JPH03103193A - ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 - Google Patents
ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用Info
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- JPH03103193A JPH03103193A JP2049140A JP4914090A JPH03103193A JP H03103193 A JPH03103193 A JP H03103193A JP 2049140 A JP2049140 A JP 2049140A JP 4914090 A JP4914090 A JP 4914090A JP H03103193 A JPH03103193 A JP H03103193A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
ホスフィノトリシン（ＰＴＣ，２−アミノー４一メチル
ホスフィノ醋酸）はグルタミンシンテターゼの阻害剤で
ある。ＰＴＣは抗生物質ホスフィノトリシルーアラニル
ーアラニンの“構造単位”である。このトリペプチド（
ＰＴＴ）は、ダラム陽性及びダラム陰性細菌に対し並び
に真菌ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｌ
ｎｅｒｅａ）に対して活性である〔バイエルら、ヘルベ
チカ・キミカ◆アクタ、第５５巻、１９７２年、第２２
４頁（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．．Ｉｌｅｌｖｅｔ１ｃ
ａ Ｃｌ１ｉｍｌｃａ Ａｃｔａ ５５（１９７２）２
２４））。ＰＴＴはストレプトミセス・ビリドクロモゲ
ネス（ＳｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ ｖｉｒｌｄｏｃ
ｈｒｏｎ＋ｏｇｅ−ｎｅｓ）Ｔ ｕ ４ ９ ４株（Ｄ
ＳＭ４０７３６、ＤＳＭ４１１２ （両寄託番号は同一
の微生物に係わるものであって、後者はブタペスト条約
上の寄託である））から産生される。
ホスフィノ醋酸）はグルタミンシンテターゼの阻害剤で
ある。ＰＴＣは抗生物質ホスフィノトリシルーアラニル
ーアラニンの“構造単位”である。このトリペプチド（
ＰＴＴ）は、ダラム陽性及びダラム陰性細菌に対し並び
に真菌ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｌ
ｎｅｒｅａ）に対して活性である〔バイエルら、ヘルベ
チカ・キミカ◆アクタ、第５５巻、１９７２年、第２２
４頁（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．．Ｉｌｅｌｖｅｔ１ｃ
ａ Ｃｌ１ｉｍｌｃａ Ａｃｔａ ５５（１９７２）２
２４））。ＰＴＴはストレプトミセス・ビリドクロモゲ
ネス（ＳｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ ｖｉｒｌｄｏｃ
ｈｒｏｎ＋ｏｇｅ−ｎｅｓ）Ｔ ｕ ４ ９ ４株（Ｄ
ＳＭ４０７３６、ＤＳＭ４１１２ （両寄託番号は同一
の微生物に係わるものであって、後者はブタペスト条約
上の寄託である））から産生される。
西独特許第２，７１７，４４０号明細書は、ＰＴＣが総
合的除草剤として作用することを開示している。公開Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ第８６／０２０９７号明細書は、ＰＴＣに
対する耐性がグルタミンシンテターゼの過剰産生に起因
する植物について開示する。このタイプの過剰産生、例
えば遺伝子増幅に基づくもの、は不安定性というリスク
を伴う。かかる不安定性はグルタミンシンテターゼ過剰
産生の低下と関係するものであり、ＰＴＣの競合的阻害
作用が再度発現することになるであろう。
合的除草剤として作用することを開示している。公開Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ第８６／０２０９７号明細書は、ＰＴＣに
対する耐性がグルタミンシンテターゼの過剰産生に起因
する植物について開示する。このタイプの過剰産生、例
えば遺伝子増幅に基づくもの、は不安定性というリスク
を伴う。かかる不安定性はグルタミンシンテターゼ過剰
産生の低下と関係するものであり、ＰＴＣの競合的阻害
作用が再度発現することになるであろう。
これに対し、特許請求の範囲で規定される本発明は、Ｐ
