CN112779236A

CN112779236A - 一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用

Info

Publication number: CN112779236A
Application number: CN202110072853.6A
Authority: CN
Inventors: 袁建国; 张言慧
Original assignee: Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd; Shandong National Biotechnology Research Institute
Current assignee: Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd; Shandong National Biotechnology Research Institute
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112779236B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用。本发明所述反式丁烯酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述反式丁烯酸转氨酶可有效催化反式丁烯酸生产R‑3‑氨基丁酸，并且采用本发明方法可实现所述反式丁烯酸转氨酶的工业化生产，为生物酶法大量制备R‑3‑氨基丁酸提供了必备条件。

Description

一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用。

背景技术

R-3-氨基丁酸主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物，R-3-氨基丁醇是度鲁特韦(dolutegravir)的关键中间体。度鲁特韦是一种人类免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)整合酶抑制药，适用于与其它抗逆转录病毒药联用治疗12岁以上和体重至少为40kg儿童的HIV-1感染。度鲁特韦于2013年08月12日获得FDA批准上市，2019年全球销售额超过20亿美元。R-3-氨基丁酸可通过生物酶法制备，如中国发明专利CN108374027B公开了一种R-3-氨基丁酸的制备方法，该方法是以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH，然后加入天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R-3-氨基丁酸。其中，所述天冬氨酸酶的获得方法是：以芽孢杆菌菌液为模板，按照GenBank上公开的芽孢杆菌天冬氨酸酶基因序列设计一对引物，随后进行PCR扩增，将PCR扩增片段和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和载体进行连接构成重组质粒，加入感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养。

该专利虽然公开了采用天冬氨酸酶可催化反式丁烯酸生产R-3-氨基丁酸，但是其并未具体公开所述天冬氨酸酶工业化生产的工艺，仅是公开了实验室摇瓶发酵工艺。而且发酵过程中的中试是从小试实验到工业化生产必经的过渡环节，由于发酵中试放大并非所有参数直接线性放大，需要综合考虑罐体温度、溶氧、菌体、补料速度等传质、扩散动力学因素，这些因素会造成发酵中试结果与小试差别很大，而且有可能在不同的发酵阶段，采用不同的参数控制方式，这些都是在摇瓶小试时无法做到的。在此基础上人们很难得到可满足1000L生物催化反应体系所需的重组天冬氨酸酶的用量。

而天然的天冬氨酸酶用于催化富马酸和氨生成天冬氨酸，无法催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸。因此，提供一种可工业化生产的可催化反式丁烯酸生产R-3-氨基丁酸的天冬氨酸酶及其生产工艺，对于生物医药行业具有重要的意义。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种反式丁烯酸转氨酶及其高密度发酵制备方法和应用。本发明所述反式丁烯酸转氨酶可有效催化反式丁烯酸生成R-3-氨基丁酸，并且采用本发明方法可实现所述反式丁烯酸转氨酶的工业化生产，为生物酶法大量制备R-3-氨基丁酸提供了必备条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一提供一种反式丁烯酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明目的之二提供一种编码以上所述反式丁烯酸转氨酶的but基因，所述but基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明目的之三提供一种反式丁烯酸转氨酶工程菌，所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，表达反式丁烯酸转氨酶but基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明目的之四提供所述反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵方法，所述方法包括以下步骤：

所述工程菌种子液培养；

将种子液接种到发酵培养基中，进行高密度发酵培养；

高密度发酵培养过程中添加诱导剂，补加碳源、氮源，控制溶氧量。

优选地，发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，溶剂为水。

优选地，所述诱导剂为IPTG或乳糖；进一步优选地，IPTG诱导浓度为0.3～0.6mmol/L，发酵5～8h时加入诱导剂进行诱导培养。

优选地，控制发酵液溶氧量为15～20％，搅拌转速为150～500rpm，通气量为1～2vvm。

优选地，发酵过程中pH值控制在6.5～7.5。

优选地，待发酵至溶氧开始回升时流加碳源，流加速率为0.2～30mL/(L·h)。

优选地，所述碳源为甘油或葡萄糖；进一步优选地，所述碳源为甘油，所用甘油浓度为40～60％v/v，流加甘油总量为发酵培养基体积的10～30％。

优选地，在发酵2～6h开始流加氮源，流加速率为0.1～5mL/(L·h)。

优选地，所述氮源为氨水；所用氨水浓度为10～30％v/v，流加氨水总量为发酵培养基体积的1～8％。

在发酵过程中产生的副产物，如乙酸等往往会对菌体生长和产物生成有不利影响，影响发酵结果。而合理掌控发酵过程中菌体的比生长速率(μ)和产物的比生产速率(Q_P)尤为关键。

