CN104371993A - 一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体，属于酶工程领域。本发明通过定点突变的方式，将天冬酰胺酶分子内部亲水性的氨基酸天冬酰胺、缬氨酸突变成疏水性强的酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高菌株表达天冬酰胺酶的酶活力，并将天冬酰胺酶酶活提高了2.57倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体，属于酶工程领域。 
背景技术
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。 
L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。 
一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。 
L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。 
本发明通过定点突变改变蛋白质分子内部的疏水性，从而进一步提高天冬酰胺酶酶活。 
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于枯草芽孢杆菌的天冬酰胺酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从而提高了天冬酰胺酶的活性。 
所述突变是将天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸，得到突变体N133Y、N133W；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸，得到突变体V143I；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为色氨酸或酪氨酸，得到 突变体N133W/V143I、N133Y/V143I。 
天冬酰胺酶突变体N133Y、N133W、V143I、N133W/V143I、N133Y/V143I的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-6所示。 
本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技术将天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。 
在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli rosetta。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，纯化获得天冬酰胺酶突变体。 
本发明还提供一株天冬酰胺酶分泌能力增强的大肠杆菌，是将含有编码天冬酰胺酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。 
在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.colirosetta。 
本发明还提供一种提高天冬酰胺酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。 
本发明通过定点突变的方式，将天冬酰胺酶分子内部亲水性的氨基酸天冬酰胺、缬氨酸突变成疏水性强的酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高菌株表达天冬酰胺酶的酶活力，并将天冬酰胺酶酶活提高了2.57倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。 
附图说明
图1突变体酶活 
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0； 
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。 
采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活，1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活定义：在 37℃反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmol NH3所需要的酶量为一个酶活单位(U/ml)。酶活测定条件：37℃条件下，1ml10mM K2HPO4-KH2PO4(PH7.5)，0.1ml189mM天冬酰胺，0.3ml发酵上清液，保温30分钟，0.1ml1.5MTCA终止反应。利用ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。 
实施例1高效分泌天冬酰胺酶菌株构建 
以NdeI、BamHI为限制性内切酶酶切位点，对质粒pMA0911-wapA-SP-ansZ(片段)及pET22b(+)质粒(载体)进行双酶切，利用胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。回收后的目的基因(wapA-SP-ansZ)与载体pET22b(+)进行连接，连接体系：目的基因(wapA-SP-ansZ)4μL，载体(pET22b(+))1μL，solutionI5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET22b-wapA-SP/ansZ转化到感受态E.coil JM109，转化氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。如图1。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET22b-wapA-SP/ansZ，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。 
WapA-SP-ansZ基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。 
实施例2高分泌能力天冬酰胺酶生产菌株的验证 
将实施例1中测序正确的质粒，转化大肠杆菌E.coli rosetta。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活，结果显示，天冬酰胺酶被分泌到胞外。酶活力为2.68U/ml。 
实施例3高活性及热稳定突变株的获得 
利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计3对引物(如表1示)，以已构建的pET22b-wapA-SP/ansZ为模版，进行PCR，将天冬酰胺酶分子内部133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸，143位的缬氨酸突变为异亮氨酸，分别命名为N133Y、N133W、V143I。PCR反应条件为：95℃5min，34个循环(95℃5min、60℃30s、72℃5min40s)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix4μL，5×primeSTAR Buffer10μL，灭菌的双蒸水32.5μL，primeSTAR DNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-asp-N133Y、pET-22b(+)-asp-N133W、pET-22b(+)-asp-V143I。 
以测序正确的菌株pET-22b(+)-asp-V143I的质粒为模版，对天冬酰胺酶分子内部133位的天冬酰胺进行复合突变，分别突变为酪氨酸、色氨酸，命名为V143I/N133Y、V143I/N133W、转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-asp-V143I/N133Y、 pET-22b(+)-asp-V143I/N133W。 
实施例4高产天冬酰胺酶生产菌株的验证 
将测序正确的质粒，转化E.coli Rosetta(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活，结果如图1所示。实验结果表明与出发菌株比较，酶活力均有显著提高，WT、N133Y、N133W、V143I、N133Y/V143I、N133W/V143I酶活力分别为2.68、4.36、4.51、3.91、5.33、6.89U/ml且复合突变菌株pET-22b(+)-asp-V143I/N133Y胞外酶活提高到6.89U/ml，较出发菌株提高2.57倍。 
表1 引物序列 
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。 

Claims (9)

1.一种酶活力提高的天冬酰胺酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为色氨酸或酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的天冬酰胺酶突变体，其特征在于，天冬酰胺酶突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-6所示。
3.一种获得权利要求1所述突变体的方法，是通过定点突变技术将天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli rosetta；挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％；菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h，收集发酵上清，纯化获得天冬酰胺酶突变体。
5.一种表达权利要求1所述天冬酰胺酶突变体的大肠杆菌，是将含有编码天冬酰胺酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌，其特征在于，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli rosetta。
7.权利要求1所述天冬酰胺酶突变体的应用。
8.权利要求5所述大肠杆菌的应用。
9.一种提高天冬酰胺酶活力的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。
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