ＴＣ耐性遺伝子のラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ−アセ
チル化のためのその使用に関する。
ＴＣ耐性遺伝子のラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ−アセ
チル化のためのその使用に関する。
なお、この遺伝子はＰＴＣ耐性植物製造にも、また耐性
マーカーとしても、使用することができるので、以下に
おいてはこれらの点についても述べるものとする。
マーカーとしても、使用することができるので、以下に
おいてはこれらの点についても述べるものとする。
本発明のＰＴＣ耐性遺伝子は、ＰＴＴ耐性に関して選択
されたストレブトミセス・ビリドクロモゲネスＤＳＭ４
１１２由来全ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、大きさ４．
０ｋｂの断片をクローニングし、更にＰＴＴ耐性につい
て選別することにより得ることができる。制限地図（第
１図）はこの４．０ｋｂ断片の特徴を詳しく表わしてい
る。
されたストレブトミセス・ビリドクロモゲネスＤＳＭ４
１１２由来全ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、大きさ４．
０ｋｂの断片をクローニングし、更にＰＴＴ耐性につい
て選別することにより得ることができる。制限地図（第
１図）はこの４．０ｋｂ断片の特徴を詳しく表わしてい
る。
この４ｋｂ断片部分のクローニング実験は、コード領域
部位を更に正確に局在化させるために行なわれた。これ
によって、耐性遺伝子は１．６ｋｂＳｓ ｔＵ−Ｓｓ
ｔ ！断片（第１図において０．５５〜２．１５位）上
に位置することが明らかになった。Ｂｇｌｎで消化した
場合に断片が得られたが、この断片は大きさが０．８ｋ
ｂであって、ブラスミドに組込みかつストレブトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｃｐｔｏａｙｃｅｓ ｌｌｖｌｄ
ａｎｓ）を形質転換させた後にはＰＴＴ耐性を与える。
部位を更に正確に局在化させるために行なわれた。これ
によって、耐性遺伝子は１．６ｋｂＳｓ ｔＵ−Ｓｓ
ｔ ！断片（第１図において０．５５〜２．１５位）上
に位置することが明らかになった。Ｂｇｌｎで消化した
場合に断片が得られたが、この断片は大きさが０．８ｋ
ｂであって、ブラスミドに組込みかつストレブトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｃｐｔｏａｙｃｅｓ ｌｌｖｌｄ
ａｎｓ）を形質転換させた後にはＰＴＴ耐性を与える。
この耐性はＰＴＣのＮ−アセチル化により生じる。
０．８ｋｂ断片のマキサム（ＭａｘａＩＩｌ）及びギル
バート（Ｇｌ ｌｂｅｒｔ）配列決定により、ＤＮＡ配
列Ｉ（後記）が決定される。耐性遺伝子の位置は、この
配列の開放読取り枠から決定することができる（２５８
位以後）。遺伝子の末端は掲示された中で端から２番目
のヌクレオチド（８０６位）に位置しており、即ち最後
のヌクレオチド（８０７位）が停止コードンの最初のヌ
クレオチドとなっている。
バート（Ｇｌ ｌｂｅｒｔ）配列決定により、ＤＮＡ配
列Ｉ（後記）が決定される。耐性遺伝子の位置は、この
配列の開放読取り枠から決定することができる（２５８
位以後）。遺伝子の末端は掲示された中で端から２番目
のヌクレオチド（８０６位）に位置しており、即ち最後
のヌクレオチド（８０７位）が停止コードンの最初のヌ
クレオチドとなっている。
ＤＮＡ配列■におけるシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎ
ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列は、開始コードンとして機
能するＧＴＧと同様に、下線によって強調されている。
ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列は、開始コードンとして機
能するＧＴＧと同様に、下線によって強調されている。
したがって、最初の下線部分が究極的な読取り枠を表わ
す。
す。
ＤＮＡ配列■は、配列決定された遺伝子中の制限部位を
示す。７回以上配列を切断する酵素は示されていない。
示す。７回以上配列を切断する酵素は示されていない。
抗生物質ＰＴＴは細菌によって取込まれ、ＰＴＣに分解
される。後者もまた細菌中のグルタミンシンテターゼを
阻害することから、細菌はグルタミン欠乏により死滅す
る。しｔこがって、ＰＴＴ産生細菌はＰＴＴの作用から
