CN104745660B - 一种酶法合成制备海藻糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶法合成制备海藻糖的方法，所述方法如下：(1)海藻糖合酶酶液酶活为1500～2000U/ml，底物麦芽糖溶液为10％；(2)利用蠕动泵向反应釜中流加酶液和麦芽糖溶液，控制流加速度；(3)反应过程检测反应体系中麦芽糖和海藻糖的比例，以及副产物葡萄糖等含量；(4)反应15～20h，合成产物80％以上为海藻糖，即终止反应，海藻糖转化率达到70％以上。本发明立足于中试发酵水平，实现了低成本、短周期、高转化的连续操作，具有很强的社会竞争力和经济意义，为大规模生产海藻糖提供较为切实可行的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法合成制备海藻糖的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
海藻糖工业化生产过程中多为酶法合成，酶法合成过程中最为直接的工艺是利用通透性海藻糖合酶细胞或是海藻糖合酶与底物麦芽糖进行反应，然后进行结晶分离制备；现有工艺受酶转化平衡关系的限制，反应体系中未转化的底物麦芽糖，一般在20％～30％，由于麦芽糖和海藻糖为同分异构体，化学性质相似，给分离带来困难，导致海藻糖的生成成本偏高，影响其生成和应用。
专利CN103146779B公开了一种利用固定化重组大肠杆菌细胞合成海藻糖的方法，该方法转化率可达到50％-60％，该酶法合成即受限于转化产物中副产物含量较高，使得终产物海藻糖转化率不高。专利CN101230407A公开了一种提高海藻糖提取收率的方法，该专利提到酶法合成海藻糖糖的终产物中，副产物麦芽糖醇、山梨醇和麦芽三糖醇，以及底物麦芽糖，大大增加了提取成本，不利于工业化生产海藻糖。
目前海藻糖合酶制备工艺相对成熟，无论是通透性含酶细胞还是经纯化制备酶液均可以应用于工业生产，但是受酶促反应平衡的制约，终产物中底物及副产物的存在给海藻糖的提纯增加了难度，关于如何提高海藻糖酶促反应效率的技术发明还没有提及。
发明内容
针对现有的规模化海藻糖生产工艺不足，海藻糖合成过程底物麦芽糖利用率低，提取纯化存在难度，本发明所要解决技术问题是提供一种酶合反应工艺，利用流加方式控制酶液和底物的比例，使其充分混合，最大程度合成海藻糖，减少副产物的生成，解决生产过程中的问题，提高底物利用率，并进一步降低海藻糖的纯化难度，减少生产成本。
本发明的技术方案为：
一种酶法合成制备海藻糖的方法，将海藻糖合酶酶液和麦芽糖分别通过流加方式在反应釜中进行充分混合，控制温度和流加速度，反应15～20h后终止酶反应，将产物提纯得到海藻糖。其特征在于：利用流加酶和底物的方式合成海藻糖。
本发明所述的方法，实施过程的步骤为
(1)海藻糖合酶酶液，酶活为1500～2000U/ml；
酶活检测：将1mL酶液加入到1mL10％麦芽糖磷酸溶液中，混匀后，将该混合物溶液于25℃保温60min，然后于100℃加热10min中止酶反应；反应混合物冷却后，5000r/min离心10min，取上清液，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量(色谱柱：Hypersil NH2，4.6mm×250mm，填料粒径5um；检测器：示差折光检测器；流动相：乙腈/水＝75/25(V/V)；柱温：室温；进样量：20uL；流速：1.0mL/min)。
(2)用磷酸缓冲液配制质量浓度10％的麦芽糖溶液，调节pH7.8，制得麦芽糖底物溶液；
(3)向30L反应釜中加入2L酶液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向反应釜中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶3(初始控制酶液流加速度为6ml/min，麦芽糖流加速度为20ml/min)，转速150rpm，温度25℃，反应4h后，取样检测反应液中相关成分含量，其中海藻糖～60％，麦芽糖为～30％，此时改变酶液流加速度为2ml/min，继续流加至12h，取样检测，海藻糖70％～75％，停止流加；
(4)反应20h，取样检测，海藻糖＞80％，麦芽糖＜20％，葡萄糖＜5％；此时终止反应，所得反应液约25L，分离纯化海藻糖转化率达到70％以上.
