JP3658323B2 - トレハロースシンターゼ蛋白質、遺伝子、プラスミド、微生物、及びトレハロースの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
［技術分野］
本発明は、トレハロース−産生微生物及びトレハロースの製造方法に関する。本発明は、また、新規のトレハロースシンターゼ蛋白質、トレハロースシンターゼ遺伝子、前記トレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、及び前記組換えプラスミドにより形質転換された微生物に関する。
【０００２】
［背景技術］
トレハロースは、２分子の糖のα−１,１結合からなる非還元性二糖類(α−Ｄ−グルコピラノシルとα−Ｄ−グルコピラノシド)である。これは、医薬、食品、及び化粧品等で広範囲に応用される。しかし、これまでその生産が非効率的であり、しかも高価であるため使用が著しく制限されていた。
【０００３】
日本国特許公開平５−９１８９０号及び特開平６−１４５１８６号は、酵母からトレハロースを抽出する方法を開示している。アルスロバクター(T. Suzuki, Argic. Biol. Chem., 33(2), 1969)、ノカルジア属(日本国特許公開昭５０−１５４４８５号)、小球菌 (日本国特許公開平６−３１９５７８号)、アミノ酸−発酵菌株であるブレビンバクテリウム属(日本国特許公開平５−２１１８８２号)及び酵母(Yoshikawa, etc., Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58, 1225-12300)などの微生物の醗酵培養液からトレハロースを分離するいくつかの方法がある。また、ブドウ糖をトレハロースに転換することができる細菌の遺伝子を含む組換え植物を用いることで、トレハロースを製造する方法が、M. Scher, Food Processing, April, 95〜96, 1993に記載されている。特開昭６３−２１６６９５号(1988年)は、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとを用いてマルトースをトレハロースに転換する方法を開示している。しかし、これらの方法は工程が複雑であり、しかも収率が低いため効果的ではない。
【０００４】
最近、いくつかの酵素工法が公開された。日本国特許公開平７−１４３８７６号及びＥＰ ６２８,６３０ Ａ２は、マルトオルゴシルトレハロースシンターゼとマルトオルゴシルトレハロハイドロラーゼとによって澱粉をトレハロースに転換する２段階の酵素転換工法を開示している。日本国特許公開平７−１７０９７７号及び大韓民国特許公開番号第９５−３４４４号は、トレハロースシンターゼによってマルトースをトレハロースに直接転換する１段階酵素転換工法を開示している。しかし、マルトースからのトレハロースの生産が収率及び費用の面で、より効率化されるためには、トレハロースシンターゼの力価を増加させる必要がなお存在する。
【０００５】
本発明者らはここ数年間、土壌からマルトースをトレハロースに転換する能力を持つ微生物を分離することに多くの努力を重ねてきた。本発明者らはトレハロースを高度に発現し、しかも既に知られた微生物とは異なり、副産物を全く生成しない新規の菌株のスクリーニングに成功した。これは、この形態学的及び生理学的特性上、シュウドモナス・ストゥッツェリー種であることが確認された。該菌株をシュウドモナス・ストゥッツェリー ＣＪ３８と命名した。
【０００６】
本発明者らは、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８の染色体からトレハロースシンターゼの遺伝子を分離し、これを制限酵素であるＳau３ＡＩを用いて公知のベクターｐＵＣｌ１８でクローニングし、該遺伝子のヌクレチオド配列を決定した。これらのヌクレチオド配列は、今まで知られていたトレハロースシンターゼ遺伝子及び全ての蛋白質の配列と明らかに異なるものであることが明らかになった。本発明は、前記トレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを構築して前記遺伝子がコードするトレハロースシンターゼ酵素を大量発現できるようにすることによって完成された。
【０００７】
［発明の開示］
本発明は、マルトースからトレハロースを産生する新規微生物、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８を提供する。該菌株はブダペスト条約のもとに受託番号ＫＣＣＭ１０１５０で、大韓民国ソウル市、韓国微生物保存センターに１９９９年２月１２日付で寄託された。該菌株は、マルトースをトレハロースに転換させるとき、ブドウ糖などの副産物を生成しないので非常に価値が高い。
【０００８】
本発明は、また、以下のアミノ酸配列を持つ新規のトレハロースシンターゼ蛋白質を提供する：
【化７】
【化８】
【化９】
【０００９】
また、本発明は、以下のヌクレチオド配列を持つ新規のトレハロースシンターゼ遺伝子を提供する：
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１０】
本発明は、また、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを提供する。好ましい実施の態様において、本発明は、本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子の４.７kb Ｓau３ＡＩ ＤＮＡ切片がベクタープラスミドｐＵＣ１８にクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１０４を提供する。これは、トレハロースシンターゼ遺伝子の効率的かつ高い発現を可能にする。さらに、好ましい実施の態様において、本発明はトレハロースシンターゼ遺伝子の更に高い発現を可能にする、本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子の２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II ＤＮＡ切片がベクタープラスミドｐＵＣ１８に含まれた組換えプラスミドｐＣＪ１２２を提供する。
【００１１】
本発明は、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組み替えプラスミドに形質転換されたＥ.coliに関するものである。好ましい実施の態様において、本発明は高い水準のトレハロースシンターゼ蛋白質の生産を可能にする、組替えプラスミドｐＣＪ１０４に形質転換されたＥ.coliを提供する。さらに、好ましい実施の態様において、本発明は一層高い水準のトレハロースシンターゼ蛋白質の生産を可能にする組換えプラスミドｐＣＪ１２２により形質転換されたＥ.coliを提供する。
【００１２】
本発明は、前記アミノ酸配列を持つトレハロースシンターゼ蛋白質をマルトース溶液と反応させ、トレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドにより形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞をマルトース溶液と反応させ、トレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。好ましい実施の態様において、本発明はプラスミドｐＣＪ１０４により形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液をマルトース溶液と反応させてトレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。さらに、好ましい実施の態様において、本発明は、プラスミドｐＣＪ１２２に形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液をマルトース溶液と反応させてトレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。
【００１４】
［発明を実施するための最良の態様］