由式(1)可知，菌体的比生长速率与生长限制性底物有关。

式中S是生长限制性底物，μ_m是最大比生长速率，K_s是半饱和常数，X为菌体细胞质量，dX/dt为菌体细胞的瞬时增量。

由式(2)可知，产物的比生产速率与菌体的比生长速率有关，进一步分析可得产物的比生产速率与生长限制性底物有关。

本发明工程菌发酵过程中，生长限制性底物包括碳源、氮源及氧。因此，通过控制限制性底物的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速、通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目标蛋白酶大量表达。通过筛选，本发明以甘油作为碳源，氨水作为氮源效果最佳。

进一步地，

式中，CH_mO_l为碳源，此处为CH2O；CH_pO_nN_q为菌体，此处可取CH_1.898O_0.627N_0.152；CH_rO_sN_t为蛋白产物，此处为CH_1.679O_0.345N_0.275；a、b、c、d均为化学计量系数；y_X是量纲为1的菌体得率，y_P是量纲为1的产物的率，它们与碳源的菌体得率Y_X/S，碳源的产物得率Y_P/S有如下关系

式中，α₁为碳源含碳量，α₂为菌体含碳量，α₃为产物含碳量。

又因为对于生长限制性底物氧而言，菌体的耗氧速率(Oxygen uptake rate,OUR)：

式中，F_in为进气流量，mol；V为发酵液体；

为排气中的氧及二氧化碳的浓度，通过在线尾气分析仪测定；t_in为进气的温度，℃；h为进气的相对湿度。

鉴于作为菌体生长和产物生成的限制性底物碳源、氮源及氧存在上述关系，经多次实验后分析计算，本发明底物的补加时间为发酵培养底料里的生长限制性底物耗尽即溶氧的突然回升为判断点，此时碳源或氮源耗尽，并开始流加碳源或氮源，通气量为1～2vvm，并调控流加速率使得溶氧控制在15～20％；碳源甘油流加量控制在发酵培养基体积的10～30％，氮源氨水流加量控制在发酵培养基体积的1～8％，而碳氮比是通过控制pH实现的，维持在6.5～7.5之间。最终使得菌体细胞在短时间内实现高密度生长(发酵24h菌体湿重即达到150g/L以上)，并且反式丁烯酸转氨酶得到高效表达(酶活可以达到1000U/mL以上)。

本发明目的之四提供以上所述反式丁烯酸转氨酶或反式丁烯酸转氨酶工程菌在制备R-3-氨基丁酸中的应用。

本发明目的之五提供一种酶法生产R-3-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

将反式丁烯酸转氨酶或含反式丁烯酸转氨酶的工程菌菌体与反式丁烯酸转化液混合，进行转化、离心收集上清，超滤纳滤，脱色、结晶、重结晶，即得；反式丁烯酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述反式丁烯酸转化液各成分浓度为：反式丁烯酸30～300g/L，硫酸铵5～50g/L，硫酸镁1～10g/L，用氨水调节pH为7.5～9.5；

优选地，按菌体湿重50-100g/L的添加量进行转化；

优选地，转化条件为：20～40℃条件下转化6～12h。

优选地，结晶方法为：将转化液离心除菌体后，经超滤膜与纳滤膜过滤后，取上清液，加入0.5％～5％质量的活性炭脱色，过滤后取上清液浓缩，降温至2～8℃，滴加乙醇；搅拌2～3h，抽滤，烘干，即得；

优选地，重结晶方法为：将初次结晶样品在加热条件下溶于水中，然后降温，温度降至2～8℃，搅拌，抽滤，烘干，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

首先，本发明提供了一种新的可用于催化反式丁烯酸转化生产R-3-氨基丁酸的反式丁烯酸转氨酶，为生物酶法生产R-3-氨基丁酸提供了更多的选择。

其次，本发明还提供了所述反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵方法，本发明方法使得菌体细胞在短时间内实现高密度生长，发酵24h菌体湿重即达到150g/L以上，并且反式丁烯酸转氨酶得到高效表达，酶活达到1000IU/mL。