本发明所述的方法中，海藻糖合酶酶液可以是经纯化得到的海藻糖合酶溶液，也可以是含海藻糖合酶的通透性细胞。
本发明所述的方法中，流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶2.5～4。
本发明的有益效果在于：
1.本发明通过采用流加酶液和底物的工艺，通过控制酶和底物的流加速度，使酶液和底物得到充分接触，进而使酶合反应始终向着终产物海藻糖的方向进行，从而进一步提高了转化率，使转化率可达到70％以上。
2.由于本发明制得的酶反应体系中，终产物海藻糖含量提高，底物麦芽糖得到充分利用，同时副产物麦芽糖醇、麦芽三糖醇等基本没有，因此可以减少了纯化海藻糖的难度，方法简单、大大降低了分离成本，对规模化生产具有可观的经济效益。
3.本发明的海藻糖合成工艺中，酶液的流加速度在反应后期减半，实际上是对反应体系中酶液的充分利用，达到反复利用的效果。
4.本发明的海藻糖合成工艺中，酶液还可以利用通透性海藻糖合酶细胞进行反应，因此应用广泛，于实际生产应用性强。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明酶法合成海藻糖的工艺进行详细说明：
检测方法：
海藻糖含量检测方法按GB/T23529-2009，海藻糖国标中的高效液相色谱法检测；
转化率为终产物海藻糖的终产量与底物麦芽糖含量的比值，转化率的水平高低直接翻译产生海藻糖的效果。
酶活定义：在一定反应条件下，每分钟形成1umol海藻糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
酶活检测：将1mL酶液加入到1mL10％麦芽糖磷酸溶液中，混匀后，将该混合物溶液25℃保温60min，然后于100℃加热10min中止酶反应；反应混合物冷却后，5000r/min离心10min，取上清液，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量(色谱柱：Hypersil NH2，4.6mm×250mm，填料粒径5um；检测器：示差折光检测器；流动相：乙腈/水＝75/25(V/V)；柱温：室温；进样量：20uL；流速：1.0mL/min)。
实施例1
本实例说明了利用流加海藻糖合酶和麦芽糖的方式进行酶促反应的步骤和效果：
(1)将酶活为1600U/ml的海藻糖合酶酶液转入已灭菌的补料瓶中。
(2)使用45mmol/L磷酸盐缓冲液配制质量浓度10％的麦芽糖溶液，调节pH7.8，转入已灭菌的补料瓶中。
(3)向30L反应釜中加入2L酶液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向反应釜中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶3(初始控制酶液流加速度为6ml/min，麦芽糖流加速度为20ml/min)。
(4)反应4h时，取样检测反应液中相关成分含量，其中海藻糖61％，麦芽糖为28％，此时改变酶液流加速度为2ml/min；继续流加至12h，取样检测，海藻糖78％，麦芽糖18％，停止流加酶液和底物。
(5)反应20h，取样检测，海藻糖82％，麦芽糖16％，葡萄糖2％；此时终止反应，所得反应液约26L，进行分离纯化即得海藻糖，海藻糖转化率达到72％；
实施例2
本实例说明了使用含酶通透性细胞进行流加工艺合成海藻糖的步骤和效果：
(1)将酶活为200U/g的海藻糖合酶通透性细胞，转入已灭菌的补料瓶中。
(2)使用45mmol/L磷酸盐缓冲液配制质量浓度10％的麦芽糖溶液，调节pH7.8，转入已灭菌的补料瓶中。
(3)向30L反应釜中加入2L通透性细胞液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向反应釜中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶3(初始控制酶液流加速度为6ml/min，麦芽糖流加速度为20ml/min)。
(4)反应4h时，取样检测反应液中相关成分含量，其中海藻糖58％，麦芽糖为33％，此时改变酶液流加速度为2ml/min；继续流加至12h，取样检测，海藻糖73％，麦芽糖19％，停止流加酶液和底物。
