CN104611317A - 一种提高l-天冬酰胺酶分泌表达的方法 - Google Patents

一种提高l-天冬酰胺酶分泌表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程领域。本发明通过在天冬酰胺酶的N端融合pelB信号肽，使重组菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，进一步共表达lepB信号肽酶，可将天冬酰胺酶酶活在此基础上提高1.45倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法
技术领域
本发明涉及一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程领域。
背景技术
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。
一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。
本发明通过在大肠杆菌中共表达带有信号肽的天冬酰胺酶及信号肽切割酶lepB，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
发明内容
本发明首先要解决的问题是提供一种提高天冬酰胺酶分泌表达的方法，是将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
在本发明的一种实施方式中，编码所述信号肽的基因如SEQ ID NO.1～8任一所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽是pelB。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬酰胺酶来源于枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明的一种实施方式中，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b(+)连接，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；将信号肽酶基因lepB连接pRSF-duet(+)，转化上一步得到的重组菌。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，分离得到天冬酰胺酶。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种胞外分泌天冬酰胺酶能力增强的重组菌，是将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因转化大肠杆菌进行共表达得到的。
在本发明的一种实施方式中，编码所述信号肽的基因如SEQ ID NO.1～8任一所示。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽是pelB，编码pelB的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬酰胺酶来源于枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明的一种实施方式中，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b(+)连接，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；将信号肽酶基因lepB连接pRSF-duet(+)，转化上一步得到的重组菌，筛选得到阳性转化子。
本发明还提供一种应用所述胞外分泌天冬酰胺酶能力增强的重组菌发酵生产天冬酰胺酶的方法，是将重组菌接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％；菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，分离得到天冬酰胺酶。
本发明通过在天冬酰胺酶的N端融合pelB信号肽，使重组菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，进一步共表达lepB信号肽酶，可将天冬酰胺酶酶活在此基础上提高1.45倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
附图说明
图1融合表达不同信号肽对胞外天冬酰胺酶产量的影响
图2共表达信号肽酶对胞外天冬酰胺酶产量的影响
图3天冬酰胺酶生产菌株蛋白电泳图；1：Marker，2：R20b-pelB胞外，3：R20b-pelB/pRSF-duet-lepB胞外，4：R20b-pelB胞内，5：R20b-pelB/pRSF-duet-lepB胞内。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活，1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmol NH3所需要的酶量为一个酶活单位(U/ml)。酶活测定条件：37℃条件下，1ml10mM K2HPO4-KH2PO4(PH7.5)，0.1ml189mM天冬酰胺，0.3ml发酵上清液，保温30分钟，0.1ml1.5M TCA终止反应。利用Shimadzu UV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
实施例1天冬酰胺酶基因融合信号肽
信号肽pelB的核苷酸序列：ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC
信号肽ompA的核苷酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCTCCG
信号肽torT的核苷酸序列：ATGCGCGTACTGCTATTTTTACTTCTTTCCCTTTTCATGTTGCCGGCATTTTCGGCTGAT
信号肽TorA的核苷酸序列：ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCACGTCGGCGTTTTCTGGCACAACTCGGCGGCTTAACCGTCGCCGGGATGCTGGGGCCGTCATTGTTAACGCCGCGACGTGCGACTGCGGCGCAAGCG
信号肽sufI的核苷酸序列：ATGTCACTCAGTCGGCGTCAGTTCATTCAGGCATCGGGGATTGCACTTTGTGCAGGCGCTGTTCCCCTGAAGGCCAGCGCAGCCGGG
信号肽DsbA的核苷酸序列：ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAG
信号肽Dmsa的核苷酸序列：ATGGAACGCAGAAGTTTTCTAAAAATGAGTGCAGCCATGGGCTGCGCAGCAACGGTCACTGGCTGT
信号肽ansZ的核苷酸序列：ATGAAAAAACAACGAATGCTCGTACTTTTTACCGCACTATTGTTTGTTTTTACCGGA