トレハロースシンターゼによってマルトースからトレハロースを産生する微生物を土壌から分離し、シュウドモナス・ストゥッツェリーの形態学的及び生理学的特徴を持つことを確認した。シュウドモナス・ストゥッツェリーはマルトースをトレハロースに転換するものとしてかって報告されたことはなかった。従って、本発明者らによって分離された微生物は新規のシュウドモナス・ストゥッツェリー菌株として認めることができ、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８と命名された。
【００１５】
本発明者らは、種々の制限酵素を用いて本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４の制限酵素地図を作成した。２つのトレハロースシンターゼ遺伝子が知られている(Biochim. Biophys. Acta 1996,1290,1-3, 及びBiochim. Biophys. Acta 1997,1334,28-32)。本発明の制限酵素地図と公知の制限酵素地図とを比較した結果、ｐＣＪ１０４が公知のものと異なるパターンを示すものであることが明らかになった。
【００１６】
公知の微生物からのトレハロースシンターゼ蛋白質は、Ｎ−末端類似性を示す。しかし、本発明のトレハロースシンターゼ蛋白質のＮ−末端配列は、公知のトレハロースシンターゼ蛋白質のものと同一でないことが明らかになった。その結果を以下の表１に示す。
【００１７】
表１.トレハロースシンターゼ酵素のＮ−末端配列
【００１８】
本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４内の４.７kb Ｓau３ＡＩのヌクレチオド配列及びこれから発現されるトレハロースシンターゼ蛋白質のアミノ酸配列を決定した(配列番号１)。
【００１９】
また、本発明のトレハロースシンターゼ蛋白質の完全な配列をBiochim. Biophys. Acta 1996,1290,1-3, 及びBiochim. Biophys. Acta 1997,1334,28-32に記載されたトレハロースシンターゼ蛋白質のものと比較した。比較の結果、それらの間には類似性がないことが確認された。
【００２０】
組換えプラスミドｐＣＪ１０４またはｐＣＪ１２２を含むＥ.coli形質転換体を用いて酵素転換反応を行なった。その結果、本発明の破砕細胞からのトレハロースシンターゼ酵素の力価が、野生シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８から得たものよりさらに高かった。
【００２１】
本発明において使用及び製造されたプラスミド及び微生物の特性及び入手方法を以下の表２に示す。
【００２２】
表２.
【００２３】
栄養培地(０.３％肉汁、０.５％ペプトン、ｐＨ６.８)及びＬＢ培地(１％トリプトン、０.５％酵母エキス、１％ ＮaＣl、pＨ７.０)をシュウドモナス・ストゥッツェリー及びＥ.coli培養にそれぞれ用いた。電気穿孔法によって形質転換された細胞の培養のためにＳＯＣ培地(２％ トリプトン、０.５％酵母エキス、１０mＭ ＮaＣl、２.５mＭ ＫＣＩ、１０mＭ ＭgＣl２、１０mＭ ＭgＳＯ４、２０mＭブドウ糖)を用いた。マッコンキー寒天培地(４％ bacto MacConkey agar base、２.０％ マルトース、pＨ７.０)をトレハロースシンターゼ遺伝子をクローニングするのに用いた。アンピシリンは、５０mg／Lの濃度になるように添加した。電気穿孔法によるＥ.coli形質転換にジーンパルサー(Bio-Rad)を使用した。本発明に用いられた遺伝子操作法は、Molecular cloning,Laboratory Manual,2nd ed., Sambrook, J., E.F. Frisch 及びT. Maniatis 及びGuide to Molecular cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, B erger, S.L., A.R.KimＭeに記載の方法に従って行われた。
【００２４】
酵素反応は、pＨ６.０〜１０.０、 好ましくは７.０〜１０及び４℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃において行なう。マルトースは基質として５０％未満の濃度で用いられる。トレハロースシンターゼ酵素は、精製された形態や破砕細胞として使用することができる。
【００２５】
以下の実施例は本発明を説明するものである。前記説明および以下実施例から、当業者が本発明を完全に実施することができることはいうまでもない。
【００２６】
実施例１
微生物のスクリーニング
土壌から分離された微生物１白金耳を５０mlのＬＢ培養溶液(０.５％酵母エキス、１.０％ bactotrypton、０.５％塩)を含有する５００mlの三角フラスコに接種して２８℃において２日間培養した。培養液を４℃、８,０００rpmにおいて５分間遠心分離した。細胞を集め生理食塩水で洗浄した。洗浄した細胞を１０mlリン酸塩緩衝溶液(１０ml、pＨ７.０)に懸濁させた。細胞を超音波処理器で破砕し、破砕した細胞を４℃、１,２００rpmにおいて２０分間遠心分離して上澄液を粗酵素溶液として用いた。粗酵素溶液中の蛋白質濃度をブレッドフォード法(Bredford Mtehod)によって決定した。１００μgの蛋白質を２０μLの１００mＭマルトース及び１０μLの１００mＭリン酸塩緩衝溶液(pＨ７.０)と混合した。総容量が１００μLになるまでに蒸留水を混合物に加え、反応を３０℃において２０時間進行させた。反応溶液中の糖類をＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＧＣによって分析した。
【００２７】
実施例２
薄層クロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図１)
反応完了後、５μLの反応溶液をキーゼルゲル６０ ＴＬＣ(Merck、ドイツ)上にスポットしてn‐ブタノール−ピリジン−水(７：３：１)の溶液系を含有する容器に入れ、標本を展開させた。メチルアルコール中２０％硫酸溶液を噴霧し、１００℃において１０分間乾燥させた。このようにして標本中の糖類を特定した。少なくとも１,０００個の被験土壌微生物の中から、２個がマルトースをトレハロースに転換する能力を持つものとして確認された。図１は、トレハロースが反応前の標本中には存在しないが、反応完了後には、糖類が標準トレハロース標本の位置から検出されていることを示している。
【００２８】
実施例３
ガスクロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図２)
反応完了後、１０μLの反応溶液を減圧乾燥器によって乾燥させた。乾燥された生成物を２０μLのジメチルホルムアミドに溶解させて得られた溶液を同一容量のビス(トリメチル)トリフルオルアセトアミドと混合してトリメチルシラン誘導体を形成させた。１μLの水滴をＧＣ分析に用いた。図２に示すように、反応溶液のピークが標準トレハロース標本と同一の時に発生することが観察された。
【００２９】
実施例４
高性能液体クロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図３)
反応完了後、反応溶液の１／２を同一容量のフェノールと混合して蛋白質を除去した。このようにして得た標本溶液をＨＰＬＣ分析に用いた。標本のピークが標準トレハロース標本と同一の時間に発生することが観察された。反応溶液の残りの１／２を１００℃において１０分間加熱して酵素活性を死活させた。それを３７℃において１０分間α−１,１−トレハロースに特異的に作用するトレハラーゼ(シグマ)と反応させた。反応完了後、溶液を同一容量のフェノール溶液と混合して蛋白質を除去した。このようにして得た溶液をＨＰＬＣにかけ、その結果、標準トレハロースと同一の時間のピークがなくなった。
【００３０】
実施例５
マルトースをトレハロースに転換する能力を持つ微生物の同定