(5)反应20h，取样检测，海藻糖80％，麦芽糖19％，葡萄糖2％；此时终止反应，所得反应液约25L，进行分离纯化即得海藻糖，海藻糖转化率达到70％。
实施例3
本实例说明了使用含酶通透性细胞进行流加工艺合成海藻糖的步骤和效果：
(1)将酶活为100U/g的海藻糖合酶通透性细胞，转入已灭菌的补料瓶中。
(2)使用45mmol/L磷酸盐缓冲液配制质量浓度10％的麦芽糖溶液，调节pH7.8，转入已灭菌的补料瓶中。
(3)向30L反应釜中加入2L通透性细胞液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向反应釜中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶3(初始控制酶液流加速度为6ml/min，麦芽糖流加速度为20ml/min)；
(4)反应4h时，取样检测反应液中相关成分含量，其中海藻糖57％，麦芽糖为34％，此时改变酶液流加速度为3ml/min；继续流加至12h，取样检测，海藻糖72％，麦芽糖20％，停止流加酶液和底物；
(5)反应20h，取样检测，海藻糖78％，麦芽糖19％，葡萄糖3％；此时终止反应，所得反应液约25L，进行分离纯化即得海藻糖，海藻糖转化率达到70％；
实施例4
本实例说明了使用固定化海藻糖合酶进行流加工艺合成海藻糖的步骤和效果：
(1)将酶活为200U/g的壳聚糖固定化海藻糖合酶转入已灭菌的补料瓶中；
(2)使用45mmol/L磷酸盐缓冲液配制质量浓度10％的麦芽糖溶液，调节pH7.8，转入已灭菌的补料瓶中；
(3)向30L反应釜中加入2L固定化酶液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向反应釜中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者比例1∶3(初始控制酶液流加速度为6ml/min，麦芽糖流加速度为20ml/min)；
(4)反应4h时，取样检测反应液中相关成分含量，其中海藻糖63％，麦芽糖为30％，此时改变酶液流加速度为2ml/min；继续流加至12h，取样检测，海藻糖76％，麦芽糖16％，停止流加酶液和底物；
(5)反应20h，取样检测，海藻糖81％，麦芽糖17％，葡萄糖2％；此时终止反应，所得反应液约24L，进行分离纯化即得海藻糖，海藻糖转化率达到72％；
综合以上实施例，本发明得到海藻糖转化率均在70％以上，保持较高水平，同时产物中副产物得到控制，大大降低了提纯的难度；通过实施例2、实施例3和实施例4的对比发现，本发明同样适用于固定化酶以及通透性含酶细胞，应用范围甚广。
Claims (3)
1.一种酶法合成制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
(1)海藻糖合酶酶液，酶活为1500～2000U/mL；
(2)使用45mmol/L pH7.8磷酸盐缓冲液配制质量浓度为10％的麦芽糖溶液；
(3)向30L反应釜中加入2L酶液，8L麦芽糖溶液，转速150rpm，温度25℃，然后通过蠕动泵分别向30L反应釜中以6mL/min的流加速度流加海藻糖合酶酶液和以20mL/min的流加速度流加麦芽糖底物溶液，反应过程中每小时取样检测反应体系中的海藻糖含量；
(4)反应至4h，海藻糖占60％，麦芽糖为30％，此时改变酶液的流加速度为2mL/min，继续流加至12h，取样检测，海藻糖占75％，停止流加酶和底物，继续反应至20h，取样检测，海藻糖占＞80％，底物麦芽糖＜20％，葡萄糖＜5％，终止反应。
2.根据权利要求1所述酶法合成制备海藻糖的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的海藻糖合酶酶液是经过纯化得到的海藻糖合酶酶液。
3.根据权利要求1所述酶法合成制备海藻糖的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加海藻糖合酶酶液和麦芽糖底物溶液，控制两者的流加速度比例为1∶2.5～4。
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