｓｄＭ”　ｍｃｒＡ　”　ｍｃｒ Ｂ　”を有する四極子ファージ変異体Ｐｉ　ｃｌ、　１０Ｏｒ！Ｉ−ｃｍ−２ａ ｍ９．１６で溶原化された細菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするため に役立つ頭−尾堪能抽出物を調製するのに用いられる細菌株。

２６、　Ｎ５２９６１という呼称の請求の範囲第２５項に記載の細菌株。

２７、　ｌａｃ　Ｉ　ｑ抑制因子の欠如したＢ５５９１という呼称のＣｒｅ”細 菌株において、ＤＮＡ断片のクローニングに有用な細菌株。

２９、　Ｎ５３１４５という呼称をもつ、請求の範囲第２８項に記載の菌株。

３１、　Ｎ５２９７４という呼称をもつ請求の範囲第３０項に記載の菌株。

３２、（ａ）ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに結紮し：（ｂ）工程（ａ）の生成物 質を座切断プロフィシエンド抽出物及び頭−尾プロフィンエンド抽出物と接触さ せ。

（Ｃ）　ｌａｃ　Ｉ　９リプレツサーを工程（ｂ）の生成物質に感染させ； （ｄ）　ＩＰＴＧを培地に添加し；そして（ｅ）クローン化及び増幅化ＤＮＡを 回収することから成る、ｌａｃプロモーターの制御下で多複写レプリコンを含有 するベクター中での９５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片のクローニング及び増幅制御 方法。

３３、　（ａ）請求の範囲第１２項のベクターのポリリンカークローニング部位 の中に外因性のＤＮＡ断片を挿入し：　。

（ｂ）工程（ａ）の生成物を座開裂堪能抽出物及び頭−尾堪能抽出物と接触させ ： （ｃ）　ｌａｃ　Ｉ　９抑制因子をもつＣｒｅ”グラム陰性菌株を工程（ｂ）の 生成物で感染させ： （ｄ）工程（Ｃ）の生成物に対してＩＰＴＧを付加することにより１ａｃＩ９抑 制因子を抑制解除し：及び（ｅ）クローニングされ増幅されたＤＮＡを回収する 段階、 を含む９５ｋｂもの大きさのＤＮＡ断片の増幅をクローニングし制御する方法。

３４、　Ｃｒｅ”細菌株が、Ｎ５２９７４又はＮ５３１４５という呼称の菌株で ある、請求の範囲第３２項又は３３項に記載の方法。

３５［四−開裂堪能抽出物がＮ５２９６２又はＮ５３２０ｇという呼称の細菌株 から調製される、請求の範囲第３２項又は第３３項に記載の方法。

３６、頭−尾堪能抽出物がＮ５２９６１又はＮ５３２１０という呼称の細菌株か ら調製される、請求の範囲第３２項又は第３３項に記載の方法。

３７、　（ａ）請求の範囲第１１項のベクターのポリリンカークローニング部位 の中に外因性ＤＮＡ断片を挿入し：（ｂ）　ｐａｃ開裂堪能抽出物と頭−尾堪能 抽出物と、工程（ａ）の生成物を接触させ。

（ｃ）工程（ｂ）の生成物でＣｒｅ″″グラム陰性菌株を感染させ；及び （ｄ）クローニングされたベクターＤＮＡを回収する、 を含む、９５ｋｂはどの大きいＤＮＡ断片をクローニングする方法。

３８、　Ｃｒｅ“菌株がＢ５５９１という呼称の細菌株である、請求の範囲第３ ２項に記載の方法。

３９、　ｐａｃ−開裂堪能抽出物及び頭−尾堪能抽出物と断片含有ベクターのＤ ＮＡを接触させる段階を含む、中にオファージハンゲージングのための方法にお いて、この断片は９５ｋｂ以下のサイズを有する方法。

４０　前記王−開裂堪能抽出物がＮ５２９６２又はＮ５３２０８という呼称の細 菌株から調製される、請求の範囲第３９項に記載の方法。

４１　頭−尾堪能抽出物がＮ５２９６１又は１ｌｓ３２１０という呼称の細菌株 から調製される、請求の範囲第３９項に記載の方法。

４２、　（ａ）請求の範囲第１４項又は第１５項のベクター内に外因性ＤＮＡ断 片を挿入し； （ｂ）工程（ａ）の生成物を諸−開裂堪能抽出物及び頭−尾堪能抽出物と接触さ せ： （ｃ）工程（ｂ）の生成物１ａｃ　Ｉｑ９抑制因子を有するＣｒｅ”″グラム陰 性菌株を感染させる； （ｄ）工程（Ｃ）の生成物にＩＰＴＧを付加することにより、１ａｃＩ９抑制因 子を抑制解除し、及び（ｅ）クローニングされ増幅されたＤＮＡを回収する、 を含む、ＤＮＡ断片のクローニング及び増幅制御方法。

４３、　Ｃｒｅ”細菌株がＮ５２９７４又はＮ５３１４５という呼称の菌株であ る、請求の範囲第４２項に記載の方法。

４４、仮四−開裂堪能抽出物がＮ５２９６２又はＮ５３２０８という呼称の細菌 株から調製される、請求の範囲第４２項に記載の方法。

４５、頭−尾堪能抽出物がＮ５２９６１又はＮ５３２１０という呼称の細菌株か ら調製される、請求の範囲第４２項に記載の方法。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 ９５ＫＢの大きさのＤＮＡ断片をクローニングすｌるための生体外へラドフルパ ッケージング系関連出願についてのクロス・リファレンス本出願は、１９８８年 ４月１５日に出願した米国特許出願筒０７／１８２．１１２号の一部継続出願で ある。

発明の分野 本発明は、ＤＮＡ断片をクローニングするための系、特に９５ｋｂの大きさのＤ ＮＡ断片をクローニングするための生体外へラドフルパッケージング系（ｈｅａ ｄｆｕｌ　ｐａｃｋａ−ｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）に関する。クローニングされ たＤＮＡの増幅もまた制限することができる。

発明の背景 組換えＤＮＡ法により、大腸菌　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）のような細菌中で増殖されるベクターを用いる高等真核生物（植物及び 動物）の染色体からのＤＮＡ断片をクローニングし、増幅することができるよう になった。

ＤＮＡがその取込みに対して受容能を持った細菌中に直接導入されるものである 場合には、細胞中へのＤＮＡ取込みの効率は、ＤＮＡの大きさが２０ｋｂより増 大すると劇的に低減するために、ＤＮＡはかなり小さくなければならない（２０ ｋｂ未満）。したがって、細菌中に大きなりＮＡを導入するために、別の供給経 路が探究された。バクテリオファージベクターＤＮＡをウィルス粒子中にパッケ ージングする技術が、この要求を満たすために開発された。それは、隣接単位効 率を用いた感染により細胞にパッケージＤＮＡを供給するという利点を有する。

Ｂｒｕｎｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４．８５−１０７（１９７８）、 及びＣｏ１１ｉｎｓｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、、　７５．４２４２−４２４６（１９７８）は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１．２５５−２８０（１９７５）が開発したラムダバク テリオファージの生体外パッケージング反応を利用して、クローン化した大型挿 入物をプラスミドとラムダバクテリオファージＣＯ３位置との融合物であるコス ミドベクター中にパッケージングした。ＣＯＳ部位は、ラムダ　バクテリオファ ージ頭部へのＤＮＡのバ、ケージングを開始するのに必要な認識要素を提供する 。

ラムダバクテリオファージ生体外パッケージング反応の大きな欠点は、ラムダバ クテリオファージ頭部が４９、５ｋｂより大きなりＮＡを収容できないことであ る。したがって、ＣＯＳベクターそれ自体は約２ｋｂの大きさであることを考慮 すると、その場合４７ｋｂ未満のクローン可能ＤＮＡをベクターに挿入して、ラ ムダバクテリオファージ頭部中にパッケージングし得る（Ｍｕｒｒａｙ、　Ｌａ ｍｂｄａ　ｌＩ２３６、３９５−４３２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８６）。

したがって、ラムダファージは５０ｋｂより大きな遺伝子をクローニングするた めに用いることはできず、″歩行”又゛は“跳躍”プロトコールによる数メガ塩 基の大きさのＤＮＡの染色体セグメントのマツピングは難しく、ラムダバクテリ オファージ系の限界を示す。大型ＤＮＡ断片をクローニングするための可能性の ある道具として２つの系が、研究者によって探査された：即ちラムダバクテリオ ファージより大きい頭部を有するファージ系と、酵母菌クローニングベクターで ある。

Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏｌ、［１ｉｏ１．　１８５，５６５−５７ ８（１９８５）は、Ｔ４ＤＮＡ（約１６５キロ塩基）がＴ４バクテリオファージ 中に生体外でパッケージングされることを立証した。その反応の効率は、１０’ −１０’プラ一ク形成単位（ＰＦＵ）　／添加Ｔ４ＤＮＡマイクログラムである 。しかしながら、Ｂｌａｃｋ。

Ｇｅｎｅ　４６．９７−１０１（１９８６）は、種々の種類のベクターＤＮＡを １４頭部にパッケージングし、適切な細菌に注入後にそのＤＮＡを回収するため に努力しても、効率は１０２−１０”　ＰＦＵ／添加Ｄ　Ｎ　Ａ　ａｙに過ぎな いことを示した。Ｂｌａｃｋの結果は、哺乳類細胞のもののような（即ち、１５ ０ｋｂの約２０、０００挿入物の等価物）　１５０ｋｂの複合ゲノムの完全ライ ブラリーを生成するためにＴ４パッケージング系を用いるのは非常に難しいと考 えられる、ということを示唆する。

第二の、そしておそらくはさらに難しい問題は、大型ＤＮＡ断片をクローニング 及び増幅するＴ４パッケージング能力を利用し得るクローニングベクターが存在 しないことである。実際、Ｔ４パッケージングを開始するのに要するおおよその Ｔ４配列は非常に小さいことが公知であるために、このようなベクターを構築す ることは困難である。

Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．８０６−８１２（１９ ８７）は、酵母菌においてミニクロモソームとして哺乳類ＤＮＡの大型セグメン トをクローニングすることができた。挿入すべきＤＮＡを、酵母菌複製要素、酵 母菌分配要素又は動原体、及び酵母菌テロメアを含有するベクター中にクローニ ングし、その結果生じるキメラＤＮＡを直接ＤＮＡ形質転換によって酵母菌中に 導入する。１００ｋｂより大きなりＮＡの挿入物を伴うミニクロモソームが確認 された。

この系に関しては、２つの問題がある。先ず、ＤＮＡの挿入物を伴う酵母菌クロ ーンは、非常に非効率的に生成される：前記の実験では、約３００クローン／挿 入ＤＮＡＨが生成された。第二に、ＤＮＡ挿入物を伴うクローンを一旦利用する と、挿入ＤＮＡをプローブ及び回収するのが困難である。形質転換酵母菌細胞に おいては、ミニクロモソームは細胞縁ＤＮＡの１：２００未満を示し、その結果 、ＤＮＡハイブリダイゼーション法によって検出されるに過ぎない。さらに、各 形質転換細胞内では、挿入物は増幅されない。挿入物のセグメントは、プラスミ ド中にサブクローニングし、細菌中に奪還することにより回収される。

関連の別の系は、Ｇａ１ｔａｎａｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４６．１ −１１（１９８６）に記載されている。ラムダベクターは、ＤＮＡを挿入し、そ の後細胞に注入するものであると記載されてイル。注入ＤＮＡは、１コピー／細 胞で宿主の染色体に組込まれるか又は染色体外的に多数コピー／細胞で細胞中に 維持される。このベクターは３０ｋｂ未満のＤＮＡを収容し得るが、一方組込ま れたプロファージは、その挿入が組込み化プロファージでそれを重複する二次感 染ラムダキメラを用いた相同組換えにより有意に増大し得る。

この方法では、あらゆるプロファージの隣接ＤＮＡのセグメントは１００ｋｂ以 上に増大され、その後染色体外状態のベクターを誘導することにより増幅される 。しかしながら、これを達成するためには、ＤＮＡの少なくともいくつかの隣接 及び重複する小型セグメントをクローニングしておく必要があり、そして組換え によってそれらを一緒に緊縮する困難な方法が実施される。さらに、一旦それが 構築されれば、大き過ぎてラムダウィルス粒子中にパッケージングされないため に、大型ＤＮＡを回収するのは難しい。その染色体外状態のＤＮＡの直接単離も 、それが大きいために難しい。

近年、Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、　Ｆｏｃｕｓ、　ｐａｇｅ　４１−４６．　Ｖｏ ｌ、１１．　Ｎｏ。

３　（Ｓｕｍｍｅｒ　１９８９）はＥ、　ｃｏｌｉのメチル化ＤＮＡのクローニ ング及び構築に関連したいくつかの難しい点を検討した。

４５ページに示唆されている対応策は、このようなりローニング（メチル化ＤＮ Ａの）が、ＭｃｒＢ系の両要素を含む３つの公知のメチル化依存制限系を欠いた 宿主中で実施すべきであるというものである。

本発明は、以下の： （ａ）スタッファ−（５ｔｕｆｆｅｒ）断片を、諸部位に近接するプラント末端 生成部位に挿入することによりベクターＤＮＡを修飾し： （ｂ）工程（ａ）の生成物質を消化して、その各々が（ｉ）プラント末端、（■ ）クローニングすべき外来ＤＮＡ断片に適合する別の末端、及び（ｆｆｌ）　ｌ ｏＩＰ部位を含有する２つのベクターアームを生成し： （Ｃ）コンカテマーを生成せずに外来ＤＮＡを工程（ｂ）の生成物質に結紮し： （ｄ）工程（Ｃ）の生成物質を、諸切断プロフィシエンド抽出物及び頭−尾プロ フイシエント抽出物（この場合、頭−尾抽出物中の大型頭部対小型頭部の比は少 なくとも５・１である）と反応させ； （６）　Ｃｒｅ＋細菌株を工程（ｄ）の生成物質に感染させ：そして （ｆ）クローン化ＤＮＡを回収する ことから成る、９５ｋｂの大きさの外来ＤＮＡ断片をクローニングするための生 体外ヘッドフルパッケージング系に関する。

本発明はさらに、以下の： （ａ）ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに結紮し。

（ｂ）工程（ａ）の生成物質を座切断プロフィシエンド抽出物及び頭−尾プロフ イシエント抽出物と接触させ；させ； （ｄ）　ＩＰＴＧを培地に添加し：そして（ｅ）クローン化及び増幅化ＤＮＡを 回収することから成る、肋■プロモーターの制御下で多複写レプリコンを含有す るベクター中での９５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片のクローニング及び増幅制御方 法に関する。

別の態様においては、本発明は、９５ｋｂの大きさのＤＮＡの外来断片をクロー ニングするのに有用なベクターにソエンド抽出物を調製するための溶源菌は、本 発明の別の態様を構成する。

Ｂ５５９１、Ｎ５２９７４、及びＮ５３１４５と命名されたＣｒｅ＋グラム陰性 菌株を特に、本発明のベクターで感染及び形質転換するよう処理した。Ｂ５５９ １は、１ａｃｌｑリプレツサー遺伝子を有していない。他方、Ｎ５２９７４及び Ｎ５３１４５は、１ａｃｌｑリプレツサー遺伝子を有し、したがって一旦形質転 換されるとＩＰＴＧが添加されるまでＬａｃプロモーターを抑制する。

図面の簡単な説明 図１は、Ｐ１バクテリオファージクローニング及び増幅系を全般的に説明する。

図２は、本発明に関するＰ１遺伝子及び要素をマツピングする。

図３は、本発明のベクターの構築を説明する。

図４は、ベクターｐＮＳ５８２喪１４及びｐＮＳ５ｇ２川１５ＡｄｌＯの構築を 説明する。

図５Ａは、６００ｂｐデルタ−３しり断片が両端でガンマ３２Ｐ−ｄＡＴＰで標 識されたことを説明する。

図５Ｂは、ｐｃｐ”パッケージング抽出物の巴切断活性を説明する。

図６Ａは、Ｃｒｅ組換え酵素を作用させた場合のｐＮＳ３５８のＤＮＡの解離を 説明する。

図６Ｂは、ベクターＤＮＡが形質転換Ｂ５５９１細菌においてＣｒｅにより作用 されることを説明する。

図７Ａは、ｐＮＳ３６４の構造を示す。

図７Ｂは、ｋａｎ−Ｒ遺伝子、Ｐ１プラスミドレプリコン、及びＰｌ溶菌レプリ コンを含有するプラスミドｐＮＳ３６４の増幅を説明する。

図８Ａ−８Ｃ及び９Ａ−９Ｂは、パッケージ化ｐＮＳ３５８ＤＮＡ、及びそれを 含有するＥ、ｃｏｌｉ挿入物の回収及び特性を説明する。

図１０は、ショ糖勾配によるサイズ分画化ヒト挿入ＤＮＡの回収を説明する。

図１１は、パッケージ化ｐＮｓ５ｇ２ｔｅｔｌイ　ＤＮＡ、及びそれを含有する ヒトＤＮＡ挿入物の回収及び特性を説明する。

図１２は、ヒトＤＮＡ挿入物をｐＮｓ５８２ｔｅｔ１４ベクターＤＮＡ又はｐＮ Ｓ５８２セ巳１４υ見０ベクターＤＮＡのアームに結紮する場合に生成される結 紮生成物質を説明する。