本発明の土壌微生物を電子顕微鏡で観察しており、鞭毛を持つ杆菌であることを特徴とする。これは、またＯ／Ｆ試験によって好気性であり、グラム−陰性であることを特徴とする。微生物の生理学的特性を表３に要約する。本微生物のこれらの特性をBergy's Mannual of Systemic Bacteriology, 1984 及び特許公報に記載された微生物のものと比較し、生理学的及び形態学的にほぼ同様の、シュウドモナス・ストゥッツェリーに分類した。
【００３１】
表３
【００３２】
実施例６
トレハロースシンターゼ遺伝子のクローニング(図４)
(1)シュウドモナス・ストゥッツェリーからの染色体ＤＮＡの分離
シュウドモナス・ストゥッツェリーを栄養培地で育て、初期静止期において遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞をＴＥ溶液(１０mＭ Tris−HCl、pＨ８.０、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)で２回洗浄した。洗浄した細胞を２０mlのＳＴＥ緩衝液(２０％しょ糖、１０ml Tris、pＨ ８.０、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)に懸濁させて５ mg／mlのリゾチームとＲＮase Ａを懸濁液に添加した。反応を３７℃において２時間行なった。反応完了後、ＳＤＳを濃度が１％になるように添加し、反応を３７℃において３０分間継続した。この溶液を同一容量のフェノールと４時間反応させて遠心分離した。この上澄液に５Ｍ ＮaＣlを濃度が０.１Ｍになるように添加した。ガラス棒を用いて２倍量の無水エタノールを加えて染色体ＤＮＡを得た。染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ溶液に溶かし、以後の実験に用いた。
【００３３】
(2)ゲノムライブラリの製造
シュウドモナス・ストゥッツェリーから分離された純粋染色体ＤＮＡを制限酵素のＳau３ＡＩにより３７℃、１５〜３０分間部分切断した。制限酵素を熱処理して不活性化させ、アガロースゲルで電気泳動して３〜１０kbのＤＮＡ切片を得た。図５に示すように、プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＢamＨＩにより切断し、子牛腸ホスファターゼで処理した。切断されたＤＮＡを既に得た３〜１０kbのＤＮＡ切片と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１５℃において１６時間結合させた。このように得た組換え体を形質転換に用いた。形質転換は以下に記述した電気穿孔法により行なった。Ｅ.coliＮＭ５２２をＬＢ培地で１４〜１５時間培養した。得られた培養物１Ｌ ＬＢ培地に初期吸光度(６００)が０.０７〜０.１になるように接種した後、吸光度が０.８になるまで培養した。細胞を遠心分離して１ＬのＨＥＰＥＳ［Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)ピペラジン-Ｎ-(２-エタンスルホン酸)］緩衝溶液に懸濁した。細胞を再び遠心分離して５００mlの冷滅菌脱イオン蒸留水に懸濁させた。細胞を再び遠心分離して１０％グリセリン溶液２０mlに懸濁させた。細胞を再度遠心分離し、１０％グリセリン溶液２〜３mlに懸濁させ、細胞濃度を２−４×１０10／mlに調整した。細胞縣濁液を急速冷凍させた後、−７０℃で保管した。凍結された細胞は約１ヵ月間形質転換頻度が減少することなく使用することができた。４０μLの凍結細胞縣濁液を氷中で溶かした後、解凍縣濁液を結合したＤＮＡ溶液と混合した。混合物を径０.２cmのパルサーキュベットに入れ、電気容量(capacitance)及び電界強度を２５μＦ及び１２.５kV／cmにそれぞれ固定した。２００〜４００Ωの抵抗において、１回の電気パルスを与えた後、直ちに１mlのＳＯＣ培地を加えて３７℃において１時間培養した。培養物をＬＢ-アンピシリン寒天培地に塗抹して２４時間培養した。アルカリ溶菌方法により純粋ＤＮＡを分離し、それからゲノムライブラリを構築した。
【００３４】
(3)トレハロースシンターゼ遺伝子のクローニング
マルトースを炭素源として用いることができないＥ.coli ＡＴＣ３５４７６を前記から得たゲノムライブラリにより電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換された細胞を２０ g／Lのマルトースを含有したマッコンキー-アンピシリン寒天培地に塗抹した。シュウドモナス・ストゥッツェリーのトレハロースシンターゼ遺伝子がＥ.coliに導入されると、マルトースがＥ.coli内に存在するトレハラーゼによってブドウ糖に転換される。得られたブドウ糖が代謝されるにつれて、pＨが低下するとマッコンキー寒天培地のコロニーの色が黄色から赤色へと変化する。この原理を本クローニングシステムに適用した。ゲノムライブラリで形質転換されたＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７をマッコンキー寒天培地で培養し、赤色を現すコロニーを得た。プラスミドＤＮＡを分離した結果、約４.７kbのＤＮＡ断片を含有していることが判った。このプラスミドをｐＣＪ１０４と名付けた。酵素分析を行なうためにＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７／ｐＵＣ１８(対照)及びＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７／ｐＣＪ１０４及び野生シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８を培養した。Ｅ.coli細胞は、ＬＡ培地で初期静止期まで育てた。シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８は栄養培地で育てた。細胞を遠心分離して破砕した。破砕された細胞を緩衝溶液としてpＨ ８.５〜９.０の２０mＭジエタノールアミン中基質としての２０％マルトースと３５℃温度において反応させた。１.０％トリクロル酢酸を反応溶液に添加した後、遠心分離して高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)でマルトース及びトレハロースを定量分析した。その結果を以下の表４に示す。
【００３５】
表４．酵素力価分析
*U=μmol トレハロース／分
【００３６】
実施例７
トレハロースシンターゼ遺伝子の制限酵素地図製作(図５)
通常の方法でプラスミドｐＣＪ１０４を分離し、種々の制限酵素を用いて制限酵素地図を作成した。
【００３７】
ｐＣＪ１０４ ＤＮＡをＡatII、ＢamＨＩ、Ｂgl II、ＥcoＲＩ、ＥcoＲＶ、ＫpnＩ、ＮcoＩ、ＮdeＩ、ＰstＩ、ＳacＩ、ＳacII、ＳalＩＳphＩ及びＸhoＩなどの約２０の制限酵素を用いて単一、二重、及び三重−切断法を実施した。ＤＮＡ切片をアガロースゲルで電気泳動によって分析し比較して制限地図を作成した。
【００３８】
実施例８
トレハロースシンター遺伝子のサブクローニング及び酵素分析
(1)トレハロースシンターゼ遺伝子のサブクローニング(図６)
プラスミドｐＣＪ１０４の４.７kb中のトレハロースシンターゼ遺伝子の位置を決定するために、サブクローニングを実施した。プラスミドｐＣＪ１０４をＫpnＩで切断して３.３５kb切片を分離した。該切片をベクターｐＵＣ１８／ＫｐｎＩ／ＣＩＰに導入し、Ｅ.coli ＮＭ５２２を得られた組換え体で形質転換した。３.３５kb切片がｐＵＣ１８／ＫpnＩに正方向にクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１２１を構築した。また、プラスミドｐＣＪ１０４を制限酵素ＢamＨＩ及びＢgl IIで二重切断した。このようにして得た２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II切片を精製した後、ベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＣＩＰに連結した後、組換え体でＥ.coli ＮＭ５２２を形質転換した。ｐＵＣ１８／ＢamＨＩに２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II切片が正方向へクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１２２を構築した。最後に、ｐＣＪ１０４を制限酵素ＢamＨＩ及びＥcoＲＩで二重切断し、得られた１.２kbＢamＨＩ‐Ｂgl II切片を精製した。該切片をベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＥcoＲＩ切片を精製した。該断片をベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＥcoＲＩと連結し、Ｅ.coli ＮＭ５２２を組換え体で形質転換した。組換えプラスミドｐＣＪ１２３を製作した。