本发明所述制备方法可实现反式丁烯酸转氨酶的工业化生产，进而为生物酶法工业化生产R-3-氨基丁酸提供可能。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明所述天然天冬氨酸酶结构图；

图2为本发明所述反式丁烯酸转氨酶结构图；

图3为验证基因工程菌构建成功的琼脂糖凝胶电泳图：其中1号是重组质粒，2号是酶切后的重组质粒，M是DNA Marker；

图4为基因工程菌摇瓶试验添加不同铵盐产R-3-氨基丁酸含量的柱状图；

图5为甘油、氨水流加曲线图；

图6为菌体干重(DCW)及比生长速率曲线图；

图7为发酵酶活变化曲线图；

图8为R-3-氨基丁酸与反式丁烯酸含量变化曲线图；

图9为R-3-氨基丁酸转化液液相检测色谱图；

图10为R-3-氨基丁酸纯品液相检测色谱图；

图11为生产R-3-氨基丁酸的流程图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1反式丁烯酸转氨酶工程菌的构建

1.天然的天冬氨酸酶(如图1所示)用于催化富马酸和氨生成天冬氨酸，无法催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸，所以采用酶定向进化的方法对天冬氨酸酶蛋白进行改造。

通过将天冬氨酸酶的活性中心进行突变(如图2所示)，从而得到高活性的反式丁烯酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，通过优化目的基因片段的遗传密码子，使其更适合在宿主大肠杆菌中表达，优化后的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

2.采用基因合成获得经过突变的反式丁烯酸转氨酶目的基因片段，基因工程菌中反式丁烯酸转氨酶的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。根据重组质粒序列，设计PCR目的片段两端引物如下。

正向引物F：5’-AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAACACCGATGTTCGTATTGAAAAAGATT-3’；

反向引物R：5’-AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTACGACCGGCAATACCCGGATGGGTCAT-3’。

PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

(1)预变性：95℃3min；

(2)变性：95℃20s；退火：55℃20s；延伸：72℃20s；循环30次；

(3)延伸：72℃10min；

(4)4℃保存。

将处理好的目的片段与载体连接反应体系为：

PCR产物 5μL

酶切后的载体 5μL

Gibson重组酶 10μL

以上连接液在50℃连接30min。

将质粒浓度在100ng/μL左右的质粒吸取1-3μL加入到100μL左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3min。42℃水浴90s不要摇动。冰浴中放置3min左右。每管中加入500-800μL 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm振荡40min。

制备含相应抗性的琼脂平板。取100μL菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15min。倒置平板于37℃培养16h可出现菌落。平板挑菌，在37℃，250rpm条件下摇菌14h，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌送测序，从而获得正确构建的基因工程菌株。重组质粒酶切电泳图谱如图3所示。

3.采用构建成功的工程菌进行摇瓶试验，种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。种子液在37℃，200rpm条件下培养16h。发酵培养基为：甘油7g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉8g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，K₂HPO₄·3H₂O 6g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁2g/L。摇瓶装量是50mL/500mL，温度37℃，pH7.0，摇床转速200rpm。发酵培养6h后加入IPTG开始诱导，诱导后培养温度为30℃，发酵周期24h。发酵结束后离心收集菌体用于转化。对比了添加硫酸铵，醋酸铵，氯化铵与不添加铵盐的转化效果。操作方法是摇瓶中添加反式丁烯酸100g/L，硫酸镁5g/L，菌体量25g/L，用氨水调节pH至8.8。实验结果如图4所示。从图4中可以看出，添加铵盐的转化效果要略好于不添加铵盐的实验组，但考虑到后续的纯化负担，可不添加铵盐。

实施例2 15L发酵罐高密度发酵培养

1.反式丁烯酸转氨酶工程菌的种子液的培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到小试发酵的种子培养液。

2.反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵培养方法

采用15L发酵罐进行了反式丁烯酸转氨酶高密度细胞培养小试发酵工艺的研究，装液量为7.5L。

将步骤1培养得到的种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为15.6时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

所用发酵培养基为：甘油7g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O18g/L，K₂HPO₄·3H₂O 13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁1g/L，溶剂为水。