それを含有するヒト挿入物の回収及び特性を説明する。

ＤＮＡバンドは、エチジウムプロミド染色により検出した。

図１．３Ｂは１３Ａと同じものであるが、但しバンドはヒトゲノムＤＮＡプロー ブとのハイブリダイゼーションにより検出した。

寄託の説明 本発明に関する以下の細菌及びプラスミドは、ブダペスト条約に基づいて＾ｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒ ｙｌａｎｄ　２０８５２−１７７６に寄託された。

ｐＮ３２０は、ＡＴＣＣ寄託番号６７６６６であった。

ｐＮＳ４２は、ＡＴＣＣ寄託番号６７６６７であった。

Ｂ５５９１は、ＡＴＣＣ寄託番号５３７６０であった。

Ｎ５２９６１は、ＡＴＣＣ寄託番号６７６６５であった。

Ｎ５２９６２は、ＡＴＣＣ寄託番号６７６６４であった。

Ｎ５２９７４は、ＡＴＣＣ寄託番号５３７５９であった。

Ｎ５３２０８は、ＡＴＣＣ寄託番号６８０７３であった。

Ｎ５３２１．０は、ＡＴＣＣ寄託番号６８０７４であった。

Ｎ５３１４５は、Ａ　ＴＣＣ寄託番号６８０７２であった。

るのに必要な部位を示す属名である。

諸切断堪能（プロフィンエンド）抽出物は、座部位を切断し、したがってパッケ ージングを開始するために必要な認識蛋白質を含有する。

頭−尾堪能（プロフィンエンド）抽出物は、クローン化ＤＮＡをウィルス粒子中 にパッケージングするのに必要な頭部及び尾部を含有する。

コンカテマーという用語は、頭−尾構築内に配列される反復単位から成るＤＮＡ 分子を意味する。

スタ、ファー断片という用語は、非反復部位でベクターＤＮＡに挿入されるＤＮ Ａ断片を示し、その中でヘッドフルパッケージングが終止する。

バクテリオファージ及びファージという用語は、本明細書中ではどちらも同じ意 味で用いる。

本明細書中に記載のクローニング系は、ラムダコスミドクローニングによって得 られるものの少なくとも２倍の大きさのＤＮＡ断片を単離できる９５ｋｂの大き さの外来ＤＮＡ断片をクローニングするためにヘッドフル生体外パンケージング 系を用いる。このクローニング能力の増大は、以下の実用性を生み出す： （１）　４５−９５ｋｂの範囲の、特に７Ｏ−９０ｋｂの範囲の大きさの遺伝子 は、直接クローニングし得るし、２５−４５ｋｂの範囲の大きさの遺伝子はさら に容易Ｊこクローニングし得る。

（２）染色体“歩行”及び“跳躍”法は、少な（とも２つのうちの１因子により スピードアップされ得るし、−緒に連鎖される必要がある隣接セグメントの数の 減少のためにさらに厳密であるべきである。

（３）本発明のクローニング系は、他の方法では溶液から十分にＤＮＡを取り込 まない細菌に効率よ＜ＤＮＡを供給するための手段として有用である。

特に、９５ｋｂの大きさの外来ＤＮＡ断片をクローニングするための本発明のへ ラドフルパッケージング系は、以するプラント末端生成部位に挿入することによ りベクターＤＮＡを修飾し； （ｂ）工程（ａ）の・生成物質を消化して、その各々が（ｉ）プラント末端、（ ｉｆ）　クローニングすべき外来ＤＮＡ断片に適合する別の末端、及び（ｆｆｌ ）　１ｏｘＰ部位を含有する２つのベクターアームを生成し：９ （Ｃ）コンカテマーを生成せずに外来ＤＮＡを工程（ｂ）の生成物質に結紮し。

（ｄ）工程（Ｃ）の生成物質を、江切断プロフィシエンド抽出物及び頭−尾プロ フィシエント抽出物（この場合、頭−尾抽出物中の大型頭部対小型頭部の比は少 なくとも５：１である）と反応させ： （ｅ）　Ｃｒｅ’細菌株を工程（ｄ）の生成物質に感染させ、そして （ｆ）クローン化ＤＮＡを回収する ことから成る。

本明細書に記載の多数の要素がＰ１バクテリオファージクローニング系に関係す るけれども、当業者は、ＤＮＡジング抽出物）は除いて、以下で考察する多数の 要素、例えば１ａｘ−Ｃｒｅ組換え系、プラスミドレプリコン、及び多複写又は 溶菌レプリコンは、パッケージ化ＤＮＡの回収に関係し、その他のクローニング 系、例えばバクテリオファージ、酵母菌等を用いてＥ、ｃｏｌｉのような細菌中 でＤＮＡを回収するために用い得る。

本発明の実施に適したバクテリオファージは、大きな頭部容量を有さなければな らず、ＤＮＡをパッケージングするのに必要な要素が限定されねばならない。例 えば、ヘッドフルパッケージングを利用するＰ２２及びＴｌファージに関しては 、必要なパッケージング要素が限定される。

しかしながら、Ｐ２２及びＴＩは非常に大きな頭部容量は有していない。他方、 大きな頭部容量を有するＴ４ファージに関しては、必要なパッケージング要素は 限定されなかった。

ヘッドフルパッケージング ＤＮＡをパッケージングするのに必要な要素（即ち、生体外へラドフルパッケー ジング系）を以下に示す：（１）認識蛋白質によって切断される非反復部位、び （２）頭部が完全に充填され、次いで残りの要素からパッケージ化ＤＮＡを分離 する切断が誘発されるまでＤＮＡをパッケージングされる（“ヘッドフル”切断 ）エンプティファージ頭部：それは、クローン化ＤＮＡをウィルス粒子にパンケ ージングするのに必要な頭部及び尾部を含有する頭−尾プロフィシェント抽出物 である。

パッケージングの開始は部位特異的である（上部位の切断がパッケージングを開 始する）けれども、パッケージングの終止は部位特異的ではない。言い換えれば 、パッケージングは頭部が充填されたいかなる点でも終止するので、非反復部位 は認識されない。

Ｐｌの場合、ウィルスの生活環中のパッケージング反応に用いられるＤＮＡ基質 は、頭−態様式で配列されたＰ１染色体の個々の単位から成るコンカテマーであ る。Ｐ１ファージ又はその他の任意のファージを用いるヘッドフルパッケージン グは、４工程から成る：（１）第一段階では、非反復部位性を、座認識蛋白質（ ＰＲＰｓ）で認識し、切断する：（２）切断の片方のＤＮＡを頭部が完全に充填 されるまでエンプティ頭部中にパッケージングする：（３）次に、残りのコンカ テマーからパッケージ化ＤＮＡを分離する二次切断を誘発する（“ヘッドフル” 切断）：そして（４）先の“ヘッドフル”切断により生じた遊離端からの第二ラ ウンドのＤＮＡパッケージングの開始−一一一したがって前進的ヘッドフル切断 時期。しかしながら、コンカテマーが生成されない場合には、前進的ヘッドフル パッケージングは生じない。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、１９４．　４６Ｌ４７９（１９８７）は、十分に機能的なた 。これらの研究も、害認識及び切断がファージ頭部及び尾部の非存在下で起こり 得るし、Ｐ１遺伝子９の突然変異体によって非機能的にされることを示している （図２参照）。

パッケージ化Ｐｉ　ＤＮＡの末端は、パッケージ化ラムダバクテリオファージＤ ＮＡの末端のようには相補的一本鎖配列を含有せず、その結果として、Ｐｉ　Ｄ ＮＡを細菌中に注入後、その環化は鎖のアニーリング、によっては起きず、むし ろ分子の末端に存在する相同配列間の組換えによって起こる。この事情ゆえに、 ＰＩパッケージングを用いる、又は任意のへラドフルパッケージング機序が重要 であるあらゆるベクターが、組換えによる直鎖パッケージ化ＤＮＡを環化する手 段を講じなければならない。本発明においては、環化は、ｌａｘ　Ｐ部位をベク ターに組み込むことにより、モしてＣｒｅ”、　グラム陰性細菌株に注入後にＤ ＮＡを環化するためにＣｒｅ組換え酵素を用いて、達成した（以下参照）。

ＰＬは、２つの大きさの頭部を、即ち１０５−１１０ｋｂのＤＮＡを収容し得る 大型頭部と、４５ｋｂ以下のＤＮＡを収容し得る小型頭部を生成する。一般に、 Ｐ１野生型感染における大型頭部対小型頭部の比は１０：１であるが、しかしな がら、本発明に記載のいくつかのパッケージング溶解物を調製するために用いら れるＰｌのｃ＋ａ−２突然変異体においては、頭部サイズの比は、１１である。

Ｐｌのｃｍ突然変異体から調製される頭〜尾パッケージング溶解物は、約１０： １の通常比の大型頭部及び小型頭部を含有した。

これは、頭−尾バッケージング抽出物の調製には好ましい溶解物である。専ら大 型ファージ頭部へのＤＮＡのパッケージングを確実にするためには、ＤＮＡは、 小型頭部が収容し得るよりも大きくなければならない。

大型頭部がかなり余分に存在するのが一般に望ましい。

しかしながら、大型頭部対小型頭部の比は、約５１以下であってはならない。

ｔａｘ　Ｐ　−Ｃｒｅ組換え系 これは、組換えが非常に効率よく起こる３４−ｂｐ部位又はＤＮＡ配列（１ｏｘ Ｐ）　、及びその部位と接触し、組換えを促進する蛋白質酵素（Ｃｒｅ）から成 る部位特異的組換え系である。＾ｂｒｅｒＢｓｋｉ　ｅｔ　’ａ１．．　Ｃｅ１ １．　３２．　１３０１−１３１１（１９８３）は、超らせん化、ニック化環、 又は直鎖ＤＮＡ上のＬａｘ　Ｐ部位間での組換えが、Ｃｒｅの存在下で起こるこ とを示した。Ｐ１生活環において、Ｃｒｅは、約１００ｋｂ離れた一ン化された 。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＮｏｔＢｉｏｌ、１８７゜１９７ −２１２．’　１９’８６は、プロファージが構築される機能的ｃｒｅ遺伝子を 含有するｐＨＲ１０３突然変異体を記載している。

本明細書中に記載の多数の要素、例えばｌａｘ　−Ｃｒｅ組換え系、Ｐ１プラス ミドレプリコン、及びｐ１溶解レプリコンも、近年、詳細に再検討された（Ｙａ ｒｍｏｌｉｎｓｋｙ　＆　Ｓｔｅｒｎ−ｂｅｒｇ、Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐ ｈａｇｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｐｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ９、　１９８８ ．　Ｐ１ｅｎｕａ＋　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２３３ 　Ｓｐｒ−ｉｎｇ　Ｓｔ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ）　。Ｐｉ遺伝子の地図、 並ヒニ１ｏｘＰ−Ｃｒｅ組換え系、Ｐ１溶解レプリコン、及びｐａｃ部位を図２ に示す。

Ｐ１宿主範囲 バクテリオファージＰ１は、そうでなければＤＮＡを効率よく取り込めない種々 のグラム陰性細菌中にそのＤＮＡを吸着及び注入し得る。Ｐ１ピリオンがＤＮＡ を吸着及び注入し得る細菌株の例を、表１に示す。

表１ Ｐｌの宿主範囲 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２．Ｃ，Ｂ　十　＋Ｓｈｉｇｅｌｌａ 　ｄｙｓｅｎｔｅｒ’ｉａｅ　十　＋Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　＋ Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　（−）＋　＋５ａｌＩＱｏｎ ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ　＆　ａｂｏｎｙ　＋Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇ ｅｎｅｓ　＋　＋Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　＋　＋Ｃ１ｔ ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　＋　＋５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓ ｃｅｎｓ　＋　（−）−１−Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　 ＋　−１−Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　＋　＋＆　 ｃｌｏａｃａｅ Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｙｏｒａ　＋　＋Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖ ｏｒａ　＋　＋Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ　＆　＋　＋ｐｓｅｕｄｏｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＩ’ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　−Ｐｓｅｕｄ ｏＩＩｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　＋　（−）＋ｒ’ｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ　（−）　＋　＋Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｓｐ、　Ｍ６４　＋　−Ａｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ　＋　−＾ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａｎｓ　−Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　＋　−Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕ ｓ　＋　−さらに、これらの株中でバクテリオファージを産生ずるＰｌの能力を 表記する。Ｐ１ファーン中にＤＮＡを生体外パッケージングする能力に関しては 、任意のこれらの細菌から直接パンケージングベクター中にＤＮＡをクローニン グし、そのＤＮＡをＰ１ピリオン中にパッケージングし、次いでそれをＰ１注入 に熟達したその細菌中に注入し戻すことが可能であるべきである。これはすべて 、その本来の宿主に入る場合に制限酵素から保護するメチル化様式の喪失を引き 起こすＥ、ｃｏｌｉにおける挿入ＤＮＡの複製を伴わずに実施し得る。

Ｊｉｌｌｏｌ、５９４、及びＹＭＣ，又はその誘導体は、プラスミド及びＰ１フ ァージの宿主として用い得る。Ｄ［Ｉ５　デルタ−１ａｃＵ１６９は、Ｄｒ、Ｍ ｉｃｈａｅｌ　ＢｅｒＩＩｌａｎ、Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓから入手 した、Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６６、　５５７−５８０（ １９８３）が記載したＤＨ５の誘導体であるＤＨＩの変種であった。

Ｂ５５９１は、Ｃｒｅ遺伝子を含有するｐＲＨ１０３突然変異体から横変異体は 、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８７゜ＪＭ Ｉ０９は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ　 ０１９１５かラ入手したもノテあって、Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｑｔ　ａ ｌ、、がＧｅｎｅ３３．　１０２−１１９（１９８５）に記載されている。Ｎ５ ２９７４は月日０９であつて、機能性Ｃｒｅ遺伝子及びｌａｃ　Ｉ　’　リプレ 、ソサー゛を含有するラムダ−…４３４−Ｐｉプロブアージを有する。Ｎ５２９ ７４の遺伝子型は、±Ａ−１すｉｄＭ”、リリＲ−１其Ａ　Ｂ　”　（ｍｃｒＡ ◆、５Ｂ１）である。５９４株及び１３３５０株は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ　ｅｔ　 ’ａ１．．　Ｃａｒｎｅｇｉｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ＷａｓｈＹｅａｒ ｂｏｏｋ　５７．　３８６（１９８７）ｊ、一記載されている。　Ｙ’ＭＣは、 Ｄｅｎｎｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　３３．３２２ −３２９Ｃ１９６８）が、Ｎ９９は５ｈｉｓ＋ａｄａ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、９３．　４８３−５０３（１９７２）に記載されている。Ｎ９ ９の遺伝子型は、±Ｄ“、肋ｑじ、逍ｉｄＭ”、ト」Ａ４、町■Ｂ４　である。

Ｎ５４３９は、ｔｒｐＥ５９４７突然変異を伴うＹＭＣ株である。Ｎ５３０６７ はＮ５４３９であって、機能性ｃｒｅ遺伝子を伴うラムダ−１ｍｍ４３４−　Ｐ Ｌプロファージを有する。細菌増殖用の培地（即ち、Ｌブロス及びＩ、−ａｍｐ 寒天）は、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌ ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９７２） に記載されている。

Ｎ５３１４５は、Ｎ１１５５４株（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ） を用いて開始して構築した。ＮＭ５５４は、遺伝子型±Ａ−１ｈｓｄＭ”、！！ −」甲１−１（□Ｒ−、ジどＡ−１懸どＢ−を有する。Ｆ直　畢夏ｑプラスミド を先ず、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９７２） に記載されているような接合によってこの株中に移入し、その結果生じた株（Ｎ ５３１００）を次にラムダ免疫性４３４−ＰＩ　Ｃｒｅ−含有プロファージに感 染させた。溶原菌を、Ｓｔｅｔｎｂｅｒｇ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２９−１４２ ゜Ｖｏｌ、　９６（１９７９）に記載されているように這択し、それらの溶原菌 の１つをＮ５３１４５と命名した。