【００３９】
Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７を構築したプラスミドでそれぞれに形質転換した。形質転換体を、２.０％マルトースを含有したメッコンキー−アンピシリン寒天倍地で培養し、それから形成されたコロニーの色の変化を観察した。プラスミドｐＣＪ１２１及びｐＣＪ１２２を含有したＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７は、赤色のコロニーを形成するが、ｐＣＪ１２３を含有したＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７は、マルトースを分解できず黄色コロニーを形成した。したがって、トレハロースシンターゼ遺伝子が１.２kbのＢamＨＩ−ＥcoＲＩ切片よりは大きい２.５kbのＢamＨＩ−Ｂgl II切片内に位置していることが判った。
【００４０】
(2)サブクローニングされたプラスミドを含有した形質転換体のトレハロースシンターゼの力価分析
形質転換されたＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２１、ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２及びＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２３をＬＢ−Ａｐ倍地で初期静止期まで培養した。遠心分離して細胞を回収して適当な容量の２０mＭジエタノールアミン溶液に懸濁させて超音波処理器で破砕した。破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液を酵素液として使用した。上澄液３５℃においてpＨ８.５−９.０の２０mＭジエタノールアミン含有２０％マルトース溶液と反応させた。１.０％トリクロル酢酸を反応溶液に添加し、遠心分離してＨＰＬＣで分析した。１単位酵素活性は、１分当たり１μmolのトレハロースを生成する酵素の量として定義した。その結果は以下の表５に記載した。
【００４１】
二重力価分析によると、Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２の酵素力価が最も高かった。Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２を５−L発酵槽で以下の表６に記載された条件にて高密度培養を行った。その結果、酵素の比活性はＬＢ倍地で培養した時とほぼ同様の５.０U／mg蛋白質であったが、高密度培養でトレハロースシンターゼ酵素の力価は、２０U／培養液 mlに増加した(表５)。野生シュウドモナス・ストゥッツェリーと比較すると、Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２の酵素の比活性及び培養力価は５０倍及び約１,３００倍に増加した。
【００４２】
表５
【００４３】
表６
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８の超音波処理された液体及びマルトース溶液を含有する反応溶液に対する薄層クロマトグラフィーによる糖類の分析を示している。Ｇ、Ｍ及びＴは、それぞれブドウ糖、マルトース及びトレハロースを示す。
【図２】 シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体及びマルトース溶液を含有する反応溶液(Ａ)及び標準トレハロース標本(Ｂ)に対するガスクロマトグラフィーによる糖類の分析を示している。Ｔreはトレハロースを示す。
【図３】 標準トレハロース標本(Ａ)、並びに標本(Ｂ)及び(Ｃ)に対する高性能液体クロマトグラフィーによる糖類の分析結果示している。標本(Ｂ)はシュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体とマルトース溶液を完全に反応させた直後に得た。標本(Ｃ)はトレハロースを反応完了後、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体とマルトース溶液を含有する反応溶液に添加して取得した。Ｔre,Ｍal及びＧluは、それぞれトレハロース、マルトース及びブドウ糖を示す。
【図４】 本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＪ１０４の構築図である。
【図５】 本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４内の４.７kb Ｓau３Ａｌ切片の制限酵素地図である。
【図６】 本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１２１及びｐＣＪ１２２の構築図である。
［技術分野］
本発明は、トレハロース−産生微生物及びトレハロースの製造方法に関する。本発明は、また、新規のトレハロースシンターゼ蛋白質、トレハロースシンターゼ遺伝子、前記トレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、及び前記組換えプラスミドにより形質転換された微生物に関する。
【０００２】
［背景技術］
トレハロースは、２分子の糖のα−１,１結合からなる非還元性二糖類(α−Ｄ−グルコピラノシルとα−Ｄ−グルコピラノシド)である。これは、医薬、食品、及び化粧品等で広範囲に応用される。しかし、これまでその生産が非効率的であり、しかも高価であるため使用が著しく制限されていた。
【０００３】
日本国特許公開平５−９１８９０号及び特開平６−１４５１８６号は、酵母からトレハロースを抽出する方法を開示している。アルスロバクター(T. Suzuki, Argic. Biol. Chem., 33(2), 1969)、ノカルジア属(日本国特許公開昭５０−１５４４８５号)、小球菌 (日本国特許公開平６−３１９５７８号)、アミノ酸−発酵菌株であるブレビンバクテリウム属(日本国特許公開平５−２１１８８２号)及び酵母(Yoshikawa, etc., Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58, 1225-12300)などの微生物の醗酵培養液からトレハロースを分離するいくつかの方法がある。また、ブドウ糖をトレハロースに転換することができる細菌の遺伝子を含む組換え植物を用いることで、トレハロースを製造する方法が、M. Scher, Food Processing, April, 95〜96, 1993に記載されている。特開昭６３−２１６６９５号(1988年)は、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとを用いてマルトースをトレハロースに転換する方法を開示している。しかし、これらの方法は工程が複雑であり、しかも収率が低いため効果的ではない。
【０００４】
最近、いくつかの酵素工法が公開された。日本国特許公開平７−１４３８７６号及びＥＰ ６２８,６３０ Ａ２は、マルトオルゴシルトレハロースシンターゼとマルトオルゴシルトレハロハイドロラーゼとによって澱粉をトレハロースに転換する２段階の酵素転換工法を開示している。日本国特許公開平７−１７０９７７号及び大韓民国特許公開番号第９５−３４４４号は、トレハロースシンターゼによってマルトースをトレハロースに直接転換する１段階酵素転換工法を開示している。しかし、マルトースからのトレハロースの生産が収率及び費用の面で、より効率化されるためには、トレハロースシンターゼの力価を増加させる必要がなお存在する。