发酵进行至4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％v/v的甘油，整个发酵过程共流加浓度为50％v/v甘油26.5％，最高流加速率为25.6mL/(L·h)。从发酵5.5h开始流加浓度为28％v/v氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水2.4％，氨水流加的最高速率为2.5mL/(L·h)。甘油刚开始时加入102mL以使发酵罐初始碳源浓度为7.0g/L，通气量调节至1.2vvm，并提高搅拌转速将溶氧控制在20％，随着菌体的生长，菌体的耗氧速率逐渐增加，需要逐渐提升碳源流加速度。氨水根据碳源的消耗速率自动流加，发酵过程中pH值控制在6.8。甘油、氨水流加曲线图如图5所示，菌体干重(DCW)及比生长速率曲线如图6所示，发酵酶活变化曲线图如图7所示。

发酵24h结束后，菌体OD₆₀₀最后为102.6。采用50nm陶瓷膜收集含反式丁烯酸转氨酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为139g/L。反式丁烯酸转氨酶酶活为1172U/mL。

3.利用菌体全细胞催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸的方法

高密度发酵结束后，将步骤2中所得过膜浓缩液按照菌体湿重50g/L的添加量加入转化液中，然后再加入2700g反式丁烯酸，180g硫酸铵，45g硫酸镁，用氨水调节pH至8.5，最后加水定容至9L开始反应。中间过程每隔2小时取样检测R-3-氨基丁酸与反式丁烯酸含量，如图8所示。转化结束后，将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续的浓缩结晶，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化丁烯酸生产R-3-氨基丁酸。转化液液相检测色谱图如图9所示。

4.R-3-氨基丁酸转化液的浓缩结晶

将步骤3中收获的转化上清液过10kDa超滤膜，收集穿出液，然后将超滤穿出液过150Da纳滤膜，收集穿出液。然后向穿出液中加入R-3-氨基丁酸质量2％的活性炭脱色。取1000mL脱色液用旋转蒸发仪在50℃条件下真空浓缩，使R-3-氨基丁酸的浓度为600-700g/L。然后取浓缩液降温析晶，在2-8℃下滴加200mL乙醇，并以80rpm转速搅拌养晶3h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为328.17g，计算晶体收率为93.23％。

重结晶：将初次结晶样品在60℃条件下加水溶解并定容至500mL，然后降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品R-3-氨基丁酸299.73g，计算晶体总收率为85.15％。检测晶体纯度为99.52％，ee值为99.9％。液相检测色谱图如图10所示。

实施例3 200L规模发酵罐进行高密度发酵培养

1.反式丁烯酸转氨酶工程菌的种子液的培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间23h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(100mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、200rpm的恒温气浴摇床中培养14h得到一级种子培养液。将摇瓶种子液接种于20L种子罐中，发酵罐装料量10L，接种量5％。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。通气量为1vvm，培养8h后，种子进入对数生长后期，得到二级种子液，可以将其接种于中试规模的发酵罐。

2.反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵培养方法

采用200L发酵罐进行培养，装液量为100L。

将步骤1中试培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为300rpm，通气量为1vvm，发酵至OD₆₀₀为15.65时，发酵时间6h加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵培养基为：蛋白胨12g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，K₂HPO₄·3H₂O13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵进行至大4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％甘油，整个发酵过程共流加20.9％，最大流加速率为18.9mL/(L·h)。从发酵2h开始流加浓度为28％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水3.9％。甘油刚开始时加入1400mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。发酵过程中pH控制在7.0。

发酵29h结束后，菌体OD₆₀₀最后为103.5。采用50nm陶瓷膜收集含反式丁烯酸转氨酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为153g/L。

3.利用菌体全细胞催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸的方法

高密度发酵结束后，将步骤2中所得过膜浓缩液按照菌体湿重75g/L的添加量进行转化，然后再加入36kg反式丁烯酸，4.8kg硫酸铵，600g硫酸镁，用氨水调节pH至8.7，最后加水定容至120L开始反应。中间过程每隔2小时取样检测R-3-氨基丁酸与反式丁烯酸含量。转化结束后，将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续的浓缩结晶，液相检测上清液R-3-氨基丁酸浓度为355.71g/L，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化丁烯酸生产R-3-氨基丁酸。