ファージ法 ファージ溶解物の調製、ファージ遺伝子的雑種の作製、ファージ相補的試験の実 施、及びファージ溶原化の発生を含むＰ１ファージ（ＰＬバクテリオファージ、 Ｐｌ）操作は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏ ｌ、　１８７．１９７−２１２（１９８６）、及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ　 ａｔ、、に　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１９４．　４５３−４６８（１９８７）に記 載されている。

ＤＮＡ１ｌ製及び操作 ２０ｋｂより小さいプラスミドＤＮＡを、（１）　ｌ＋）１ｍｅｓ　＆Ｑｕｉｇ ｌｅｙがＢｉｃｙｃｈｅａ＋、　１１４．１４３−１９７（１９８１）に記載の 迅速法（以後、迅速プラスミド調製と呼ぶ）、又は（２）　Ｇｏｄｓｏｎａｎｄ 　Ｖａｐｎｅｋ、　’ＢＭ＾２９９．５１６−５２２（１９７３）が記載のよう な塩化セシウム密度勾配法にしたがって、Ｅ、ｃｏＬｉから調製した。２０ｋｂ より大きいプラスミドＤＮＡは、ＢｅｒｎｂｏｉＩｌｅｔ　ａｌｌ、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．　１５１３−１５２３（１９７９）の方法によって調 製した。細胞ＤＮＡは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔａｔ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｒｉａｌ、　１９４．４６９−４７９（１９８７）が記載したようにＥ、　ｃｏ ＬＬから単離した。２００ｋｂより大きいＤＮＡサイズを維持するために、この 単離操作中は剪断力を避けるよう注意した。Ｃａｒｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３２．　６５−６８（１９８６）・に記載されているように、パル スフィールド（ｐｕｌｓｅ　ｆｉｅｌｄ）アガロースゲル電気泳動を実施した。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの制限酵素消化及びＤＮＡ結紮は、販売元（我 々の場合は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）が明記しているように して実施すべきである。ＤＮＡ操作についてのその他の方法はすべて、Ｍａｎｉ ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１［ａ ｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｂ ｏｘ　１００．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ１９８２）に記 載されている。

高分子ヒトＤＮＡの調製、消化、及びサイズ分別ヒトリンパ芽球様細胞６９７株 （Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢＢＲＣ。

１２７５−１２８２．　ＶｏＬ１５９（１９８９））　’ｃ、ＤＮＡ供給源とし て用いた。そのＤＮＡは、以下のように調製した：懸濁培養中で増殖中の細胞を 遠心分離（ＲＴ６０００ローター中で４．００Ｏｒｐｍ）によって収集し、燐酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回、そして５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　ｐｌ’１７ ．５．１００ｍＭＮａＣ１で２回、洗浄した。次に、細胞を２ＷＡ’の後者緩衝 液（５０ｆｆ１ＭトリスーＨＣ１，ｐＨ７，５，’１００ｍＭ　Ｎａ（、ｊ’） 中に懸濁し、以下の要素を添加した：　ｌ　厘ｇ７　ｍｌプロテイナーゼＫ、１ ２０ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、及び４ｍｌの水。次いで、懸濁液を ５０℃で２時間インキュベートし、次に、先ず４＋１’のフェノ−１しで、次い で４冒ｌのクロロホルム−イソアミルアルコール も水性層は除く）。次に、水性層を、各々１す，ットルの１０１１ＩＭトリス− １１（Ｊ，　ｐＨ８．０−　Ｉ　ＱＩＭ　ＥＤＴＡを４回替えて、４℃で透析し た。各回とも、８時間透析した。

１０１１９の透析高分子量ＤＮＡを、Ｍｇ”＋を含有せず、ウシ血清アルブミン （１００１１９／　ｍｌ＞及び１〜１０単位の制限酵素（　Ｂａｗｌ　Ｉ又璃Ｓ ａｕ３Ａ　Ｉ　）を含有する１０ｈＪのＩ×制限緩衝液（２０ｍ＋１１　トリス −ＨＣＩ，　ｐＨ８．０，　１００ａＭ　ＮａＣＡ’）中で、静かに攪拌しなが ら４℃で１２時間インキュベートした。この１・・無含有インキュベーションは 、反応開始前に粘性ＤＮＡと酵素との混合を均一にするために意図された。

次に、ｌｈｌの１００ｍｉｌ　ｌ１ｇｃｊ！２溶液を各反応試験管に添加し、ピ ペットの先で試験管の内容物を静かに混合して、直ちに試験管を３７℃でインキ ュベートした。５分後に２００１１Ｍ　。

ＥＤＴＡのｌＯμ！溶液を試験管に添加して反応を停止させ、次いでそれを４℃ で放置した。約５μｌの試料を各試験管から取り出して、フィールド逆位電気泳 動（以下に説明）を施して、制限反応の程度を査定した。少なくとも５０％のＤ ＮＡが３０〜２００ｋｂの範囲の大きさに消化された反応をさらに、ショ糖勾配 で分画した。フィールド逆位電気泳動を、０．６秒の前方パルス、０．２秒の後 方ノくルス、及び２０のランプ因子で、２３０ボルトで、トリス−硼酸塩−ＥＤ ＴＡ緩衝液（０．　０８９　）リス−硼酸塩、０．　０８９硼酸、０．　００２ ＭＥＤＴＡ）　中！．：作成した１％アガロースゲル中で２時間実施した。

３５＊ｌの１０　−　５０％ショ糖勾配を、ｌｌａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ， 。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｂｏｘ　 １００．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ．ＮＹ１９８２）に記載のよう に調製した。上記で調製した適切なＥＤＴＡ−停止反応物をこれらの勾配の上面 に層化し、その勾配を、４℃で５１２７スイングバケツ５ｏｒｖａｌｌ　ロータ ー中で２０．　ＯＯＯｒｐｍで１５時間、遠心分離した。遠心管の上部をパラフ ィンで密封し、注意して締めて立たせた。管の底を１８ゲージの針で穿刺して、 次いでその針を取り除いた。勾配滴下を開始するために、パラフィンカバーを針 で突き破った。指で上面の穴を押して流ｌを調節した。

フィールド逆位ゲル電気泳動により各勾配分画中のＤＮＡの大きさを分析後、適 切な分画をプールし、次いでｎ−ブタノール抽出によって濃縮した。先ず、プー ルした分画を、１．０ｍ１ｌトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０−１ｍＭ　ＥＤＴＡ 緩衝液の表面に浮かせたＶＳＷＰ　０２５００フイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）上に分取して透析した。通常、１〜２ｍｌの試料は、５００薦βの緩衝液に対 して２５℃で約２時間で完全に透析される。透析した試料を次に、２０５９フア ルコン管中の２容量のｎ−ブタノールと混合し、その混合物を、水性相の容積が ２〜３分の１に減少するまで静かに揺すった。その管を２０００ｒｐｍで２分間 遠心分離し、上部のブタノール相を除去した。これらの工程を、水性相が約４０ 〜５０μｌに減少するまで繰り返した。次に、残留ブタノールを室温でＩＯ分間 蒸発させて、次いで試料をｌ０ｍＭ　トリス−１１Ｃ７！、　ｐＨ８，０−１ｍ ｉｌ　ＥＤＴＡに対して３０分間、フィルター上で透析して、あらゆる残留塩を 除去した。

フィールド逆位ゲル電気泳動によるショ糖勾配分別レーンの断片の大きさをレー ンＭの１６５ｋｂ及び５０ｋｂＤＮＡマーカーの大きさと比較すると、レーン６ 〜】Ｑの断片がＰ１ベクター中にクローニングするための所望の５０〜１１０ｋ ｂ範囲に及ぶことが明らかである。レーンＴは、元５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５０７（１９７５）の方法（以後、“サ ザーン分析”と呼ぶ）にしたがって、ＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロ ース膜に移して、特異的標識化ＤＮＡ断片又はプラスミドでプローブした。

ＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、。

ＵＳＡ、　７４．５４６３−５．４６７　（１９７７）のジチオキシヌクレオチ ド法を用いてノーケンシングした。

制限分析 ５００す／ダラムのＤＮＡを、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、　ＭＡ　０１９１５）　（ここから酵素を購入した）が明記した２ ０μｌの緩衝液中で３７℃で２時間、１〜２単位の制限酵素で消化した。反応は 、０．２５％ブロモフェニルブルー、０２５％キルンシアツール、及び４０％（ Ｗ／Ｖ）ショ糖の３μｌ溶液を添加し、その後反応液を７０℃で５分間加熱する ことによって停止した。試料を、トリス−硼酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（００８９ト リス−硼酸塩、０．０８９硼酸、０．００２ＭＥＤＴＡ）中に沈めた１％アガロ ースゲルの溝（１５Ｘ１５ｃ肩）にいれた。電気泳動は、キシレンンアノールバ ンドがゲル中に３分の２移動するまで、通常室温で約１２時間、２０Ｉ＾（３０ ｖｏ１ｔＳ）で実施した。次に、ゲルを０．５１１ｇ／１１６のエチジウムプロ ミドの溶液中で３０分染色し、透過ＵＶ光源（３２０ｎｍ）及びポラロイド５７ 型フイルムを用いてゲルの写真を撮った。

アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）によるＤＮＡの処理ＤＮＡを前節に記載され ているように制限酵素で消化後に、７０℃で５分間加熱した。反応液を３７℃に 冷却し、１０Ｉ　トリス−ＨＣＡ’、　ｐｉ（８，０溶液で１００μｌとし、次 いで０．旧単位の仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼを用いて３７℃　゛で１時 間インキュベートした。反応液を、等量のフェノールで４回、等量のクロロホル ムイソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出し、次いで２容量のエタノール を用いて一２０℃で３時間、Ｉ　Ｍ　ＬｘＣ１２中にＤＮＡを沈殿させた。

ＤＮＡ断片のベクターへの結紮及び挿入５ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５ ，５ａ＋Ｍ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭｍチントレイトール、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰＳ１０ ０属ｇ／舅ｌウン血清アルブミンを含有する２０μｌの容積の溶液中で結紮反応 を実施した。

コンピテント細菌中への形質転換により回収すべきプラスミドへの断片の挿入を 伴う反応のためには、１００ｎ９の消化流ベクターＤＮＡ及び１００〜４００ｎ ａの挿入断片を用いた。生体外へラドフルパッケージングにより回収すべきプラ スミドベクターを伴う反応に関しては、５００ｎｇのベクターＤＮＡ、及び１〜 ２μ９の挿入断片を用いた。４００単位の７４Ｕガーゼを各反応のために添加し 、反応液を１６℃で２０時間インキュベートした。反応は、７０℃で１０分間加 熱することにより停止した。

以下の実施例４に記載されるように、本発明の独自の態様の一つは、コンピテン トを生じることなく外来ＤＮＡをベクターＤＮＡに結紮する能力である。

コンカテマー生成は、２つの異なる制限部位でベクターＤＮＡを消化して２つの ベクター断片（アーム）を生成することにより回避された。各アームは、ＤＮＡ 挿入物に結紮できない一端を含有し、それ自体と結紮できず、そしてパッケージ 化ＤＮＡの環化中に回収されない。各アームは、別の自由な末端を含有して、ク ローン化されるＤＮＡと結紮する。アームへの断片結紮後、その結果生じる生成 物質は、二重消化により生成されるベクターアーム間にはさまったクローン化さ るべきＤＮＡを含有する。この結紮物質の端は、さらに結紮されず、したがって コンカテマー生成が防止される。

さらに結紮できない末端は、おそらくは、ベクターＤＮＡに独特のプラント末端 生成部位を切断することにより生じる。例えば、以下の実験の項では、プラント 末端生成部位はＳｃａ　Ｉ部位である。このプラント末端生成部位は、天然に、 又は人工的に生成され得る。

自由に結紮する末端は、結紮されるであろうＤＮＡの挿入物末端と適合していな ければならない。加えて、このンークエンスは、環化の際に回収されるが、独特 な、プラント末端産生部位は環化の際に回収されない。

形質転換体の選択 高効率ｔ−要ｔル場合は、（１）　Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　ＩＴｉｇａ、Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１５９−１６２（１９７０）の方法、又は（２） 　Ｈａｎａ−ｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉａｌ、　１６６、５５７−５８０ （１９８３）の方法にしたがって、Ｅ、　ｃｏｌｉ株を形質転換した。Ｏ，ｂ＋ １’の容量の形質転換細胞を希釈して、Ｌ−グロスで１ｍｌとし、３７℃で１時 間インキュベートした。１００〜２００μｌの培養を、カナマイシンＣ２５ａｌ ／諺ｌ）又はアムピシリン（１５０ｇｇ／菖ｌ）を含有するし寒天平板上に広げ て、平板を３７℃で１６時間インキュベートした。次に、コロニーを採点した。

カナマイシン又はアムピシリンを含むし一寒天平板上での増殖に関してＡｌｌ１ ｐ−Ｒ形質転換体を試験した。

プラスミドベクターｐＮＳ３５８−１ｙｔ　（ｐＮＳ５８２）の構築ｐＮＳ３５ ８−１ｙｔと同定されるプラスミドベクターは、ｐＮ３５８２としても同定され る。したがって、本明細書中では、ｐＮ３３５８−１ｙｔ及びｐＮＳ５８２とい う用語は同義に用いる。

ベクターの構築の種々の工程を説明するフローシートを図３に示す。出発プラス ミドはｐＢｓ６９であった。それは、同一方向に配向される２つのｌｏｘ　Ｐ組 換え部位を含有する４、　９ｋｂプラスミドであった。Ｃｒｅ蛋白質の存在下で は、組換えはこれらの部位の間で起こり、各々１つのｔａｘ　Ｐ部位とｐＢＳ６ ９のｌａｘ　Ｐ部位環の２つのＤＮＡ領域の１つを含有する２つのＤＮＡ環を生 成する。これらの環化領域（以後士−Ｒドメインと呼ぶ）の１つは、薬剤アムビ シリンに対する耐性及びプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ複製系（レプリコン又 は複製の起始［ｏｒｊｌ　）　（以後、ｐＢｌ？３２２　ｏｒｉと呼ぶ）をコー ドする遺伝子を含有した。ｐＢＳ６９の１ｏｘＰ部位間のその他の環化領域は、 酵母菌■２遺伝子を含有した。

（ａ）ｐＢＳ６９へのＰ１パッケージング部位ｐａｃの挿入ＤＮＡパッケージン グの開始に必要なＰ１配列は、ＤＮＡの１６１ｂｐセグメン１〜（諸部位）に局 在した。ＤＮＡのこのセグメントは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１９４、４６９−４７９　（１９８１）が記載した二重欠失突然変異体に残留す るＰ１配列（デルタ−３〜デルタ−２０）を示した。

デルタ−３〜デルタ−２０ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及び５ａｌＩで消化し、 １６１ｂｐ　ｐａｃ部位を含有する４３７ｂｐ断片を単離して、ｐＢＳ６９　Ｄ 　Ｎ　Ａのａｍｐ−Ｒドメインの非反復Ｘｈ。

■部位に結紮した。その結果生じたｐＢＳ６９−　ｐａｃプラスミドは、図３に 示すようにパッケージノブが反時計回りに起こるように配向されたｐａｃを含有 した。ｐａｃに加えて、４３７ｂｐ挿入物は、ｐＢＲ３２２地図相関物３７５及 び６５１間に位置するテトラサイクリン耐性遺伝子配列を含有した。さらに、４ ３７ｂｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片中に存在し、プラスミドＤＮＡの６９８ａｍｔｌＩ部 位のみを有することを確実にした。

