CN108330096A - 胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents

胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胞外表达L‑天冬氨酸α‑脱羧酶工程菌的构建方法及应用该菌生产β‑丙氨酸。本发明克隆高活性的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L‑天冬氨酸α‑脱羧酶的胞外分泌工程菌，并配合发酵调控措施增加L‑天冬氨酸α‑脱羧酶的胞外分泌量，所得L‑天冬氨酸α‑脱羧酶酶液用于转化L‑天冬氨酸生产β‑丙氨酸。本发明实现酶的胞外释放，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，有利于底物同酶的接触；直接采用发酵液催化L‑天冬氨酸生产β‑丙氨酸，无需破碎细胞提取纯酶进行反应；且采用底物流加的方式催化合成β‑丙氨酸，避免催化过程中产生多量的盐，产品纯度高。

Description

胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
现有技术中，大肠杆菌作表达蛋白多为胞内产物，易形成包涵体、被蛋白酶降解，蛋白活性不高，催化时需要透膜处理，成本高。
L-天冬氨酸α-脱羧酶（L-aspartate-α-decarboxylase，ADC）催化L-天冬氨酸脱α位羧基生产β-丙氨酸，β-丙氨酸是生物体内合成泛酸的重要前体物质，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸及其衍生物广泛应用于医药、食品及化工等领域。化学合成法是目前β-丙氨酸的主要生产方法，存在成本高、工艺条件苛刻、副产物较多及生产环境不友好等缺点，采用ADC的生物转化法生产工艺被认为是最有前景的替代方法。ADC主要存在于细菌、古细菌、放线菌等低等生物中，不同来源的ADC氨基酸序列和酶活性存在较大差异，如Mycobacterium tuberculosis和Escherichia coli的同源性仅为45%，目前认为Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum等菌属的ADC具有较高的工业应用潜力。
Shen等对重组Corynebacterium glutamicum ADC酶学性质进行充分研究，并以此为基础应用于β-丙氨酸催化合成，36 h可产生12.85 g/L的β-丙氨酸，转化率为97.2%（ShenY., Zhao L., Li Y., Zhang L., Shi G., 2014. Synthesis of beta-alanine from l-aspartate using l-aspartate-alpha-decarboxylase from Corynebacteriumglutamicum, Biotechnol. Lett. 36 (2014) 1681–1686.）。Song等利用E. coli W3110胞内异源扩增ADC合成基因，同时强化表达天冬氨酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，构建从葡萄糖开始的β-丙氨酸全合成途径，经39 h发酵β-丙氨酸产量达到32.3 g/L，葡萄糖转化率13.5%（Song C. W, Lee J, Ko Y. S, Lee S.Y., 2015. Metabolic engineering ofEscherichia coli for the production of 3-aminopropionic acid. MetabolicEngineering, 30: 121-129.）。Li等克隆Corynebacterium glutamicum的ADC基因，全细胞催化合成β-丙氨酸，产量达到24.8g/L，转化率92.6%（Li H., Lu X., Chen K., Yang J.,Zhang A., Wang X., 2018. β-alanine production using whole-cell biocatalystsin recombinant Escherichia coli. Molecular Catalysis, 449: 93-98.）。以上研究表明工程细胞在生产β-丙氨酸方面取得较大的进步，但仍然存在酶活不够高、产物浓度低、转化率低及生产周期长的缺点。
发明内容
本发明针对上述胞内表达的不足，提供一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法。该构建方法可增加酶的表达量，简化酶使用前的透膜处理工序，增加酶同底物的接触效率，提高酶法生产β-丙氨酸的效率。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，所述构建方法步骤包括：克隆高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌。
优选地，所述信号肽基因是pelB信号肽基因或torA信号肽基因。
优选地，所述构建方法具体步骤为：根据B. tequilensis全基因组中PanD的基因和克隆载体pET20b的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以B.tequilensis PanD37基因组DNA为模板，克隆Bacillus tequilensis L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因panD，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和 Xho I酶切载体pET20a进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-pelB-panD，并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/pT20b-pelB-panD。
优选地，所述构建方法具体步骤为：
（1）合成信号肽torA编码基因，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET20b双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的质粒pET20b-torA；
（2）根据B. tequilensis全基因组中PanD基因和步骤（1）得到的质粒载体pET20b-torA的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以B. tequilensis PanD37基因组DNA为模板，克隆Bacillus tequilensis L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因panD，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和 Xho I酶切载体pET20b-torA进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-torA-panD，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/pT20b-torA-panD。
本发明还提供一种胞外分泌工程菌，采用上述的胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法得到。
本发明还提供一种胞外分泌工程菌在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明还提供一种生产β-丙氨酸的方法，步骤包括：将构建的如上述的胞外分泌工程菌进行扩大培养，再进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液进行生物转化，得到β-丙氨酸。
优选地，所述扩大培养为：
（1）将所述胞外分泌工程菌接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养10～20h；其中LB培养基配方为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