【０００５】
本発明者らはここ数年間、土壌からマルトースをトレハロースに転換する能力を持つ微生物を分離することに多くの努力を重ねてきた。本発明者らはトレハロースを高度に発現し、しかも既に知られた微生物とは異なり、副産物を全く生成しない新規の菌株のスクリーニングに成功した。これは、この形態学的及び生理学的特性上、シュウドモナス・ストゥッツェリー種であることが確認された。該菌株をシュウドモナス・ストゥッツェリー ＣＪ３８と命名した。
【０００６】
本発明者らは、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８の染色体からトレハロースシンターゼの遺伝子を分離し、これを制限酵素であるＳau３ＡＩを用いて公知のベクターｐＵＣｌ１８でクローニングし、該遺伝子のヌクレチオド配列を決定した。これらのヌクレチオド配列は、今まで知られていたトレハロースシンターゼ遺伝子及び全ての蛋白質の配列と明らかに異なるものであることが明らかになった。本発明は、前記トレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを構築して前記遺伝子がコードするトレハロースシンターゼ酵素を大量発現できるようにすることによって完成された。
【０００７】
［発明の開示］
本発明は、マルトースからトレハロースを産生する新規微生物、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８を提供する。該菌株はブダペスト条約のもとに受託番号ＫＣＣＭ１０１５０で、大韓民国ソウル市、韓国微生物保存センターに１９９９年２月１２日付で寄託された。該菌株は、マルトースをトレハロースに転換させるとき、ブドウ糖などの副産物を生成しないので非常に価値が高い。
【０００８】
本発明は、また、以下のアミノ酸配列を持つ新規のトレハロースシンターゼ蛋白質を提供する：
【化７】
また、本発明は、以下のヌクレチオド配列を持つ新規のトレハロースシンターゼ遺伝子を提供する：
【化１０】
本発明は、また、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを提供する。好ましい実施の態様において、本発明は、本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子の４.７kb Ｓau３ＡＩ ＤＮＡ切片がベクタープラスミドｐＵＣ１８にクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１０４を提供する。これは、トレハロースシンターゼ遺伝子の効率的かつ高い発現を可能にする。さらに、好ましい実施の態様において、本発明はトレハロースシンターゼ遺伝子の更に高い発現を可能にする、本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子の２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II ＤＮＡ切片がベクタープラスミドｐＵＣ１８に含まれた組換えプラスミドｐＣＪ１２２を提供する。
【００１１】
本発明は、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組み替えプラスミドに形質転換されたＥ.coliに関するものである。好ましい実施の態様において、本発明は高い水準のトレハロースシンターゼ蛋白質の生産を可能にする、組替えプラスミドｐＣＪ１０４に形質転換されたＥ.coliを提供する。さらに、好ましい実施の態様において、本発明は一層高い水準のトレハロースシンターゼ蛋白質の生産を可能にする組換えプラスミドｐＣＪ１２２により形質転換されたＥ.coliを提供する。
【００１２】
本発明は、前記アミノ酸配列を持つトレハロースシンターゼ蛋白質をマルトース溶液と反応させ、トレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、前記ヌクレチオド配列を持つトレハロースシンターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドにより形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞をマルトース溶液と反応させ、トレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。好ましい実施の態様において、本発明はプラスミドｐＣＪ１０４により形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液をマルトース溶液と反応させてトレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。さらに、好ましい実施の態様において、本発明は、プラスミドｐＣＪ１２２に形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液をマルトース溶液と反応させてトレハロースを得ることを含むトレハロースの製造方法を提供する。
【００１４】
［発明を実施するための最良の態様］
トレハロースシンターゼによってマルトースからトレハロースを産生する微生物を土壌から分離し、シュウドモナス・ストゥッツェリーの形態学的及び生理学的特徴を持つことを確認した。シュウドモナス・ストゥッツェリーはマルトースをトレハロースに転換するものとしてかって報告されたことはなかった。従って、本発明者らによって分離された微生物は新規のシュウドモナス・ストゥッツェリー菌株として認めることができ、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８と命名された。
【００１５】
本発明者らは、種々の制限酵素を用いて本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４の制限酵素地図を作成した。２つのトレハロースシンターゼ遺伝子が知られている(Biochim. Biophys. Acta 1996,1290,1-3, 及びBiochim. Biophys. Acta 1997,1334,28-32)。本発明の制限酵素地図と公知の制限酵素地図とを比較した結果、ｐＣＪ１０４が公知のものと異なるパターンを示すものであることが明らかになった。
【００１６】
公知の微生物からのトレハロースシンターゼ蛋白質は、Ｎ−末端類似性を示す。しかし、本発明のトレハロースシンターゼ蛋白質のＮ−末端配列は、公知のトレハロースシンターゼ蛋白質のものと同一でないことが明らかになった。その結果を以下の表１に示す。
【００１７】
表１.トレハロースシンターゼ酵素のＮ−末端配列
本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４内の４.７kb Ｓau３ＡＩのヌクレチオド配列及びこれから発現されるトレハロースシンターゼ蛋白質のアミノ酸配列を決定した(配列番号１)。
【００１９】
また、本発明のトレハロースシンターゼ蛋白質の完全な配列をBiochim. Biophys. Acta 1996,1290,1-3, 及びBiochim. Biophys. Acta 1997,1334,28-32に記載されたトレハロースシンターゼ蛋白質のものと比較した。比較の結果、それらの間には類似性がないことが確認された。
【００２０】
組換えプラスミドｐＣＪ１０４またはｐＣＪ１２２を含むＥ.coli形質転換体を用いて酵素転換反応を行なった。その結果、本発明の破砕細胞からのトレハロースシンターゼ酵素の力価が、野生シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８から得たものよりさらに高かった。
【００２１】
本発明において使用及び製造されたプラスミド及び微生物の特性及び入手方法を以下の表２に示す。
【００２２】
表２.
