CN115851848A - 一种联产d-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种联产D‑阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)以D‑果糖和D‑葡萄糖为底物，加入溶剂和全细胞催化剂Ⅰ，调pH，控温，得到为D‑蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液；(2)取上清液，调pH至中性，在通风、搅拌状态下再加入全细胞催化剂Ⅱ，反应结束后得到混合溶液；(3)取混合液，先过阳离子树脂柱，收集的流出液再过阴离子树脂柱，将收集的流出液经处理得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经处理得到葡萄糖酸钠产品。利用这个两步多酶串联生物转化系统，催化D‑果糖和D‑葡萄糖联产D‑阿洛酮糖和葡萄糖酸钠，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-ps icose)是一种非常重要的稀有己酮糖，甜度为蔗糖的70％，但是其能量几乎为0，溶剂特性与口感与蔗糖相近，在食药行业D-阿洛酮糖是蔗糖的理想替代品。此外，D-阿洛酮糖具有抑制肥胖，降血糖，降血脂等功能，非常适用于糖尿病患者和肥胖人群的食用，因此，D-阿洛酮糖在医疗、保健方面具有显著功效。目前，D-阿洛酮糖的生产主要是基于异构酶催化D-果糖(D-fructose)的异构化反应，该反应是一个可逆反应，存在转化率低的问题，转化率在30％左右。
葡萄糖酸钠又称五羟基己酸钠，是一种白色或淡黄色结晶粉末，易溶于水微溶于醇，不溶于醚。作为一种具有广泛用途的有机酸钠盐，它主要用于建筑、化工、食品、医药等行业。目前，葡萄糖酸钠的生产方法主要是利用黑曲霉等菌株进行生物发酵或者利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行双酶氧化。生物发酵法具有生产稳定温和、容易规模工业化生产等特点，但同时也有一定的缺陷，如产品色泽不易控制、无菌化要求程度高等。双酶氧化法虽然具有速度快、工艺简单、产品纯度高、能耗低等特点，但同时也存在一些缺点：目前酶制剂价格较高，导致生产成本增加。因此针对上述问题，建立了一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，利用该制备方法同时生产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠，降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以D-果糖和D-葡萄糖为底物，加入溶剂和共表达三种酶的全细胞催化剂Ⅰ，调整反应体系的pH为弱酸性，控制反应体系的温度，待反应结束后离心收集的上清液即为D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的上清液，调pH至中性，在通风、搅拌状态下再加入共表达两种酶的全细胞催化剂Ⅱ，反应结束后得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，先过阳离子树脂柱，收集的流出液再过阴离子树脂柱，将收集的流出液经蒸发、浓缩、结晶抽滤后得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩、结晶抽滤后得到葡萄糖酸钠产品。
作为一种改进的技术方案，所述全细胞催化剂Ⅰ为同时表达阿洛酮糖差向异构酶(DPE)基因、蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因、葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的全细胞催化剂；所述全细胞催化剂Ⅱ为同时表达蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因和NADH氧化酶(NOX)基因的全细胞催化剂。
作为一种改进的技术方案，所述全细胞催化剂Ⅰ可表达的阿洛酮糖差向异构酶基因来源菌株选自Clostridiales，蒜糖醇脱氢酶基因来源菌株选自Providenciaalcalifaciens，葡萄糖脱氢酶基因来源菌株选自Bacillaceae；所述全细胞催化剂Ⅱ可表达的蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因来源菌株选自Rubrivivax sp.，NADH氧化酶(NOX)基因来源菌株选自Streptococcus pyogenes。
作为一种改进的技术方案，所述全细胞催化剂Ⅰ的制备包括以下操作：将阿洛酮糖差向异构酶基因(DPE)、蒜糖醇脱氢酶基因(RDH)和葡萄糖脱氢酶基因(GDH)连接到pYB1s质粒上，将得到的重组质粒pYB1s-DPE-RDH-GDH转化到大肠杆菌BW25113中，得到全细胞催化剂Ⅰ；
所述全细胞催化剂Ⅱ的制备包括以下操作：将蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因、NADH氧化酶基因(NOX)连接到pYB1s质粒上，将得到的重组质粒pYB1s-RDH-NOX转化到大肠杆菌BW25113中，得到全细胞催化剂Ⅱ。
作为一种改进的技术方案，步骤(1)中D-果糖和D-葡萄糖分别按照50-100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅰ按照湿重浓度为10-30g/L的比例加入，所述溶剂为0.05-0.1mol/L的磷酸钠溶液；反应体系的pH为5.5-6.5，反应温度为38-45℃，反应时间为10-12h。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中D-果糖和D-葡萄糖分别按照100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅰ按照湿重浓度10g/L的比例加入，反应体系的pH为6.0，反应温度为40℃，反应时间为12h。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中所述D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液按照D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠分别为50-100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅱ按照湿重浓度10-30g/L的比例加入；空气按照1.5-2.5L/min的流速通入，且维持反应体系中的溶解氧在30-40％v/v，搅拌速度从开始的500rpm逐渐增加至1000rpm，反应时间控制在20-24h，反应温度控制在40-45℃。
作为一种优选的技术方案，步骤(2)中所述D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液按照50g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅱ按照湿重浓度30g/L的比例加入，按照1.8L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在35％v/v，反应体系的pH为7.0，反应温度为40℃，反应时间为24h。