（2）500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养4～12h；其中所述液体LB培养基包括为：酵母粉 5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
优选地，所述发酵培养为：5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以1～10%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～60%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2～7g/L，37 ℃培养6～10 h降温至22～35℃加入1～10g/L的乳糖进行诱导表达，同时加入透膜剂，继续培养8～14h结束发酵测定酶活。
优选地，所述生物转化为：发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应体系中加入10～200g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100～300mL，并定容至1L，过程中流加2 mol/L HCl或固体L-天冬氨酸控制pH在6.0～8.0，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应；反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重。
优选地，发酵过程中加入的透膜剂为1-10g/L的甘氨酸或0.5-5g/L的吐温-80或0.5-5g/L的曲拉通X-100的一种或几种组合。
有益效果：
本发明克隆高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌，并配合发酵调控措施增加L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌量，所得L-天冬氨酸α-脱羧酶酶液用于转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，最高可以完全转化150g/L的L-天冬氨酸，提取收率大于85%，β-丙氨酸纯度大于99%。
本发明采用pelB信号肽基因共表达构建L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌株，酶释放量达到50%以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高46%，有利于底物同酶的接触，大幅度提高酶的催化效率；本发明采用torA信号肽基因共表达构建L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌株，酶释放量达到17.6%以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高13.3%。
本发明可以直接采用发酵液催化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，无需破碎细胞提取纯酶进行反应，节约酶的使用成本。且采用底物（L-天冬氨酸）流加的方式催化合成β-丙氨酸，避免催化过程中产生多量的盐，β-丙氨酸的分离提取无需除盐，简化提取工艺，产品纯度高。
附图说明
图1为本发明空白液相图；
图2为本发明β-丙氨酸标准品液相谱图；
其中，图2中8.2min为β-丙氨酸；
图3为本发明L-天冬氨酸和β-丙氨酸标准品液相谱图；
其中，图3中3.5min为L-天冬氨酸，8.2min为β-丙氨酸；
图4为本发明转化产物液相谱图；
其中，图4中8.2min为β-丙氨酸；。
具体实施方式
实施例1
一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌及其构建方法，所述构建方法步骤包括：克隆高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌。具体为：
根据B. tequilensis全基因组（LGRW01000001）中PanD的基因序列信息和克隆载体pET20b设计含有接头（斜体表示）和限制性内切酶位点（粗体表示）的上下游引物，上游引物为pelB-PanD-F：5′-cccagccggcgatggccatggatatgtatcgaacaatgatgagc-3′；下游引物为pelB-PanD-R：5′-gtggtggtggtggtgctcgagctacaaaattgtacgggcggg-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到B. tequilensis PanD37（CGMCC NO:10506）基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和 Xho I酶切载体pET20a进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-pelB-panD，检测正确后转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD；其中pelB编码基因见SEQ.NO.2。
实施例2
一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌及其构建方法，所述构建方法步骤包括：克隆高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌。具体为：
合成trimethylamine-N-oxide reductase的信号肽torA编码基因（Genebank号：BAA36139.1），利用引物F-torA：5′-AAccatgggcatgaacaataacgatctctttc-3′和R-torA：5′-ATCCATGGCCGCTTGCGCCGCAGTC-3′扩增，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET20b双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的质粒pET20b-torA；根据B.tequilensis全基因组（LGRW01000001）中PanD的基因序列信息和质粒载体pET20b-torA设计含有接头（斜体表示）和限制性内切酶位点（粗体表示）的上下游引物，上游引物为TorA-PanD-F：5′-Ctgcggcgcaagcggccatgggaatgtatcgaacaatgatgagc-3′；下游引物为TorA-PanD-R：5′-gtggtggtggtggtgctcgagctacaaaattgtacgggcggg-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到B. tequilensis PanD37（CGMCC NO:10506）基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和Xho I酶切载体pET20b-torA进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-torA-panD，检测正确后转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pT20b-torA-panD；其中torA编码基因见SEQ.NO.3。
对比例1