自らを保護するメカニズム、即ち産生されたＰＴＴの再
取込みを妨げるか又は分解産物ＰＴＣを変化させるよう
なメカニズム、を有していなければならない。しかしな
がら、驚くべきことに、ＰＴＴ産生株Ｓ．ビリドク口モ
ゲネスＤＳＭ４１１２は、その自らの抗生物質に対して
感受性を有している。ところが予想に反し、ＰＴＴ耐性
について選択することにより、ＰＴＴに耐性でありかつ
隣接コロニーのバックグラウンド増殖を抑制する選択株
を１０−５の驚異的高率で発現させることが可能であっ
た。
される。後者もまた細菌中のグルタミンシンテターゼを
阻害することから、細菌はグルタミン欠乏により死滅す
る。しｔこがって、ＰＴＴ産生細菌はＰＴＴの作用から
自らを保護するメカニズム、即ち産生されたＰＴＴの再
取込みを妨げるか又は分解産物ＰＴＣを変化させるよう
なメカニズム、を有していなければならない。しかしな
がら、驚くべきことに、ＰＴＴ産生株Ｓ．ビリドク口モ
ゲネスＤＳＭ４１１２は、その自らの抗生物質に対して
感受性を有している。ところが予想に反し、ＰＴＴ耐性
について選択することにより、ＰＴＴに耐性でありかつ
隣接コロニーのバックグラウンド増殖を抑制する選択株
を１０−５の驚異的高率で発現させることが可能であっ
た。
遺伝子バンクは、ＤＮＡを単離し、それをＢａｍＨＩで
切断し、かつそれをストレプトミセテスベクターと連結
することにより、これらの選択株のＤＮＡから製造され
た。連結混合産物で市販Ｓ，リビダンスＴＫ２３株を形
質転換して、連結混合産物１μｇ当たり約１〜５ｋｂの
挿入物を有する約５０００〜１００００個の形質転換株
が得られた。形質転換株中にＰＴＴ耐性Ｓ，リビダンス
株が存在していた。ブラスミドの単離及びＳ．リビダン
スの再形質転換によって、耐性がプラスミドにコードさ
れていることを証明することが可能であった。耐性をに
なう遺伝子は４ｋｂＢａｍＨＩ断片上に位置している（
第１図）。コード領域は０．８ｋｂＢｇｌＩＩ断片上に
位置する。
切断し、かつそれをストレプトミセテスベクターと連結
することにより、これらの選択株のＤＮＡから製造され
た。連結混合産物で市販Ｓ，リビダンスＴＫ２３株を形
質転換して、連結混合産物１μｇ当たり約１〜５ｋｂの
挿入物を有する約５０００〜１００００個の形質転換株
が得られた。形質転換株中にＰＴＴ耐性Ｓ，リビダンス
株が存在していた。ブラスミドの単離及びＳ．リビダン
スの再形質転換によって、耐性がプラスミドにコードさ
れていることを証明することが可能であった。耐性をに
なう遺伝子は４ｋｂＢａｍＨＩ断片上に位置している（
第１図）。コード領域は０．８ｋｂＢｇｌＩＩ断片上に
位置する。
ＢａｍＨＩ断片は酵素Ｃｌａｌ、ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲ
ＶＳＨｉｎｄｍ、Ｈｐａ Ｌ Ｋｐｎ ＩｓＰｖｕ Ｌ
ＰｖｕＩ［及びＸｈｏｌの切断部位を有していない。
ＶＳＨｉｎｄｍ、Ｈｐａ Ｌ Ｋｐｎ ＩｓＰｖｕ Ｌ
ＰｖｕＩ［及びＸｈｏｌの切断部位を有していない。
ストレブトミセス・ヒグロスコビクス（９ｔｒｅｐ−ｔ
ｏｍｙｃｃｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｌｃｕｓ）Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｂ Ｐ − １ ３ ０．／ＡＴＣＣ２１７０
５ （欧州特許出願公開第０．１７３，３２７号、第７
図）に関する、まだ詳細には特徴づけられていない耐性
遺伝子の制限地図との比較により、本発明の耐性遺伝子
はＰＴＴ生合成遺伝子に関する研究中に見出された公知
遺伝子と異なることが示される。
ｏｍｙｃｃｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｌｃｕｓ）Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｂ Ｐ − １ ３ ０．／ＡＴＣＣ２１７０
５ （欧州特許出願公開第０．１７３，３２７号、第７
図）に関する、まだ詳細には特徴づけられていない耐性
遺伝子の制限地図との比較により、本発明の耐性遺伝子
はＰＴＴ生合成遺伝子に関する研究中に見出された公知
遺伝子と異なることが示される。
一方ではＳ．ビリドク口モゲネスＤＳＭ４１１２及びＳ
．リビダンスＴＫ２３の細胞抽出物と、他方ではＰＴＴ
耐性Ｓ．ビリドクロモゲネス選択株及びプラスミド担持
Ｓ，リビダンス形質転換株と、ＰＴＣ及びアセチルＣｏ
Ａとのインキュベーションにより、後者の細胞がアセチ
ル化活性を有することを明らかにすることができた。ク