Ｔｎ９０３カナマイシン耐性（ｋａｎ−Ｒ）遺伝子を、プラスミドｐｕｃ４Ｋ　 （ＰしＢｉｏｃｈｅｆｆｌｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＷＩ）から購入 ）から１．３ｋｂ　Ａｃｃ　Ｉ断片として単離した。ｐＢＳ６９−９Ｅ四ＤＮＡ を、そのＤＮＡを酵母菌１ｅｕ　２遺伝子内で一旦切断した制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ で消化した。等量（１０１００ｎのその消化プラスミドＤＮＡ及びｋａｎ　−Ｒ 遺伝子断片を２０μ！中で混合して、１６℃で一晩結紮した。結紮混合物を用い て、ＤＨ５株細菌を形質転換して、ｋａｎ−Ｒ，ａｍｐ　−Ｒ形質転換体を選択 した。これらの形質転換体から作製した迅速プラスミド調製物の分析から、それ らがすべて、ｐＢＳ６９−ｐａｃのＣ１ａ　Ｉ部位でｋａｎ−Ｒ遺伝子を含有す ることが示された。その後の全操作のために選択されたプラスミド（以後、ｐＮ ｓ２０と呼ぶ）は、ｋａｎ転写の方向がが反時計回りであるように配向されたｋ ａｎ−Ｒ断片を含有した（図３）。このｋａｎ−Ｒ遺伝子を含有するｌｏｘ　Ｐ 部位が側面に位置する領域は、以後ｋａｎ−Ｒａｎｄンと呼ぶ。

ＰＬプラスミドレプリコン及び分配領域は、溶原性細胞の集団における単位複写 染色体外要素としてのＰ１プロファージの維持に寄与する。それは、細胞分裂周 期当り１回の複製を開始するためにＤＮＡの原配列で作用する蛋白質をコードす る複製遺伝子（ｒｅｐＰ）を含有する。レプリコン中には、細胞分裂時に娘細胞 に複製の生成物質を忠実に分配するために、ある部位［■Ｓで作用する２つの遺 伝子、即ちｐａｒＡ及びｐａｒＢも存在する。

Ｐ１１回相関物５９及び６６間に位置する（図２）ＤＮＡの７　ｋｂ　Ｋｐｎ　 Ｉ断片を、Ｋｐｎ　Ｉを用いてＰ１ファージからＤＮＡを消化後に単離した。そ れをｐＮｓ２０の非反復Ｋｐｎ　Ｉ部位に結紮し、プラスミド中のその存在を、 迅速プラスミド調製物の制限酵素消化を分析することにより確証した。

その後の操作のために選択した特定の構築物はｐＮｓ１５０と命名され、プラス ミド中で反時計回りに配向する地図相関物５９〜６６からのＰＩＤＮＡを含有し た。７ｋｂＰ１挿入物はプラスミド複製系を含有するのみならず、その分配系を も含有した（Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、ｉｎ　” Ｔｈｅ　。

Ｂａｃｔｅｒｉａ−ｐｈａｇｅｓ！、　Ｃｈａｐｔｅｒ　９．１９８ｇ）。

相補的配列を有する２つの３１塩基オリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホラミ タイド法により合成した。１００μｌの容量（１０ｍＭ　）リスーＦｉＣ１緩衝 液、　ｐＨ８，０，ｌ＠ｌ　ＥＤＴ＾）中に溶解した１０＋１９の各オリゴヌク レオチドを７０℃で１０分間、互いにアニーリングした。その結果生じた２本鎖 断片を以下に示す： ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴ＾ＧＡＧＡＴ ＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＤＮＡのこの断片は、 左から右に、以下の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する： ずれもｐＮ３１５０のＤＮＡ中に存在しなかった。その断片も、ＢａｍＨＩ消化 によって生成された末端と相補的である１本鎖ＧＡＴＣ末端を含有した。その断 片のＧＡＴＣ末端に対するヌクレオチド３′が異なるために、…ＨＩ末端による この断片のＤＮＡへの結紮は、挿入物の片側にＢａｍＨＩを再生したが、しかし 他方には再生しなかった。その断片をＢａｍＦ（ｒ−切断ｐＮｓ１．５０　Ｄ　 Ｎ　Ａに結紮し、挿入物の存在を、５つの制限酵素ＢａｍＨＩ　Ｓ翔Ｉ、独Ｉ、 加工、及び５ｎａＢＩの各々によって１回だけ切断されるプラスミドの能力によ り確証した。次の操作のために選択した特定の構築物はｐＮ３３５８と命名され 、プラスミド上に反時計回りに配向したＢａＩＩＩＨＩから５ｎａＢ　Ｉまでの ポリリンカーを有した（図３）。

、（ｅ）　ｐＮＳ３５８−１ｙｔ　（ｐＮＳ５８２）を生成するためのｐＮＳ３ ５８へのＰ１溶菌レプリコンの挿入 Ｐ１増殖型又は溶菌レプリコンは、プロファージ抑制後３０分以内にＤＮＡを多 数の複写体に複製し得る。このレプリコンは、転写プロモーターＰ５３、及びそ の生成物質が複製を促進するために原配列で作用する下流ｒｅｐ　Ｌ遺伝子から 成る。レプリコンは、Ｐ５３と結合し、ｒｅｐＬ遺伝子の転写を防止する旦１フ ァージリプレッサーにより負に調節される。

Ｐ１溶菌レプリコンは、正常Ｐ５３プロモーターがｌａｃプロモーターに置き換 わった１、９ｋｂ　ＡｓｕＩＩ断片（ＰＬ地図相関物５３〜５５）としてクロー ニングした。したがって、Ｐ１溶菌レプリコンはｌａｃプロモーターの制御下に 置かれた。ｌａｃプロモーターは、順次、Ｌａｃ　Ｉ　’　リプレッサーに制御 される。ＩＰＴＧ　（イソプロピル−ペター〇−ガラクトシド）の存在下では、 ｌａｃ　Ｉ　ｑ　リプレッサーは抑制され、レプリコンは機能的になる。シ些プ ロモーターー調節Ｐ１溶菌レプリコンを、プラスミドｐＮＳ４２からのＰｖｕ　 Ｉｔ　−Ｈｐａ　Ｉ断片として単離し、５ｎａＢ　Ｉ−消化ｐＮＳ３５８　Ｄ　 Ｎ　Ａに結紮して、ｐＮＳ３５８−１ｙｔプラスミドを生成した。レプリコン（ ＰＬ地図相関物５３〜５５）をプラスミド中に反時計回りに配向した。

したがって、別の態様では、本発明は、ＩＰＴＧを加えてし、プリコンを抑制す るまで、１ａｃ１９　レプリコンの制御下にあるｌａｃプロモーターを用いるク ローン化ＤＮＡの増幅制御に関する。

プラスミドベクターｐＮｓ５８２ｔｅｔ１４及びｐＮｓ５８２ｔｅｔ１４＾ｄｌ 。

乃！！ 上記の２つのベクターの構築の種々の工程を説明するフローシートを図４に示す 。ｐＮｓ５８２ｔｅｔ１４を生成するために、プラスミドｐＮ３５８２からのＤ ＮＡ　（図３）を、その両方がｐＮＳ５８２のポリリンカークローニング部位を 切断すスミドｐＢＲ３２２からのＤＮＡを、プラスミドの残りの部分からｐＢｌ ？３２２のテトラサイクリン耐性（±−Ｒ）遺伝子を切断する制限酵ｆ：Ｅｃａ ＲＩ及びＮｄｅ　Ｉで消化した。ｔｅｔ　−Ｒ遺伝子は、２．３ｋｂＤＮＡ断片 上に存在する。次に、両方のＤＮＡ消化物をｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ 、及びｄＣＴＰとともに、そしてＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｂｏｘ　１００．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１９８２ ）　ｌ、一記載ｆ７）ヨウなりＮＡポリメラーゼ■　フレノウ断片（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてインキュベートして、上記のような制 限酵素切断反応により生成された１本鎖末端を充填した。制限酵素及びフレノウ 断片を、最終反応物を７０°Ｃで１５分加熱することにより不活性化した。等量 （５００ｎｇ）の２つの消化及び充填プラスミドＤＮＡを上記のように２０μｌ の結紮緩衝液中で混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で１６℃で一晩、結紮 した。結紮混合物を用いて、ＤＨ５細菌を形質転換し、１リーＲ，±−Ｒ１Ｐ已 −Ｒ形質転換体を選択した。これらの形質転換体から作製した迅速プラスミド調 製物の分析は、それらが、ｐＮ５５８２　ＤＮＡのポリリンカークローニング部 位のＢａｍＨＩ及び５ａｌＩ間に挿入されるｔｅｔ−Ｒ遺伝子断片を含有するこ とを示した。

クローニング工程において、後者２部位、即ちＢａｍ１（Ｉは、そのコード領域 内に１つのＢａｍ８１部位と１つの５ａ１１部位を含有した。ｐＮｓ５８２±１ ４ＤＮ＾では、これらの部位は非反復性であって、それらの部位へのＤＮＡのク ローニングがｔｅｔ−ｇ遺伝子を妨害する。それらのクローンは、テトラサイク リン感受性であるために、容易に認識される。

ｐＮ３５８２男１４υ１０を生成するために、ｐＮＳ５８吐部１４　ＤＮＡを、 ａｍｐ−Ｒ遺伝子でそれを一度切断する制限酵素Ｓｅａ　Ｉで消化した。同時に 、アデノウィルスＤ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇａ＋ａ）を制限酵素Ｓｃａ　Ｉ及びＢａ ｎ）（Ｉで消化して、約１０ｋｂのＳｅａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を生成した。そ の後者の消化物を４つのデオキシヌクレオチドトリホスファターゼ及びフレノウ 断片（上記）とともにインキュベートして、ＢａｍＨＩにより生成された１本鎮 端を充填した（Ｓｃａ　Ｉ消化は、天然にはプラント末端を生じる）。等量（５ ００ｎｇ）の２つの消化ＤＮＡを上記のように２０μ！の結紮緩衝液中で混合し て、１６℃で一晩結紮した。結紮混合物を用いて、ＤＨ５細菌を形質転換し、ｋ ａｎ　−Ｒ，ｔｅｔ　−Ｒ、シリ−３形質転換体を選択した。これらの形質転換 体のうちの１０個から作製した迅速プラスミド調製物の分析は、一つの形質転換 体が、ｐＮｓ５ｇ２ｔｅｔ１４　ＤＮＡのＳｃａ　Ｉ部位にクローン化されたア デノウィルスＤＮＡからの約１０．６ｋｂのＳｃａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩだべを含 有することを示した。ベクター中のこの断片の配向は、そのＳｃａ　Ｉ末端が座 部位に隣接するようなものであった（図４）。充填ＢａｍＨＩのＳｃａ　Ｉ末端 への結紮はその２つの酵素ののいずれによっても切断されないＤＮＡ配列を生じ るため、ｐＮＳ５８２箪１４回１０　ＤＮＡは単−沖１部位のみを含有した。

アデノウィルス断片の目的は、ヘッドフルパッケージングが終止し得る大型（＞ ５ｋｂ）ＤＮＡ断片を提供することであった≦それが存在しない場合、ヘッドフ ルパッケージングの終止は、ｌｏｘ　Ｐ部位に隣接する±−Ｒ遺伝子とａｍｐ− Ｒ遺伝子内のＳｃａ　１部位との間の短い４００塩基対領域に再結紮されるが、 この状況はコンカテマー化の非存在下での挿入物のクローニングを厳しく限定す る。

アデノウィルス断片は、ベクターＤＮＡ中に充填されてパッケージングの終止の ためのＤＮＡをさらに容易に提供するので、“スタッファ−”断片と呼ばれる。

スタ。

ファー断片がクローニングされる部位は、パッケージ化ＤＮＡの環化中は回収さ れない。

さらに、あらゆるＤＮＡは、スタッファ−断片として用い得るので、それがアデ ノウィルスＤＮＡである必要はない。スタッファ−断片ＤＮＡの選択に加わるい くつかの考察には、以下のものが含まれる：（１）この部位が依然としてベクタ ーＤＮＡ中で非反復性であって、ｐａｃ部位に隣接するようなベクターＤＮＡプ ラント末端生成部位にスタッファ−断片を挿入し得る容易性：そして（２）スタ ッファ−断片として役立つＤＮＡの供給源が容易に手に入る必要がある。

スタッファ−断片の大きさは、クローニング効率で回収さるべきＤＮＡの大きさ により、約５ｋｂから約２０ｋｂまで変わり得る。スタッファ−断片の大きさは 、回収さるべきＤＮＡの５〜１０ｋｂ内のサイズ範囲を決定する。

例えば、ＤＮＡ分子の初期集団が種々のサイズのもので、回収すべきＤＮＡのサ イズが約９０〜９５ｋｂである場合には、スタッファ−の好ましいサイズは、か なり小さい。

同時に、クローニング効率は、クローン化される狭いサイズ範囲（９０〜９５ｋ ｂ）の２〜３のＤＮＡ分子のみが存在するために低い。実際、スタッファ−断片 は、挿入ＤＮＡが上記の４００塩基対領域内でパッケージングを終止させるのに 十分大きい場合には、まったく除去し得る。

回収すべきＤＮＡの大きさが約７０〜８５ｋｂである場合には、スタッファ−断 片は約１０ｋｂの大きさであるべきである。回収すべきＤＮＡの大きさが約６０ 〜７５ｋｂである場合には、好ましいスタッファ−断片の大きさはは約２０ｋｂ でＰ１パッケージング抽出物の調製のための溶原性細菌（溶源菌）を構築するの に用いたファージは、四重突然変異体Ｐｉ　ｒｔａ−ｃｔａ−２ｃ１．１００９ ．１６又はＰＩ　ｒｖ−ｃｍ−２ｃｌ。

ｔｏｏ　ｔｏ、ｔであった。ここの突然変異の特性、及び最終ファージ中のそれ らの取込みの理由を以下に考察する。

（ａ）　ｃｌ、　１００．　この突然変異（Ｒｏｓｎｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

４８、６７９−６８９（１９７２）によって最初に記載された）は、ｃｌファー ジリプレッサーを温度感受性にする。したがって、このＰ１ファージを含有する 溶源菌は、通常３３℃以下の温度で増殖するが、しかし高１で導入されて溶菌周 期に入り、ファージを産生ずる。例えば、培養温度が３３℃から４０℃に上げた 場合、培養はその温度に維持され、細胞溶解が移動の５０分以内に起こり始め、 約１００フアージ／細胞が放出される。

（ｂ）　ｒｍ−０この突然変異（Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔ。

Ｒｅｓ、、　４．４８０−４８２（１９６３）によって最初に記載された）は、 ウィルスの制限及び修飾系を不活性にする。それを、誘発Ｐ１１溶源菌ら作製し た抽出物が、パッケージ化される前に添加ＤＮＡを破壊し得る制限エンドヌクレ アーゼ活性を含有しないように、ここで用いるファージに取り込ませた。

（ｃ）　ｃｍ−２゜　本突然変異は、ｌ１ｄａ　ａｎｄ　Ａｒｔｅｒ、　Ｍｏｌ 。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１５３．２５９−２６９（１９７７）に記載されて おり、そのクロラムフェニコール耐性（ｃｍ−Ｒ）遺伝子を有するＴｎ９　トラ ンスポゾンをＰ１地図相関物２４で挿入し、地図相関物２４及び３３間の１０ｋ ｂのＰｉ　ＤＮＡを欠失した大きな染色体転位である。本突然変異は、溶源菌の 導入後に、別の方法でできるよりも遅い時点で細菌を収穫し得るようにファージ を部分的に溶菌欠損性にする。この突然変異体の別の特性は、それが野生型Ｐ１ よりもさらに小さな頭部を持ったファージを産生ずることである。

Ｃ１１は、Ｐｉ　ＤＮＡの付随する１０ｋｂ欠失を伴わずに、Ｐ１地図相関物２ ４にＴｎ９　トランスポゾンを含有する突然変異体である。

（ｄ）　ａｍ９．１６及びａｍｌＯ，１゜　Ｐ１アンバー（ａｍ）突然変異体１ ０．１は、ＰＬ遺伝子ｌＯ中にナンセンス突然変異を含有しく図２参照）、全て の“後期”ファージ蛋白質合成を欠損する。それは、正常量のｐａｃ切断活性を 産生ずる。ＰＬアンバー突然変異体９．１６は、Ｐ１遺伝子９にナンセンス突然 変異を含有し、［■切断活性の産生を欠損する。それは、一般にファージ頭部及 び尾部を含むファージ形態形成蛋白質を産生ずる。これらの突然変異体の一つか ら調製される抽出物は、生体外でＤＮＡをパッケージングす　。