一种L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌及其构建方法，由于panD序列中存在NdeI的酶切位点，因此工程菌的构建采用一步法克隆定向无缝克隆试剂盒进行。根据B. tequilensis全基因组（LGRW01000001）中PanD的基因序列信息和克隆载体pET20b设计含有接头（斜体表示）和限制性内切酶位点（粗体表示）的上下游引物，上游引物为PanD-F：5′-ttaagaaggagatatacatatgatgtatcgaacaatgatgagc-3′；下游引物为PanD-R：5′-gtggtggtggtggtgctcgagctacaaaattgtacgggcggg-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到B. tequilensis PanD37（CGMCC NO:10506）基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NdeI和 Xho I酶切载体pET20b进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-panD，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/pT20b-panD；其中panD编码基因见SEQ.NO.1。
L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活测定
10mL L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液10000r/min离心10min，上清液用于测胞外酶活；离心收集的细胞重悬于50 mM的磷酸缓冲液中（pH 7.0），超声破碎后13000r/min离心10min去除细胞碎片，清液用于测定胞内酶活。
反应体系：0.1mL适当稀释的酶液加入到含0.1M的L-天冬氨酸的的磷酸缓冲液（50mM，pH 7.0）中，37度反应30min，加入等体积的10%的三氯乙酸终止反应，采用高效液相色谱仪测定β-丙氨酸的含量。酶活定义为在pH 7.0、温度37 ℃的条件下，每l min转化生成1 μmol β-丙氨酸所需的酶量为1个酶活力单位U。
表1为基因工程菌酶活检测表。将对比例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET20b-panD、实施例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pET20b-pelB-panD、以及实施例2构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-torA-panD分别接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养16h，其中LB培养基配方为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于LB液体培养基，37℃、200r/min培养6h，加入0.4mmol/L的IPTG诱导20h，发酵结束分别测定胞内胞外酶活，其中液体LB培养基配方为；酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L， pH7.0，121℃灭菌30min。
表1 基因工程菌酶活检测表
结果如表1所示，E. coli BL21(DE3)/ pET20b-pelB-panD、E. coli BL21(DE3)/pT20b-torA-panD均可实现胞外分泌；其中E. coli BL21(DE3)/ pET20b-pelB-panD效果更优。
实施例3
胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法，步骤为：
(1) 将实施例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养16h，其中LB培养基配方为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种种子培养基37℃、200r/min培养7h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L， pH7.0，121℃灭菌30min；
(3) 5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以5%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为4g/L，37℃培养6 h降温至30℃加入5g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养30h结束发酵测定酶活，胞外酶活为8.3U/mL，占总酶活的52%。其中发酵培养基为：葡萄糖 20g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 15 g/L，玉米浆 20 g/L，KH2PO4 15 g/L，MgSO4 1 g/L，富马酸 2 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，生物素 20μg/L，维生素B1 2mg/L，FeSO4 0.5mg/L，pH7.0，121℃灭菌20min。补料培养基为：葡萄糖 500 g/L，玉米浆 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
(4) 将步骤（3）得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应瓶中加入20g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100mL，并定容至1L，温度40℃，200r/min转条件下反应，过程中流加2 mol/L HCl控制pH在7.0，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应，完全反应时间为1h。反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，β-丙氨酸质量为11.5g，提取收率为85.9%，纯度为99.5%。
本发明L-天冬氨酸与β-丙氨酸含量测定：
取转化液10000rpm 离心10min，收集上清液，分别以L-天冬氨酸和β-丙氨酸作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与邻苯二甲醛衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定L-天冬氨酸和β-丙氨酸的含量。
高效液相色谱条件：液相色谱条件为氨基酸专用ODS-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：30℃；检测波长：340nm；流动相：乙腈：20mM乙酸钠缓冲液（pH5.9）=25:75，流动相总流量：1mL/min，邻苯二甲醛柱前衍生测定。
实施例4
胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法，步骤为：
(1) 将实施例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养18h，其中液体LB培养基同实施例3；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养6h，其中液体LB培养基同实施例3；
(3) 5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以2%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在30-40%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加葡萄糖控制葡萄糖浓度为2g/L，37 ℃培养8h降温至30℃加入2g/L的乳糖进行诱导表达，同时加入1g/L的曲拉通X-100，继续培养28h结束发酵测定胞外酶活为12.6U/mL，占总酶活的72%，发酵培养基同实施例3。