本发明制备方法中步骤(1)和步骤(2)中反应方程式：
步骤(1)的反应：
步骤(2)的反应：
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明以D-果糖和D-葡萄糖为底物，调整反应体系的pH为弱酸性，采用同时表达阿洛酮糖差向异构酶(DPE)基因、蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因、葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的全细胞催化剂Ⅰ，得到NADH再生系统，将D-果糖和D-葡萄糖为分别催化成D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠；然后，采用同时表达蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因和NADH氧化酶(NOX)基因的全细胞催化剂Ⅱ，将D-蒜糖醇氧化为D-阿洛酮糖，同时葡萄糖酸钠残留在反应体系中。在这种合成路线中，两个NADH再生系统分别通过GDH驱动的还原和NOX驱动的氧化来完成。利用这个两步多酶串联生物转化系统，催化D-果糖和D-葡萄糖联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠，降低生产成本。
附图说明
图1为实施例4中步骤(1)反应收集的上清液的高相液相检测图谱；
图2为实施例4中步骤(2)反应收集的混合液的高相液相检测图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为100g/L、磷酸钠溶液0.05mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为30g(湿重)/L，调整反应体系的pH为5.5，控制反应体系的温度38℃，反应12h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液稀释至0.5L，D-蒜糖醇浓度为90g/L,葡萄糖酸钠的浓度为97g/L,置于1.0L生物反应器中，按照2.5L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在40％v/v，调pH至中性，搅拌状态下加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)30g(湿重)/L，对反应体系的搅拌时按照500rpm逐渐和葡萄糖酸钠的混合溶液增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度45℃，反应24h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h的流速进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h的流速进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
实施例2
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为100g/L、磷酸钠溶液0.05mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为20g(湿重)/L，调整反应体系的pH为6.0，控制反应体系的温度38℃，反应12h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇溶液和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液稀释至0.5L，D-蒜糖醇浓度为80g/L,葡萄糖酸钠的浓度为86g/L，置于体积为1L的生物反应器中，按照2.3L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在38％v/v，加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)20g(湿重)/L，调pH至中性，对反应体系搅拌时按照500rpm逐渐增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度40℃，反应20h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h的流速进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h的流速进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
实施例3
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为60g/L、磷酸钠溶液0.05mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为20g(湿重)/L，调整反应体系的pH为6.0，控制反应体系的温度40℃，反应10h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇溶液和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液0.5L(D-蒜糖醇浓度为60g/L,葡萄糖酸钠的浓度为65g/L)，置于体积为1L的生物反应器中，按照2.0L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在35％v/v，加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)20g(湿重)/L，调pH至中性，对反应体系搅拌时按照500rpm逐渐增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度42℃，反应22h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
实施例4
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为100g/L、磷酸钠溶液0.1mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为10g(湿重)/L，调整反应体系的pH为6.0，控制反应体系的温度40℃，反应12h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇溶液和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液稀释至0.5L，D-蒜糖醇浓度为50g/L,葡萄糖酸钠的浓度为55g/L，置于体积为1L的生物反应器中，按照1.8L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在35％v/v，加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)30g(湿重)/L，调pH至中性，对反应体系搅拌时按照500rpm逐渐增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度40℃，反应24h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h的流速进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h的流速进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