ることかできると予測し得ないが、しかし両袖出物はともに、パッケージングに 必要な全要素を有すべきである。

Ｐ１アンバー突然変異体１３１も、Ｐ１遺伝子９にナンセンス突然変異を含有し 、と切断活性の産生を欠損する。

（ｅ）四重ファージ突然変異体を２段階工程で構築した。

先ず、ファージＰＩ　ｃｔａ−２、及びＰｉ　ｃｌ、１００．９．１６又はＰｌ ｃｌ、１００．１０．１を交雑し、３つの突然変異を含有する組換えファージ、 即ちＰｉ　ｃｍ−２ｃ１．１００９．１６又はＰｉｃｍ−２ｃ１．１００　１０ ．１を選択した。この交雑により産生されたファージを用いて、ＹＭＣ株の細菌 運上にプラークを生成し、個々のプラークを、以下の３つの特性に関してスクリ ーニングした： （１）　ｃ＋ｏ　−Ｒである溶源菌を産生ずる能カニ（２）ａ度感受性；及び （３）　Ｎ９９株上ではなく、ＹＭＣ細菌株上にプラークを作る能力。

ＹＭＣ株はアンバーサプレッサーを含有したが、−万Ｎ９９株は含有しなかった 。アンバー突然変異組換え体が正確なアンバー突然変異を含有することを確証す るために、対照９．１６及び１０，１フアージを用いた相補性実験を実施した。

同一遺伝子におけるアンバー突然変異体は、ファージ産生に関して互いに相補的 でないが、しかし異なる遺伝子、例えば遺伝子９及び１０のような遺伝子の突然 変異体は、相補的である。相補性試験は、三重突然変異体のアンバー突然変異が その突然変異体を生成するために用いたファージに基づいて予測されるものであ ることを確証した。三重突然変異体を、次にＰＩ、ｒｍ−と交雑して、四重突然 変異体を、三重突然変異体のすべての特性＋任意のＥ、ｃｏｌｉ株にプロファー ジとして存在する場合にラムダファージの増殖を制限することの無能力を有する と同定した。他の四重突然変異体と同様にＰｉ　ｃｌ、　１０Ｏｒ「、　ｃｔｎ 　ａｍ１３１を構築したが、但し２つの出発ファージはＰｌｃＩｌｌ及びＰＩ　 ｃｌ、１００　ａｍ１３１であった。

四重Ｐ１突然変異体を用いて、Ｎ９９株を溶原化し、それぞれＮ５２９６１及び Ｎ５２９６２と呼ばれる９、　１６及び１０１突然変異体に関する溶原菌を用い て、生体外パンケージング反応のためのＰ１抽出物を調製した。さらに、これら のＰ１突然変異体を用いて、それらの取込みに熟達したあらゆる細菌株を溶原化 し得る。Ｎ５２９６１及びＮ５２９６２は、遺伝子型ｒｅｃＤ”、ｈｓｄＲ”、 ｈｓｄＭ　”、ｍｃｒＡ　”、ｍｃｒＢ４を有する。

Ｐ１溶原菌Ｎ５３２０５、Ｎ５３２０８、及びＮ５３２１０を構築するために、 遺伝子型がｒｅｃ　Ａ　”、ｈ　ｓ　ｄ　Ｍ　’、ｈｓｄＲ−１ｍｃｒＡ−１ｍ ｃｒＢ−であるＭＣｌ０６１株細菌（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ、ａｂ ｓから入手した）を用いた。この株は、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔＴａｒ ｂｏｒ、　ＮＹ、　１９７２）に記載されテイルような隣接テトラサイクリン耐 性遺伝子と連鎖するｒｅｃ　Ｄ−突然変異のＰ１形質導入によりｒｅｃ　Ｄ−と された。

次に、その結果生じた株をＰｉ　Ｃ１，１００Ｃｌ−２ｒｍ−ａｍ９１６又はＰ ｉ　ｄ、　１００　ｃｍ−２ｒｍ−ａ！ｏ１．０．１．、又はＰＩ　ｃｌ、、　 １００ｃｍ　ｒｌ　ａｍ１３１で溶原化して、それぞれＮ５３２０５、Ｎ５３２ ０８、又はＮ５３２１０を生成した。Ｎ５３２０５、Ｎ５３２０８、及びＮ５３ ２１０は、遺伝子型ｒｅｃ　Ｄ−１ｈｓｄ　Ｒ＼ｈｓｄＭ″″、ｍｃｒＡ＼ｍｃ ｒ　Ｂ−を有する。Ｎ５３２０５及びＮ５３２０８のＰ１プロファージは、その ｃｍ−Ｒ遺伝子を伴うＴｎ９　ｈランスポゾンを含有するのみならず、ＰＩ　Ｄ ＮＡの隣接欠失を含有することに留意すべきである。これに対比して、Ｎ５３２ １０は、本明細書中でＣ１Ｂと呼ばれるＴｎ９　トランスポゾンのみを含有した 。Ｎ５３２１０と呼ばれる溶原菌から調製された頭−尾バッケージング抽出物は 、大型頭部対小型頭部の比が少なくとも約１０・１の正常比であるファージ頭部 を含有した。本発明を実施する場合、大型頭部対小型頭部の比は少なくとも約５ （ａ）　１．０．１又はｐａｃ切断プロフィンエンド（１）（４）±）抽出物１ リツトルのＬブロスにＮ５２９６２株細菌のコロニーを接種し、培養を０．８の ０Ｄ６５０に対して３２℃で増殖させた。次に、９０℃の水浴中でそれをかき混 ぜて培養の温度を急速に４２℃に上げ、４２℃で１５分間、激しく曝気しながら 増殖を継続させた。次に、３８℃の水浴中に放置して、さらに１６５分間激しく 曝気し続けて、培養の温度を下げた。次に、細菌懸濁液を、氷スラリー中で４℃ に急冷し、４℃で１０分間、５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳ＾ローターで６０００Ｘ　９ で遠心分離してベレット化した。細胞ベレットを、２０［１１Ｍトリス−ＨＣｌ 、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　ＮａＣｌ、及び１ｍＭフェー ルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）から成る２ｚｌの緩衝液中に再懸濁 した。懸濁細胞を、４０秒の間隔で５回に対して５と設定したＢｒａｎｓｏｎ音 波処理器の中間先端を用いて氷上で音波処理した。各音波処理突発間、試料を６ ０秒間氷上に置いた。次に、音波処理抽出物を３４．０００Ｘ　９で３０分間遠 心分離し、上澄を１０μｌのアリコートに分けて、−８０℃で凍結保存した。こ れらの抽出物は、通常、何度凍結−解氷しても安定であった。

ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１９４．４６９−４７ ９（１９８７））。ポリヌクレオチドキナーゼを用いることによりガンマ３２ｐ −ＡＴＰで断片の両端を標識化し、次にｐｃｐ”抽出物の種々のアリコートを用 いてインキュベートした。反応は、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ３，５０ ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣ４２、ＩＩＩＩＭＤＴＴ、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ 、１μｌの標識化豊断片を（１２μ９／ｍｌ）伴うｌＯμ９の音波処理子ウシ胸 腺ＤＮＡ、及び無抽出物又は０．０１〜Ｉｐｌ！のｐｃｐ”抽出物（３，４１９ 蛋白質／ｍｌ）から成る１５μｌの緩衝液中で実施した。反応混合液を３０℃で １５分インキュベートし、０２％の濃度までＳＤＳを添加し、７０℃で５分間加 熱することによって、反応を停止した。反応の生成物質を、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により分析した。試料を垂直５％ゲルの溝に入れ、１．５０ボルト で４時間電気泳動処理した。次に、ゲルを乾燥し、コダックＸＲＰフィルムに一 晩露出した。その結果は、図５Ｂに示すように、ＩＡＩ！の抽出物（レーン２） は約２０％の断片を切断し、抽出物を添加しないレーン（レーン１、）では認め られない２つの新規の断片を生成した。抽出物の１０倍希釈（レーン３）は、境 界部のみ断片切断量が減少したが、しかし抽出物のさらに１０倍希釈（レーン４ ）は切断効率を約５％に低減した。

上記（ａ）１ご記載されているように、１リツトルの■５ブロスにＮ５２９６１ 株細菌のコロニーを接種し、培養を増殖させた。温度を４２℃に上げて、４２℃ で１５分間、培養をインキュベート後、温度を３８℃に戻して、その後４５分間 インキュベートした。培養を半分に分けて、（ａ）に記載されているように細胞 をベレット化した。半分の培養からの細菌細胞を、２０１ＩＭトリスーＨＣＬ　 ｐＨ１３，５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！、１ｉＭ　ＥＤＴ＾、５ＩＩＩＭ　ＭｇＣ１ｈ 、ｌ　ａ＋Ｍ　ＰＭＳＦ、及び５ＩＩｌ菖ベーターメルカプトエタノールから成 るＩＭＩの緩衝液中に再懸濁し、上記（ａ）に記載されているように音波処理し た。１００ｐｉのアリコートを直接−８０℃で凍結した。他の半分の培養からの 細胞は、５０ｆｆｉ輩　トリス−ＨＣｌ緩衝液、　ｐＨ７，４，１０％ンヨ糖の ｌ＋ｃ／溶液中に再懸濁して、次に、２度、凍結−解氷した。凍結は、液体窒素 中で実施し、凍結細胞は室温で解氷した。次いで、卵白リゾチーム（１０μｑ／ ｘｉＶ）の８μｍｏｌ溶液を解氷細胞に添加し、４℃で１５分後、音波処理ｈｔ ｐ”　抽出物用に用いた緩衝液を添加した。４℃で５分間、全要素を静かに混合 後、抽出物の１００μ！アリコートを一６０℃で凍結した。

細胞を採集する前に、細菌株Ｎ５２９６２を、Ｎ５２９６１株よりも長い時間導 入したことに留意すべきである。これは、２９６２株の１０．１アンバー突然変 異が、両細胞株に存在したＣｌ１１−２突然変異の場合よりも劇的に細胞溶解を 阻害したためであった。したがって、導入Ｎ５２９６２溶原菌は、導入後４時間 は溶解しなかったが、導入Ｎ５２９６１溶原菌は、導入後約８０〜１００分で溶 解を始めた。実際、遠心分離によってそれらをベレット化する前に導入Ｎ５２９ ６１細胞を急冷して、遠心分離工程中に溶解しないように気をつけた。

（Ｃ）　Ｎ５３２１０株細菌からの頭−尾プロフィシエント抽出物の調製 本株を用いての抽出物調製操作は、それがｃｍ−２突然変異を含有しなかったた めに修正した。Ｎ５３２１０の培養は、導入後約５０〜６０分で溶解する。した がって、Ｎ５２９６１又はＮ５３２０５の導入培養よりさらに迅速に処理して、 機能的頭−尾プロフィシェント抽出物を生成しなければならない。

１リツトルの導入細胞を上節のように処理したが、但し、細胞を濃縮するために 用いる遠心分離工程中に細胞溶解が起きないようにするために、５分の１容積の 冷却５０％ショ糖溶液を遠心分離工程前に培養液に添加して、遠心分離中の細胞 を安定化する。細胞を５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ。

ｐＨ１，４，１０％ンヨ糖の１ｍＡ’溶液に再懸濁し、４０μｌのアリコートを 、４μｌの１０　ｖＩ９　／　菖１リゾチーム溶液を含入する１、　５ｍ／の円 錐エッペンドルフ遠心管に分配した。この管の内容物を液体窒素中で急速凍結し 、−８０℃で保存した。

Ｎ５３２１０から調製した頭−尾抽出物はｃｌｌ−２突然変異を含有せず、した がって、大型頭部対小型頭部が約１０：１という正常比のファージを含有した。

これは、頭−尾抽出物を調製するには好ましいプロトコルである。

本明細書で構築したベクターが、Ｃｒｅ組換え酵素を含有する細胞に導入した場 合に予期されるようにプロセッシングされることを立証するために、ｐＮｓ２０ 及びｐＮＳ３５８をＥ、ｃｏｌｉ　［）Ｈ５株及びＢ５５９１株に導入した。旧 ■５は機能的ｃｒｅ遺伝子を含有しなかったが、一方Ｂ５５９１は機能的ｃｒｅ 結果は表２に示されているが、これはＣｒｅが細胞中のこれらの両方のプラスミ ドの２つのドメインを効率よく分離し、各ドメインは、それが回収去るべきもの である場合にはレプリコンを含有しなければならない（図６Ａ参ｐＮＳ　３５８ Ｐｌプラスミド　０．６　０．５　０−４　０．５ＢＳ５９１株を、ａｍｐ−Ｒ ドメインにおいてのみレプリコンを有するｐＮｓ２０で形質転換した場合、±− Ｒ形質転換の効率は、ｋａｎ−Ｒ形質転換の効率の約１０００倍高かった。

ＤＨ５株の形質転換の結果は、これがｔａｘ　Ｐ部位間のＣｒｅ介在組換えによ る２つのドメインの分離によるものであるという結論を支持する。この場合、ｐ Ｎｓ２０を用いた±−Ｒ及びｋａｎ−Ｒ形質転換の効率は、同じであった。ｋａ ｎ　−Ｒドメインがレプリコンを有する場合には、プラスミドｐＮ３３５ｇ）場 合と同様に、ｋａｎ−Ｒ及びａｍｐ−Ｒはともに、Ｂ５５９１株の形質転換体の 間で等しく現われる。さらにＢ５５９１のｋａｎ−Ｒ形質転換体の約２０〜３０ ％がアムピシリン感受性であって、同数の±−Ｒ形質転換体かり−Ｒ感受性であ った。予測通り、ｐＮ３３５８　Ｄ　Ｎ　ＡによるＤＩ＋５の全形質転換体（Ｃ ｒｅ−）が、±−Ｒ及びｋａｎ−Ｒであった。

これらの実験における形質転換の１単位は、１０６形質転換体／使用したＤＮＡ のμワを示した。

Ｂ５５９１におけるｐＮＳ３５ｇのＤＮＡの分離の物理的証拠（図６Ｂ）は、Ｂ ５５９１及び０１１５の形質転換体に由来するＤＮＡの迅速プラスミド調製物の 制限分析から得られた。全ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩで消化して、その結果生じ た断片の数を、アガロース　ゲル電気泳動及びサザーンハイプリダイゼーション により測定した。Ｄ［１５の±−Ｒｋａｎ−Ｒ形質転換体に由来するプラスミド ＤＮＡ　（レーン１）は、元のｐＮＳ３５８プラスミドと区別できなかった。そ れらはともに、予測される３つのＸｈｏ　Ｉ断片を含有した。こ　。

れに対比して、Ｂ５５９１の±−Ｒ，ｋａｎ−Ｒ形質転換体からのプラスミドＤ ＮＡは単−Ｘｈｏ　Ｉ部位のみを伴うＤＮＡを含有した（レーン２）が、一方［ ｌ５５９１のｋａｎ−Ｒ，ａｍｐ−Ｓ形質転換体からのプラスミドＤＮＡは、２ つのＸｈ。

■断片を含有した（レーン３）。Ｂ５５９１の±−Ｒｋａｎ−Ｒ形質転換体から のプラスミドＤＮＡ　（レーン４）は、３種（７）ＤＮＡ、即ちｐＮＳ３５ｇ、 単−Ｘｈｏ　Ｉ部位ヲ有ｔ　ルａｍｐ−ＲドメインプラスミドＤＮＡ、及び２つ のＸｈｏ　Ｉ部位を有するｋａｎ−ＲドメインプラスミドＤＮＡの全てを含有し た。予測通り、ｐＮｓ３５８のｋａｎ−Ｒドメインをちょうど有するプラスミド ＤＮＡは、ｐＮＳ３５８ＤＮＡ又はシリーＲプラスミドＤＮＡの場合よりも非常 に少ない量で（即ち、ＤＮＡバンドが非常に薄かった）回収された。ｋａｎ−Ｒ ドメインのＰ１プラスミドレプリコンはυ１ｐ−ＲドメインにおけるｐＢＲ３２ ２レプリコンの場合より非常に低い複写数にＤＮＡを複製した。

ｐｃｐ十　及びｈｔｐ”　抽出物によるＤＮＡパッケージングのＬ延 結紮ベクター（ｐＮＳ３５ｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａのパッケージングを生・成した。３ ０ｎ９のこのＤＮＡを卜′前１１に１記載の０．２μ！の１ＪＩ）’：ｃ・ｐ″ １　抽出物とともにインキュベー：ドしグたが、但し、イ〕ンーご、キーユパベ ー　ンヨン時間は１５分では、′な・；く−て、１６０分であった。