(4) 将步骤（3）得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应瓶中加入40g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100mL，并定容至1L，温度37℃，过程中流加2 mol/L HCl控制pH在7.0，200r/min转条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应，完全反应时间为2h。反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，β-丙氨酸质量为23.8g，提取收率为88.9%，纯度为99.3%。
实施例5
胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法，步骤为：
(1) 将实施例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养15h，其中液体LB培养基同实施例3；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养6h，其中液体LB培养基同实施例3；
(3) 5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以2%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在30-40%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加葡萄糖控制葡萄糖浓度为2g/L，37 ℃培养8h降温至26℃加入3g/L的乳糖进行诱导表达，同时加入1g/L的吐温-80，继续培养28h结束发酵测定胞外酶活为13.5U/mL，占总酶活的75%，发酵培养基同实施例3。
(4) 将步骤（3）得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应瓶中加入150g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100mL，并定容至1L，过程中流加2 mol/L HCl控制pH在7.0，温度37℃，200r/min转条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应，完全反应时间为16h。反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，β-丙氨酸质量为90g，提取收率为89.6%，纯度为99.7%。
实施例6
胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法，步骤为：
(1) 将实施例1构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养15h，其中液体LB培养基同实施例3；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养6h，其中液体LB培养基同实施例3；
(3) 5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以2%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在30-40%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加葡萄糖控制葡萄糖浓度为2g/L，37 ℃培养8h降温至24℃加入5g/L的乳糖进行诱导表达，同时加入5g/L的甘氨酸，继续培养28h结束发酵测定胞外酶活为11.8U/mL，占总酶活的68%，发酵培养基同实施例3。
(4) 将步骤（3）得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应瓶中加入10g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.5，补入发酵液100mL，并定容至1L，pH上升时流加固体L-天冬氨酸，终浓度为150g/L，控制pH在7.5，温度37℃，200r/min条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应，完全反应时间为13h。反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，β-丙氨酸质量为91.2g，提取收率为90.8%，纯度为99.9%。
实施例7
胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的方法，步骤为：
(1) 将实施例2构建的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pT20b-torA-panD接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养16h，其中LB培养基配方为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
(2)500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种种子培养基37℃、200r/min培养7h，其中液体LB培养基配方为；酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L， pH7.0，121℃灭菌30min；
(3) 5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以5%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～30%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为4g/L，37℃培养6 h降温至30℃加入5g/L的乳糖进行诱导表达，继续培养30h结束发酵测定酶活，胞外酶活为2.1U/mL，占总酶活的20%。其中发酵培养基为：葡萄糖 20g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 15 g/L，玉米浆 20 g/L，KH2PO4 15 g/L，MgSO4 1 g/L，富马酸 2 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，生物素 20μg/L，维生素B1 2mg/L，FeSO4 0.5mg/L，pH7.0，121℃灭菌20min。补料培养基为：葡萄糖 500 g/L，玉米浆 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
(4) 将步骤（3）得到的发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应瓶中加入20g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100mL，并定容至1L，温度40℃，过程中流加2 mol/L HCl控制pH在7.0，200r/min转条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应，反应时间为45min。反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重，β-丙氨酸质量为11.8g，提取收率为88.2%，纯度为99.3%。
大肠杆菌作表达蛋白多为胞内产物，易形成包涵体、被蛋白酶降解，蛋白活性不高，催化时需要透膜处理，成本高。本发明是为了克服胞内表达的缺点，提供一种L-天冬氨酸α-脱羧酶胞外表达的方法，增加酶的表达量，简化酶使用前的透膜处理工序，增加酶同底物的接触效率，提高酶法生产β-丙氨酸的效率。
本发明采用胞外表达方式构建L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌株，酶释放量达到30%以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高50%。
本发明发酵产生的酶部分释放到发酵液中，且菌体细胞通透性良好，有利于底物同酶的接触，大幅度提高酶的催化效率，可以直接采用发酵液催化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，无需破碎细胞提取纯酶进行反应，节约酶的使用成本。