ロマトグラフィー試験は、アセチル化がアミノ基で生じ
ることを示している。
．リビダンスＴＫ２３の細胞抽出物と、他方ではＰＴＴ
耐性Ｓ．ビリドクロモゲネス選択株及びプラスミド担持
Ｓ，リビダンス形質転換株と、ＰＴＣ及びアセチルＣｏ
Ａとのインキュベーションにより、後者の細胞がアセチ
ル化活性を有することを明らかにすることができた。ク
ロマトグラフィー試験は、アセチル化がアミノ基で生じ
ることを示している。
ＰＴＴ耐性が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ１ｃｈｌａ ｃｏｌ
ｔ）でもみられ、よって耐性メカニズムがダラム陰性菌
でも機能していることから、輸送現象に基づく耐性を除
去することができる。したがって、植物プロモーターに
結合させた後適当なベクターを用いて、本発明の耐性遺
伝子を植物に組込んで形質転換させることができ、もっ
てこの方法によりＰＴＣ耐性植物を製造することができ
る。
ｔ）でもみられ、よって耐性メカニズムがダラム陰性菌
でも機能していることから、輸送現象に基づく耐性を除
去することができる。したがって、植物プロモーターに
結合させた後適当なベクターを用いて、本発明の耐性遺
伝子を植物に組込んで形質転換させることができ、もっ
てこの方法によりＰＴＣ耐性植物を製造することができ
る。
ＰＴＣのＮ−アセチル化は、Ｌ型のみの選択的アセチル
化が生じることから、合成Ｄ， ＬＰＴＣのラセミ分
割のためにも利用することができる。
化が生じることから、合成Ｄ， ＬＰＴＣのラセミ分
割のためにも利用することができる。
このように、本発明は、ラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ
−アセチル化のための耐性遺伝子の使用にも関する。
−アセチル化のための耐性遺伝子の使用にも関する。
本発明の耐性遺伝子によりコードされたＰＴＣアセチル
トランスフェラーゼは、Ｌ型のみを選択的に攻撃し、Ｄ
型は未変化のままであることから、例えば西独特許第２
，７１７，４４０号明細書の方法から得られるように、
ラセミ体をこの酵素のアセチル化作用に供することによ
り、ラセミＰＴＣを光学対掌体に分割するために使用す
ることができる。かくして得られる混合物は次いで、性
質の違いに基づき自体公知の方法で分割される。
トランスフェラーゼは、Ｌ型のみを選択的に攻撃し、Ｄ
型は未変化のままであることから、例えば西独特許第２
，７１７，４４０号明細書の方法から得られるように、
ラセミ体をこの酵素のアセチル化作用に供することによ
り、ラセミＰＴＣを光学対掌体に分割するために使用す
ることができる。かくして得られる混合物は次いで、性
質の違いに基づき自体公知の方法で分割される。
Ｎ−アシルーＤ，Ｌ−アミノ酸をアシラーゼ（担体に固
定しておいてもよい）と接触させてＬ一アミノ酸を選択
的に遊離させ、次いで酸性化後にＮ−アシルーＤ−アミ
ノ酸含有混合物からこのＬ−アミノ酸を水不溶性溶媒で
抽出することが、開示されている（英国特許第１，３６
９，４６２号明細書）。Ｎ−アシルーＤ，Ｌ−ＰＴＣの
同様の分画は、例えば西独公開第２，９３９，２６９号
又は米国特許第４．２２６．９４１号明細書に開示され
ている。
定しておいてもよい）と接触させてＬ一アミノ酸を選択
的に遊離させ、次いで酸性化後にＮ−アシルーＤ−アミ
ノ酸含有混合物からこのＬ−アミノ酸を水不溶性溶媒で
抽出することが、開示されている（英国特許第１，３６
９，４６２号明細書）。Ｎ−アシルーＤ，Ｌ−ＰＴＣの
同様の分画は、例えば西独公開第２，９３９，２６９号
又は米国特許第４．２２６．９４１号明細書に開示され
ている。
本発明では残存するＤ−ＰＴＣは公知の方法（欧州特許
出願公開第（ＥＰ−Ａ）０，１３７，３７１号、実施例
８）でラセミ化され、次いで元のプロセスに戻される。
出願公開第（ＥＰ−Ａ）０，１３７，３７１号、実施例
８）でラセミ化され、次いで元のプロセスに戻される。
必ずしも必要ではないが、酵素を単離することは可能て
あり、ここで酵素とは本文及び以下において常に酵素的
に活性な部分をも意味しているつもりである。酵素が単
離される場合、これは遊離型として又は担体に固定され
て使用することができる。適当な担体の例はＥＰ−Ａ第
０． １４１，２２３号明細書に記載されている。し
かしながら、酵素を単離するのではなく、本発明の酵素
を発現するいずれかの望ましいＰ Ｔ Ｃ ｉＪ性細胞
を用いることが得策である。したがってＳ．ビリドクロ
モゲネスＤＳＭ４１１２のＰＴＴ耐性選択株を用いるこ
とが、可能かつ得策である。更には、本発明の遺伝子で
形質転換されかつＰＴＣアセチルトランスフエラーゼを