栄養培地(０.３％肉汁、０.５％ペプトン、ｐＨ６.８)及びＬＢ培地(１％トリプトン、０.５％酵母エキス、１％ ＮaＣl、pＨ７.０)をシュウドモナス・ストゥッツェリー及びＥ.coli培養にそれぞれ用いた。電気穿孔法によって形質転換された細胞の培養のためにＳＯＣ培地(２％ トリプトン、０.５％酵母エキス、１０mＭ ＮaＣl、２.５mＭ ＫＣＩ、１０mＭ ＭgＣl２、１０mＭ ＭgＳＯ４、２０mＭブドウ糖)を用いた。マッコンキー寒天培地(４％ bacto MacConkey agar base、２.０％ マルトース、pＨ７.０)をトレハロースシンターゼ遺伝子をクローニングするのに用いた。アンピシリンは、５０mg／Lの濃度になるように添加した。電気穿孔法によるＥ.coli形質転換にジーンパルサー(Bio-Rad)を使用した。本発明に用いられた遺伝子操作法は、Molecular cloning,Laboratory Manual,2nd ed., Sambrook, J., E.F. Frisch 及びT. Maniatis 及びGuide to Molecular cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, B erger, S.L., A.R.KimＭeに記載の方法に従って行われた。
【００２４】
酵素反応は、pＨ６.０〜１０.０、 好ましくは７.０〜１０及び４℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃において行なう。マルトースは基質として５０％未満の濃度で用いられる。トレハロースシンターゼ酵素は、精製された形態や破砕細胞として使用することができる。
【００２５】
以下の実施例は本発明を説明するものである。前記説明および以下実施例から、当業者が本発明を完全に実施することができることはいうまでもない。
【００２６】
実施例１
微生物のスクリーニング
土壌から分離された微生物１白金耳を５０mlのＬＢ培養溶液(０.５％酵母エキス、１.０％ bactotrypton、０.５％塩)を含有する５００mlの三角フラスコに接種して２８℃において２日間培養した。培養液を４℃、８,０００rpmにおいて５分間遠心分離した。細胞を集め生理食塩水で洗浄した。洗浄した細胞を１０mlリン酸塩緩衝溶液(１０ml、pＨ７.０)に懸濁させた。細胞を超音波処理器で破砕し、破砕した細胞を４℃、１,２００rpmにおいて２０分間遠心分離して上澄液を粗酵素溶液として用いた。粗酵素溶液中の蛋白質濃度をブレッドフォード法(Bredford Mtehod)によって決定した。１００μgの蛋白質を２０μLの１００mＭマルトース及び１０μLの１００mＭリン酸塩緩衝溶液(pＨ７.０)と混合した。総容量が１００μLになるまでに蒸留水を混合物に加え、反応を３０℃において２０時間進行させた。反応溶液中の糖類をＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＧＣによって分析した。
【００２７】
実施例２
薄層クロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図１)
反応完了後、５μLの反応溶液をキーゼルゲル６０ ＴＬＣ(Merck、ドイツ)上にスポットしてn‐ブタノール−ピリジン−水(７：３：１)の溶液系を含有する容器に入れ、標本を展開させた。メチルアルコール中２０％硫酸溶液を噴霧し、１００℃において１０分間乾燥させた。このようにして標本中の糖類を特定した。少なくとも１,０００個の被験土壌微生物の中から、２個がマルトースをトレハロースに転換する能力を持つものとして確認された。図１は、トレハロースが反応前の標本中には存在しないが、反応完了後には、糖類が標準トレハロース標本の位置から検出されていることを示している。
【００２８】
実施例３
ガスクロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図２)
反応完了後、１０μLの反応溶液を減圧乾燥器によって乾燥させた。乾燥された生成物を２０μLのジメチルホルムアミドに溶解させて得られた溶液を同一容量のビス(トリメチル)トリフルオルアセトアミドと混合してトリメチルシラン誘導体を形成させた。１μLの水滴をＧＣ分析に用いた。図２に示すように、反応溶液のピークが標準トレハロース標本と同一の時に発生することが観察された。
【００２９】
実施例４
高性能液体クロマトグラフィーによるトレハロースの分析(図３)
反応完了後、反応溶液の１／２を同一容量のフェノールと混合して蛋白質を除去した。このようにして得た標本溶液をＨＰＬＣ分析に用いた。標本のピークが標準トレハロース標本と同一の時間に発生することが観察された。反応溶液の残りの１／２を１００℃において１０分間加熱して酵素活性を死活させた。それを３７℃において１０分間α−１,１−トレハロースに特異的に作用するトレハラーゼ(シグマ)と反応させた。反応完了後、溶液を同一容量のフェノール溶液と混合して蛋白質を除去した。このようにして得た溶液をＨＰＬＣにかけ、その結果、標準トレハロースと同一の時間のピークがなくなった。
【００３０】
実施例５
マルトースをトレハロースに転換する能力を持つ微生物の同定
本発明の土壌微生物を電子顕微鏡で観察しており、鞭毛を持つ杆菌であることを特徴とする。これは、またＯ／Ｆ試験によって好気性であり、グラム−陰性であることを特徴とする。微生物の生理学的特性を表３に要約する。本微生物のこれらの特性をBergy's Mannual of Systemic Bacteriology, 1984 及び特許公報に記載された微生物のものと比較し、生理学的及び形態学的にほぼ同様の、シュウドモナス・ストゥッツェリーに分類した。
【００３１】
表３
実施例６
トレハロースシンターゼ遺伝子のクローニング(図４)
(1)シュウドモナス・ストゥッツェリーからの染色体ＤＮＡの分離
シュウドモナス・ストゥッツェリーを栄養培地で育て、初期静止期において遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞をＴＥ溶液(１０mＭ Tris−HCl、pＨ８.０、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)で２回洗浄した。洗浄した細胞を２０mlのＳＴＥ緩衝液(２０％しょ糖、１０ml Tris、pＨ ８.０、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)に懸濁させて５ mg／mlのリゾチームとＲＮase Ａを懸濁液に添加した。反応を３７℃において２時間行なった。反応完了後、ＳＤＳを濃度が１％になるように添加し、反応を３７℃において３０分間継続した。この溶液を同一容量のフェノールと４時間反応させて遠心分離した。この上澄液に５Ｍ ＮaＣlを濃度が０.１Ｍになるように添加した。ガラス棒を用いて２倍量の無水エタノールを加えて染色体ＤＮＡを得た。染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ溶液に溶かし、以後の実験に用いた。