本发明采用底物（L-天冬氨酸）流加的方式催化合成β-丙氨酸，避免催化过程中产生多量的盐，β-丙氨酸的分离提取简单，无需除盐，产品纯度高。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法及其应用
<130> 2018
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> Bacillus tequilensis
<400> 1
atgtatcgaa caatgatgag cggcaagctt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60
aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180
cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
cacgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaacccgccc gtacaatttt gtag 384
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> Bacillus Cohn
<400> 2
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggcc 66
<210> 3
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(ordo artificialis)
<400> 3
aacatatgaa caataacgat ctctttcagg catcacgtcg gcgttttctg gcacaactcg 60
gcggcttaac cgtcgccggg atgctggggc cgtcattgtt aacgccgcga cgtgcgactg 120
cggcgcaagc ggccatggaa 140

Claims (10)

1.一种胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤包括：克隆高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导L-天冬氨酸α-脱羧酶的胞外分泌工程菌。
2.如权利要求1所述的胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述信号肽基因是pelB信号肽基因或torA信号肽基因。
3.如权利要求2所述的胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体步骤为：根据B. tequilensis全基因组中PanD的基因和克隆载体pET20b的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以B. tequilensis PanD37基因组DNA为模板，克隆Bacillus tequilensis L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因panD，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和 Xho I酶切载体pET20a进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-pelB-panD，并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pT20b-pelB-panD。
4.如权利要求2所述的胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体步骤为：
（1）合成信号肽torA编码基因，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET20b双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的质粒pET20b-torA；
（2）根据B. tequilensis全基因组中PanD基因和步骤（1）得到的质粒载体pET20b-torA的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以B. tequilensis PanD37基因组DNA为模板，克隆Bacillus tequilensis L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因panD，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NcoI和 Xho I酶切载体pET20b-torA进行连接，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶表达质粒pET20b-torA-panD，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株E. coli BL21(DE3)/pT20b-torA-panD。
5.一种胞外分泌工程菌，其特征在于，采用如权利要求1-4任一项所述的胞外表达L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法得到。
6.一种生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，采用如权利要求5所述的胞外分泌工程菌转化生产β-丙氨酸。
7.如权利要求6所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤包括：将构建的如权利要求5所述的胞外分泌工程菌进行扩大培养，再进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液进行生物转化，得到β-丙氨酸。
8.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述扩大培养为：
（1）将所述胞外分泌工程菌接入含100mg/L氨苄西林的LB斜面培养基37℃培养10～20h；
其中LB培养基配方为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；
（2）500mL三角瓶装LB液体培养基50mL，加入100mg/L的氨苄西林，接1环斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养4～12h；
其中所述液体LB培养基包括为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min。
9.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养为：5 L发酵罐中装入3.0 L培养基，种子液以1～10%种量接入发酵培养基，调节转速和通气量控制溶氧值在20～60%之间，用25%氨水调节pH值稳定在7.0，流加补料培养基控制葡萄糖浓度为2～7g/L，37 ℃培养6～10 h降温至22～35℃加入1～10g/L的乳糖进行诱导表达，同时加入透膜剂，继续培养8～14h结束发酵测定酶活。
10.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述生物转化为：发酵液作为催化剂投入转化液中进行β-丙氨酸生产，其转化条件为：1L反应体系中加入10～200g的L-天冬氨酸，加入适量水溶解并用NaOH调节pH为7.0，补入发酵液100～300mL，并定容至1L，过程中流加2 mol/L HCl或固体L-天冬氨酸控制pH在6.0～8.0，温度35～50℃，200r/min转条件下反应，液相检测L-天冬氨酸完全转化时停止反应；反应结束后过微滤膜和超滤膜去除菌体和蛋白，真空浓缩至晶体出现，于4℃条件下结晶16h，离心收集晶体烘干称重。
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