4.R-3-氨基丁酸转化液的浓缩结晶

将步骤3中收获的转化上清液过10kDa超滤膜，收集穿出液，然后将超滤穿出液过150Da纳滤膜，收集穿出液。然后向穿出液中加入R-3-氨基丁酸质量1.5％的活性炭脱色。取1000mL脱色液用旋转蒸发仪在50℃条件下真空浓缩，使R-3-氨基丁酸的浓度为650-750g/L。然后取浓缩液降温析晶，在2-8℃下滴加500mL乙醇，并以100rpm转速搅拌养晶2h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为342.05g，计算晶体收率为96.16％。

重结晶：将初次结晶样品在55℃条件下加水溶解并定容至500mL，然后降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品R-3-氨基丁酸282.31g，计算晶体总收率为79.37％。检测晶体纯度为99.12％，ee值为99.9％。

实施例4 2000L发酵罐进行高密度发酵培养

1.反式丁烯酸转氨酶工程菌的种子液的培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间26h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(1L/3L锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到一级种子培养液。将摇瓶种子液接种于200L种子罐中，发酵罐装料量100L，接种量3％。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。通气量为1.2vvm，培养8h后，种子进入对数生长后期，得到二级种子液，可以将其接种于2000L规模的发酵罐。

2.反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵培养方法

采用2000L发酵罐进行培养，装液量为1000L。

将步骤1中培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到1000L发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为12.26时，发酵时间6h加入终浓度为0.45mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵培养基为：蛋白胨12g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，K₂HPO₄·3H₂O13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁2.0g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵进行至4.8h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％甘油，整个发酵过程共流加19.5％，最大流加速率为23.5L/(L·h)。从发酵2.5h开始流加浓度为26％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水4.5％。甘油刚开始时加入7L以使发酵罐初始碳源浓度为3.5g/L。发酵过程中pH控制在7.0。

发酵24h结束后，菌体OD₆₀₀最后为105.6。采用碟片式离心机收集含反式丁烯酸转氨酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为149g/L。

3.利用菌体全细胞催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸的方法

高密度发酵结束后，将步骤2中所得全细胞催化剂按照菌体湿重100g/L的添加量进行转化，然后再加入240kg反式丁烯酸，6kg硫酸镁，用氨水调节pH至8.5，最后加水定容至1200L开始反应。中间过程每隔2小时取样检测R-3-氨基丁酸与反式丁烯酸含量。转化结束后，将转化液采用碟片式离心机进行离心收集上清液，检测上清液R-3-氨基丁酸浓度为225.16g/L，转化率为94.02％。上清液用于后续的浓缩结晶，分离所得全细胞菌体可以用于下次继续转化丁烯酸生产R-3-氨基丁酸。

4.R-3-氨基丁酸转化液的浓缩结晶

将步骤3中收获的转化上清液过5kDa超滤膜，收集穿出液，然后将超滤穿出液过200Da纳滤膜，收集穿出液。然后向穿出液中加入R-3-氨基丁酸质量2％的活性炭脱色。取1000mL脱色液用旋转蒸发仪在50℃条件下真空浓缩，使R-3-氨基丁酸的浓度为600-700g/L。然后取浓缩液降温析晶，在2-8℃下滴加300mL乙醇，并以80rpm转速搅拌养晶4.5h后抽滤，放于40℃真空烘干，得到固体干重为213.90g，计算晶体收率为95.03％。

重结晶：将初次结晶样品在60℃条件下加水溶解并定容至500mL，然后降温至2-8℃，并低速搅拌析晶。搅拌养晶结束后开始抽滤，将抽滤所得晶体真空烘干，即得成品R-3-氨基丁酸200.95g，计算晶体总收率为89.25％。检测晶体纯度为99.95％，ee值为99.9％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东国力生物技术研究院，山东国力生物科技有限公司

<120> 一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Met Val Cys Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaacaccg atgttcgtat tgaaaaagat tttctgggtg aaaaagagat tccgaaagat 60