発現しつるいずれかの望ましい細胞を用いることが、可
能かつ有利である。このような関係から、本発明の遺伝
子は、これもその活性部分を意味するつもりであるが、
ブラスミドに組込まれた形で又はトランスフェクション
（ ｔ ｒａｎｓ Ｉ’ｅｃｔ ｔｏｎ）のような他の
慣用的遺伝子操作法により宿主細胞中に導入することが
できる。例えばＥＰ−Ａ第０．１６３，２４９号及び第
０．１７１，０２４号明細書の公知の方法による、例え
ば大腸菌発現ブラスミドへの組込み及びかかるブラスミ
ドによる大腸菌の形質転換が得策である。
あり、ここで酵素とは本文及び以下において常に酵素的
に活性な部分をも意味しているつもりである。酵素が単
離される場合、これは遊離型として又は担体に固定され
て使用することができる。適当な担体の例はＥＰ−Ａ第
０． １４１，２２３号明細書に記載されている。し
かしながら、酵素を単離するのではなく、本発明の酵素
を発現するいずれかの望ましいＰ Ｔ Ｃ ｉＪ性細胞
を用いることが得策である。したがってＳ．ビリドクロ
モゲネスＤＳＭ４１１２のＰＴＴ耐性選択株を用いるこ
とが、可能かつ得策である。更には、本発明の遺伝子で
形質転換されかつＰＴＣアセチルトランスフエラーゼを
発現しつるいずれかの望ましい細胞を用いることが、可
能かつ有利である。このような関係から、本発明の遺伝
子は、これもその活性部分を意味するつもりであるが、
ブラスミドに組込まれた形で又はトランスフェクション
（ ｔ ｒａｎｓ Ｉ’ｅｃｔ ｔｏｎ）のような他の
慣用的遺伝子操作法により宿主細胞中に導入することが
できる。例えばＥＰ−Ａ第０．１６３，２４９号及び第
０．１７１，０２４号明細書の公知の方法による、例え
ば大腸菌発現ブラスミドへの組込み及びかかるブラスミ
ドによる大腸菌の形質転換が得策である。
ラセミ体中のＬ − ＰＴＣの本発明によるＮ−アセチ
ル化の場合、ＰＴＣアセチルトランスフエラーゼを発現
する細胞は遊離又は固定された形で使用することができ
るが、固定化としては慣用的方法が適用される（例えば
西独公開第３，２３７，３４１号明細書及びそこで引用
された文献）。
ル化の場合、ＰＴＣアセチルトランスフエラーゼを発現
する細胞は遊離又は固定された形で使用することができ
るが、固定化としては慣用的方法が適用される（例えば
西独公開第３，２３７，３４１号明細書及びそこで引用
された文献）。
Ｌ−ＰＴＣの本発明による酵素的アセチル化は、酵素反
応に関して慣用的な方法により行なわれるが、その方法
の条件は使用される生物の特徴によって定められる。原
則として、これに適した方法は上記選択的脱アシル化方
法と同様である。
応に関して慣用的な方法により行なわれるが、その方法
の条件は使用される生物の特徴によって定められる。原
則として、これに適した方法は上記選択的脱アシル化方
法と同様である。
本発明は下記例によって詳細に説明されている。
他に言及のない限り、及び百分率は重量基準である。
例１：ＰＴＴ耐性選択株
Ｓ．ビリドク口モゲネスＤＳＭ４１１２株を最少培地〔
ホップウッドら、ストレプトミセスの遺伝子操作、実験
マニュアル、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション、
ノーリツジ、イングランド、１９８５年、２３３頁（Ｉ
ｌｏｐｖｏｏｄ ｅｔ ａｌ．．ＧｅｎｅｔｌｃＭａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ’ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｔｈｅ
Ｊｏｈｎ ｌｎｎｅｓ Ｐｏｕｎｄａｔｌｏｎ．Ｎｏｒ
ｗｉｃｈ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５），ｐａｇｅ２３
３））で培養し、ＰＴＴａ度を増加させながら加えた。
ホップウッドら、ストレプトミセスの遺伝子操作、実験
マニュアル、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション、
ノーリツジ、イングランド、１９８５年、２３３頁（Ｉ
ｌｏｐｖｏｏｄ ｅｔ ａｌ．．ＧｅｎｅｔｌｃＭａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ’ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｔｈｅ
Ｊｏｈｎ ｌｎｎｅｓ Ｐｏｕｎｄａｔｌｏｎ．Ｎｏｒ
ｗｉｃｈ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５），ｐａｇｅ２３