１イ、シキーユ・ベージコン終了時に、ｌ−６ｄ１Ｍ′トリス−、ＨＣｌ、　ｐ ［Ｉ’７．、ｉ４１、ｉｔ！Ｍ：ｋｌ　、’、＾工Ｐ、、１６ａＭ　Ｍｇ（Ｊ’ ２．、：３５０−ｊＭ　シ・ぺ・ルミジン、６０＋Ｍブトトレシ：ン１、二及： ＪＪ、、’３’、Ｏｔｎ　Ｍベーター　メノル功ニブ＋エタノールを１含１有− す二る’；１４ｐ、’Ｑの、緩衝液を１．１８・μｌ・、の膚疼結−輩水ｈ：、 ｔｐ”　抽出１物ｔ−−（緒４こ・１反、応、・液、に；添加心丈、。・そ、の 琴結果生じた。混合液を：！３）σ工、で溶、ら１１こ・ｆ３η３℃閘イこンキ ュ“ベー：トシ、”だ。こ７の期＋ａの終−７５時１に、Ｊｐ反、応液を７ＭＧ 　、、（ｌＦ、０ｓｊｌ　Ｈ）　・リス−！Ｈ’Ｇ１．　：ｐＨ７，’５．　’ １．０ｍ、Ｍ’ＪＭｖｆｌ’Ｑ＊　、　＋’０．ｌＬ’％ゼラーチ：ン、：）Ｔ ’ｌ’５１）、＞：６ニ＞ｔ！釈・し１、＋１）Ｎエース：Ｉを＋、Ｉｉ＠ＩＬ ｑ／＝ｗ’ｔの１ｍまで、添加上で、未パ！ノ′ケージ化Ｄ”ＮＡを・全゛て一 破；壊しまた。Ｊ５．ａ’ｌの上記パッケージジグ反応−液を１０′１へ細ｖｍ 立細、胞の・′４３．ｓ’５・９１株に添加し、その結果生じた混合液を’＋３ １０”Ｃ−で１１″Ｏ分インキュベートして、ファージ吸着を起こさせた。。− ｔＬの結果生じた感染細胞をＬグロスで２ｍｌに希釈し、：ｒｓ；ｒ・℃で１時 間増殖させて、遠心分離によりペレット化し１、次゛、いでＬ−ａｍｐ寒天寒天 上板上げた。−晩インキュベーシタン後、平板は２２０８クローンを含有した。

これは、２　Ｘ　１０’パツケ一ジ化ＤＮＡ分子／添加ベクターＤＮＡのμ９の パッケージング効率に相当した。パッケージ化ベクターを検定するために用いた 細菌株がＤＨ５（Ｃｒｅ−）組換えが注入直鎖ＤＮＡを環化する必要があったこ とを示す。２、つの抽出物のいずれかがパッケージング反応から取り残された場 合には、ａｍｐ−Ｒコロニーは検出されず、これは両袖出物がパッケージングに 必要であったことを示す。凍結−解氷ｈｔｐ”の代わりに音波処理ｈｔｐ“抽出 物を用いた場合、パッケージング効率は変わらなかった。しかしながら、音波処 理抽出物は凍結−解氷抽出物よりも安定性が非常に低いことが立証されているの で、・その後の実験はすべて、凍結−解氷抽出物を用いた。最後、に１、−ａｍ ｐ−Ｒコロニーの分析は、５０％（２５／　５０）がｋａｎ−Ｒであることを示 したが、これは、ｐＮｓ３５８の両抗生物質耐性ドメインがしばしばパッケージ 化されたことを示す。

細菌のベクター感染 １００＋＋ｊ’の細菌のオーバーナイト培養（２〜３　Ｘ　１０’細胞／ｉＪ） をファージ溶解物、又は生体外パッケージング反応のアリコートとともに３０℃ で１０分間インキュベートした。ファージが検定すべきものであった場合、５５ ℃の３、　Ｏａｌの溶融り一上層寒天（０，７に寒天）を感染細胞に添加し、そ の混合物をＬ−寒天平板上に広げた。上層寒天を室温で５分間固化後、平板を３ ７℃で１６時間インキュベートし、プラークを採点した。抗生物質耐性細胞が検 出されない場合は、感染細胞を抗生物質含有り寒天平板上に広げて、これらの平 板を３７℃で１６時間インキュベートした。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡのクローン化挿入物を有するプラスミドを、以下の２つ の方法で回収した： （１）　ＢｉｒｎｂｏｉＩｌｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、 　７．　１５１３−１５２３（１９７９）のアルカリ溶解プロトコルにより、そ してＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　：＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｂｏｘ　１００゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１９８２）が記載した塩化セシウムエチジウムプロミ ド平衡遠心分離により２〜３　Ｘ　１０ｇ細胞／＊１！に一晩増殖させた細胞１ リツトルから、プラスミドＤＮＡを単離した。勾配液からＤＮＡを取り出した後 、それを塩化セシウム−飽和イソプロパツールで４回抽出して、１０ｍＭ　トリ ス−ＨＣ４ｐＨ８，０，１ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡの１リツトル溶液に対して４℃で５ 時間透析し、フェノールで２回抽出して、次にＩ　Ｍ　ＬｉＣｌ２　に溶解した ２容積のエタノールで沈殿させた。

（２）クローン化挿入ＤＮＡを有するプラスミドを、それらの細胞をＰ１ファー ジに感染させることによって、ファージ粒子中の形質転換細胞から回収した。感 染ＰＩ　ＤＮＡは、両ＤＮＡ上のｌｏｘ　Ｐ部位に関連したＣｒｅ−介在組換え 工程により細胞中の常在性プラスミドと再結合した。

この出来事は、クローン化挿入プラスミドに隣接したＰ１ｐａｃ部位で起き、空 絵によってファージ粒子へのそのパッケージングがなされる。１００＋＋１の形 質転換細胞のオーバーナイト培養（約２ＸｌＯｓ細胞）　ヲ６Ｘ１０”　Ｐ１７ ｙ　−ジとともに３０℃で１０分間インキュベートし、次いでＬ−グロスで５ｍ ｌに希釈した。感染細胞を、細胞溶解が観察されるまで（約９０分）、３７℃で 激しく振盪した。クローン化断片をｐＮＳ３５８のｋａｎ−Ｒドメインとともに 含有するファージの数を、Ｂ５５９１を溶解物のアリコートに感染させ、次いで 産生されたｋａｎ　−Ｒ細胞の数を測定することによって査定した。溶解物中の プラーク形成ファージを、上記のようにして測定した。通常、これらの溶解物中 のｋａｎ−Ｒファージ対プラーク形成ファージの比は、約０．１〜１％であった 。

本プラスミドの構造を、図７Ａに説明する。我々は、本明細書中でそれを用いて 、ｌａｃ遺伝子プロモーターによって調節されるＰ１溶菌レプリコンのようなり ローン化多複写レプリコンを用いて細胞中のプラスミド複写数を容易に増幅し得 ることを説明した。ＪＭ１０９株（ｌａｃｌｑ）をｐＮＳ３６４　Ｄ　Ｎ　Ａで 形質転換して、形質転換細胞をＬ−ブロス中で増殖させた。これらの条件下では 、プラスミドは、１コピ一／細胞染色体でプラスミドレプリコンにより維持され ると予測された。ＩＰＴＧを培地に添加すると、１ａｃｌｑリプレツサーは不活 性化され、したがってｌａｃプロモーター及びＰ１溶菌レプリフンが活性化され る。６０ｍ１の月１０９　（ｐＮＳ３６４）の培養を３７℃でＬ−グロス中で５ ×１０７細胞／ｍｌの密度に増殖させて、次いで各５■ｌの８つのアリコートに 分けた。１つのアリコートをＬ−グロス中で３７℃でさらに３時間増殖させ、一 方他の７つのアリコートは各々、１ｈＭ〜ｌｌ１１Ｍの範囲の濃度でＩＰＴＧを 用いて３時間、Ｌ−グロス中で増殖させた。総細胞ＤＮＡを各培養から単離し、 制限酵素ＢａｍＨＩ　（これは２つの断片にｐＮｓ３６４を切断する）で消化し 、サザーンハ゛イブリダイゼーションによって分析した。その結果（ＩＩ６Ａ） は、培地中のＩＰＴＧの濃度が増大するとプラスミド複写数も増大〜４０多かっ た（レーン１と８を比較）。

実施例１ ｐＮ５３５８への大腸菌ＤＮＡ断片の挿入、キメラベクターＤＮＡのパッケージ ング、パフケージングされたキメラベクターでの細菌の形質転換、形質転換され た細菌の選択及び挿入されたＤＮＡ断片の回収 ２マイクログラムのｐＮＳ３５ｇ　ＤＮＡをＢａｍＨＩ又は與Ｉ制限酵素のいず れかで消化させた。これらの酵素の各々は、ポリリンカークローニング部位の中 で一度ベクターＤＮＡを開裂した。開裂されたＤＮＡを次に、その後の結合反応 における開裂末端の再結合を防ぐべくアルカリ性ホスファターゼで処理した。

挿入物ＤＮＡの供給源は大腸菌株ｆ３３５０であり、分離されたＤＮＡのサイズ は２０Ｏｋｂより大きいものでありだ。

ベクター内にＤＮＡのいずれかを挿入する前に、Ｓａυ３ａＩで２０〜５０ｋｂ の平均サイズまで、或いは又制限酵素Ｎｏｔ■で完了に至るまで消化を行った。

２０マイクロリツトルの量でほぼ同量（２０Ｏｒ＋９）のベクターＤＮＡと大腸 菌ＤＮＡ　（ＢａｍＨＩ消化されたベクターと５ａｕ３ａ　Ｉ消化された大腸菌 ＤＮＡ又はＮｏｔＩ消化されたベクターとＮｏｔＩ消化された大腸菌ＤＮＡ）を 混合し、−晩結合させた。ｒｐｃｐ”及びｈｔｐ′″抽出物によるＤＮＡパッケ ージングの実証」という題の前述の項で記したとおりにこの結合混合物を１マイ クロリツトル）ぐツケージングし、「べ、フタ−による細菌の感染」という項で 記したとおり感染により大腸菌株Ｂ５５９１を形質転換するのに用いた。結果と して得られた形質祿換済みの細菌を表３に示されているようなｋａｎ−Ｒコロニ ーとして検出した。

表３　′ ９ＮＳ３５ｇ−大腸菌ＤＮＡの生体外パッケージングベクターＤＮＡ１ｒｇあた りの力 １）ＮＳ３５８−　ＢａｍＨＩ　’　＜　１０’しＮ８３５ｇ　−Ｂ聾ＨＩ＋リ ガーゼ　２Ｘ１０’　２．４Ｘ１０’ｐＮ３３５８−　ＢａｍＨＩ　−ＡＰ＋リ ガーゼ　２Ｘ１０’ｐＮ３３５８−　Ｂａｍ　ＨＩ−ＡＰ 十−＋リガーゼ　４Ｘ１０Ｓ　６．０Ｘ１０３大腸菌ＤＮＡ−５ａｕ３ａ　Ｉ ｐＮ３３５８−　Ｎｏｔ　ｒ＋リガーゼ　２ＸｌＯ”　４．２Ｘ１０’ｐＮＳ３ ５８−匣す−ＡＰ＋リガーゼ　１刈０４ｐＮＳ３５８−　Ｎｏｔ　Ｉ−ＡＰ 十−＋リガーゼ　１．８ｘ　１０’　８．　Ｏｘ　１０３大腸菌ＤＮＡ　−Ｎｏ ｔ　Ｉ ＡＰ＝アルカリ性ホスファターゼで処理されたＤＮＡ断片アルカリ性ホスファタ ーゼで処理されなかったＢａｆｆ１ＨＩ又はＮｏｔＩ−消化されたベクターＤＮ −Ａのパワケージング効率は、付加されたベクターＤＮＡ　１マイクログラムあ たり約２　Ｘ　１０’個のパッケージングされたＤＮＡ分子であった。アルカリ 性ホスファターゼでのベクターＤＮＡの処理はパッケージング後のＤＮＡの回収 を約１００倍から２００倍までに減少させたが、５ａｕ３ａ　Ｉ−又は與Ｉ消化 された大、腸菌ＤＮＡを結合反応に・加えてこの損失を部分的に回復することが 可能である。これらの結果、を解釈すると、ホスファターゼ処理を受けたベクタ ーＤＮＡは大きなコンカテマー（鎖状体）に結合され得ず、従って効率よくパッ ケージングされ得ないということになる。ベクターＤＮＡに大腸菌ＤＮＡ挿入物 を付加することにより、このベクターＤＮＡをパッケージング可能なサイズに達 するようにすることができた。特定のパッケージング反応に応じて、５０〜９０ ％のｋａｎ−Ｒコロニーがａｍｐ−Ｓであり、これらにはｐＮＳ３５８のａｍｐ −Ｒドメインが欠如していた。

パッケージングされたｐＮＳ３５８　ＤＮＡ及びそれに含まれていた大腸菌挿入 物の回収と特徴づけ （ａ）　５ａｕ３ａＩクローン ｐＮ３３５８内に挿入された５ａｕ３ａ　Ｉ消化された大腸菌をパッケージング することにより生成された１０個の別々のコロニーから増殖された培養の各々の 中のプラスミドＤＮＡを、ＢｉｒｎｂｏｉＩＩら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ ｓ、７．　１５１３−１５２３（１９７９年）のアルカリ手順によって分離し、 制限酵素消化によって分析した。プラスミドのうちの２つのＤＮＡはｐＮＳ３５ ８　ＤＮＡのｋａｎ−Ｒドメインと同じであっ、だが、残りは、数多くの新しい 制限断片を含めベクター内に存在するものよりもかなり多くのＤＮＡを含んでい た。制限酵素Ｉ■、Ｘｈｏｌ　、ＰｖｕＩｒ及びＥｃｏ　Ｖでのベクター（レー ン３）及びベクター−５ａｕ３ａ　Ｘキメラのうちの５つ（レーン４〜８）の消 化物を図８３に示す。レーン４〜８にみられる新しいＤＮＡ断片は＊Ｍｊｔｌ！ ！１Ｓａｕ３ａ　Ｉ断片の挿入から得られるものであることがわかった。図８ａ のレーン１及び２は、ＤＮＡサイズ標識を含んでいた。分離された最大のプラス ミドは３８〜４０ｋｂであった。パルスフィールドゲル分析は、されが２２ｋｂ と１．７　ｋ　ｂの２つのＮｏｔＩ断片を含んでいることを示した（図８Ｂ、レ ーン３）。レーン１は、パンケージングされたベクターＤＮＡを含み、レーン２ はＮｏｔ　Ｉで消化された第２の５ａｕ３ａ　Ｉ−キメラを含んでいた。これら の結果は、全てとは言わないまでも５ａｕ３ａ　Ｉ挿入物のほとんどが、容量が ４０ｋｂ以下の小さい頭の（ＰＩＳ）粒子内にパッケージされたことを示唆して Ｓｍｊ　ｔｈらにより記述された最近の大腸菌ＤＮＡのＮｏｔＩ制限地図（「科 学Ｊ　２３６．１４８８−１４５３（１９８７年））は、大腸菌ＤＮＡのＮｏｔ Ｉ消化が、本発明の兜ＫｆｌＰ１ハンゲージングンステムによりパンケージング されうる５つのＤＮＡの断片を生成するということを示している。これらの断片 のサイズは２０ｋｂ、　４０ｋｂ、４３ｋｂ　（このサイズの断片が２つ）そし て９５ｋｂである。Ｎｏｔｌ断片をｐＮ３３５ｇ　ＤＮＡ内に挿入し、これらを ５ａｕ３ａ　Ｉ挿入物について記述したようにＢ５５９１細菌内でクローニング した後、５つのクローンからのプラスミドＤＮＡを検査した。クローニングされ たプラスミドのうちの２つのＤＮＡはｐＮ３３５８の…−Ｒドメインのみを含ん でいた。その池３つのクローニングさルミ気泳動によってさらに正確に決定され た。プラスミドの１つ（図８Ｂ、レーン１１）は、ゲル内に４０ｋｂの標識で移 動したＮｏｔＩ挿入物を含み、−万能の２つ（図８ｂ、レーン９及び１０）は、 ４２．５ｋｂの標識よりわずかに上で移動する挿入物を含んでいた。これら３つ のクローンは、ベクターの…−Ｒドメインに相応する１２ｋｂのＮｏｔ　Ｉ断片 を含んでいた。４３ｋｂの入物を含むクローンの１つのＤＮＡはな（Ｂｇｌ［［ 及びＸｈｏ　Ｉによるレーン１０内に示されたプラスミドＤＮＡの消化は合計サ イズが６０ｋｂを超す一群の断片を生成し、Ｎｏｔ■ｍ化物に基づくサイズ見積 りを確認した（図８０、レーン２）、その大きなサイズに基づき、Ｎｏｔ　Ｉ挿 入物を伴う３つのプラスミドは大きなＰＬ（ＰＩＢ）頭によりバクケージングさ れていなくてはならない。