实施例5
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为60g/L、磷酸钠溶液0.08mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为25g(湿重)/L，调整反应体系的pH为6.3，控制反应体系的温度45℃，反应11h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇溶液和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液0.5L(D-蒜糖醇浓度为50g/L,葡萄糖酸钠的浓度为55g/L，)，置于体积为1L的生物反应器中，按照1.5L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在30％v/v，加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)20g(湿重)/L，调pH至中性，对反应体系搅拌时按照500rpm逐渐增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度43℃，反应24h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h的流速进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h的流速进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
实施例6
一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，包括以下步骤：
(1)底物D-果糖和D-葡萄糖分别为80g/L、磷酸钠溶液0.1mol/L,全细胞催化剂Ⅰ(同时表达阿洛酮糖差向异构酶基因、蒜糖醇脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因)加入量为15g(湿重)/L，调整反应体系的pH为6.5，控制反应体系的温度42℃，反应12h后反应结束，离心收集的上清液即为D-蒜糖醇溶液和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的混合溶液稀释至0.5L，D-蒜糖醇浓度为70g/L,葡萄糖酸钠的浓度为76g/L，置于体积为1L的生物反应器中，按照2.5L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在35％v/v，加入全细胞催化剂Ⅱ(同时表达蒜糖醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因)30g(湿重)/L，调pH至中性，对反应体系搅拌时按照500rpm逐渐增加至1000rpm的搅拌反应体系中的料液，控制反应体系的温度45℃，反应24h后反应结束，得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，按照0.5bv/h的流速进入阳离子树脂柱(树脂柱填料为001*16)，收集的流出液再按照0.5bv/h的流速进入阴离子树脂柱(树脂柱填料为D941)，将收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-85wt％时，加入95wt％乙醇，降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，然后搅拌缓慢降温至室温后离心分离，得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩至固形物为70-80wt％，将浓缩液降温至45℃，加入浓缩液质量0.5％晶种，保持45℃,真空度-0.05MPa,进行恒温蒸发结晶，离心分离，得到葡萄糖酸钠产品。
其中实施例1-6中全细胞催化剂I的制备方法包括以下步骤：
(1)重组质粒pYB1s-DPE-RDH-GDH的构建：将pYB1s载体用XhoI和SpeI双酶切后，回收载体片段；将人工合成的DPE基因片段、RDH基因片段和GDH基因片段(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)与回收的载体片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smi th HO:Enzymatic assembly of DNA molecules upto several hundred ki lobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，得到连接产物。将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，测序正确的载体命名为pYB1s-DPE-RDH-GDH。
(2)重组蛋白DPE和RDH和GDH的诱导表达：将载体pYB1s-DPE-RDH-GDH用化学转化法转化大肠杆菌BW25113，得到全细胞催化剂Ⅰ。将重组菌(全细胞催化剂Ⅰ)划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100mL的琼脂(含50μg/mL的链霉素)LB平板上，37℃培养12h。挑取单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养10h，转速为220rpm；将培养物以体积百分比为1％的接种量接种至500mL LB培养基，37℃振荡培养3h，加入终浓度2g/L的阿拉伯糖进行诱导表达，30℃振荡培养12h。
实施例1-6中全细胞催化剂Ⅱ的制备方法包括以下步骤：
(1)重组质粒pYB1s-RDH-NOX的构建：将pYB1s载体用XhoI和SpeI双酶切后，回收载体片段；将人工合成的RDH基因片段和NOX基因片段(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)与回收的载体片段用Gibson方法进行连接，得到连接产物。将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，测序正确的载体命名为pYB1s-RDH-NOX。
(2)重组蛋白RDH和NOX的诱导表达：将载体pYB1s-RDH-NOX用化学转化法转化大肠杆菌BW25113，得到全细胞催化剂Ⅱ。将重组菌(全细胞催化剂Ⅱ)划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100mL的琼脂(含50μg/mL的链霉素)LB平板上，37℃培养12h。挑取单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养10h，转速为220rpm；将培养物以体积百分比为1％的接种量接种至500mL LB培养基，37℃振荡培养3h，加入终浓度2g/L的阿拉伯糖进行诱导表达，30℃振荡培养12h。