３））で培養し、ＰＴＴａ度を増加させながら加えた。
濃度１００μｇ／ｍｌで、約１０５のコロニーにつき１
つの耐性コロニーが見出された。
つの耐性コロニーが見出された。
例２：ベクターの調製
プラスミドｐｓＶＨ１ （欧州特許第０．０７０．５２
２号明細書、米国特許第４，６７３，６４２号明細書）
をＢｇｌｎで切断し、大きさ約７．１ｋｂの断片を分離
し、チオストレブトン耐性の１．１ｋｂＢｃｌｌ断片と
連結させる（欧州特許出願公開第０．１５８，２０１号
）。大きさが約８．１５ｋｂのプラスミドｐＥ８２が得
られる（第２図）。
２号明細書、米国特許第４，６７３，６４２号明細書）
をＢｇｌｎで切断し、大きさ約７．１ｋｂの断片を分離
し、チオストレブトン耐性の１．１ｋｂＢｃｌｌ断片と
連結させる（欧州特許出願公開第０．１５８，２０１号
）。大きさが約８．１５ｋｂのプラスミドｐＥ８２が得
られる（第２図）。
例３：耐性遺伝子の分離
全ＤＮＡを例１の選択株から分離し、これをＢａｍＨＩ
で切断する。ブラスミドｐＥＢ２をＢａｍＨＩで同様に
開環し、２つの混合物を合わせ、連結させる。連結混合
産物でＳ．リビダンスＴＫ２３ （ジョン◆インズ・フ
ァンデーションから人手可能）を形質転換すると、約１
〜５ｋｂの挿入物を有する５０００〜１００００個の形
質転換株が連結混合産物１μｇ当たりから得られる。
で切断する。ブラスミドｐＥＢ２をＢａｍＨＩで同様に
開環し、２つの混合物を合わせ、連結させる。連結混合
産物でＳ．リビダンスＴＫ２３ （ジョン◆インズ・フ
ァンデーションから人手可能）を形質転換すると、約１
〜５ｋｂの挿入物を有する５０００〜１００００個の形
質転換株が連結混合産物１μｇ当たりから得られる。
ＰＴＴ耐性について選別により２つの耐性Ｓ．リビダン
スコロニーが得られる。取込まれたプラスミドを後者か
ら分離し、ＢａｍＨＩで切断する。
スコロニーが得られる。取込まれたプラスミドを後者か
ら分離し、ＢａｍＨＩで切断する。
耐性の要因となる遺伝子を含む４ｋｂＢａｍＨＩ断片が
見出される。このブラスミドをｐＰＲ１（第３図）と命
名した。
見出される。このブラスミドをｐＰＲ１（第３図）と命
名した。
Ｓ．リビダンスＴＫ２３の再形質転換により形質転換株
はＰＴＴＩＯＯμｇ／ｍｌ含有最少培地で増殖すること
から、ＰＴＴ耐性がプラスミドにコードされている二と
が示される。
はＰＴＴＩＯＯμｇ／ｍｌ含有最少培地で増殖すること
から、ＰＴＴ耐性がプラスミドにコードされている二と
が示される。
例４：Ｎ−アセチル化によるＰＴＣ不活性化の証明
クローニングした断片のアセチル化活性を証明するため
に、下記株を試験した：Ｓ．ビリドクロモゲネスＤＳＭ
４１１２、Ｓ， ビリドクロモゲネス（ＰＴＴ耐性変
異株）、Ｓ．リビダンスＴＫ２３及びＳ．リビダンスＴ
Ｋ２Ｂ （ｐＰＲ１）。
に、下記株を試験した：Ｓ．ビリドクロモゲネスＤＳＭ
４１１２、Ｓ， ビリドクロモゲネス（ＰＴＴ耐性変
異株）、Ｓ．リビダンスＴＫ２３及びＳ．リビダンスＴ
Ｋ２Ｂ （ｐＰＲ１）。
そのためには、株を溶菌培地Ａ（欧州特許出願公開第０
．１５８，８７２号、第６頁）に接種し、かつオービタ
ルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）中３０
℃で２日間インキユベーションすることが必要である。
．１５８，８７２号、第６頁）に接種し、かつオービタ
ルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）中３０
℃で２日間インキユベーションすることが必要である。
回収後、菌糸体１■を適当な緩衝液〔例えばＲＳ緩衝液
：シー・ジエイ・トムソンら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー、第１５１巻、１９８２年、第６７８−６
８５頁（Ｃ．Ｊ．Ｔｈｏ−ｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１５１（１９８２），６７８−６８５） ）中超音波
で破壊する。ＰＴＣ分解を測定するための典型的丈験操
作法は下記のとおりである。
：シー・ジエイ・トムソンら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー、第１５１巻、１９８２年、第６７８−６
８５頁（Ｃ．Ｊ．Ｔｈｏ−ｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１５１（１９８２），６７８−６８５） ）中超音波
で破壊する。ＰＴＣ分解を測定するための典型的丈験操
作法は下記のとおりである。