【００３３】
(2)ゲノムライブラリの製造
シュウドモナス・ストゥッツェリーから分離された純粋染色体ＤＮＡを制限酵素のＳau３ＡＩにより３７℃、１５〜３０分間部分切断した。制限酵素を熱処理して不活性化させ、アガロースゲルで電気泳動して３〜１０kbのＤＮＡ切片を得た。図５に示すように、プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＢamＨＩにより切断し、子牛腸ホスファターゼで処理した。切断されたＤＮＡを既に得た３〜１０kbのＤＮＡ切片と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１５℃において１６時間結合させた。このように得た組換え体を形質転換に用いた。形質転換は以下に記述した電気穿孔法により行なった。Ｅ.coliＮＭ５２２をＬＢ培地で１４〜１５時間培養した。得られた培養物１Ｌ ＬＢ培地に初期吸光度(６００)が０.０７〜０.１になるように接種した後、吸光度が０.８になるまで培養した。細胞を遠心分離して１ＬのＨＥＰＥＳ［Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)ピペラジン-Ｎ-(２-エタンスルホン酸)］緩衝溶液に懸濁した。細胞を再び遠心分離して５００mlの冷滅菌脱イオン蒸留水に懸濁させた。細胞を再び遠心分離して１０％グリセリン溶液２０mlに懸濁させた。細胞を再度遠心分離し、１０％グリセリン溶液２〜３mlに懸濁させ、細胞濃度を２−４×１０10／mlに調整した。細胞縣濁液を急速冷凍させた後、−７０℃で保管した。凍結された細胞は約１ヵ月間形質転換頻度が減少することなく使用することができた。４０μLの凍結細胞縣濁液を氷中で溶かした後、解凍縣濁液を結合したＤＮＡ溶液と混合した。混合物を径０.２cmのパルサーキュベットに入れ、電気容量(capacitance)及び電界強度を２５μＦ及び１２.５kV／cmにそれぞれ固定した。２００〜４００Ωの抵抗において、１回の電気パルスを与えた後、直ちに１mlのＳＯＣ培地を加えて３７℃において１時間培養した。培養物をＬＢ-アンピシリン寒天培地に塗抹して２４時間培養した。アルカリ溶菌方法により純粋ＤＮＡを分離し、それからゲノムライブラリを構築した。
【００３４】
(3)トレハロースシンターゼ遺伝子のクローニング
マルトースを炭素源として用いることができないＥ.coli ＡＴＣ３５４７６を前記から得たゲノムライブラリにより電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換された細胞を２０ g／Lのマルトースを含有したマッコンキー-アンピシリン寒天培地に塗抹した。シュウドモナス・ストゥッツェリーのトレハロースシンターゼ遺伝子がＥ.coliに導入されると、マルトースがＥ.coli内に存在するトレハラーゼによってブドウ糖に転換される。得られたブドウ糖が代謝されるにつれて、pＨが低下するとマッコンキー寒天培地のコロニーの色が黄色から赤色へと変化する。この原理を本クローニングシステムに適用した。ゲノムライブラリで形質転換されたＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７をマッコンキー寒天培地で培養し、赤色を現すコロニーを得た。プラスミドＤＮＡを分離した結果、約４.７kbのＤＮＡ断片を含有していることが判った。このプラスミドをｐＣＪ１０４と名付けた。酵素分析を行なうためにＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７／ｐＵＣ１８(対照)及びＥ.coli ＡＴＣＣ３５６４７／ｐＣＪ１０４及び野生シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８を培養した。Ｅ.coli細胞は、ＬＡ培地で初期静止期まで育てた。シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８は栄養培地で育てた。細胞を遠心分離して破砕した。破砕された細胞を緩衝溶液としてpＨ ８.５〜９.０の２０mＭジエタノールアミン中基質としての２０％マルトースと３５℃温度において反応させた。１.０％トリクロル酢酸を反応溶液に添加した後、遠心分離して高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)でマルトース及びトレハロースを定量分析した。その結果を以下の表４に示す。
【００３５】
表４．酵素力価分析
【００３６】
実施例７
トレハロースシンターゼ遺伝子の制限酵素地図製作(図５)
通常の方法でプラスミドｐＣＪ１０４を分離し、種々の制限酵素を用いて制限酵素地図を作成した。
【００３７】
ｐＣＪ１０４ ＤＮＡをＡatII、ＢamＨＩ、Ｂgl II、ＥcoＲＩ、ＥcoＲＶ、ＫpnＩ、ＮcoＩ、ＮdeＩ、ＰstＩ、ＳacＩ、ＳacII、ＳalＩＳphＩ及びＸhoＩなどの約２０の制限酵素を用いて単一、二重、及び三重−切断法を実施した。ＤＮＡ切片をアガロースゲルで電気泳動によって分析し比較して制限地図を作成した。
【００３８】
実施例８
トレハロースシンター遺伝子のサブクローニング及び酵素分析
(1)トレハロースシンターゼ遺伝子のサブクローニング(図６)
プラスミドｐＣＪ１０４の４.７kb中のトレハロースシンターゼ遺伝子の位置を決定するために、サブクローニングを実施した。プラスミドｐＣＪ１０４をＫpnＩで切断して３.３５kb切片を分離した。該切片をベクターｐＵＣ１８／ＫｐｎＩ／ＣＩＰに導入し、Ｅ.coli ＮＭ５２２を得られた組換え体で形質転換した。３.３５kb切片がｐＵＣ１８／ＫpnＩに正方向にクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１２１を構築した。また、プラスミドｐＣＪ１０４を制限酵素ＢamＨＩ及びＢgl IIで二重切断した。このようにして得た２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II切片を精製した後、ベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＣＩＰに連結した後、組換え体でＥ.coli ＮＭ５２２を形質転換した。ｐＵＣ１８／ＢamＨＩに２.５kb ＢamＨＩ−Ｂgl II切片が正方向へクローニングされた組換えプラスミドｐＣＪ１２２を構築した。最後に、ｐＣＪ１０４を制限酵素ＢamＨＩ及びＥcoＲＩで二重切断し、得られた１.２kbＢamＨＩ‐Ｂgl II切片を精製した。該切片をベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＥcoＲＩ切片を精製した。該断片をベクターｐＵＣ１８／ＢamＨＩ／ＥcoＲＩと連結し、Ｅ.coli ＮＭ５２２を組換え体で形質転換した。組換えプラスミドｐＣＪ１２３を製作した。