为了更好的证明本发明的方法可以同时得到高收率的D-阿洛酮糖产品和葡萄糖酸钠产品，以实施例4为参照，给出了4个对比例，底物的产率以及产物的收率详见表1。
对比例1
与实施例4不同的是：步骤(1)中全细胞催化I按照湿重浓度40g/L的比例加入，其余操作相同；
对比例2
与实施例4不同的是，步骤(1)中反应温度为35℃，其余操作相同；
对比例3
与实施例4不同的是，步骤(2)中维持反应体系中的溶解氧在40％v/v，其余操作相同。
表1
通过表1中的数据可以发现，采用本发明的制备方法可以适于工业化成产，通过多酶体系催化D-果糖和D-葡萄糖联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠，降低生产成本，取实施例4中步骤(1)反应后的上清液，用高效液相色谱法(Aminex HPX-87C柱(7.8*300mm)、检测器(RID)、流动相：双蒸水、柱温80℃、流速：0.6ml/min)测定蒜糖醇和葡萄糖酸钠的浓度，具体检测详见附图1。
取实施例4中步骤(2)反应后的混合液，用高效液相色谱法(Aminex HPX-87H柱(7.8*300mm)、检测器(DAD,210nm)、流动相：5mM硫酸、柱温50℃、流速：0.5ml/min)测定葡萄糖酸钠和D-阿洛酮糖的浓度，具体检测详见附图2。
阿洛酮糖差向异构酶蛋白序列、蒜糖醇脱氢酶蛋白序列、葡萄糖脱氢酶蛋白序列、蒜糖醇脱氢酶蛋白序列以及NADH氧化酶蛋白序列详见序列表。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以D-果糖和D-葡萄糖为底物，加入溶剂和共表达三种酶的全细胞催化剂Ⅰ，调整反应体系的pH为弱酸性，控制反应体系的温度，待反应结束后离心收集的上清液即为D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(2)取步骤(1)中的上清液，调pH至中性，在通风、搅拌状态下再加入共表达两种酶的全细胞催化剂Ⅱ，反应结束后得到D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的混合溶液；
(3)取步骤(2)的混合液，先过阳离子树脂柱，收集的流出液再过阴离子树脂柱，将收集的流出液经蒸发、浓缩、结晶抽滤后得到阿洛酮糖产品；采用氢氧化钠溶液冲洗阴离子树脂柱，收集的流出液经蒸发、浓缩、结晶抽滤后得到葡萄糖酸钠产品。
2.根据权利要求1所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：所述全细胞催化剂Ⅰ为同时表达阿洛酮糖差向异构酶(DPE)基因、蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因、葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的全细胞催化剂；所述全细胞催化剂Ⅱ为同时表达蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因和NADH氧化酶(NOX)基因的全细胞催化剂。
3.根据权利要求2所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：所述全细胞催化剂Ⅰ可表达的阿洛酮糖差向异构酶基因来源菌株选自Clostridiales，蒜糖醇脱氢酶基因来源菌株选自Providencia alcalifaciens，葡萄糖脱氢酶基因来源菌株选自Bacillaceae；所述全细胞催化剂Ⅱ可表达的蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因来源菌株选自Rubrivivaxsp.，NADH氧化酶(NOX)基因来源菌株选自Streptococcus pyogenes。
4.根据权利要求2所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：所述全细胞催化剂Ⅰ的制备包括以下操作：将阿洛酮糖差向异构酶基因(DPE)、蒜糖醇脱氢酶基因(RDH)和葡萄糖脱氢酶基因(GDH)连接到pYB1s质粒上，将得到的重组质粒pYB1s-DPE-RDH-GDH转化到大肠杆菌BW25113中，得到全细胞催化剂Ⅰ；
所述全细胞催化剂Ⅱ的制备包括以下操作：将蒜糖醇脱氢酶(RDH)基因、NADH氧化酶基因(NOX)连接到pYB1s质粒上，将得到的重组质粒pYB1s-RDH-NOX转化到大肠杆菌BW25113中，得到全细胞催化剂Ⅱ。
5.根据权利要求1所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中D-果糖和D-葡萄糖分别按照50-100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅰ按照湿重浓度为10-30g/L的比例加入，所述溶剂为0.05-0.1mol/L的磷酸钠溶液；反应体系的pH为5.5-6.5，反应温度为38-45℃，反应时间为10-12h。
6.根据权利要求5所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中D-果糖和D-葡萄糖分别按照100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅰ按照湿重浓度10g/L的比例加入，反应体系的pH为6.0，反应温度为40℃，反应时间为12h。
7.根据权利要求1所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液按照D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠分别为50-100g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅱ按照湿重浓度10-30g/L的比例加入；空气按照1.5-2.5L/min的流速通入，且维持反应体系中的溶解氧在30-40％v/v，搅拌速度从开始的500rpm逐渐增加至1000rpm，反应时间控制在20-24h，反应温度控制在40-45℃。
8.根据权利要求7所述的一种联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述D-蒜糖醇和葡萄糖酸钠的混合溶液按照50g/L的比例加入，全细胞催化剂Ⅱ按照湿重浓度30g/L的比例加入，按照1.8L/min的流速通入空气，维持反应体系中的溶解氧量在35％v/v，反应体系的pH为7.0，反应温度为40℃，反应时间为24h。
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| CN116162673A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-05-26 | 山东福洋生物科技股份有限公司 | 一种多种功能糖联产的方法 |
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