ＰＴＣ （２５０μｇ／ｍｌ）溶液１００μｌ及びアセ
チルＣ ｏ Ａ （４ｍｇ／ｍｌ） ５ ０ ｕ １を
粗抽出物２５０μｌに加え、混合物を３０℃で２時間イ
ンキユベーションする。その時点でもなお存在するＰＴ
Ｃ量をＨＰＬＣで測定する。この結果は以下のとおりで
ある。
チルＣ ｏ Ａ （４ｍｇ／ｍｌ） ５ ０ ｕ １を
粗抽出物２５０μｌに加え、混合物を３０℃で２時間イ
ンキユベーションする。その時点でもなお存在するＰＴ
Ｃ量をＨＰＬＣで測定する。この結果は以下のとおりで
ある。
薄層クロマトグラフイーによる参照物質（ニンヒドリン
で染色されない）との比較は、ＰＴＣのＮ−アセチル化
が生じたことを示すものである。
で染色されない）との比較は、ＰＴＣのＮ−アセチル化
が生じたことを示すものである。
Ｓ．リビダンスＴＫ２３
Ｓ．ビリドク口モゲネス
（ＤＳＭ４１１２）
Ｓ，ビリドク口モゲネス
選択株（例１による）
Ｓ，リビダンスＴＫ２３
（ｐＰＲ１）
１００％
７２％
７％
３１％
ｒＩＪ′ｉＩ４！Ｊごの淳書（内容に
第１図は、本発明に係る
限地図である。
第２図は、プラスミドｐ
ＰＴＣ耐性遺伝子の制
ＥＢ２の制限地図であ
る。
第３図は、プラスミドｐＰＲ１の制限地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ホスフィノトリシル−アラニル−アラニン（ＰＴＴ
）に耐性のストレプトミセス・ピリドクロモゲネスＤＳ
Ｍ４１１２を選別し、耐性株由来全ＤＮＡをＢａｍＨＩ
で切断し、大きさ４．０ｋｂ断片をクローニングし、更
にＰＴＴ耐性について選別することにより得ることがで
きるホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性遺伝子、を発現
する細胞又はこの遺伝子でコードされた酵素をラセミＰ
ＴＣと接触させることからなる、ラセミＰＴＣのＬ型の
選択的Ｎ−アセチル化法。 ２、第１図に示された制限地図を有する遺伝子を発現す
る細胞又はこの遺伝子でコードされた酵素をラセミＰＴ
Ｃと接触させることからなる、特許請求の範囲第１項記
載のラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ−アセチル化法。 ３、後記のＤＮＡ配列Ｉの２５８−８０６位を有する遺
伝子を発現する細胞又はこの遺伝子でコードされた酵素
をラセミＰＴＣと接触させることからなる、特許請求の
範囲第１項記載のラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ−アセ
チル化法。
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863628747 DE3628747A1 (de) | 1986-08-23 | 1986-08-23 | Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung |
| DE3628747.4 | 1986-08-23 | ||
| DE3637307 | 1986-11-03 | ||
| DE19863642829 DE3642829A1 (de) | 1986-08-23 | 1986-12-16 | Resistenzgen gegen phosphinothricin |
| DE3642829.9 | 1986-12-16 | ||
| DE3700313.5 | 1987-01-08 | ||
| DE19873700313 DE3700313A1 (de) | 1986-08-23 | 1987-01-08 | Verwendung eines resistenzgens gegen phosphinothricin |
| DE3637307.7 | 1987-01-08 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62209123A Division JPH0797994B2 (ja) | 1986-08-23 | 1987-08-22 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03103193A true JPH03103193A (ja) | 1991-04-30 |
| JP2749424B2 JP2749424B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=27433686