サイズの断片をＰＩ頭の中にパフケージングできることを示すのに用いられた。

Ｎｏｔｌ消化された大腸菌ＤＮＡを用いたパッケージング反応の結果として得た ファージを、ラムダ−ｐｌ　：　ａｒｅプロファージを含む大腸菌の江「菌株Ｎ ５３０６７を感染させるために使用した。結果として得られたｋａｎ−Ｒ細菌を 分離させ、トリプトファンの無い状態で最小の寒天上でこれらが増殖できるか否 かを見極めるためにテストした。テストした５０のうち２つが増殖した。

プラスミドＤＮＡを正のクローンのうちの１つから分離し、臭化エチジウム染色 （図９Ａ、レーン３−４）又はパルスフィールドゲルのサザン分析（図９Ａ、レ ーン５〜６）により、大腸菌ｔｒｐ　Ｅ遺伝子プローブに雑種形成りＮＡを含み 、レーン４及び６は■■で消化された大腸菌ＤＮＡを含んでいた。ｋａｎ−Ｒ遺 伝子ＤＮＡでパルスフィールドゲルを探査すると、遠プラスミドＤＮＡを含むレ ーン（レーン７）には１２ｋｂのＤＮＡ断片が現われたが、大腸菌ＤＮＡを含む レーン（レーン８）内には現われなかった。この断片はｐＮＳ３５８　ＤＮＡの ψ−Ｒドメインに相応していた。さまざまな制限酵素（ＢａｌＩＩ　−Ｘｈｏ　 Ｉ、レーン１及び２、Ｈｉｎｄｎ［、レーン３及び４、Ｓｅａ　ｒ　、レーン５ 及び６）での仰プラスミド及び大腸菌ＤＮＡの消化（図９Ｂ）とそれに続＜、当 プラスミドＤＮＡをプローブとして用いたサザン分析は、プラスミドＤＮＡが、 す片を含んでいることを示した。レーン１．３及び５は木５ＩＪｌｉｌＤＮＡｔ −含み、レーン２．４及び６は雪プラスミドＤＮＡを含んでいた。断片がプラス ミドレーンには無く大腸菌レーンに存在していたか又はその逆であった場合、こ れは、これらの断片がベクタから誘導されたか或いは又それらがベクターと大腸 菌ＤＮＡの間の接合部を表わしていることを示す。これらの結合と全て合わせて 考慮すると、Ｐ１パッケージング系が１０７ｋｂものＤ　Ｎ　Ａ　（９５ｋｂの Ｎｏｔ　Ｉ挿入物と１２ｋｂのプラスミド史−Ｒドメイン）を収納できること、 及びベクターはこのＤＮＡを染色体外プラスミドとして忠実に複製していたこと を示していた。

実施例２ クローニングされたＤＮＡ断片を増幅するためのｐＮＳ３５８−１ｖｔベクタの 使用 ＢａｍＨＩ又はＮｏｔＩを用いて２マイクログラムのｐＮＳ３５８−１ｙｔＤ　 Ｎ　Ａを消化し、それぞれ、実施例１に記したとおり大腸菌ＤＮＡの５ａｕ３ａ 　Ｉ及びＮｏｔＩ断片をクローニングするのに使用した。実施例にあるとおり５ ａｕ３ａ　Ｉ又は独■断片挿入物でベクターＤＮＡを生体外パッケージングした 後、パッケージングされたキメラＤＮＡを菌株Ｎ５２９７４内に注入しｋａｎ　 −Ｒ形質転換体を選択した。実施例１ならびにｒｃｒｅ’細胞の生体外パッケー ジング及び形質転換の後のｐＮＳ３５Ｓ　ＤＮＡ内にクローニングされた外因性 ＤＮＡ断片の回収Ｊ（ｐ２７〜２８）の項に記されているように、個々のり−Ｒ 形實転換体のＤＮＡを分離し、制限入物を含んでいることがわかった。ベクタ内 で溶菌レプリコンによりベクター−挿入物ＤＮＡを増幅できるか否かを見極める ため、キメラプラスミドを含むＮ５２９７４菌株の細菌の培養を半分に分割し、 １ｍＭのＩＰＴＧが存在する中でか或いは又これが無い状態で３時間増殖させた 。増殖期の終わりで、全ての細胞ＤＮＡを２つの培養の各々から分離し、ｒｋａ ｎ−Ｒ遺伝子、Ｐ１プラスミドレプリコン及びＰ１溶菌レプリコン、ｐＮＳ３６ ４を含むプラスミドの増幅」という題の項でプラスミドｐＮ３３６４について記 した通りにプラスミドのコピー数をサザン雑種形成によって測定した。ＩＰＴＧ と共に増殖させた培養からのＤＮＡはＩＰＴＧ無しで増殖させた培養から分離し たＤＮＡに比べ２０倍乃至３０倍のベクター挿入物プラスミドを含んでいた。こ の結果は、ＣｓＣ１−臭化エチジウムの平衡密度勾配を用いて２つの培養からの 超コイル環状ＤＮＡを分離することにより、確認された。

実施例３ サイズ選択された５ａｕ３Ａ　ＩヒトＤＮＡ断片のクローニングに対する大腸菌 ｍｃｒＡＢ制限系の効果大腸菌ＤＮＡ断片をクローニングするために用いられた Ｐ１クローニング系の要素（ｐＮＳ５８２、Ｎ５２９６１、Ｎ５２９６１及びＢ ５５９１）を哺乳動物のＤＮＡ供給源からの高分子量のサイズ選択されたＤＮＡ 断片を効果的にクローニングするのに用いることができるか否かを見極めるため 、図１０に合させた。ここでは、クローニングプロセスの分析が単純化されるこ とを理由として、ｐＮＳ５８２　ＤＮＡではなくｐＮＳ５８２ｔｅｔ１４　ＤＮ Ａを使用した。ベクターとしてｐＮｓ５８２ｔｅｔ１４ＤＮ＾を用いてプラスミ ドＤＮＡを分離し消化することにより特定の形質転換体が挿入物を含んでいるか 否かを見極めるのではなく、むしろ、ｔｅｔ−３であるｋａｎ−Ｒ細胞の分画を 見極めることによって挿入物を伴う形質転換体の分画を単純に評価した。大腸菌 ＤＮＡではなくサイズ選択されたヒトのＤＮＡを用いたという点を除いて、表３ に記したものと類似の実験を行なった。２％未満の…−Ｒ形質転換体がｔｅｔ− ６であった。細菌のＤＮＡのものに比べてヒトＤＮＡのクローニング効率が低い のは、細菌ｍｃｒＡＢ系による制限のせいであると思われた。

１１ｏｏｄｃｏｃｋら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１６．ｐｐ４４６５〜 ４４８２（１９８８年）及びＲａｌｅｉｇｈｔら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　 Ｒｅｓ、　１６．　ｐｐ１５６３〜１５７５（１９８８年）によって示されてい るように、ｍｃｒＡＢ系はメチルｃｐｃ（’“ＣｐＧ）を含むＤＮＡを外来性の ものとして認識し、それを分解する。哺乳動物及び植物のＤＮＡの中のＣｐＧ塩 基対は往々にしてメチルシトシンを含んでいることから、このメチル化されたＤ ＮＡは、回収される前にｍｃｒＡ　”　ｍｃｒＢ　”受容体細菌株（例えばＢ５ ５９１）の中で消化されることになる。その上、回収されるヒトＤＮＡ断片は、 ＭｅＣｐＧが過少表象（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）されているＤＮ Ａ配列について高度にバイヤスされる確率が高くなる。この問題を処理するため 、受容体菌株Ｂ５５９１をＮ５３１４５で置換した。Ｂ５５９１と同様、菌株Ｎ ５３１４５は、注入された線形ベクターＤＮＡの環化のため構成的に表現された Ｐ１付加されるまでベクタ内でＰ１溶菌レプリコンを阻害するＦｌｅｃ　Ｉ　ｅ ｌプラスミドも含んでいる（例２を参照のこと）。

Ｂ５５９１の代りにＮ５３１４５を用いた場合、形質転換体の頻度は２％未満か ら約２０〜３０％まで増大した。それでもなお、この頻度は、細菌ＤＮＡ断片を クローニングした場合に得られるものよりもかなり低いものであった。”ＣｐＧ を含むＤＮＡの分解がｍｃｒＡ”、ｍｃｒＢ”の受容体細胞系統内のみならずＮ ５２９６１及びＮ５２９６２といったｍｃｒＡ◆、ＩＩＣｒＢ十細菌から調製さ れたパッケージング抽出物内でも起こっていた場合、この考察を説明することは 可能である。

Ｎ５２９６１及びＮ５２９６２に類似する細菌株（それぞれＮ５３２０５及びＮ Ｓ３２０ｇ）を構成したが、これらにはｍｃｒＡ−及びｍｃｒＢ−サイズ選択さ れた５ａｕ３＾■消化されたヒトＤＮＡ断片を含む表３に記されているもののよ うな結合反応をパッケージングするのにＮ５３２０５及びＮ５３２０８から調製 されたパ。

ケージング抽出物を用い、結果として得られた形質転換体をＮ５３１４５内で回 収した場合、ｋａｎ　−Ｒ形質転換体のうちの６０％から８０％までもがｔｅｔ −Ｓであった。これとは対照的に、パッケージング抽出物を調製するのに用いら れた細菌株がｍｃｒＡ　”及びａ＋ｃｒ　Ｂ＋を除いてｒｅｃ　Ｄ−であった場 合、ｔｅｔ−３形質転換体は、Ｎ５２９６１及びＮ５２９６２抽出物の場合に比 べて低い効率（２０〜３０％）で回収された。

これらの研究から、パッケージング抽出物及びＣｒｅ“受容体細菌株の両方の中 に存在していたｍｃｒＡＢ系が、ＤＮＡ断片を分解することによってヒトＤＮＡ 断片のクローニングと干渉していたという結論が導き出された。

実施例４ Ｐ１クローニング系によって回収されたヒトＤＮＡ断片のサイズの増加 パッケージング抽出物及びパッケージングされたＤＮＡが中に注入された細菌株 を調製するのにｍｃｒＡ−１ｍｃｒＢ−細菌株を用いた結果、クローニングされ たＤＮＡ断片を含むｋａｎ−Ｒ形質変換体が高い割合で生成されたが、これらの 形質変換体におけるプラスミドＤＮＡの分析は、数多くの形質変換体がＤＮＡの 出発母集団のサイズを基にして予想以上に小さいクローニングされたヒトの断片 を含んでいることを示した。例えば、断片の出発母集団のサイズが約３０ｋｂか ら８０ｋｂである実験において、回収されたプラスミドの大部分は３０ｋｂから ４０ｋｂの範囲のクローニングされた断片を含んでいた。図１１は、１２　ｋａ ｎ−Ｒ１ｔｅｔ−Ｓ形質転換体から分離されたプラスミドＤＮＡについての結果 を示している。これらのＤＮＡ　（レーン２−１３）は、制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ 　及びＸｈｏ　Ｉにより消化された、後、アガロースゲル電気泳動法によって分 析された。ファージラムダＤＮＡのサイズ規格（レーン１４）を用いて、イズ（ ｊ約１ｔ５ｋｂ）を差し引くことにより、いずれかのプラスミドの中のヒトＤＮ Ａの量を見極めることができる。

こ・のような分析に基づくと、検査された４８のプラスミドのうち３一つのみが ５０ｋｂよりも大きい挿入物を有していた。

、”欠の、２つ・の理由から、回収されたクローンから大きい方・のヒト、の゛ 断片が除外されていると考えられた。すなわち１．１゛）こｔ・らの実験で用い られた頭−尾堪能（ｐｒｏｆｉｃｉ−ｅｎ　ｔＮ）ｌ抽出書物内の大きい頭と小 さい頭の比は１：１であった。大きい頭と小さい頭の比がこのように低いのは（ 通常の条件下“で、は１０：’１）、菌株Ｎ５３２０５内に存在するｃｏ＋−２ 突然変異のせいであった。おそらく、この抽出物内の大き、い頭の分画の減少は 、より大きなりローニングされた断片をもつベクタの回収を減少させたと思われ る。さらにこの効果は恐らく、いずれかの断片母集団内の小さい方のＤＮＡ断片 が大きい方の断片の場合よりも切断を受けにくいことからクローニングされる可 能性がより高いために、悪化したと思われる。２）小さいクローニングされた断 片の優先的回収の第２の考えられる理由は、Ｐ１ヘッドフルパッケージングのた めの基質を生成する結合反応の性質ならびに以下に記すようなヘッドフルパッケ ージングプロセス自体の性質からくるものである。従って、結合反応は、クロー ニングすべき断片が他の断片にではなくベクターＤＮＡに結合するようにするた め、大きなベクターＤＮＡが余剰である状態で行なわれる必要がある。もし他の 断片への結合が起こったとすると、現在クローニング中のゲノムの異なる部分か らきたＤＮＡ断片は連鎖された状態となり、これは、正しくないゲノム地図を生 成することになる状況である。比較的高いＤＮＡ濃度（〉１０μｑ／ｍｌ）で大 きいベクタが余剰である状態で結合反応が行なわれた場合、交互のベクターと挿 入物ＤＮＡから成るコンカテマーが生成される。ＢａｍＨＩ消化されアルカリ性 ホスファターゼ処理を受けたｐＮＳ５８２ｔｅｔ１４　ＤＮＡが５ａｕ３Ａ　Ｉ −消化されたヒトのＤＮＡに結合されたときに生成されるこのようなコンカテマ ーの一例が図１２Ａに示されている。このコンカテマーがＰ１ヘッドフルパッケ ージングシステムによりパッケージングされる場合、パッケージングはベクター 分子の１つの中のｐａｃ部位から開始され、空の２１頭の中に１頭分のＤＮＡ（ １１０−１１５ｋｂ）が取り込まれるまで完了しない。このようなパッケージン グプロセスの結果、特にベクターＤＮＡに結合された断片がＰ１ヘッドフルサイ ズに比べて小さい場合（図１２Ａ）、単一のファージ頭の中に複数のベクターＤ ＮＡコピー及び複数のヒトＤＮＡ断片がパッケージングされうろことになる。こ のことはすなわち、小さい方のヒトＤＮＡ断片が小さい２１頭の中にのみパッケ ージングされ得ず、より大きいコンカテマーの一部として大きい２１頭の中にも パッケージングされ得るということを意味している。このパッケージングされた コンカテマーＤＮＡが菌株Ｎ５３１４５内に注入されると、ｌａｘ　Ｐ部位と側 面を接した全てのＤＮＡ断片は環化され回収される。これらの中に含まれるのは 、挿入物を全くもたないｋａｎ−Ｒドメインのプラスミド分子ならびに小さいヒ トＤＮＡこれらの問題を克服するため、クローニング系に対し２つの変更が加え られた。まず第１に、頭−尾堪能抽出物の調製において、Ｎ５３２０５の代りに 細菌株Ｎ５３２１０を用いた。この細菌株３２１０は望突然変異を含んでいたた め小さい２１頭よりも５〜１０倍大きい２１頭を生成した。Ｎ５３２１０内のａ 　ｒｎ　１．３１突然変異及びＮ５３２０５内のａｍ９．１６突然変異は両方共 バカーゼ欠慣表現型を生成した。クローニング系における第２の変更には、挿入 物ＤＮＡへの結合以前のベクターＤＮＡの処理方法の変化が関与していた。この アプローチでは、結合反応中にコンカテマーは生成されなかった。このアプロー チを利用するため、上述のように、Ｓｃａ　Ｉ部位とプラスミドレプリコン−近 位ｌａｘ　Ｐ部位の間に挿入された１０−１１ｋｂのスタファＤＮＡ断片を最終 生成ルスＤＮＡからの約１０ｋｂ（１０，６ｋｂ）の「スタファ」断片を挿入す ることにより、ｐＮＳ５８２±１４ベクターＤＮＡを変更した（図４）。クロー ニングされるべきＤＮＡのサイズは、６０ｋｂから約９０ｋｂの範囲内にあった 。スタファ断片は、環化の間に回収されなかった部位の中に挿入された。