gcctattatg gtgttcagac cattcgcgcc accgaaaatt ttccgattac cggttatcgc 120

attcatccgg aactgattaa gagtctgggt attgtgaaaa aatctgcagc actggcaaat 180

atggaagtgg gcctgctgga taaagaagtt ggccagtata ttgttaaagc cgcagatgaa 240

gtgattgaag gcaaatggaa tgatcagttt attgttgatc cgattcaggg cggcgccggc 300

accagtatta atatgaatgc aaatgaagtg atcgccaatc gtgccctgga actgatgggc 360

gaagaaaaag gcaattatag taaaattagc ccgaatagtc acgtgaatat gagccagagc 420

accaatgatg cctttccgac cgccacccat attgcagttc tgagcctgct gaatcagctg 480

attgaaacca ccaaatatat gcagcaggag tttatgaaaa aggccgatga atttgcaggt 540

gttattaaga tgggtcgttg ccatctgcag gatgcagttc cgattctgct gggtcaggaa 600

tttgaagcct atgcacgtgt tattgcccgc gatattgaac gcattgcaaa tacccgtaat 660

aatctgtatg atattaacat gggtgcaacc gcagtgggta caggcctgaa tgccgatccg 720

gaatatatta gtattgtgac cgaacatctg gccaaatttt ctggccatcc gctgcgtagt 780

gcacagcatc tggttgatgc cacccagaat accgattgct ataccgaagt gagcagcgca 840

ctgaaagtgt gcatgattaa tatgagcaaa atcgccaatg atctgcgtct gatggcaagt 900

ggtccgcgcg ccggcctgag tgaaattgtg ctgccggcac gccagccggg tagtagcatt 960

attccgggta tggtgtgccc ggttatgccg gaagttatga atcaggtggc atttcaggtt 1020

tttggtaatg atctgaccat taccagcgca agtgaagcag gccagtttga actgaatgtt 1080

atggaaccgg tgctgttttt caatctgatt cagagtatta gcatcatgac caatgtgttt 1140

aaaagtttta ccgaaaactg cctgaaaggt attaaggcaa atgaagaacg catgaaagaa 1200

tatgtggaaa aaagcattgg cattattacc gcaattaatc cgcatgtggg ttatgaaacc 1260

gcagcaaaac tggcccgcga agcatatctg accggtgaaa gtattcgcga actgtgtatt 1320

aagtatggcg tgctgaccga agaacagctg aatgaaattc tgaatccgta tgaaatgacc 1380

catccgggta ttgccggtcg taaataa 1407

Claims

1.一种反式丁烯酸转氨酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述反式丁烯酸转氨酶的but基因，其特征在于，所述but基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种反式丁烯酸转氨酶工程菌，其特征在于，所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，表达反式丁烯酸转氨酶but基因，所述基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.权利要求3所述反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述工程菌种子液培养；

将种子液接种到发酵培养基中，进行高密度发酵培养；

高密度发酵培养过程中添加诱导剂，补加碳源、氮源，控制溶氧量；

优选地，发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，溶剂为水；

优选地，所述诱导剂为IPTG或乳糖；进一步优选地，IPTG诱导浓度为0.3～0.6mmol/L，发酵5～8h时加入诱导剂进行诱导培养；

优选地，控制发酵液溶氧量为15～20％，搅拌转速为150～500rpm，通气量为1～2vvm；

优选地，发酵过程中pH值控制在6.5～7.5。

5.根据权利要求4所述高密度发酵方法，其特征在于，待发酵至溶氧开始回升时流加碳源，流加速率为0.2～30mL/(L·h)；

所述碳源为甘油或葡萄糖；优选地，所述碳源为甘油，所用甘油浓度为40～60％v/v，流加甘油总量为发酵培养基体积的10～30％。

6.根据权利要求4所述高密度发酵方法，其特征在于，在发酵2～6h开始流加氮源，流加速率为0.1～5mL/(L·h)；

7.权利要求1所述反式丁烯酸转氨酶或权利要求3所述反式丁烯酸转氨酶工程菌在制备R-3-氨基丁酸中的应用。

8.一种酶法生产R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述反式丁烯酸转化液各成分浓度为：反式丁烯酸30～300g/L，硫酸铵5～50g/L，硫酸镁1～10g/L，用氨水调节pH为7.5～9.5；

优选地，按菌体湿重50-100g/L的添加量进行转化；

优选地，转化条件为：20～40℃条件下转化6～12h。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，结晶方法为：将转化液离心除菌体后，经超滤膜与纳滤膜过滤后，取上清液，加入0.5％～5％质量的活性炭脱色，过滤后取上清液浓缩，降温至2～8℃，滴加乙醇；搅拌2～3h，抽滤，烘干，即得；

优选地，重结晶方法为：将初次结晶样品在加热条件下溶于水中，然后降温，温度降至2～8℃，滴加乙醇，搅拌，抽滤，烘干，即得。