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62209123A Expired - Lifetime JPH0797994B2 (ja) | 1986-08-23 | 1987-08-22 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 |
| JP2049140A Expired - Lifetime JP2749424B2 (ja) | 1986-08-23 | 1990-02-28 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 |
| JP6249627A Pending JPH07147985A (ja) | 1986-08-23 | 1994-10-14 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 |
| JP8268910A Expired - Lifetime JP2815847B2 (ja) | 1986-08-23 | 1996-10-09 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62209123A Expired - Lifetime JPH0797994B2 (ja) | 1986-08-23 | 1987-08-22 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6249627A Pending JPH07147985A (ja) | 1986-08-23 | 1994-10-14 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 |
| JP8268910A Expired - Lifetime JP2815847B2 (ja) | 1986-08-23 | 1996-10-09 | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0257542B1 (ja) |
| JP (4) | JPH0797994B2 (ja) |
| CN (2) | CN1040772C (ja) |
| AT (1) | ATE75776T1 (ja) |
| AU (1) | AU604743B2 (ja) |
| CA (1) | CA1337597C (ja) |
| DK (1) | DK175254B1 (ja) |
| ES (1) | ES2038631T3 (ja) |
| FI (1) | FI100251B (ja) |
| GR (1) | GR3005200T3 (ja) |
| HU (1) | HU217208B (ja) |
| IL (1) | IL83604A (ja) |
| NZ (1) | NZ221526A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009531188A (ja) * | 2006-03-28 | 2009-09-03 | スル チョイ，グァン | 産業用ロボットのケーブル調節装置 |
| US10247328B2 (en) | 2014-04-03 | 2019-04-02 | Igus Gmbh | Guide system for supply lines and robot having a guide system |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3765449D1 (de) * | 1986-03-11 | 1990-11-15 | Plant Genetic Systems Nv | Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen. |
| CN87100603A (zh) * | 1987-01-21 | 1988-08-10 | 昂科公司 | 抗黑素瘤疫苗 |
| DE3716309A1 (de) * | 1987-05-15 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Resistenzgen gegen phosphinothricin |
| DE3732972A1 (de) * | 1987-07-02 | 1989-01-12 | Hoechst Ag | Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung |
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