の生成物の処理で構成されていた。ＢａｍＨＩ末端で５ａｕ３Ａ工消化を受けサ イズ選択されたヒトのＩ）ＮＡ断片に結合することができるもののその平滑断端 生成部位すなわちＳｅａ　Ｉ末端で反応中のいかなるＤＮＡにも結合できない２ つのベクター断片（アーム）がこの手順により生成された。後者の状況はコンカ テマーの形成を妨げ、その結果２つのベクターアームの間にはさまれたヒトのＤ ＮＡ断片から成る結合生成物が得られた（図１２Ｂ）。より短いベクターアーム は、パンケージングの開始点である諸部位を含み、両方のベクターアームはｆａ ｘ　Ｐ部位を含んでいた。図２Ｂに示されている構造内の挿入物ＤＮＡのサイズ は、その挿入物が回収されるか否かを決定した。

挿入物のサイズが７０ｋｂ未満である場合、分子の末端とケージングは不成功に 終わる。挿入物が９５ｋｂより大きい場合、頭は部位ｌａｘ　Ｐ部位の細膜の前 に充てんされ、パッケージングされたＤＮＡは、受容体Ｃｒｅ　”細菌株Ｎ５３ １４５内に注入された後再環化され得ないために回収されないことになる。ベク ターアームでパッケージング可能なりＮＡのサイズ範囲は、結合された分子の右 端と部位１ｏｘＰ部位の間のＤＮＡのサイズすなわちアデノウィルス「スタファ 」断片のサイズに対応していた（図１２Ｂ）。

細菌系統Ｎ５３２０８及びＮ５３２１０、ｐＮＳ５８２叩連４醸１０ベクター、 受容体菌株Ｎ５３１４５及び６０〜９Ｑｋｂの範囲内のサイズ選択されたヒトＤ ＮＡ断片（画分６−９、図１０）から誘導された抽出物を泪いて、…−Ｒ形質転 換体が生成され、そのほぼ全て（〉８０％）が、７０〜９０ｋｂのサイズ範囲内 のヒトＤＮＡ挿入物を含んでいた。図１３はＢａ１ＩＩ及びＸｈｏ　Ｉ消化及び アガロースゲル電気泳動の後の挿入物を伴うクローンのうちのいくつかからのＤ ＮＡを示している（レーン１〜６　；　１０−１３）。対照として、挿入物無し の消化４、３ｋｂ、２．３ｋｂ及び２．０ｋｂ）も示されている（レーン８）。

図１３へのＤＮＡは臭化エチジウム染色により視覚化され、図１３８のＤＮＡは サザン転移後の全ヒトゲノムＤＮＡプローブに対する雑種形成により視覚化され た。後者の手順はヒトＤＮＡ断片の約２分の１〜３分の２を検出した。

７（ｌｋｂより小さい断片がこのクローニングプロセスにおいて回収されたこと から、２１頭を完全に充てんする必要性は切迫したものでないと思われる。

ＦＩＧ、１ ４−一一一　未切断ｐａｃ断片　→ ■ し＝ ヒ ＦＩＧ、ＩＩ 挿入物及びｐＮｓ５ｇ２ｔｅｔ１４ベクターＯＮ＾のコンカテマ−ｐＮ５５８２ ｔｅｔ１４＾ｄｌＯＤＮ＾の２本のアーム間に結紮されたＤＮＡを挿入するＦＩ Ｇ、Ｉ３Ａ ＦＩＧ１３Ｂ 手続補正書（方式） ％式％補正片 １、事件の表示 平成１年特許願第５０９６９４号 （ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３６０７） ２、発明の名称 ９５ＫＢの大きさのＤＮＡ断片をクローニングするための生体外へラドフルパッ ケージング系 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 カンパニー ４、代理人 住所　東京都千代田区麹町３丁目２番地（相互第一ビル）５、補正命令の日付（ 自発） ６、補正の対象 明細書および請求の範囲の翻訳文全文、代理権を証明する７、補正の内容 別紙のとおり下記の書面を提出します。

１）特許出願人の代表者氏名を記載した特許法第１８４条の５第１項の規定によ る書面 ２）委任状および法人国籍証明書ならびにそれらの訳文３）明細書および請求の 範囲の翻訳文浄書（内容に変更なし） 以上 宝際調査報告 １Ｎ＋ｅｌｌｌｌｌ□ａ＃、ｌＡ−１＝ｍ−ｗ−ＰＩＴＴ／ＩＫ　ＲＱ／ｎｆｆ １’；ｎ７国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片を、ｐａｃ部位に近接するブラ ント末端生成部位に挿入することによりベクターＤＮＡを修飾し； （ｂ）工程（ａ）の生成物質を消化して、その各々が（ｉ）ブラント末端、（ｉ ｉ）クローニングすべき外来ＤＮＡ断片に適合する別の末端、及び（ｉｉｉ）Ｉ ｏｘＰ部位を含有する２つのベクターアームを生成し； （ｃ）コンカテマーを生成せずに外来ＤＮＡを工程（ｂ）の生成物質に結紮し； （ｄ）工程（ｃ）の生成物質を、ｐａｃ切断プロフィソエント抽出物及び頭−尾 プロフィシェント抽出物（この場合、頭−尾抽出物中の大型頭部対小型頭部の比 は少なくとも５：１である）と反応させ； （ｅ）Ｃｒｅ＋細菌株を工程（ｄ）の生成物質に感染させ；そして （ｆ）クローン化ＤＮＡを回収する ことから成る、９５ｋｂの大きさの外来ＤＮＡ断片をクローニングするための生 体外ヘッドフルパッケージング系。 ２．スタファ（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片のサイズが約５ｋｂから約２０ｋｂである 、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．スタファ断片がアデノウイルスＤＮＡからの約１０ｋｂのＳｃｏａＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．生体外ヘッドフルパッケージング系が、（ｉ）ＮＳ３２０８という呼称の細 菌株から調製されたｐａｃ開裂堪能抽出物及び（ｉｉ）ＮＳ３２１０という呼称 の細菌株から調製された頭−尾堪能抽出物で構成されている、請求の範囲第１項 に記載の方法。 ５．Ｃｒｅ＋細菌株がｌａｃＩｑ抑制因子を有する、請求の範囲第１項に記載の 方法。 ６．ＩａｃＩｑ抑制因子を抑制解除するためＩＰＴＧが付加される、請求の範囲 第５項に記載の方法。 ７．クローニングされたＤＮＡはサイズ選定される、請求の範囲第１項に記載の 方法。 ８．Ｃｒｅ＋細菌株はＮＳ３１４５という呼称の菌株である、請求の範囲第５項 に記載の方法。 ９．工程（ｅ）の生成物が増幅され、次に回収される、請求の範囲第１項に記載 の方法。 １０．請求の範囲第１項に記載の生体外ヘッドフルパッケージング系において９ ５ｋｂという大きい外来性ＤＮＡ断片をクローニングするためのベクター。 １１．ＰｌｌｏｘＰ部位−アンピシリン抵抗性遺伝子−ｐＢＲ３２２ｏｒｉ−ｐ ａｃ−ＰｌｌｏｘＰ部位−ポリリンカークローニング部位−カナマイシン抵抗性 遺伝子−Ｐｌプラスミドレプリコンという配列を含むＤＮＡ断片をクローニング するためのベクターにおいて、Ｐｌプラスミドレプリコンが第１のＰｌＩｏｘＰ 部位に付着されて配列を反時計回り方向に書かれることになるように前記配列が 環状化されているベクター。 １２．前記ベクターは、ポリリンカークローニング部位とカナマイシン抵抗性遺 伝子の間に挿入されたｌａｃプロモータの制御下でＰｌ溶菌レプリコンを有する 、請求の範囲第１１項に記載のベクター。 １３．Ｐ１ｌｏｘＰ部位−Ｓｃａ１部位を有するアンピシリン抵抗性遺伝子−ｐ ＢＲ３２２ｏｒｉ−ｐａｃ−Ｐｌ−ｌｏｘＰ部位−ポリリンカークローニング部 位に存在するＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位に置換するＢａｍＨＩ部位及びＳａｌ Ｉ部位を有するテトラサイクリン抵抗性遺伝子−ｌａｃプロモータの制御下にあ るＰｌ溶菌レプリコン−カナマイシン抵抗性遺伝子−Ｐｌプラスミドレプリコン という配列を含むＤＮＡ断片をクローニングするためのべクタにおいて、Ｐｌプ ラスミドレプリコンが第１のＰｌｌｏｘＰ部位に付着されて配列が反時計回り方 向に書かれることになるように前記配列が環状化されているベクター。 １４．ＤＮＡスタファ断片がアンピシリン抵抗性遺伝子のＳｃａＩ部位にクロー ニングされている、請求の範囲第１３項に記載のベクター。 １５．ＳｃａＩ部位にクローニングされたＤＮＡ断片が約５〜約２０キロ塩基の 範囲内のサイズを有する、請求の範囲第１４項に記載のベクター。 １６．アデノウイルスＤＮＡからの約１０ｋｂのＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ断片がア ンピシリン抵抗性遺伝子のＳｃａＩ部位内に挿入される、請求の範囲第１５項に 記載のベクター。 １７．遺伝子型ｒｅｃＤ−ｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ＋ｍｃｒＡ−ｍｃｒＢ−を有する ファージ変異体Ｐｌｃｌ．１００ｃｍ−２ｒｍ−ａｍ１０．１で溶原化された細 菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするためのｐａｃ−開裂堪能抽出物を 調製するのに用いられる細菌株。 １８．ＮＳ３２０８という呼称の請求の範囲第１７項に記載の細菌株。 １９．遺伝子型ｒｅｃＤ−ｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ＋ｍｃｒＡ−ｍｃｒＢ−を有する ファージ変異体Ｐｌｃｌ．１００ｃｍｒｍ−ａｍ１３１で溶原化された細菌株に おいて、ファージの大きい頭と小さい頭の比率が約１０：１でありＤＮＡ断片を クローニングするために用いられる頭−尾堪能抽出物を調製するのに用いられる 細菌株。 ２０．ＮＳ３２１０という呼称の請求の範囲第１９項に記載の細菌株。 ２１．遺伝子型ｒｅｃＤ−ｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ＋ｍｃｒＡ−ｍｃｒＢ−を有する ファージ変異体Ｐｌｃｌ．１００ｃｍ−２ｍｒｍ−ａｍ９．１６で溶原化された 細菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするための頭−尾堪能抽出物を調製 するために用いられる細菌株。 ２２．ＮＳ３２０５という呼称の請求の範囲第２１項に記載の細菌株。 ２３．遺伝子型ｒｅｃＤ＋．ｈｓｄＲ＋ｈｓｄＭ＋ｍｃｒＡ＋ｍｃｒＢ＋を有す る四極子ファージ変異体Ｐｌｃ１．１００ｃｍ−２ｒｍ−ａｍ１０．１で溶原化 された細菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするためｐａｃ開裂堪能抽出 物を調製するのに用いられる細菌株。 ２４．ＮＳ２９６２という呼称の請求の範囲第２３項に記載の細菌株。 ２５．遺伝子型ｒｅｃＤ＋ｈｓｄＲ＋ｈｓｄＭ＋ｍｃｒＡ＋ｍｃｒＢ＋を有する 四極子ファージ変異体Ｐｌｃｌ．１００ｒｍ−ｃｍ−２ａｍ９．１６で溶原化さ れた細菌株において、ＤＮＡ断片をクローニングするために役立つ頭−尾堪能抽 出物を調製するのに用いられる細菌株。 ２６．ＮＳ２９６１という呼称の請求の範囲第２５項に記載の細菌株。 ２７．ｌａｃＩｑ抑制因子の欠如したＢＳ５９１という呼称のＣｒｅ＋細菌株に おいて、ＤＮＡ断片のクローニングに有用な細菌株。 ２８．連伝子型ｒｅｃＡ−ｈｓｄＭ＋ｈｓｄＲ−ｍｃｒＡ−ｍｃｒＢ−を有する 、ｌａｃＩｑ抑制因子をもつＣｒｅ＋細菌株。 ２９．ＮＳ３１４５という呼称をもつ、請求の範囲第２８項に記載の菌株。 ３０．遺伝子型ｒｅｃＡ−ｈｓｄＭ＋ｈｓｄＲ−ｍｃｒＡ＋ｍｃｒＢ＋を有し、 ｌａｃＩｑ抑制因子をもつＣｒｅ＋細菌株。 ３１．ＮＳ２９７４という呼称をもつ請求の範囲第３０項に記載の菌株。 ３２．（ａ）ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに結紮し；（ｂ）工程（ａ）の生成物 質をｐａｃ切断プロフィシェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接 触させ； （ｃ）１ａｃＩｑリプレッサーを工程（ｂ）の生成物質に感染させ； （ｄ）ＩＰＴＧを培地に添加し；そして（ｅ）クローン化及び増幅化ＤＮＡを回 収することから成る、１ａｃプロモーターの制御下で多複写レプリコンを含有す るベクター中での９５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片のクローニング及び増幅制御方 法。 ３３．（ａ）請求の範囲第１２項のベクターのポリリンカークローニング部位の 中に外因性のＤＮＡ断片を挿入し；（ｂ）工程（ａ）の生成物をｐａｃ開裂堪能 抽出物及び頭−尾堪能抽出物と接触させ； （ｃ）ｌａｃＩｑ抑制因子をもつＣｒｅ＋グラム陰性菌株を工程（ｂ）の生成物 で感染させ； （ｄ）工程（ｃ）の生成物に対してＩＰＴＧを付加することにより１ａｃＩｑ抑 制因子を抑制解除し；及び（ｅ）クローニングされ増幅されたＤＮＡを回収する 段階、 を含む９５ｋｂもの大きさのＤＮＡ断片の増幅をクローニングし制御する方法。 ３４．Ｃｒｅ＋細菌株が、ＮＳ２９７４又はＮＳ３１４５という呼称の菌株であ る、請求の範囲第３２項又は３３項に記載の方法。 ３５．ｐａｃ−開裂堪能抽出物がＮＳ２９６２又はＮＳ３２０８という呼称の細 菌株から調製される、請求の範囲第３２項又は第３３項に記載の方法。 ３６．頭−尾堪能抽出物がＮＳ２９６１又はＮＳ３２１０という呼称の細菌株か ら調製される、請求の範囲第３２項又は第３３項に記載の方法。 ３７．（ａ）請求の範囲第１１項のベクタ１のポリリンカークローニング部位の 中に外因性ＤＮＡ断片を挿入し；（ｂ）ｐａｃ開裂堪能抽出物と頭−尾堪能抽出 物と、工程（ａ）の生成物を接触させ； （ｃ）工程（ｂ）の生成物でＣｒｅ＋グラム陰性菌株を感染させ；及び （ｄ）クローニングされたベクターＤＮＡを回収する、 を含む、９５ｋｂほどの大きいＤＮＡ断片をクローニングする方法。 ３８．Ｃｒｅ＋菌株がＢＳ５９１という呼称の細菌株である、請求の範囲第３２ 項に記載の方法。 ３９．ｐａｃ−開裂堪能抽出物及び頭−尾堪能抽出物と断片含有ベクターのＤＮ Ａを接触させる段階を含む、中に挿入された外因性ＤＮＡ断片をもつ請求の範囲 第１１項、１２項又は１３項のベクターのＤＮＡの生体外Ｐｌバクテリオファー ジパッケージングのための方法において、この断片は９５ｋｂ以下のサイズを有 する方法。 ４０．前記ｐａｃ−開裂堪能抽出物がＮＳ２９６２又はＮＳ３２０８という呼称 の細菌株から調製される、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４１．頭−尾堪能抽出物がＮＳ２９６１又はＮＳ３２１０という呼称の細菌株か ら調製される、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４２（ａ）請求の範囲第１４項又は第１５項のベクター内に外因性ＤＮＡ断片を 挿入し； （ｂ）工程（ａ）の生成物をｐａｃ−開裂堪能抽出物及び頭−尾堪能抽出物と接 触させ； （ｃ）工程（ｂ）の生成物ｌａｃＩｑｑ抑制因子を有するＣｒｅ＋グラム陰性菌 株を感染させる； （ｄ）工程（ｃ）の生成物にＩＰＴＧを付加することにより、ｌａｃＩｑ抑制因 子を抑制解除し；及び（ｅ）クローニングされ増幅されたＤＮＡを回収する、 を含む、ＤＮＡ断片のクローニング及び増幅制御方法。 ４３．Ｃｒｅ＋細菌株がＮＳ２９７４又はＮＳ３１４５という呼称の菌株である 、請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４４．ｐａｃ−開裂堪能抽出物がＮＳ２９６２又はＮＳ３２０８という呼称の細 菌株から調製される、請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４５．頭−尾堪能抽出物がＮＳ２９６１又はＮＳ３２１０という呼称の細菌株か ら調製される、請求の範囲第４２項に記載の方法。