【００３９】
Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７を構築したプラスミドでそれぞれに形質転換した。形質転換体を、２.０％マルトースを含有したメッコンキー−アンピシリン寒天倍地で培養し、それから形成されたコロニーの色の変化を観察した。プラスミドｐＣＪ１２１及びｐＣＪ１２２を含有したＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７は、赤色のコロニーを形成するが、ｐＣＪ１２３を含有したＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７は、マルトースを分解できず黄色コロニーを形成した。したがって、トレハロースシンターゼ遺伝子が１.２kbのＢamＨＩ−ＥcoＲＩ切片よりは大きい２.５kbのＢamＨＩ−Ｂgl II切片内に位置していることが判った。
【００４０】
(2)サブクローニングされたプラスミドを含有した形質転換体のトレハロースシンターゼの力価分析
形質転換されたＥ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２１、ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２及びＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２３をＬＢ−Ａｐ倍地で初期静止期まで培養した。遠心分離して細胞を回収して適当な容量の２０mＭジエタノールアミン溶液に懸濁させて超音波処理器で破砕した。破砕された細胞を遠心分離し、得られた上澄液を酵素液として使用した。上澄液３５℃においてpＨ８.５−９.０の２０mＭジエタノールアミン含有２０％マルトース溶液と反応させた。１.０％トリクロル酢酸を反応溶液に添加し、遠心分離してＨＰＬＣで分析した。１単位酵素活性は、１分当たり１μmolのトレハロースを生成する酵素の量として定義した。その結果は以下の表５に記載した。
【００４１】
二重力価分析によると、Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２の酵素力価が最も高かった。Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２を５−L発酵槽で以下の表６に記載された条件にて高密度培養を行った。その結果、酵素の比活性はＬＢ倍地で培養した時とほぼ同様の５.０U／mg蛋白質であったが、高密度培養でトレハロースシンターゼ酵素の力価は、２０U／培養液 mlに増加した(表５)。野生シュウドモナス・ストゥッツェリーと比較すると、Ｅ.coli ＡＴＣＣ３５４６７／ｐＣＪ１２２の酵素の比活性及び培養力価は５０倍及び約１,３００倍に増加した。
【００４２】
表５
表６
【図面の簡単な説明】
【図１】 シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８の超音波処理された液体及びマルトース溶液を含有する反応溶液に対する薄層クロマトグラフィーによる糖類の分析を示している。Ｇ、Ｍ及びＴは、それぞれブドウ糖、マルトース及びトレハロースを示す。
【図２】 シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体及びマルトース溶液を含有する反応溶液(Ａ)及び標準トレハロース標本(Ｂ)に対するガスクロマトグラフィーによる糖類の分析を示している。Ｔreはトレハロースを示す。
【図３】 標準トレハロース標本(Ａ)、並びに標本(Ｂ)及び(Ｃ)に対する高性能液体クロマトグラフィーによる糖類の分析結果示している。標本(Ｂ)はシュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体とマルトース溶液を完全に反応させた直後に得た。標本(Ｃ)はトレハロースを反応完了後、シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８からの超音波処理された液体とマルトース溶液を含有する反応溶液に添加して取得した。Ｔre,Ｍal及びＧluは、それぞれトレハロース、マルトース及びブドウ糖を示す。
【図４】 本発明のトレハロースシンターゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＪ１０４の構築図である。
【図５】 本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１０４内の４.７kb Ｓau３Ａｌ切片の制限酵素地図である。
【図６】 本発明の組換えプラスミドｐＣＪ１２１及びｐＣＪ１２２の構築図である。
Claims (9)
- アミノ酸配列：
- ヌクレチオド配列：
- 請求項２に記載のトレハロースシンターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミド。
- 請求項２に記載されたトレハロースシンターゼ遺伝子の、２．５ｋｂａ ＢamＨＩ−Ｂgl II切片を含む組換えプラスミドｐＣＪ１２２。
- 請求項３に記載の組換えプラスミドにより形質転換されたＥ.coli。
- 請求項４に記載の組換えプラスミドｐＣＪ１２２により形質転換されたＥ.coli。
- 請求項１に記載のトレハロースシンターゼ酵素を、マルトース溶液と反応させてトレハロースを得ることを含む、トレハロースの製造方法。
- 請求項５に記載の形質転換されたＥ.coliを破砕し、破砕された細菌を遠心分離し、得られた上澄液をマルト−ス溶液と反応させてトレハロースを得ることを含む、トレハロースの製造方法。
- マルトースからトレハロースを産生する韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０１５０で寄託された新規微生物シュウドモナス・ストゥッツェリーＣＪ３８。
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