合成8种信号肽：pelB、ompA、sufI、DsbA、Dmsa、TorT、TorA、ansZ。PCR反应条件为：94℃5min，30个循环(98℃15s、50℃15s、72℃20s)，72℃10min。以pET-22b(+)-ansZ作为模版，以p1、p2作为正、反向引物，通过PCR扩增出一条具有N-末端His标签但缺失天然信号肽的天冬酰胺酶基因。PCR反应条件为：94℃5min，30个循环(98℃15s、50℃15s、72℃80s)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix4μL，5×primeSTARBuffer10μL，灭菌的双蒸水32.5μL，primeSTAR DNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。通过重叠PCR的方式，将信号肽与天冬酰胺酶进行融合。
P1:TGTTCACATTCTCCTGAAACAAAAG
P2:CCGCTCGAGTCAATACTCATTGAAATAAGCTTGG(下划线XhoI酶切位点)
表1引物序列
引物 序列
ansZ-F GGGAATTCCATATGAAAAAACAACGAATGCTCGTAC
ansZ-R TCCGGTAAAAACAAACAATAGTGCG
dmsA-F GGGAATTCCATATGGAACGCAGAAGTTTTCTAAAAA
dmsA-R ACAGCCAGTGACCGTTGCTGC
dsbA-F GGGAATTCCATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCT
dsbA-R CTGCGCCGCCGATGCGCTAAAC
torT-F GGGAATTCCATATGCGCGTACTGCTATTTTTACTTC
torT-R ATCAGCCGAAAATGCCGGCAA
torA-F GGGAATTCCATATGAACAATAACGATCTCTTTCAGG
torA-R CGCTTGCGCCGCAGTCGCACG
sufI-F GGGAATTCCATATGTCACTCAGTCGGCGTCAGTTCA
sufI-R CCCGGCTGCGCTGGCCTTCAG
ompA-F GGGAATTCCATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTG
ompA-R CGGAGCGGCCTGCGCTACGGTAGCG
pelB-F GGGAATTCCATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTG
pelB-R GGCCATCGCCGGCTGGGCAG
下划线为NdeI酶切位点
实施例2融合片段与载体pET-20b(+)连接
利用限制性内切酶NdeI、XhoI对回收后产物进行双酶切，并使用柱回收试剂盒进一步回收目的片段。融合片段与载体pET-20b(+)连接，连接体系：融合片段4μL，载体pET20b1μL，solution I5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET20b-SP-ansZ转化到感受态E.coilJM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET20b-SP-ansZ，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。将测序正确的质粒，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得产天冬酰胺酶基因工程菌。
实施例3高产天冬酰胺酶生产菌株的验证
将测序正确的质粒，转化E.coli Rosetta(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活，结果如图1所示。实验结果表明与出发菌株比较，酶活力均有显著提高，融合了信号肽ansZ、TorA、Sufl、Tort、DsbA、Dmsa、ompA、pelB的重组菌中酶活力分别为1.43、1.74、1.40、5.40、0.98、3.45、6.89、9.72、31.71U/ml，其中融合表达信号肽pelB的重组菌R20b-pelB的天冬酰胺酶活力较其他菌株提高近20倍。
实施例4共表达信号肽酶lepB基因
合成带有酶切位点酶NcoI、XhoI的信号肽酶lepB基因。以相同的限制性内切酶NcoI、XhoI对目的基因片段lepB及载体pRSF-duet进行酶切，采用胶回收试剂盒对其产物进行纯化和回收。电泳检验回收产物的浓度并进行连接，连接体系：目的片段lepB4μL，载体pRSF-duet1μL，solution I5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pRSF-duet-lepB转化到感受态E.coil JM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pRSF-duet-lepB，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。
将测序正确的质粒pRSF-duet-lepB，转化融合表达信号肽pelB的重组菌R20b-pelB的感受态，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活，结果如图2所示，R20b-pelB/pRSF-duet-lepB的胞外天冬酰胺酶酶活力进一步提高到46.78U/ml，较出发菌株重组菌R20b-pelB酶活力提高1.45倍。
实施例5高产天冬酰胺酶生产菌株蛋白电泳验证产量
取发酵上清，分别对重组菌R20b-pelB、重组菌R20b-pelB/pRSF-duet-lepB进行蛋白样品处理，体系：10μL4X蛋白上样缓冲液，30μL发酵上清。70℃,10min。然后进行蛋白电泳。通过染色、脱色等过程，结果如图3所示。显然R20b-pelB/pRSF-duet-lepB孔道中天冬酰胺酶条带较R20b-pelB孔道粗，表明产量明显增加，同时可以发现在R20b-pelB/pRSF-duet-lepB孔道中存在一条37kDa左右的蛋白条带，初步可以断定其为信号肽酶的条带。这表明实现了信号肽酶的高效表达，同时也促进了天冬酰胺酶的分泌。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高天冬酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因在大肠杆菌中进行共表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述信号肽的基因如SEQ ID NO.1～8任一所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQID NO.9所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b(+)连接，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；将信号肽酶基因lepB连接pRSF-duet(+)，转化上一步得到的重组菌；挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％；菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h，收集发酵上清，分离得到天冬酰胺酶。
9.一种胞外分泌天冬酰胺酶能力增强的重组菌，其特征在于，是将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因转化大肠杆菌进行共表达得到的。
10.权利要求9所述的重组菌在天冬酰胺酶生产中的应用。
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